CN102264444B

CN102264444B - 纯化方法

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Publication number: CN102264444B
Application number: CN200980153125.5A
Authority: CN
Inventors: P·科斯塔蒂诺; F·贝蒂; A·卡巴诺瓦; M·R·罗马诺
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2008-10-27
Filing date: 2009-10-27
Publication date: 2015-08-05
Anticipated expiration: 2029-10-27
Also published as: PT2349520T; PL2349520T3; DK2349520T3; SI2349520T1; US11065323B2; JP2012506853A; ES2586308T3; HUE029265T2; HRP20160815T1; CY1117906T1; AU2009309416B2; WO2010049806A1; CN102264444A; CA2777837A1; JP5689064B2; AU2009309416A1; EP2349520A1; EP2349520B1; CA2777837C; US20120010398A1

Abstract

一种包括阴离子交换层析步骤纯化化脓性链球菌GAS糖的方法。该方法提供了良好的GAS糖产率。本发明的糖所含污染的透明质酸、蛋白质和核酸水平低。

Description

纯化方法

本申请要求2008年10月27日提交的美国临时申请号61/108,763的优先权，并引入此文内容以供参考。

技术领域

本发明涉及细菌多糖纯化领域，具体是化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)多糖的纯化和用于制备疫苗。

背景技术

多年来已在疫苗中采用了细菌多糖。然而，由于糖是T细胞非依赖性抗原，它们的免疫原性很弱。与载体偶联可将T细胞非依赖性抗原转变成T细胞依赖性抗原，从而增强记忆应答产生保护性免疫力。因此，最有效的糖疫苗基于糖偶联物，原型偶联疫苗是抗b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(‘Hib’)疫苗[例如见参考文献95的第14章]。

已报导有偶联疫苗的另一种细菌是化脓性链球菌，也称为“A群链球菌”，或简称为“GAS”。偶联疫苗包含GAS糖，它是细菌细胞壁的一种成分。JohnZabriskie及其同事对其已进行了许多研究，例如在参考文献1、2和3中有所讨论。

糖基疫苗的起始点是糖本身，通常从目标细菌纯化获得。Zabriskie纯化GAS糖的方法根据参考文献4和5的方法，在参考文献6中有详述。Zabriskie所用的另一种方法与参考文献7的方法类似，在参考文献8和9中有描述。参考文献10中描述了另一种方法。这些方法涉及用还原性酸处理提取GAS糖。具体说，将化脓性链球菌细胞与亚硝酸钠和冰醋酸混合裂解细胞，从而释放GAS糖。然后用分子大小排除层析(如参考文献10中所述)纯化得到的细胞裂解悬液，例如通过凝胶过滤，采用磷酸缓冲盐水作为洗脱液(见参考文献6)，或通过切向流过滤(如文献8)澄清，然后将GAS糖与合适的载体蛋白偶联。

文献6和8-10没有说明所用纯化方法达到的GAS糖产率。另外，虽然参考文献6和8声称得到的GAS糖制品“所含蛋白和核酸低于1％(w/w)”[6]或“无蛋白质和核酸”[8]，但没有提到是否除去了蛋白质或核酸以外的杂质。因此，需要进一步改进纯化GAS糖的方法，特别是实现更高产率和纯度的方法。

发明内容

本发明基于阴离子交换层析纯化糖的方法。发明人发现阴离子交换层析提供了良好的GAS糖产率。另外，阴离子交换层析提供了特别纯的GAS糖制品。具体说，本发明人发现GAS糖常污染有GAS荚膜多糖的透明质酸。阴离子交换层析对减少GAS糖污染的透明质酸特别有效。当GAS糖用于疫苗时，这具有特别的优点，因为已知透明质酸本身具有免疫原性[11]。因此，透明质酸的存在可能干涉对GAS糖的免疫应答。另外，认为透明质酸会诱导与人组织发生交叉反应的抗体([12]和[13])，因此药物产品中存在透明质酸可能对健康有害。阴离子交换层析对减少GAS糖污染的蛋白质和核酸也特别有效。

例如另一个优点是，本发明人发现GAS糖的纯化应在阴离子交换层析允许糖“流穿”的条件下进行，此时杂质结合于阴离子交换基质，而GAS糖直接流穿此系统进入洗脱液。采用这些条件简化了纯化过程，因为不需要用流动相缓冲液来提高离子强度或提高pH等从基质上洗脱GAS糖。

发明人还发现GAS糖常污染有GAS糖的聚鼠李糖基变体。本发明的纯化方法对减少GAS糖污染的聚鼠李糖特别有效。

因此，本发明提供一种包括阴离子交换层析步骤的纯化化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)GAS糖的方法。化脓性链球菌GAS糖悬液中可能含有透明质酸、链球菌蛋白质和核酸的至少之一种。具体说，本发明提供一种分离GAS糖与透明质酸的方法，包括阴离子交换层析步骤。透明质酸通常来自化脓性链球菌荚膜多糖。该方法在阴离子交换层析步骤前后可包括其它纯化步骤。例如，可包括过滤步骤，以除去高分子量污染物(例如细胞碎片)。类似的，可包括超滤步骤，尤其在所述过滤步骤后，以除去低分子量污染物(例如化脓性链球菌多糖的片段)。还可包括凝胶过滤步骤，以选择特定长度的GAS糖分子，和减少污染，尤其是蛋白质污染。除了凝胶过滤步骤外，或作为替代，本发明方法可包括一次或多次浓缩GAS糖的步骤。过滤和/或超滤步骤通常在阴离子交换层析步骤前进行，而凝胶过滤步骤和/或浓缩步骤通常在阴离子交换层析步骤后进行。随后可用GAS糖制备疫苗。因此，该方法可包括各种处理步骤，例如透析和/或冻干步骤。该方法还可包括将纯化的GAS糖与载体分子偶联的步骤。通常在上述层析步骤之后进行偶联步骤。

因此，本发明纯化化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)GAS糖方法的改进，是包括采用阴离子交换层析。阴离子交换层析所得到的GAS糖产率良好，只含有有限量的透明质酸、蛋白质和核酸污染。

阴离子层析步骤的产率通常高于70％(例如＞75％、＞80％、＞85％、＞90％)。实际的平均产率上限可能不会超过90％(例如可能＜90％、＜80％、＜75％等)。

本发明也提供纯化化脓性链球菌GAS糖的方法，该方法提供一种组合物，该组合物所含的污染透明质酸水平低于200ng/ml(例如＜150ng/ml，＜100ng/ml，＜90ng/ml，＜80ng/ml，＜75ng/ml，＜60ng/ml，＜50ng/ml，＜40ng/ml，＜25ng/ml，＜20ng/ml，＜10ng/ml等)。通常透明质酸污染水平低于100ng/ml，特别是低于80ng/ml。透明质酸污染的水平也可表示为纯化样品中透明质酸重量与GAS糖重量的相对比例。由此，本发明提供纯化化脓性链球菌GAS糖的方法，该方法提供一种组合物，该组合物所含的污染透明质酸水平低于GAS糖重量的5％(例如＜4％，＜3％，＜2％，＜1％，＜0.75％，＜0.5％，＜0.25％，＜0.1％等)。通常透明质酸污染水平小于1％透明质酸与GAS糖的重量比。也可以实现低于此水平，例如等于或低于0.005％透明质酸重量/GAS糖重量比。

本发明也提供纯化化脓性链球菌GAS糖的方法，该方法提供一种组合物，该组合物所含的污染性聚鼠李糖水平低于50％(例如＜40％，＜30％，＜25％，＜20％，＜15％，＜10％，＜8％，＜6％，＜5％，＜4％，＜2％等)聚鼠李糖重量/GAS糖重量比。通常污染的聚鼠李糖水平低于20％聚鼠李糖重量/GAS糖重量比。也可获得低于此水平，例如等于或低于5％聚鼠李糖重量/GAS糖重量比。

本发明还提供纯化化脓性链球菌GAS糖的方法，该方法提供了一种组合物，该组合物所含的污染蛋白质水平低于4.0％(例如＜3.5％，＜3.1％，＜3.0％，＜2.5％，＜2.0％，＜1.5％，＜1.0％，＜6％，＜5％，＜4％，＜2％等)蛋白质重量/GAS糖重量比。通常蛋白质污染水平约为2％蛋白质重量/GAS糖重量比。

本发明还提供纯化化脓性链球菌GAS糖的方法，该方法提供一种组合物，该组合物所含的核酸污染水平低于5％(例如＜4％，＜3％，＜2％，＜1％，＜0.75％，＜0.5％，＜0.25％，＜0.1％等)核酸重量/GAS糖重量比，。通常核酸污染水平低于1％以核酸重量/GAS糖重量比。也可获得低于此水平，例如等于或低于0.5％核酸重量/GAS糖重量比。

