ES2240979T3

ES2240979T3 - Enzima para la escision de la region de anclaje de las proteinas superficiales de bacterias gram positivas.

Info

Publication number: ES2240979T3
Application number: ES95936209T
Authority: ES
Inventors: Vincent A. Fischetti; Vijaykumar Pancholi
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1995-10-06
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2015-10-06
Also published as: PT804559E; DE69534252D1; AU697227B2; AU3824095A; JPH10506795A; DE69534252T2; EP0804559B1; US5968763A; ATE296877T1; CA2201616A1; EP0804559A1; EP0804559A4; WO1996011263A1

Abstract

SE PRESENTA UNA ENZIMA QUE SE EXFOLIA EN LA SECUENCIA LPXTGX (N1 ID SEC: 1) DE LAS PROTEINAS SUPERFICIALES DE LA BACTERIA GRAM POSITIVA. LA ENZIMA SE AISLO DE UN GRUPO STREPTOCOCCUS A. ADEMAS SE PRESENTAN UN METODO PARA LA DETECCION DE LA ENZIMA, UN METODO PARA AISLAR LA ENZIMA, Y METODOS DE INHIBICION DE LA ENZIMA. LA FIGURA ES UNA ILUSTRACION ESQUEMATICA DEL POSICIONAMIENTO DE LA PROTEINA SUPERFICIAL EN LA MEMBRANA BACTERIANA, Y EL PASO DE EXFOLIACION QUE LLEVA A LA BACTERIA INFECTIVA.

Description

Enzima para la escisión de la región de anclaje de las proteínas superficiales de bacterias gram positivas.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a una enzima para escindir en el interior de la región de anclaje de pared de una proteína superficial de una bacteria gram-positiva, a un procedimiento para detectar tal enzima, y a un procedimiento para purificar esa enzima. En particular, la enzima se aísla a partir de un Streptococcus de grupo A y escinde la región de anclaje de la proteína estreptocócica M.

2. Descripción de la técnica relacionada

Las bacterias pueden denominarse gram-positivas y gram-negativas, basándose en la tinción de sus paredes celulares con el colorante de Gram. En la amplia división de las bacterias gram positivas están los cocos gram positivos, que incluyen los géneros Aerococcus, Corprococcus, Deinobacter, Deinococcus, Enterococcus, Gemella, Lactococcus, Leuconostoc, Marinococcus, Melissococcus, Micrococcus, Pediococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Planococcus, Ruminococcus, Saccharococcus, Salinicoccus, Carcina, Staphylococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Trichococcus, Vagococcus, Listeria y Actinomyces.

En las bacterias gram-positivas, las proteínas son secretadas al medio que las rodea, mientras que en las bacterias gram-negativas, la secreción tiene lugar en el espacio periplásmico entre el citoplasma y las membranas externas (Model y Russel (1990) Cell 61: 739-741; Schatz y Beckwith (1990) Annu. Rev. Genet. 24: 215-248). Se conciben las señales procarióticas de selección para el ensamblaje local de estructuras supramoleculares como microvellosidades (Strom y Lory, (1987) J. Bacteriol. 169:3181-3188), flagelos (Loewy et al (1987) Genes Dev. 1: 626-635), y bacteriófagos (Brissette y Russel (1990) J. Mol. Biol. 211: 565-580), o para localizar proteínas en compartimentos bacterianos definidos. Dichos compartimentos incluyen la membrana externa de las bacterias gram-negativas (Model y Russel (1990) Cell 61: 739-741), la pared celular (Braun et al (1970) Eur. J. Biochem. 13: 336-346; Eur. J. Biochem. 14: 387-391; Biochemistry 9:5041-5049; Shockman y Barrett (1983) Annu. Rev. Microbiol. 37: 501-527), y el anillo periseptal (MacAlister et al (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 1372-1376).

Puede considerarse que la pared celular de las bacterias gram-positivas representa un único compartimento celular, que contiene proteínas superficiales ancladas que requieren señales específicas de selección. Algunos productos biológicamente importantes se anclan de esta forma, incluyendo la proteína A y las proteínas que se unen a la fibronectina de Staphylococcus aureus y la proteína M de Streptococcus pyogenes. Estudios de la proteína A estafilocócica y de la fosfatasa alcalina de E. coli muestran que la señal, tanto necesaria como suficiente para el anclaje de la pared celular, consiste en el motivo LPXTGX (SEC ID nº:1), un dominio hidrofóbico C-terminal y una cola cargada. Estos elementos secuenciales se conservan en muchas proteínas superficiales de distintas bacterias gram-positivas.

La proteína M de los estreptococos del grupo A, una molécula fibrilar arrollada \alpha-helicoidalmente en forma de cilindro que se encuentra en la superficie del organismo (Fischetti et al (1988) Proteins Struct. Func. Genet. 3:60), es responsable de la propiedad antifagocítica de estas bacterias (Lancefield et al (1962) J. Immunol. 89: 307). La variación antigénica (Jones et al (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8271) y la inmunidad tipo específica depende de los epítopos localizados en el interior de la mitad NH_{2}-terminal de la molécula M (distal a la pared celular) (Jones et al (1988) J. Exp. Med. 167: 1114). Las secuencias aminoácidas que se conservan entre distintas proteínas M se localizan en la mitad COOH-terminal (Jones et al (1985) J. Exp. Med. 161:623; Hollingshead et al (1987) Infect. Immun. 55:3237) y contiene epítopos que se han demostrado recientemente responsables de la inmunidad de tipo no específico contra la colonización estreptocócica (Bessen et al (1988) Infect. Immun, 56: 2666; Fischetti et al (1989) Science (Wash. DC) 244:1487).

La región de unión de la molécula, predicha a partir de la secuencia del ADN, se localiza en el extremo terminal COOH, y está compuesta por aminoácidos cargados en el extremo COOH, seguidos por 19 aminoácidos hidrofóbicos de los que se sospecha constituyen un anclaje de la membrana, seguidos por un motivo hexapeptídico, LPXTGX. Esta región es adyacente a una región rica en glicina y prolina que se sitúa en el interior de la capa de peptoglicanos de la pared celular (Fischetti (1988) Proteins Struc. Func. Genet. 3: 60; Pancholi et al (1988) J. Bacteriol. 170: 2618; Hollingshead et al (1986), J. Biol. Chem. 261: 1677).

