JP3140757B2 - パッケージング欠陥ｈｉｖプロウイルス、細胞系及びその使用 - Google Patents
パッケージング欠陥ｈｉｖプロウイルス、細胞系及びその使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、パッケージング欠陥（packaging defectiv
e）HIVプロウイルスを含むベクター、HIVパッケージン
グ欠陥細胞系を作製するためのかかるベクターの使用、
及び得られた細胞系の使用に係る。より好ましくは、HI
VプロウイルスがHIV−１プロウイルスである。
e）HIVプロウイルスを含むベクター、HIVパッケージン
グ欠陥細胞系を作製するためのかかるベクターの使用、
及び得られた細胞系の使用に係る。より好ましくは、HI
VプロウイルスがHIV−１プロウイルスである。
ヒト免疫不全ウイルス（HIV−１、HTLV−III、LAVま
たはHTLV−III/LAVとも呼ばれる）は後天性免疫不全症
候群（エイズ（AIDS））及び類縁疾患の病因物質である
〔Barre−Sinoussi等、Science 220:868〜871（1983）;
Gallo等、Science 224:550〜503（1984）;Levy等、Scie
nce 225:840〜842（1984）;Popovic等、Science 224:49
7〜500（1984）:Sarngadharan等、Science 224:506〜50
8;Siegal等、N.Engl.J.Med.305:1439〜1444（198
1）〕。この疾患の特徴は、長い無症候期間後に免疫系
及び中枢神経系に進行性の変性を生じることである。ウ
イルスの研究の結果から該ウイルスの複製が高度に調節
されていることが判明し、組織培養ではCD4陽性ヘルパ
ーＴリンパ球サブセットへの潜伏性及び溶解性感染がと
もに生じる〔Zagury等、Science 231:850〜853（198
6）〕。また、感染患者においてはウイルスの発現が免
疫応答を回避するように調節されると考えられる。HIV
−１の調節及びゲノム構成の分子論的研究から、該ウイ
ルスが多数の遺伝子をコードしていることが判明した
〔Ratner等、Nature 313:277〜284（1985）;Sanchez−P
escador等、Science 227:484〜492（1985）:Muesing
等、Nature 313:450〜457（1985）;Wain−Hobson等、Ce
ll 40:9〜17（1985）〕。
たはHTLV−III/LAVとも呼ばれる）は後天性免疫不全症
候群（エイズ（AIDS））及び類縁疾患の病因物質である
〔Barre−Sinoussi等、Science 220:868〜871（1983）;
Gallo等、Science 224:550〜503（1984）;Levy等、Scie
nce 225:840〜842（1984）;Popovic等、Science 224:49
7〜500（1984）:Sarngadharan等、Science 224:506〜50
8;Siegal等、N.Engl.J.Med.305:1439〜1444（198
1）〕。この疾患の特徴は、長い無症候期間後に免疫系
及び中枢神経系に進行性の変性を生じることである。ウ
イルスの研究の結果から該ウイルスの複製が高度に調節
されていることが判明し、組織培養ではCD4陽性ヘルパ
ーＴリンパ球サブセットへの潜伏性及び溶解性感染がと
もに生じる〔Zagury等、Science 231:850〜853（198
6）〕。また、感染患者においてはウイルスの発現が免
疫応答を回避するように調節されると考えられる。HIV
−１の調節及びゲノム構成の分子論的研究から、該ウイ
ルスが多数の遺伝子をコードしていることが判明した
〔Ratner等、Nature 313:277〜284（1985）;Sanchez−P
escador等、Science 227:484〜492（1985）:Muesing
等、Nature 313:450〜457（1985）;Wain−Hobson等、Ce
ll 40:9〜17（1985）〕。
典型的な分類によればレトロウイルスは、３つの亜
科、即ちオンコウイルス、スプーマウイルス及びレンチ
ウイルスのいずれかに所属する。オンコウイルスの感染
は典型的には悪性疾患を随伴する。これらのウイルスは
典型的には、約8,000〜10,000のヌクレオチドから成りg
ag、pol及びenv遺伝子とLTR（long terminal repeat）
配列とを包含するプラス鎖の１本鎖RNAゲノムを含む。
いくつかのオンコウイルスは腫瘍遺伝子を含む。スプー
マウイルスは組織培養で泡沫状細胞変性を誘発するが、
in vivoでは病原性でないと一般に考えられている。レ
ンチウイルスによる感染は一般に緩慢であり、長い潜伏
期間後に慢性の衰弱性疾患を発病させる。これらのウイ
ルスは、gag、pol及びenv遺伝子に加えて、更に調節機
能を有する多数の遺伝子を有する。
科、即ちオンコウイルス、スプーマウイルス及びレンチ
ウイルスのいずれかに所属する。オンコウイルスの感染
は典型的には悪性疾患を随伴する。これらのウイルスは
典型的には、約8,000〜10,000のヌクレオチドから成りg
ag、pol及びenv遺伝子とLTR（long terminal repeat）
配列とを包含するプラス鎖の１本鎖RNAゲノムを含む。
いくつかのオンコウイルスは腫瘍遺伝子を含む。スプー
マウイルスは組織培養で泡沫状細胞変性を誘発するが、
in vivoでは病原性でないと一般に考えられている。レ
ンチウイルスによる感染は一般に緩慢であり、長い潜伏
期間後に慢性の衰弱性疾患を発病させる。これらのウイ
ルスは、gag、pol及びenv遺伝子に加えて、更に調節機
能を有する多数の遺伝子を有する。
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）はレンチウイルスとし
て分類されている。その理由は、感染が緩慢でありまた
レンチウイルスに共通の構造的特性を有するからである
〔Haase,A.T.、Nature 322:130〜136（1986）参照〕。
て分類されている。その理由は、感染が緩慢でありまた
レンチウイルスに共通の構造的特性を有するからである
〔Haase,A.T.、Nature 322:130〜136（1986）参照〕。
HIV−１ウイルスはその他のレトロウイルスと共通のg
ag、pol及びenv遺伝子を有する〔Haseltine,W.A.、Jour
nal of Acquired Immune Deficiency Syndrome、1:217
〜240（1988）〕。HIV−１はまた、更にウイルス複製を
調節する遺伝子を有する。HIV−１ゲノムは、vif、vp
r、tat、rev、vpu及びnefタンパク質をコードしている
〔Haseltine,W.A.、Journal of Acquired Immune Defic
iency Syndrome、前掲〕。更に、HIVのLTRは、組込み、
転写及びポリアデニル化に重要なcis作用（cis−actin
g）配列を含む。付加的なcis作用シグナルは、新しいHI
V遺伝子産物のいくつかによってHIV配列の調節を可能に
する〔Haseltine,W.A.、Journal of Acquired Immune D
eficiency Syndrome、前掲;Sodroski等、Science 231:1
549〜1553（1986）;Arya等、Science 229:69〜73（198
5）;Sodroski等、Science 227:171〜173（1985）;Sodro
ski等、Nature 321:412〜417（1986）;Feinberg等、Cel
l 46:807〜817（1986）;Wong−Staal等、AIDS Res.and
Human Retroviruses ３:33〜39（1987）；これらの文献
の記載内容はすべて本明細書に含まれるものとする〕。
今日までに配列決定された種々のHIV−１菌株中では、