本发明还提供了一种纯化化脓性链球菌GAS糖的方法，其中(a)污染的透明质酸水平低于200ng/ml或5％(如上所述)；(b)污染的聚鼠李糖水平低于50％(如上所述)；(c)污染的蛋白质水平低于4.0％(如上所述)，和(d)污染的核酸水平低于5％(如上所述)。

本发明还提供一种组合物，其含有用本发明方法获得的化脓性链球菌GAS糖。

本发明还提供含有化脓性链球菌GAS糖的组合物，该组合物包含的污染透明质酸水平低于200ng/ml(例如＜150ng/ml，＜100ng/ml，＜90ng/ml，＜80ng/ml，＜75ng/ml，＜60ng/ml，＜50ng/ml，＜40ng/ml，＜25ng/ml，＜20ng/ml，＜10ng/ml等)。通常污染的透明质酸水平低于100ng/ml，特别低于80ng/ml。污染的透明质酸水平也可表示为透明质酸重量与组合物总重量之比。因此，本发明提供包含化脓性链球菌GAS糖的组合物，该组合物包含的污染透明质酸水平低于5％(例如＜4％，＜3％，＜2％，＜1％，＜0.75％，＜0.5％，＜0.25％，＜0.1％等)透明质酸重量/GAS糖重量比，。通常透明质酸污染水平低于1％透明质酸重量/GAS糖重量比。也可获得低于此水平，例如等于或低于0.005％透明质酸重量/GAS糖重量比。

本发明还提供包含化脓性链球菌GAS糖的组合物，该组合物所含的污染聚鼠李糖水平低于50％(例如＜40％，＜30％，＜25％，＜20％，＜15％，＜10％，＜8％，＜6％，＜5％，＜4％，＜2％等)聚鼠李糖重量/GAS糖重量比。通常聚鼠李糖污染水平低于20％聚鼠李糖重量/GAS糖重量比。也可以实现低于此水平，例如等于或低于5％聚鼠李糖重量/GAS糖重量比。

本发明还提供包含化脓性链球菌GAS糖的组合物，该组合物所含的污染蛋白质水平低于4.0％(例如＜3.5％，＜3.1％，＜3.0％，＜2.5％，＜2.0％，＜1.5％，＜1.0％，＜6％，＜5％，＜4％，＜2％等)蛋白质重量/GAS糖重量比。通常污染的蛋白质水平约为2％蛋白质重量/GAS糖重量比。

本发明还提供包含化脓性链球菌GAS糖的组合物，该组合物所含的污染核酸水平低于5％(例如＜4％，＜3％，＜2％，＜1％，＜0.75％，＜0.5％，＜0.25％，＜0.1％等)核酸重量/GAS糖重量比。通常污染的核酸水平低于1％核酸重量/GAS糖重量比。也可以实现低于此水平，例如等于或低于0.5％核酸重量/GAS糖重量比。

本发明还提供一种含有化脓性链球菌GAS糖的组合物，该组合物(a)污染的透明质酸水平低于200ng/ml或5％(如上所述)；(b)污的染聚鼠李糖水平低于50％(如上所述)；(c)污染的蛋白质水平低于4.0％(如上所述)，和(d)污染的核酸水平低于5％(如上所述)。

GAS糖

化脓性链球菌GAS糖(也称为GAS胞壁多糖或GASP)通常的特征是含有L-鼠李吡喃糖(Rhap)骨架的分枝结构，该骨架由交替的α-(1→2)和α-(1→3)糖苷键及D-N-乙酰葡糖胺(GlcpNAc)残基经β-(1→3)-连接于交替的鼠李糖环组成(图1和[14])。已报导存在Rhap骨架但是没有GlcpNAc分枝(即聚鼠李糖，图2和[6])的A群链球菌变体。本发明优选含GAS糖的化脓性链球菌而非A群链球菌变体。事实上，本发明的纯化方法对减少化脓性链球菌GAS糖中的污染聚鼠李糖特别有效。

本发明纯化的糖通常是天然形式，但也可以是修饰形式的糖。例如，这种糖可以比天然GAS糖短，或可经化学修饰。

因此，本发明所用的糖可以是天然发现的基本上全长的GAS糖，或可短于天然长度。可解聚全长多糖产生用于本发明的较短片段，例如，用温和的酸水解、加热、通过分子大小层析等。已提出对应于GAS糖末端单元的短片段可用作疫苗[15]。因此，本发明也考虑这种短片段。然而，优选采用基本上全长的糖。本发明纯化的糖分子量通常约10kDa、具体约7.5-8.5kDa。可用HPLC，例如采用与标准支链淀粉(pullulan)相关的TSK Gel G3000SW柱(Sigma)进行SEC-HPLC，例如购自“聚合物标准服务(Polymer Standard Service)”公司的SEC-HPLC仪测定分子量[16]。该测定的典型条件包括用含100mM NaPi、100mM NaCl和5％乙腈的洗脱缓冲液以0.5ml/分钟流速等度(无梯度)洗脱。可通过测量214nm吸光度检测存在的GAS糖。

可化学修饰天然GAS来糖制备所述糖。例如，可对所述糖进行去-N-乙酰化(部分或完全)、N-丙酰化(部分或完全)等修饰。例如可用常规试验评估去乙酰化等修饰对免疫原性的影响。

原材料：

本发明的方法通常从液体形式的GAS糖开始，例如含有透明质酸和/或聚鼠李糖的GAS糖水悬液开始。该悬液中可能存在链球菌蛋白和/或核酸。通常，该悬液含有透明质酸、聚鼠李糖、蛋白质和核酸。透明质酸通常由化脓性链球菌荚膜多糖产生。

通常，通过处理细菌本身(或含有细菌胞壁的物质)释放GAS糖制备这种原材料。例如，可收集培养的细菌，优选静止期细菌。可在收集前加热灭活培养菌。例如，本发明人发现90℃加热处理60分钟适合灭活培养菌。收集包括，离心培养菌，例如用水或缓冲盐重悬细菌沉淀。离心前，通过切向流过滤，例如采用0.2μm中空纤维过滤柱过滤处理培养菌[8]。可以任何合适的速度，例如100-10,000g之间的速度离心。发现300g速度离心有效。参考文献8中提到3000g速度。如果用缓冲盐水重悬细菌，可用水稀释悬液再作进一步处理[8]。

可用各种方法，包括化学、物理或酶处理使细菌释放GAS糖。一种典型的化学处理方法是还原性酸处理，例如用亚硝酸钠和冰醋酸处理[例如，如文献4、5、7和10所述]，使细菌释放GAS糖。通常，在细菌悬液中加入等体积的4N亚硝酸钠和冰醋酸，搅拌混合物适当长时间，例如1小时。合适的温度，例如37℃进行这种处理。通常混合液的最终pH＝约3.0。用4M氢氧化钠中和混合液的pH＝6-7。用水稀释混合液[8]。

过滤和超滤

培养后，例如用上述还原性酸处理获得的GAS糖通常不纯，可能含有透明质酸和/或聚鼠李糖污染。也可能存在链球菌蛋白质和/或核酸。可用一次或多次过滤步骤除去高分子量物质纯化GAS糖。例如，本发明人发现，可采用包括正交过滤的过滤步骤除去GAS糖中的杂质，而GAS糖留在滤液中。通常，用0.65μm滤膜进行正交过滤。例如，可采用Sartopure GF2^TM(Sartorius公司)的密封滤器(面积0.2m²)。然而，也可采用0.2μm滤膜。为提高产率，可取出滤膜上的残留滤液与其余滤液合并。可向滤膜施加驱动力(如蠕动或压力)，或在该系统中注入蒸馏水来回收滤液。

也可用一次或多次超滤步骤除去低分子量物质纯化GAS糖。超滤也可浓缩GAS糖。优选在上述过滤步骤后进行一次或多次超滤步骤。发明人发现透析步骤，例如切向流过滤，对除去GAS糖中的杂质特别有效，而GAS糖留在滞留液中。可在透析前浓缩GAS糖，例如浓缩约15-20倍。适合用1M NaCl(例如约10体积)，然后用水(例如另外10体积)进行切向流过滤。切向流过滤可采用3、5、10、或30kDa截留值的膜用水进行。例如，可采用Hydrosart^TM(Sartorius公司)5kDa截留膜(0.1m²膜面积)。Hydrosart^TM是疏水的稳定化纤维素膜，在广泛pH范围内都稳定。然而，本发明人发现采用30kDa截留膜的切向流过滤更适合大规模生产。这种切向流过滤还能更好地除去污染蛋白质和缩短过滤时间，而不显著损失GAS糖。切向流过滤后，可浓缩滞留液例如约5倍。为提高产率，例如可用相应于该膜死腔体积的蒸馏水洗涤膜2次，将洗出液加入滞留液。