La asociación de la proteína M a la membrana citoplásmica de las bacterias gram-positivas puede examinarse después de eliminar la pared celular con la lisina enzimática muralítica (Fischetti et al. (1974) Streptococcal Disease and the Community, M.J. Haverkorn, editor. Excerpta Medica, Amsterdam. 26.), que es activa contra las paredes celulares de estreptococos del grupo A en un amplio intervalo del pH. La proteína M se libera durante la eliminación de la pared celular indicando que un factor endógeno media esta liberación (Pancholi et al (1989) J. Exp. Med. 170: 2119-2133).

El análisis de la forma liberada de la proteína M demuestra que los 19 aminoácidos hidrofóbicos COOH terminales y la cola cargada de la molécula M no está presente (Pancholi et al (1989) J. Exp. Med. 170: 2119-2133). Esto sugiere que la liberación de las proteínas M a partir de la membrana y su unión a la pared celular se asocia de algún modo con la escisión de la región hidrofóbica COOH-terminal.

Se ha mostrado que la escisión de las proteínas superficiales de las bacterias gram-positivas en la región LPXTGX adyacente al dominio hidrofóbico tiene lugar durante el procedimiento de anclaje de estas proteínas (Schneewind et al (1992) Cell 70:267-281). A causa de que la interferencia con esta escisión evita la disposición apropiada de las proteínas superficiales en la célula bacteriana, la caracterización de la enzima responsable de esta escisión constituirá una etapa crítica en el desarrollo antibiótico.

Pancholi et al. (J. Exp. Med. 170(6):2119-2133 (1989)) describe una actividad enzimática endógena que escinde el anclaje de la membrana, con capacidad para liberar la proteína M a partir de los protoplastos aislados de estreptococos. La liberación de las moléculas de la proteína M tiene lugar cuando los protoplastos cargados con ella se disponen en tampón de rafinosa a pH 7,4. Existen pruebas que confirman que la actividad enzimática que escinde el anclaje está unida a la membrana, probablemente como una molécula integral de ésta. Asimismo, se obtuvo una evidencia de la similitud secuencial entre la proteína M y ciertas proteínas ancladas a GPI en la región responsable del anclaje proteico.

Lee et al (Infect. & Immun. 60(10):4032-4039 (1992)) describe cómo las células enteras y los protoplastos de Streptococcus mutans son capaces de liberar sus proteínas superficiales en dependencia del pH, con una liberación óptima entre un pH 5 a 6. Los análisis revelaron que las proteínas liberadas eran muy complejas, no debiéndose probablemente a la actividad proteolítica la liberación de la adhesina P1.

El documento US-A-4598044 describe un péptido cromogénico para el ensayo de la actividad proteásica.

El documento US-A-5235039 describe varios ensayos enzimáticos generales para numerosas muestras.

Por tanto, está claro que lo que se requiere en la presente técnica es un procedimiento para detectar y aislar esta enzima que escinde las proteínas superficiales de bacterias gram-positivas.

Sumario de la invención

De acuerdo con esto, un objetivo principal de la presente invención es proporcionar una enzima aislada y purificada que escinda las proteínas superficiales de bacterias gram-positivas en el interior del motivo LPXTGX.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un anticuerpo dirigido contra la enzima que escinde a las bacterias gram-positivas.

Otro objetivo, aún, de la presente invención, es proporcionar un procedimiento para detectar la presencia de la enzima que escinde las bacterias gram-positivas en el interior del motivo LPXTGX.

Otro objetivo todavía de la presente invención es proporcionar un procedimiento para aislar una enzima que escinda las proteínas superficiales en las bacterias gram-positivas.

Brevemente, la presente invención se refiere a una enzima que escinde una proteína superficial en bacterias gram-positivas, y a un procedimiento para detectarla, que incluye las etapas de: (a) sintetizar un péptido que comprende una secuencia aminoácida de LPXTGX; (b) marcar el péptido de la etapa (a) con un marcador detectable; (c) unir covalentemente el péptido marcado a una perla cromatográfica; (d) mezclar las perlas unidas con un extracto membranoso de bacterias gram-positivas; (e) detectar una liberación del marcador a partir de las perlas; y (f) correlacionar la liberación del marcador con la presencia de la enzima.

La invención se refiere asimismo a anticuerpos dirigidos a la enzima escindidora.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento para aislar la enzima escindidora, que incluye las etapas de: (a) preparar un extracto de la membrana de las bacterias gram-positivas que contiene proteínas unidas a la membrana; (b) fraccionar las proteínas unidas a la membrana mediante cromatografía, utilizando un gradiente salino; y (c) identificar la presencia de la enzima en por lo menos una fracción.

Con los objetivos anteriores y otros, y con las ventajas y características de la invención que se pondrán más claramente de manifiesto a continuación, la naturaleza de la invención se entenderá más claramente haciendo referencia a la descripción detallada que sigue a continuación de las formas de realización preferidas de la invención, y a las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una curva dosis-respuesta con el extracto de carbonato dializado de las membranas D471.

La Figura 2 es una curva de tiempo-respuesta que utiliza un extracto de carbonato de las membranas D471.

La Figura 3 muestra la actividad de escisión de la enzima en presencia de los inhibidores y activadores enzimáticos.

CPM	=	cuentas por minuto
DTT	=	Ditiotreitol
ZnCl_{2}	=	cloruro de zinc
CdOAc	=	acetato de cadmio
CaCl_{2}	=	cloruro cálcico
pHMB	=	ácido parahidroximercuribenzoico
pHMPS	=	ácido parahidroximercurifenilsulfónico.

La Figura 4 es un esquema que muestra el posicionamiento de la proteína superficial en la membrana bacteriana, y la etapa de escisión que conduce a las bacterias infecciosas. Un antibiótico que se dirija a la etapa de escisión da lugar a bacterias no infecciosas.

Descripción detallada de las formas de realización preferidas de la invención

Más particularmente, la presente invención se refiere a procedimientos para detectar y purificar una enzima de escisión que escinde proteínas superficiales de bacterias gram-positivas en un motivo conocido, preferentemente un motivo LPXTGX (SEC ID nº:1), y se refiere asimismo a la enzima purificada de escisión en sí misma.

La enzima de escisión puede aislarse a partir de cualquier bacteria gram-positiva.

