ES2358427T3

ES2358427T3 - Elementos de unión a cd-3 desinmunizados multiespecíficos.

Info

Publication number: ES2358427T3
Application number: ES04790488T
Authority: ES
Inventors: Robert Hofmeister; Birgit Kohleisen; Ulla LENKKERI-SCHÜTZ; Christian Itin; Patrick BÄUERLE; Francis J. Carr; Anita A. Hamilton; Stephen Williams
Original assignee: Micromet GmbH
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH
Priority date: 2003-10-16
Filing date: 2004-10-15
Publication date: 2011-05-10
Anticipated expiration: 2024-10-15
Also published as: NO340900B1; CA2542239C; KR101229731B1; HRP20110187T1; KR20060101485A; KR20120125634A; MXPA06004035A; AU2004283850A1; HK1086846A1; IL174902A; AU2004283850C1; CA2542239A1; CN100453556C; JP4948174B2; CN1867586A; SI1673398T1; PL1673398T3; US20130224205A1; EP2292664A2; JP2007537714A

Abstract

Una construcción de unión específica a CD3 citotóxicamente activa que comprende un primer dominio que se une específicamente a CD3 humano y un segundo dominio de unión derivado de Ig, en la que dicho primer dominio está desinmunizado y comprende una región CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en SEC ID Nº: 88, una región CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en SEC ID Nº: 90 ó 92 y una región CDR-H3, que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en SEC ID Nº: 96, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 ó 127; y en la que dicho primer dominio comprende adicionalmente en su H1 flanqueante la secuencia VKK y en la que la secuencia de transición entre la región H1 flanqueante y CDRH1 comprende la secuencia Ala-Ser- Gly-Tyr-Thr-Phe (ASGYTF; SEC ID Nº: 233).

Description

La presente invención se refiere a una construcción de unión específica a un CD3 citotóxicamente activa que comprende un primer dominio que se une específicamente a CD3 humano y un segundo dominio de unión derivado de Ig. Además, se proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una construcción de unión específica a CD3 de la invención. Son aspectos adicionales de la invención vectores y células huésped que comprenden dicha secuencia de ácido nucleico, un procedimiento para la producción de la construcción de la invención y una composición que comprende dicha construcción. La invención también proporciona el uso de dichas construcciones para la preparación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades particulares y un kit que comprende la construcción de unión de la invención.

CD3 humano indica un antígeno que se expresa en linfocitos T como parte del complejo de linfocitos T multimolecular y que consiste en tres cadenas diferentes: CD3-, CD3- y CD3-. El agrupamiento de CD3 en linfocitos T, por ejemplo, por anticuerpos anti-CD3 inmovilizados conduce a una activación de linfocitos T similar a la unión del receptor de linfocitos T pero independientemente de su especificidad típica de clon; véase Documento WO 99/54440 ó Hoffman (1985) J. Immunol. 135:5-8.

Se describen anticuerpos que reconocen específicamente antígeno CD3 en la técnica anterior, por ejemplo en Traunecker, EMBO J 10 (1991), S655-9 y Kipriyanov, Int. J. Cáncer 77 (1998), 763-772. Recientemente, se han propuesto los anticuerpos dirigidos contra CD3 en el tratamiento de una diversidad de enfermedades. Estos anticuerpos o construcciones de anticuerpos actúan como agentes de agotamiento de linfocitos T o como agentes mitógenos, como se desvela en el Documento EP 1 025 854. Se desvelan anticuerpos híbridos de ser humano/roedor que se unen específicamente al complejo de antígeno CD3 humano en el Documento WO 00/05268 y se proponen como agentes inmunosupresores, por ejemplo para el tratamiento de episodios de rechazo después del trasplante de aloinjertos renales, sépticos y cardiacos. El Documento WO 03/04648 desvela un anticuerpo biespecífico dirigido a CD3 y a un antígeno de cáncer ovárico. Además, Kufer (1997) Cancer Immunol lmmunother 45:193-7 se refiere a un anticuerpo biespecífico específico para CD3 y EpCAM para la terapia del cáncer residual mínimo.

Sin embargo, los anticuerpos de la técnica anterior dirigidos contra CD3 derivan de fuentes no humanas. Esto conduce a varios problemas graves cuando se usan tales anticuerpos anti-CD3 como parte de un régimen terapéutico en seres humanos.

Un problema tal es “síndrome de liberación de citocinas (CRS)”. CRS es un síndrome clínico que se ha observado después de la administración de las primeras pocas dosis de anticuerpo anti-CD3 y está relacionado con el hecho de que muchos anticuerpos dirigidos contra CD3 son mitógenos. In vitro, los anticuerpos mitógenos dirigidos contra CD3 inducen proliferación de linfocitos T y producción de citocinas. In vivo, esta actividad mitógena conduce a la liberación a gran escala de citocinas, incluyendo muchas citocinas derivadas de linfocitos T, durante las horas iniciales después de la primera inyección de anticuerpo. La capacidad mitógena de anticuerpos específicos de CD3 es dependiente de monocito/macrófago e implica la producción de IL-6 e IL-1 por estas células.

Los síntomas de CRS varían de síntomas “de tipo gripe” suaves a reacciones presentadas menos frecuentemente de “tipo choque” graves (que pueden incluir manifestaciones cardiovasculares y del sistema nervioso central). Los síntomas incluyen, entre otros, cefalea, temblor, náusea/vómitos, diarrea, dolor abdominal, malestar y achaques de los músculos/articulaciones, debilidad generalizada, acontecimientos cardiorrespiratorios así como acontecimientos neuropsiquiátricos. Se han producido varios edemas pulmonares en pacientes con sobrecarga de fluidos y en los que no parecían tener una sobrecarga de fluidos. Otro problema grave que obstaculiza el uso terapéutico de, especialmente, anticuerpos monoclonales murinos es la inducción de la respuesta inmune humoral contra tales anticuerpos, dando como resultado la producción de anticuerpos anti-ratón humanos (“HAMA”) (Schroff (1985) Cáncer Res.45:879-885, Shawler (1985) J. Immunol. 135:1530-1535). Los HAMA típicamente se generan durante la segunda semana de tratamiento con el anticuerpo murino y neutralizan los anticuerpos murinos, bloqueando de este modo su capacidad para unirse a su diana pretendida. La respuesta de HAMA puede depender de las regiones de anticuerpo constantes murinas (“Fc”) y/o la naturaleza de las regiones variables murinas (“V”).

La técnica anterior contiene diversos enfoques para reducir o prevenir la producción de HAMA mediante la modificación de anticuerpos monoclonales de origen no humano.

Un enfoque para reducir la inmunogenicidad de tales anticuerpos es mediante humanización, como por ejemplo se describe en el Documento WO 91/09968 y el Documento US 6.407.213. En general, la humanización implica sustituciones de secuencia de anticuerpo no humanas con secuencias humanas correspondientes, como es el caso por ejemplo con insertos de CDR.

Otro enfoque para reducir la inmunogenicidad de tales anticuerpos es mediante desinmunización, como por ejemplo se describe en los Documentos WO 00/34317, WO 98/52976, WO 02/079415, WO 02/012899 y WO 02/069232. En general, la desinmunización implica llevar a cabo sustituciones de aminoácidos dentro de epítopos de linfocitos T potenciales. De este modo, la probabilidad de que una secuencia dada de lugar a epítopos de linfocitos T tras el procesamiento proteico intracelular se reduce. Además, el Documento WO 92/10755 describe un enfoque en el que se desarrollan por ingeniería genética determinantes antigénicos en proteínas. Particularmente, las proteínas se mapean con respecto a epítopos y su secuencia de aminoácidos se cambia a través de ingeniería genética.

Sin embargo, los anticuerpos humanizados con frecuencia muestran una afinidad de unión disminuida con respecto a su diana en comparación con sus anticuerpos parentales no humanizados y también con frecuencia aún son inmunogénicos en cierta medida en un huésped humano.

Por lo tanto, el problema técnico de la presente invención fue la provisión de medios y procedimientos para el tratamiento de y/o el alivio de enfermedades tumorales, trastornos proliferativos así como enfermedades relacionadas con linfocitos B por inducción de respuesta inmune mediada por linfocitos T. Los medios y procedimientos anteriormente mencionados deberían superar las desventajas mencionadas de terapias basadas en anticuerpos conocidas.

La solución a dicho problema técnico se consigue proporcionando los anticuerpos caracterizados en las reivindicaciones.

En consecuencia, la presente invención se refiere a una construcción de unión específica a CD3 citotóxicamente activa que comprende un primer dominio que se une específicamente a CD3 humano y un segundo dominio de unión derivado de Ig, en la que dicho primer dominio está desinmunizado y comprende una región CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en SEC ID Nº: 88, una región CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en SEC ID Nº: 90 ó 92 y una región CDR-H3, que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en SEC ID Nº: 96, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 ó 127; y en la que dicho primer dominio comprende adicionalmente en su H1 flanqueante la secuencia VKK (Val-Lys-Lys) y en la que la secuencia de transición entre la región flanqueante H1 y CDR-H1 comprende la secuencia Ala-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe (ASGYTF; SEC ID Nº: 233).

Se descubrió sorprendentemente que las modificaciones específicas anteriormente mencionadas a regiones CDR así como regiones flanqueantes y sus secuencias de transición correspondientes conducen a moléculas de unión específica a CD3 desinmunizadas que muestran una inmunogenicidad reducida pero conservan su actividad citotóxica en comparación con secuencias no desinmunizadas originales. Este hallazgo fue sorprendente en particular porque no todos los protocolos de desinmunización posibles condujeron a construcciones funcionales bioactivas que muestran actividad citotóxica particular; véanse los ejemplos adjuntos. Además, sorprendentemente las moléculas de unión a CD3 citotóxicamente activas desinmunizadas mostraron un aumento de la productividad. De acuerdo con la presente invención, secuencias específicas de anticuerpos no desinmunizados se han reemplazado por/modificado a las secuencias mencionadas en el presente documento anteriormente. En particular, en las regiones flanqueantes H1 la secuencia original Leu-Ala-Arg (LAR) se ha reemplazado con la secuencia Val-Lys-Lys (VKK). Además, la secuencia Thr-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe (TSGYTF) comprendida en la región de transición de H1 flanqueante y CDR-H1 de algunos anticuerpos específicos de CD3 no desinmunizados/no modificados se ha modificado de acuerdo con la invención a Ala-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe (ASGYTF) (SEC ID Nº:233) (véase Figura 14). Una construcción de unión específica a CD3 de la invención deseada se caracteriza por que comprende al menos dos especificidades de unión por las que una segunda especificidad de unión deriva de Ig. Además, dichas construcciones deseadas se caracterizan por la secuencia de aminoácidos específica mostrada en el presente documento anteriormente. Según se documenta en los ejemplos adjuntos las construcciones como se proporcionan en el presente documento aún conservan bioactividad en su forma modificada/desinmunizada. Los ejemplos también documentan que no todas las desinmunizaciones, determinadas por procedimientos conocidos en la técnica (documentos WO 92/10755, WO 00/34317, WO 98/52976, WO 02/079415 ó WO 02/012899), conducen a moléculas bioactivas; véase en particular los ejemplos 2 y 5.

La expresión “construcción de unión a CD3 citotóxicamente activa”, como se usa en el presente documento se refiere a una construcción específica de CD3 capaz de unirse al complejo CD3 humano expresado en linfocitos T y capaz de inducir eliminación/lisis de células diana. La unión de elementos de unión específicos de CD3 del complejo CD3/CD3 (por ejemplo anticuerpos, derivados de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos) conduce a la activación de linfocitos T como se conoce la técnica; véase el Documento WO 99/54440. En consecuencia, una construcción de la invención tiene que ser capaz de eliminar/lisar células diana in vivo y/o in vitro. Las células diana correspondientes comprenden células que expresan una molécula de superficie, que se reconoce por el segundo dominio de unión derivado de Ig de las construcciones de la invención. Tales moléculas de superficie están caracterizadas en el presente documento posteriormente. Puede detectarse citotoxicidad por procedimientos conocidos en la técnica y procedimientos como se ilustran en el presente documento posteriormente y en los ejemplos adjuntos. En consecuencia, tales procedimientos comprenden, entre otros, ensayos in vitro fisiológicos. Tales ensayos fisiológicos pueden controlar la muerte celular, por ejemplo por pérdida de integridad de membrana celular (por ejemplo ensayo de yoduro de propidio basado en FACS, ensayo de afluencia de azul de tripano, ensayos de liberación de enzima fotométricos (LDH), ensayo de liberación de 51Cr radiométrico, ensayos de liberación de CalceinaAM y de liberación de Europio fluorométrico). Ensayos adicionales comprenden controlar la viabilidad celular, por ejemplo mediante ensayos de Azul de alamar, WST-1, XTT, MTT fotométricos, ensayo de incorporación de 3H-Thd radiométrico, ensayo clonogénico que mide la actividad de división celular, y ensayo fluorométrico de Rodamina123 que mide el gradiente transmembrana mitocondrial. Además, puede controlarse la apoptosis por ejemplo mediante ensayo de exposición de fosfatidilserina basado en FACS, ensayo de TUNEL basado en ELISA, ensayo de la actividad caspasa (fotométrico, fluorométrico o basado en ELISA) o analizando el cambio de la morfología de la célula (contracción, aparición de ampollas en la membrana). Se prefiere analizar la actividad citotóxica mediante mediciones basadas en FACS de liberación de colorantes basados en fluorescencia. En un ensayo tal las células marcadas con fluorescencia, que portan una molécula que se une al segundo dominio de la construcción de unión a CD3 biespecífica citotóxicamente activa de la invención (preferentemente, células NALM-6 para CD19 y células Kato para el antígeno EpCAM) se incuban con PBMC aisladas de donantes aleatorios

: o con una línea de linfocitos T normalizada en presencia de la construcción de unión a CD3 biespecífica citotóxicamente activa de la invención. Después de incubación, la liberación del colorante a partir de las células diana fluorescentes en el sobrenadante se determina mediante un espectrofluorímetro. Una construcción a CD3 biespecífica desinmunizada citotóxicamente activa de la presente invención se caracteriza mediante la comparación de valores obtenidos mediante la medición de la bioactividad de una construcción similar que no está desinmunizada

: o que no tiene especificidad por las células diana.

La expresión “que se une a/que interactúa con” como se usa en el contexto con la presente invención define una unión/interacción de al menos dos “sitios de interacción con antígeno” entre sí. La expresión “sitio interacción con antígeno” define, de acuerdo con la presente invención, un motivo de un polipéptido que muestra la capacidad de interacción específica con un antígeno específico o un grupo específico de antígenos. Dicha unión/interacción también se entiende que define un “reconocimiento específico”. La expresión “que reconoce específicamente” significa de acuerdo con la presente invención que la molécula de anticuerpo es capaz de interaccionar específicamente con y/o unirse al menos a dos aminoácidos de cada una de las moléculas diana humanas como se define en el presente documento. Los anticuerpos pueden reconocer, interaccionar y/o unirse con diferentes epítopos en la misma molécula diana. Dicha expresión se refiere a la especificidad de la molécula de anticuerpo, es decir a su capacidad para diferenciar entre las regiones específicas de la molécula diana humana como se define en el presente documento. La interacción específica del sitio de interacción con antígeno con su antígeno específico puede dar como resultado un inicio de una señal, por ejemplo debido a la inducción de un cambio de la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc. De este modo, un motivo específico en la secuencia de aminoácidos del sitio de interacción con antígeno y el antígeno se unen entre sí como resultado de su estructura primaria, secundaria o terciaria así como resultado de modificaciones secundarias de dicha estructura.

La expresión “interacción específica” como se usa de acuerdo con la presente invención significa que la construcción de unión específica a CD3 de la invención no reacciona de forma cruzada o esencialmente no reacciona de forma cruzada con (poli)péptidos de estructuras similares. En consecuencia, la construcción de la invención específicamente se une/interacciona con CD3 humano y es capaz, debido a su segundo dominio derivado de Ig de interaccionar con compuestos distintos seleccionados específicos, antígenos, marcadores de superficie celular, marcadores tumorales, etc. Posteriormente en el presente documento se proporcionan ejemplos específicos de tales moléculas contra las que se dirige dicho segundo dominio derivado de Ig.

La reactividad cruzada de un panel de construcciones a investigar puede ensayarse, por ejemplo, evaluando la unión de dicho panel de construcciones de cadena sencilla biespecíficas en condiciones convencionales (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 y Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) con el (poli)péptido de interés así como a varios (poli)péptidos relacionados de forma más o menos (estructuralmente y/o funcionalmente) cercana. Solamente las construcciones (es decir anticuerpos, scFvs (biespecíficos) y similares) que se unen con el (poli)péptido/proteína de interés pero que no se unen o esencialmente no se unen a ninguno de los otros (poli)péptidos que se expresan preferentemente por el mismo tejido que el (poli)péptido de interés, por ejemplo por las células del tejido cardiaco, se consideran específicas para (poli)péptido/proteína de interés y se seleccionan para estudios adicionales de acuerdo con el procedimiento proporcionado en el presente documento e ilustrado en los ejemplos adjuntos. Esto procedimientos pueden comprender, entre otros, estudios de unión, estudios de bloqueo y competición con moléculas estrechamente relacionadas estructural y/o funcionalmente. Estos estudios de unión también comprenden análisis de FACS, resonancia de plasmon superficial (SPR, por ejemplo con BIAcore®), ultracentrifugación analítica, calorimetría de valoración isotérmica, anisotropía de fluorescencia, espectroscopia de fluorescencia o mediante ensayos de unión a ligando radiomarcado. Además, pueden realizarse ensayos fisiológicos, tales como ensayos citotóxicos (como se ilustra en los ejemplos) y ensayos mencionados anteriormente. En consecuencia, los ejemplos para interacción específica de un sitio de interacción con antígeno con un antígeno específico pueden comprender la especificidad de un ligando por su receptor. Dicha definición comprende particularmente la interacción de ligandos que inducen una señal tras la unión con su receptor específico. Los ejemplos para ligandos correspondientes comprenden citocinas que interaccionan/se unen con/a sus receptores de citocinas específicos. También está comprendida de forma particular en dicha definición la unión de un sitio de interacción con antígeno con antígenos tales como antígenos de la familia de la selectina, integrinas y de la familia de factores de crecimiento tales como EGF. Otro ejemplo para dicha interacción, que también está comprendida particularmente por dicha definición, es la interacción de un determinante antigénico (epítopo) con el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo.

La expresión “que se unen con/que interacciona con” se refiere no solamente a un epítopo lineal sino que también puede referirse a un epítopo conformacional, un epítopo estructural o un epítopo discontinuo que consiste en dos regiones de las moléculas dianas humanas o parte de las mismas. En el contexto de la presente invención, un epítopo conformacional se define por dos o más secuencia de aminoácidos discretas separadas en la secuencia primaria que se juntan en la superficie de la molécula cuando el polipéptido se pliega a la proteína nativa (Sela, (1969) Science 166, 1365 y Laver, (1990) Cell 61, 553-6).

La expresión “epítopo discontinuo” significa en el contexto de la invención epítopos no lineales que se ensamblan a partir de restos de parte distantes de la cadena polipeptídica. Estos restos se juntan en la superficie cuando la cadena polipeptídica se pliega en una estructura tridimensional para constituir un epítopo conformacional/estructural.

También se prevé que las construcciones de la presente invención se unan/interaccionen específicamente con un epítopo o epítopos conformacionales/estructurales compuestos de y/o que comprenden las dos regiones del complejo de CD3 humano descrito en el presente documento o partes del mismo como se desvelan en el presente documento posteriormente.

En consecuencia, puede determinarse la especificidad experimentalmente por procedimientos conocidos en la técnica y procedimientos como se describen y desvelan en el presente documento. Tales procedimientos comprenden, pero sin limitación transferencia de Western, ensayos de ELISA, RIA, ECL, IRMA y exploraciones peptídicas.

La expresión “segundo dominio de unión derivado de Ig” se refiere a un “dominio derivado de inmunoglobulina”, específicamente a un anticuerpo o fragmentos del mismo, a anticuerpo de cadena sencilla, a anticuerpos sintéticos, a fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, fragmentos F(ab2)’, Fv o scFv, etc., o un derivado químicamente modificado de cualquiera de estos. Estas moléculas de anticuerpos pueden derivarse de diferentes especies o pueden ser de origen quimérico. Más preferentemente (como se documenta posteriormente en el presente documento), dicho segundo dominio derivado de Ig comprendido en la construcción de unión específica a CD3 de la invención es un scFv. Los anticuerpos, construcciones de anticuerpo, fragmentos de anticuerpo, derivado de anticuerpo(todos derivados de Ig) a emplear de acuerdo con la invención o su cadena o cadenas de inmunoglobulinas correspondientes puede modificarse adicionalmente usando técnicas convencionales conocidas en la materia, por ejemplo, mediante el uso de delección o delecciones, inserción o inserciones, sustitución o sustituciones, adición o adiciones y/o recombinación o recombinaciones de aminoácidos y/o cualquier otra modificación o modificaciones conocidas en la técnica solas o en combinación. Los procedimientos para introducir tales modificaciones en la secuencia de ADN subyacente a la secuencia de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina se conocen bien para el experto en la materia; véase, por ejemplo, Sambrook (1989), en el lugar ya citado. La expresión “dominio derivados de Ig” se refiere particularmente a construcciones de (poli)péptido que comprenden al menos una CDR. Los fragmentos o derivados de los dominios derivados de Ig mencionados definen (poli)péptidos que son parte de las moléculas de anticuerpo anteriores y/o que se modifican por procedimientos químicos/bioquímicos o de biología molecular. Los procedimientos correspondientes se conocen en la técnica y se describen entre otros en los manuales de laboratorio (véase Sambrook y col.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2º edición 1989 y 3º edición 2001; Gerhardt y col.; Methods for General and Molecular Bacteriology; ASM Press, 1994; Lefkovits; Immunology Meth-5 ods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Inter-actions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002).

El término “desinmunizado” como se usa el presente documento se refiere al primer dominio anteriormente identificado de la construcción de unión a CD3 de la invención, modificándose dicho primer dominio en comparación con una construcción de tipo silvestre original haciendo a dicha construcción de tipo silvestre no inmunogénica o menos inmunogénica en seres humanos. Las construcciones de tipo silvestre de acuerdo con la invención se refieren a anticuerpos o parte de los mismos (tales como flanqueantes y/o CDR) de origen no humano. Son ejemplos correspondientes a anticuerpos o fragmentos de los mismos como se describen el Documento US 4.361.549 ó el Documento WO 99/54440. El término “desinmunizado” también se refiere a construcciones, que muestran una propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T. De acuerdo con la presente invención, la expresión “propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T” se refiere a la retirada de epítopos de linfocitos T que conducen a activación específica de linfocitos T. Además, una propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T significa sustitución de aminoácidos que contribuyen a la formación de epítopos de linfocitos T, es decir sustitución de aminoácidos que son esenciales para la formación de un epítopo de linfocitos T. En otras palabras, una propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T se refiere a inmunogenicidad reducida o capacidad reducida de inducir proliferación de linfocitos T independiente de antígeno. Además, una propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T se refiere a desinmunización, que significa pérdida o reducción de epítopos de linfocitos T de secuencias de aminoácidos que inducen proliferación de linfocitos T independiente de antígeno. De acuerdo con la invención, una región de unión a CD3, que tiene propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T es menos o preferentemente no inmunogénica en comparación con moléculas no desinmunizadas pero que aún conservan su capacidad de unión a CD3, es decir, una construcción de anticuerpo no inmunogénica o de baja inmunogenicidad que se une a CD3.

La expresión “epítopo de linfocitos T” se refiere a secuencias peptídicas cortas que pueden liberarse durante la degradación de péptidos, polipéptidos o proteínas dentro de células y posteriormente presentarse por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) para desencadenar la activación de linfocitos T; véase entre otros el Documento WO 02/066514. Para péptidos presentados por MHC de clase II dicha activación de linfocitos T puede dar lugar después a una respuesta de anticuerpos por estimulación directa de linfocitos T para producir dichos anticuerpos. En consecuencia, un primer dominio desinmunizado que se une específicamente a un CD3 humano comprende al menos la CDR-H3 anteriormente mencionada localizada entre las H3 y H4 flanqueantes, mostrando dicho primer dominio de unión una propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T en comparación con un primer dominio no desinmunizado que comprende la (wt)-CDR-H3 de tipo silvestre no modificada localizada entre las H3 y H4 flanqueantes. Además, dicho primer dominio desinmunizado comprende al menos en la región de transición de la H1 flanqueante y CDR-H1 el motivo de secuencia anteriormente mencionado que proporciona una propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T en comparación con un primer dominio no desinmunizado que comprende la región de transición wt-H1 no modificada de la H1 flanqueante y CDR-H1. La “propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T” y/o “desinmunización” puede medirse por técnicas conocidas en la materia. Preferentemente, la desinmunización de proteína puede ensayarse in vitro por un ensayo de proliferación de linfocitos T. En este ensayo se exploran PBMC de donantes que representan > 80 % de alelos de HLA-DR en el mundo con respecto a proliferación en respuesta a péptidos de tipo silvestre o desinmunizados. Idealmente la proliferación celular se detecta solamente después que cargar las células presentadoras de antígenos con péptidos de tipo silvestre. Como alternativa, puede ensayarse la desinmunización mediante la expresión de tetrámeros de HLA-DR que representan todos los haplotipos. Estos tetrámeros puede ensayarse con respecto a unión de péptidos

o cargarse con péptidos sustitutos para células de presentación de antígenos en ensayos de proliferación. Para ensayar si están presentes péptidos desinmunizados en haplotipos HLA-DR, puede medirse la unión de péptidos marcados con fluorescencia en PBMC. Además, puede probarse la desinmunización determinando si se han formado anticuerpos contra las moléculas desinmunizadas después de la administración en pacientes. Un procedimiento particular preferido es un ensayo de proliferación de linfocitos T como, entre otros, se muestra en el ejemplo adjunto 6.

Preferentemente, se desinmunizan moléculas derivadas de anticuerpos en las regiones flanqueantes y la mayoría de las regiones CDR no se modifican para generar una propensión reducida a inducir epítopos de linfocitos T de modo que la afinidad de unión de las regiones CDR no se ve afectada. Incluso la eliminación de un epítopo de linfocitos T da como resultado una inmunogenicidad reducida. Preferentemente, la molécula se desinmuniza en la región CDR2 de la cadena VL, más preferentemente en la región CDR2 de la cadena VH, incluso más preferentemente en la región CDR1 de la cadena VL, incluso más preferentemente en la región CDR1 de la cadena VH, más preferentemente en la región flanqueante (FR) de la cadena VL y más preferentemente en la región flanqueante (FR) de la cadena VH.

El término “CDR” como se emplea en el presente documento se refiere a “región determinante de complementariedad” que se conoce bien en la técnica. Las CDR son partes de inmunoglobulinas y receptores de linfocitos T que determinan la especificidad de dichas moléculas y entran en contacto con ligando específico. Las CDR son la parte más variable de la molécula y contribuyen a la diversidad de estas moléculas. Existen tres regiones CDR CDR1, CDR2 y CDR3 en cada dominio V. CDR-H representa una región CDR de una cadena pesada variable y CDR-L se refiere a una región CDR de una cadena ligera variable. H significa la cadena pesada variable y L significa la cadena ligera variable. Las regiones CDR de una región derivada de Ig pueden determinarse como se describe en Kabat (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edic., Publicación de NIH nº 91-3242

U.S. Department of Health and Human Services, Chothia (1987). J. Mol. Biol. 196, 901-917 y Chothia (1989) Nature, 342, 877-883.

En general CDR-L1 consiste en 10-17 restos aminoacídicos, comienza aproximadamente en el resto aminoacídico 24 de la región VL completa de una secuencia derivada de Ig y el resto Cys precede a la CDR-L1. Preferentemente, el resto Trp sigue a CDR-L1. CDR-L2 comienza preferentemente 16 restos aminoacídicos después de CDR-L1 y consiste preferentemente en 7 restos. Preferentemente, los restos aminoacídicos Ile-Tyr, pero también, Val-Tyr, Ile-Lys, Ile-Phe preceden a CDR-L2. CRD-L3 comienza, preferentemente, 33 restos aminoacídicos después de CDR-L2 y consiste, preferentemente, en 7-11 restos. CDR-L3 sigue, preferentemente al resto Cys y, preferentemente, los restos Phe-Gly-Xaa-Gly siguen directamente a CRD-L3. CDR-H1 consiste en, preferentemente, 10-12 restos y comienza, preferentemente, aproximadamente en el resto 26 desde el comienzo de la región VH. Preferentemente, el resto Trp sigue a CDR-H1. CDR-H2 comienza, preferentemente, 15 restos aminoacídicos después del final de CDR-H1 y consiste, preferentemente en 16 a 19 restos. Preferentemente, los restos Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala siguen a CDR-H2. CDR-H3 comienza 33 restos aminoacídicos después de CDR-H2 y tiene una longitud de 3-25 restos aminoacídicos. CDR-H3 sigue a la secuencia Cys-Xaa-Xaa (preferentemente Cys-Ala-Arg) y los restos Trp-Gly-Xaa-Gly siguen a CDR-3. La estructura de regiones CDR se ha descrito en http://www.bioinf.org.uk/abs/.