过滤和/或超滤后，可浓缩GAS糖制品。通常用水透析GAS糖制品后再作进一步处理。

阴离子交换层析

本发明方法包括阴离子交换层析步骤。发明人发现，阴离子交换层析对除去GAS糖中污染的透明质酸、蛋白质和核酸特别有效，同时保持了良好的糖产率。

可在上述过滤和/或超滤步骤后进行阴离子交换层析步骤。

可用任何合适的阴离子交换基质进行阴离子交换层析。常用的阴离子交换基质有树脂，例如Q树脂(基于季铵)和DAEA树脂(基于二乙基氨基乙烷)。本发明人发现Q树脂(例如Q-Sepharose^TM XL和Q-Sepharose^TM FF树脂(通用-健康护理公司)特别合适，虽然也可采用其它树脂。可用常规实验无须过多负担确定纯化一定量物质所需树脂的合适用量。例如，本发明人发现每0.5mg或1mg的GAS糖采用1mL树脂有效。

也可用常规实验无须过多负担确定阴离子交换层析的合适起始缓冲液和流动相缓冲液。用于阴离子交换层析的典型缓冲液包括：N-甲基哌嗪、哌嗪、L-组氨酸、双-Tris、双-Tris丙烷、三乙醇胺、Tris、N-甲基二乙醇胺、二乙醇胺、1，3-二氨基丙烷、乙醇胺、哌啶和磷酸缓冲盐水。发明人发现，宜在允许GAS糖“流穿”的条件下进行阴离子交换层析步骤，其中杂质结合于阴离子交换基质，而GAS糖直接流穿通过该系统进入洗脱液。采用这些条件简化了纯化过程，因为不需要用流动相缓冲液来提高离子强度或提高pH等即可从基质上洗脱GAS糖。可采用常规实验无须过多负担确定流穿阴离子交换层析柱的合适条件。磷酸缓冲盐水，例如磷酸钠缓冲液，适合用作阴离子交换层析的流动相。缓冲液可以是任何合适的浓度。例如，发现10mM磷酸钠适合。

发明人发现在流动相缓冲液中加入醇能提高GAS糖产率。发明人还发现流动相缓冲液加醇可以降低GAS糖制品的混浊。然而，本发明人发现采用不含任何醇的流动相缓冲液更适合大规模生产。当采用醇时，流动相缓冲液可含有任何合适浓度的醇。例如，可在流动相缓冲液中加入醇，其体积达到最终醇浓度占5％-50％(例如约10％，15％，20％，25％，30％)。通常，在流动相缓冲液中加入醇，达到最终醇浓度15-25％之间，具体为20％体积。醇优选低级醇，例如，甲醇、乙醇、丙-1-醇、丙-2-醇、丁-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙基-1-醇、2-甲基-丙基-2-醇、二元醇等。可凭经验无须过度负担测试所选择的合适醇，但优选例如乙醇和异丙醇(丙-2-醇)等醇，而不是苯酚那样的醇。通常，所述醇是乙醇。可将所述醇以纯形式或用可混溶溶剂(例如水)稀释后加入。优选的溶剂混合物是醇∶水混合物，优选其比例约70∶30-95∶5(例如，75∶25、80∶20、85∶15、90∶10)。

可通过测定215nm处UV吸光度确定洗脱组分所含的GAS糖。洗脱物的纯度比阴离子交换层析步骤前的GAS糖制品高。可合并所有含GAS糖的组分然后作进一步处理。

可重复阴离子交换层析步骤，例如1、2、3、4或5次。然而，通常进行一次阴离子交换层析步骤。

凝胶过滤

本发明方法包括一次或多次凝胶过滤步骤。用该凝胶过滤选择特定长度的GAS糖分子，并进一步减少污染，特别是蛋白质污染。然而，本发明人发现与参考文献6相反，不需要凝胶过滤步骤即可获得高纯度GAS糖。因此，可从本发明方法中省略该步骤。省略该步骤将有助于扩大此方法的规模。

例如，可在上述阴离子交换层析步骤后进行凝胶过滤步骤。

可用任何合适的凝胶过滤基质进行此凝胶过滤步骤。常用的凝胶过滤基质有：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰吗啉凝胶和聚苯乙烯凝胶等。也可采用交联葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺/琼脂糖混合凝胶。发明人发现葡聚糖凝胶(例如Sephacryl S100凝胶或Sephadex^TM G50凝胶(通用-健康护理公司))特别适合，虽然也可采用其它凝胶。可用常规实验无须过多负担确定纯化一定量物质所需凝胶的合适用量。例如，本发明人发现每0.2mg的GAS糖采用1mL凝胶有效。类似的，可通过常规实验无须过多负担确定任何给定凝胶过滤柱的GAS糖制品合适负载量。通常加入凝胶过滤柱的GAS糖制品体积不超过柱体积的5％。

可用常规实验无须过多负担确定用于凝胶过滤的合适流动相缓冲液。用于凝胶过滤的典型缓冲液包括：N-甲基哌嗪、哌嗪、L-组氨酸、双-Tris、双-Tris丙烷、三乙醇胺、Tris、N-甲基二乙醇胺、二乙醇胺、1，3-二氨基丙烷、乙醇胺、哌啶和磷酸盐缓冲液。例如，磷酸盐缓冲液，如磷酸钠缓冲液可能适合用作流动相。缓冲液可以是任何合适的浓度。例如，流动相可采用10mM磷酸钠。

发明人发现，宜采用与阴离子交换层析步骤相同的流动相缓冲液进行凝胶过滤。采用这种缓冲液简化了纯化过程，因为不需要制备不同的缓冲液。例如，流动相可采用10mM磷酸钠缓冲液。

也优选在凝胶过滤的流动相缓冲液中加入醇。加入醇可提高GAS糖的产率和/或减少GAS糖制品的混浊。可在流动相缓冲液中采用任何合适浓度的醇。例如，可在流动相缓冲液中加入醇，达到最终体积占5％-50％(例如约10％，15％，20％，25％，30％)。通常，在流动相缓冲液中加入醇，达到最终醇浓度15-25％之间，具体为20％体积。醇优选低级醇，例如，甲醇、乙醇、丙-1-醇、丙-2-醇、丁-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-1-醇、2-甲基-丙-2-醇、二元醇等。可凭经验无须过度负担通过测试选择合适的醇，但优选例如乙醇和异丙醇(丙-2-醇)等醇，而非苯酚那样的醇。通常，所述醇是乙醇。可加入纯形式的所述醇或用可混溶的溶剂(例如水)稀释后加入。优选的溶剂混合物是醇∶水混合物，优选其比例约70∶30-95∶5(例如，75∶25、80∶20、85∶15、90∶10)。

可通过测定215nm处的UV吸光度确定洗脱液组分的GAS含量。发明人发现洗脱液中存在两个GAS糖峰：一个峰对应于高分子量GAS糖，另一个(通常较小)峰对应于低分子量GAS糖。如果要将GAS糖制品加工成为以后的疫苗制品，通常选择含高分子量GAS糖组分。另外，可合并含高和低分子量GAS糖组分然后作进一步处理。

通常用水透析GAS糖制品再作进一步处理。

浓度

除了一次或多次凝胶过滤步骤外，或作为替代，本发明方法可包括一次或多次浓缩GAS糖步骤。如下文所述，这种浓缩可获得浓度正确的样品，用于随后GAS糖与载体分子的偶联。然而，本发明人发现获得高纯度GAS糖不需要此浓缩步骤。因此，可从本发明方法中省略该步骤。

发明人发现采用一次或多次浓缩GAS糖步骤比采用凝胶过滤更适合大规模生产。采用一次或多次浓缩GAS糖步骤特别合适用上述30kDa截留膜切向流过滤纯化GAS糖。发明人发现用切向流过滤步骤意味着不需要在纯化过程中包括凝胶过滤步骤来除去GAS糖中的杂质，特别是聚鼠李糖。

例如，可在上述阴离子交换层析步骤后进行浓缩步骤。如果采用浓缩步骤加上述凝胶过滤步骤的方法，可在上述凝胶过滤步骤之前或之后进行浓缩步骤。然而，通常采用浓缩步骤代替凝胶步骤。