Dichas bacterias gram-positivas comprenden los géneros Aerococcus, Corprococcus, Deinobacter, Deinococcus, Enterococcus, Gemella, Lactococcus, Leuconostoc, Marinococcus, Melissococcus, Micrococcus, Pediococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Planococcus, Ruminococcus, Saccharococcus, Salinicoccus, Carcina, Staphylococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Trichococcus, Vagococcus, Listeria y Actinomyces. Las bacterias Gram-positivas conocidas por tener proteínas superficiales que contienen un motivo LPXTGX (SEC ID nº:1) son las siguientes:

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

Una especie más preferida para la presente invención es Streptococcus pyogenes, y la más preferida es la M de tipo 6.

Los protoplastos pueden prepararse a partir de las bacterias mediante cualquiera de los medios que se conocen en la técnica. El cultivo se desarrolla en cualquier medio conocido que soporte el crecimiento de la especie en particular, preferentemente en el caldo de cultivo Todd-Hewitt. Las células, entonces, se centrifugaron y lavaron. Las células se volvieron entonces a suspender en tampón fosfato, a una concentración preferentemente de entre 20 y 100 mM, más preferentemente de 50 mM aproximadamente, y que contiene rafinosa, preferentemente en un porcentaje de entre el 10 y 50%, preferentemente de aproximadamente el 30%, o sacarosa en un porcentaje de aproximadamente entre el 10 y el 30%, preferentemente de aproximadamente el 20%, y EDTA. Se añadió entonces una enzima específica para degradar la pared celular, preferentemente una lisina estreptocócica del Grupo C, fágico asociada, incubándose a una temperatura de aproximadamente 37ºC durante 30 minutos por lo menos.

Las membranas pueden prepararse a partir de los protoplastos utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica, pero preferentemente, mediante tratamientos repetidos de congelación-descongelación en presencia de inhibidores de la proteasa. Las membranas se recuperaron entonces mediante centrifugación a 100.000 x g aproximadamente, se lavaron, y se volvieron entonces a sedimentar en presencia de inhibidores proteásicos.

Como procedimiento para analizar la actividad de escisión de la enzima, y especialmente para analizar la actividad de los mutantes enzimáticos de escisión, pueden prepararse moléculas superficiales diana liberando éstas de la membrana utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica. Preferentemente, la molécula superficial puede liberarse tratando las membranas con carbonato sódico a un pH>9, preferentemente >11, más preferentemente con un valor de 11,5 aproximadamente.

La presencia de la proteína superficial, particularmente de la proteína M, puede identificarse en el sobrenadante utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica, que incluye la separación en el gel SDS-PAGE, transferencia Western, ensayo inmunoenzimático (ELISA), ELISA de captura, RIA y similares. Los anticuerpos para la detección de la proteína M están disponibles en la técnica e incluyen sueros policlonales, tales como el (producido) contra la proteína ColiM6.1 (Fischetti et al (1984) J. Exp. Med. 159: 1083); sueros policlonales para un péptido sintético que corresponde a residuos de la proteína M, tales como los residuos 1-21 (Jones et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8271), o los anti-SM6 (308-327) para los residuos 308-327, los anti-SM6 (339-352) para los residuos 339-352, o los anti-SM6 (381-398) para los residuos 381-398; o el anticuerpo monoclonal 10B6 para un epítopo en la región conservada de la molécula M entre los residuos 275 y 289.

En general, los monoclonales se utilizan a una dilución de 1:100-1:10.000, preferentemente alrededor de 1:1000, y los sueros policlonales se utilizan a una dilución de alrededor de 1:50-1:5000, preferentemente alrededor de
1:500.

La enzima de escisión se detecta preferentemente preparando un substrato sintético marcado de forma detectable. El substrato sintético marcado contiene preferentemente una secuencia LPXTGX (SEC ID nº:1), y más preferentemente contiene una secuencia LPSTGE (SEC ID nº:14). Los procedimientos para la preparación y análisis de dicho péptido sintético son bien conocidos en la técnica.

El péptido sintético puede marcarse con cualquier marcador detectable conocido en la técnica. Preferentemente, este marcador es un isótopo, muy preferentemente el ^{125}I. El péptido sintético marcado se une preferentemente a un substrato, muy preferentemente a una perla disponible comercialmente.

La cepa bacteriana que contiene la enzima de escisión se trata para extraer la membrana bacteriana. Preferentemente, las membranas bacterianas son tratadas con un tampón alcalino, preferentemente tampón carbonato, a un pH de 9 a 13 aproximadamente, preferentemente de aproximadamente 11,5. La extracción se lleva a cabo preferentemente a una temperatura inferior a la ambiental, preferentemente a 0ºC aproximadamente. El extracto de la membrana se mezcla entonces con las perlas marcadas en un tampón apropiado, analizándose la liberación del marcado radioactivo a partir del péptido sintético escindido.

La enzima se aísla a partir del extracto utilizando procedimientos de purificación proteica conocidos en la técnica. En particular, el extracto de la membrana que contiene la actividad de escisión detectada, se somete a técnicas cromatográficas que separan las proteínas que se encuentran en el extracto según su tamaño, afinidad y carga. Las fracciones obtenidas de cada etapa cromatográfica se analizan con respecto a la actividad de escisión tal como se ha descrito anteriormente, y se someten a ulteriores etapas de purificación. Un procedimiento particularmente preferido para obtener la enzima de escisión purificada es la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Después de que la enzima se haya purificado, su secuencia aminoácida puede determinarse utilizando procedimientos de secuenciación aminoácida conocidos en la técnica. Un procedimiento particularmente preferido es la degradación de Edman. Habiendo obtenido información secuencial mediante la enzima de escisión, se pueden diseñar sondas oligonucleótidas para aislar el ADN que codifica la enzima de escisión, utilizando procedimientos convencionales de rastreo, o procedimientos de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Es preferible particularmente diseñar dichos oligonucleótidos de una forma completamente degenerada, de tal manera que los oligonucleótidos que contenga cada codón que codifica un aminoácido particular, se encuentren en la mezcla oligonucleótida. Alternativamente, la inosina puede utilizarse en posiciones en el codón en las que se sabe que se encuentran degeneraciones.

En general, los procedimientos para aislar el ADN que codifica la enzima de escisión, sometiéndolo a digestión parcial, aislando (los) fragmentos de ADN, uniendo los fragmentos en un vector de clonación y transformado un huésped, son bien conocidos en la tecnología del ADN recombinante. De acuerdo con esto, un experto en la materia puede utilizar o adaptar los protocolos detallados para dichos procedimientos, tal como se encuentran en Sambrook et al. (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 3 volúmenes, o en cualquier otro manual sobre tecnología del ADN recombinante.