Las regiones CDR-H1 y CDR-H2 anteriormente mencionadas derivan de moléculas de anticuerpo que son capaces de unirse específicamente/interaccionar con CD3 humano. Dichos anticuerpos específicos CD3 se conocen en la técnica y comprenden en particular los anticuerpos monoclonales OKT-3, TR-66 o X35-3, VIT3, BMA030 (BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, F111-409, CLB-T3.4.2, TR-66, WT32, SPv-T3b, 11D8, XIII-141, XIII-46, XIII-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, OKT3D, M-T301, SMC2, F101.01, UCHT-1 o WT-31. Todos los anticuerpos anti-CD3 mencionados son específicos de seres humanos y de acuerdo con la presente invención es posible combinar diversas regiones CDR, en particular regiones CDRH de los anticuerpos.

En una realización más preferida, dichas regiones CDR-H1 y CDR-H2 de dicho dominio específico de CD3 con propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T derivan de la construcción de anticuerpos descrita en el documento WO 99/54440. Incluso más preferentemente (y como se ilustra en los ejemplos adjuntos) dichas regiones CDR-H1 y CDR-H2, así como la región CDR-H3 derivan de un anticuerpo/derivado de anticuerpo con especificidad por la molécula CD3 descrita por Traunecker (1991), EMBO J. 10, 3655-3659. De acuerdo con la presente invención, dichas regiones CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 derivan de anticuerpos/derivados de anticuerpos y similares que son capaces de reconocer específicamente la cadena CD3- en el contexto de otras subunidades TCR, por ejemplo en células de ratón transgénicas para cadena CD3- humana. Estas células de ratón transgénicas expresan cadena CD3- humana en una conformación nativa o casi nativa.

De acuerdo con la presente invención, una región flanqueante se refiere a una región en el dominio V (dominio VH o VL) de inmunoglobulinas y receptores de linfocitos T que proporciona un armazón proteico para las regiones determinantes de complementariedad hipervariables (CDR) que entran en contacto con el antígeno. En cada dominio V, existen cuatro regiones flanqueantes designadas FR1, FR2, FR3 y FR4. La flanqueante 1 abarca la región desde el extremo N-terminal del dominio V hasta el comienzo de CDR1, flanqueante 2 se refiere a la región entre CDR1 y CDR2, flanqueante 3 abarca la región entre CDR2 y CDR3 y flanqueante 4 significa la región desde el extremo de CDR3 hasta el extremo C-terminal del dominio V; véase, entre otros, Janeway, Immunobiology, Garland Publishing, 2001, 5ª ed. De este modo, las regiones flanqueantes abracan todas las regiones fuera de las regiones CDR en dominios VH o VL. Además, la expresión “secuencia de transición entre una región flanqueante y una CDR” se refiere a un punto de unión directo entre la región flanqueante y CDR. En particular, la expresión “secuencia de transición entre una región flanqueante y una CDR” significa la secuencia directamente localizada N- y C-terminal de las regiones CDR o aminoácidos que rodean a las regiones CDR. En consecuencia, las flanqueantes también pueden comprender secuencias entre diferentes regiones CDR. El experto en la materia está en una posición para fácilmente deducir a partir de una secuencia dada las regiones flanqueantes, las CDR así como las secuencias de transición correspondientes; véase Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edic., Publicación de NIH nº 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services, Chothia (1987). J. Mol. Biol. 196, 901-917 y Chothia (1989) Nature, 342, 877-883.

Una construcción de unión específica a CD3 citotóxicamente activa preferida de la invención comprende adicionalmente en dicho primer dominio una región H3 flanqueante que comprende la secuencia Met-Glu-Leu-Ser (MELS; SEC ID Nº: 234). Se prefiere incluso más una construcción de la invención que comprende en dicho primer dominio una región H3 flanqueante que comprende la secuencia Ile-Thr-Thr-Asp-Lys (ITTDK; SEC ID Nº: 235).

De acuerdo con la presente invención, el primer dominio de la construcción de la invención que se une específicamente/interacciona con CD3 humano y que tiene una propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T, comprende unas regiones CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, como se han definido en el presente documento y, en una realización preferida, regiones flanqueantes VH (flanqueantes 1, 2, 3, 4) como se ha definido anteriormente, en particular como se muestra en cualquiera de SEC ID Nº: 152 o 153, 156 o 157, 160 o 161 y/o 164 o 165. Por lo tanto, la construcción de unión específica a CD3 de la invención comprende un primer dominio que se une específicamente a CDR3 humano y comprende una región flanqueante 1 como se muestra en SEC ID Nº: 152 o 153, una región flanqueante 2 como se muestra en SEC ID Nº: 156 o 157, una región flanqueante 3 como se muestra en SEC ID Nº: 160 o 161 y/o una región flanqueante 4 como se muestra en SEC ID Nº: 164 o 165.

Se prefiere particularmente en el presente documento que la construcción de unión específica a CD3 desinmunizada citotóxicamente activa comprende en su primer dominio (a) una CDR-H1 como se representa en SEC ID Nº: 88, y (b) una CDR-H2 como se representa en SEC ID Nº: 90 o 92.

En consecuencia, las regiones CDR-H1 y CDR-H2 modificadas conducen a una propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T y derivan de un anticuerpo específico de cadena CD3-. Más preferentemente de acuerdo con la presente invención dichos anticuerpos (parentales) deberían ser capaces de unirse específicamente a epítopos que reflejan la estructura nativa o casi nativa o un epítopo conformacional de CD3 humano presentado en el contexto del complejo TCR.

Preferentemente, la construcción de unión específica a CD3 de la invención comprende una región VH como se representa en SEC ID Nº: 74 o 76. SEC ID Nº: 74 muestra una región pesada variable desinmunizada ilustrativa y, de forma similar, SEC ID Nº: 76 muestra una región pesada variable desinmunizada ilustrativa.

Preferentemente, la construcción de unión específica a CD3 de la invención comprende una CDR-L1 como se representa en SEC ID Nº: 98 o 100, una CDR-L2 como se representa en SEC ID Nº: 102 y/o una CDR-L3 como se representa en SEC ID Nº: 104.

La construcción de unión específica a CD3 de la invención comprende, en una realización preferida, una región VL en su parte específica de CD3, seleccionándose dicha región VL del grupo que consiste en SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 80, SEC ID Nº: 82 y SEC ID Nº: 112. VL1 como se caracteriza en SEC ID Nº: 78, VL2 como se caracteriza en SEC ID Nº: 80 y VL3 como se caracteriza en SEC ID Nº: 82 se refieren a regiones VL desinmunizadas completas de acuerdo con la presente invención y pueden usarse en diversas combinaciones con las regiones VH anteriormente descritas. Sin embargo, también se prevé que la región VL no desinmunizada pueda combinarse, de acuerdo con la invención, con regiones VH desinmunizadas definidas anteriormente. Una región VL no desinmunizada correspondiente empleada preferentemente en una construcción de unión a CD3 citotóxicamente activa de la invención, se muestra en SEC ID Nº: 112. En consecuencia, no sólo la parte de cadena pesada del “primer dominio” anteriormente mencionado de la construcción de CD3 de la invención puede modificarse para tener una propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T. También se prevé que dicho dominio comprenda las partes de cadena ligera variable correspondientes. La SEC ID Nº: 78, 80 y 82, por ejemplo, representan regiones VL1, VL2 y VL3 desinmunizadas de la parte de unión a CD3 de una construcción desvelada en el documento WO 99/54440.

Como se ha mencionado anteriormente, la construcción de unión específica a CD3 de la invención, más preferentemente, comprende un segundo dominio derivado de Ig que es un scFv. En consecuencia, en una realización más preferida de la presente invención, una construcción del anticuerpo de cadena sencilla biespecífica desinmunizada se proporciona con una especificidad para CD3 humano y una especificidad adicional que está mediada por un segundo scFc, dirigida contra/capaz de interaccionar con un compuesto/molécula adicional. Estas moléculas/compuestos adicionales pueden comprender moléculas de superficie celular, marcadores de tumor, antígenos tumorales y similares. Tales compuestos/moléculas adicionales se ejemplifican en el presente documento posteriormente y se dan también construcciones específicas y se proporcionan en los ejemplos adjuntos.

La expresión “construcción de anticuerpo de cadena sencilla biespecífica” se refiere a una construcción que comprende dos dominios de unión derivados de anticuerpos, preferentemente scFv. Uno de dichos dominios de unión consiste en regiones variables (o partes de las mismas) de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado del mismo, capaces de unirse específicamente/interaccionar con antígeno CD3 humano (molécula diana 1). El segundo dominio de unión consiste en regiones variables (o partes de las mimas) de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado del mismo, capaz de unirse específicamente/interaccionar con otro antígeno (humano) (molécula diana 2) como se define posteriormente. En consecuencia, dicho dominio de unión es, de acuerdo con la presente invención, el segundo dominio derivado de Ig mencionado anteriormente que comprende un sitio de interacción con antígeno con especificidad por una molécula de superficie celular y/o un marcador específico de tumor. Dichos dos dominios/regiones en la construcción biespecífica, preferentemente dicha construcción de anticuerpo de cadena sencilla biespecífica, se conectan preferentemente de forma covalente entre sí como una cadena sencilla. Esta conexión puede efectuarse directamente (dominio 1 [específico para antígeno CD3 humano, que comprende una propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T y que comprende regiones CDR o regiones y regiones flanqueantes como se ha definido anteriormente] – dominio 2 [específico para una molécula de superficie celular y/o un marcador específico de tumor] o dominio 1 [específico para una molécula de superficie celular y/o un marcador específico de tumor] – dominio 2 [específico para antígeno CD3 humano, que comprende una propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T y que comprende regiones CDR o regiones CDR y regiones flanqueantes como se ha definido anteriormente]) o a través de una secuencia de engarce polipeptídica adicional (dominio 1 – secuencia de engarce – dominio 2). En el caso de que se use un engarce, este engarce es preferentemente de una longitud y secuencias suficientes para asegurar que cada uno de los dominios primero y segundo pueden, independientemente uno del otro, conservar sus especificidades de unión diferencial. Como se ha mencionado anteriormente y como se documenta en los ejemplos adjuntos, preferentemente, la construcción de unión específica a CD3 que comprende al menos dos dominios como se han definido en el presente documento es una “construcción de anticuerpo de cadena sencilla biespecífica”, más preferentemente un Fv de cadena sencilla biespecífico (scFv). Se prevé en particular que dicha construcción se emplea en el contexto de una composición farmacéutica. Las moléculas de cadena sencilla biespecíficas se conocen en la técnica y se describen en el documento WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Löffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, J. Immunol., (2001), 166, 2420-2426. Un formato particularmente preferido de la invención proporciona una construcción polipeptídica en la que el dominio de unión específica a CD3 de la construcción de la invención comprende al menos una región VH y una VL como se ha definido anteriormente. Debe observarse que además de una región VH como se ha definido en el presente documento y que tiene una propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T, dicha construcción de unión específica puede comprender regiones/dominios adicionales con propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T. Como se ha mencionado anteriormente, además la región VL y/o las flanqueantes correspondientes pueden comprender tramos de aminoácidos que se han modificado por ingeniería genética de acuerdo con la presente invención para tener una propensión reducida para generación de epítopos de linfocitos T. La orientación intramolecular del dominio VH y del dominio VL, que están ligados entre sí por un dominio de engarce, el formato scFv no es decisiva para las construcciones de cadena sencilla biespecíficas mencionadas. De este modo, scFv con ambas disposiciones posibles (dominio VH- dominio de engarce – dominio VL; domino VL - dominio de engarce - dominio VH) son realizaciones particulares de la construcción de cadena sencilla biespecífica mencionada. Un dominio específico de CD3 puede localizarse Nor C-terminal en la molécula biespecífica. Las regiones VH y VL de cada dominio pueden disponerse en diferentes órdenes (VH- VL o VL- VH).

La expresión “cadena sencilla” como se usa de acuerdo con la presente invención significa que dichos primer y segundo dominio de la construcción de cadena sencilla biespecífica están unidos covalentemente, preferentemente en forma de secuencia de aminoácidos colineal codificada por una molécula de ácido nucleico sencilla.

Debe observarse que la construcción de la invención puede comprender, además del primer dominio definido en el presente documento y el segundo dominio derivado de Ig un dominio o dominios adicionales, por ejemplo para el aislamiento y/o preparación de construcciones producidas de forma recombinante.

Debe observarse que, de acuerdo con la presente invención, no solo el primer dominio anteriormente descrito que se une específicamente a CD3 humano de la construcción de CD3 de la invención puede tener propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T. También se prevé que el segundo dominio derivado de Ig y/o una región o regiones de engarce conectoras se modifiquen, por ejemplo se humanicen y/o también se desinmunicen.

Como se ha mencionado anteriormente, los enfoques de desinmunización se ilustran en particular en los documentos WO 00/34317, WO 98/52976, WO 02/079415 o WO 02/012899 y los ejemplos adjuntos. Estos enfoques suponen llevar a cabo sustituciones de aminoácidos dentro de epítopos potenciales de linfocitos T. De este modo, la probabilidad de que una secuencia dada de lugar a epítopos de linfocitos T tras el procesamiento proteico intracelular se reduce. Además, el documento WO 92/10755 describe un enfoque en el que se obtienen por ingeniería genética determinantes antigénicos o proteínas. Particularmente, se mapean las proteínas con respecto a epítopos y se cambia su secuencia de aminoácidos a través de ingeniería genética.

Además, se conocen bien “enfoques de humanización” en la técnica y se describen en particular para moléculas de anticuerpo, por ejemplo moléculas derivadas de Ig. El término “humanizado” se refiere a formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab’, F(ab’), scFvs, u otras secuencias parciales de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen alguna parte de la secuencia derivada del anticuerpo no humano. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas en las que se reemplazan restos de una región determinante de complementariedad (CDR) de la inmunoglobulina humana con restos de una CDR de una especie no humana tal como ratón, rata o conejo que tiene la capacidad, afinidad y especificidad de unión deseadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y generalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana; véase, entre otros, Jones y col., Nature 321:522-525 (1986), Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos se conocen bien en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más aminoácidos introducidos en él a partir de una fuente que es no humana para asemejarse de forma más cercana a un anticuerpo humano, conservando aún la actividad de unión original del anticuerpo. Los procedimientos para humanización de anticuerpos/moléculas de anticuerpo se detallan adicionalmente en Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332:323-327 (1988); y Verhoeyen y col., Science 239:1534-1536 (1988). Se conocen en la técnica ejemplos específicos de anticuerpos humanizados, por ejemplo anticuerpos dirigidos contra EpCAM, véase, por ejemplo (LoBuglio, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology (Resumen). 1997, 1562 y Khor, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology (Resumen), 1997, 847).

En consecuencia, en el contexto de la presente invención, en particular se proporcionan construcciones de anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos que están desinmunizadas y pueden emplearse de forma satisfactoria en composiciones farmacéuticas.

Como se ha mencionado anteriormente, el segundo dominio derivado de Ig de la construcción de unión específica a CD3 anteriormente descrita puede comprender un sitio de interacción con antígeno con especificidad por una molécula de superficie celular.

La expresión “molécula de superficie celular”, como se usa en el presente documento, también indica moléculas que se presentan en la superficie de células. La expresión “molécula de superficie celular”, se refiere a moléculas, que se presentan en la superficie de células y comprenden dominios o epítopos accesibles (in vitro o in vivo) a dominios de unión derivados de Ig, preferentemente anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o derivados. Como se ha ilustrado anteriormente, más preferentemente dicho dominio derivado de Ig es un scFv. Los ejemplos para dichas moléculas de superficie celular son proteínas de membrana y transmembrana, moléculas adaptadas a dichas proteínas o la superficie celular etc. De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención dicha molécula de superficie celular es un marcador específico de tumor. En el contexto de la presente invención, la expresión “marcador específico de tumor” se refiere a moléculas, que se presentan y/o localizan en la superficie de células tumorales o que se expresan de forma ubicua pero son accesibles solamente para la unión de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o derivados de anticuerpos en la superficie de células tumorales. Se proporcionan ejemplos de marcadores tumorales a continuación en el presente documento y comprenden, pero sin limitación, EpCAM, CD19, HER-2, HER-2 neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (mucina), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, CD44v6, Wue-1, antígeno de célula plasmática (véase documento WO 01/47953), IgE (unido-membrana), proteoglicano de Condroitín Sulfato de Melanoma (MCSP), STEAP, mesotelina, Antígeno de Célula Madre de la Próstata (PSCA), sTn (antígeno de Tn sialilado), FAP (antígeno de activación de fibroblastos), EGFRvIII, Ig, Ig, MT-MMP, antígeno de Cora, EphA2, L6 y CO-29.

El segundo dominio derivado de Ig de la construcción de unión específica a CD3 de la invención también puede comprender un sitio de interacción con antígeno con una especificidad por EpCAM.

Las construcciones proporcionadas en el presente documento son particularmente útiles en situaciones médicas. Por ejemplo, pueden tratarse enfermedades tumorales y/o linfomas, preferentemente linfoma de linfocitos B no de Hodgkin, con una construcción desinmunizada (biespecífica) desvelada en el presente documento dirigida contra CD3 y CD20 (CD3xCD20 o CD20xCD3). Pueden tratarse enfermedades autoinmunes mediante la administración de construcciones desinmunizadas (biespecíficas) dirigidas contra CD3 y CD30 o CD19 humanos (es decir CD3xCD30

o CD30xCD3 o CD3xCD19 o CD19xCD3). Puede tratarse artritis reumatoide, así como otras enfermedades inflamatorias con una construcción desinmunizada (biespecífica) desvelada en el presente documento dirigida contra CD3 y CCR5 humanos (CD3xCCR5 o CCRxCD3). Una construcción de unión específica a CD3 desinmunizada como se define en el presente documento y que comprende un segundo dominio derivado de Ig dirigido hacia/que se une con precursor de TNF-alfa también puede ser útil en el tratamiento o prevención de enfermedades inflamatorias. Las construcciones de CD3 como se proporcionan en el presente documento y que comprenden un segundo dominio derivado de Ig contra/que se une a/que interacciona con EpCAM puede ser particularmente útil en la intervención médica de enfermedades tumorales tales como cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel (melanoma), cánceres del tracto genitourinario, por ejemplo, cáncer ovárico, cáncer de endometrio, cáncer de cuello del útero y cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer del intestino delgado, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de vesícula biliar, cánceres del conducto biliar, cáncer de esófago, cáncer de las glándulas salivares y cáncer de la glándula tiroides u otras enfermedades tumorales tales como tumores hematológicos, gliomas, sarcomas u osteosarcomas. La administración de las construcciones de unión a CD3 también es aconsejable para enfermedad residual mínima, preferentemente para tumores sólidos tempranos, tumores sólidos avanzados o tumores sólidos metastásicos.

Como también se ilustra en los ejemplos adjuntos, una construcción de unión específica a CD3 particularmente preferida de la invención comprende el primer dominio anteriormente definido con propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T y un segundo dominio derivado de Ig que comprende un sitio de interacción con antígeno con una especificidad por EpCAM.

La molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM, también denominada antígeno 17-1A, KSA, EGP40, GA733-2, ks1-4 o esa) es una glucoproteína integrada en membrana de 40-kDa de 314 aminoácidos con expresión específica en ciertos epitelios y en muchos carcinomas humanos (revisado en Balzar, J. Mol. Med. 1999, 77, 699-712). EpCAM se descubrió y se clonó posteriormente a través de su reconocimiento por el anticuerpo monoclonal murino 171A/edrecolomab (Goettlinger, Int J Cancer. 1986; 38, 47-53 y Simon, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990; 87, 27552759). EpCAM sirve para adherir células epiteliales en una disposición orientada y altamente ordenada (Litvinov, J Cell Biol. 1997, 139, 1337-1348). Tras la transformación maligna de células epiteliales las células tumorales de rápido crecimiento abandonan el alto orden celular de los epitelios. Por consiguiente, la distribución de superficie de EpCAM se vuelve menos restringida y la molécula se expone mejor en células tumorales y es accesible para la unión de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o derivados de anticuerpos en la superficie de células tumorales. Debido a su origen de célula epitelial, las células tumorales de la mayoría de los carcinomas aún expresan EpCAM en su superficie.

In vivo, la expresión de EpCAM está relacionada con una proliferación epitelial aumentada y se relaciona negativamente con diferenciación celular (para revisión véase Balzar, 1999, J. Mol. Med. 77, 699-712). La expresión de EpCAM esencialmente se ve con todos los carcinomas principales (revisado en Balzar, J Mol Med. 1999, 77, 699712 o documentado, entre otros en De Bree, Nucl Med Commun. 1994, 15, 613-27; Zhang, Clin Cancer Res. 1998, 4, 295-302). Debido a su expresión generalizada, EpCAM se denomina un antígeno “pan-carcinoma”. En muchos casos, se observó que las células tumorales expresaban EpCAM hasta un grado mucho mayor que su epitelio parental o formas menos agresivas de dichos cánceres. Por ejemplo, la expresión aumentada de EpCAM representa un acontecimiento temprano en el desarrollo de cáncer de próstata (Poczatek, J Urol., 1999, 162, 1462-1644). Además, en la mayoría de los adenocarcinomas y carcinomas de células escamosas del cuello uterino una fuerte expresión de EpCAM se relaciona con una proliferación aumentada y la desaparición de marcadores para la diferenciación terminal (Litvinov, Am. J. Pathol. 1996, 148, 865-75). En cáncer de mama, la sobreexpresión de EpCAM en células tumorales es un factor de predicción de supervivencia (Gastl, Lancet. 2000, 356, 1981-1982). EpCAM es un marcador para la detección de células tumorales diseminadas en pacientes que padecen carcinoma de células escamosas de cabeza, cuello y pulmón (Chaubal, Anticancer Res 1999, 19, 2237-2242, Piyathilake, Hum Pathol. 2000, 31, 482-487). El epitelio escamoso normal, como se halla en la epidermis, cavidad oral, epiglotis, faringe, laringe y esófago no expresa significativamente EpCAM (Quak, Hybridoma, 1990, 9, 377-387). Se ha mostrado que EpCAM se expresa en la mayoría de NSCLC (células de cáncer de pulmón de células no pequeñas (Passlick, Int J Cancer, 2000, 87, 548-552)), diseminadas, metastásicas y primarias en adenocarcinomas del punto de unión gastroesofágico y gástricos (Martin, J Clin Pathol 1999, 52, 701-4) y en líneas celulares derivadas de carcinomas colorrectales, pancreáticos y carcinomas de mama (Szala, Proc Natl Acad Sci U S A 1990, 87, 3542-6, Packeisen, Hybridoma, 1999, 18, 37-40).

En una realización más preferida, la construcción de unión específica a CD3 de la invención que comprende un segundo dominio derivado de Ig dirigido contra/que se une a EpCAM, comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de

(a): una secuencia de aminoácidos como se muestra en una cualquiera de SEC ID Nº: 31, 33, 35, 37, 39, 49, 55, 58, 61, 63, 65, 67, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323 y 325;

(b): una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico como se muestra en cualquiera de SEC ID Nº: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 54, 57, 60, 62, 64, 66, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322 y 324; y

(c): una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que está degenerada como resultado del código genético para una secuencia de nucleótidos de (b).

En consecuencia, la presente invención proporciona, en una realización particularmente preferida, construcciones de CD3 específicas que comprenden una parte de unión/interacción con CD3 (“anti-CD3”) que tiene propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T y una parte de cadena sencilla adicional (un dominio derivado de Ig) que interacciona específicamente/se une con EpCAM (“anti-EpCAM”). Las siguientes tablas 1A, 1B, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A, 4B, 5A y 5B se refieren a configuraciones preferidas de tales construcciones de unión a CD3 y EpCAM.

EpCAM 3-1, EpCAM 3-5, EpCAM 4-1, EpCAM 4-7 y EpCAM 5-10 se refieren a anticuerpos de cadena sencilla específicos contra EpCAM aislados por presentación de fagos en el documento WO 99/25818.

Cada construcción proteica de las Tablas 1A, 2A, 3A, 4A y 5A comprende 7 módulos proteicos distintos, indicados A-G. Los módulos proteicos A-G se unen directa y covalentemente entre sí en una cadena polipeptídica contigua sencilla por enlaces peptídicos en el orden A-B-C-D-E-F-G, con el módulo proteico A en el extremo N-terminal y el módulo proteico G en el extremo C-terminal. Los módulos proteicos A, C, E y G indican dominios variables de anticuerpo que pueden ser dominios VH o VL de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno EpCAM o CD3 humano. Los módulos B, D y F son engarces que conectan los dominios VH y VL.

Si el módulo proteico A es un dominio de anticuerpo VH, entonces el módulo proteico C es un dominio proteico VL y viceversa. Si el módulo proteico E es un dominio de anticuerpo VH, entonces el módulo proteico G es un dominio proteico VL y viceversa.

Los dominios VH desinmunizados de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano pueden seleccionarse de las secuencias como se exponen en SEC ID Nº: 74 o 76. Los dominios VL desinmunizados de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano pueden seleccionarse de las secuencias como se exponen en SEC ID Nº: 78, 80 u 82. El dominio proteico VH de anticuerpo EpCAM 3-1, 3-5, 4-1, 4-7 y 5-10 humanos es como se expone en SEC ID Nº: 137, 141, 145, 149 y 133, respectivamente. El dominio proteico VL de anticuerpo EpCAM 3-1, 3-5, 4-1, 4-7 y 5-10 humano es como se expone en SEC ID Nº: 139, 143, 147, 151 y 135, respectivamente.

Pares de dominios variables de anticuerpo indicados por los pares de módulos proteicos A/C y E/G se unen por módulos proteicos de unión adicionales en los que el módulo proteico B sirve para unir directamente el par de módulos A/C y el módulo proteico F sirve para unir directamente el par de módulos E/G. Cuando el par de módulos A/C o E/G es un par de dominios proteicos VH/VL o VL/VH desinmunizados de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD3 humano, un módulo proteico B o F respectivamente, tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº: 3. Cuando el par de módulos A/C o E/G es un par de VH/VL o VL/VH de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno EpCAM, el módulo proteico B o F, respectivamente, tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº: 168. El módulo D conecta los grupos de módulos ABC y EFG.

La combinación de módulos proteicos A-B-C y la combinación de módulos proteicos E-F-G constituyen respectivamente cada una un fragmento scFv de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD3 humano o para el antígeno EpCAM. Los módulos A y C muestran la secuencia de unión a CD3, los grupos respectivos de módulos proteicos A-B-C y E-F-G están conectados entre sí a través del módulo proteico D, que tiene la secuencia como se expone en SEC ID Nº: 176. Por otro lado, si los módulos A y C muestran la secuencia de unión a EpCAM, los grupos respectivos de módulos proteicos A-B-C y E-F-G están conectados entre sí a través del módulo proteico D que tiene la secuencia como se expone en SEC ID Nº: 174. De este modo, puede insertarse una serina adicional después de la cadena VL para fines de clonación. Sin embargo, el experto en la materia también puede usar el engarce como se muestra en SEC ID Nº: 174 para unir un dominio VL con el dominio V posterior en lugar de SEC ID Nº: 176. El módulo proteico D sirve para conectar el extremo C-terminal del módulo proteico C con el extremo N-terminal del módulo proteico E.

Cada construcción de ácido nucleico en las Tablas 1 B, 2B, 3B, 4B y 5B comprende 7 módulos de ácido nucleico distintos, indicados A-G. Los módulos de ácido nucleico A-G se unen directa y covalentemente entre sí en una cadena de nucleótidos contigua sencilla mediante enlaces de glucósido fosfato en el orden A-B-C-D-E-F-G, con el módulo de ácido nucleico A en el extremo 5’ y el módulo de ácido nucleico G en el extremo 3’ de una construcción de ácido nucleico respectiva. Los módulos de ácido nucleico A, C, E y G indican regiones codificantes para dominios variables de anticuerpo que pueden ser dominios VH o VL de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno EpCAM o CD3 humano.