可用任何合适的方法进行浓缩步骤。例如，发本明人发现浓缩步骤可以是上述超滤步骤，例如采用5或10kDa截留膜的切向流过滤浓缩。例如，可采用Hydrosart^TM(Sartorius公司)10kDa截留膜(200cm²膜面积)。通常，可用Hydrosart^TM(Sartorius公司)5kDa截留膜(200cm²膜面积)。发明人发现5kDa截留膜提供的产率比10kDa截留膜高。不想受理论的束缚，认为5kDa膜截留的GAS糖量较大，随后的产率更高。

用水透析GAS糖制品后再作进一步处理。然而，本发明人发现进一步透析可能导致透填过液中的GAS糖损失。

GAS糖的进一步处理

纯化后，可进一步处理该糖除去污染物。这在甚至非常微量的污染也不能接受(例如人疫苗生产)的情况下特别重要。

可抽真空干燥所述糖。这种处理通常不用于稳定糖以便贮存，而是干燥糖除去任何残留的醇。

还可进行进一步轮次的过滤。

纯化GAS糖的聚合度通常在10-30，例如20-24之间(用纯化样品的醛基浓度测量[17])。然而，这种多糖可能解聚形成寡糖。优选将多糖解聚的寡糖用于疫苗。可在阴离子交换层析步骤前后进行多糖解聚成为寡糖。如果进行解聚，通常要筛分产物除去长度短的寡糖。可用各种方法如超滤然后离子交换层析实现此目的。在本发明的组合物包含解聚糖步骤时，优选在偶联前解聚。

如果天然GAS糖的D-N-乙酰基葡糖胺残基被去N-乙酰化，本发明的方法还可包括重新N-乙酰化步骤。可采用试剂如乙酸酐(CH₃CO)₂O(例如用5％碳酸氢铵溶液配制)方便地进行受控的重新N-乙酰化[18]。

通常可在室温下进行这些额外的步骤。

贮存

可冻干，例如通过真空冷冻干燥GAS糖制品，或冷冻GAS糖制品溶液(例如包括最终浓缩步骤，冷冻洗脱液)，以便于在纯化过程任何阶段贮存。因此，在加工过程中不需要将该制品从一个步骤立即转运到另一个步骤。例如，如果采用过滤和/或超滤纯化GAS糖制品，可在该纯化前冻干或冷冻GAS糖制品溶液。类似的，可在阴离子交换层析步骤前冻干或冷冻GAS糖溶液。如果用凝胶过滤纯化GAS糖制品，可以在该纯化前冻干或冷冻GAS糖制品溶液。类似的，如果要浓缩GAS糖制品，可在该步骤前冻干或冷冻GAS糖制品溶液。在进一步处理前，用合适的溶液重建冻干制品。类似的，在进一步处理前解冻冷冻溶液。

本发明方法获得的纯化GAS糖可经任何合适的方式处理后贮存。例如，可以如上所述冻干该糖。另外，通常在低温，例如20℃贮存该糖的水溶液，。贮存阴离子交换层析、凝胶过滤或浓缩步骤后含该糖的洗脱液。

偶联

本发明最终纯化的GAS糖可用作抗原而无须进一步修饰，例如用于体外诊断试验，用于免疫接种等。

然而，为了免疫接种目的优选将糖与载体分子，例如蛋白质偶联。通常，与载体共价偶联可增强糖的免疫原性，因为偶联可将糖由T-非依赖性抗原转变为T-依赖性抗原，因此可引发免疫记忆。偶联对于儿科疫苗[例如文献19]特别有用，而且是众所周知的技术[例如参考文献20-28中的综述]。因此，本发明的方法还包括将纯化的GAS糖与载体分子，例如载体蛋白偶联的步骤。

在一方面，本发明因此提供(i)用本发明方法获得的GAS糖与(ii)载体分子的偶联物。

载体分子可直接或通过接头共价偶联于GAS糖。

GAS糖与载体蛋白的直接连接参考文献6和8已有报导。GAS糖偶联的典型现有技术方法包括通过还原性胺化将纯化的糖连接于载体蛋白，例如破伤风类毒素(TT)[例如参考文献29的文献8所述]。还原性胺化包括使载体的一个氨基酸侧链胺基与该糖的醛基反应。GAS糖的末端残基含有一个醛基。因此，可利用该基团与载体偶联[如文献8中所述]。另外，可在偶联前产生额外的醛基，例如通过氧化该糖的非还原性末端。

可用任何已知方法，如参考文献30和31所述的方法通过接头基团连接。优选的连接类型是己二酸接头，可通过使游离的-NH₂基团(例如通过胺化引入GAS糖中)与己二酸(例如，用二亚胺活化)偶联形成此连接，然后使蛋白质偶联于所得的糖-己二酸中间体[32、33、34]。另一种优选的连接类型是羰基接头，可通过使修饰的GAS糖的游离羟基与CDI反应[35，36]形成此接头，然后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯连接键。其它接头包括β-丙酰胺基[37]、硝基苯基-乙基胺[38]、卤代酰基卤化物[39]、糖苷键[40]、6-氨基己酸[41]、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)-丙酸(SPDP)[42]、己二酸二酰肼ADH[43]、C₄-C₁₂部分[44]等。也可利用碳二亚胺缩合反应[45]。一种另选的偶联方法包括利用该糖中的-NH₂基团(N-乙酰化或引入胺基后产生的)与双功能接头连接，如参考文献46中GBS荚膜糖所述。

其它合适的GAS糖偶联方法见参考文献6中所述。

优选的载体蛋白是细菌毒素，如白喉或破伤风毒素、其类毒素或及突变体。这些常用于偶联疫苗。特别优选CRM₁₉₇白喉毒素突变体[47]。

其他合适的载体蛋白包括：脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)外膜蛋白复合物[48]、合成肽[49，50]、热激蛋白[51，52]、百日咳蛋白[53，54]、细胞因子[55]、淋巴因子[55]、激素[55]、生长因子[55]、人血清白蛋白(优选重组的)、含有各种病原体衍生抗原的人CD4⁺T细胞多种表位的人造蛋白[56]，例如N19[57]、流感嗜血杆菌(H.influenzae)的蛋白D[58-60]、肺炎球菌溶血素[61]或其无毒衍生物[62]、肺炎球菌表面蛋白PspA[63]、摄铁蛋白[64]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[65]、重组绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)胞外蛋白A(rEPA)[66]、GBS蛋白[112]、GAS蛋白[67]等等。

优选通过载体蛋白的-NH₂基团，例如赖氨酸残基侧链或精氨酸残基侧链的-NH₂基团与载体蛋白连接。也可通过-SH基团，如半胱氨酸残基侧链的-SH基团连接。

对于GAS糖抗原可采用一种以上的载体蛋白，例如以减少载体抑制风险。因此，GAS糖可以分成两组，一些偶联于CRM197而其它偶联于破伤风类毒素。然而，通常优选所有糖采用同一种载体蛋白。

一种载体蛋白可携带一种以上的糖抗原[68，69]。

优选糖∶蛋白质比例(w/w)1∶10(即蛋白质过量)-10∶1(即糖过量)的偶联物。优选1∶5-5∶1之间的比例，如1∶5-1∶2.5之间的比例。

偶联物与游离载体联用[70]。当本发明组合物中给定载体蛋白存在游离和偶联二种形式时，优选未偶联形式不多于该组合物中载体蛋白总量的5％，更优选低于2％重量。

偶联后，可分离游离和偶联的糖。有许多合适的分离方法，包括疏水层析、切向流超滤、透析等。[也参见参考文献71和72等]。

偶联物与其它抗原

本发明方法制备(特别是在上所述偶联后)的糖可以例如彼此混合和/或与其它抗原混合。因此，本发明方法包括进一步混合所述糖与一种或多种其它抗原的步骤。

可混合多种不同的GAS糖偶联物。可通过制备不同的偶联物，然后混合这些偶联物来制备所述组合物。

其它抗原包括非GAS病原体的抗原。因此，本发明的组合物还可包含一种或多种非GAS抗原，包括其它细菌、病毒或寄生虫的抗原。这些抗原可选自以下：

-血清群B型脑膜炎奈瑟球菌的蛋白质抗原，例如参考文献73-79中所述的那些，特别优选蛋白质‘287’(见下文)及其衍生物(例如‘ΔG287’)。

-血清群B型脑膜炎奈瑟氏菌的外膜囊泡(OMV)制品，例如参考文献80、81、82、83等中所述。

-脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，例如参考文献84所述的血清群C的寡糖或参考文献85所述的寡糖。

-肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[例如参考文献86-88；参考文献95的第15章]。

-甲型肝炎病毒如灭活病毒的抗原[例如参考文献89、90；参考文献95的第15章。

--乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[如参考文献90，91；参考文献95的第16章]。