Una vez que se ha obtenido a partir de una especie el gen que codifica la enzima de escisión del LPXTGX (SEC ID nº:1), puede servir como una sonda de hibridación para aislar los genes correspondientes de otras especies mediante hibridación cruzada bajo condiciones de baja a moderada restricción. Dichas condiciones se encuentran habitualmente de modo empírico determinando las condiciones en las que la sonda hibridiza cruzada y específicamente a su gen opuesto con una mínima hibridación anterior. La hibridación de ácidos nucleicos es una técnica bien conocida y que se detalla en profundidad en Sambrook et al.

Tal como se consideró anteriormente, el ADN que codifica la enzima de escisión puede aislarse originariamente utilizando la PCR. Los ADNs correspondientes de otras especies pueden aislarse asimismo utilizando la PCR, y los oligonucleótidos para realizar estas subsiguientes reacciones PCR pueden optimizarse utilizando la información secuencial obtenida a partir del ADN clonado de las primeras especies.

También pueden producirse los ácidos nucleicos que codifican los genes objeto en vectores de expresión capaces de replicación y los huéspedes transformados que contienen estos vectores. Los vectores de expresión capaces de replicación pueden también utilizarse para obtener los polipéptidos de la presente invención, mediante procedimientos que son bien conocidos en la tecnología del ADN recombinante.

Los vectores de expresión capaces de replicación pueden comprender un ácido nucleico que codifica el gen objeto, es decir, la secuencia codificante está unida operativamente en un marco de lectura apropiado a un elemento de la secuencia nucleótida que dirige la expresión del enzima de escisión. En particular, los elementos de la secuencia nucleótida pueden incluir un promotor, un elemento de potenciación de la transcripción, una señal de finalización, una señal de traducción, o una combinación de dos o más de estos elementos, que incluyen generalmente por lo menos un elemento promotor.

Los vectores de expresión capaces de replicarse son generalmente moléculas de ADN que se construyen para la expresión controlada de un gen deseado, especialmente si se desea producir grandes cantidades de un producto génico particular, o un polipéptido. Los vectores comprenden una o más secuencias nucleótidas que se unen operativamente a un gen para controlar la expresión de ese gen, el gen que va a expresarse, y un origen de replicación, que es capaz de operar en el huésped que se considera. Preferentemente, el vector codifica un marcador seleccionable, por ejemplo, la resistencia a los antibióticos. Los vectores de expresión capaces de replicarse pueden ser plásmidos, bacteriófagos, cósmidos y virus. También se considera cualquier vector de expresión que comprenda ARN. Los vectores de expresión capaces de replicarse pueden expresar la enzima de escisión en grandes cantidades. Muchos de estos vectores se basan en pBR322, M13 y lambda, y son bien conocidos en la técnica, utilizando promotores tales como trp, lac, P_{L} T7 polimerasa y similares. Por lo tanto, el experto en la materia tiene muchas posibilidades de selección de vectores de expresión capaces de replicarse, huéspedes compatibles, y procedimientos bien conocidos para obtener y utilizar los vectores.

Además, también se consideran los péptidos y fragmentos, así como los derivados químicamente modificados de la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1). Brevemente, se considera cualquier fragmento peptídico, derivado o análogo que conserve sustancialmente la misma actividad biológica de la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1). Un análogo puede definirse en la presente memoria como un péptido o fragmento que exhibe una actividad de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1), pero posee una sustitución, inserción o deleción aminoácida en comparación con la enzima de escisión de tipo salvaje. Dicho análogo puede prepararse mediante la sustitución "conservadora" de un aminoácido que tenga propiedades químicas similares.

Así, también se apreciará que no sólo puedan producirse las secuencias de ADN que codifican una enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº1) que tenga la misma secuencia aminoácida que la enzima de tipo salvaje, sino que asimismo, puedan producirse aquellas secuencias de ADN que están degeneradas con respecto a la secuencia de tipo salvaje. "Están degeneradas con respecto a" significa que se utiliza un codón de tres letras distinto para especificar un aminoácido particular. Es bien conocido en la técnica que los siguientes codones pueden utilizarse de modo intercambiable para codificar cada aminoácido específico:

Fenilalanina (Phe o F)	UUU o UUC
Leucina (Leu o L)	UUA o UUG o CUU o CUC o CUA o CUG
Isoleucina (Ile o I)	AUU o AUC o AUA
Metionina (Met o M)	AUG
Valina (Val o V)	GUU o GUC de GUA o GUG
Serina (Ser o S)	UCU o UCC o UCA o UCG o AGU o AGC
Prolina (Pro o P)	CCU o CCC o CCA o CCG
Treonina (Thr o T)	ACU o ACC o ACA o ACG
Alanina (Ala o A)	GCU o GCG o GCA o GCG
Tirosina (Tyr o T)	UAU o UAC
Histidinac (His o H)	CAU o CAC
Glutamina (Gln o Q)	CAA o CAG
Asparagina (Asn o N)	AAU o AAC
Lisina (Lys o K)	AAA o AAG
ácido aspártico (Asp o D)	GAU o GAC
ácido glutámico (Glu o E)	GAA o GAG
Cisteína (Cys o C)	UGU o UGC
Arginina (Arg o R)	CGU o CGC o CGA o CGG o AGA o AGG
Glicina (Gly o G)	GGU o GGC o GGA o GGG
Codón de finalización	UAA (ocre) o UAG (ámbar) o UGA (ópalo).

Deberá entenderse que los codones que se especifican anteriormente son para las secuencias de ARN. Los codones correspondientes para el ADN tienen la T sustituida por la U.

Las mutaciones pueden llevarse a cabo en la secuencia de tipo salvaje, de forma que un codón particular se cambia a un codón que codifica un aminoácido distinto. Dicha mutación se realiza generalmente llevando a cabo los mínimos cambios nucleótidos posibles. Una mutación de sustitución de este tipo puede realizarse para cambiar un aminoácido en la proteína resultante de una manera no conservadora (es decir, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a una grupo de aminoácidos que tienen un tamaño o característica particular, a un aminoácido que pertenece a otro grupo) o de una manera conservadora (es decir, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tienen un tamaño o característica particular, a un aminoácido que pertenece al mismo grupo). Dicho cambio conservador conduce generalmente a un cambio menor en la estructura y función de la proteína resultante. Un cambio no conservador es más proclive a alterar la estructura, actividad o función de la proteína resultante.