５′主要スプライス供与部位とgag遺伝子開始コドンと
の間の領域は高度に保存されている〔Myers,G.等、Theo
retical Biology and Biophysics、（1988）〕。
ag、pol及びenv遺伝子を有する〔Haseltine,W.A.、Jour
nal of Acquired Immune Deficiency Syndrome、1:217
〜240（1988）〕。HIV−１はまた、更にウイルス複製を
調節する遺伝子を有する。HIV−１ゲノムは、vif、vp
r、tat、rev、vpu及びnefタンパク質をコードしている
〔Haseltine,W.A.、Journal of Acquired Immune Defic
iency Syndrome、前掲〕。更に、HIVのLTRは、組込み、
転写及びポリアデニル化に重要なcis作用（cis−actin
g）配列を含む。付加的なcis作用シグナルは、新しいHI
V遺伝子産物のいくつかによってHIV配列の調節を可能に
する〔Haseltine,W.A.、Journal of Acquired Immune D
eficiency Syndrome、前掲;Sodroski等、Science 231:1
549〜1553（1986）;Arya等、Science 229:69〜73（198
5）;Sodroski等、Science 227:171〜173（1985）;Sodro
ski等、Nature 321:412〜417（1986）;Feinberg等、Cel
l 46:807〜817（1986）;Wong−Staal等、AIDS Res.and
Human Retroviruses ３:33〜39（1987）；これらの文献
の記載内容はすべて本明細書に含まれるものとする〕。
今日までに配列決定された種々のHIV−１菌株中では、
５′主要スプライス供与部位とgag遺伝子開始コドンと
の間の領域は高度に保存されている〔Myers,G.等、Theo
retical Biology and Biophysics、（1988）〕。
これらの遺伝子の多くは、ウイルスのライフサイクル
に必要な産物をコードする。例えば、tat遺伝子は、HIV
複製及び遺伝子発現に重要な14kDのタンパク質をコード
する〔Rosen,C.A.等、Nature 319:555〜559（1986）;So
droski,J.等、Science 227:171〜173（1985）;Arya等、
Science 229：前掲;Sodroski等、Science 229：前掲;Da
yton,A.等、Cell 44:941〜947（1986）；これらの文献
の記載内容はすべて本明細書に含まれるものとする〕。
複製に必要な別の遺伝子はrev遺伝子である〔Sodroski
等、Nature 321:412〜417（1986）；この文献の記載内
容は本明細書に含まれるものとする〕。
に必要な産物をコードする。例えば、tat遺伝子は、HIV
複製及び遺伝子発現に重要な14kDのタンパク質をコード
する〔Rosen,C.A.等、Nature 319:555〜559（1986）;So
droski,J.等、Science 227:171〜173（1985）;Arya等、
Science 229：前掲;Sodroski等、Science 229：前掲;Da
yton,A.等、Cell 44:941〜947（1986）；これらの文献
の記載内容はすべて本明細書に含まれるものとする〕。
複製に必要な別の遺伝子はrev遺伝子である〔Sodroski
等、Nature 321:412〜417（1986）；この文献の記載内
容は本明細書に含まれるものとする〕。
いくつかのオンコウイルスにおいては、５′LTRとgag
遺伝子開始コドンとの間に存在するcis作用配列がウイ
ルスRNAをビリオンに有効にパッケージするために必要
であることが知見された〔Bender,M.A.等、J.Virol 61:
1639〜1646（1987）;Katz,R.A.等、J.Virol 59:163〜16
7（1986）;Mann,R.等、Cell 33:153〜159（1983）;Puga
tsch,T.等、Virology 128:505〜511（1983）、Watanab
e,S.等、Proc.Natl.Acad.Sci.79:5986〜5990（1983）;E
glitis,M.A.等、Bio Techniques ６:608〜614（198
8）、これらの文献の記載内容は本明細書に含まれるも
のとする〕。これらの配列に加えて、gag遺伝子と部分
的に重複する配列が、Moloneyマウスの白血病ウイルス
においてウイルスRNAのキャプシド封入効率に寄与する
ことが知見された〔Adam,M.A.等、J.Virol.62:3802〜38
06（1988）〕。レンチウイルスRNA（例えばHIV RNA）を
ビリオン粒子にパッケージするために必要なシグナルは
まだ同定されていない。
遺伝子開始コドンとの間に存在するcis作用配列がウイ
ルスRNAをビリオンに有効にパッケージするために必要
であることが知見された〔Bender,M.A.等、J.Virol 61:
1639〜1646（1987）;Katz,R.A.等、J.Virol 59:163〜16
7（1986）;Mann,R.等、Cell 33:153〜159（1983）;Puga
tsch,T.等、Virology 128:505〜511（1983）、Watanab
e,S.等、Proc.Natl.Acad.Sci.79:5986〜5990（1983）;E
glitis,M.A.等、Bio Techniques ６:608〜614（198
8）、これらの文献の記載内容は本明細書に含まれるも
のとする〕。これらの配列に加えて、gag遺伝子と部分
的に重複する配列が、Moloneyマウスの白血病ウイルス
においてウイルスRNAのキャプシド封入効率に寄与する
ことが知見された〔Adam,M.A.等、J.Virol.62:3802〜38
06（1988）〕。レンチウイルスRNA（例えばHIV RNA）を
ビリオン粒子にパッケージするために必要なシグナルは
まだ同定されていない。
HIV−１を解明するために多くの研究が費やされた
が、このレトロウイルスのライフサイクルは完全には解
明されていない。
が、このレトロウイルスのライフサイクルは完全には解
明されていない。
更に、このウイルスに対するワクチンを開発する研究
も多数行なわれているが、成功の報告はいまだ皆無であ
る。その理由の１つは、ウイルスの活性な抗原性部分の
保存の欠如にあり、いま１つは、ウイルスタンパク質及
び／または失活ウイルス粒子の機能的に重要な領域の免
疫原性が弱いことにある。
も多数行なわれているが、成功の報告はいまだ皆無であ
る。その理由の１つは、ウイルスの活性な抗原性部分の
保存の欠如にあり、いま１つは、ウイルスタンパク質及
び／または失活ウイルス粒子の機能的に重要な領域の免
疫原性が弱いことにある。
従って、HIVタンパク質を産生できるプロウイルスで
あり同時に、ウイルスRNAがビリオンに包装されること
ができないために致死性でないプロウイルスを開発する
ことは極めて重要である。このパッケージング欠陥プロ
ウイルスベクターの使用によって、ウイルスのパッケー
ジングメカニズムの研究、及び該パッケージングメカニ
ズムを妨害する戦略の開発のために有用なパッケージン
グ欠陥細胞系の作製が可能であろう。かかるパッケージ
ング欠損（negative）プロウイルスによって産生される
ビリオンの重要性は、ワクチンとして使用できること、
また所望の遺伝子を哺乳類細胞に有効に導入する系とし
ても使用できることである。
あり同時に、ウイルスRNAがビリオンに包装されること
ができないために致死性でないプロウイルスを開発する
ことは極めて重要である。このパッケージング欠陥プロ
ウイルスベクターの使用によって、ウイルスのパッケー
ジングメカニズムの研究、及び該パッケージングメカニ
ズムを妨害する戦略の開発のために有用なパッケージン
グ欠陥細胞系の作製が可能であろう。かかるパッケージ
ング欠損（negative）プロウイルスによって産生される