--丙型肝炎病毒的抗原[如参考文献92]。

-百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3蛋白混合[例如参考文献93和94；参考文献95的第21章]。

--白喉抗原，如白喉类毒素[例如，参考文献95的第13章]。

--破伤风抗原，如破伤风类毒素[例如，参考文献95的第27章]。

-流感嗜血杆菌B的糖抗原[如参考文献95的第14章]。

-淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)的抗原[例如参考文献73，74，75]。

-肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的抗原[例如参考文献96、97、98、99、100、101、102]。

--沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)抗原[例如参考文献103]。

--牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原[例如参考文献104]。

-脊髓灰质炎抗原[例如参考文献95的第24章]，例如IPV。

-狂犬病抗原[例如参考文献107]，例如冻干的灭活病毒[例如RabAvert^TM]。

-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[如参考文献95的第19、20和26章]。

-流感抗原[例如参考文献95的第17和18章]，例如血凝素和/或神经酰胺酶表面蛋白。

-粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)抗原[例如参考文献109]。

-无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B型链球菌)的蛋白抗原[例如参考文献67、110-112]。

采用糖抗原时，优选与载体蛋白偶联以增强免疫原性。B型流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌和肺炎球菌糖抗原的偶联是熟知的。

必要时，可使毒性蛋白质抗原脱毒(如通过化学和/或遗传方法使百日咳毒素脱毒[94])。

当所述组合物中包含白喉抗原时，优选也包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地，当包含破伤风抗原时，优选也包含白喉和百日咳抗原。相似地，当包含百日咳抗原时，优选也包含白喉和破伤风抗原。

可使抗原吸附于铝盐。

所述组合物中各抗原的浓度一般至少1μg/ml。通常，任何给定抗原的浓度应足以引发针对该抗原的免疫应答反应。

作为本发明组合物中所用蛋白质抗原的另一种替代方式，可采用编码该抗原的核酸[例如文献113-121]。本发明组合物的蛋白质组分可用编码该蛋白的核酸(优选DNA，如质粒形式的DNA)替代。

在实施时，本发明组合物中包含的抗原数目可能有上限。本发明组合物中抗原的数目少于20、少于19、少于18、少于17、少于16、少于15、少于14、少于13、少于12、少于11、少于10、少于9、少于8、少于7、少于6、少于5、少于4、或少于3种。

药物学组合物和方法

本发明提供制备药物组合物的方法，包括：混合(a)本发明的糖(任选偶联形式的糖)与(b)药学上可接受载体的步骤。这类载体的充分讨论可参见参考文献122。

可将本发明组合物制备成各种剂型。例如，可将所述组合物制备成液体溶液或悬浮液的可注射剂型。也可制备成合适的固体剂型，在注射前用液体运载体配成溶液或悬浮液。可将所述组合物制备成局部给药的剂型，例如油膏、乳膏或粉剂。可将所述组合物制备成口服剂型，例如，片剂、胶囊或糖浆(任选调味)。可将所述组合物制备成肺部给药剂型，例如采用细粉或喷雾的吸入剂。可将所述组合物制备成栓剂或阴道栓。可将所述组合物制备成经鼻、经耳或眼部给药的剂型，例如，滴剂、喷雾剂、或粉剂[例如参考文献123]。].

所述组合物优选无菌。优选无热原。

优选采用，例如pH 6-pH 8，通常约pH 7的缓冲液。组合物可以是水溶液，或冻干。

本发明还提供包含本发明药物组合物的递送装置。所述装置可以是例如注射器或吸入器。

本发明的药物组合物优选免疫原性组合物，其包含免疫有效量的GAS糖免疫原。“免疫有效量”指给予个体能有效治疗或预防的一次剂量或一系列剂量的分剂量。该用量根据所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类学分组(例如，分类为非人灵长动物、灵长动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学状况的评估和其它相关因素而不同。预计该用量的范围较宽，可通过常规试验确定。

一旦配制好，可将本发明组合物直接给予对象。所述待治疗对象可以是动物；具体而言，可治疗人类对象。

本发明的免疫原性组合物可用于治疗(即治疗已有的感染)或预防(即防止将来的感染)。

可将所述药物学组合物包装入小瓶或针筒内。针筒可提供或不提供针头。针筒可装入一个剂量的组合物，而药瓶可装入一个剂量或多个剂量。

本发明糖的组合物水溶液适合于以冻干形式重建其它疫苗。当临用前用本发明的组合物重建时，本发明提供重建这类冻干疫苗的方法，包括混合冻干物质与本发明组合物水溶液的步骤。该重建物质进行注射。

概述

术语“包含”包括：“包含”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可仅由X组成，或可包含其它物质，例如X+Y。

与数值x相关的术语“约”表示例如，x±10％。

术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。当需要时，可从本发明定义中删除术语“基本上”。

当本发明提供包括多个连续步骤的方法时，本发明也提供包括比步骤总数少的方法。例如，如果通过已去除了污染性核酸和/或蛋白而部分纯化的糖，可从本发明的方法中删除该步骤。类似的，可进行去除污染物的步骤，得到准备好阴离子交换层析的物质，但不需要进行阴离子交换层析步骤。不需要进行阴离子交换层析步骤也属于本发明范围内，因为此前加工的物质已可作为糖制品的中间物，而利用、储藏、运出等，然后用于后面的阴离子交换层析。可在不同时间由不同人员在不同地点(例如在不同国家)进行这些不同的步骤。

应理解所述糖环可以是开环或闭环形式，虽然本文结构式显示的是闭环形式，但本发明也包括开环形式。类似的，应理解所述糖可以吡喃糖和呋喃糖形式，虽然本文结构式显示的是吡喃糖形式，但也包括呋喃糖形式。还可包括糖的不同异头形式。

附图简要说明

图1描述了化脓性链球菌GAS糖的结构。

图2，化脓性链球菌GAS糖与A群链球菌变体GAS糖结构的比较。

图3显示GAS糖的示范性NMR图谱。

图4显示凝胶过滤后GAS糖的示范性NMR图谱。

图5比较用阴离子交换层析、阳离子交换层析、以及疏水相互作用层析法获得的GAS糖制品的透明质酸污染，和单用3kDa截留膜超滤后观察到的污染。

图6小结纯化GAS糖的一种优化方法。

图7显示用Q-Sepharose阴离子交换层析纯化的GAS糖的示范性色谱图。

图8显示切向流过滤浓缩后GAS糖的示范性HPLC-SE概况。

图9显示凝胶过滤后GAS糖的标注NMR图谱。

图10显示凝胶过滤后GAS糖的示范性色谱图。

图11显示在1)阴离子交换层析步骤后和2)10kDa切向流过滤步骤后对GAS糖进行的分析性凝胶过滤色谱图。

图12显示10kDa切向流过滤；10kDa切向流过滤和凝胶过滤；和单独凝胶过滤后GAS糖的1H NMR图谱。

图13显示获得GAS糖-CRM₁₉₇偶联物的反应流程。

图14显示GAS糖-CRM₁₉₇偶联物的SDS-Page凝胶电泳分析。

图15显示含接头的GAS糖-CRM₁₉₇偶联物的1)SDS-Page凝胶电泳分析和2)SEC-HPLC分析。

实施本发明的具体实施方式

实施例1

纯化化脓性链球菌的GAS糖

每个纯化步骤后，用NMR分析验证GAS糖结构(见下文)。示范性GAS糖的NMR图谱见图3所示。

步骤1：GAS糖的提取

80℃加热灭活培养的4L化脓性链球菌，300g离心。取细菌沉淀重新悬浮于缓冲盐水，通过还原性酸处理释放出GAS糖。简言之，取0.1体积4N亚硝酸钠和0.1体积冰醋酸搅拌加入细菌悬液中，直到混合液最终pH＝3.0左右。然后中和pH＝6-7。

步骤2：过滤和超滤

用0.6μm滤膜(Sartopure GF2，Sartorius)过滤混合液，然后用3kDa截留膜(膜面积0.1m²)超滤。浓缩制品至体积约200ml，用大约10倍体积的水透析。测定该阶段GAS糖制品的蛋白质污染，显示为20-30％。

步骤3和4：层析步骤

在AKTA^TM系统(Farmacia公司)上进行以下层析步骤。检测洗脱液组分215nm处的UV吸光度，测定GAS糖(含量)。

用Q Sepharose^TM XL树脂(通用-健康护理公司)阴离子交换层析处理GAS糖制品。收集该柱GAS糖的流穿液。每0.5mg GAS糖采用1ml树脂。流动相缓冲液是补充有20％体积乙醇的10mM磷酸钠缓冲液。在流穿液中GAS糖呈现为单一峰。合并所有含GAS糖的组分。测定该阶段GAS糖制品的蛋白质污染，显示为5％左右。