Si el módulo de ácido nucleico A codifica un dominio de anticuerpo VH, entonces el módulo de ácido nucleico C codifica un dominio proteico VL y viceversa. Si el módulo de ácido nucleico E codifica un dominio de anticuerpo VH, entonces el módulo de ácido nucleico G codifica un dominio proteico VL y viceversa.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican dominios VH desinmunizados de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano pueden seleccionarse de las secuencias como se exponen en SEC ID Nº: 73 o 75. Las moléculas de ácido nucleico que codifican dominios VL desinmunizados de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano pueden seleccionarse de las secuencias como se exponen en SEC ID Nº: 77, 79 u

81. La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio proteico VH de los anticuerpos EpCAM 3-1, 3-5, 4-1, 4-7 y 5-10 humanos es como se expone en SEC ID Nº: 136, 140, 144, 148 y 132 respectivamente. La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio proteico VL de los anticuerpos EpCAM 3-1, 3-5, 4-1, 4-7 y 5-10 humanos es como se expone en SEC ID Nº: 138, 142, 146, 150 y 134 respectivamente.

Los pares de ácidos nucleicos que codifican dominios variables de anticuerpo indicados por los pares de módulos de ácido nucleico A/C y E/G se unen por módulos de ácido nucleico de enlace adicionales, en los que el módulo de ácido nucleico B sirve para unir directamente el par de módulos A/B y el módulo de ácido nucleico F sirve para unir directamente el par de módulos E/G. Cuando el par de módulos A/C o E/G indica ácido nucleico que codifica un par de dominios proteicos VH/VL o VH desinmunizados de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD3 humano, el módulo de ácido nucleico B o F, respectivamente, tiene la secuencia de nucleótidos como se expone en SEC ID Nº: 202. Cuando el par de módulos A/C o E/G indica ácido nucleico que codifica un par de VH/VL o VL/VH de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno EpCAM humano, el módulo de ácido nucleico B o F, respectivamente, tiene la secuencia de nucleótidos como se expone en SEC ID Nº: 201.

La combinación de módulos de ácido nucleico A-B-C y la combinación de módulos de ácido nucleico E-F-G constituyen respectivamente cada uno un fragmento scFv de un anticuerpo que tiene especificidad por el antígeno CD3 humano o por el antígeno EpCAM. Si los módulos A y C comprenden secuencias de unión a CD3, los grupos respectivos de módulos de ácido nucleico A-B-C y E-F-G están conectados entre sí a través del módulo de ácido nucleico D, que tiene la secuencia de nucleótidos como se expone en SEC ID Nº: 175. Si los módulos A y C comprenden secuencias de unión a EpCAM, los grupos respectivos de módulos de ácido nucleico A-B-C y E-F-G se conectan entre sí a través del módulo de ácido nucleico D, que tiene la secuencia de nucleótidos como se expone en SEC ID Nº: 173. Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, el codón adicional que codifica una serina (en SEC ID Nº: 175) puede insertarse para fines de clonación. El experto en la materia puede ligar la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena VL directamente con el dominio V posterior con el engarce como se representa en SEQ ID Nº: 173 sin el codón adicional que codifica serina en el extremo 5’ del engarce. El módulo de ácido nucleico D sirve para conectar el extremo 3’ del módulo de ácido nucleico C con el extremo 5’ del módulo de ácido nucleico E.

Tabla 1A

Construcciones anti-CD3 humano desinmunizadas que comprenden regiones variables anti-EpCAM 3-1 de cadena sencilla: secuencia de aminoácidos

Construcción: SEC ID Nº: en la parte de la construcción... Construcción antiCD3 desinmunizada / Especificidad (N-> C) Disposición de dominios

A: B C D E F G

1: 80 3 74 176 137 168 139 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (3-1) LHHL

2: 74 3 80 176 137 168 139 CD3 (VH5NL2) xEPCAM (3-1) HLHL

3: 80 3 74 176 139 168 137 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (3-1) LHLH

4: 74 3 80 176 139 168 137 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM (3-1) HLLH

5: 139 168 137 174 74 3 80 EPCAM(3-1) xCD3 (VH5/VL2) LHHL

6: 137 168 139 174 74 3 80 EPCAM(3-1) xCD3 (VH5/VL2) HLHL

7: 139 168 137 174 80 3 74 EPCAM(3-1) xCD3(VL2/V H5) LHLH

8: 137 168 139 174 80 3 74 EPCAM(3-1) xCD3(VL2/ VH5) HLLH

9: 80 3 76 176 137 168 139 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM (3-1) LHHL

10: 76 3 80 176 137 168 139 CD3 (VH7NL2) xEPCAM (3-1) HLHL

11: 80 3 76 176 139 168 137 CD3 (VL2NH7) xEPCAM (3-1) LHLH

12: 76 3 80 176 139 168 137 CD3 (VH7NL2) xEPCAM (3-1) HLLH

(continuación)

A: B C D E F G

13: 139 168 137 174 76 3 80 EPCAM(3-1) xCD3 (VH7NL2) LHHL

14: 137 168 139 174 76 3 80 EPCAM(3-1) xCD3 (VH7/VL2) HLHL

15: 139 168 137 174 80 3 76 EPCAM(3-1) xCD3 (VL2/VH7) LHLH

16: 137 168 139 174 80 3 76 EPCAM(3-1) xCD3 (VL2/VH7) HLLH

Tabla 1B

Construcción: SEC ID Nº: en la parte de la construcción... Construcción anti-CD3 desinmunizada / Especificidad (N -> C) Disposición de dominios

A: B C D E F G

1: 79 202 73 175 136 201 138 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (3-1) LHHL

2: 73 202 79 175 136 201 138 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM (3-1) HLHL

3: 79 202 73 175 138 201 136 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (3-1) LHLH

(continuación) (Continuación)

A: B C D E F G

4: 73 202 79 175 138 201 136 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM (3-1) HLLH

5: 138 201 136 173 73 202 79 EPCAM(3-1) xCD3 (VH5/VL2) LHHL

6: 136 201 138 173 73 202 79 EPCAM(3-1) xCD3 (VH5/VL2) HLHL

7: 138 201 136 173 79 202 73 EPCAM(3-1) xCD3 (VL2/VH5) LHLH

8: 136 201 138 173 79 202 73 EPCAM(3-1) xCD3(VL2/ VH5) HLLH

9: 79 202 75 175 136 201 138 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM (3-1) LHHL

10: 75 202 79 175 136 201 138 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM (3-1) HLHL

11: 79 202 75 175 138 201 136 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM (3-1) LHLH

12: 75 202 79 175 138 201 136 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM (3-1) HLLH

13: 138 201 136 173 75 202 79 EPCAM(3-1) xCD3 (VH7NL2) LHHL

Construcción: SEC ID Nº: en la parte de la construcción... Construcción anti-CD3 desinmunizada / Especificidad Disposición de dominios

A: B C D E F G

14: 136 201 138 173 75 202 79 EPCAM(3-1) xCD3 (VH7/VL2) HLHL

15: 138 201 136 173 79 202 75 EPCAM(3-1) xCD3 (VL2/ VH7) LHLH

16: 136 201 138 173 79 202 75 EPCAM(3-1) xCD3(VL2/ VH7) HLLH

Tabla 2A

Construcciones anti-CD3 humano desinmunizadas que comprenden regiones variables anti-EpCAM 3-5 de cadena sencilla: secuencia de aminoácidos

Construcción: SEC ID Nº: en la parte de la construcción... Construcción anti-CD3 desinmunizada / Especificidad (N-> C) Disposición de dominios

A: B C D E F G

1: 80 3 74 176 141 168 143 CD3 (VL2NH5) xEPCAM (3-5) LH HL

2: 74 3 80 176 141 168 143 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM (3-5) HLHL

3: 80 3 74 176 143 168 141 CD3 (VL2/VH5) xEPCAM (3-5) LHLH

4: 74 3 80 176 143 168 141 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM (3-5) HLLH

(coninuación)

A: B C D E F G

5: 143 168 141 174 74 3 80 EPCAM(3-5) xCD3 (VH5NL2) LHHL

6: 141 168 143 174 74 3 80 EPCAM(3-5) xCD3 (VH5/VL2) HLHL

7: 143 168 141 174 80 3 74 EPCAM(3-5) xCD3 (VL2/VH5) LHLH

8: 141 168 143 174 80 3 74 EPCAM(3-5) xCD3(VL2/ VH5) HLLH

9: 80 3 76 176 141 168 143 CD3 (VL2/VH7) xEPCAM(35) LHHL

10: 76 3 80 176 141 168 143 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM (3-5) HLHL

11: 80 3 76 176 143 168 141 CD3 (VL2/VH7) xEPCAM (3-5) LHLH

12: 76 3 80 176 143 168 141 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM (3-5) HLLH

13: 143 168 141 174 76 3 80 EPCAM(3-5) xCD3 (VH7/VL2) LHHL

14: 141 168 143 174 76 3 80 EPCAM(3-5) xCD3 (VH7NL2) HLHL

15: 143 168 141 174 80 3 76 EPCAM(3-5) xCD3 (VL2/VH7) LHLH

16: 141 168 143 174 80 3 76 EPCAM(3-5) xCD3(VL2/ VH7) HLLH

Tabla 2B

Construcciones anti-CD3 humano desinmunizadas que comprenden regiones variables anti-EpCAM 3-5 de cadena sencilla: secuencia de nucleótidos

A: B C D E F G

1: 79 202 73 175 140 201 142 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (3-5) LHHL

2: 73 202 79 175 140 201 142 CD3 (VH5NL2) xEPCAM (3-5) HLHL

3: 79 202 73 175 142 201 140 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (3-5) LHLH

4: 73 202 79 175 142 201 140 CD3 (VH5NL2) xEPCAM (3-5) HLLH

5: 142 201 140 173 73 202 79 EPCAM(3-5) xCD3 (VH5/VL2) LHHL

6: 140 201 142 173 73 202 79 EPCAM(3-5) xCD3 (VH5/VL2) HLHL

7: 142 201 140 173 79 202 73 EPCAM(3-5) xCD3 (VL2NH5) LHLH

8: 140 201 142 173 79 202 73 EPCAM(3-5) xCD3 (VL2/VH5) HLLH

9: 79 202 75 175 140 201 142 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM (3-5) LHHL

10: 75 202 79 175 140 201 142 CD3 (VH7NL2) xEPCAM (3-5) HLHL

11: 79 202 75 175 142 201 140 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM (3-5) LHLH

(continuación)

Construcciones anti-CD3 humano desinmunizadas que comprenden regiones variables anti-EpCAM 3-5 de cadena sencilla: secuencia de nucleótidos

A: B C D E F G

12: 75 202 79 175 142 201 140 CD3 (VH7NL2) xEPCAM (3-5) HLLH

13: 142 201 140 173 75 202 79 EPCAM(3-5) xCD3 (VH7NL2) LHHL

14: 140 201 142 173 75 202 79 EPCAM(3-5) xCD3 (VH7/VL2) HLHL

15: 142 201 140 173 79 202 75 EPCAM(3-5) xCD3 (VL2NH7) LHLH

16: 140 201 142 173 79 202 75 EPCAM(3-5) xCD3 (VL2/VH7) HLLH

Tabla 3A

Construcciones anti-CD3 humano desinmunizadas que comprenden regiones variables anti-EpCAM 4-1 de cadena sencilla: secuencia de aminoácidos

A: B C D E F G

1: 80 3 74 176 145 168 147 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (4-1) LHHL

2: 74 3 80 176 145 168 147 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM (4-1) HLHL

(continuación) (continucación)

A: B C D E F G

3: 80 3 74 176 147 168 145 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (4-1) LHLH

4: 74 3 80 176 147 168 145 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM (4-1) HLLH

5: 147 168 145 174 74 3 80 EPCAM(4-1) xCD3 (VH5/VL2) LHHL

6: 145 168 147 174 74 3 80 EPCAM(4-1) xCD3 (VH5/VL2) HLHL

7: 147 168 145 174 80 3 74 EPCAM(4-1) xCD3 (VL2/ VH5) LHLH

8: 145 168 147 174 80 3 74 EPCAM(4-1) xCD3(VL2/ VH5) HLLH

9: 80 3 76 176 145 168 147 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM (4-1) LHHL

10: 76 3 80 176 145 168 147 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM (4-1) HLHL

11: 80 3 76 176 147 168 145 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM (4-1) LHLH

12: 76 3 80 176 147 168 145 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM (4-1) HLLH

A: B C D E F G

13: 147 168 145 174 76 3 80 EPCAM(4-1) xCD3 (VH7/VL2) LHHL

14: 145 168 147 174 76 3 80 EPCAM(4-1) xCD3 (VH7/VL2) HLHL

15: 147 168 145 174 80 3 76 EPCAM(4-1) xCD3 (VL2/ VH7) LHLH

16: 145 168 147 174 80 3 76 EPCAM(4-1) xCD3(VL2/ VH7) HLLH

Tabla 3B

A: B C D E F G

1: 79 202 73 175 144 201 146 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (4-1) LHHL

2: 73 202 79 175 144 201 146 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM (4-1) HLHL

3: 79 202 73 175 146 201 144 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (4-1) LHLH

4: 73 202 79 175 146 201 144 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM (4-1) HLLH

(continucación)

A: B C D E F G

5: 146 201 144 173 73 202 79 EPCAM(4-1) xCD3 (VH5/VL2) LHHL

6: 144 201 146 173 73 202 79 EPCAM(4-1) xCD3 (VH5/VL2) HLHL

7: 146 201 144 173 79 202 73 EPCAM(4-1) xCD3 (VL2/ VH5) LHLH

8: 144 201 146 173 79 202 73 EPCAM(4-1) xCD3(VL2/ VH5) HLLH

9: 79 202 75 175 144 201 146 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM (4-1) LHHL

10: 75 202 79 175 144 201 146 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM (4-1) HLHL

11: 79 202 75 175 146 201 144 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM (4-1) LHLH

12: 75 202 79 175 146 201 144 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM (4-1) HLLH

13: 146 201 144 173 75 202 79 EPCAM(4-1) xCD3 (VH7/VL2) LHHL

14: 144 201 146 173 75 202 79 EPCAM(4-1) xCD3 (VH7/VL2) HLHL

15: 146 201 144 173 79 202 75 EPCAM(4-1) xCD3 (VL2/ VH7) LHLH

16: 144 201 146 173 79 202 75 EPCAM(4-1) xCD3(VL2/ VH7) HLLH

Tabla 4A

A: B C D E F G

1: 80 3 74 176 149 168 151 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (4-7) LHHL

2: 74 3 80 176 149 168 151 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM (4-7) HLHL

3: 80 3 74 176 151 168 149 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (4-7) LHLH

4: 74 3 80 176 151 168 149 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM (4-7) HLLH

5: 151 168 149 174 74 3 80 EPCAM(4-7) xCD3 (VH/VNL2) LHHL

6: 149 168 151 174 74 3 80 EPCAM(4-7) xCD3 (VH5/VL2) HLHL

7: 151 168 149 174 80 3 74 EPCAM(4-7) xCD3 (VL2/ VH5) LHLH

8: 149 168 151 174 80 3 74 EPCAM(4-7) xCD3(VL2/ VH5) HLLH

9: 80 3 76 176 149 168 151 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM (4-7) LHHL

10: 76 3 80 176 149 168 151 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM (4-7) HLHL

(continuación)

A: B C D E F G

11: 80 3 76 176 151 168 149 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM (4-7) LHLH

12: 76 3 80 176 151 168 149 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM (4-7) HLLH

13: 151 168 149 174 76 3 80 EPCAM(4-7) xCD3 (VH7/VL2) LHHL

14: 149 168 151 174 76 3 80 EPCAM(4-7) xCD3 (VH7NL2) HLHL

15: 151 168 149 174 80 3 76 EPCAM(4-7) xCD3 (VL2/ VH7) LHLH

16: 149 168 151 174 80 3 76 EPCAM(4-7) xCD3(VL2/ VH7) HLLH

Tabla 4B

Construcciones anti-CD3 humano desinmunizadas que comprenden regiones variables anti-EpCAM 4-7 de cadena sencilla: secuencia de nucleótidos

A: B C D E F G

1: 79 202 73 175 148 201 150 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (4-7) LHHL

(continuación) (continuación)

A: B C D E F G

2: 73 202 79 175 148 201 150 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM (4-7) HLHL

3: 79 202 73 175 150 201 148 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (4-7) LHLH

4: 73 202 79 175 150 201 148 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM (4-7) HLLH

5: 150 201 148 173 73 202 79 EPCAM(4-7) xCD3 (VH5/VL2) LHHL

6: 148 201 150 173 73 202 79 EPCAM(4-7) xCD3 (VH5/VL2) HLHL

7: 150 201 148 173 79 202 73 EPCAM(4-7) xCD3 (VL2/ VH5) LHLH

8: 148 201 150 173 79 202 73 EPCAM(4-7) xCD3(VL2/ VH5) HLLH

9: 79 202 75 175 148 201 150 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM (4-7) LHHL

10: 75 202 79 175 148 201 150 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM (4-7) HLHL

11: 79 202 75 175 150 201 148 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM (4-7) LHLH

12: 75 202 79 175 150 201 148 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM (4-7) HLLH

A: B C D E F G

13: 150 201 148 173 75 202 79 EPCAM(4-7) xCD3 (VH7/VL2) LHHL

14: 148 201 150 173 75 202 79 EPCAM(4-7) xCD3 (VH7/VL2) HLHL

15: 150 201 148 173 79 202 75 EPCAM(4-7) xCD3 (VL2/ VH7) LHLH

16: 148 201 150 173 79 202 75 EPCAM(4-7) xCD3(VL2/ VH7) HLLH

Tabla 5A

Construcciones anti-CD3 humano desinmunizadas que comprenden regiones variables anti-EpCAM 5-10 de cadena sencilla: secuencia de aminoácidos

A: B C D E F G

1: 80 3 74 176 133 168 135 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (5-10) LHHL

2: 74 3 80 176 133 168 135 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM (5-10) HLHL

3: 80 3 74 176 135 168 133 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (5-10) LHLH

(continuación) (continuación)

A: B C D E F G

4: 74 3 80 176 135 168 133 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM (5-10) HLLH

5: 135 168 133 174 74 3 80 EPCAM (5-10)xCD3 (VH5/VL2) LHHL

6: 133 168 135 174 74 3 80 EPCAM (5-10)xCD3 (VH5/VL2) HLHL

7: 135 168 133 174 80 3 74 EPCAM (5-10)xCD3 (VL2/ VH5) LHLH

8: 133 168 135 174 80 3 74 EPCAM (5-10)xCD3 (VL2/ VH5) HLLH

9: 80 3 76 176 133 168 135 CD3(VL2/ VH7) xEPCAM LHHL

10: 76 3 80 176 133 168 135 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM (5-10) HLHL

11: 80 3 76 176 135 168 133 CD3 (VL2/VH7) xEPCAM (5-10) LHLH

12: 76 3 80 176 135 168 133 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM (5-10) HLLH

13: 135 168 133 174 76 3 80 EPCAM (5-10)xCD3 (VH7/VL2) LHHL

A: B C D E F G

14: 133 168 135 174 76 3 80 EPCAM (5-10)xCD3 (VH7/VL2) HLHL

15: 135 168 133 174 80 3 76 EPCAM (5-10)xCD3 (VL2/ VH7) LHLH

16: 133 168 135 174 80 3 76 EPCAM (5-10)xCD3 (VL2/ VH7) HLLH

Tabla 5B

Construcciones anti-CD3 humano desinmunizadas que comprenden regiones variables anti-EpCAM 5-10 de cadena sencilla: secuencia de nucleótidos

A: B C D E F G

1: 79 202 73 175 132 201 134 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (5-10) LHHL

2: 73 202 79 175 132 201 134 CD3 (VH5/VL2) xEPCAM (5-10) HLHL

3: 79 202 73 175 134 201 132 CD3 (VL2/ VH5) xEPCAM (5-10) LHLH

4: 73 202 79 175 134 201 132 CD3 (VH5NL2) xEPCAM (5-10) HLLH

(continuación)

A: B C D E F G

5: 134 201 132 173 73 202 79 EPCAM (5-10)xCD3 (VH5/VL2) LHHL

6: 132 201 134 173 73 202 79 EPCAM (5-10)xCD3 (VH5/VL2) HLHL

7: 134 201 132 173 79 202 73 EPCAM (5-10)xCD3 (VL2/ VH5) LHLH

8: 132 201 134 173 79 202 73 EPCAM (5-10)xCD3 (VL2/ VH5) HLLH

9: 79 202 75 175 132 201 134 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM (5-10) LHHL

10: 75 202 79 175 132 201 134 CD3 (VH7NL2) xEPCAM (5-10) HLHL

11: 79 202 75 175 134 201 132 CD3 (VL2/ VH7) xEPCAM (5-10) LHLH

12: 75 202 79 175 134 201 132 CD3 (VH7/VL2) xEPCAM (5-10) HLLH

13: 134 201 132 173 75 202 79 EPCAM (5-10)xCD3 (VH7/VL2) LHHL

14: 132 201 134 173 75 202 79 EPCAM (5-10)xCD3 (VH7/VL2) HLHL

15: 134 201 132 173 79 202 75 EPCAM (5-10)xCD3 (VL2/ VH7) LHLH

16: 132 201 134 173 79 202 75 EPCAM (5-10)xCD3 (VL2/ VH7) HLLH

Más preferentemente, la invención proporciona construcciones de anticuerpos biespecíficas que comprenden una unión de especificidad con CD3 y EpCAM y que tienen la SEC ID Nº: 30, 31 (construcción 2 de Tabla 1A y 1B), Sec

ID Nº: 48, 49 (construcción 5 de la Tabla 1A, 1B), SEC ID Nº: 64, 65 (construcción 2 de Tabla 2A, 2B), SEC ID Nº: 54, 55 (construcción 5 de Tabla 2A, 2B), Sec ID Nº: 66, 67 (construcción 2 de la Tabla 3A, 3B), SEC ID Nº: 32, 33 (construcción 2 de Tabla 4A, 4B), SEC ID Nº: 34, 35 (construcción 4 de Tabla 4A, 4B), SEC ID Nº: 60, 61 (construcción 5 de Tabla 4A, 4B), SEC ID Nº: 36, 37 (construcción 2 de Tabla 5A, 5B), SEC ID Nº: 38, 39 (construcción 4 de Tabla 5A, 5B) o SEC ID Nº: 62, 63 (construcción 5 de Tabla 5A, 5B).

De acuerdo con las construcciones proporcionadas en el presente documento anteriormente, las construcciones de unión a EpCAM y CD3 particularmente preferidas de la invención, que comprenden al menos el primer dominio anteriormente descrito con propensión reducida para generación de epítopos de linfocitos T y especificidad para CD3 humano y un segundo dominio derivado de Ig que es específico para EpCAM se muestran en las SEC ID Nº: 31, 33, 35, 37, 39, 49, 55, 58, 61, 63, 65, 67, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323 y 325. Las moléculas de ácido nucleico correspondientes que codifican dichas construcciones de unión a EpCAM y CD3 preferidas como se definen en el presente documento comprenden SEC ID Nº: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 54, 57, 60, 62, 64, 66, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322 y 324.

En consecuencia, la presente invención también proporciona construcciones de unión específica a CD3 que comprenden un primer dominio que se une específicamente con CD3 humano y tiene propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T y que comprenden un segundo dominio derivado de Ig dirigido contra/capaz de unirse a EpCAM, seleccionado del grupo que consiste en

(a): una secuencia de aminoácidos como se muestra en una cualquiera de SEC ID Nº: 31, 33, 35, 37, 39, 49, 55, 58, 61, 63, 65, 67, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323 o 325;

(b): una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico como se muestra en cualquiera de SEC ID Nº: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 54, 57, 60, 62, 64, 66; 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322 o 324;

(c): una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que está degenerada como resultado del código genético para una secuencia de nucleótidos de (b);

(d): una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la hebra complementaria de una secuencia de ácido nucleico como se define en (b) en condiciones de hibridación rigurosas.

La presente invención también proporciona construcciones de unión específica a CD3 que comprenden un primer dominio que se une específicamente a CD3 humano y tiene propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T y que comprenden un segundo dominio derivado de Ig dirigido contra/capaz de unirse a EpCAM, que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la hebra complementaria de una secuencia de ácido nucleico como se ha definido en (b) anteriormente en el presente documento, es decir a una secuencia de ácido nucleico como se muestra en cualquiera de SEC ID Nº: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 54, 57, 60, 62, 64, 66, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322 o 324 en condiciones de hibridación rigurosas.

La expresión “que hibrida” como se usa en el presente documento se refiere a polinucleótidos/secuencias de ácido nucleico que son capaces de hibridar con los polinucleótidos que codifican las construcciones desinmunizadas como se han definido en el presente documento. Por lo tanto, dichos polinucleótidos pueden ser útiles como sondas en análisis de transferencia de Northern o Southern de preparaciones de ARN o ADN, respectivamente, o pueden usarse como cebadores oligonucleotídicos en análisis de PCR dependiendo de su tamaño respectivo. Preferentemente, dichos polinucleótidos de hibridación comprenden al menos 10, más preferentemente al menos 15 nucleótidos de longitud mientras que un polinucleótido de hibridación de la presente invención a usar como una sonda preferentemente comprende al menos 100, más preferentemente al menos 200 o más preferentemente al menos 500 nucleótidos de longitud.

Se conoce bien en la técnica cómo realizar experimentos de hibridación con moléculas de ácido nucleico, es decir el experto en la materia conoce qué condiciones de hibridación debe usar de acuerdo con la presente invención. Tales condiciones de hibridación se indican en libros de texto convencionales tales como Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y. Se prefieren de acuerdo con las presentes invenciones polinucleótidos que sean capaces de hibridar con los polinucleótidos de la invención o partes de los mismos, en condiciones de hibridación rigurosas.

“Condiciones de hibridación rigurosas” se refiere, es decir, a una incubación durante una noche a 42ºC en una solución que comprende formamida al 50%, SSC 5x (NaCl 750 mM, citrato sódico 75 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6) solución de Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10% y ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado 20µg/ml, seguido de lavado de los filtros en SSC 0,1 x a aproximadamente 65ºC. También se contemplan moléculas de ácido nucleico que hibridan con los polinucleótidos de la invención en condiciones de hibridación de baja rigurosidad. Los cambios en la rigurosidad de hibridación y detección de señal se consiguen principalmente a través de manipulación de concentración de formamida (porcentajes más bajos de formamida dan como resultado una menor rigurosidad); condiciones salinas o temperatura. Por ejemplo, condiciones de baja rigurosidad incluyen una incubación durante una noche a 37ºC en una solución que comprende SSPE 6X (SSPE 20X = NaCl 3M, NaH2PO4 0,2 M; EDTA 0,02 M, pH 7,4), SDS al 0,5%, formamida al 30%, ADN de bloqueo de esperma de salmón 100 g/ml; seguido de lavados a 50ºC con SSPE 1 X, SDS 0,1 %. Además, para conseguir una rigurosidad aún menor, pueden hacerse lavados realizados después de una hibridación rigurosa a mayores concentraciones salinas (por ejemplo SSC 5X). Debe observarse que pueden conseguirse variaciones en las condiciones anteriores a través de la inclusión y/o sustitución de reactivos de bloqueo alternativos usados para suprimir el fondo en experimentos de hibridación. Los reactivos de bloqueo típicos incluyen reactivo de Denhardt, BLOTTO, heparina, ADN de esperma de salmón desnaturalizado y formulaciones patentadas disponibles en el mercado. La inclusión de reactivos de bloqueo específicos puede requerir modificación de las condiciones de hibridación descritas anteriormente, debido a problemas con la compatibilidad.

Las moléculas de ácido nucleico mencionadas pueden ser, por ejemplo, ADN, ADNc, ARN o ADN o ARN producido de forma sintética o una molécula de ácido nucleico quimérica producida de forma recombinante que comprende cualquiera de esos polinucleótidos solos o en combinación.

Las construcciones de unión a EpCAM y CD3 desinmunizadas proporcionadas en la presente invención son particularmente útiles en situaciones médicas, por ejemplo en la prevención, tratamiento y/o el alivio de enfermedades tumorales, en particular, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel (melanoma), cáncer del tracto genitourinario, por ejemplo cáncer ovárico, cáncer del endometrio, cáncer del cuello uterino y cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer del intestino delgado, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de vesícula biliar, cánceres del conducto biliar, cáncer de esófago, cáncer de las glándulas salivares y cáncer de la glándula tiroides. En particular, las construcciones desinmunizadas que se unen a CD3 y a EpCAM pueden usarse para el tratamiento de cáncer epitelial, preferentemente adenocarcinomas, o enfermedad residual mínima, más preferentemente tumor sólido temprano, tumor sólido avanzado o tumor sólido metastásico.