ビリオンの重要性は、ワクチンとして使用できること、
また所望の遺伝子を哺乳類細胞に有効に導入する系とし
ても使用できることである。
発明の概要 発明者等は、機能性HIV遺伝子産物を発現するHIVゲノ
ムに対応する十分な数のヌクレオチド配列（HIVヌクレ
オチド）を含むが、HIVゲノムの５′主要スプライス供
与部位とgag遺伝子開始コドンとの間のヌクレオチドに
対応する、ウイルスRNAをビリオンに有効にパッケージ
するための十分な数のヌクレオチド（HIVパッケージン
グ配列）を含まないベクターの開発に成功した。好まし
くはこのHIVパッケージング配列は、５′主要スプライ
ス供与部位とgag遺伝子開始コドンとの間の領域に対応
する。より好ましくはこの配列は、５′主要スプライス
供与部位の直ぐ下流からgag開始コドンの約14塩基上流
までのセグメントに対応する。この配列の１つの具体例
は、配列AAAAATTTTGACTAGCGGAを有する19塩基から成る
セグメントである。
ムに対応する十分な数のヌクレオチド配列（HIVヌクレ
オチド）を含むが、HIVゲノムの５′主要スプライス供
与部位とgag遺伝子開始コドンとの間のヌクレオチドに
対応する、ウイルスRNAをビリオンに有効にパッケージ
するための十分な数のヌクレオチド（HIVパッケージン
グ配列）を含まないベクターの開発に成功した。好まし
くはこのHIVパッケージング配列は、５′主要スプライ
ス供与部位とgag遺伝子開始コドンとの間の領域に対応
する。より好ましくはこの配列は、５′主要スプライス
供与部位の直ぐ下流からgag開始コドンの約14塩基上流
までのセグメントに対応する。この配列の１つの具体例
は、配列AAAAATTTTGACTAGCGGAを有する19塩基から成る
セグメントである。
このベクターを使用し、予め選択された細胞系を形質
転換させるとHIVパッケージング欠陥細胞系が得られ
る。好ましくは、細胞系を形質転換するために少なくと
も２つのベクターを用いる。これらのベクターは両者を
合わせるとHIV gag、pol及びenv産物を発現するために
必要なHIVヌクレオチドを含むが、各ベクター単独では
上記の３つの産生物全部を発現するために必要なヌクレ
オチドを含まない。更に、各ベクターは、HIVゲノムの
５′主要スプライス供与部位とgag遺伝子との間のヌク
レオチドに対応する、HIV RNAを有効にパッケージする
ための十分な数のヌクレオチドを含まない。各ベクター
が異なるマーカー遺伝子を含むのが好ましい。形質転換
された細胞系は、HIVビリオンを発現するであろうが、
これらのビリオン内にHIV RNAをパッケージすることは
できないだろう。従ってこれらのビリオンは、抗体を産
生するために使用でき、ワクチンとしてまたはHIVに感
染し得る別の細胞系に所望の遺伝子産物を移入する手段
として使用され得る。
転換させるとHIVパッケージング欠陥細胞系が得られ
る。好ましくは、細胞系を形質転換するために少なくと
も２つのベクターを用いる。これらのベクターは両者を
合わせるとHIV gag、pol及びenv産物を発現するために
必要なHIVヌクレオチドを含むが、各ベクター単独では
上記の３つの産生物全部を発現するために必要なヌクレ
オチドを含まない。更に、各ベクターは、HIVゲノムの
５′主要スプライス供与部位とgag遺伝子との間のヌク
レオチドに対応する、HIV RNAを有効にパッケージする
ための十分な数のヌクレオチドを含まない。各ベクター
が異なるマーカー遺伝子を含むのが好ましい。形質転換
された細胞系は、HIVビリオンを発現するであろうが、
これらのビリオン内にHIV RNAをパッケージすることは
できないだろう。従ってこれらのビリオンは、抗体を産
生するために使用でき、ワクチンとしてまたはHIVに感
染し得る別の細胞系に所望の遺伝子産物を移入する手段
として使用され得る。
詳細な説明 発明者等は、HIVパッケージング欠陥ベクター及び細
胞系の作製が可能であることを知見した。発明者等は、
HIVウイルスの５′主要スプライス供与部位とgag遺伝子
開始コドンとの間の領域が、HIV RNAをビリオンに包装
するために必要な配列を含んでいることを知見した。従
って、所望のHIV産物を発現するための十分な数のHIVゲ
ノム由来のヌクレオチドに対応するヌクレオチド配列を
含むが、５′主要スプライス供与部位とgag遺伝子開始
コドンとの間の領域に対応する、HIV RNAを有効にパッ
ケージするための十分な数のヌクレオチドを含まない包
装欠陥HIVプロウイルスを含むベクターを作製すること
が可能である。
胞系の作製が可能であることを知見した。発明者等は、
HIVウイルスの５′主要スプライス供与部位とgag遺伝子
開始コドンとの間の領域が、HIV RNAをビリオンに包装
するために必要な配列を含んでいることを知見した。従
って、所望のHIV産物を発現するための十分な数のHIVゲ
ノム由来のヌクレオチドに対応するヌクレオチド配列を
含むが、５′主要スプライス供与部位とgag遺伝子開始
コドンとの間の領域に対応する、HIV RNAを有効にパッ
ケージするための十分な数のヌクレオチドを含まない包
装欠陥HIVプロウイルスを含むベクターを作製すること
が可能である。
これらの配列は好ましくは、HIV−１、HIV−２及びサ
ル免疫不全ウイルス（SIV）に対応する〔Ratner等、Nat
ure 313、前掲;Sanchez−Pescador等、Science 227、前
掲;Muesing等、Nature 313、前掲;Wain−Hobson等、Cel
l 40、前掲;Guyader,M.等、Nature 326:662〜669（198
7）;Chakrabarti等、Nature 328:543〜547（1987）;Hir
sch,V.等、Cell 49:307〜319（1987）；これらの文献の
記載内容はすべて本明細書に含まれるものとする〕。
ル免疫不全ウイルス（SIV）に対応する〔Ratner等、Nat
ure 313、前掲;Sanchez−Pescador等、Science 227、前
掲;Muesing等、Nature 313、前掲;Wain−Hobson等、Cel
l 40、前掲;Guyader,M.等、Nature 326:662〜669（198
7）;Chakrabarti等、Nature 328:543〜547（1987）;Hir
sch,V.等、Cell 49:307〜319（1987）；これらの文献の
記載内容はすべて本明細書に含まれるものとする〕。
好ましくはベクターは、５′主要スプライス供与部位
の直ぐ下流にあり且つgag遺伝子開始コドンの直ぐ上流
にあるセグメントに対応するHIVパッケージング配列を
含まない。典型的には、ベクターがgag開始コドンの上
流約14塩基から２塩基までの範囲、例えば上流約14塩基
または５塩基のヌクレオチドを含みながらも依然として
パッケージング欠損であった。１つの実施態様ではベク
ターが、５′主要スプライス供与部位の約９塩基下流か
ら始まりgag開始コドンの約14塩基上流まで続くヌクレ
オチド配列を含まない。残存すべき塩基の数は大幅に違
っていてもよい。例えばHIV−１の19塩基対の欠失即ち
配列AAAAATTTTGACTAGCGGAの欠失は十分にパッケージン
グ能力を喪失させるが（第１図参照）、この領域のより
小さい欠失でさえもパッケージング効果を喪失させる。
実際、この領域の約５塩基の小さい欠失がパッケージン
グ能力を除去できると予測される。従って、当業者は本
発明の開示に基づいて特定の欠失のサイズを容易に決定
できる。
の直ぐ下流にあり且つgag遺伝子開始コドンの直ぐ上流
にあるセグメントに対応するHIVパッケージング配列を
含まない。典型的には、ベクターがgag開始コドンの上
流約14塩基から２塩基までの範囲、例えば上流約14塩基
または５塩基のヌクレオチドを含みながらも依然として
パッケージング欠損であった。１つの実施態様ではベク
ターが、５′主要スプライス供与部位の約９塩基下流か
ら始まりgag開始コドンの約14塩基上流まで続くヌクレ