A continuación se da un ejemplo de varios grupos aminoácidos:

Aminoácidos con grupos R no polares

Alanina

Valina

Leucina

Isoleucina

Prolina

Fenilalanina

Triptófano

Metionina.

Aminoácidos con grupos R polares no cambiados

Glicina

Serina

Treonina

Cisteína

Tirosina

Asparagina

Glutamina.

Aminoácidos con grupos R polares cargados (cargados negativamente a pH 6,0)

ácido aspártico

ácido glutámico.

Aminoácidos básicos (cargados positivamente a pH 6,0)

Lisina

Arginina

Histidina (a pH 6,0).

Otro grupo puede consistir en aquéllos aminoácidos con grupos fenilos:

Fenilalanina

Triptófano

Tirosina.

Otro grupo puede constituirse según el peso molecular (es decir, tamaño de los grupos R):

Glicina	75
Alanina	89
Serina	105
Prolina	115
Valina	117
Treonina	119
Cisteína	121
Leucina	131
Isoleucina	131
Asparagina	132
Ácido aspártico	133
Glutamina	146
Lisina	146
Ácido glutámico	147
Metionina	149
Histidina (pH 6)	155
Fenilalanina	165
Arginina	174
Tirosina	161
Triptófano	204.

Sustituciones particularmente preferidas son:

- Lys por Arg y viceversa, de forma que pueda mantenerse una carga positiva;

- Glu por Asp y viceversa, de forma que pueda mantenerse una carga negativa;

- Ser por Thr, de forma que pueda mantenerse un -OH libre; y

- Gln por Asn, de forma que pueda mantenerse un NH_{2} libre.

Las sustituciones aminoácidas pueden también introducirse para sustituir un aminoácido con una propiedad particularmente preferida. Por ejemplo, una Cys puede introducirse en un sitio potencial para el puente disulfuro con otra Cys. Una His puede introducirse como un sitio particularmente "catalítico" (es decir, His puede actuar como un ácido o una base y constituye el aminoácido más habitual en la catálisis bioquímica). Pro puede introducirse a causa de su estructura particularmente planar, que induce giros \beta en la estructura proteica.

La purificación de la enzima de escisión del sujeto LPXTGX (SEC ID nº:1) a partir de fuentes naturales o recombinantes, puede realizarse mediante medios de purificación convencionales tales como la precipitación mediante sulfato amónico, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de adsorción, cromatografía de afinidad, cromatoenfoque, HPLC, FPLC, y similares. En los cuales procedimientos, las etapas apropiadas de purificación pueden llevarse a cabo en tanques o en columnas.

Los fragmentos peptídicos de la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1) pueden prepararse mediante proteolisis o degradación química. Las enzimas proteolíticas típicas son la tripsina, quimiotripsina, proteasa V8, subtilisina y similares; las enzimas se encuentran disponibles comercialmente y los protocolos para realizar los digestos proteolíticos son bien conocidos. Los fragmentos peptídicos se purifican mediante medios convencionales, tal como se ha descrito anteriormente. Los fragmentos peptídicos pueden identificarse a menudo mediante la composición aminoácida o secuencia. Los fragmentos peptídicos son útiles como inmunógenos para obtener anticuerpos contra la enzima de escisión del sujeto LPXTGX (SEC ID nº:1).

La presente invención se refiere asimismo a anticuerpos para la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº1). Dichos anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y se consideran útiles para desarrollar ensayos de detección (inmunoensayos) para las proteínas enzimáticas de escisión, para controlar los niveles de los enzimas de escisión y para purificar éstos. Así, según la presente invención, un anticuerpo para una enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1) abarca anticuerpos monoclonales o policlonales para dicha enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1), o para partes antigénicas suyas.

Tanto los anticuerpos policlonales como los monoclonales para la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1) pueden obtenerse mediante inmunización de un animal con la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1) purificada, la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1) recombinante purificada, fragmentos de estas proteínas, o proteínas de fusión purificadas de la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1) con otra proteína. En el caso de los anticuerpos monoclonales, pueden servir como inmunógenos proteínas o fragmentos parcialmente purificados. Los procedimientos para obtener ambos tipos de anticuerpos son bien conocidos en la técnica, encontrándose excelentes protocolos para la producción de los anticuerpos en Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pág. 726.

Los sueros policlonales se preparan de modo relativamente fácil, inyectando a un animal apropiado de laboratorio una cantidad efectiva de la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1) purificada o de partes suyas, recuperando el suero del animal, y aislando sueros específicos mediante cualquiera de las técnicas inmunoadsorbentes conocidas. Los anticuerpos producidos mediante este procedimiento, son útiles en virtualmente cualquier tipo de inmunoensayo.

Los anticuerpos monoclonales son particularmente útiles, porque pueden producirse en grandes cantidades y con un alto grado de homogeneidad. Fusionando una progenie celular inmortal con linfocitos sensibilizados contra la preparación inmunogénica, se preparan progenies celulares hidridómicas que producen anticuerpos monoclonales, llevándose a cabo mediante procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la materia. (Véase, por ejemplo, Douillard, I.Y. y Hoffman, T., "Basic Facts About Hybridomas", en Compendium of Immunology, Vol. II, L. Schwartz (Ed.) (1981); Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975) y European Journal of Immunology 6: 511-519 (1976); Harlow et al,; Koprowski, et al., patente U.S. nº 4.172.124; Koprowski et al., patente U.S. nº 4.196.265 y Wands, patente U.S. nº 4.271.145.

La presencia de la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1) en una muestra, tal como un sobrenadante de cultivo y similares, en un microorganismo, o en cualquier otra fuente de la que se sospeche contenga la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1), puede detectarse utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales, preparados tal como se ha mencionado anteriormente, en virtualmente cualquier tipo de inmunoensayo. De este modo, estos anticuerpos pueden utilizarse para identificar microorganismos que tengan o produzcan la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1). De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar una enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1) mediante las etapas de poner en contacto una muestra de la que se sospeche que contiene dicha enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1), con un anticuerpo de la invención, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar un complejo enzima-anticuerpo, sometiendo este complejo a medios de detección. Como es conocido por los expertos en la materia, el tiempo y condiciones para los ensayos de inmunodetección son variables y dependen del ensayo particular.