Se describen en el presente documento construcciones de unión específica a CD3 que comprenden un segundo dominio derivado de Ig que comprende un sitio de interacción con antígeno con una especificidad para CCR5.

El receptor de quimiocina CCR5 es un miembro de una gran familia de receptores de siete dominios transmembrana acoplados a proteína G que se une a las quimiocinas proinflamatorias RANTES, MIP1-, MIP1- y MCP-2. Las quimiocinas actúan junto con moléculas de adhesión para inducir la extravasación de leucocitos y para dirigir su migración a sitios de lesión tisular. CCR5 se expresa en una minoría de linfocitos T y monocitos y es adicionalmente el principal correceptor para cepas de VIH-1 M-tróficas que predominan en la etapa temprana del transcurso de una infección por VIH.

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) no puede entrar en células humanas a no ser que se una primero a dos moléculas clave en la superficie celular, CD4 y un correceptor. El correceptor que se reconoce inicialmente es CCR5, posteriormente en el ciclo vital del virus otro receptor de quimiocina CXCR4 se convierte en el correceptor para VIH-1 (D’Souza, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 529 (1996)). Las cepas de VIH-1 que causan la mayoría de las transmisiones de virus por contacto sexual se denominan virus M-trópicos. Estas cepas de VIH-1 (también conocidas como virus primarios no inductores de sincitio (NSI)) pueden replicar en linfocitos T CD4+ primarios y macrófagos y usan el receptor de quimiocina CCR5 (y, con menor frecuencia, CCR3) como su correceptor. Los virus T-trópicos (en ocasiones denominados virus primarios inductores de sincitio (SI)) también pueden replicar en linfocitos T CD4+ primarios pero pueden además infectar líneas de linfocitos T CD4+ establecidas in vitro, lo que hacen mediante el receptor de quimiocina CXCR4 (fusina). Muchas de estas cepas T-trópicas pueden usar CCR5 además de CXCR4 y algunas pueden entrar en macrófagos mediante CCR5, al menos en ciertas condiciones in vitro (D’Souza, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 529 (1996)).

No se ha resuelto si otros correceptores contribuyen a patogénesis por VIH-1, pero la existencia de otro correceptor para algunas cepas T-trópicas puede inferirse a partir de estudios in vitro. Debido a que las cepas de VIH-1 Mtrópicas están implicadas en aproximadamente el 90% de las transmisiones sexuales de VIH, CCR5 es el correceptor predominante para el virus en pacientes; la transmisión (o establecimiento sistémico) de cepas que usan CXCR4 (T-trópicas) es poco común (D’Souza, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 529 (1996), Paxton, Nature Med. 2, 412 (1996); Liu, Cell 86, 367 (1996); Samson, Nature 382, 722 (1996); Dean, Science 273, 1856 (1996); Huang, Nature Med. 2, 1240 (1996)). Sin embargo, una vez que los virus SI evolucionan in vivo (o si se transmiten), son especialmente virulentos y causan una progresión de la enfermedad más rápida (D’Souza, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 529 (1996), Schuitemaker, J. Virol. 66, 1354 (1992); Connor, J. Virol. 67, 1772 (1993); Richman, J. Infect. Dis. 169, 968 (1994);

R. I. Connor y col., J. Exp. Med. 185, 621 (1997); Trkola, Nature 384, 184 (1996)).

Los números e identidades de las moléculas correceptoras en células diana y la capacidad de las cepas de VIH-1 para probablemente entrar en células mediante los diferentes correceptores, parecen ser determinantes críticos de la progresión de la enfermedad. Estos factores son influencias principales en aspectos dependientes de virus y de huésped de la infección por VIH-1. Por ejemplo, un defecto homocigótico (delta 32) en CCR5 se correlaciona fuertemente con resistencia a infección por VIH-1 in vivo e in vitro. Los individuos que son heterocigotos para un alelo CCR5 defectuoso están protegidos débilmente en el mejor de los casos contra la infección y tienen solamente una progresión de la enfermedad levemente ralentizada (Paxton, Nature Med. 2, 412 (1996); Liu, Cell 86, 367 (1996); Samson, Nature 382, 722 (1996); Dean, Science 273, 1856 (1996); Huang y col., Nature Med. 2, 1240 (1996)). Sin embargo, otros factores pueden influir en el nivel de expresión de CCR5 en linfocitos T CD4+ activados y afectar de este modo a la eficacia de infección por VIH-1 in vitro (Trkola, Nature 384, 184 (1996); Bleul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1925 (1997)).

Para esclerosis múltiple se mostró que CCR5 y CXCR3 se expresan predominantemente en linfocitos T que infiltran lesiones cerebrales desmielinizantes, así como en la sangre periférica de pacientes afectados. La eliminación de los linfocitos T bloquearía la rama de linfocitos T de esta enfermedad autoinmune.

También se observó alta expresión de CCR3 y CCR5 en linfocitos T y linfocitos B de ganglios linfáticos derivados de pacientes con enfermedad de Hodgkin.

Se considera que la diabetes tipo I es una enfermedad autoinmune mediada por linfocitos T. La expresión del receptor CCR5 en el páncreas se asoció con la progresión de diabetes tipo I en modelos animales relevantes (Cameron (2000) J. Immunol. 165, 1102-1110). En particular, la expresión de CCR5 se asoció con el desarrollo de insulinitis y diabetes tipo I espontánea.

Se conocen varios anticuerpos que se unen específicamente a CCR5 (humano) en la técnica y comprenden, MC-1 (Mack (1998) J. Exp. Med. 187, 1215-1224 o MC-5 (Blanpain (2002) Mol Biol Cell. 13:723-37, Segerer (1999) Kidney Int. 56:52-64, Kraft (2001) J Biol Chem. 14.276:34408-18). Los anticuerpos de CCR5, en particular MC-1 y MC-5 pueden servir como una fuente para segundo dominio derivado de Ig de la construcción específica de CD3 descrita en el presente documento. En consecuencia, se describe una construcción biespecífica en el presente documento que comprende al menos dos dominios, en la que el primer dominio proporciona la especificidad para CD3 humano y tiene una propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T y por lo que el segundo dominio derivado de Ig deriva de un anticuerpo específico para CCR5 (humano). Más preferentemente, una construcción tal es un scFV de cadena sencilla como se define en el presente documento.

Se mostró que MC-1 se unía específicamente a la primera parte del segundo bucle extracelular de CCR5 humano y no reaccionaba de forma cruzada con CCR5 derivado de macacos rhesus como se muestra en los ejemplos adjuntos. Por lo tanto, se prefiere que la construcción específica de CD3 descrita en el presente documento comprenda, por ejemplo, dominios VL y VH de un anticuerpo (es decir, un segundo dominio derivado de Ig) específico para CCR5, preferentemente el CCR5 humano y dominios VH y VL de un anticuerpo específico para el antígeno CD3. Dicho anticuerpo específico para el CCR5 humano es el anticuerpo anti-CCR5 humano murino MC-1, descrito, entre otros, en Mack (1998), J. Exp. Med. 187, 1215-1224 y en los ejemplos adjuntos. Aun así, se prevé que otros anticuerpos anti-CCR5, tales como MC-5 (como se caracteriza en los ejemplos adjuntos y se describe en in Blanpain (2002) Mol Biol Cell. 13:723-37, Segerer (1999) Kidney Int. 56:52-64 y Kraft (2001) J Biol Chem. 14; 276:34408-18) puedan emplearse en este contexto.

Se describen en el presente documento construcciones de unión específica a CD3 que comprenden un dominio desinmunizado dirigido contra/que se une a/que interacciona con CD3 humano y un segundo dominio derivado de Ig que se une específicamente/interacciona con CCR5. Tales construcciones se muestran en la Tabla 6A y 6B. Los módulos A-G en las Tablas 6A y 6B pueden definirse como se ha mencionado anteriormente para las tablas 1-5. Pueden seleccionarse dominios VH desinmunizados de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano de las secuencias como se exponen en SEC ID Nº: 74 o 76. Los dominios VL desinmunizados de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano pueden seleccionarse de las secuencias como se exponen en SEC ID Nº: 78, 80 u 82. El dominio proteico VH de anticuerpo CCR5 humano es como se expone en SEC ID Nº: 129. El dominio proteico VL de anticuerpo de CCR5 humano es como se expone en SEC ID Nº: 131. Cuando el par de módulos A/C o E/G es un par de dominios proteicos VH/VL o VL/VH desinmunizados de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD3 humano, el módulo proteico B o F, respectivamente, tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº: 3. Cuando el par de módulos A/C o E/G es un par de VH/VL o VL/VH de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno EpCAM, el módulo proteico B o F, respectivamente, tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº: 168. Los grupos respectivos de módulos proteicos A-B-C y E-F-G se conectan entre sí a través del módulo proteico D, que tiene la secuencia como se expone en SEC ID Nº: 174. Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente puede introducirse una serina adicional para fines de clonación (engarce como se representa en SEC ID Nº: 176) entre el dominio VL y dominio V posterior.

Pueden seleccionarse moléculas de ácido nucleico que codifican dominios VH desinmunizados de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano a partir de las secuencias como se exponen en SEC ID Nº: 73 o

75. Pueden seleccionarse moléculas de ácido nucleico que codifican dominios VL desinmunizados de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano de las secuencias como se exponen en SEC ID Nº: 77, 79 u

81. La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio proteico VH del anticuerpo de CCR5 humano es como se expone en SEC ID Nº: 128. La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio proteico VL del CCR5 humano es como se expone en SEC ID Nº: 130. Cuando el par de módulos A/C o E/G indica ácido nucleico que codifica un par

5 de dominios proteicos VH/VL o VL/VH desinmunizados de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD3 humano, el módulo de ácido nucleico B o F respectivamente, tiene la secuencia de ácido nucleico como se expone en SEC ID Nº: 202. Cuando el par de módulos A/C o E/G indica ácido nucleico que codifica un par de VH/VL

o VL/VH de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno de CCR5, el módulo de ácido nucleico B o F, respectivamente, tiene la secuencia de ácido nucleico como se expone en SEC ID Nº: 201. Los grupos de módulos

10 de ácido nucleico A-B-C y E-F-G están conectados entre sí a través del módulo proteico D, que tiene la secuencia como se expone en SEC ID Nº: 173. Un engarce alternativo SEC ID Nº: 175 también puede usarse para conjugar dominio VL con un dominio V posterior (incluyendo un codón adicional que codifica un resto de serina para fines de clonación).

Tabla 6A Construcciones de anti CD3 humano desinmunizadas que comprenden las regiones variables anti15 CCR5 de cadena sencilla:

Secuencia de aminoácidos

Construcción: SEQ ID Nº: en la parte de la construcción... Especificidad de construcción anti-CD3 desinmunizada (N-> C) Disposición de dominios

A: B C D E F G

1: 80 3 74 174 129 168 131 CD3 (VL2/VH5) xCCR5 LHLH

2: 74 3 80 174 129 168 131 CD3 (VH5/VL2) xCCR5 LHLH

3: 80 3 74 174 131 168 129 CD3 (VL2/VH5) xCCR5 LHLH

4: 74 3 80 174 131 168 129 CD3 (VH5/VL2) xCCR5 HLLH

5: 131 168 129 174 74 3 80 CCR5xCD3 (VH5/VL2) LHHL

6: 129 168 131 174 74 3 80 CCR5xCD3 (VH5/VL2) HLHL

7: 131 168 129 174 80 3 74 CCR5xCD3 (VL2/ VH5) LHLH

8: 129 168 131 174 80 3 74 CCR5xCD3 (VL2/ VH5) HLLH

9: 80 3 76 174 129 168 131 CD3 (VL2/VH7) xCCR5 LHHL

10: 76 3 80 174 129 168 131 CD3 (VH7/VL2) xCCR5 HLHL

11: 80 3 76 174 131 168 129 CD3 (VL2/VH7) xCCR5 LHLH

12: 76 3 80 174 131 168 129 CD3 (VH7/VL2) xCCR5 HLLH

13: 131 168 129 174 76 3 80 CCR5xCD3 (VH7/VL2) LHHL

(continuación)

A: B C D E F G

14: 129 168 131 174 76 3 80 CCR5xCD3 (VH7/VL2) HLHL

15: 131 168 129 174 80 3 76 CCR5xCD3 (VL2/ VH7) LHLH

16: 129 168 131 174 80 3 76 CCR5xCD3 (VL2/ VH7) HLLH

Tabla 6B Construcciones anti CD3 humano desinmunizadas que comprenden regiones variables anti-CCR5 de cadena sencilla: secuencia de ácido nucleico

Construcción: SEQ ID Nº: en la parte de la construcción... Especificidad de construcción anti-CD3 desinmunizado (N-> C) Disposición de dominios

A: B C D E F G

1: 79 202 73 173 128 201 130 CD3 (VL2/VH5) xCCR5 LHHL

2: 73 202 79 173 128 201 130 CD3 (VH5NL2) xCCR5 HLHL

3: 79 202 73 173 130 201 128 CD3 (VL2/VH5) xCCR5 LHLH

4: 73 202 79 173 130 201 128 CD3 (VH5NL2) xCCR5 HLLH

5: 130 201 128 173 73 202 79 CCR5xCD3 (VH5NL2) LHHL

6: 128 201 130 173 73 202 79 CCR5xCD3 (VH5/VL2) HLHL

7: 130 201 128 173 79 202 73 CCR5xCD3 (VL2/ VH5) LHLH

8: 128 201 130 173 79 202 73 CCR5xCD3 (VL2/ VH5) HLLH

9: 79 202 75 173 128 201 130 CD3 (VL2/VH7) xCCR5 LHHL

10: 75 202 79 173 128 201 130 CD3 (VH7NL2) xCCR5 HLHL

11: 79 202 75 173 130 201 128 CD3 (VL2/VH7) xCCR5 LHLH

12: 75 202 79 173 130 201 128 CD3 (VH7/VL2) xCCR5 HLLH

(continuación)

A: B C D E F G

13: 130 201 128 173 75 202 79 CCR5xCD3 (VH7NL2) LHHL

14: 128 201 130 173 75 202 79 CCR5xCD3 (VH7/VL2) HLHL

15: 130 201 128 173 79 202 75 CCR5xCD3 (VL2/ VH7) LHLH

16: 128 201 130 173 79 202 75 CCR5xCD3 (VL2/ VH7) HLLH

Preferentemente, dichas construcciones comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de

(a) una secuencia de aminoácidos como se muestra en una cualquiera de SEC ID Nº: 206, 208, 210, 212, 214 o 5 216;

(b): una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico como se muestra en una cualquiera de SEC ID Nº: 205, 207, 209, 211, 213 o 215; y

10 (d) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la hebra complementaria de una secuencia de ácido nucleico como se define en (b) en condiciones de hibridación rigurosas.

Las construcciones de unión a CD3 y CCR5 SEC ID Nº: 206, 208, 210 representan la construcción 5 y SEC ID Nº: 212, 214 y 216 representan la construcción 13 de la Tabla 6 y tienen las tres regiones VL diferentes (VL1 (SEC ID

15 Nº: 78), VL2 (SEC ID Nº: 80) o VL3 (SEC ID Nº: 82).

Se describen en el presente documento construcciones de unión específica a CD3 que comprenden un primer dominio que se une específicamente a CD3 humano y tiene propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T y que comprenden un segundo dominio derivado de Ig dirigido contra/capaz de unirse a CCR5, que comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la hebra complementaria

20 de una secuencia de ácido nucleico como se define en (b) anteriormente en el presente documento, es decir a una secuencia de ácido nucleico como se muestra en una cualquiera de SEC ID Nº: 205, 207, 209, 211, 213 o 215 en condiciones de hibridación rigurosas. Las expresiones “hibridación” y “condiciones rigurosas” se han descrito anteriormente en el presente documento. Las definiciones y realizaciones correspondientes se aplican aquí cambiando lo que se deba cambiar.

25 Las construcciones de unión a CCR5 y CD3 desinmunizadas descritas en el presente documento son particularmente útiles en la intervención médica de enfermedades virales, en particular infecciones por VIH y SIDA o de enfermedades autoinmunes y/o enfermedades inflamatorias, tales como artritis reumatoide.

También se describen en el presente documento construcciones de unión específica a CD3 como se ha definido anteriormente el presente documento, en las que el segundo dominio derivado de Ig de la construcción de la

30 invención comprende un sitio de interacción con antígeno con especificidad para CD19.

CD19 ha demostrado ser una diana médica muy útil. CD19 se expresa en el linaje de linfocitos B completo desde el prolinfocito B hasta el linfocito B maduro, no se desprende, se expresa de forma uniforme en todas las células de linfoma y está ausente de células madre (Haagen, Clin Exp Immunol 90 (1992), 368-75; Uckun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8603-7). Se ha desvelado terapia de combinación que emplea tanto un anticuerpo dirigido 35 contra CD19 como un anticuerpo inmunorregulador adicional para el tratamiento de tumores malignos de linfocitos B (Documentos WO 02/04021, US2002006404, US2002028178) y enfermedades autoinmunes (Documentos WO 02/22212, US2002058029). El Documento WO 00/67795 desvela el uso entre otros de anticuerpos dirigidos contra CD19 para el tratamiento de formas indolentes y agresivas de linfomas de linfocitos B, así como formas agudas y crónicas de leucemias linfáticas. El Documento WO 02/80987 desvela el uso terapéutico de inmunotoxinas

basándose en anticuerpos contra el antígeno CD19 para el tratamiento de tales enfermedades como linfomas de linfocitos B no de Hodgkin, linfoma de Hodgkin o leucemia de linfocitos B (por ejemplo leucemia linfática aguda de linfocitos B (B-ALL), (por ejemplo linfoma de tricoleucitos) leucemia linfática aguda de precursores de linfocitos B (pre-B-ALL), leucemia linfática crónica de linfocitos B (B-CLL)).

5 También se describen en el presente documento construcciones de unión específica a CD3, que comprenden un dominio desinmunizado dirigido contra/que se une a/interacciona con CD3 humano y un segundo dominio derivado de Ig que se une específicamente/interacciona con CD19. Tales construcciones se muestran en las Tablas 7A y 7B. Los módulos A-G en las Tablas 7A y 7B pueden definirse como se ha mencionado anteriormente para las Tablas 1

5. Los dominios VH desinmunizados de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano pueden

10 seleccionarse de las secuencias como se exponen en SEC ID Nº: 74 ó 76. Los dominios VL desinmunizados de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano pueden seleccionarse de las secuencias como se exponen en SEC ID Nº: 78, 80 ó 82. El dominio proteico VH del anticuerpo de CD19 humano es como se expone en SEC ID Nº: 114. El dominio proteico VL del anticuerpo de CCR5 humano es como se expone en SEC ID Nº: 116. Cuando el par de módulos A/C ó E/G es un par de dominios proteicos VH/VL ó VL/VH desinmunizados de un

15 anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD3 humano, el módulo proteico B ó F, respectivamente, tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº.: 3. Cuando el par de módulos A/C ó E/G es un par de VH/VL ó VL/VH de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD19, el módulo proteico B ó F, respectivamente, tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº.: 168. Los grupos respectivos de módulos proteicos A-B-C y E-F-G están conectados entre sí a través del módulo proteico D, que tiene la secuencia

20 como se expone en SEC ID Nº: 174. Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente pueden introducirse una serina adicional para fines de clonación (engarce como se representa en SEC ID Nº: 176) entre el dominio VL y el dominio V posterior.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican dominios VH desinmunizados de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano pueden seleccionarse de las secuencias como se exponen en SEC ID Nº: 73 ó 75. 25 Las moléculas de ácido nucleico que codifican dominios VL desinmunizados de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano pueden seleccionarse de las secuencias como se exponen en SEC ID Nº: 77, 79 ó

81. La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio proteico VH del anticuerpo de CD19 humano es como se expone en SEC ID Nº: 113. La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio proteico VL del anticuerpo de CCR5 humano es como se expone en SEC ID Nº: 115. Cuando el par de módulos A/C ó E/G indica un ácido 30 nucleico que codifica un par de dominios proteicos VH/VL ó VL/VH desinmunizados de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD3 humano, el módulo de ácido nucleico B ó F, respectivamente, tienen la secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº.: 202. Cuando el par de módulos A/C ó E/G indica un ácido nucleico que codifica un par de VH/VL ó VL/VH de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD19, el módulo de ácido nucleico B ó F, respectivamente, tiene la secuencia de ácido nucleico como se expone en

35 SEC ID Nº.: 201. Los grupos de módulos de ácido nucleico A-B-C y E-F-G están conectados entre sí a través del módulo proteico D, que tiene la secuencia como se expone en SEC ID Nº: 173. Un engarce alternativo SEC ID Nº: 175 también puede usarse para conjugar dominio VL con un dominio V posterior (incluyendo un codón adicional que codifica un resto de serina para fines de clonación).

Tabla 7A Construcciones de anti CD3 humano desinmunizadas que comprenden regiones variables anti40 CD19 de cadena sencilla: secuencia de aminoácidos

Construcción: SEC ID Nº.: en la parte de la construcción... Construcción anti-CD3 desinmunizada / especificidad (N -> C) Disposición de los dominios

A: B C D E F G

1: 80 3 74 174 114 168 116 CD3 (VL2/ VH5) xCD19 LHHL

2: 74 3 80 174 114 168 116 CD3 (VH5/VL2) xCD19 HLHL

3: 80 3 74 174 116 168 114 CD3 (VL2/ VH5) xCD19 LHLH

(continuación)

A: B C D E F G

4: 74 3 80 174 116 168 114 CD3 (VH5/VL2) xCD19 HLLH

5: 116 168 114 174 74 3 80 CD19xCD3 (VH5/VL2) LHHL

6: 114 168 116 174 74 3 80 CD19xCD3 (VH5/VL2) HLHL

7: 116 168 114 174 80 3 74 CD19xCD3 (VL2/VH5) LHLH

8: 114 168 116 174 80 3 74 CD19xCD3 (VL2/VH5) HLLH

9: 80 3 76 174 114 168 116 CD3 (VL2/ VH7) xCD19 LHHL

10: 76 3 80 174 114 168 116 CD3 (VH7/VL2) xCD19 HLHL

11: 80 3 76 174 116 168 114 CD3 (VL2/ VH7) xCD19 LHLH

12: 76 3 80 174 116 168 114 CD3 (VH7NL2) xCD19 HLLH

13: 116 168 114 174 76 3 80 CD19xCD3 (VH7/VL2) LHHL

14: 114 168 116 174 76 3 80 CD19xCD3 (VH7/VL2) HLHL

15: 116 168 114 174 80 3 76 CD19xCD3 (VL2/ VH7) LHLH

16: 114 168 116 174 80 3 76 CD19xCD3 (VL2/ VH7) HLLH

Tabla 7B Construcciones anti CD3 humano desinmunizadas que comprenden regiones variables anti-CD19 de cadena sencilla: secuencia de ácido nucleico

A: B C D E F G

1: 79 202 73 173 113 201 115 CD3 (VL2/ VH5) xCD19 LHHL

2: 73 202 79 173 113 201 115 CD3 (VH5/VL2) xCD19 HLHL

3: 79 202 73 173 115 201 113 CD3 (VL2/ VH5) xCD19 LHLH

4: 73 202 79 173 115 201 113 CD3 (VH5NL2) xCD19 HLLH

5: 115 201 113 173 73 202 79 CD19xCD3 (VH5NL2) LHHL

6: 113 201 115 173 73 202 79 CD19xCD3 (VH5/VL2) HLHL

7: 115 201 113 173 79 202 73 CD19xCD3 (VL2/ VH5) LHLH

8: 113 201 115 173 79 202 73 CD19xCD3 (VL2/ VH5) HLLH

9: 79 202 75 173 113 201 115 CD3 (VL2/ VH7) xCD19 LHHL

10: 75 202 79 173 113 201 115 CD3 (VH7/VL2) xCD19 HLHL

11: 79 202 75 173 115 201 113 CD3 (VL2/ VH7) xCD19 LHLH

12: 75 202 79 173 115 201 113 CD3 (VH7NL2) xCD19 HLLH

13: 115 201 113 173 75 202 79 CD19xCD3 (VH7/VL2) LHHL

14: 113 201 115 173 75 202 79 CD19xCD3 (VH7/VL2) HLHL

15: 115 201 113 173 79 202 75 CD19xCD3 (VL2/ VH7) LHLH

16: 113 201 115 173 79 202 75 CD19xCD3 (VL2/ VH7) HLLH

Se describe en el presente documento una construcción de unión específica a CD3 desinmunizada que comprende un dominio de unión a CD3 como se ha definido anteriormente y un segundo dominio derivado de Ig que se une específicamente/interacciona con CD19, preferentemente CD19 humano, comprendiendo dicha construcción de unión específica a CD3 una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de

(a): una secuencia de aminoácidos como se muestra en una cualquiera de SEC ID Nº.: 190, 192, 194,196,198, 200, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377; 379,381,383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407 ó 409;

(b): una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico como se muestra en una cualquiera de SEC ID Nº.: 189, 191,193, 195, 197, 199, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406 ó 408; y

(d): y secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la hebra complementaria de una secuencia de ácido nucleico como se define en (b) en condiciones de hibridación rigurosas.

Son construcciones de unión a CD19 y CD3 preferidas SEC ID Nº: 190, 192, 194, que representan la construcción 5 y SEC ID Nº: 196,198 y 200 que representan la construcción 13 de la Tabla 7 y que tienen las tres regiones VL diferentes (VL1 (SEC ID Nº:78), VL2 (SEC ID Nº:80); ó VL3 (SEC ID Nº:82)).

También se describen en el presente documento construcciones de unión específica a CD3 que comprenden un primer dominio que se une específicamente a CD3 humano y tiene propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T y que comprenden un segundo dominio derivado de Ig dirigido contra/capaz de unirse a CD19, que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la hebra complementaria de una secuencia de ácido nucleico como se ha definido en (b) anteriormente en el presente documento, es decir a una secuencia de ácido nucleico como se muestra en una cualquiera de SEC ID Nº.: 189, 191, 193, 195, 197,199, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406 ó 408, en condiciones de hibridación rigurosas. Las expresiones “hibridación” y “condiciones rigurosas” se han descrito en el presente documento anteriormente. Las definiciones y realizaciones correspondientes se aplican aquí cambiando lo que se deba cambiar.

Las construcciones de unión a CD3 y CD19 desinmunizadas desveladas en el presente documento son particularmente útiles en la prevención, tratamiento o alivio de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad inflamatoria, un trastorno inmunológico, una enfermedad autoinmune, una enfermedad infecciosa, una enfermedad viral, reacciones alérgicas, relaciones parasitarias, enfermedades de injerto contra huésped, enfermedades de huésped contra injerto o tumores malignos de linfocitos B, en particular linfoma de linfocitos de no Hodgkin, linfoma de Hodgkin o leucemia de linfocitos B (por ejemplo leucemia linfática aguda de linfocitos B (B-ALL), (por ejemplo linfoma de tricoleucitos) leucemia linfática aguda de precursores de linfocitos B (pre-B-ALL), leucemia linfática crónica de linfocitos B (B-CLL)).

Se describe el presente documento una construcción de unión específica a CD3 como se ha definido anteriormente que comprende un primer dominio que se une específicamente con CD3 humano y que tiene una propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T y un segundo dominio, en la que dicho segundo dominio es derivado de Ig y comprende un sitio de interacción con antígeno con una especificidad para CD20.

CD20 es una de las proteínas de superficie celular presentes en linfocitos B. El antígeno CD20 se encuentra en linfocitos B maduros y pre-B malignos y normales, incluyendo los que están en más del 90 % de linfomas de linfocitos B no Hodgkin (NHL). El antígeno está ausente en células madre hematopoyéticas, linfocitos B activados (células plasmáticas) y tejido normal. Se han descrito varios anticuerpos principalmente de origen murino: 1 F5 ((Press y col., 1987, Blood 69/2, 584-591), 2B8 / C2B8, 2H7, 1H4 (Liu y col., 1987, J Immunol 139, 3521-3526; Anderson y col., 1998. Patente de Estados Unidos en Nº. 5.736,137; Haisma y col., 1998, Blood 92, 184-190; Shan y col., 1999, J. Immunol 162, 6589-6595).