然后用Sephadex^TM G50凝胶(通用-健康护理公司)柱通过凝胶过滤处理Gas糖制品。每0.2mg GAS糖采用1ml凝胶。GAS糖制品体积不超过凝胶过滤柱体积的5％。流动相缓冲液是补充有20％体积乙醇的10mM磷酸钠缓冲液。在流穿液中GAS糖呈现为两个峰：a)高分子量GAS糖物质为一个大峰，和b低分子量GAS糖物质为一个小峰。选择第一个峰用于制备疫苗。测定该阶段GAS糖制品的蛋白质污染，显示约2-3％。GAS糖的产率为50-90％。

凝胶过滤后GAS糖的示范性NMR图谱见图4所示。整合NMR谱中的峰确认GAS糖结构正确(表I)。

表I

*整合值相当于1摩尔。**整合值相当于3x摩尔。***整合值相当于6x摩尔。当由于与HDO信号重叠检测不到H₁GlcNAc峰时，将参比值固定为H₁GlcNAc或CH₃CONHGlcNAc。

贮存

GAS糖制品可-20℃贮存。

不同层析方法效率的比较

比较了不同类型层析减少GAS糖制品的污染效力。层析类型有：凝胶过滤(采用Sephadex^TM G50凝胶)；阴离子交换层析(采用Q Sepharose^TM XL树脂)；阳离子交换层析(采用SP Sepharose^TM XL树脂)；和疏水相互作用层析(采用苯基Sepharose^TM 6快速流树脂)。所有树脂和凝胶都购自通用-健康护理公司。测定了每种类型层析获得的GAS糖最终产率(CHO)和GAS糖制品的蛋白质污染(表II)。

表II

*nd未检测(界面)

这些数据显示阴离子交换层析得到的GAS糖产率较高，尤其是与参考文献6所用的凝胶过滤相比时。阴离子交换层析得到的GAS糖的蛋白质污染量在所有测试方法中最少。

将用阴离子交换、阳离子交换、和疏水相互作用层析法获得的GAS糖制品的透明质酸污染，与单用3kDa截留膜超滤后观察到的污染作比较(图5)。这些数据显示阴离子交换层析导致的透明质酸污染量在所有测试方法中最少。

分析方法：

GAS糖浓度测定

用带脉冲电流检测的DIONEX^TM系统进行高效阴离子交换层析。用4M三氟乙酸水解GAS糖制品。用CarboPac^TM PA1分析柱，以50mM NaOH作为流动相缓冲液。用500mM NaOH再生此柱。N-乙酰葡糖胺和鼠李糖的滞留时间分别为5.3分钟和7.2分钟。整合鼠李糖和N-乙酰基-葡糖胺的峰，根据标准的校准曲线计算出GAS糖含量。

蛋白质浓度

用MicroBCA试验(Pierce公司)测定蛋白质污染。

核酸浓缩

用260nm处吸光度(A)测定核酸浓度。用A＝εbc的兰玻比尔二氏定律定量浓度，其中c是样品浓度；b是样品长度(1cm)，ε是0.020(μg/ml)^-1cm^-1(DNA双螺旋的文献值)。读取装在分光光度计(分光光度计λ25，Perkin Elmer公司)石英杯中用水或缓冲液配的1mg/ml多糖溶液的吸光度，用相应的水或缓冲液重新设定该仪器。核酸浓度计算公式：c＝A/εb。从该值，将核酸浓度除以多糖浓度乘100，计算污染核酸的％。

NMR分析

冻干去除质子化H₂O溶剂制备样品(约1mg多糖)。然后将产物溶于氧化氘(D₂O，99.9％原子D，购自Aldrich公司)产生均匀溶液。发明人发现冻干不影响该糖分子的物理化学结构。

25℃在Bruker Avance^TM 600MHz分光光度计上用5mm宽带探针(Burker公司)记录1H NMR实验。用XWINNMR^TM软件包(Bruker公司)获取数据和加工。收集质子谱l0ppm谱宽上的32k数据点。传输器设置在HDO频率，也用作参比信号(4.79ppm)。

用标准的一次脉冲(one-pulse)实验收集1-D质子NMR谱。

透明质酸(HA)残留量的估计。

用Gorgenix Inc.公司的市售试剂盒估计透明质酸残留量。(产品号029-001)。该HA试验试剂盒是一种酶联结合蛋白质试验，采用称作透明质酸结合蛋白(HABP)的捕获分子。在HABP包被的微孔中培育正确稀释的血清或血浆和HA参比溶液，使样品中存在的HA与固定的结合蛋白(HABP)反应。洗涤除去未结合的样品分子后，在微孔中加入偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的HABP溶液，与结合的HA形成复合物。再次洗涤步骤后，加入四甲基联苯胺生色底物和过氧化氢，导致反应混合液颜色改变。用分光光度计检测450nm光密度(OD)单位测定颜色强度。用试剂盒提供的空白试剂(0ng/ml)和HA参比溶液(50、100、200、500、800ng/mL)制作标准参比曲线，测定未知样品和对照样品中的HA水平。

实施例2

化脓链球菌GAS糖纯化的优化

培养后获得的GAS糖一般不纯，含有透明质酸、蛋白质、鼠李糖和核酸污染。优化实施例1以切向流过滤、阴离子交换层析和分子大小排阻层析(凝胶过滤)为基础的纯化方法，促进了规模化和提高了纯度。

优化后的纯化方法(总结于图6)除去了透明质酸，减少聚鼠李糖污染至＜20％，并且减少残留蛋白质污染至＜4％。该方法的各个步骤在下文详述。

0.65μm膜正交过滤

此第一纯化步骤采用0.65μm膜正交过滤除去颗粒污染物。在过滤前，将亚硝酸钠和冰醋酸处理后获得的GAS糖悬液的pH中和到约6-7。然后用Sartopure GF2^TM的0.65μm膜(Sartorius公司)过滤混合液。对于5L发酵液获得约2L悬液，通常采用0.2m²的过滤面积，在约30-40分钟内完成操作。

表III显示该步骤滤过液的示范性GAS糖浓度。

表III

第二步是切向流过滤，可除去低分子量物质(例如蛋白质、核酸和透明质酸)。为改善纯化和减少处理时间，比较了不同截留值的膜。

用膜面积为0.1m²的Hydrosart^TM3kDa、5kDa、10kDa和30kDa截留膜(Sartorius)处理从5L发酵液所得的物质。浓缩粗制多糖溶液约15-20倍后，用约10倍体积的1M NaCl液透析，然后用约10倍体积的水透析。用0.1m²盒式过滤器(Sartorius公司)(装有蠕动泵(WatsonMarlon))进行切向流过滤步骤。所用压力条件是Pin＝1.0巴，Pout＝0.4巴，过滤流速视膜的截留值而不同，从18ml/分钟-100ml/分钟，如下：

3kDa，流速＝18mL/min

5kDa，流速＝40mL/min

10kDa，流速＝50mL/min

30kDa，流速＝80-100mL/min

发现30kDa截留膜较好地减少了蛋白质污染和缩短了过滤时间，滞留液没有GAS糖显著丢失(表IV)。

表IV

Q-Sepharose层析

阴离子交换层析步骤对减少GAS糖的透明质酸污染以及蛋白质和核酸含量特别有效。

用Akta^TM系统(通用-健康护理公司)进行该步骤，以215nm紫外吸光度检测GAS糖含量。超滤步骤的滞留液中加入100mM NaPi缓冲液(pH7.2)，获得最终浓度10mMNaPi pH7.2的缓冲液。然后用10mM NaPi缓冲液(pH7.2)平衡Q Sepharose^TMXL树脂(通用-健康护理公司)进行阴离子交换层析，加工GAS糖制品。通常1mg GAS糖采用1ml树脂。设定阴离子交换层析(条件)使GAS糖“流穿”，其中的杂质结合于阴离子交换基质。

收集流穿该层析柱的含GAS糖组分，呈现单一主峰(图7)。合并各组分(除图7所示峰尾的那些组分)。

表V显示该方法此阶段示范性多糖回收合并组分中的蛋白质含量和透明质酸含量％。

表V

在另一种方法中，先用100mM NaPi缓冲液(pH7.2)平衡Q Sepharose^TMFF树脂(通用-健康护理公司)至pH＝7.2，然后用10mMNaPi(pH7.2)平衡至导电率＝1.8-2.0mS/cm，进行阴离子交换层析处理GAS糖。表VI显示了层析条件：