Está disponible una amplia variedad de técnicas y condiciones de detección para el experto en la materia, como puede apreciarse tomando como referencia las patentes U.S. nº 4.016.043; nº 4.424.279 y nº 4.018.653 y a Harlow et al, que proporcionan protocolos extensos para la inmunodetección de moléculas. Estas técnicas, por supuesto, incluyen tanto ensayos den sitios únicos como en sitios dobles, o ensayos "sándwich", ensayos de tipo no competitivo, así como ensayos de unión competitiva, ELISA; radioinmunoensayos, inmunoprecipitación e inmunotransferencia (Transferencia Western). Los ensayos sándwich se utilizan habitualmente, existen diversas variaciones de la técnica, y todas tienen el propósito de incluirse en la presente invención.

Inmunoensayos directos e indirectos, es decir, ELISA, inmunotransferencia y similares, pueden utilizar moléculas informadoras unidas a un anticuerpo primario (ensayo directo) o a un anticuerpo secundario, o a una proteína anticuerpo específica tal como la Proteína A o la Proteína G (ensayo indirecto). El anticuerpo primario puede ser un anticuerpo de la invención objeto marcado con la molécula informadora deseada.

Por "molécula informadora", tal como se utiliza en la presente memoria, se quiere significar una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal identificable para detectar los complejos antígeno-anticuerpo. La detección puede ser cualitativa o cuantitativa. Las moléculas informadoras utilizadas más habitualmente son enzimas, fluoróforos, o moléculas que contienen radionúclidos (es decir, isótopos radioactivos). En el caso de un inmunoensayo enzimático, una enzima se conjuga al anticuerpo, generalmente mediante glutaraldehído o peryodato. Como fácilmente se reconocerá, sin embargo, existe una amplia variedad de distintas técnicas de conjugación, que están fácilmente disponibles para el experto en la materia. Las enzimas que se utilizan habitualmente incluyen la peroxidasa de rábano, glucosa oxidasa, \beta-galactosidasa, y fosfatasa alcalina, entre otras. El substrato a utilizar con una enzima particular se selecciona generalmente para producir un cambio de color detectable después de la reacción. Por ejemplo, el p-nitrofenil fosfato es apropiado para utilizar con conjugados de la fosfatasa alcalina; para los conjugados de la peroxidasa, pueden utilizarse habitualmente la 1,2-fenilendiamina, el ácido 5-aminosalicílico, o la toluidina. Es posible asimismo utilizar substratos fluorogénicos, que dan lugar a un producto fluorescente, más que los substratos cromogénicos que se consideraron anteriormente. Después de unir un anticuerpo marcado con una enzima a un antígeno o complejo antígeno-anticuerpo, de forma apropiada, el anticuerpo marcado en exceso se elimina, y se añade una solución que contiene el substrato apropiado. El substrato reacciona con la enzima, es decir, la molécula informadora, para dar una señal visual cualitativa o una señal cuantitativa que puede evaluarse para indicar la cantidad del antígeno que se encuentra en la muestra.

Alternativamente, compuestos fluorescentes, tales como la fluoresceína y la rodamina, pueden acoplarse químicamente a anticuerpos sin alterar su capacidad de unión. Tal como se utiliza en la inmunofluorescencia, cuando un anticuerpo marcado con un fluoróforo es activado iluminándolo con una luz de longitud de onda específica, absorbe la energía luminosa, induciendo al fluoróforo a un estado de excitación al que sigue la emisión de luz con una longitud de onda característica. Generalmente, la luz que se emite constituye un color característico en el espectro visible y es detectable con un microscopio óptico equipado para inmunofluorescencia. Los anticuerpos fluorescentes se utilizan en ensayos sándwich y en inmunoensayos directos e indirectos tal como se ha descrito anteriormente, y excepto después de lavado, el complejo inmune se expone a la luz de una longitud de onda apropiada, observándose la fluorescencia. La inmunofluorescencia y las técnicas de inmunoensayo basadas enzimáticamente están ambas bien establecidas en la técnica y son particularmente preferidas. Sin embargo, otras moléculas informadoras tales como isótopos radioactivos, moléculas quimioluminiscentes o bioluminiscentes, pueden asimismo utilizarse. Será fácil para el experto en la materia variar el procedimiento para lograr la finalidad requerida.

Otro aspecto de la invención proporciona un medio para purificar una enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1) mediante selección por afinidad. Este procedimiento implica contactar una muestra que contiene la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1) con un anticuerpo de la invención, y separar el complejo antígeno-anticuerpo, es decir, el complejo enzima-anticuerpo del resto de la muestra y recuperar la enzima en una forma que esté libre del anticuerpo. Típicamente, la muestra que contiene el complejo se fracciona y la fracción o fracciones que contienen la enzima se identifican mediante medios convenientes de detección bioquímica, enzimática, inmunológica u otros. Para facilitar el fraccionamiento dichos anticuerpos pueden unirse a una resina cromatográfica antes o después de unirse a la enzima de escisión. Este procedimiento puede producir la enzima de escisión purificada en grandes cantidades y en forma pura.

De acuerdo con esto, puede prepararse asimismo un equipo para el ensayo conveniente y rápido de una enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1), en muestras en las que se sospeche que contienen la enzima. El equipo puede contener un anticuerpo dirigido a la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1), y un anticuerpo secundario detectable, o puede contener un substrato marcado para la enzima, de tal forma que, en presencia de ésta, se detecte un producto de escisión marcado.

Otro aspecto se refiere a un procedimiento para detectar el ADN o el ARN que codifica la enzima de escisión en el LPXTGX sujeto (SEC ID nº:1), mediante técnicas de hibridización de ácidos nucleicos tales como la transferencia Southern, la transferencia Northern y similares, o mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). De acuerdo con esto, se proporciona un procedimiento para detectar una enzima de escisión que comprende contactar una muestra que se sospecha contiene dicho ADN codificante de la enzima de escisión, con un primer ácido nucleico suficientemente complementario para hibridizar un segundo ácido nucleico que codifica dicha enzima de escisión en dicha muestra, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para llevar a cabo dicha hibridización y por tanto, formar un complejo de dichos primer y segundo ácidos nucleicos y someter dicho complejo a un medio de detección. En este procedimiento, el primer ácido nucleico puede tener un grupo informador unido a él. Los grupos informadores pueden incluir isótopos radioactivos, grupos que se detectan enzimáticamente tales como biotina, o fluoróforos tales como rodamina y fluoresceína. En Sambrook et al. se encuentran procedimientos detallados para la hibridización y transferencia.