Se ha descrito CD20 en estrategias inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores malignos de células plasmáticas usando vacuna con ADN que codifica scFv ligado a una proteína vehículo (Treon y col., 2000, Semin Oncol 27(5), 598) y en tratamiento inmunoterapéutico usando CD20 se ha mostrado que los anticuerpos (IDECC2B8) son eficaces en el tratamiento del linfoma de linfocitos B no Hodgkin. Los anticuerpos CD20 tienen tolerancia y eficacia demostradas en linfoma no de Hodgkin, consiguiendo tasas de respuesta de 73 % y 48 % en linfoma no Hodgkin previamente no tratado o de recaída/refractario indolente, respectivamente (Montserrat, 2003, Semin Oncol 30(1supl2), 34-39). Además, se han usado ampliamente anticuerpos de CD20 para tratar neoplasias de linfocitos B de etapa avanzada o de recaída con una eficacia de aproximadamente el 50 %.

Se describen en el presente documento construcciones de unión específica a CD3 que comprenden un dominio desinmunizado dirigido contra/que se une a/que interacciona con CD3 humano y un segundo dominio derivado de Ig que se une específicamente con/interacciona con CD20. Tales construcciones se muestran en las Tablas 8A y 8B. Los módulos A-G en las Tablas 8A y 8B pueden definirse como se ha mencionado anteriormente para las Tablas 1

5. Los dominios VH desinmunizados de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano pueden seleccionarse de las secuencias como se exponen en SEC ID Nº: 74 ó 76. Los dominios VL desinmunizados de 5 anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano pueden seleccionarse de las secuencias como se exponen en SEC ID Nº: 78, 80 u 82. El dominio proteico VH de anticuerpo de CD20 humano es como se expone en SEC ID Nº: 170. El dominio proteico VL del anticuerpo de CD20 humano es como se expone en SEC ID Nº: 172. Cuando el par de módulos A/C ó E/G es un par de dominios proteicos VH/VL ó VL/VH desinmunizados de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD3 humano, el módulo proteico B ó F, respectivamente, tiene la 10 secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº.: 3. Cuando el par de módulos A/C ó E/G es un par de VH/VL ó VL/VH de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD20, el módulo proteico B ó F, respectivamente, tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº.: 168. Los grupos respectivos de módulos proteicos A-B-C y E-F-G están conectados entre sí a través del módulo proteico D, que tiene la secuencia como se expone en SEC ID Nº: 174. Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente puede introducirse una

15 serina adicional para fines de clonación (engarce como se representa en SEC ID Nº: 176) entre el dominio VL y V posterior.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican dominios VH desinmunizados de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno CD3 humano pueden seleccionarse de las secuencias como se exponen en SEC ID Nº: 73 ó 75. Las moléculas de ácido nucleico que codifica dominios VL desinmunizados de anticuerpos que tienen especificidad 20 para el antígeno CD3 humano pueden seleccionarse de las secuencias como se exponen en SEC ID Nº: 77, 79 ó

81. La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio proteico VH del anticuerpo de CD20 humano es como se expone en SEC ID Nº: 169. La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio proteico VL del anticuerpo de CD20 humano es como se expone en SEC ID Nº: 171. Cuando el par de módulos A/C ó E/G indica un ácido nucleico que codifica un par de dominios proteicos VH/VL ó VL/VH desinmunizados de un anticuerpo que tiene especificidad 25 para el antígeno CD3 humano, el módulo de ácido nucleico B ó F, respectivamente, tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº.: 202. Cuando el par de módulos A/C ó E/G indica un ácido nucleico que codifica un par de VH/VL ó VL/VH de un anticuerpo que tiene especificidad para el antígeno CD20, el módulo de ácido nucleico B ó F, respectivamente, tiene la secuencia de ácido nucleico como se expone en SEC ID Nº.: 201. Los grupos de módulos de ácido nucleico A-B-C y E-F-G están conectados entre sí a través del módulo de ácido

30 nucleico D, que tiene la secuencia como se expone en SEC ID Nº: 173. Un engarce alternativo SEC ID Nº: 175 también puede usarse para conjugar dominio VL con un dominio V posterior (incluyendo un codón adicional que codifica un resto de serina con fines de clonación).

Tabla 8A Construcciones anti CD3 humano desinmunizadas que comprenden regiones variables anti-CD20 de cadena sencilla: secuencia de aminoácidos

Construcción: SEC ID Nº: en la parte de la construcción... Construcción anti-CD3 desinmunizada / Especificidad (N -> C) Disposición de los dominios

A: B C D E F G

1: 80 3 74 174 170 168 172 CD3 (VL2/ VH5) xCD20 LHHL

2: 74 3 80 174 170 168 172 CD3 (VH5NL2) xCD20 HLHL

3: 80 3 74 174 172 168 170 CD3 (VL2/ VH5) xCD20 LHLH

4: 74 3 80 174 172 168 170 CD3 (VH5NL2) xCD20 HLLH

5: 172 168 170 174 74 3 80 CD20xCD3 (VH5/VL2) LHHL

6: 170 168 172 174 74 3 80 CD20xCD3 (VH5/VL2) HLHL

7: 172 168 170 174 80 3 74 CD20xCD3 (VL2/ VH5) LHLH

A: B C D E F G

8: 170 168 172 174 80 3 74 CD20xCD3 (VL2/ VH5) HLLH

9: 80 3 76 174 170 168 172 CD3 (VL2/ VH7) xCD20 LHHL

10: 76 3 80 174 170 168 172 CD3 (VH7/VL2) xCD20 HLHL

11: 80 3 76 174 172 168 170 CD3 (VL2/ VH7) xCD20 LHLH

12: 76 3 80 174 172 168 170 CD3 (VH7/VL2) xCD20 HLLH

13: 172 168 170 174 76 3 80 CD20xCD3 (VH7/VL2) LHHL

14: 170 168 172 174 76 3 80 CD20xCD3 (VH7/VL2) HLHL

15: 172 168 170 174 80 3 76 CD20xCD3 (VL2/ VH7) LHLH

16: 170 168 172 174 80 3 76 CD20xCD3 (VL2/ VH7) HLLH

Tabla 8B Construcciones anti CD3 desinmunizadas que comprenden regiones variables anti-CD20 de cadena sencilla: Secuencia de nucleótidos

A: B C D E F G

1: 79 202 73 173 169 201 171 CD3 (VL2/ VH5) xCD20 LHHL

2: 73 202 79 173 169 201 171 CD3 (VH5NL2) xCD20 HLHL

3: 79 202 73 173 171 201 169 CD3 (VL2/ VH5) xCD20 LHLH

(continuación)

A: B C D E F G

4: 73 202 79 173 171 201 169 CD3 (VH5/VL2) CD20 HLLH

5: 171 201 169 173 73 202 79 CD20xCD3 (VH5/VL2) LHHL

6: 169 201 171 173 73 202 79 CD20xCD3 (VH5/VL2) HLHL

7: 171 201 169 173 79 202 73 CD20xCD3 (VL2/ VH5) LHLH

8: 169 201 171 173 79 202 73 CD20xCD3 (VL2/ VH5) HLLH

9: 79 202 75 173 169 201 171 CD3 (VL2/ VH7) xCD20 LHHL

10: 75 202 79 173 169 201 171 CD3 (VH7NL2) xCD20 HLHL

11: 79 202 75 173 171 201 169 CD3 (VL2/ VH7) xCD20 LHLH

12: 75 202 79 173 171 201 169 CD3 (VH7/VL2) xCD20 HLLH

13: 171 201 169 173 75 202 79 CD20xCD3 (VH7/VL2) LHHL

14: 169 201 171 173 75 202 79 CD20xCD3 (VH7/VL2) HLHL

15: 171 201 169 173 79 202 75 CD20xCD3 (VL2/ VH7) LHLH

16: 169 201 171 173 79 202 75 CD20xCD3 (VL2/ VH7) HLLH

Más preferentemente, las construcciones de unión a CD3 y CD20 desinmunizadas descritas en el presente documento comprenden una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en

5 (a) una secuencia de aminoácidos como se muestra en una cualquiera de SEC ID Nº: 218, 220, 222, 224, 226, o 228;

(b) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico como se muestra en una cualquiera de SEC ID Nº: 217, 219, 221, 223, 225 o 227; y

(c) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que está degenerada como 10 resultado del código genético para una secuencia de nucleótidos de (b);

(d) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la hebra complementaria de una secuencia de ácido nucleico como se define en (b) en condiciones de hibridación rigurosas.

Se describen en el presente documento construcciones de unión específica de CD3 que comprenden un primer 15 dominio que se une específicamente a CD3 humano y tiene propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T y que comprenden un segundo dominio derivado de Ig dirigido contra/capaz de unirse a CD20, que comprende una

secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la hebra complementaria de una secuencia de ácido nucleico como se ha definido en (b) anteriormente en el presente documento, es decir a una secuencia de ácido nucleico como se muestra en una cualquiera de SEC ID Nº: 217, 219, 221, 223, 225 o 227, en condiciones de hibridación rigurosas. Las expresiones “hibridación” y “condiciones rigurosas” se han descrito anteriormente en el presente documento. Las definiciones y realizaciones correspondientes se aplican aquí cambiando lo que se deba cambiar.

Las construcciones de unión a CD20 y CD3 desinmunizadas descritas en el presente documento se prevén para su uso en el tratamiento, prevención y/o alivio de trastornos relacionados con linfocitos B, preferentemente en la intervención médica de linfoma, más preferentemente en el tratamiento de linfoma no de Hodgkin.

La invención también proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de unión específica a CD3 de la invención.

Resulta evidente para el experto en la materia que pueden añadirse secuencias reguladoras a la molécula de ácido nucleico de la invención. Por ejemplo, pueden emplearse promotores, potenciadores de la transcripción y/o secuencias que permiten la expresión inducida del polinucleótido de la invención. Un sistema inducible adecuado es por ejemplo expresión génica regulada por tetraciclina como se describe, por ejemplo, en Gossen y Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547-5551) y Gossen y col. (Trends Biotech. 12 (1994), 58-62), o un sistema de expresión génica inducible por dexametasona como se describe, por ejemplo, en Crook (1989) EMBO J. 8, 513-519.

Además, se prevé para fines adicionales que las moléculas de ácido nucleico pueden contener, por ejemplo, tioéster y/o análogos de nucleótidos. Dichas modificaciones pueden ser útiles para la estabilización de la molécula de ácido nucleico contra endo y/o exonucleasas en la célula. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden transcribirse por un vector apropiado que contiene un gen quimérico que permite la transcripción de dicha molécula de ácido nucleico en la célula. A este respecto, también debe entenderse que dicho polinucleótido puede usarse para enfoques de “reconocimiento génico” o “terapia génica”. En otra realización, dichas moléculas de ácido nucleico están marcadas. Los procedimientos para la detección de ácidos nucleicos se conocen bien en la técnica, por ejemplo, transferencia de Southern y Northern, PCR o extensión de cebador. Esta realización puede ser útil para procedimientos de exploración para verificar la introducción exitosa de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente durante los enfoques de terapia génica.

Dicha molécula o moléculas de ácido nucleico pueden ser una molécula de ácido nucleico quimérica producida de forma recombinante que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico anteriormente mencionadas solas o en combinación. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico es parte de un vector.

La presente invención también se refiere por lo tanto a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico descrita en la presente invención.

Se conocen muchos vectores adecuados para los expertos en biología molecular, la elección de los cuales dependería de la función deseada e incluyen plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores usados convencionalmente en ingeniería genética. Pueden usarse procedimientos que los expertos en la materia conocen bien para construir diversos plásmidos y vectores; véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y col. (en el lugar ya citado) y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Como alternativa, los polinucleótidos y vectores de la invención pueden reconstituirse en liposomas para su suministro a células diana. Como se analiza en más detalle posteriormente, se usó un vector de clonación para aislar secuencias individuales de ADN. Las secuencias relevantes pueden transferirse a vectores de expresión en los que se requiere la expresión de un polipéptido particular. Los vectores de clonación típicos incluyen pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 y pGBT9. Los vectores de expresión típicos incluyen pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT. Preferentemente dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia reguladora unida operativamente a dicha secuencia de ácido nucleico que codifica una construcción de anticuerpo de cadena sencilla biespecífica definida en el presente documento.

Tales secuencias reguladoras (elementos de control) se conocen para el experto en la materia y pueden incluir un promotor, un casete de corte y empalme, codón de inicio de la traducción, sitio de traducción e inserción para introducir un inserto en el vector. Preferentemente, dicha molécula de ácido nucleico está unida operativamente a dichas secuencias de control de la expresión permitiendo la expresión en células eucariotas o procariotas.

Se prevé que dicho vector es un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica una construcción de anticuerpo de cadena sencilla biespecífica definida en el presente documento.

La expresión “secuencia reguladora” se refiere a secuencias de ADN, que son necesarias para efectuar la expresión de secuencias codificantes a las que se ligan. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped. En procariotas, las secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de unión a ribosomas y terminadores. En eucariotas generalmente las secuencias de control incluyen promotores, terminadores y, en algunos casos, potenciadores, transactivadores o factores de transcripción. Se pretende que la expresión “secuencia de control” incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión y también puede incluir componentes ventajosos adicionales.

La expresión “unido operativamente” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar de su manera pretendida. Una secuencia de control “unida operativamente” a una secuencia codificante está ligada de tal modo que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control. En el caso de que la secuencia control sea un promotor, es obvio para el experto en la materia que se usa preferentemente ácido nucleico bicatenario.

De este modo, el vector mencionado es preferentemente un vector de expresión. Un “vector de expresión” es una construcción que puede usarse para transformar un huésped seleccionado y posibilita la expresión de una secuencia codificante en el huésped seleccionado. Los vectores de expresión pueden por ejemplo ser vectores de clonación, vectores binarios o vectores de integración. La expresión comprende transcripción de la molécula de ácido nucleico preferentemente a un ARNm traducible. Los expertos en la materia conocen bien los elementos reguladores que aseguran la expresión en células procariotas y/o eucariotas. En el caso de células eucariotas, comprenden normalmente promotores que aseguran el inicio de la transcripción y opcionalmente señales de poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y estabilización del transcrito. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresión en célula huésped procariotas comprenden, por ejemplo, el promotor PL, lac, trp o tac en E. coli y son ejemplo de elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucariotas el promotor AOX1 o GAL1 en levadura o el promotor de CMV, SV40, RSV (virus de sarcoma de Rous), potenciador de CMV, potenciador de SV40 o un intrón de globina en células de mamífero y otros animales.

Además de los elementos que son responsables del inicio de la transcripción tales elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, tales como el sitio de poli-A de SV40 o el sitio de poli-A de tk, cadena abajo del polinucleótido. Además, dependiendo del sistema de expresión usado pueden añadirse secuencias líder capaces de dirigir el polipéptido a un compartimiento celular o secretarlo en el medio a la secuencia codificante de la secuencia de ácido nucleico mencionada y éstas se conocen bien en la técnica; véase también, por ejemplo, el ejemplo adjunto 1. La secuencia o secuencias líder se ensamblan en fase apropiada con las secuencias de traducción, inicio y terminación y, preferentemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de proteína traducida, o una parte de la misma, en el espacio periplásmico o medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N terminal que transmite características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada de producto recombinante expresado; véase anteriormente. En este contexto, se conocen en la técnica vectores de expresión adecuados tales como el vector de expresión de ADNc de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene), pEF-DHFR, pEF-ADA ó pEF-neo (Raum y col. Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150) ó pSPORT1 (GIBCO BRL).

Preferentemente, las secuencias de control de la expresión serán sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas, pero también pueden usarse secuencias de control para huéspedes procariotas. Una vez que se ha incorporado el vector en el huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para expresión de alto nivel de las secuencias de nucleótidos y, según se desee, puede seguir la recogida y purificación del polipéptido de la invención; véase, por ejemplo, los ejemplos adjuntos.

Un sistema de expresión alternativo que podría usarse es un sistema de insecto. En un sistema tal, se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes ajenos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. La secuencia codificante de una molécula de acido nucleico mencionada puede clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina, y colocarse bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción exitosa de dicha secuencia codificante hará al gen de polihedrina inactivo y producirá virus recombinantes sin la cubierta de proteínas. Los virus recombinantes se usan después para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en los que se expresa la proteína de la invención (Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224-3227). Elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales así como traduccionales. De forma ventajosa, los vectores de la invención anteriormente descritos comprenden un marcador seleccionable y/o puntuable.

Los genes marcadores seleccionables útiles para la selección de células transformadas y, por ejemplo, tejido vegetal y plantas se conocen bien por los expertos en la materia y comprenden, por ejemplo, resistencia a antimetabolitos como base de la selección para DHFR, que confiere resistencia a metotrexato (Reiss, Planta Physiol (Life Sci. Adv) 13 (1994), 143-149); npt, que confiere resistencia a los aminoglucósidos neomicina, kanamicina y paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) e higro, que confiere resistencia a higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Se han descrito genes adicionales seleccionables, concretamente trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano; hisD, que permite a las células utilizar histinol en vez de histidina (Hartman, Proc Natl Acad Sci USA 85 (1988), 8047); manosa-6- fosfato isomerasa que permite a las células utilizar manosa (Documento WO 94/20627) y ODC (ornitin descarboxilasa), que confiere resistencia al inhibidor de la ornitin descarboxilasa, 2 - (difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, En: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) o desaminasa de Aspergillus terreus que confiere resistencia a Blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338).

Los expertos en la materia también conocen marcadores puntuables útiles y estos están disponibles en el mercado. Provechosamente, dicho marcador es un gen que codifica luciferasa (Giacomin, PI Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact 178 (1996),121), proteína verde fluorescente (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) o glucuronidasa (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3,901-3.907). Esta realización es particularmente útil para exploración rápida y sencilla de células, tejidos y organismos que contienen un vector mencionado.

Como se ha descrito anteriormente, la molécula de acido nucleico mencionada puede usarse sola o como parte de un vector para expresar la construcción especifica de CD3 codificada en células para, por ejemplo, purificación, pero también para fines de terapia génica. Las moléculas o vectores de acido nucleico que contienen la secuencia o secuencias de ADN que codifican una cualquiera de las construcciones de CD3 (biespecíficas) anteriormente descritas se introduce en las células que a su vez producen el polipéptido de interés. La terapia génica, que se basa en introducir genes terapéuticos en células mediante técnicas ex vivo o in vivo es una de las aplicaciones más importantes de la transferencia génica. Se describen vectores, procedimientos o sistemas de suministro de genes adecuados para terapia génica in vitro o in vivo en la bibliografía y se conocen por los expertos en la materia, véase, por ejemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann.

N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; Documentos WO 94/29469; WO 97/00957, US 5.580.859; US 5.589.466; ó Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640. Las moléculas de acido nucleico y vectores mencionados pueden diseñarse para la introducción directa o para la introducción mediante liposomas o vectores virales (por ejemplo, adenovirales, retrovirales) en la célula. Preferentemente, dicha célula es una célula de línea germinal, célula embrionaria u óvulo o derivada de las mismas, más preferentemente dicha célula es una célula madre. Un ejemplo de una célula madre embrionaria puede ser, entre otras, una célula madre como se describe en, Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424-8428.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención se refiere a procedimientos para derivar vectores, sobre todo plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos utilizados convencionalmente en la ingeniería genética que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia polipeptídica de una construcción de anticuerpo de cadena sencilla biespecífica definida en el presente documento. Preferentemente, dicho vector es un vector de expresión y/o un vector de dirección o transferencia génica. Los vectores de expresión derivados de virus como retrovirus, virus vaccinia, virus adeno-asociados, virus del herpes, o virus del papiloma bovino, pueden usarse para el suministro de los polinucleótidos mencionados o vector en poblaciones de células diana. Pueden usarse procedimientos que se conocen bien por los expertos en la materia para construir vectores recombinantes; véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y col (en el lugar ya citado), Ausubel (1989, en el lugar ya citado) u otros libros de texto convencionales. Como alternativa, los vectores y moléculas de ácido nucleico mencionados pueden reconstituirse en liposomas para su suministro a células diana. Los vectores que contienen moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden transferirse a la célula huésped por procedimientos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, se utiliza habitualmente transfección de cloruro de calcio para células procariotas, mientras que puede usarse tratamiento de fosfato cálcico o electroporación para otros huéspedes celulares; véase Sambrook, mencionado anteriormente.

El vector mencionado puede, entre otros ser el pEF-DHFR, pEF-ADA ó pEF-neo. Los vectores pEF-DHFR, pEF-ADA y pEF-neo se han descrito en la técnica, por ejemplo en Mack y col. (PNAS (1995) 92, 7021-7025) y Raum y col. (Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150).

La invención también proporciona un huésped transformado o transfectado con un vector como se ha descrito en el presente documento. Dicho huésped puede producirse introduciendo al menos uno del vector anteriormente descrito

o al menos una de las moléculas de acido nucleico anteriormente descritas en el huésped. La presencia de dicho al menos un vector o al menos una molécula de acido nucleico en el huésped puede mediar la expresión de un gen que codifica las construcciones de anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos anteriormente descritas.

La molécula de acido nucleico o vector descrito que se introduce en el huésped puede integrarse en el genoma del huésped o puede mantenerse extracromosómicamente.

El huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota.

Se pretende que el término “procariota” incluya todas las bacterias que puedan transformarse o transfectarse con moléculas de ADN o ARN para la expresión de una proteína de la invención. Los huéspedes procariotas pueden incluir bacterias gran negativas así como gran positivas tales como, por ejemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. Se pretende que el término “eucariota” incluya levaduras, plantas superiores, insectos y preferentemente células de mamíferos. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, la proteína modificada por el polinucleótido de la presente invención puede ser glucosilado o puede ser no glucosilado. Especialmente se prefiere el uso de un plásmido o el virus que contiene la secuencia codificante del polipéptido de la invención y fusionado genéticamente con el mismo un marcador FLAG N-terminal y/o marcador de His C-terminal. Preferentemente, la longitud de dicho marcador FLAG es de aproximadamente de 4 a 8 aminoácidos, más preferentemente de 8 aminoácidos. Un polinucleótido anteriormente descrito puede usarse para transformar o transfectar el huésped usando cualquiera de las técnicas habitualmente conocidas para los expertos en la materia. Además, los procedimientos para preparar genes unidos operativamente, fusionados y expresarlos en, por ejemplo, células de mamíferos y bacterias se conocen bien en la técnica (Sambrook, en el lugar ya citado).

Preferentemente, dicho huésped es una célula bacteriana, de insecto, fúngica, vegetal o animal.

Particularmente se prevé que el huésped mencionado pueda ser una célula de mamífero, más preferentemente una célula humana o línea celular humana.

Las células huésped particularmente preferidas comprenden células CHO, células COS, líneas celulares de mieloma tales como SP2/0 o NS/0. Como se ilustra en los ejemplos adjuntos, se prefiere particularmente células CHO como huéspedes.

En una realización adicional, la presente invención se refiere de este modo a un procedimiento para la preparación de una construcción especifica de CD3 descrita anteriormente que comprende cultivar una célula y/o el huésped de la invención en condiciones adecuadas para la expresión de dicha construcción y aislar la construcción de la célula o el medio de cultivo.

Los huéspedes transformados pueden dejarse crecer en fermentadores y cultivarse de acuerdo con técnicas conocidas en la materia para conseguir un crecimiento celular óptimo. El polipéptido de la invención puede después aislarse del medio de cultivo, lisados celulares o fracciones de membranas celulares. El aislamiento y purificación de, por ejemplo, los polipéptidos expresados en microbios de la invención puede ser por cualquier medio convencional tal como, por ejemplo, separaciones cromatográficas preparatorias y separaciones inmunológicas tales como las que implican el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos, por ejemplo, contra un marcador del polipéptido de la invención o como se describe en los ejemplos adjuntos.

Además, la invención proporciona una composición que comprende una construcción de unión especifica a CD3 (humano) como se define en el presente documento o una construcción de unión especifica CD3 (humano) como se produce por el procedimiento desvelado anteriormente, una molécula de ácido nucleico de la invención, un vector o un huésped de la invención. Dicha composición puede, opcionalmente, comprender también un compuesto proteínico capaz de proporcionar una señal de activación para células efectoras inmunes. Más preferentemente, dicha composición es una composición farmacéutica que comprende adicionalmente, opcionalmente, formulaciones adecuadas de vehículo, estabilizadores y/o excipientes.

De acuerdo con la presente invención, la expresión “composición farmacéutica” se refiere a una composición para administración a un paciente, preferentemente un paciente humano. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende una composición para administración parenteral, transdérmica, intraluminal, intraarterial, intratecal o por inyección directa en el tejido o tumor. En particular se prevé que dicha composición farmacéutica se administre a un paciente mediante infusión o inyección. La administración de las composiciones adecuadas puede efectuarse de diferentes maneras, por ejemplo, por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se conocen bien en la técnica e incluyen soluciones salinas taponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden tales vehículos pueden formularse por procedimientos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto en una dosis adecuada. El régimen de dosificación se determinará por el médico a cargo y factores clínicos. Como se conoce bien en las técnicas médicas, las dosificaciones para un paciente cualquiera dependen de muchos factores, incluyendo la talla del paciente, área de superficie corporal, edad, el compuesto particular a administrar, el sexo, tiempo y vía de administración, salud general y otros fármacos que se estén administrando simultáneamente. Generalmente, el régimen como una administración regular de la composición farmacéutica debería estar en el intervalo de unidades de 1 μg a 5 g por día. Sin embargo, una dosificación más preferida para infusión continua podría estar en el intervalo de unidades de 0,01 μg a 2 mg, preferentemente 0,01 μg a 1 mg, más preferentemente de 0,01 μg a 100 μg, incluso más preferentemente de 0,01 μg a 50 μg y más preferentemente de 0,01 μg a 10 μg por kilogramo de peso corporal por hora. Las dosificaciones particularmente preferidas se mencionan posteriormente en el presente documento. Puede controlarse el progreso mediante evaluación periódica. Las dosificaciones variarán pero una dosificación preferida para administración intravenosa de ADN es de aproximadamente de 106 a 1012 copias de la molécula de ADN. Las composiciones de la invención pueden administrarse por vía sistémica o local. La administración será generalmente por vía parenteral, por ejemplo, intravenosa; el ADN también puede administrarse directamente al sitio diana, por ejemplo, por suministro biolístico a un sitio diana interno o externo o por un catéter a un sitio en una arteria. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones, y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Son ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como etil oleato. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer lactado o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen regeneradores de nutrientes y fluidos, regeneradores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, y gases inertes y similares. Además, la composición farmacéutica de la presente invención podría comprender vehículos proteínicos tales como, por ejemplo, albúmina de suero o inmunoglobulina, preferentemente de origen humano. Se prevé que la composición farmacéutica de la invención podría comprender, además de las construcciones de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico o proteínico o moléculas de ácidos nucleico o vectores que codifican a las mismas (como se describe en la presente invención), agentes biológicamente activos adicionales, dependiendo del uso pretendido de la composición farmacéutica. Tales agentes podrían ser fármacos que actúan en el sistema gastrointestinal, fármacos que actúan como citostáticos, fármacos que previenen hiperuriquemia, fármacos que inhiben inmunorreacciones (por ejemplo, corticosteroides), fármacos que actúan sobre el sistema circulatorio y/o agentes tales como moléculas coestimuladoras de linfocitos T o citocinas conocidas en la técnica.

Posibles indicios para la administración de la composición o composiciones de la invención son enfermedades tumorales, especialmente cánceres epiteliales/carcinomas tales como cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel (melanoma), cáncer del tracto genito-urinario, por ejemplo, cáncer ovárico, cáncer del endometrio, cáncer del cuello uterino y cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer del intestino delgado, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de vesícula biliar, cáncer del conducto biliar, cáncer de esófago, cáncer de las glándulas salivares y cáncer de la glándula tiroides u otras enfermedades tumorales tales como tumores hematológicos, gliomas, sarcomas y osteosarcomas. La administración de la composición o composiciones de la invención es especialmente aconsejable para enfermedad residual mínima, preferentemente tumores sólidos tempranos, tumores sólidos avanzados o tumores sólidos metastásicos, que se caracterizan por la reaparición local y no local del tumor causado por la supervivencia de células sencillas.

La invención prevé adicionalmente los protocolos de co-administración con otros compuestos, por ejemplo, moléculas capaces de proporcionar una señal de activación para células efectoras inmunes, para proliferación celular o para estimulación celular. Dicha molécula puede ser, por ejemplo, una señal de activación primaria adicional para linfocitos T (por ejemplo, una molécula coestimuladora adicional: moléculas de la familia B7, Ox40L,

4.1 BBL) o una citocina adicional: interleucina (por ejemplo IL-2) o compuesto de unión a NFG-2D.

La composición de la invención como se ha descrito anteriormente, también puede ser una composición de diagnóstico que comprende adicionalmente, opcionalmente, medios y procedimientos para la detención.