表VI

10kDa或5kDa切向流过滤

切向流过滤可导致浓缩GAS糖溶液。GAS糖的浓缩优化了随后的偶联。

当该方法用于5L发酵液时，采用Tandem型装有Hydrosart^TM10kDa截留膜(膜面积200cm²)的1082^TM系统(都是Sartorius公司)进行切向流过滤步骤。压力条件是Pin＝0.5巴，Pout＝0.0巴，流速定为4-5mL/分钟。进行过滤直至达到所需的GAS糖浓度。该浓缩步骤后不需要透析，因为可能导致滤过液的GAS糖损失。

也可用Hydrosart^TM 5kDa截留膜(膜面积200cm²)(Sartorius公司)进行切向流过滤步骤。压力条件是Pin＝0.7巴，Pout＝0.0巴，流速定为2-5mL/分钟。

发现浓缩步骤后纯化GAS糖的最终回收率是：最初5L发酵液可得到约300mg。

表VII显示该方法此阶段的示范性合并组分中的多糖回收，及蛋白质、聚鼠李糖、透明质酸和核酸含量％。图8显示纯化GAS糖的HPLC-SE概貌。

表VII

不想受理论的束缚，认为蛋白含量(用MicroBCA试验(Pearce公司)测定)可能因为GAS糖样品中存在鼠李糖的干涉而人为高估。当用SDS-Page凝胶(NuPAGE^TM 7％Tris-乙酸盐凝胶，Invitrogen公司)测定还原和非还原条件下过量GAS糖样品(630μg，如果蛋白质污染水平为2％，可能约为12.6μg)时，并未检测到这样高水平的蛋白质。

分析方法：

残留聚鼠李糖含量的估计

根据NMR峰的排布(图9)，用以下积分比例(integral ratio)估计聚鼠李糖残留量：

％聚鼠李糖＝[H₁ ^RhaB _VAR/(H₁ ^RhaA+H₁ ^RhaA _VAR)]x100

实施例3

10kDa或5kDa切向流过滤过滤与凝胶过滤步骤之间的比较

在实施例1中，阴离子交换层析步骤后接凝胶过滤步骤，以进一步减少污染。相反，实施例2的优化方法包括切向流过滤(5kDa或10kDa)替代此法该阶段的凝胶过滤。这两种不同方法得到的GAS糖回收水平大致相同。然而，切向流过滤似乎导致聚鼠李糖污染水平更低(用1H NMR测定)。

凝胶过滤步骤

在Akta^TM系统(通用-健康护理公司)上进行层析，用Sephacryl S100凝胶(通用-健康护理公司)进行凝胶过滤。GAS糖制品体积不超过凝胶过滤柱体积的5％。流动相缓冲液是10mM NaPi缓冲液(pH7.2)。

流穿液中多糖呈现两个峰：a)一个GAS糖大峰，和b)一个聚鼠李糖小峰(图10)。聚鼠李糖含量相当高，占样品总多糖约40-50％。

切向流过滤步骤

相反，用优化后的方法获得的GAS糖纯度较高。

图11显示对：1)优化方法的阴离子层析步骤后，和2)该方法的10kDa切向流过滤步骤(在阴离子层析后进行)后，GAS糖样品的凝胶过滤色谱图分析。

用1H NMR比较这些与其它凝胶过滤获得的糖，测定聚鼠李糖污染水平。图12显示在1)优化方法的10kDa切向流过滤步骤后；2)优化方法的10kDa切向流过滤步骤再接凝胶过滤步骤后；和3)优化方法修改，用凝胶过滤步骤替代10kDa切向流过滤步骤后；获得样品的NMR图谱。谱非常相似，显示30kDa切向流过滤和阴离子层析步骤足以纯化GAS糖，所含聚鼠李糖污染低(＜20％)。不需要凝胶过滤步骤，而只用10kDa或5kDa切向流过滤进行浓缩步骤方便了GAS糖的进一步加工，例如与载体分子偶联。

实施例4

偶联物制备

直接还原性胺化反应

通过直接还原性胺化反应偶联纯化的GAS糖与载体蛋白CRM197(图13)。还原性胺化反应涉及载体蛋白赖氨酸侧链氨基和GAS糖的醛基，特别是AS糖还原末端的醛基。

偶联前，用旋转蒸发系统干燥纯化的GAS糖。然后将干燥的GAS糖溶于pH8.0的NaPi 200mM缓冲液中，最终浓度10mg/mL。将载体蛋白CRM₁₉₇加入NaPi 200mM缓冲液(pH8.0)的GAS糖溶液，并加入NaBH₃CN(Aldrich公司)。多糖∶蛋白比例为4∶1(重量/重量)，多糖∶NaBCNH₃比例为2∶1(重量/重量)。反应后，用0.22μm滤膜过滤溶液，37℃保持2天。

两天后，进行SDS-Page凝胶电泳分析(NuPAGE^TM 7％Tris-乙酸盐凝胶(Invitrogen公司))，证实共价偶联形成。结果见图14。

另一种偶联反应

GAS糖也可通过接头与载体分子偶联。纯化的GAS糖可通过己二酸接头与载体蛋白CRM₁₉₇偶联。

第一步，还原性胺化GAS多糖的还原性末端醛基。将纯化的GAS糖溶解于水，最终浓度4mg/mL。加入AcONH₄至300g/L浓度，加入NaBH₃CN至NaBH₃CN∶AcONH₄＝1∶5摩尔比。混合该混合液，核查该混合液的pH＝7.0-7.5。然后37℃保持混合液60小时。最后，用10kDa切向流过滤纯化反应混合液，用约10倍体积的0.1M NaCl透析，再用约10倍体积的水透析。

第二步，用接头活化胺化的GAS糖。先用旋转蒸发系统(Buchi)浓缩胺化的GAS糖，然后溶于水至浓度40μmol/ml氨基。加入等于混合物所含水量9倍的DMSO，加入与氨基摩尔比10∶1的Et₃N。最后，加入与氨基摩尔比12∶1的SIDEA(琥珀酸丁二酯)。室温搅拌反应混合液2小时。向混合液滴加AcOEt(最终反应体积的80％)和NaCl 1M(最终反应体积的1.5％)后，将溶液置冰上1小时，期间活化的GAS糖沉淀为白色固体。然后4000rpm(1780xg)离心悬液15分钟，用等于沉淀体积(用于沉淀GAS糖的AcOEt初始体积)1/3量的AcOEt洗涤沉淀5次。每次洗涤包括混合5分钟然后4000rpm离心5分钟。洗涤后，干燥沉淀过夜。最后一步，使活化GAS糖与CRM₁₉₇蛋白偶联。用活化GAS糖的活性酯与CRM₁₉₇的摩尔比为20∶1的偶联比例进行该反应。用NaPi 100mM缓冲液(pH7.2)稀释CRM₁₉₇至终浓度20mg/mL。然后，温和搅拌将活化的GAS糖粉逐步加入到蛋白质溶液中。然后室温温和搅拌反应混合液3小时。

进行SDS-Page凝胶电泳分析(NuPAGE^TM 7％Tris-乙酸盐凝胶(Invitrogen公司))验证共价偶联物形成。还进行了SEC-HPLC分析。结果见图15。SDS-Page凝胶电泳和SEC-HPLC分析提示含接头的偶联物与直接还原性胺化获得的偶联物之间没有显著差异。

实施例5

小鼠研究

用腹膜内GAS攻击试验测试了通过直接还原性胺化反应偶联CRM₁₉₇的纯化GAS糖的效力。通过腹膜内注射该偶联物(含10μg糖剂量)和铝佐剂免疫小鼠。用化脓性链球菌M1菌株攻击，51％小鼠存活，而没有免疫接种的对照小鼠16％存活。在另一项研究中，用M1或M23菌株攻击小鼠。在该研究中，用M1菌株攻击的经免疫小鼠56％存活，没有免疫小鼠20％存活；而用M23菌株攻击的经免疫小鼠41％存活，对照11％存活。因此，用本发明方法纯化的GAS糖提供了保护性免疫力。

应理解，仅以举例方式描述了本发明，可对此进行修改但仍属于本发明的范围和构思内。

参考文献

[1]Bisno等.(2005)临床传染病杂志41(8)：1150-6.

[2]Cohen-Poradosu和Kasper(2007)临床传染病杂志45(7)：863-5.

[3]世界卫生组织儿童和青少年健康和发育部(2005)“A群链球菌疫苗的开发：现状和与较不发达国家相关的问题”(WHO/FCH/CAH/05.09；WHO/IVB/05.14)

[4]McCarty(1958)实验医学杂志108(3)：311-23.

[5]Dubois等，(1956)分析化学杂志28：350-356.