Para la PCR, el procedimiento para detectar un gen que codifica la enzima de escisión en LPXTGX (SEC ID nº:1) comprende someter una muestra que se sospecha contiene la enzima de escisión, a una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando por lo menos dos iniciadores oligonucleótidos suficientemente complementarios para hibridizar a un ácido nucleico en dicha muestra, que codifique dicha enzima de escisión, produciendo, por lo tanto, por lo menos, un segmento amplificado de ácido nucleico e identificar dicho segmento. La PCR se ha descrito en las patentes U.S. nº 4.683.195; nº 4.683.202; y nº 4.800.159 que se incorporan en la presente memoria como referencia, habiendo sido asimismo descrita extensamente en la literatura, véase por ejemplo Saiki et al. (1988), Science 239:487-491. El segmento puede detectarse mediante electroforesis en gel o transferencia, por ejemplo.

Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar de modo más completo las formas de realización preferidas de la invención. Sin embargo, no deben de ninguna forma contemplarse a título del amplio alcance de la invención.

Ejemplo 1 Preparación de un substrato sintético para la detección de la actividad de escisión

Se diseñó un péptido sintético con la siguiente secuencia aminoácida (SEC ID nº:18):

: K R Q L P S T G E T A N P F Y

Este péptido se preparó mediante el procedimiento en fase sólida de Barany y Merrifield (1979) En Gross y J. Meienhofer, (ed.), Academic Press, Inc., New York, págs 1 a 284, que se incorpora completo como referencia, y que se purificó mediante cromatografía líquida de alta presión en una columna Brownlee C8 de fase inversa (Brownlee Laboratories, Santa Clara, CA) con un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,05%. La secuencia se comprobó mediante composición aminoácida y análisis de la secuencia, de la forma siguiente:

Para el análisis de aminoácidos, se hidrolizaron los péptidos en HCl 6N a 110ºC durante 22 horas y se derivatizaron con etanol-trietilamina-agua-fenilisotiocianato (7:1:1:1) en una estación de trabajo Picotag (Waters Associates, Inc., Milford, MA), analizándose con una columna Novapak C18 (Waters) y un Módulo de Datos Waters 840.

El análisis de la secuencia aminoácida se realizó mediante el modelo de degradación de Edman automatizado en un secuenciador de fase de gas modelo 470A (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los aminoácidos fenilhidantoínicos se identificaron mediante cromatografía líquida de alta presión en una columna C18 con un analizador 1084B (Hewlett-Packard Co, Rockville, MD) o bien un modelo de analizador 120A PTH (Applied Biosystems). Para el análisis de los amino azúcares, se hidrolizaron los péptidos en HCl 4 N a 100ºC durante 7 horas. Se derivatizaron entonces y se analizaron tal como se describe anteriormente para el análisis de aminoácidos con una columna C18 Novapak (Waters).

El péptido purificado contenía la secuencia LPSTGE (SEC ID nº: 14) flanqueada a cada lado por los aminoácidos que se encontraban en esta posición en la molécula de la proteína M estreptocócica. Como marcador, se secuenció el péptido con una tirosina (Y) en el extremo C-terminal, de forma que pudiera marcarse con ^{125}I.

El péptido se marcó radioactivamente con ^{125}I utilizando perlas de yodo, y se purificó entonces el péptido marcado en una columna Sephadex G10 y se unió covalentemente por su extremo N-terminal y por EDC (etil-3-(3 dietilaminopropil)carbodiimida HCl) a un brazo extendido sobre una perla disponible comercialmente (3M Emphase Biospheres AB1 de Pierce, Rockford, IL), eliminándose el marcaje radioactivo en exceso lavando las perlas con tampón de NaCl 1M.

Ejemplo 2 Detección de la actividad de escisión en extractos de la membrana estreptocócica

La cepa D471 estreptocócica M de tipo 6 se trató con carbonato sódico 0,1 M (pH 11,5) y se incubó durante 30 minutos a 0ºC para extraer las membranas estreptocócicas.

El extracto resultante se mezcló con las perlas marcadas del Ejemplo 1 (muestra de 50 \mul, 50 \mul de 50 mM Tris HCl (pH 8,0) con 10 mM DTT). El marcaje radioactivo se liberó en dependencia del tiempo y de la dosis, tal como se aprecia en las Figuras 1 y 2. Los controles que utilizaron detergente no iónico, y los tampones que contenían una alta concentración de sales, fueron incapaces de liberar la actividad enzimática, sugiriendo que la actividad enzimática de escisión estaba firmemente asociada con la membrana estreptocócica. Sin embargo, las membranas que se extrajeron con carbonato sódico 0,1 M, pH 11,5, demostraron actividad de escisión.

Ejemplo 3 Aislamiento de la enzima de escisión

El extracto de carbonato se cromatografió en una columna cromatográfica de perfusión 20 HQ, utilizando un instrumento Biocad Sprint (Perceptive Biosystem), empleando un gradiente de NaCl de entre 0 mM y 500 mM (24,9 ml)
seguido por un gradiente de entre 500 mM y 1000 mM (33,2 ml). Para medir la actividad enzimática que se encontró en las fracciones, una muestra de 50 \mul de cada fracción se mezcló en un tampón de reacción con un volumen final de 100 \mul que contenía 5 mM DTT y 5 \mul del substrato-perla, tal como se describe en el Ejemplo 1. Las muestras de control que contenían sólo tampón y el substrato, se mezclaron asimismo y se incubaron a 37ºC durante 4 horas bajo rotación lenta y constante. La radioactividad liberada se midió entonces en 25 \mul del sobrenadante obtenido después de centrifugación. La actividad específica se midió después de restar los valores de control de las muestras del ensayo.

La actividad enzimática se eluyó en un pico obtenido entre un gradiente de 0,6 M a 0,7 M NaCl (es decir, entre 37,5 y 43,2 mSiemans de conductividad) en un total de 6 fracciones de 1 ml cada una. Se descubrió que la radioactividad específica que se liberó en estas fracciones estaba entre 6000 y 11000 cpm comparada con otras fracciones en las que los valores variaron entre 0 y 1000 cpm.