オチド配列を含まない。残存すべき塩基の数は大幅に違
っていてもよい。例えばHIV−１の19塩基対の欠失即ち
配列AAAAATTTTGACTAGCGGAの欠失は十分にパッケージン
グ能力を喪失させるが（第１図参照）、この領域のより
小さい欠失でさえもパッケージング効果を喪失させる。
実際、この領域の約５塩基の小さい欠失がパッケージン
グ能力を除去できると予測される。従って、当業者は本
発明の開示に基づいて特定の欠失のサイズを容易に決定
できる。
ベクターは、機能性HIV遺伝子産物を発現させるHIVゲ
ノムのヌクレオチドに対応する十分な数のヌクレオチド
を含むHIVヌクレオチドセグメントを含んでいなければ
ならないが、前記のごとく５′主要スプライス供与部位
とgag遺伝子開始コドンとの間の領域に対応する、ウイ
ルスRNAをビリオンに有効にパッケージするための十分
な数のヌクレオチドを含んでいてはならない。これらの
ベクターを使用してHIVパッケージング欠陥細胞系を樹
立するために、かかる細胞系が感染性HIVを全く産生し
ないのが好ましい。これらのパッケージング欠陥ベクタ
ーによって形質転換された細胞系は、細胞がパッケージ
ング欠陥であるため感染力が弱いが、ある種のRNAは依
然としてビリオンにパッケージされ得る。従って、HIV
ヌクレオチドセグメントが全HIVゲノムに対応せず、そ
の結果として、ウイルスRNAがビリオンにパッケージさ
れてもパッケージされたものが複製コンピテントウイル
スにならないのが好ましい。
ノムのヌクレオチドに対応する十分な数のヌクレオチド
を含むHIVヌクレオチドセグメントを含んでいなければ
ならないが、前記のごとく５′主要スプライス供与部位
とgag遺伝子開始コドンとの間の領域に対応する、ウイ
ルスRNAをビリオンに有効にパッケージするための十分
な数のヌクレオチドを含んでいてはならない。これらの
ベクターを使用してHIVパッケージング欠陥細胞系を樹
立するために、かかる細胞系が感染性HIVを全く産生し
ないのが好ましい。これらのパッケージング欠陥ベクタ
ーによって形質転換された細胞系は、細胞がパッケージ
ング欠陥であるため感染力が弱いが、ある種のRNAは依
然としてビリオンにパッケージされ得る。従って、HIV
ヌクレオチドセグメントが全HIVゲノムに対応せず、そ
の結果として、ウイルスRNAがビリオンにパッケージさ
れてもパッケージされたものが複製コンピテントウイル
スにならないのが好ましい。
好ましくは、各々がHIVゲノムの異なる部分を含みウ
イルスパッケージングに必要な配列を含まない２つ以上
の異なるベクターを作製する。次いで、各ベクターを細
胞にコトランスフェクトすると、細胞は全部のHIV構造
タンパク質を発現しビリオンを産生するであろう。１つ
の好ましい実施態様では、ベクターがHIV LTRに対応す
る配列を含まないがプロモーター領域及び／または別の
ゲノムのポリアデニル化配列に対応する配列を含むであ
ろう。特定のプロモーター及びポリアデニル化配列の選
択は特定宿主細胞に基づいて容易に決定され得る。
イルスパッケージングに必要な配列を含まない２つ以上
の異なるベクターを作製する。次いで、各ベクターを細
胞にコトランスフェクトすると、細胞は全部のHIV構造
タンパク質を発現しビリオンを産生するであろう。１つ
の好ましい実施態様では、ベクターがHIV LTRに対応す
る配列を含まないがプロモーター領域及び／または別の
ゲノムのポリアデニル化配列に対応する配列を含むであ
ろう。特定のプロモーター及びポリアデニル化配列の選
択は特定宿主細胞に基づいて容易に決定され得る。
１つの好ましい実施態様では、１つのベクターがenv
の上流にHIVタンパク質を発現させ得る配列を含み、第
２のベクターが残りのタンパク質を発現させ得る配列を
含む。例えば１つのベクターが、gag開始コドンの上流
からenv遺伝子配列までの５′側の多くの遺伝子産物
（５′−most gene products）を発現させるのに十分な
数のヌクレオチドに対応するHIVヌクレオチドセグメン
トを含み、他方のベクターが、gag遺伝子配列の下流に
存在し機能性env遺伝子配列を含む十分な数のヌクレオ
チドに対応するHIVヌクレオチドセグメントを含む。本
明細書の開示に基づいて当業者は、これらのウイルス中
の既知の制限エンドヌクレアーゼ部位を利用し、これら
のベクターをHIVゲノムの発表された配列から化学的に
合成するかまたは多くの入手可能なHIVプロウイルスか
ら誘導し得る。好ましくは、各ベクターに異なるマーカ
ー遺伝子を付加してもよい。即ち、これらの異なるベク
ターを予め選択した細胞系にコトランスフェクトし、両
方のマーカーを含む細胞を捜し出すことによって２つの
ベクターでコトランスフェクトされた細胞系を作製して
もよい。かかる細胞は全てのHIVタンパク質を産生し得
る。しかしながら、ビリオンは産生されるであろうが、
全ウイルス配列に対応するRNAはこれらのビリオンにパ
ッケージされないであろう。必要に応じて３つ以上のベ
クター、例えばgag−polベクターとenvベクターとvif/v
puベクターとを使用することも可能である。
の上流にHIVタンパク質を発現させ得る配列を含み、第
２のベクターが残りのタンパク質を発現させ得る配列を
含む。例えば１つのベクターが、gag開始コドンの上流
からenv遺伝子配列までの５′側の多くの遺伝子産物
（５′−most gene products）を発現させるのに十分な
数のヌクレオチドに対応するHIVヌクレオチドセグメン
トを含み、他方のベクターが、gag遺伝子配列の下流に
存在し機能性env遺伝子配列を含む十分な数のヌクレオ
チドに対応するHIVヌクレオチドセグメントを含む。本
明細書の開示に基づいて当業者は、これらのウイルス中
の既知の制限エンドヌクレアーゼ部位を利用し、これら
のベクターをHIVゲノムの発表された配列から化学的に
合成するかまたは多くの入手可能なHIVプロウイルスか
ら誘導し得る。好ましくは、各ベクターに異なるマーカ
ー遺伝子を付加してもよい。即ち、これらの異なるベク
ターを予め選択した細胞系にコトランスフェクトし、両
方のマーカーを含む細胞を捜し出すことによって２つの
ベクターでコトランスフェクトされた細胞系を作製して
もよい。かかる細胞は全てのHIVタンパク質を産生し得
る。しかしながら、ビリオンは産生されるであろうが、
全ウイルス配列に対応するRNAはこれらのビリオンにパ
ッケージされないであろう。必要に応じて３つ以上のベ
クター、例えばgag−polベクターとenvベクターとvif/v
puベクターとを使用することも可能である。
概していかなる細胞系の使用も可能であるが、好まし
くは哺乳類細胞系、例えばCV−１、Hela、Raji、RD、SW
480またはCHO細胞系を使用する。
くは哺乳類細胞系、例えばCV−１、Hela、Raji、RD、SW
480またはCHO細胞系を使用する。
ウイルス性細胞産生物の産生量を増加するために５′
LTR以外のプロモーターを使用してもよい。例えば５′L
TRに代えて、特定細胞系中でそのコントロール下に遺伝
子を優先的に発現させるプロモーターを使用する。例え
ば、CV−１またはHela細胞中で遺伝子を発現させるには
CMVプロモーターの使用が好ましいであろう。当業者
は、使用される特定の宿主細胞系に基づいて、使用する
特定プロモーターを容易に決定し得る。
LTR以外のプロモーターを使用してもよい。例えば５′L
TRに代えて、特定細胞系中でそのコントロール下に遺伝
子を優先的に発現させるプロモーターを使用する。例え
ば、CV−１またはHela細胞中で遺伝子を発現させるには
CMVプロモーターの使用が好ましいであろう。当業者
は、使用される特定の宿主細胞系に基づいて、使用する
特定プロモーターを容易に決定し得る。
また、ウイルス性細胞産生物のレベルを増加させるた
めに、HIV LTR及び／またはプロモーターを増強するエ
ンハンサー配列をベクターに付加してもよい。当業者は
宿主細胞系に基づいて特定のエンハンサー配列を容易に
決定し得る。
めに、HIV LTR及び／またはプロモーターを増強するエ