[6]美国专利5,866,135.

[7]Pancholi和Fischetti(1988)细菌学杂志170(6)：2618-24.

[8]Sabharwal等(2006)传染病杂志193(1)：129-35.

[9]Sabharwal等，(2006)国际会议系列1289：329-331.

[10]Michon等，(2005)传染免疫学杂志73(10)：6383-9.

[11]Fillit等(1986)实验医学杂志164(3)：762-76.

[12]Cunningham于革兰氏阳性病原体，Fischetti等编，ASM出版社，Washington D.C.(2006)ISBN：9781555813437.

[13]Martins等，(2008)国际免疫学杂志20(3)：445-52.

[14]Kreis等(1995)国际生物大分子杂志17(3-4)：117-30.

[15]等(2002)糖类研究337(21-23)：2023-36

[16]www.polymer.de

[17]Park和Johnson(1949)生物化学杂志282，149-151.

[18]Wessels等，(1989)传染免疫学57：1089-94.

[19]Ramsay等，(2001)Lancet 357(9251)：195-196.

[20]Lindberg(1999)疫苗17增刊2：S28-36.

[21]Buttery & Moxon(2000)J R Coll Physicians Lond 34：163-68.

[22]Ahmad & Chapnick(1999)北美传染病临床13：113-33，vii.

[23]Goldblatt(1998)医学微生物学杂志47：563-7.

[24]欧洲专利0477508.

[25]美国专利5,306,492.

[26]WO98/42721.

[27]Dick等，刊于偶联疫苗(Cruse等编)Karger，Basel，1989，10：48-114.

[28]Hermanson生物偶联技术，学术出版社，San Diego(1996)ISBN：0123423368.

[29]Jennings和Lugowski(1981)免疫学杂志127(3)：1011-8.

[30]美国专利4,882,317

[31]美国专利4,695,624

[32]EP-B-0 477 508

[33]分子免疫学，1985，22，907-919

[34]EP-A-0208375

[35]Bethell G.S.等，生物化学杂志，1979，254，2572-4

[36]Hearn M.T.W.，层析杂志，1981，218，509-18

[37]WO00/10599

[38]Gever等，医学微生物免疫学，165：171-288(1979).

[39]美国专利4,057,685.

[40]美国专利4,673,574；4,761,283；4,808,700.

[41]美国专利4,459,286.

[42]美国专利5,204,098

[43]美国专利4,965,338

[44]美国专利4,663,160.

[45]WO2007/000343.

[46]WO 2006/082530.

[47]研究公开，453077(2002年1月)

[48]EP-A-0372501.

[49]EP-A-0378881.

[50]EP-A 0427347.

[51]WO93/17712

[52]WO94/03208.

[53]WO98/58668.

[54]EP A 0471177.

[55]WO91/01146

[56]Falugi等，(2001)欧洲免疫学杂志31：3816-3824.

[57]Baraldo等(2004)传染病免疫学72(8)：4884-7.

[58]EP-A-0594610.

[59]Ruan等，(1990)免疫学杂志145：3379-3384.

[60]WO00/56360.

[61]Kuo等，(1995)传染病免疫学63：2706-13.

[62]Michon等(1998)疫苗16：1732-41.

[63]WO02/091998.

[64]WO01/72337

[65]WO00/61761.

[66]WO00/33882

[67]WO02/34771.

[68]WO99/42130.

[69]WO2004/011027.

[70]WO96/40242.

[71]Lei等，(2000)发育生物学(Basel)103：259-264.

[72]WO00/38711；美国专利6,146,902.

[73]WO99/24578.

[74]WO99/36544.

[75]WO99/57280.

[76]WO00/22430.

[77]Tettelin等(2000)科学287：1809-1815.

[78]WO96/29412.

[79]Pizza等，(2000)科学287：1816-1820.

[80]WO01/52885.

[81]Bjune等，(1991)柳叶刀338(8775)：1093-1096.

[82]Fukasawa等(1999)疫苗17：2951-2958.

[83]Rosenqvist等，(1998)标准发育生物学92：323-333.

[84]Costantinodeng，(1992)疫苗10：691-698.

[85]WO03/007985.

[86]Watson(2000)儿科传染病杂志19：331-332.

[87]Rubin(2000)北美儿科临床47：269-285，v.

[88]Jedrzejas(2001)微生物学分子生物学综述65：187-207.

[89]Bell(2000)儿科传染病杂志19：1187-1188.

[90]Iwarson(1995)APMIS 103：321-326.

[91]Gerlich等，(1990)疫苗8增刊：S63-68 & 79-80.

[92]Hsu等，(1999)临床肝病3：901-915.

[93]Gustafsson等(1996)新英格兰医学杂志334：349-355.

[94]Rappuoli等(1991)TIBTECH 9：232-238.

[95]疫苗(2004)，Plotkin & Orenstein编，ISBN 0-7216-9688-0.

[96]WO02/02606.

[97]Kalman等(1999)天然遗传学21：385-389.

[98]Read等，(2000)核酸研究28：1397-406.

[99]Shirai等，(2000)传染病杂志181(增刊3)：S524-S527.

[100]WO99/27105.

[101]WO00/27994.

[102]WO00/37494.

[103]WO99/28475.

[104]Ross等(2001)疫苗19：4135-4142.

[105]Sutter等(2000)北美儿科临床47：287-308.

[106]Zimmerman & Spann(1999)美国家庭医师59：113-118，125-126.

[107]Dreesen(1997)疫苗15增刊：S2-6.

[108]MMWR流动性死亡率周报1998年1月16；47(1)：12，19.

[109]McMichael(2000)疫苗19增刊1：S101-107.

[110]WO03/093306.

[111]WO2004/018646.

[112]WO2004/041157.

[113]Robinson & Torres(1997)免疫学研讨会9：271-283.

[114]Donnelly等(1997)免疫学年度回顾15：617-648.

[115]Scott-Taylor & Dalgleish(2000)药物调查专家的观点9：471-480.

[116]Apostolopoulos & Plebanski(2000)分子医疗目前观点2：441-447.

[117]Ilan(1999)分子医疗目前观点1：116-120.

[118]Dubensky等(2000)分子药物学6：723-732.

[119]Robinson & Pertmer(2000)高级病毒研究55：1-74.

[120]Donnelly等(2000)美国呼吸道重症监护杂志162(4 Pt 2)：S190-193.

[121]Davis(1999)西奈山医学杂志66：84-90.

[122]Gennaro(2000)Remington：药物科学和实践，20版，ISBN：0683306472.

[123]Almeida & Alpar(1996)药物靶向杂志3：455-467。

Claims

1.一种制备含化脓性链球菌Streptococcus pyogenes GAS糖和药学上可接受载体的药物组合物的方法，所述GAS糖通过含阴离子交换层析步骤的过程纯化以降低其中透明质酸污染。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化的GAS糖分子量为10kDa。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述糖部分或完全去N-乙酰化。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法的起始物质是GAS糖的水悬液，该悬液还含有透明质酸和/或聚鼠李糖。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，通过处理化脓性链球菌制备所述悬液，从而通过还原型酸处理释放所述GAS糖。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法在阴离子交换层析步骤前包括一次或多次过滤步骤。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述过滤是采用0.65μm滤膜的正交过滤。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法在阴离子交换层析步骤前包括一次或多次超滤步骤。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述超滤是采用30kDa截留值膜的切向流过滤。

10.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，采用Q-树脂作为阴离子交换基质进行所述阴离子交换层析步骤。

11.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，每1mg GAS糖采用1ml阴离子交换基质树脂对进行阴离子交换层析步骤。

12.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在允许GAS糖流穿的条件下进行所述阴离子交换层析步骤。

13.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析的流动相缓冲液包含醇。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述流动相缓冲液中醇的最终浓度介于15％-25％之间。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述醇是乙醇。

16.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，该方法在阴离子交换层析步骤后包括一次或多次凝胶过滤步骤。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述凝胶过滤步骤采用葡聚糖凝胶作为凝胶过滤基质。

18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，每0.2mg GAS糖采用1ml凝胶过滤基质进行所述凝胶过滤步骤。

19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，采用与阴离子交换层析步骤相同的流动相缓冲液进行凝胶过滤步骤。

20.如权利要求16所述的方法，其特征在于，采用权利要求13-15任何一项所述的流动相缓冲液进行凝胶过滤步骤。

21.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法在阴离子交换层析步骤后包括一次或多次浓缩GAS糖步骤。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，采用5-10kDa截留值膜通过切向流过滤进行所述浓缩步骤。

23.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，该方法还包括将纯化的GAS糖与载体分子偶联的步骤。