Las construcciones específicas de CD3 proporcionadas en el presente documento también son adecuadas para su uso en inmunoensayos en los que pueden utilizarse en fase líquida o unidas a un vehículo de fase sólida. Los ejemplos de inmunoensayos que pueden utilizar el polipéptido de la invención son inmunoensayos competitivos y no competitivos en formato directo o indirecto. Los ejemplos de tales inmunoensayos son el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA), inmunoensayo de enzima (EIA), radioinmunoensayo (RIA), el ensayo de tipo sándwich (ensayo inmunométrico) y la transferencia de Western.

Las construcciones de unión específica a CD3 de la invención pueden unirse a muchos vehículos diferentes y usarse para aislar células unidas específicamente a dichos polipéptidos. Los ejemplos de vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, policarbonato; dextrina, nailon, amilosas, celulosas naturales y modificadas; poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble o insoluble, por ejemplo como perlas, para los fines de la invención.

Existen muchos marcadores y procedimientos de marcaje diferentes conocidos por los expertos en la materia. Los ejemplos de tipos de marcadores que pueden usarse en la presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes; véase también las realizaciones analizadas anteriormente en el presente documento.

En una realización más preferida de la presente invención, se prevé el uso de una molécula de unión específica a CD3, de un vector o de un huésped de la invención para la preparación de una composición farmacéutica. Dicha composición farmacéutica puede emplearse en la prevención, tratamiento o alivio de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad inflamatoria, un trastorno inmunológico, una enfermedad autoinmune, una enfermedad infecciosa, una enfermedad viral, reacciones alérgicas, reacciones parasitarias, enfermedades de injerto contra huésped o enfermedades de huésped contra injerto.

Además, las construcciones desinmunizadas que comprenden los dominios de unión a CD19 y CD3, preferentemente SEC ID Nº: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407 o 409, pueden usarse para el tratamiento de trastornos inmunológicos (diversos tumores malignos de linfocitos B) o enfermedades autoinmunes, las construcciones desinmunizadas que comprenden dominios de unión a CCR5 y CD3, preferentemente SEC ID Nº: 206, 208, 210, 212, 214 o 216 pueden usarse para el tratamiento de enfermedades virales (VIH), enfermedades autoinmunes y/o enfermedades inflamatorias (como artritis reumatoide), las construcciones desinmunizadas que comprenden los dominios de unión a CD20 y CD3, preferentemente SEC ID Nº: 218, 220, 222, 224, 226, 228, pueden usarse para el tratamiento de enfermedades tumorales, preferentemente linfoma, más preferentemente linfoma de linfocitos B no Hodgkin y las construcciones desinmunizadas que comprenden dominios de unión a EpCAM y CD3, preferentemente SEC ID Nº: 31, 33, 35, 37, 39, 49, 55, 58, 61, 63, 65, 67, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291; 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323 o 325 pueden usarse para el tratamiento de enfermedades tumorales, preferentemente cánceres epiteliales.

También se describen en el presente documento un procedimiento para la prevención, tratamiento o alivio de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad inflamatoria, un trastorno inmunológico, una enfermedad autoinmune, una enfermedad infecciosa, enfermedad viral, reacciones alérgicas, reacciones parasitarias, enfermedades de injerto contra huésped o enfermedades de huésped contra injerto que comprende la administración de una molécula de unión específica a CD3 (biespecífica) de la invención o una molécula de unión específica a CD3 (biespecífica) según se produjo por el procedimiento descrito en el presente documento, de una molécula de ácido nucleico, un vector o un huésped de la invención a un sujeto que necesite dicha prevención, tratamiento o alivio. Preferentemente, dicho sujeto es un ser humano.

El procedimiento descrito en el presente documento para la prevención, tratamiento o alivio también puede, además comprender la administración de un compuesto proteínico capaz de proporcionar una señal de activación para células efectoras inmunes. Dicho compuesto proteínico puede administrarse simultáneamente o no simultáneamente con la molécula de unión a CD3, una molécula de ácido nucleico, un vector o un huésped de la invención. El compuesto proteínico puede, entre otros, seleccionarse del grupo que consiste en una molécula coestimulante adicional: moléculas de la familia B7, Ox40L, 4.1 BBL) o una citocina adicional: interleucina (por ejemplo, IL-2) o compuestos de unión a NKG-2D.

Finalmente, la invención proporciona un kit que comprende la molécula de unión específica a CD3 como una molécula de ácido nucleico, un vector o un huésped de la invención.

Dicho kit es particularmente útil en la preparación de la composición farmacéutica de la presente invención y puede, entre otros, consistir en un envase útil para inyecciones o infusiones. Ventajosamente, el kit de la presente invención comprende adicionalmente, opcionalmente un tampón o tampones, soluciones de almacenamiento y/o reactivos o materiales restantes requeridos para la realización de fines médicos o científicos. Además, partes del kit de la invención pueden envasarse individualmente en frascos o botellas o en combinación en envases o unidades multienvase. El kit de la presente invención puede provechosamente usarse, entre otros, para llevar a cabo el procedimiento de la invención y podría emplearse en una diversidad de aplicaciones indicadas en el presente documento, por ejemplo, como herramientas de investigación o herramientas médicas. La fabricación de los kits preferentemente sigue los procedimientos convencionales que se conocen por el experto en la materia.

Éstas y otras realizaciones se desvelan y están abarcadas por la descripción y Ejemplos de la presente invención. Bibliografía adicional referida a uno cualquiera de los anticuerpos, procedimientos, usos y compuestos a emplear de acuerdo con la presente invención pueden recuperarse de bases de datos y bibliotecas públicas, usando por ejemplo, dispositivos electrónicos. Por ejemplo, la base de datos pública “Medline”, disponible en Internet, puede utilizarse, por ejemplo, en http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. El experto en la materia conoce bases de datos y direcciones adicionales, tales como http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research tools.html, http://www.tipr.org/ y pueden obtenerse también usando, por ejemplo, http://www.lycos.com.

Las figuras muestran:

Figura 1. Secuencias de aminoácidos y de ADN del casete anti-CD3 no desinmunizado (SEC ID Nº: 1 y 2).

Figura 2. A) Secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas VH2 (SEC ID Nº: 70), VH3 (SEC ID Nº: 72), VH5 (SEC ID Nº: 74) y VH7 (SEC ID Nº: 76) y las cadenas ligeras VL1 (SEC ID Nº: 78), VL2 (SEC ID Nº: 80) y VL3 (SEC ID Nº: 82), respectivamente, B) Secuencias de nucleótidos de las cadenas pesadas VH2 (SEC ID Nº: 69), VH3 (SEC ID Nº: 71), VH5 (SEC ID Nº: 73) y VH7 (SEC ID Nº: 75) y las cadenas ligeras VL1 (SEC ID Nº: 77), VL2 (SEC ID Nº: 79) y VL3 (SEC ID Nº: 81), respectivamente, C) Secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de las cadenas pesadas de las anti-CD3 no desinmunizadas (SEC ID Nº: 84, 90, 96, respectivamente), VH2 (SEC ID Nº: 86, 94, 96, respectivamente), VH3 (SEC ID Nº: 86, 94, 96, respectivamente), VH5 (SEC ID Nº: 88, 92, 96, respectivamente) y VH7 (SEC ID Nº: 88, 90, 96, respectivamente) y de las cadenas ligeras de las anti-CD3 no desinmunizadas (SEC ID Nº: 98, 102, 104, respectivamente), cadenas VL1 (SEC ID Nº: 100, 102, 104, respectivamente), VL2 (SEC ID Nº: 100, 102, 104, respectivamente) y VL3 (SEC ID Nº: 98, 102, 104, respectivamente) y D) Secuencias de nucleótidos de las CDR 1, 2 y 3 de las cadenas pesadas de las anti-CD3 no desinmunizadas (SEC ID Nº: 83, 89, 95, respectivamente), VH2 (SEC ID Nº: 85, 93, 95,respectivamente), VH3 (SEC ID Nº: 85, 93, 95, respectivamente), VH5 (SEC ID Nº: 87, 91, 95, respectivamente) y VH7 (SEC ID Nº: 87, 89, 95, respectivamente) y de las cadenas ligeras de las anti-CD3 no desinmunizadas (SEC ID Nº: 97, 101, 103, respectivamente), cadenas VL1 (SEC ID Nº: 99, 101, 103, respectivamente), VL2 (SEC ID Nº: 99, 101, 103, respectivamente) y VL3 (SEC ID Nº: 97, 101, 103, respectivamente).

Figura 3. A) Secuencia de nucleótidos de anti-CD3 (VH2/VL1) (SEC ID Nº: 4) B) Secuencia de aminoácidos de anti-CD3 (VH2/VL1) (SEC ID Nº: 5) C) Secuencia de nucleótidos de anti-CD3 (VH2/VL2) (SEC ID Nº: 6) D) Secuencia de aminoácidos de anti-CD3 (VH2/VL2) (SEC ID Nº: 7) E) Secuencia de nucleótidos de anti-CD3 (VH2/VL3) (SEC ID Nº: 8) F) Secuencia de aminoácidos de anti-CD3 (VH2/VL3) (SEC ID Nº: 9).

Figura 4. A) Secuencia de nucleótidos de anti-CD3 (VH3/VL1) (SEC ID Nº: 10) B) Secuencia de aminoácidos de anti-CD3 (VH3/VL1) (SEC ID Nº: 11) C) Secuencia de nucleótidos de anti-CD3 (VH3/VL2) (SEC ID Nº: 12) D) Secuencia de aminoácidos de anti-CD3 (VH3/VL2) (SEC ID Nº: 13) E) Secuencia de nucleótidos de antiCD3 (VH3/VL3) (SEC ID Nº: 14) F) Secuencia de aminoácidos de anti-CD3 (VH3/VL3) (SEC ID Nº: 1).

Figura 5. A) Secuencia de nucleótidos de anti-CD3 (VH5/VL1) (SEC ID Nº: 16) B) Secuencia de aminoácidos de anti-CD3 (VH5/VL1) (SEC ID Nº: 17) C) Secuencia de nucleótidos de anti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 18) D) Secuencia de aminoácidos de anti-CD3 (VH5xVL2) (SEC ID Nº: 1) E) Secuencia de nucleótidos de anti-CD3 (VH5/VL3) (SEC ID Nº: 20) F) Secuencia de aminoácidos de anti-CD3 (VH5/VL3) (SEC ID Nº: 21).

Figura 6. A) Secuencia de nucleótidos de anti-CD3 (VH7/VL1) (SEC ID Nº: 22) B) Secuencia de aminoácidos de anti-CD3 (VH7xVL1) (SEC ID Nº: 23) C) Secuencia de nucleótidos de anti-CD3 (VH7/VL2) (SEC ID Nº: 24) D) Secuencia de aminoácidos de anti-CD3 (VH7xVL2) (SEC ID Nº: 25) E) Secuencia de nucleótidos de antiCD3 (VH7/VL3) (SEC ID Nº: 26) F) Secuencia de aminoácidos de anti-CD3 (VH7/VL3) (SEC ID Nº: 27).

Figura 7. Unión de construcciones anti-CD19 biespecíficas con diferentes partes anti-CD3 desinmunizadas: las anti-CD3 (VH2/VL1) (SEC ID Nº: 178), anti-CD3 (VH2/VL2) (SEC ID Nº: 180), anti-CD3 (VH2/VL3) (SEC ID Nº: 182), anti-CD3 (VH3/VL1) (SEC ID Nº: 184), anti-CD3 (VH3/VL2) (SEC ID Nº: 186), anti-CD3 (VH3/VL3) (SEC ID Nº: 188), anti-CD3 (VH5/VL1) (SEC ID Nº: 190), anti-CD3 (VH5/VK2) (SEC ID Nº: 192), anti-CD3 (VH5/VL3) (SEC ID Nº: 194), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEC ID Nº: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEC ID Nº: 198), anti-CD3 (VH7/VL3) (SEC ID Nº: 200) A) CD3 y B) CD19. La unión se midió mediante un ensayo basado en FACS usando PBMC enriquecidas con CD3 (A) o células NALM positivas para CD19 (B). Se usaron CD3 y un anticuerpo anti-Ig de ratón marcado con FITC secundario como un control negativo en (A) y CD19 y un anticuerpo anti-Ig de ratón marcado con FITC secundario se usaron como un control negativo en (B). Se usaron construcciones anti-CD19xanti-CD3 y anti-EpCAM (M79)xanti-CD3 como controles. IFM indica intensidad de fluorescencia media.

Figura 8. Un patrón de elución representativo de una variante desinmunizada de fracción proteica antiCD19xanti-CD3 de una columna de HCIC a 280 nm. La línea inferior que muestra una etapa principal a 700 ml indica el gradiente teórico del tampón de elución que contiene acetato 20 mM, pH 3,5. La alta adsorción a 280 nm se debió a proteína no unida en el flujo continuo de la columna. La flecha a 810,98 ml indica la fracción antiCD3 desinmunizada eluida.

Figura 9. Un patrón de elución representativo de una variante desinmunizada de fracción proteica antiCD19xanti-CD3 de una columna Quelante de Ni His Trap a 280 nm. La línea inferior que muestra una primera etapa a 85 ml y una segunda etapa principal a 90 ml indica el gradiente teórico del tampón de elución (línea punteada). La flecha a 93,16 ml indica la fracción proteica que contiene la construcción antiCD19 x antiCD3.

Figura 10. Un patrón de elución de proteína representativo de una columna de filtración en gel Sephadex S200. Las fracciones se recogieron de tiempo de retención 0-130 ml. El pico de proteínas a 80,44 ml corresponde a un PM de aproximadamente 52 kD y contiene la construcción antiCD19 x antiCD3 desinmunizada.

Figura 11. A) Análisis de SDS-PAGE de variantes desinmunizadas de fracciones proteicas anti-CD19xantiCD3. Carril M: Marcador de peso molecular; Carril 1: flujo continuo de HCIC; carril 2: sobrenadante de cultivo celular; carril 3: eluato de HCIC; carril 4: flujo continuo de IMAC; carril 5: lavado de IMAC; carril 6: eluato de IMAC; carril 7: eluato de filtración en gel;

B) Análisis de transferencia de Western de variantes desinmunizadas purificadas de fracciones proteicas antiCD19xanti-CD3. El análisis de transferencia de Western de proteína biespecífica purificada se realizó con anticuerpos dirigidos contra el marcador de His (PentaHis, Qiagen) e Ig anti ratón de cabra marcado con fosfatasa alcalina. Carril M: Marcador de peso molecular; Carril 1: flujo continuo de HCIC; carril 2: sobrenadante de cultivo celular; carril 3: eluato de HCIC; carril 4: flujo continuo de IMAC; carril 5: lavado de IMAC; carril 6: eluato de IMAC; carril 7: eluato de filtración en gel.

Figura 12: Unión de las construcciones anti-CD19 biespecíficas purificadas con diferentes partes anti-CD3 desinmunizadas: anti-CD3 (VH5/VL1) (SEC ID Nº: 190), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEC ID Nº: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEC ID Nº: 198) y anti-CD3 (VH7/VL3) (SEC ID Nº: 200) con A) CD3 y B) CD19 en comparación con la construcción de tipo silvestre anti-CD19xanti-CD3. La unión se midió mediante un ensayo basado en FACS usando PBMC enriquecidas con CD3 (A) o células NALM positivas para CD19 (B). Un anticuerpo secundario con células positivas para CD3 se usó como control negativo en (A) y un anticuerpo secundario con células positivas para CD19 se usó como un control negativo en (B). Se usaron construcciones anti-CD19xantiCD3 y anti-EpCAM (M79)xanti-CD3 como controles. El ensayo se llevó a cabo con concentraciones de 1 g/ml y 5 g/ml. IFM indica intensidad de fluorescencia media.

Figura 13. Ensayo citotóxico de construcciones anti-CD19 biespecíficas con diferentes partes anti-CD3 desinmunizadas: anti-CD3 (VH5/VL1) (SEC ID Nº: 190), anti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 192), anti-CD3 (VH5/VL3) (SEC ID Nº: 194), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEC ID Nº: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEC ID Nº: 198) y anti-CD3 (VH7/VK3) (SEC ID Nº: 200) en comparación con el control.

Figura 14. Alineamiento de secuencia de la región variable pesada del anticuerpo de CD3 no desinmunizado, VH5 (SEC ID Nº: 74), VH7 (SEC ID Nº: 76), VH2 (SEC ID Nº: 70) y VH3 (SEC ID Nº: 72). Se han representado la región Flanqueante 1 (FR1), región determinante de complementariedad 1 (CDR1), región Flanqueante 1 (FR1), región determinante de complementariedad 2 (CDR2), región Flanqueante 3 (FR3), región determinante de complementariedad 3 (CDR3) y región Flanqueante 4 (FR4). Se han marcado con cajas la secuencia LAR y VKK en FR1, la secuencia ASGYTF y en la transición de la región flanqueante 1 y la región CDR1 y la secuencia LTTDK, ITTDK y MTTDT en FR3 y la secuencia MQLS, MELS y LQMN en FR3. El alineamiento se llevó a cabo usando el programa AlingnX de Vector NTI Advance (Informax, Inc., Estados Unidos).

Figura 15. Análisis de unión de construcciones anti EpCAM biespecíficas con diferentes partes anti-CD3 desinmunizadas: anti-CD3 (VH5/VL2)x5-10 (SEC ID Nº: 37) (A), anti-CD3 (VH5/VL2)x4-7 desinmunizada (SEC ID Nº: 33), (B) anti-CD3 (VH5/VL2)x3-1 desinmunizada (SEC ID Nº: 31) (C), (VH5/VL2)x4-7 (VL-VH) anti-CD3 desinmunizada (SEC ID Nº: 35) (D) y (VH5/VL2)x5-10 (VL-VH) anti-CD3 desinmunizada (SEC ID Nº: 39) (E) en células Jurkat positivas para CD3 y Kato III positivas para EpCAM con un ensayo basado en FACS. Un desplazamiento hacia la derecha muestra unión. En células Jurkat la línea punteada indica el desplazamiento del control negativo (solamente anticuerpo secundario), la línea discontinua muestra la unión de un anticuerpo control anti-EpCAM-anti-CD3, la línea en negrita muestra la construcción biespecífica de interés. En el ensayo de unión que usa células Kato III positivas para EpCAM en lugar de anticuerpo monoclonal para CD3 se usó un anticuerpo monoclonal para EpCAM como un control positivo.

Figura 16. Análisis de unión de construcciones anti-EpCAM biespecíficas con diferentes partes anti-CD3 desinmunizadas: 3-1xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 49) (A) y 5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 63) (B) en células Jurkat positivas para CD3 y en células Kato positivas para EpCAM con un ensayo basado en FACS. Un desplazamiento hacia la derecha muestra unión.

Figura 17. Ensayo de citotoxicidad de construcciones de EpCAM con partes anti-CD3 desinmunizadas (di antiCD3) en posición N-terminal anti-CD3 (VH5/VL2)x3-1 (SEC ID Nº: 31) anti-CD3 (VH5/VL2)x-5-10 (SEC ID Nº: 37) y anti-CD3 (VH5/VL2)x4-7 (SEC ID Nº: 33) en comparación con las construcciones no desinmunizadas correspondientes. Se usaron clones de linfocitos T CB15 y células CHO-EpCAM en una relación E:T de 5:1. Se tiñeron las células CHO-EpCAM con colorante PKH26 y se contaron las células después de incubación de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico con análisis de FACS.

Figura 18. Ensayo de citotoxicidad de construcciones de EpCAM con partes anti-CD3 desinmunizadas en la posición C-terminal 3-1xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº. 49) y 5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº. 63) en comparación con las construcciones de tipo silvestre no desinmunizadas correspondientes. El ensayo de citotoxicidad se llevó a cabo de forma idéntica a la Figura 17.

Los siguientes Ejemplos ilustran la invención:

En los siguientes ejemplos se han obtenido por ingeniería genética varios anticuerpos anti-CD3 humano de cadena sencilla para mostrar inmunogenicidad reducida en el hombre. Los diferentes anticuerpos anti-CD3 humano desinmunizados comprenden 12 combinaciones de 4 regiones VH diferentes VH (VH2 (SEC ID Nº: 69, 70), VH3 (SEC ID Nº: 71, 72), VH5 (SEC ID Nº: 73, 74) y VH7 (SEC ID Nº: 75, 76)) y 3 regiones VL diferentes (VL1 (SEC ID Nº: 77, 78), VL2 (SEC ID Nº: 79, 80) y VL3 (SEC ID Nº: 81, 82)) unidas entre sí. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de las regiones VH y VL anteriormente mencionadas se muestran en las Figuras 3-6. De forma ilustrativa, los anticuerpos de cadena sencilla anti-CD3 desinmunizados se combinaron con un anticuerpo de cadena sencilla anti-CD19 o con un anticuerpo de cadena sencilla anti-EpCAM para formar un producto biespecífico.

Ejemplo 1. Clonación y expresión de construcciones anti-CD3 desinmunizadas

1.1. Transferencia de ADNc que codifica anticuerpo de cadena sencilla

El ADN que codifica el anticuerpo de cadena sencilla anti-CD3, que se desinmunizó, se denomina en el presente documento casete anti-CD3. Este casete anti-CD3 consiste en un engarce SGGGGS (SEC ID Nº: 176), la región VH anti-CD3 (SEC ID Nº. 110), un engarce GS de 14 aminoácidos (engarce VEGGSGGSGGSGGSGGVD (SEC ID Nº: 68)), y la región de cadenas VL anti-CD3 (SEC ID Nº: 112) seguido de 6 restos de histidina. El ADN anteriormente mencionado se clonó en el vector p-PCR-Script-Amp SK(+) (Stratagene) en el sitio Srf1. El ADN y la secuencia de aminoácidos del casete anti-CD3 se muestra en SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2 y la Figura 1.

1.2. Análisis informático de secuencias para epítopos de linfocitos T inmunogénicos y diseño de secuencias de anticuerpos de cadena sencilla desinmunizados

La secuencia de aminoácidos del casete anti-CD3 (SEC ID Nº: 2) se analizó mediante un programa de alineamiento estructural de péptidos para identificar epítopos de linfocitos T potenciales con el procedimiento como se describe en el documento WO 98/52976. SEC ID Nº: 3 muestra la secuencia engarce desinmunizada y SEC ID Nº: 68 la secuencia engarce original.

1.3. Construcción de secuencias de anticuerpo de cadena sencilla desinmunizadas

Las versiones desinmunizadas del casete anti-CD3 se construyeron por el procedimiento de recombinación por PCR

5 solapante. El casete anti-CD3 (SEC ID Nº: 1, 2) en pPCR-S-Amp SK+ se usó como el molde para la mutagénesis a las secuencias desinmunizadas requeridas. Se sintetizaron conjuntos de pares de cebadores mutagénicos que abarcaban las regiones a alterar. Las secuencias desinmunizadas producidas, que incluyen 4 regiones VH diferentes y 3 regiones VL diferentes, se clonaron como fragmentos de Not1 a Hind111 en el vector pPCR-S-Amp SK+ y se confirmó que la secuencia completa de ADN era correcta. Las 4 regiones diferentes VH y 3 regiones diferentes VK

10 se unieron en todas las combinaciones (un total de 12), por PCR o usando un sitio de BstE11 único introducido en el extremo 3’ de la región VH. Se confirmó que la secuencia de ADN completa de cada combinación era correcta. Las diferentes regiones VH (SEC ID Nº: 70, 72, 74 y 76) y regiones VL (SEC ID Nº: 78, 80 y 82) desinmunizadas con las secuencias no desinmunizadas originales correspondientes (VH: SEC ID Nº: 110; VL: SEC ID Nº: 112) de las construcciones anti-CD3 se resumen en la Tabla 9.

15 Tabla 9: SEC ID Nº: de regiones VH y VL desinmunizadas

SEC ID Nº:: SEC ID Nº: CDR1 SEC ID Nº: CDR2 SEC ID Nº: CDR3

Ácido: Amino- Ácido Amino- Ácido Amino- Ácido Amino-

Nucleico: ácido Nucleico ácido Nucleico ácido Nucleico ácido

VH2 desinmunizada: 69 70 85 86 93 94 95 96

VH3 desinmunizada: 71 72 85 86 93 94 95 96

VH5 desinmunizada: 73 74 87 88 91 92 95 96

VH7 desinmunizada: 75 76 87 88 89 90 95 96

VH del CD3 no desinmunizado: 110 83 84 89 90 95 96

VH del CD3 no: 105 106 83 84 89 90 107 108

desinmunizado

con Mutación

Cys→Ser

(continuación)

SEC ID Nº:: SEC ID Nº: CDR1 SEC ID Nº: CDR2 SEC ID Nº: CDR3

Ácido Nucleico: Aminoácido Ácido Nucleico Aminoácido Ácido Nucleico Aminoácido Ácido Nucleico Aminoácido

VL1 desinmunizada: 77 78 99 100 101 102 103 104

VL2 desinmunizada: 79 80 99 100 101 102 103 104

VL3 desinmunizada: 81 82 97 98 101 102 103 104

VL del CD3 no desinmunizado: 111 112 97 98 101 102 103 104

1.4. Transferencia de genes de anticuerpos de cadena sencilla desinmunizados al vector de expresión

Los casetes anti-CD3 desinmunizados se escindieron de pPCR-S-Amp-SK+ con BspE1 y Sal1 y se clonaron en el 5 vector de expresión pEF que comprende VLCD19-VHCD19-VHCD3-VLCD3. La parte CD3 del vector pEF-DHFR se reemplazó con cada uno de los casetes anti-CD3 desinmunizados del sitio BspE1 al sitio Sal1 dando como resultado las siguientes 12 construcciones: pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH2/VL1) (SEC ID Nº: 177, 178) pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH2/VL2) (SEC ID Nº: 179, 180) 10 pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH2/VL3) (SEC ID Nº: 181, 182) pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH3/VL1) (SEC ID Nº: 183, 184) pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH3/VL2) (SEC ID Nº: 185, 186) pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH3/VL3) (SEC ID Nº: 187, 188) pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH5/VL1) (SEC ID Nº: 189, 190) 15 pEF anti-CD19kanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 191, 192) pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH5/VL3) (SEC ID Nº: 193, 194) pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH7/VL1) (SEC ID Nº: 195, 196) pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH7/VL1) (SEC ID Nº: 197, 198) pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH7NL3) (SEC ID Nº: 199, 200). 20 Las construcciones comprenden adicionalmente un líder de cadena pesada de IgG murino para permitir la secreción de la proteína. Las secuencias de ADN de los casetes anti-CD3 desinmunizados en el vector de expresión se confirmaron usando los cebadores de secuenciación (SEC ID Nº: 28 y 29). Las secuencias de aminoácidos y ADN de los 12 casetes anti-CD3 desinmunizados en el vector pEF del sitio BspE1 al sitio Sal1 se muestran en SEC ID Nº: 177-200.

25 1.5. Producción de construcciones de anticuerpos

Después de la transformación del vector en K12 de E. coli, se prepararon ADN de uso en transfección de los diferentes vectores de expresión. Se produjeron proteínas secretadas en células CHO-dhfr. Para la producción transitoria los sobrenadantes de cultivo celular se recogieron 2 días después de la transfección, para la generación de células transfectadas estables, se pusieron las células en medio de selección dos días después de la 30 transfección. Después de cinco pases, se obtuvieron grupos estables. Posteriormente, se identificaron clones sencillos en diluciones limitantes. Para facilitar el procedimiento de purificación, las células se adaptaron a medio sin suero. Se purificaron construcciones de anticuerpos de aproximadamente 1 litro de sobrenadante.

Los niveles de producción se ensayaron en ELISA. No se observaron diferencias importantes en los niveles de anticuerpo secretado entre las diferentes construcciones que comprenden construcciones anti-CD19 y anti-CD3 desinmunizadas.