ンハンサー配列をベクターに付加してもよい。当業者は
宿主細胞系に基づいて特定のエンハンサー配列を容易に
決定し得る。
ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスのエンハンサー
タンパク質のごとくウイルス産物のレベルを増進するた
めにHIV LTRに作用するウイルス性エンハンサータンパ
ク質または細胞性トランスアクチベーションタンパク質
を発現するベクターを付加することも可能である。細胞
性トランスアクチベーションタンパク質の例は、NF k−
Ｂ、UV光反応性因子及び当業者に公知のその他のＴ細胞
活性化因子である。
タンパク質のごとくウイルス産物のレベルを増進するた
めにHIV LTRに作用するウイルス性エンハンサータンパ
ク質または細胞性トランスアクチベーションタンパク質
を発現するベクターを付加することも可能である。細胞
性トランスアクチベーションタンパク質の例は、NF k−
Ｂ、UV光反応性因子及び当業者に公知のその他のＴ細胞
活性化因子である。
集合させると完全HIVゲノムを含むようになる一連の
ベクターを使用して、ビリオンがHIV RNAを含まないこ
とを除いてはHIVビリオンに等しいビリオンを産生する
細胞系を作製できる。ビリオンはこれらの細胞から容易
に得られる。例えば、細胞を培養し上清を採集する。所
望の用途次第では、ビリオン含有上清を使用してもよ
く、またはこれらのビリオンを標準法で上清から分離し
てもよい。典型的には、勾配遠心、過等で分離する。
ベクターを使用して、ビリオンがHIV RNAを含まないこ
とを除いてはHIVビリオンに等しいビリオンを産生する
細胞系を作製できる。ビリオンはこれらの細胞から容易
に得られる。例えば、細胞を培養し上清を採集する。所
望の用途次第では、ビリオン含有上清を使用してもよ
く、またはこれらのビリオンを標準法で上清から分離し
てもよい。典型的には、勾配遠心、過等で分離する。
これらの弱毒化されたビリオンはワクチンの製造に極
めて有用である。これらのビリオンはHIVビリオンに対
する抗原性応答を生じさせるために使用でき、また、こ
れらのビリオンの内部がウイルスRNAを含まないこと以
外はこれらのビリオンは実際のHIVビリオンと同じであ
るので、製造されるワクチンは特に有効である。
めて有用である。これらのビリオンはHIVビリオンに対
する抗原性応答を生じさせるために使用でき、また、こ
れらのビリオンの内部がウイルスRNAを含まないこと以
外はこれらのビリオンは実際のHIVビリオンと同じであ
るので、製造されるワクチンは特に有効である。
これらのビリオンはまた、ビリオンに対する抗体を増
産するために使用でき、得られた抗体を種々の目的、例
えば、ビリオンのスクリーニング、ビリオンに対する標
的系の開発、等に使用できる。
産するために使用でき、得られた抗体を種々の目的、例
えば、ビリオンのスクリーニング、ビリオンに対する標
的系の開発、等に使用できる。
更に、これらのHIVパッケージング欠陥細胞系は、所
望遺伝子、例えば異種遺伝子（heterologous gene）を
哺乳類細胞に導入する手段として極めて有用である。
望遺伝子、例えば異種遺伝子（heterologous gene）を
哺乳類細胞に導入する手段として極めて有用である。
これらのビリオンは、HIVによって感染され得る標的
細胞に所望の遺伝子配列を包装するための極めて有効な
手段として使用され得る。このためには、HIVウイルス
のパッケージングヌクレオチド（HIV包装領域）に対応
する十分な数のヌクレオチドを含むヌクレオチドセグメ
ントと所定の遺伝子とを含むベクターを調製し、前記パ
ッケージング配列と前記所定の遺伝子とを、パッケージ
ング、逆転写、組込み及び遺伝子発現のための十分な数
のHIV LTR由来の配列に対応する配列と結合させる。使
用されるパッケージング領域は好ましくは、少なくとも
５′主要スプライス供与部位とgag開始コドンの直ぐ上
流との間の領域に対応し、より好ましくは、５′主要ス
プライス供与部位とgag遺伝子のBal I部位との間の領域
に対応する。このベクターを使用してHIVパッケージン
グ欠陥細胞の１つをトランスフェクトすると、このベク
ターに由来のヌクレオチド配列がビリオンにパッケージ
されるであろう。これらの「パッケージされたHIV」遺
伝子は、HIVによって感染され得る細胞の標的となり得
る。この形質転換方法は現行の方法よりもはるかに効率
がよいと期待される。更に、遺伝子を適当に選択するこ
とによって、HIVの感染方法をモニターすることも可能
である。
細胞に所望の遺伝子配列を包装するための極めて有効な
手段として使用され得る。このためには、HIVウイルス
のパッケージングヌクレオチド（HIV包装領域）に対応
する十分な数のヌクレオチドを含むヌクレオチドセグメ
ントと所定の遺伝子とを含むベクターを調製し、前記パ
ッケージング配列と前記所定の遺伝子とを、パッケージ
ング、逆転写、組込み及び遺伝子発現のための十分な数
のHIV LTR由来の配列に対応する配列と結合させる。使
用されるパッケージング領域は好ましくは、少なくとも
５′主要スプライス供与部位とgag開始コドンの直ぐ上
流との間の領域に対応し、より好ましくは、５′主要ス
プライス供与部位とgag遺伝子のBal I部位との間の領域
に対応する。このベクターを使用してHIVパッケージン
グ欠陥細胞の１つをトランスフェクトすると、このベク
ターに由来のヌクレオチド配列がビリオンにパッケージ
されるであろう。これらの「パッケージされたHIV」遺
伝子は、HIVによって感染され得る細胞の標的となり得
る。この形質転換方法は現行の方法よりもはるかに効率
がよいと期待される。更に、遺伝子を適当に選択するこ
とによって、HIVの感染方法をモニターすることも可能
である。
更に、これらのHIVパッケージング欠陥細胞系は、in
vivo及びin vitroの両方の系でHIVのライフサイクルの
種々の時期を研究するために使用され得る。その理由は
細胞がHIV細胞性タンパク質を発現するがRNAをパッケー
ジしないからである。
vivo及びin vitroの両方の系でHIVのライフサイクルの
種々の時期を研究するために使用され得る。その理由は
細胞がHIV細胞性タンパク質を発現するがRNAをパッケー
ジしないからである。
本発明を実施例に基づいてより詳細に以下に説明す
る。これらの実施例は本発明の理解を助けるために提示
されたものであり、本発明の範囲がこの実施例に限定さ
れると解釈してはならない。
る。これらの実施例は本発明の理解を助けるために提示
されたものであり、本発明の範囲がこの実施例に限定さ
れると解釈してはならない。
HIV−1 5′LTRとgag遺伝子との間の領域を第１図に示
す。第１図は、後述するベクターpHBΔP1中の５′主要
スプライス供与部位（SD）及び欠失部位を示す。この領
域の19bpの欠失は、Fisher,A.G.等、Nature 316:262〜2
65（1985）のプラスミドpHXBc2に含まれる感染性HIV−
１プロウイルスクローン中で作製されたものである。こ
のプラスミドはまた、COS−１細胞中で有効な遺伝子発
現を行なわせるSV40起源の複製を有する。Kunkel,T.A.
等、Methods in Enzymology 154:367〜382（1987）に記
載のごとき特定部位の突然変異誘発によって突然変異を
誘発し、DNA配列決定によってその配列を確認した（San
ger,F.等、Proc.Natl.Acad.Sci.74:5463〜5467（197
7））。突然変異したプラスミドをpHXBΔP1と命名し
た。
す。第１図は、後述するベクターpHBΔP1中の５′主要
スプライス供与部位（SD）及び欠失部位を示す。この領
域の19bpの欠失は、Fisher,A.G.等、Nature 316:262〜2
65（1985）のプラスミドpHXBc2に含まれる感染性HIV−
１プロウイルスクローン中で作製されたものである。こ
のプラスミドはまた、COS−１細胞中で有効な遺伝子発
現を行なわせるSV40起源の複製を有する。Kunkel,T.A.