Ejemplo 4 Propiedades de la enzima de escisión

La Figura 3 muestra la actividad enzimática del extracto de carbonato de las membranas (como fuente enzimática) en presencia de varios inhibidores y activadores.

Se descubrió que la actividad se potenciaba en presencia de 5 mM DTT y de cationes divalentes tales como el calcio.

Cada 1 mM de ácido parahidroximercuribenzoico (PHMB) y de ácido parahidroximercurifenilsulfónico (PHMPS) inhibió la actividad de escisión.

Estos resultados indican que la enzima es sulfhidrilo dependiente.

Ejemplo 5 Determinación del sitio de escisión

Se analizó el péptido sintético escindido marcado utilizando la secuenciación del extremo C y/o el análisis aminoácido para determinar el sitio exacto de la escisión, y las regiones óptimas que franquean al sitio diana LPXTGX (SEC ID nº:1).

Aunque la presente invención se ha descrito e ilustrado en la presente memoria haciendo referencia a diversos procedimientos, ejemplos y material específico, se comprende que no se restringe a las combinaciones particulares del material y de los procedimientos que se seleccionaron con esta finalidad. Pueden considerarse numerosas variaciones de dichos detalles, tal como se apreciará por los expertos en la materia.

Claims

1. Enzima purificada y aislada que escinde las proteínas superficiales de bacterias gram-positivas en el interior del motivo LPXTGX (SEC ID nº:1).

2. Enzima según la reivindicación 1, en la que la bacteria es Streptococcus, preferentemente un Streptococcus del grupo A.

3. Enzima según la reivindicación 1 ó 2, en la que la proteína superficial enzimática es una proteína M, y, preferentemente, la secuencia aminoácida del motivo es LPSTGE (SEC ID nº:14).

4. Enzima según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se ha aislado de bacterias gram-positivas preferentemente de Streptococcus, más preferentemente de un Streptococcus del grupo A.

5. Enzima según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la actividad de escisión de la enzima es potenciada en presencia de un agente reductor, preferentemente ditiotreitol.

6. Enzima según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima es inhibida por el ácido parahidroximercuribenzoico o por el ácido parahidroximercurifenilsulfónico.

7. Anticuerpo dirigido a la enzima según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

8. Anticuerpo según la reivindicación 7, en la que el anticuerpo es policlonal.

9. Anticuerpo según la reivindicación 7, en la que el anticuerpo es monoclonal.

10. Procedimiento para analizar en una muestra, el nivel de actividad enzimática de una enzima que escinde las proteínas superficiales de bacterias gram-positivas en el interior del motivo LPXTGX (SEC ID nº:1), que comprende las etapas de:

(a): mezclar el substrato que vehiculiza el péptido marcado unido covalentemente, que comprende una secuencia aminoácida de LPXTGX (SEC ID nº:1), con un extracto de la membrana de bacterias gram-positivas de dicha muestra;

(b): detectar una liberación del marcado a partir del substrato; y

(c): correlacionar la liberación del marcado con la actividad de la enzima.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el péptido comprende la secuencia LPSTGE (SEC ID nº:14).

12. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la bacteria es Streptococcus, preferentemente un Streptococcus de grupo A.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el marcado es radioactivo.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que el substrato está formado por perlas cromatográficas de un diámetro preferentemente de entre 30 y 100 \mum, más preferentemente de entre 50 y 80 \mum.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que el extracto de la membrana se obtiene tratando dicha muestra con un tampón carbonato, preferentemente con una concentración de carbonato sódico comprendido entre 0,05 a 2,0 M, más preferentemente de aproximadamente 0,1 M.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el tampón bicarbonato tiene un pH comprendido entre 9 y 14, preferentemente de aproximadamente 11,5.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, en el que se evalúa la actividad de un inhibidor putativo de dicha enzima, en el que la etapa a) se lleva a cabo en presencia y ausencia del inhibidor putativo, comparándose la liberación del marcado en presencia del inhibidor con la liberación del marcado en ausencia del inhibidor putativo.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que el inhibidor es un compuesto que oxida los grupos sulfhidrilo de los residuos de cisteína en la enzima para formar cistina, y se encuentra en la etapa a) en una cantidad suficiente para inactivar la unión de la enzima a su substrato.

19. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que el inhibidor es un compuesto que contiene un metal pesado que reacciona con los grupos sulfhidrilo de los residuos de cisteína en la enzima para formar mercáptidos, y se encuentra en la etapa a), seleccionándose preferentemente de entre el grupo formado por el ácido parahidroximercuribenzoico y parahidroximercurifenilsulfónico en una cantidad suficiente para inactivar la unión de la enzima a su substrato.

20. Substrato sintético que comprende un péptido que comprende una secuencia aminoácida LPSTGE, un marcador radioactivo y una perla.

21. Substrato sintético según la reivindicación 20, en el que el marcador radioactivo es ^{125}I y preferentemente perlas yodadas.

22. Substrato sintético según la reivindicación 21, en el que el péptido es KRQLPSTGETANPFY.

23. Substrato sintético según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que las perlas son perlas cromatográficas, con un diámetro preferentemente de entre 30 y 100 \mum, más preferentemente de entre 50 y 80 \mum.

24. Utilización de un substrato sintético según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el procedimiento de la reivindicación 10.

25. Procedimiento para aislar e identificar una enzima que escinde las proteínas superficiales de bacterias gram-positivas, que incluye las etapas siguientes:

(a): preparar un extracto de la membrana de una muestra que contiene las bacterias gram-positivas que contienen proteínas unidas a la membrana;

(b): fraccionar las proteínas unidas a la membrana mediante cromatografía, utilizando un gradiente salino; y

(c): identificar la presencia de la enzima en una fracción utilizando el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16.

26. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que la bacteria gram-positiva en la muestra es Streptococcus, preferentemente un Streptococcus de grupo A.

27. Procedimiento según la reivindicación 25 ó 26, en el que (en la etapa a) el extracto de membrana se obtiene utilizando tampón carbonato, con una concentración de carbonato sódico comprendida preferentemente entre 0,05 y 0,2 M, más preferentemente aproximadamente del 0,1 M.

28. Procedimiento según la reivindicación 27, en el que el tampón carbonato es de un pH comprendido entre 9 y 14, preferentemente aproximadamente del 11,5.