Ejemplo 2: Ensayos de Unión

Para analizar la eficacia de unión de las construcciones desinmunizadas a CD3 y CD19 se realizó un ensayo basado en FACS. Inicialmente, se ensayaron sobrenadantes en bruto con respecto a unión en PBMC enriquecidas con CD3

o células NALM-6 positivas para CD19. Se incubaron las células con sobrenadantes no diluidos durante 30 minutos a 8ºC. Tras dos etapas de lavado las células se marcaron con un anticuerpo anti-His (Qiagen) en las mismas condiciones. Después de etapas de lavado adicional se detectó unión de las construcciones con un anticuerpo antiratón de oveja conjugado con FITC (Sigma). Las células se analizaron con un citómetro FACS Caliber (B&D). Como controles se incluyeron sobrenadantes de células transfectadas con GFP y anti-CD19xanti-CD3. Se usó CD3 y un anticuerpo secundario como un control negativo y mostró una intensidad de fluorescencia media (IFM) de aproximadamente 3,5. Las construcciones anti-CD19xanti-CD3 que comprende anti-CD3 (VH5/VL1) (SEC ID Nº: 190), anti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 192), anti-CD3 (VH5/VL3) (SEC ID Nº: 194), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEC ID Nº: 196), anti-CD3 (VH7NL2) (SEC ID Nº: 198) y anti-CD3 (VH7/VL3) (SEC ID Nº: 200) tuvieron una IFM de al menos 90, uniéndose de este modo de una manera aproximadamente 25 veces más fuerte. El control positivo, que fue una construcción anti-CD19xanti-CD3 no desinmunizada alcanzó una IFM de aproximadamente 60 mostrando que las construcciones desinmunizadas que comprenden anti-CD3 (VH5/VL1) (SEC ID Nº: 190), anti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 192), anti-CD3 (VH5/VL3) (SEC ID Nº: 194), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEC ID Nº: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEC ID Nº: 198) y anti-CD3 (VH7/VL3) (SEC ID Nº: 200) se unían a CD3 con eficacia extremadamente alta. En un segundo experimento, las siguientes construcciones que comprenden anti-CD19 y anti-CD3: anti-CD3 (VH2/VL1) (SEC ID Nº: 178), anti-CD3 (VH2NL2) (SEC ID Nº: 180), anti-CD3 (VH2/VL3) (SEC ID Nº: 182, anti-CD3 (VH3/VL1) (SEC ID Nº: 184), anti-CD3 (VH3NL2) (SEC ID Nº: 186) y anti-CD3 (VH3NL3) (SEC ID Nº: 188), mostraron una unión similar a la del control negativo (IFM de aproximadamente 6).

El ensayo de unión basado en FACS también se llevó a cabo para CD19. En este experimento CD19 y un anticuerpo secundario fueron un control negativo. En este experimento, todas las construcciones ensayadas alcanzaron una IFM de al menos 80 mientras que la IFM del control negativo fue de aproximadamente 3.

De este modo, las construcciones que comprenden anti-CD3 (VH5/VL1) (SEC ID Nº: 190), anti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 192), anti-CD3 (VH5/VL3) (SEC ID Nº: 194), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEC ID Nº: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEC ID Nº: 198) y anti-CD3 (VH7NL3) (SEC ID Nº: 200) resultaron unirse a CD3 y CD19 tan bien como la anti-CD19xantiCD3 no modificada (SEC ID Nº: 204). Sin embargo, las construcciones anti-CD3 (VH2/VL1) (SEC ID Nº: 178), antiCD3 (VH2NL2) (SEC ID Nº: 180), anti-CD3 (VH2NL3) (SEC ID Nº: 182), anti-CD3 (VH3/VL1) (SEC ID Nº: 184), antiCD3 (VH3NL2) SEC ID Nº: 186), anti-CD3 (VH3NL3) (SEC ID Nº: 188) habían perdido completamente su capacidad de unión anti-CD3, mientras que la unión a CD19 se conservaba completamente (Figura 7).

De este modo, se demostró que las cadenas pesadas desinmunizadas dominaban la especificidad y fuerza de unión. Como resultado, las construcciones anti-CD3 con grupos VH5 y VH7 se purificaron y analizaron con respecto a actividad citotóxica.

Ejemplo 3: Expresión y purificación de las variantes que muestran alta afinidad de unión

Las proteínas anti-CD19xanti-CD3 desinmunizadas anti-CD3 (VH5/VL1) (SEC ID Nº: 190), anti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 192), anti-CD3 (VH5/VL3) (SEC ID Nº: 194), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEC ID Nº: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEC ID Nº:1 98) y anti-CD3 (VH7/VL3) (SEC ID Nº: 200) se expresaron en células de ovario de hámster chino (CHO),

Para purificar las construcciones de cadena sencilla biespecíficas que comprenden una parte anti-CD3 desinmunizada se cultivaron células CHO-CD19 en frascos rotativos con medio DMEM modificado para CHO HiClone (HiQ) durante 7 días antes de la recolección. Las células se retiraron por centrifugación y el sobrenadante, que contenía la proteína expresada, se almacenó a -20ºC.

Se usaron Äkta FPLC System (Pharmacia) y Unicorn Software para cromatografía. Todos los componentes químicos fueron de uso en investigación y se obtuvieron de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).

Se realizó cromatografía de inducción de carga hidrófoba en medio MEP Hypercel cargado en una columna XK 16/60 (Pharmacia) que se equilibró con tampón A1 (Tris 20 mM pH 7,2). Se aplicaron 500 ml de sobrenadante de cultivo celular a la columna (10 ml) con un caudal de 3 ml/min. Se retiró por lavado la muestra no unida con el tampón A1 y se eluyó la proteína unida con tampón B1 al 100% (acetato 20 mM pH 3,5). Se agruparon las fracciones de proteína eluidas para purificación adicional.

Se realizó IMAC, usando una columna HisTrap (Pharmacia) que se cargó con NiSO4 de acuerdo con el protocolo del fabricante. La columna se equilibró con tampón A2 (NaP 20 mM pH 7,5, NaCl 0,4 M) y la muestra se diluyó 2:1 con tampón A2 para obtener un pH de 7. La muestra se aplicó a la columna (2 ml) con un caudal de 1 ml/min y la columna se lavó con tampón A2 para retirar la muestra no unida. La proteína unida se eluyó usando un gradiente de 2 etapas de tampón B2 (NaP 20 mM pH 7,5, NaCl 0,4 M, Imidazol 0,5 M) Etapa 1: tampón B2 al 20% en 10 volúmenes de columna; Etapa 2: tampón B2 al 100% en 10 volúmenes de columna. Las fracciones de proteína eluida se agruparon para purificación adicional.

Se realizó una cromatografía de filtración en gel en una columna Sephadex S200 HiPrep (Pharmacia) equilibrada con PBS (Gibco). Se sometieron las muestras proteicas eluidas (caudal 1 ml/min) a SDS-Page y transferencia de Western para detección (Figura 11). La columna se calibró previamente para la determinación del peso molecular (kit de marcador de peso molecular, Sigma MW GF-200).

5 Las variantes desinmunizadas de proteína anti-CD19xanti-CD3 se aislaron en un procedimiento de purificación de tres etapas que incluía cromatografía de inducción de carga hidrófoba (HCIC) (Figura 8), cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) (Figura 9) y filtración en gel (Figura 10). La construcción biespecífica tuvo un peso molecular de 52 kDa en condiciones nativas según se determinó por filtración en gel en PBS.

La proteína biespecífica purificada se analizó con SDS-PAGE en condiciones reductoras usando geles Bis Tris al 4

10 12% prefabricados (Invitrogen). La preparación y aplicación de muestras fue de acuerdo con el protocolo del fabricante. El peso molecular se determinó con un patrón de proteínas MultiMark (Invitrogen). El gel se tiñó con Coomasie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada fue >95% (Figura 11 a) y la molécula tiene un tamaño de 52 kD.

Además, las variantes desinmunizadas de proteína anti-CD19xanti-CD3 se detectaron específicamente mediante

15 transferencia de Western. La transferencia de Western se analizó con una membrana Optitran BA-S83 y el Blot Module de Invitrogen de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los anticuerpos usados fueron Penta His (Quiagen) e Ig anti-Ratón de Cabra marcado con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma), la solución de tinción fue líquido BCIP/NBT (Sigma). Se mostró que la señal principal correspondía a la banda principal en el SDS-PAGE a 52 kD (Figura 11 b).

20 Se determinaron concentraciones de proteína usando colorante de ensayo de proteínas (MicroBCA, Pierce) e IgG (Biorad) como proteína patrón. Se proporciona un sumario de las producciones finales de variantes proteicas purificadas en la Tabla 10 que muestra la alta productividad de todas las construcciones y muy buen rendimiento de la construcción con anti-CD3 (VH5/VL1) (SEC ID Nº: 190) de 924.8 g.

Tabla 10: Rendimientos proteicos de las construcciones anti-CD19-anti-CD3 desinmunizadas

Construcción de CD3 desinmunizada: Rendimiento [g/sobrenadante]

CD19xanti CD3 (VH5/ VL1) (SEC ID Nº: 190): 924,8

CD19xanti CD3 (VH5/ VL2) (SEC ID Nº: 192): 446,7

CD19xanti CD3 (VH5/ VL3) (SEC ID Nº: 194): 218,4

CD19xanti CD3 (VH7/ VL1) (SEC ID Nº: 196): 268,5

CD19xanti CD3 (VH7/VL2) (SEC ID Nº: 198): 553,4

CD19xanti CD3 (VH7/VL3) (SEC ID Nº: 200): 477,3

La productividad de las construcciones CD19xanti-CD3 (VH5/ VL2) y CD19xanti-CD3 (VH7/VL2) se comparó con las construcciones no desinmunizadas correspondientes. Los resultados se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11. Rendimientos de la construcción biespecífica desinmunizada en comparación con la construcción no desinmunizada correspondiente

Construcción: Rendimiento (g/l)

CD19xanti-CD3: 62

CD19xantiCD3 (VH5NL2): 204

CD19xantiCD3 (VH7/VL2): 310

La Tabla 11 claramente demuestra que las construcciones biespecíficas que comprenden dominio de unión a CD3 5 desinmunizado tienen una productividad mucho mayor (al menos tres veces) que la construcción no desinmunizada correspondiente.

Ejemplo 4. Ensayos de unión basados en FACS de las construcciones anti-CD3

La unión de construcciones de anticuerpo purificadas seleccionadas que comprenden anti-CD19 y anti-CD3 se detectó como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2 a diversas concentraciones. En el ensayo de unión a 10 CD3, el anticuerpo secundario de control negativo (anti-His, conjugado con FITC), que se incubó con células positivas para CD3, mostró una IFM de aproximadamente 2,5 y el anticuerpo de cadena sencilla biespecífico antiCD19xanti-CD3 desinmunizado de control positivo de aproximadamente 70 a una concentración de 1 g/ml y 50 a una concentración de 5 g/ml (Figura 12A). A la concentración de 1 g/ml, los anticuerpos biespecíficos desinmunizados anti-CD3 (VH5/VL1) (SEC ID Nº: 190), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEC ID Nº: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) 15 (SEC ID Nº: 198) y anti-CD3 (VH7/VL3) (SEC ID Nº: 200) mostraron valores de IFM de 10-20; teniendo anti-CD3 (VH5/VL1) (SEC ID Nº: 190) la mayor (20). A 5 g/ml anti-CD3 (VH7/VL2) (SEC ID Nº: 198) alcanzó una IFM de 25, mientras anti-CD3 (VH7/VL1) (SEC ID Nº: 196), anti-CD3 (VH7/VL3) (SEC ID Nº: 200) y anti-CD3 (VH5/VL1) (SEC ID Nº: 190) tuvieron una IFM de al menos 40 mostrando de este modo la misma eficacia de unión que el control positivo no desinmunizado. A una concentración de 5 g/ml, las construcciones de unión fuerte con parte anti-CD3

20 desinmunizada VH5/VL1 (SEC ID Nº: 190), VH7/VL1 (SEC ID Nº: 196), VH7/VL2 (SEC ID Nº: 198), VH7/VL3 (SEC ID Nº:200) se unieron a CD3 así como el anti-CD19xanti-CD3 (SEC ID Nº: 204).

Todas las construcciones de anticuerpo se unieron a CD19 con una alta eficacia, que fue a aproximadamente IFM de 200, mientras que la construcción no desinmunizada anti-CD19xanti-CD3 (SEC ID Nº: 204) mostró IFM de 80. No se observaron diferencias para unión con CD19 a las concentraciones ensayadas para las diferentes construcciones

25 (Figura 12B).

Ejemplo 5: Ensayos de Citotoxicidad

Anti-CD19xanti-CD3 media la citotoxicidad dependiente de linfocitos T para células diana positivas para CD19. Eso se analizó in vitro para la determinación de la potencia biológica de anti-CD19xanti-CD3.

Para este fin se incubaron células diana NALM-6 positivas para CD19 marcadas con fluorescencia con PBMC

30 aisladas de donantes aleatorios o linfocitos T CB15 (línea de linfocitos T normalizada) como células efectoras en presencia de anti-CD19xanti-CD3. Después de incubación durante 4 h a 37ºC en un incubador humidificado, la liberación del colorante fluorescente de las células diana al sobrenadante se determinó en un espectrofluorímetro. Las células diana incubadas sin anti-CD19xanti-CD3 y células diana lisadas totalmente por la adición de saponina al final de la incubación sirvieron como controles negativo y positivo, respectivamente. La citotoxicidad específica

35 medida a una cierta concentración de anti-CD19xanti-CD3 puede calcularse con la siguiente fórmula:

RFU(Muestra) -RFUMedia (control)

Citotoxicidad específica [%] = x 100 RFUMedia(lisis total)-RFUMedia(control)

La respuesta a dosis se analizó de anti-CD19xanti-CD3 0,4 pg/ml a anti-CD19xanti-CD3 100 ng/ml para especificar el valor de CE50. Aunque el valor de CE50 describe la potencia biológica de anti-CD19xanti-CD3, el valor absoluto variará significativamente dependiendo de la fuente de las células efectoras. De este modo una potencia relativa se

40 calcula en comparación con un material de referencia anti-CD19xanti-CD3 basándose en la siguiente fórmula:

CE50 de la Muestra

Potencia Relativa = CE50 de Referencia

Las actividades citotóxicas de las construcciones que comprenden anti-CD19 y anti-CD3 desinmunizada se muestran en la Figura 13. Se usó anti-CD19xanti-CD3 desinmunizada purificada como control. Los valores de CE50 de las construcciones desinmunizadas estuvieron en un intervalo de 21,9-81,6 pg/ml mientras que el valor de CE50 de la construcción anti-CD19xanti-CD3 no desinmunizada fue de 22,7 pg/ml. De este modo, todas las construcciones desinmunizadas revelaron valores de CE 50 comparables a la molécula no desinmunizada.

Ejemplo 6. Ensayo de proliferación de linfocitos T

Se seleccionaron veinte donantes sanos para exploración en ensayos de linfocitos T basándose en tipificación de HLA-DR (Tabla 12). Esto permite la exploración de péptidos en el ensayo de linfocitos T contra más del 80% de alelos de DR expresados en la población mundial.

Tabla 12: Haplotipos de HLA DR de 20 donantes sanos usados para ensayar la inmunogenicidad de péptidos obtenidos de scAb anti-CD3 desinmunizados y no desinmunizados.

Alotipo de HLA DR

1: DRB1*07, DRB1*15, DRB4*01, DRB5

2: DRB1*03, DRB1*04, DRB3, DRB4*01

3: DRB1*04, DRB1*07 y DRB4*01

4: DRB1*07, DRB1*11, DRB4*01

5: DRB1*04, DRB1*07, DRB4*01

6: DRB1*01, DRB1*04, DRB4*01

7: DRB1*03, DRB1*07, DRB3, DRB4*01

8: DRB1*07, DRB1*11, DRB3, DRB4*01

9: DRB1*12. DRB1*15, DRB3, DRB5

10: DRB1*01, DRB1*09, DRB4*01

11: DRB1*03, DRB1*15, DRB3, DRB5

12: DRB1*10, DRB1*13, DRB3

13: DRB1*03, DRB1*15, DRB3, DRB5

14: DRB1*04, DRb1*15, DRB4*01, DRB5

15: DRB1*04, DRB1*13, DRB3, DRB4*01

16: DRB1*01, DRB1*13, DRB3

17: DRB1*01, DRB1*04, DRB4*01

18: DRB1*07, DRB1*13, DRB3, DRB4*01

19: DRB1*07, DRB1*16, DRB4*01, DRB5

20: DRB1*04, DRB1*15, DRB4*01, DRB5

10 6.1. Ensayo de Proliferación de Linfocitos T

Se obtuvieron péptidos de Pepscan (Países Bajos) a una pureza de más del 90%. Se usaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de los 20 donantes sanos seleccionados (Tabla 12) para explorar péptidos individuales en pocillos triplicados a 1 y 5 M. Se incluyeron dos péptidos control positivos (C32 y C49) y hemocianina de lapa californiana (KLH) en el ensayo. Después de 7 días de incubación de células y péptidos, se usó un pulso de 18

15 horas con 3H-timidina a 1 Ci/pocillo para evaluar la proliferación de linfocitos T. Estos datos se expresan como índice de estimulación en el que:

Índice de estimulación = CPM de péptido de ensayo / CPM de control no tratado

Un epítopo de linfocito T se define como un péptido que proporciona un índice de estimulación (SI) mayor de 2. Los resultados de dos ejecuciones independientes indicaron que 5 de los 22 péptidos de unión al MHC en la secuencia anti-CD3 no desinmunizada tenían la capacidad de inducir proliferación de linfocitos T humanos (SI>2). Por el contrario, ninguna de las moléculas desinmunizadas correspondientes indujo proliferación de linfocitos T. La Tabla 13 resume los resultados del ensayo de proliferación de linfocitos T que muestra los valores de SI Medios de 2

5 ejecuciones independientes.

Los datos también mostraron un efecto dependiente de la concentración por el que cada una de las moléculas de unión no desinmunizadas mostraron SI > 3 en solamente una de las dos concentraciones (1m o 5 m) usadas. La diferencia en respuesta a diferentes concentraciones se explica por el hecho de que los péptidos individuales tendrán concentraciones óptimas a las que indujeron proliferación de linfocitos T. Si esta concentración se excede, 10 entonces la proliferación puede reducirse (las altas concentraciones de péptidos pueden tener un efecto inhibidor en la proliferación de linfocitos T). Esto explica por qué, en algunos casos, la proliferación se ve a la menor concentración y no a la mayor. A partir de la experiencia, se observará proliferación de linfocitos T en una o dos de las concentraciones de péptidos usadas si un péptido contiene un epítopo de linfocitos T. Estos datos demostraron que la desinmunización había retirado de forma exitosa los epítopos de linfocitos T de anti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID

15 Nº: 19) y anti-CD3 (VH7/VL2) (SEC ID Nº: 25). El hecho de que aproximadamente el 75% de los péptidos de unión al MHC de la secuencia anti-CD3 no desinmunizada no indujeron proliferación de linfocitos T puede explicarse por tolerancia del sistema inmune humano a estos péptidos o una incapacidad del repertorio de linfocitos T humanos para reconocer estos péptidos particulares.

Tabla 13: Sumario de datos que comparan péptidos de ratón positivos (SI>2) y péptidos desinmunizados 20 correspondientes.

Anti-CD3 Nodesinmunizada: Anti-CD3 desinmunizada

Péptido: Alotipo Concentración SI Medio SI Medio

Región: (M)

6-20: 5 5 2,51 0,77

74-86: 5 1 2,52 0,97

0,96

90-102: 5 5 2,21 0,56

1,38

90-102: 6 5 2,24 0,90

0,82

90-102: 11 5 2,23 0,83

0,78

162-174: 5 1 3,82 0,59

216-230: 10 1 2,12 1,03

Ejemplo 7. Alineamiento de homología de anti-CD3 (VH5), anti-CD3 (VH7), anti-CD3 (VH2) y anti-CD3 (VH3) con la VH anti-CD3 no desinmunizada

La región pesada variable del anticuerpo de CD3 no desinmunizado VH5 (SEC ID Nº: 74), VH7 (SEC ID Nº: 76),

25 VH2 (SEC ID Nº: 70) y VH3 (SEC ID Nº: 72) se alineó usando el programa AlingnX de Vector NTI Advance (Informax, Inc., Estados Unidos). El algoritmo Clustal W usado se describe en Nucleic Acid Research, 22 (22): 46734860, 1994. El alineamiento se muestra en la Figura 14. A partir del alineamiento se puede ver que las regiones variables VH5 y VH7, que muestran una unión sorprendentemente buena tienen la secuencia ASGYTF en la región de transición de la flanqueante 1 a CDR1. Además, las regiones VH que no muestran unión (VH2 (SEC ID Nº: 70) y

30 VH3 (SEC ID Nº: 72)) comprenden la secuencia ASGYTA en la transición de flanqueante 1 a CDR1. De este modo, para obtener una construcción que tiene una propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T y unión a CD3, la construcción tiene que comprender la secuencia ASGYTF en la transición de flanqueante 1 a CDR1. Sorprendentemente, las regiones pesadas variables que se unen a CD3 y que muestran propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T que comprenden la secuencia anteriormente mencionada ASGYTF muestran una buena unión.

Ejemplo 8. Clonación de construcciones que comprenden anti-CD3 y anti-EpCAM desinmunizadas

Para demostrar que el polipéptido anti-CD3 desinmunizado de la invención puede ser una parte de una construcción funcional con otras dianas, se generaron varias construcciones biespecíficas que comprenden anticuerpos de cadena sencilla desinmunizados anti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 19) y anti-EpCAM diferentes (3-1 (SEC ID Nº: 137, 139), 3-5 (SEC ID Nº: 141, 143), 4-1 (SEC ID Nº: 145, 147), 4-7 (SEC ID Nº: 149, 151), 5-10 (SEC ID Nº: 133, 135)).

8.1. Clonación de elementos de unión a EpCAM C-terminal que comprenden parte anti-CD3 desinmunizada (SEC ID Nº: 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 y 39) 8.1.1 Amplificación de la anti-CD3 desinmunizada de la construcción anti-CD19xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 192)

La anti-CD3(VH5/VL2) desinmunizada N-terminal se obtuvo por PCR usando la (CD19 x anti-CD3 (VH5/VL2) desinmunizada (SEC ID Nº: 192) como patrón y los siguientes cebadores (DI CD3 5-2 VH BsrGI AGGTGTACACTCCGACGTCCAACTGGTGCAGTCAG (SEC ID Nº: 40), DI CD3 5-2 VL BspEI AATCCGGATTTGATCTCCACCTTGGTCCCG (SEC ID Nº: 41).

8.1.2. Clonación y expresión de las construcciones desinmunizadas anti-CD3xanti-EpCAM desinmunizado en orientación VHCD3-VLCD3 x VHEpCAM-VLEpCAM

El producto de PCR anteriormente mencionado que contiene la anti-CD3 desinmunizada se escindió con las enzimas de restricción BsrG1 y BspE1 y se clonó posteriormente en el vector bluescript KS (Stratagene, La Jolla, CA), que contenía la secuencia de aminoácidos de una señal secretora eucariota (péptido líder) como un fragmento EcoRI/BsrGI. Después de la escisión de esta construcción con EcoRI y BspEI el fragmento de ADN resultante que comprende el scFv anti-CD3 respectivo con el péptido líder se clonó en un plásmido escindido con EcoRI/BspEI que contenía el scFv anti EpCAM 3-1, 4-7 ó 5-10 en posición C terminal en el vector pEF-DHFR. Después de la confirmación de la secuencia que codifica la cadena sencilla biespecífica por secuenciación (Sequiserve, Vaterstetten) el plásmido se transfectó en células CHO deficientes en DHFR para expresión eucariota. La expresión de proteínas eucariotas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe en Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566).

8.1.3. Clonación y expresión de las construcciones anti-CD3xanti-EpCAM desinmunizadas en orientación VHCD3-VLCD3 x VLEpCAM-VHEpCAM

Anti-EpCAM 4-7 en orientación VL-VH que contiene el engarce convencional de 15 aminoácidos (SEC ID Nº: 168) se obtuvo por PCR. La región VH 4-7 y la región VL 4-7 se amplificaron por separado mediante los siguientes cebadores (4-7 VL: 4-7 VL BspEI DIR CTGAAATCCGGAGGTGGTGGATCCGAGCTCGTGATGACCCAGACTCC (SEC ID Nº: 117), 4-7 VL GS15 INV GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCTTTGATCTCAAGCTT GGTCCCC (SEC ID Nº: 118); 4-7 VH: 4-7 VH GS15. DIR GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTC TGAGGTGCAGCTGCTCGAGCAG (SEC ID Nº: 42), 4-7 VH SalI INV TTTTAAGTCGACCTAATGATGATGATGAT GATGTGAGGAGACGGTGACCGTGG (SEC ID Nº: 43)). Se usaron secuencias complementarias solapantes introducidas en los productos de PCR para formar la secuencia codificante de un engarce (engarce convencional) de 15 aminoácidos (G4S1)3 (código de aminoácidos de una letra) (SEC ID Nº: 168) durante la PCR de fusión posterior. Esta etapa de amplificación se realizó con el par de cebadores 4-7 VL BspEI DIR y 4-7 VH Sall INV (SEC ID Nº: 42 y 43).

Se obtuvo Anti-EpCAM 5-10 en orientación VL-VH que contenía el engarce de 15 aminoácidos convencional ((G4S1)3) por PCR. La región 5-10 VH y la región 5-12 VL se amplificaron por separado mediante los siguientes cebadores (5-10 VL: 5-10 VL BspEI DIR CTGAAATCCGGAGGTGGTGGATCCGAGCTCGTGATGA CACAGTCTCCAT (SEC ID Nº. 44), 5-10 VL GS15 INV GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCTTTGA TCTCAAGCTTGGTCCCAG; (SEC ID Nº: 45) 5-10 VH: 5-10 VH GS15 DIR GGCGGCGGCGGCTCCGGTGG TGGTGGTTCTGAGGTGCAGCTGCTCGAGC (SEC ID Nº: 46), 5-10 VH SalI INV TTTTAAGTCGACCTAA TGATGATGATGATGATGTGAGGAGACGGTGACCGTGG (SEC ID Nº. 47). Se usaron secuencias complementarias solapantes introducidas en los productos de PCR para formar la secuencia codificante de un engarce (engarce convencional) de 15 aminoácidos (G4S1)3 (código de aminoácidos de una letra) (SEC ID Nº: 168) durante la PCR de fusión posterior. Esta etapa de amplificación se realizó con el par de cebadores 5-10 VL BspEI DIR y 5-10 VH Sall INV. Los productos de PCR (5-10 VL-VH y 4-7 VL-VH) se clonaron en el vector pEF-DHFR que comprende construcción anti-CD3 (VH5/VL2). Después de la confirmación de la secuencia que codifica la cadena sencilla biespecífica mediante secuenciación, el plásmido se transfectó en células CHO deficientes en DHFR para expresión eucariota. La expresión de proteínas eucariotas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe en Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566).

8.1.4. Unión de las construcciones anti-CD3xanti-EpCAM desinmunizadas con EpCAM y CD3

La unión de moléculas de cadena sencilla biespecíficas con la parte anti-CD3 en orientación N-terminal a EpCAM y CD3 se confirmó mediante análisis de FACS. Para este fin se usó la línea celular de cáncer gástrico humano positiva para EpCAM Kato III (ATCC HTB-103). La unión de la parte anti-CD3 se demostró en células Jurkat (ATCC TIB 152).

Las células se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del proveedor y se incubó un número de 200000 células con 10 g/ml de la construcción en 50 l de PBS con FCS (suero de ternero fetal) al 2%. La unión de la construcción se detectó con un anticuerpo anti-His (Anticuerpo Penta-His, obtenido de Qiagen, Hilden, FRG) a 2 g/ml en PBS con FCS al 2%. Se usó como una segunda etapa F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-Ficoeritrina derivado de IgG anti-ratón de cabra, diluido 1:100 en 50 l de PBS con FCS al 2% (Dianova, Hamburgo, FRG). Las muestras se midieron en un FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, FRG).

Los resultados de análisis de FACS se muestran en la Fig. 15. Todas las construcciones que comprenden parte antiCD3 desinmunizada mostraron una unión más fuerte que el anticuerpo de cadena sencilla biespecífico anti-EpCAM (M79)xanti-CD3 no desinmunizado en células KatoIII positivas para EpCAM.

8.2. Clonación de elementos de unión a EpCAM N-terminales que comprenden parte anti-CD3 desinmunizada 8.2.1. Clonación de las construcciones anti-EpCAM x anti-CD3 8.2.1.1 Clonación de construcción 3-1xanti-CD3 (VH5/VL2) desinmunizada (SEC ID Nº: 48, 49)

La construcción desinmunizada 3-1xanti-CD3 (VH5NL2) (SEC ID Nº: 48) se derivó de la construcción no desinmunizada anti-EpCAM (3-1)xanti-CD3. Las regiones VH y VL del anticuerpo anti-EpCAM 3-1 se muestran en SEC ID Nº: 137 y 139. Los plásmidos pEF-DHFR-3-1x anti-CD3 y pEF anti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 192) se digirieron con BspEI y SalI (Biolabs) para el aislamiento del vector y el inserto anti-CD3 (VH5/VL2), respectivamente. El vector digerido con BspEI-Sall se desfosforiló y se purificó en gel de agarosa al 0,7%, mientras que el inserto se purificó en gel de agarosa al 1,5%.