等、Methods in Enzymology 154:367〜382（1987）に記
載のごとき特定部位の突然変異誘発によって突然変異を
誘発し、DNA配列決定によってその配列を確認した（San
ger,F.等、Proc.Natl.Acad.Sci.74:5463〜5467（197
7））。突然変異したプラスミドをpHXBΔP1と命名し
た。
ウイルスタンパク質発現及びビリオン産生に対する突
然変異の効果を鑑定するために、DEAE−デキストラン法
〔Lopata等、Nucl.Acids Res.12:5707〜5717（1984）;Q
ueen ＆ Baltimore、Cell 33:741〜748（1983）;Sodros
ki,J.等、Science 231:1549〜1553（1986）；これらの
文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする〕によ
ってCOS−１細胞にプラスミドpHXBc2及びpHXBΔP1をト
ランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後
に、35S−システインで放射性標識したCOS−１細胞の溶
解液と上清とを19501エイズ患者血清で沈降させた〔Sod
roski,J.等、Science 231、前掲〕。細胞溶解液中で検
出されたウイルスタンパク質の総レベルは、野性型HXBc
2を含むベクター及びHIVパッケージング欠陥HXBΔP1を
含むベクターの双方で同等であった。第2A図を参照され
たい。第2A図は、19501患者血清による35S標識ウイルス
タンパク質の免疫沈降を、DNAによるトランスフェクシ
ョンなし（レーン１及び４）、または10μｇのpHXBc2で
トランスフェクション（レーン２及び５）もしくは10μ
ｇのpHXBΔP1でトランスフェクション（レーン３及び
６）を行なったCOS−１細胞の溶解液（レーン１〜３）
または上清（レーン４〜６）で測定した結果を示す。細
胞溶液中で検出されたウイルスタンパク質の総レベルは
pHXBc2またはpHXBΔP1でトランスフェクトされた細胞の
両方で同等であった。COS−１細胞の上清から沈降した
ウイルスタンパク質の総レベルはpHXBΔP1のほうがpHXB
c2よりもやや低かった。pHXBΔP1でトランスフェクトさ
れたCOS−１細胞の上清中で測定された逆転写酵素（R
T）活性の量は、pHXBc2ベクターでトランスフェクトさ
れた細胞の上清中で測定された量の60％であった（デー
タ示さず）。pHXBΔP1でトランスフェクトされたCOS−
１細胞をトランスフェクションの48時間後に固定して電
子顕微鏡で観察した。正常HIV−１形態をもち出芽形（b
udding form）を含むウイルス粒子が観察された。第2B
図はpHXBΔP1でトランスフェクトされたCOS−１細胞の
電子顕微鏡写真を示す。ウイルス粒子は正常HIV−１形
態を有する。
然変異の効果を鑑定するために、DEAE−デキストラン法
〔Lopata等、Nucl.Acids Res.12:5707〜5717（1984）;Q
ueen ＆ Baltimore、Cell 33:741〜748（1983）;Sodros
ki,J.等、Science 231:1549〜1553（1986）；これらの
文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする〕によ
ってCOS−１細胞にプラスミドpHXBc2及びpHXBΔP1をト
ランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後
に、35S−システインで放射性標識したCOS−１細胞の溶
解液と上清とを19501エイズ患者血清で沈降させた〔Sod
roski,J.等、Science 231、前掲〕。細胞溶解液中で検
出されたウイルスタンパク質の総レベルは、野性型HXBc
2を含むベクター及びHIVパッケージング欠陥HXBΔP1を
含むベクターの双方で同等であった。第2A図を参照され
たい。第2A図は、19501患者血清による35S標識ウイルス
タンパク質の免疫沈降を、DNAによるトランスフェクシ
ョンなし（レーン１及び４）、または10μｇのpHXBc2で
トランスフェクション（レーン２及び５）もしくは10μ
ｇのpHXBΔP1でトランスフェクション（レーン３及び
６）を行なったCOS−１細胞の溶解液（レーン１〜３）
または上清（レーン４〜６）で測定した結果を示す。細
胞溶液中で検出されたウイルスタンパク質の総レベルは
pHXBc2またはpHXBΔP1でトランスフェクトされた細胞の
両方で同等であった。COS−１細胞の上清から沈降した
ウイルスタンパク質の総レベルはpHXBΔP1のほうがpHXB
c2よりもやや低かった。pHXBΔP1でトランスフェクトさ
れたCOS−１細胞の上清中で測定された逆転写酵素（R
T）活性の量は、pHXBc2ベクターでトランスフェクトさ
れた細胞の上清中で測定された量の60％であった（デー
タ示さず）。pHXBΔP1でトランスフェクトされたCOS−
１細胞をトランスフェクションの48時間後に固定して電
子顕微鏡で観察した。正常HIV−１形態をもち出芽形（b
udding form）を含むウイルス粒子が観察された。第2B
図はpHXBΔP1でトランスフェクトされたCOS−１細胞の
電子顕微鏡写真を示す。ウイルス粒子は正常HIV−１形
態を有する。
HIV−１複製に対するpHXBΔP1の突然変異の効果を鑑
定するために、pHXBc2及びpHXBΔP1でトランスフェクト
されたCOS−１細胞からの上清を過（0.2μ）し、RTを
測定した。等量のRT活性を含む突然変異ウイルス及び野
性型ウイルスの上清をJurkatヒトＴリンパ球に添加し
た。２日おきに培地を交換しながらJurkat培養物を疑似
（mock）感染培養物と共に維持した。所定の時期にJurk
at細胞のアリコートを採取して標識し、19501エイズ患
者の血清で免疫沈降させてHIV−１タンパク質の発現を
鑑定した。第３図は、COS−１細胞から得られた上清に
接触したJurkat T細胞の標識ウイルスタンパク質の免疫
沈降を、COS−１細胞を疑似（mock）トランスフェクト
した場合（レーン１、４、７、10、13及び16）、pHXBc2
でトランスフェクトした場合（レーン２、５、８、11、
14及び17）またはpHXBΔP1でトランスフェクトした場合
（レーン３、６、9,12,15及び18）の夫々についてJurka
t T細胞の溶解物（レーン１〜３、７〜９及び13〜15）
または上清（レーン４〜６、10〜12及び16〜18）で測定
した結果である。Jurkat細胞を、感染の７日後（レーン
１〜６）、14日後（レーン７〜12）及び21日後（13〜1
8）に検査した。pHXBΔP1に接触したJurkat培養物は、
野性型ウイルスpHXBc2に接触した培養物に比較してウイ
ルスタンパク質産生の顕著な遅れ及びレベルの低下を示
した。従って、pHXBΔP1でトランスフェクトされたヒト
Ｔリンパ球中のウイルス複製は、pHXBc2によってトラン
スフェクトされた細胞に比較して有意に弱められている
ことが判明した。
定するために、pHXBc2及びpHXBΔP1でトランスフェクト
されたCOS−１細胞からの上清を過（0.2μ）し、RTを
測定した。等量のRT活性を含む突然変異ウイルス及び野
性型ウイルスの上清をJurkatヒトＴリンパ球に添加し
た。２日おきに培地を交換しながらJurkat培養物を疑似
（mock）感染培養物と共に維持した。所定の時期にJurk
at細胞のアリコートを採取して標識し、19501エイズ患
者の血清で免疫沈降させてHIV−１タンパク質の発現を
鑑定した。第３図は、COS−１細胞から得られた上清に
接触したJurkat T細胞の標識ウイルスタンパク質の免疫
沈降を、COS−１細胞を疑似（mock）トランスフェクト
した場合（レーン１、４、７、10、13及び16）、pHXBc2
でトランスフェクトした場合（レーン２、５、８、11、
14及び17）またはpHXBΔP1でトランスフェクトした場合
（レーン３、６、9,12,15及び18）の夫々についてJurka
t T細胞の溶解物（レーン１〜３、７〜９及び13〜15）
または上清（レーン４〜６、10〜12及び16〜18）で測定
した結果である。Jurkat細胞を、感染の７日後（レーン
１〜６）、14日後（レーン７〜12）及び21日後（13〜1
8）に検査した。pHXBΔP1に接触したJurkat培養物は、
野性型ウイルスpHXBc2に接触した培養物に比較してウイ
ルスタンパク質産生の顕著な遅れ及びレベルの低下を示
した。従って、pHXBΔP1でトランスフェクトされたヒト
Ｔリンパ球中のウイルス複製は、pHXBc2によってトラン
スフェクトされた細胞に比較して有意に弱められている
ことが判明した。
上記培養物からの上清を0.2μフィルターで過し、1
2000×ｇで20℃で１時間遠心することによって均等量の
逆転写酵素活性をペレット化した。バナジルリボヌクレ
オチドの存在下にNP40によってウイルスペレットを溶解
し、種々の希釈度のウイルスをニトロセルロースフィル
ターにドットブロットした。ドットブロットする前にい
くつかのサンプルを水酸化ナトリウム（5M、60℃で15分
間）で処理した。Maniatis,T.等、Molecular Cloning、
Cold Spring Harbor Laboratory（1982）、によって記
載された方法で、フィルターを、HIV−１のgag遺伝子及
びenv遺伝子の配列から成るDNAプローブとハイブリダイ
ズし、洗浄し、オートラジオグラフにかけた。野性型HX
Bc2ウイルスの場合、1000RT単位の過上清のブロット
後にRNAに特有のシグナルが検出された。HXBΔP1の場
合、５×104RT単位を有する上清からもシグナルが検出
できなかった。第４図は、Jurkat培養物の過上清のブ
ロット後のRNAドットブロットを、水酸化ナトリウム非
処理（カラム１）及び処理（カラム２）の場合の夫々に
ついて示す。上清は、５×104cpmのHXBΔP1（Ａ列）、
５×104cpmのHXBc2（Ｂ列）、１×105cpmHXBc2（Ｃ列）
のRT活性を含んでいた。これらの結果は、本発明のパッ
ケージング欠陥ウイルスベクターでトランスフェクトさ
れた細胞においてウイルス特異的RNAがビリオンにパッ
ケージされる効率は、野性型ウイルスの２％未満である
ことを示す。
2000×ｇで20℃で１時間遠心することによって均等量の
逆転写酵素活性をペレット化した。バナジルリボヌクレ
オチドの存在下にNP40によってウイルスペレットを溶解
し、種々の希釈度のウイルスをニトロセルロースフィル
ターにドットブロットした。ドットブロットする前にい
くつかのサンプルを水酸化ナトリウム（5M、60℃で15分
間）で処理した。Maniatis,T.等、Molecular Cloning、
Cold Spring Harbor Laboratory（1982）、によって記
載された方法で、フィルターを、HIV−１のgag遺伝子及
びenv遺伝子の配列から成るDNAプローブとハイブリダイ
ズし、洗浄し、オートラジオグラフにかけた。野性型HX
Bc2ウイルスの場合、1000RT単位の過上清のブロット
後にRNAに特有のシグナルが検出された。HXBΔP1の場
合、５×104RT単位を有する上清からもシグナルが検出
できなかった。第４図は、Jurkat培養物の過上清のブ
ロット後のRNAドットブロットを、水酸化ナトリウム非
処理（カラム１）及び処理（カラム２）の場合の夫々に
ついて示す。上清は、５×104cpmのHXBΔP1（Ａ列）、
５×104cpmのHXBc2（Ｂ列）、１×105cpmHXBc2（Ｃ列）
のRT活性を含んでいた。これらの結果は、本発明のパッ
ケージング欠陥ウイルスベクターでトランスフェクトさ
れた細胞においてウイルス特異的RNAがビリオンにパッ
ケージされる効率は、野性型ウイルスの２％未満である
ことを示す。
これらの結果は、ウイルスRNAをビリオンにパッケー
ジするためにはHIV−１の５′LTRとgag遺伝子との間の
領域が重要であることを示す。この領域の突然変異はト
ランスフェクション後のタンパク質及びビリオン粒子を
産生するプロウイルスの能力に対して最小の影響を示す
が、ビリオンRNAのレベルを顕著に低下させてヒトCD4陽
性リンパ球細胞系におけるウイルス複製を弱める。HIV
−１は培養されたCD4陽性細胞中で無細胞伝達または細
胞間伝達によって複製される。後者は感染細胞と非感染
細胞との接触を含む〔Fisher,A.G.等、Nature 316:262
〜265（1985）;Sodroski,J.等、Science 231:1549〜155
3（1986）;Strebel,K.等、Nature 328:728〜730（198
7）〕。
ジするためにはHIV−１の５′LTRとgag遺伝子との間の
領域が重要であることを示す。この領域の突然変異はト
ランスフェクション後のタンパク質及びビリオン粒子を
産生するプロウイルスの能力に対して最小の影響を示す
が、ビリオンRNAのレベルを顕著に低下させてヒトCD4陽
性リンパ球細胞系におけるウイルス複製を弱める。HIV
−１は培養されたCD4陽性細胞中で無細胞伝達または細
胞間伝達によって複製される。後者は感染細胞と非感染
細胞との接触を含む〔Fisher,A.G.等、Nature 316:262
〜265（1985）;Sodroski,J.等、Science 231:1549〜155
3（1986）;Strebel,K.等、Nature 328:728〜730（198
7）〕。
以上の開示に基づき、記載の実施例の多数の変更が本
発明の範囲内で可能であること、本発明の範囲及び思想
は特許請求の範囲のみによって限定されることは当業者
に容易に理解されよう。
発明の範囲内で可能であること、本発明の範囲及び思想
は特許請求の範囲のみによって限定されることは当業者
に容易に理解されよう。
第１図は、本発明の１つの実施態様であるベクターpHXB
ΔP1中の、HIV−１ゲノムの５′LTRからgag開始コドン
までの５′主要スプライス供与部位（SD）及び欠失部位
を示す概略図、第2a図は、COS−１細胞からの35S標識ウ
イルスタンパク質のエイズ患者血清による免疫沈降を示
すオートラジオグラムによる粒子構造の写真、第2b図は
pHXBΔP1でCOS−１細胞にトランスフェクトされた正常H
IV−１形態のビリオン粒子を示す電子顕微鏡による粒子
構造の写真、第３図は、トランスフェクトまたは疑似
（mock）トランスフェクトされたCOS−１細胞の上清に
接触したJurkat T細胞の溶解液または上清からの標識ウ
イルスタンパク質の免疫沈降を示すオートラジオグラム
による粒子構造の写真、第４図はRNAドットブロットテ
ストによる粒子構造の写真である。
ΔP1中の、HIV−１ゲノムの５′LTRからgag開始コドン
までの５′主要スプライス供与部位（SD）及び欠失部位
を示す概略図、第2a図は、COS−１細胞からの35S標識ウ
イルスタンパク質のエイズ患者血清による免疫沈降を示
すオートラジオグラムによる粒子構造の写真、第2b図は
pHXBΔP1でCOS−１細胞にトランスフェクトされた正常H
IV−１形態のビリオン粒子を示す電子顕微鏡による粒子
構造の写真、第３図は、トランスフェクトまたは疑似
（mock）トランスフェクトされたCOS−１細胞の上清に
接触したJurkat T細胞の溶解液または上清からの標識ウ
イルスタンパク質の免疫沈降を示すオートラジオグラム
による粒子構造の写真、第４図はRNAドットブロットテ