El fragmento purificado (BspEI-Sall) se clonó posteriormente en los sitios correspondientes del vector pEF-OHFR. La construcción final 3-1xanti-CD3 (VH5NL2) (SEC ID Nº: 48, 49) se verificó por digestiones de restricción y por secuenciación de ADN del inserto completo.

Clonación de la construcción no desinmunizada 3-1xanti-CD3

Para la clonación de la construcción 3-1xanti-CD3 (VH5NL2) la construcción no desinmunizada correspondiente se generó como sigue.

El 3-1 C-terminal en orientación VH-VL se obtuvo por PCR para la construcción de molécula no desinmunizada 3-1 x anti-CD3. Los fragmentos I y II que comprenden el 3-1 VH-VL en dos partes se amplificaron mediante PCR usando pares de cebadores me 91 a (SEC ID Nº: 53) /me 90 (SEC ID Nº: 52) y me 83 (SEC ID Nº: 50) / me 84 (SEC ID Nº: 51), respectivamente. Se realizó una PCR de Comienzo a Alta Temperatura usando el Sistema de Alta Fidelidad Expand de Roche Diagnostics. Se usaron 20 ciclos (94ºC/30 s; 60ºC/1 min; 72ºC/1 min) para amplificación seguido de un ciclo de 3 min a 72ºC.

Los fragmentos de PCR I y II se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%. Se mezclaron los fragmentos (1 ng de cada uno) y se usaron como un molde para la siguiente reacción de PCR realizada con el par de cebadores me 91a (SEC ID Nº: 53) y me 84 (SEC ID Nº: 51) para amplificación de fragmento III que comprende el 3-1 completo Se realizó PCR como se ha descrito anteriormente, pero con una temperatura de hibridación de 68ºC. Se purificó el fragmento III en un gel de agarosa y se digirió con BsrGI y BspEI (Biolabs), se purificó y se clonó posteriormente en los sitios correspondientes de la construcción pEF-DHFR-anti EpCAM (M79) X anti-CD3. La región clonada se verificó mediante digestiones de restricción y por secuenciación de ADN.

Secuencias de los Cebadores usados:

Me 83: 5’- GGT TCT GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGT TCT GAG GTG CAG CTG CTC GA CAG TCT G -3’ (SEC ID Nº: 50) Me 84: 5’- GTG CTC CGG AGG AGA CGG TGA CCG TGG TCC CTT GGC CCC AG -3’ (SEC ID Nº: 51)

Me 90: 5’- CCG GAG CCG CCG CCG CCA GAA CCA CCA CCA CCT TTG ATC TCA AGC TTG GTC CC -3’ (SEC ID Nº: 52)

Me 91a: 5’- GGA TTG TAC A CTCC GA GCT CGT CAT GAC CCA GTC TCC ATC TTA TCT TGC TGC -3’ (SEC ID Nº: 53)

8.2.1.2 Clonación de construcción desinmunizada 3-5xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 54, 55):

El 3-5 C-terminal en orientación VH-VL se obtuvo por PCR para la construcción de molécula 3-5 xanti-CD3. Las regiones VH y VL del anticuerpo anti-EpCAM 3-5 se muestran en SEC ID Nº: 141 y 143. Los plásmidos pEFDHFR-35xanti-CD3 y pEF anti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 192) se digirieron con EcoRI y BspEI (Biolabs) para el aislamiento del inserto (3-5) y el vector respectivamente. El vector desfosforilado (digerido con EcoRI y BspEI) y el inserto se purificaron por electroforesis en gel de agarosa.

El fragmento purificado (EcoRI-BspEI) se clonó posteriormente en los sitios correspondientes del vector pEF-DHFR. La construcción final 3-5xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 54) se verificó mediante digestiones de restricción.

Clonación de la construcción no desinmunizada 3-5xanti-CD3:

Para la clonación de la construcción 3-5xanti-CD3 (VH5/VL2) se generó la construcción no desinmunizada correspondiente como sigue.

Los fragmentos I y II que comprenden el 3-5 en dos partes se amplificaron por PCR de acuerdo con las condiciones descritas para 3-1xanti-CD3 usando pares de cebadores me 81 (SEC ID Nº: 56) /me 90 (SEC ID Nº: 52) y me 83 (SEC ID Nº: 50) /me 84 (SEC ID Nº: 51) respectivamente. Se reamplificaron los fragmentos de gel de agarosa que comprenden fragmentos de PCR I y II con el par de cebadores me 81 (SEC ID Nº: 56) y me 84 (SEC ID Nº: 51) para amplificación del fragmento III que comprende el 3-5 completo. Se realizó PCR como se ha descrito anteriormente. Se purificó el fragmento III en un gel de agarosa y se digirió con BssHII y BspEI (Biolabs), se purificó y se clonó posteriormente en los sitios correspondientes del vector de clonación pEF-DHFR. La región clonada se verificó mediante digestiones de restricción y por secuenciación de ADN.

Secuencia del Cebador Me81 (Sec ID Nº: 56):

Me 81: 5’- GGA TGC GCG CGA GCT CGT GAT GAC CCA GAC TCCA CTC TCC -3’

8.2.1.3 Clonación de la construcción desinmunizada 4-1xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 57, 58):

El 4-1 C-terminal en orientación VH-VL se obtuvo por PCR para la construcción de molécula 4-1xanti-CD3. Las regiones VH y VL del anticuerpo anti-EpCAM 4-1 se muestran en SEC ID Nº: 145 y 147. Los plásmidos pEFDHFR-41xanti-CD3 y pEF anti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 192) se digirieron con EcoRI y BspEI (Biolabs) para el aislamiento del inserto (4-1) y el vector respectivamente. El vector desfosforilado (digerido con EcoRI y BspEI) y el inserto se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa.

El fragmento purificado (EcoRI-BspEI) se clonó posteriormente en los sitios correspondientes del vector. La construcción final 4-1xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 57) se verificó por digestiones de restricción.

Clonación de la construcción no desinmunizada 4-1xanti-CD3:

Para la clonación de la construcción 4-1xanti-CD3 (VH5/VL2) se generó la construcción no desinmunizada correspondiente como sigue.

Los fragmentos I y II que comprenden el 4-1 en dos partes se amplificaron por PCR usando los pares de cebadores me 91 a (SEC ID Nº: 53) /me 90 (SEC ID Nº: 452) y me 83 (SEC ID Nº: 50) /me 84 (SEC ID Nº: 51) con las condiciones anteriormente mencionadas, respectivamente.

Los fragmentos de gel de agarosa que comprendían fragmentos de PCR I y II se reamplificaron con el par de cebadores me 92a (SEC ID Nº: 59) y me 84 (SEC ID Nº: 51) para amplificación del fragmento III que comprende el 4-1 completo. Se realizó PCR como se ha descrito anteriormente pero se realizó la hibridación a 68ºC. El fragmento III se purificó en un gel de agarosa y se digirió con BsrGI y BspEI (Biolabs), se purificó y se clonó posteriormente en los sitios correspondientes de la construcción de vector de clonación pEF-DHFR-anti EpCAM (M79) X anti-CD3. La región clonada se verificó por digestiones de restricción y por secuenciación de ADN.

Secuencia del cebador Me92a (SEC ID Nº: 59)

Me 92a: 5’- GGA TTG TAC A CTCC GA GCT CGT GAT GAC ACA GTCTCC ATC CTC C -3’

8.1.2.4 Clonación de la construcción desinmunizada 4-7xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 60, 61):

El 4-7 C-terminal en orientación VH-VL se obtuvo por PCR para la construcción de 4-7xanti-CD3. Las regiones VH y VL del anticuerpo anti-EpCAM 4-7 se muestran en SEC ID Nº: 149 y 151. Los plásmidos pEFDHFR-4-7xanti-CD3 y pEF anti-CD3 VH5/VL2 (SEC ID Nº: 192) se digirieron con EcoRI y BspEI (Biolabs) para el aislamiento del inserto (47) y el vector respectivamente. El vector desfosforilado (digerido con EcoRI y BspEI) y el inserto se purificaron por electroforesis en gel de agarosa.

El fragmento purificado (EcoRI-BspEI) se clonó posteriormente en los sitios correspondientes del vector pEF-DHFR. La construcción final 4-7xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 60) se verificó por digestiones de restricción.

Clonación de la construcción no desinmunizada 4-7xanti-CD3:

Para la clonación de la construcción 4-7xanti-CD3 (VH5/VL2) se generó la construcción no desinmunizada correspondiente como sigue.

Los fragmentos I y II que comprenden el 4-7 en dos partes se amplificaron por PCR usando los pares de cebadores me 81 a (SEC ID Nº: 56) /me 90 (SEC ID Nº: 52) y me 83 (SEC ID Nº: 50) /me 84 (SEC ID Nº: 51) con las condiciones anteriormente mencionadas, respectivamente. Los fragmentos de gel de agarosa que comprendían fragmentos de PCR I y II se reamplificaron con el par de cebadores me 81 (SEC ID Nº: 56) y me 84 (SEC ID Nº: 51) para amplificación del fragmento III que comprende la cadena VH y VL completa de 4-7. Se realizó PCR como se ha descrito anteriormente. El fragmento III se purificó en un gel de agarosa y se digirió con BssHII y BspEI (Biolabs), se purificó y se clonó posteriormente en los sitios correspondientes del vector de clonación pEF-DHFR. La región clonada se verificó por digestiones de restricción y por secuenciación de ADN.

8.1.2.5 Clonación de la construcción desinmunizada 5-10x anti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 62, 63):

El 5-10 C-terminal en orientación VH-VL se obtuvo por PCR para la construcción de molécula 5-10 xanti-CD3. Las regiones VH y VL del anticuerpo anti-EpCAM 5-10 se muestran en SEC ID Nº: 133 y 135. Los plásmidos pEFDHFR5-10xanti-CD3 y pEF anti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 192) se digirieron con EcoRI y BspEI (Biolabs) para el aislamiento del inserto (5-10) y el vector respectivamente. El vector desfosforilado (digerido con EcoRI y BspEI) y el inserto se purificaron por electroforesis en gel de agarosa.

El fragmento purificado (EcoRI-BspEI) se clonó posteriormente en los sitios correspondientes del vector pEF-DHFR. La construcción final 5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 62) se verificó por digestiones de restricción y por secuenciación de ADN.

Clonación de construcción no desinmunizada 5-10xanti-CD3:

Para la clonación de la construcción 5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) se generó la construcción no desinmunizada correspondiente como sigue.

Los fragmentos I y II que comprenden el 5-10 en dos partes se amplificaron por PCR usando pares de cebadores me 92a (SEC ID Nº: 59) /me 90 (SEC ID Nº: 52) y me 83 (SEC ID Nº: 50) /me 84 (SEC ID Nº: 51) con las condiciones anteriormente mencionadas, respectivamente. Se reamplificaron fragmentos de gel de agarosa que comprendían los fragmentos de PCR I y II con el par de cebadores me 92 (SEC ID Nº: 59) y me 84 (SEC ID Nº: 51) para amplificación del fragmento III que comprende el 5-10 completa. Se realizó PCR como se ha descrito anteriormente pero la hibridación se realizó a 68ºC. El fragmento III se purificó en un gel de agarosa y se digirió con BsrGI y BspEI (Biolabs), se purificó y se clonó posteriormente en los sitios correspondientes del vector de clonación pEFDHFR-anti EpCAM (M79) x anti-CD3. La región clonada se verificó mediante digestiones de restricción y por secuenciación de ADN.

8.2.2 Expresión de moléculas anti-EpCAMx-anti-CD3 desinmunizada con anti-EpCAM en la posición N-terminal:

Se mantuvieron células CHO que carecían del gen DHFR en medio MEM alfa (Life Technologies, cat. nº: 32561) complementado con suero de ternero fetal al 10% (Life Technologies, inactivado por calor a 65ºC durante 30 minutos) y con HT (Hipoxantina y Timidina; Life Technologies). Las células se transfectaron con pEF-DHFR-3-1xantiCD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 48) y pEF-DHFR-5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 62), usando Lipofectamine 2000 kit (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el Fabricante. Después de 48 h se realizó selección en medio de selección (medio MEM alfa que contenía suero de ternero fetal dializado al 10% inactivado por calor (Life Technologies). Después de 3-4 semanas se recogió el sobrenadante de cultivo celular y se centrifugó a 4ºC durante 10 minutos a 300 g para retirar las células y residuos celulares. El sobrenadante que contenía el anticuerpo biespecífico se almacenó -20ºC hasta análisis adicional.

8.2.3. Ensayos de unión de variantes anti-EpCAMxanti-CD3 biespecíficas:

Se incubaron de forma independiente 250000 células Jurkat (para unión a CD3) y células Kato (para unión a EpCAM) con sobrenadantes de cultivo celular (50 l) que contenían la construcción biespecífica (pEF-DHFR-31xanti-CD3 (VH5/VL2) (Nº 50, SEC ID Nº: 48) y pEF-DHFR-5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (Nº 54) (SEC ID Nº: 62), respectivamente) durante 45 min a 4ºC. A continuación, las células se lavaron dos veces en tampón FACS (solución salina tamponada con fosfato que contenía suero de ternero fetal al 1% (FCS) y azida sódica a 0,05%) y se incubaron con anticuerpo anti-His de ratón (Dianova, DIA910) durante 60 min a 4ºC. Se realizaron etapas de lavado como anteriormente.

Las células se incubaron finalmente con anticuerpo conjugado con Ig- FITC anti-ratón de cabra (BD 550003) o con IgG anti-ratón conjugado con PE (Sigma, P8547). Después de las etapas de lavado, se analizaron 10000 acontecimientos usando FACS Calibur (B&D). Los resultados de los ensayos de unión se observan en la Figura 16. Las construcciones 3-1 xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 49) y 5-10xanti-CD3 (SEC ID Nº: 63) mostraron fuerte unión a CD3 en células Jurkat y a CD19 en células Kato.

Ejemplo 8.3. Purificación de construcciones biespecíficas anti EpCAM con parte anti-CD3 desinmunizada

5 Las construcciones que comprenden una región anti-CD3 desinmunizada y una región específica de EpCAM se purificaron con un procedimiento de purificación de dos etapas que incluía cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC) y filtración en gel. La cromatografía de afinidad por iones metálicos (IMAC) y la filtración en gel se llevaron a cabo como se demuestra en el ejemplo 3.2.

Se realizó una cromatografía de intercambio catiónico de alta resolución adicional en una columna MiniS

10 (Amersham), equilibrada con tampón MES 20 mM pH 5,5. La muestra se diluyó 1:3 con el mismo tampón antes de cargarla en la columna. Se eluyó proteína unida con un gradiente 0-30% de NaCl 1 M en tampón de equilibrio. Las fracciones de proteína eluidas se ensayaron en el ensayo de bioactividad. La Tabla 14 muestra los rendimientos de las construcciones de EpCAM desinmunizadas purificadas. Todas las construcciones podrían producirse de forma eficaz. Sorprendentemente, la construcción 5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID Nº: 63) tuvo un rendimiento

15 extremadamente bueno de 2200 g/l.

Tabla 14. Rendimientos de las construcciones de EpCAM desinmunizadas

Construcción: Rendimiento del monómero [g de proteína purificada por litro de cultivo]

anti-CD3 (VH5NL2)x4-7 (SEC ID NO: 33): 112,5

3-1xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID NO: 49): 87,5

anti-CD3 (VH5NL2)x3-1 (SEC ID NO: 31): 442,5

5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEC ID NO: 63): 2200

anti-CD 3 (VH5/VL2)x5-10 (SEC ID NO: 37): 80

Ejemplo 8.4. Ensayos citotóxicos de las construcciones biespecíficas anti-EpCAM con parte desinmunizada anti-CD3

20 Para confirmar la bioactividad alta de los anticuerpos biespecíficos de la invención, se llevó a cabo un ensayo basado en FACS. Se transfectaron células de CHO con molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM). Un clon celular derivado de esta transfección, denominadas células CHO-EpCAM, se usó para los experimentos.

Para el ensayo de citotoxicidad, se lavaron las células CHO-EpCAM (1,5x107) para retirar el suero dos veces con PBS y se incubaron con colorante PKH26 (Sigma-Aldrich Co.) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

25 Después de la tinción, las células se lavaron dos veces con RPMI/FACS al 10%.

Las células se contaron y se mezclaron con células efectoras CB15. El Dr. Fickenscher, Universidad de Erlangen/Nuemberg, Alemania, proporcionó amablemente el clon de linfocitos T positivo para CD4 CB15. Se cultivaron las células como recomiendan los proveedores. La suspensión de células resultante contenía 400.000 células diana y 2 x 106 efectoras por ml. Se usaron 50 l de la mezcla por pocillo en una placa de fondo redondo de

30 96 pocillos.

Se diluyeron los anticuerpos en RPMI/FCS al 10% a la concentración requerida y se añadieron 50 l de esta solución a la suspensión celular. Se incubó una reacción convencional durante 16 h a 37ºC / CO2 al 5%. Se añadió yoduro de propidio a una concentración final de 1 g/ml. Después de 10 min de incubación a temperatura ambiente se analizaron las células mediante FACS. Se usó fluorescencia de PKH26 para identificación positiva de las células

35 diana. La citotoxicidad se midió como relación de PI positivas frente a todas las células diana.

Las curvas de respuesta a dosis sigmoideas típicamente tuvieron valores de R2 > 0,97 según se determinó por Software Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, Estados Unidos). Los resultados de los ensayos citotóxicos se muestran en las Figuras 17 y 18.

Ejemplo 8.5. Comparación de la productividad de moléculas biespecíficas que comprenden una parte de 40 unión a EpCAM y una parte de unión a CD3 desinmunizada en células CHO

Para determinar la productividad de una proteína L de construcción desinmunizada se realizó un ELISA. Los datos de productividad se calcularon a partir de cultivos discontinuos.

8.5.1 Cultivo Celular

Se cultivaron líneas celulares CHO que producían (CHO-DHFR) desinmunizado y (CHO-DHFR o CHO-K1) no desinmunizado en medio HyQ PF CHO LS + L-Glutamina 4 mM en un incubador de CO2 a 37ºC y CO2 al 5%. Se determinaron los números de células y su viabilidad usando Azul de tripano. La densidad celular se estableció a 1-2  105 células/ml.

Se transfirieron las células a matraces de agitación y se ajustaron de este modo a condiciones de un cultivo agitado. Los ajustes de parámetros operativos fueron 80 rpm, 37ºC y CO2 al 5% con gaseado en un incubador de CO2. El volumen de cultivo estuvo en el intervalo de 100-500 ml y la densidad celular en inoculación en el intervalo de 1-2  105 células/ml. En cuanto al subcultivo en matraces en T, los cultivos se centrifugaron y resuspendieron en medio precalentado fresco en cada pase. La densidad celular se estableció a 1-2  105 células/ml.

Para análisis de datos de productividad (Tabla 15) se cultivaron células hasta 14 días (d) sin ninguna adición de medio o intercambio. Los números y viabilidad de las células se determinaron diariamente usando tinción con azul de tripano. Las concentraciones de producto en el sobrenadante se analizaron mediante ELISA de Proteína L.

8.5.2 ELISA de Proteína L

Se llevó a cabo unión cuantitativa de las moléculas biespecíficas con placas de microtitulación revestidas de rProteína L. La rProteína L es una forma recombinante de la Proteína L de unión a inmunoglobulina producida por Peptostreptococcus magnus. Tiene cuatro dominios de unión y se une a inmunoglobulina a través de la cadena ligera (). Las moléculas biespecíficas, que contienen dominios variables de dos anticuerpos parentales respectivamente con dos cadenas ligeras diferentes, también se unen a rProteína L.

Las placas de microtitulación se revistieron con rProteína L en tampón PBS (2 g de rProteína L/ml tampón de PBS) durante una noche a 2-8ºC. Después del revestimiento, se bloquearon los sitios de adsorción restantes con tampón de bloqueo (BSA al 2% en tampón PBS). Después, las placas se congelaron y se almacenaron a 18ºC. Antes de su uso, las placas se descongelaron y se lavaron con tampón de lavado (Tween 20 al 0,05% en tampón PBS) para retirar la mezcla de solución de revestimiento y tampón de bloqueo.

Se analizaron diluciones en serie de sobrenadante de cultivo celular sin células en BSA al 1% + Tween 20 al 0,01% en PBS (tampón de dilución). Se usó anti-EpCAM(M79)xanti-CD3 biespecífico como un control positivo en diluciones comparables.

Se realizó incubación durante una noche a 2-8ºC.

Después de lavar se añadió IgG anti-ratón de conejo (1:5.000 en tampón de dilución) y se incubó durante 60 min a temperatura ambiente. Se añadió IgG anti-conejo de cabra con fosfatasa alcalina (1:1.000 en tampón de dilución; 60 min a temperatura ambiente) después del lavado. Se añadió solución de sustrato de pNPP y la reacción se detuvo por la adición de NaOH 3 M. La absorbancia se midió con un lector de ELISA a 405 nm (filtro de referencia 492 nm).

Tabla 15. Productividad de una construcción desinmunizada anti-EpCAM

Construcción: M79xanti-anti-CD3 5-10xanti-CD3 (VH5/VL2)

Línea celular básica: CHO-K1 CHO-dhfr CHO-dhfr-

Productividad específica: 0,2-0,6 pg/célula por día 1-3 pg/célula por día 15-20 pg/célula por día

Densidad celular máxima: 3x106 c/ml 1,2-1,8x106 c/ml 1,5x106 c/ml

Tiempo de doblado: 17-20 h 25-30 h 25-30 h

De este modo, la construcción 5-10xanti-CD3 (VH5NL2) de la invención demostró una productividad específica mucho mayor (al menos cinco veces mayor) que el anticuerpo de unión a EpCAM y CD3 no desinmunizado biespecífico de la técnica anterior.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una construcción de unión específica a CD3 citotóxicamente activa que comprende un primer dominio que se une

específicamente a CD3 humano y un segundo dominio de unión derivado de Ig, en la que dicho primer dominio está desinmunizado y comprende una región CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en SEC ID Nº: 88, una región CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en SEC ID Nº: 90 ó 92 y una región CDR-H3, que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en SEC ID Nº: 96, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 ó 127; y en la que dicho primer dominio comprende adicionalmente en su H1 flanqueante la secuencia VKK y en la que la secuencia de transición entre la región H1 flanqueante y CDRH1 comprende la secuencia Ala-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe (ASGYTF; SEC ID Nº: 233).
2.

La construcción de unión específica a CD3 citotóxicamente activa de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente en dicho primer dominio una H3 flanqueante que comprende la secuencia Met-Glu-Leu-Ser (MELS; SEC ID Nº: 234).
3.

La construcción de unión específica a CD3 citotóxicamente activa de la reivindicación 1 ó 2 que comprende adicionalmente en dicho primer dominio una H3 flanqueante que comprende la secuencia Ile-Thr-Thr-Asp-Lys (ITTDK; SEC ID Nº: 235).
4.

La construcción de unión específica a CD3 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho primer dominio que se une específicamente a CD3 humano comprende una H1 flanqueante como se muestra en SEC ID Nº: 152 ó 153.
5.

La construcción de unión específica a CD3 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho primer dominio que se une específicamente a CD3 humano comprende una H2 flanqueante como se muestra en SEC ID Nº: 156 ó 157.
6.

La construcción de unión específica a CD3 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho primer dominio que se une específicamente a CD3 humano comprende una H3 flanqueante como se muestra en SEC ID Nº: 160 ó 161.
7.

La construcción de unión específica a CD3 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho primer dominio que se une específicamente a CD3 humano comprende una H4 flanqueante como se muestra en SEC ID Nº: 164 ó 165.
8.

La construcción de unión específica a CD3 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha construcción comprende una región VH como se representa en SEC ID Nº: 74 ó 76.
9.

La construcción de unión específica a CD3 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha construcción comprende una CDR-L1 como se representa en SEC ID Nº: 98 ó 100.
10.

La construcción de unión específica a CD3 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicha construcción una CDR-L2 como se representa en SEC ID Nº: 102.
11.

La construcción de unión específica a CD3 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicha construcción comprende una CDR-L3 como se representa en SEC ID Nº: 104.
12.

La construcción de unión específica a CD3 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende una región VL en su parte específica de CD3, en la que dicha región VL se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 80, SEC ID Nº: 82 y SEC ID Nº: 112.
13.

La construcción de unión específica a CD3 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicho segundo dominio derivado de Ig es un scFv.
14.

La construcción de unión específica a CD3 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que dicho segundo dominio derivado de Ig y/o una región o regiones de engarce de conexión están humanizados y/o desinmunizados.
15.

La construcción de unión específica a CD3 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que dicho segundo dominio derivado de Ig comprende un sitio de interacción con antígeno con especificidad para una molécula de superficie celular.
16.

La construcción de unión específica a CD3 de la reivindicación 15, en la que dicha molécula de superficie celular es un marcador específico de tumor.
17.

La construcción de unión específica a CD3 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que dicho segundo dominio de unión derivado de Ig comprende un sitio de interacción con antígeno con una especificidad para EpCAM.
18.

La construcción de unión específica a CD3 de la reivindicación 17, en la que dicha construcción de unión específica a CD3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de

(a)

una secuencia de aminoácidos como se muestra en una cualquiera de SEC ID Nº: 31, 33, 35, 37, 39, 49, 55, 58, 61, 63, 65, 67, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323 y 325;

(b)

una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico como se muestra en una cualquiera de SEC ID Nº: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 54, 57, 60, 62, 64, 66, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322 y 324; y

(c)

una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que está degenerada como resultado del código genético para una secuencia de nucleótidos de (b);

(d)

y secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la hebra complementaria de una secuencia de ácido nucleico como se define en (b) en condiciones de hibridación rigurosas.
19.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica una construcción de unión específica a CD3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
20.

Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 19.
21.

El vector de la reivindicación 20, que comprende adicionalmente una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia reguladora unida operativamente a dicha secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación
19.
22.

El vector de la reivindicación 20 ó 21, en la que el vector es un vector de expresión.
23.

Un huésped transformado o transfectado con un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a
22.
24.

Un procedimiento para la producción de una construcción de unión específica a CD3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 comprendiendo dicho procedimiento cultivar un huésped de la reivindicación 23 en condiciones que permiten la expresión de la construcción polipeptídica y recuperar la construcción polipeptídica producida del cultivo.
25.

Una composición que comprende una construcción de unión específica a CD3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o como se produce por el procedimiento de la reivindicación 24, una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 19, un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 o un huésped de la reivindicación 23 y, opcionalmente, un compuesto proteínico capaz de proporcionar una señal de activación para células efectoras inmunes.
26.

La composición de la reivindicación 25, que es una composición farmacéutica que comprende adicional y opcionalmente, formulaciones adecuadas de vehículo, estabilizadores y/o excipientes.
27.

La composición de la reivindicación 25, que es una composición de diagnóstico que comprende adicional y opcionalmente, medios y procedimientos para detección.
28.

Uso de una construcción de unión específica a CD3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o como se produce por el procedimiento de la reivindicación 24; una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 19; un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22; o como huésped de la reivindicación 23, para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención, tratamiento o alivio de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad inflamatoria, un trastorno inmunológico, una enfermedad autoinmune, una enfermedad infecciosa, una enfermedad viral, reacciones alérgicas, reacciones parasitarias, enfermedades de injerto contra huésped o enfermedades de huésped contra injerto.
29.

El uso de la reivindicación 28, en el que la composición farmacéutica es para administrarse de forma simultánea

o no simultánea con un compuesto proteínico capaz de proporcionar una señal de activación para células efectoras inmunes.
30.

Una composición farmacéutica que comprende una construcción de unión específica a CD3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o como se produce por el procedimiento de la reivindicación 24; una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 19; un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22; o un huésped de la reivindicación 23, para su uso en la prevención, tratamiento o alivio de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad inflamatoria, un trastorno inmunológico, una enfermedad autoinmune, una enfermedad infecciosa, una enfermedad viral, reacciones alérgicas, reacciones parasitarias, enfermedades de injerto contra huésped o enfermedades de huésped contra injerto.
31.

La composición farmacéutica de la reivindicación 30 que la composición farmacéutica es para administrarse de forma simultánea o no simultánea con un compuesto proteínico capaz de proporcionar una señal de activación para células efectoras inmunes.
32.

Un kit que comprende una construcción de unión específica a CD3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o como se produce por el procedimiento de la reivindicación 24; una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 19; un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22; o un huésped de la reivindicación 23.