ストによる粒子構造の写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウィリアム・エイ・ハセルティン アメリカ合衆国、マサチューセッツ・ 02140、ケンブリッジ、マウント・バー ナン・ストリート・24 (72)発明者 ハインリヒ・ゴットリンガー ドイツ連邦共和国、8000・ミュンヘン・ 71、ブエルムゼーシュトラーセ・50 (72)発明者 アンドリュー・リーバー イギリス国、ロンドン・エス・ダブリ ュ・17・０・アール・イー、セント・ジ ョージス・ホスピタル、メディカル・ス クール―クラナー・テラス（番地なし) (56)参考文献 特表 平３−504079（ＪＰ，Ａ) 国際公開87／6259（ＷＯ，Ａ１) 国際公開88／3167（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (21)
- 【請求項１】（ａ）HIV gag,env及びpolタンパク質をコ
ードするHIVゲノムに対応するヌクレオチド即ちHIVセグ
メントであって、HIV gag,env及びpolタンパク質が組み
合わさって発現されたときにHIVビリオンを形成し得る
ヌクレオチド、及び （ｂ）HIVセグメントに作動的に結合したプロモーター を含むHIVベクターであって、該ベクターはHIV RNAをパ
ッケージするのに必要なHIVパッケージングセグメント
を欠失しており、該パッケージング配列は５′主要スプ
ライス供与部位とgag遺伝子の開始コドンの間に位置
し、ベクターにより発現される前記HIVタンパク質は複
製能を有するHIVウイルスを生じるに十分なHIV RNAを含
まないHIVビリオンを形成し得る、HIVベクター。 - 【請求項２】少なくとも２つのベクター即ち第１ベクタ
ー及び第２ベクターを含むベクター系であって、 （ａ）前記第１ベクターはHIV gag及びpolタンパク質即
ちHIVセグメントをコードするヌクレオチドを含み、HIV
gag及びpolタンパク質が組み合わさって発現されたと
きにHIVビリオンを形成し得、該ベクターはHIV RNAをパ
ッケージするのに必要なHIVパッケージングセグメント
を欠失しており、効率的にHIV RNAをパッケージするの
に必要な該パッケージング配列は５′主要スプライス供
与部位とgag遺伝子の開始コドンの間に位置し、HIV ga
g,env及びpolタンパク質は単一のベクターによってコー
ドされているのではなく、 （ｂ）前記第２ベクターはHIVパッケージング配列の下
流に異種遺伝子を含み、該異種遺伝子はHIV LTRに結合
しており、該第２ベクターはHIV gag,env及びpol遺伝子
を選択的に有しておらず、さらに、 （ｃ）プロモータが作動的にHIVセグメントに結合して
おり、 前記ベクター系は、複製能を有するHIVウイルスを生じ
るに十分なHIV RNAを含まないHIVビリオンを発現し得、
前記パッケージング配列及び異種遺伝子は異種遺伝子を
HIV LTRのパッケージするのに足る部分に結合し、さら
に、前記第２ベクターはHIV gag,env及びpol遺伝子を含
まないことを特徴とするベクター系。 - 【請求項３】HIV env遺伝子をコードするヌクレオチド
を有する第３ベクターを含み、該ベクターはHIV RNAを
パッケージするのに必要なHIVパッケージングセグメン
トを欠失しており、該セグメントは５′主要スプライス
供与部位とgag遺伝子の開始コドンの間に位置し、該ベ
クターはHIV gagとHIV polタンパク質の両方をコードし
ておらず、該ベクターはさらにHIV env遺伝子に作動的
に結合したプロモータを含むことを特徴とする請求項２
に記載のベクター系。 - 【請求項４】プロモーターがHIV LTRであることを特徴
とする請求項１から３のいずれか一項に記載のベクタ
ー。 - 【請求項５】プロモータが特定細胞中で遺伝子産物を優
先的に発現させるプロモータであることを特徴とする請
求項１から３のいずれか一項に記載のベクター。 - 【請求項６】プロモータがCMVプロモータであることを
特徴とする請求項５に記載のベクター。 - 【請求項７】HIVパッケージングセグメントの欠失が、
５′主要スプライス供与部位の下流から、gag遺伝子開
始コドンの５塩基上流までのヌクレオチド配列であるこ
とを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の
ベクター。 - 【請求項８】HIVパッケージングセグメントの欠失が、
５′主要スプライス供与部位の９塩基下流から、gag遺
伝子開始コドンの14塩基上流までのヌクレオチド配列で
あることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に
記載のベクター。 - 【請求項９】HIVパッケージングセグメントの欠失が、
配列AAAAATTTTGACTAGCGGAであることを特徴とする請求
項７に記載のベクター。 - 【請求項１０】HIV遺伝子が、HIV−１、HIV−２及びSIV
からなるグループから選択されることを特徴とする請求
項１から３のいずれか一項に記載のベクター。 - 【請求項１１】HIV遺伝子がHIV−１遺伝子であることを
特徴とする請求項10に記載のベクター。 - 【請求項１２】HIV遺伝子がHIV−１遺伝子であることを
特徴とする請求項９に記載のベクター。 - 【請求項１３】請求項１から３のいずれか一項に記載の
ベクターによって形質転換された細胞系を含むHIVパッ
ケージング欠陥細胞系。 - 【請求項１４】細胞株を請求項１から３のいずれか一項
に記載のベクターで形質転換させることを包含するHIV
パッケージング欠陥細胞系の製造方法。 - 【請求項１５】細胞系が哺乳類細胞であることを特徴と
する請求項14に記載の方法。 - 【請求項１６】細胞が集合的にHIVタンパク質を発現し
てビリオンを形成することができる２つのベクターによ
り形質転換されることを特徴とする請求項14に記載の方
法。 - 【請求項１７】細胞を２つのベクターによって形質転換
させ、１つのベクターがHIV gag開始コドンの上流からe
nv遺伝子配列の上流までのヌクレオチド配列を含み、第
２のベクターがHIV gag遺伝子配列の下流にあり機能性e
nv配列を含むヌクレオチド配列を含むことを特徴とする
請求項14に記載の方法。 - 【請求項１８】各ベクターが異なるマーカー遺伝子配列
を含むことを特徴とする請求項16に記載の方法。 - 【請求項１９】請求項16の方法で形質転換された安定な
細胞系。 - 【請求項２０】（ａ）請求項19に記載の細胞系をHIVパ
ッケージング配列に対応するヌクレオチド配列の下流の
異種遺伝子を含むベクターを用いて形質転換する段階を
含み、HIVパッケージング配列によってパッケージされ
るべきHIV LTRに対応する十分な数のヌクレオチドに対
応した配列は前記異種遺伝子及び前記HIVパッケージン
グ配列の双方を含むセグメントの３′末端及び５′末端
の双方に結合しており、HIVパッケージング配列とHIV L
TR配列とがHIV遺伝子と同じHIVゲノムに対応しており、 更に、 （ｂ）段階（ａ）で形質転換された細胞系を培養し、 （ｃ）段階（ｂ）の細胞系から産生されたビリオンを採
集し、 （ｄ）段階（ｃ）で得られたビリオンを所定の哺乳類細
胞とin vitroで接触させることを特徴とする遺伝子を哺
乳類細胞に移入する方法。 - 【請求項２１】HIVパッケージング配列のヌクレオチド
が、５′主要スプライス供与部位からgag遺伝子のBal I
部位までのヌクレオチドであり、HIV LTR配列が完全なH
IV LTRに対応することを特徴とする請求項20に記載の方
法。
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