ES2858482T3

ES2858482T3 - Miembros de unión al TNF alfa

Info

Publication number: ES2858482T3
Application number: ES15712626T
Authority: ES
Inventors: Abdijapar Shamshiev; Titus Kretzschmar
Original assignee: Cell Medica Switzerland AG
Current assignee: Cell Medica Switzerland AG
Priority date: 2014-03-26
Filing date: 2015-03-26
Publication date: 2021-09-30
Anticipated expiration: 2035-03-26
Also published as: US20170107282A1; RU2016141561A; JP2017515457A; MX2016012479A; IL248000B; WO2015144852A1; EP3122777A1; RU2016141561A3; AU2015238261A1; AU2015238261B2; IL248000A0; KR20160142849A; CA2943445A1; US20210332119A1; CN106414498A; BR112016022055A2; EP3122777B1; JP6832707B2; US10995138B2; RU2706551C2

Abstract

Un miembro de unión que tiene una especificidad de unión al TNF alfa, comprendiendo el miembro de unión (i) la cadena pesada variable como se establece en la SEQ ID NO: 2; y (ii) la cadena ligera variable como se establece en la SEQ ID NO: 1; en el que el miembro de unión es un fragmento variable de cadena sencilla scFv.

Description

DESCRIPCIÓN

Miembros de unión al TNF alfa

Campo de la invención

Se proporciona un miembro de unión contra el TNF alfa, tal como una molécula de unión humanizada, en particular un reactivo anti-TNF alfa monovalente, altamente potente y estable, tal como un fragmento de anticuerpo, aplicable para usos terapéuticos y de diagnóstico. En algunas variantes el miembro de unión es una inmunoglobulina, un fragmento de esta, o una molécula proteínica de unión con funciones similares a las de las inmunoglobulinas, específicas para el TNF alfa. También se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica tal miembro de unión, un vector que contiene la secuencia de una molécula de ácido nucleico respectiva, una célula huésped que contiene el vector o la secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico respectiva, una composición farmacéutica y de diagnóstico que contiene el miembro de unión o la molécula de ácido nucleico, así como el uso de estos.

Antecedentes

La siguiente discusión de los antecedentes de la invención se proporciona simplemente para ayudar al lector en la comprensión de la invención y no se admite para describir o constituir técnica anterior a la presente invención.

El factor de necrosis tumoral (TNF) alfa es una potente citocina proinflamatoria que desempeña un papel central en las respuestas inmunitarias y los trastornos inflamatorios. Se ha divulgado como mediador clave de reacciones inflamatorias, inmunológicas y fisiopatológicas. Principalmente secretado por monocitos y macrófagos activados, el TNF alfa también se produce por muchos otros tipos de células, que incluye fibroblastos, neutrófilos, eosinófilos y células epiteliales.

También denominado caquectina, el TNF alfa existe en dos formas biológicamente activas: una forma transmembrana y una soluble. La forma soluble del TNF alfa se libera del TNF alfa transmembrana (tmTNF alfa) mediante escisión proteolítica. Ambas formas del TNF alfa son trímeros biológicamente activos, se unen a los receptores de TNF y ejercen diversas funciones biológicas para contribuir a la defensa del huésped. Además, tanto el TNF alfa transmembrana como el soluble juegan un papel en la patogenia de enfermedades inflamatorias y autoinmunes.

Se identificaron dos receptores para el TNF alfa (TNF-R1 y -R2) que median los efectos pleiotrópicos del TNF alfa. Estos receptores se expresan en una variedad de células, principalmente en monocitos y macrófagos. La activación del receptor desencadena los diversos efectos biológicos, que incluyen la producción de citocinas proinflamatorias como la IL-1, el TNF alfa, la IL-6, la IL-8; la producción de quimiocinas; la activación de neutrófilos; aumenta la permeabilidad de la capa de endotelio; y la expresión de moléculas de adhesión. Por consiguiente, un gran número de enfermedades está asociado con niveles de TNF alfa regulados positivamente y, en consecuencia, los inhibidores de TNF alfa han encontrado un amplio uso en el tratamiento médico. Una subclase importante del número cada vez mayor de inhibidores del TNF alfa son los fármacos biológicos. Varios inhibidores biológicos del TNF alfa recibieron aprobación regulatoria y están disponibles comercialmente. Un grupo de tales inhibidores biológicos son las inmunoglobulinas de longitud completa. Por ejemplo, el infliximab (Remicade®), una IgG quimérica de aproximadamente 150 kDa, se ha aprobado para el tratamiento de la enfermedad de Crohn, la artritis reumatoide, la artritis psoriásica, la colitis ulcerosa, la espondilitis anquilosante, la psoriasis y la enfermedad de Behget. El adalimumab (Humira®), una IgG1 de aproximadamente 150 kDa, está aprobado para la artritis reumatoide, la artritis reumatoide juvenil, la enfermedad de Crohn, la artritis psoriásica, la psoriasis, la espondilitis anquilosante, la colitis ulcerosa y la enfermedad de Behget. Por último, el golimumab (Simponi®), una IgG1 humana de aproximadamente 150 kDa de peso molecular, está aprobado en la artritis reumatoide, la artritis psoriásica, la espondilitis anquilosante y la colitis ulcerosa.

Aun así, algunos inhibidores biológicos del TNF alfa aprobados se desvían de la estructura de inmunoglobulina de longitud completa. Por ejemplo, el etanercept (Enbrel®) es una proteína de fusión Fc de dominio extracelular del receptor 2 del TNF con un peso molecular de 150 kDa que se ha aprobado para el tratamiento de la artritis reumatoide, la artritis reumatoide juvenil, la artritis psoriásica, la psoriasis y la espondilitis anquilosante. Además, el certolizumab pegol (Cimzia®), un conjugado de Fab-PEG humanizado de aproximadamente 90 kDa, está aprobado y se usa ampliamente en el tratamiento de la enfermedad de Crohn y de la artritis reumatoide.

A pesar de los avances en el campo, sigue existiendo la necesidad de productos biológicos con una combinación óptima de características biofísicas. Por ejemplo, el tratamiento tópico de enfermedades de la piel, es decir, la aplicación tópica de inhibidores de TNF alfa sobre la piel, sería una vía de aplicación muy preferente ya que podrían evitarse los efectos secundarios del tratamiento sistémico. Sin embargo, hasta la fecha, tal tratamiento no es factible, entre otras cosas, ya que los inmunoterapéuticos aprobados actualmente son demasiado grandes y por lo tanto no pueden atravesar el estrato córneo de la piel y/o debido a los costos de producción del fármaco. El documento WO 2016/031013 A2 divulga anticuerpos scFv solubles que son específicos para el TNFa. El documento WO 2010/006454 A2 divulga polipéptidos terapéuticos tales como scFv. El documento WO 20 08/144753 A2 divulga anticuerpos y fragmentos de estos que tienen especificidad de unión por el TNFa. El documento WO 2011/084714 A2divulga moléculas de scFv anti-TNFa estabilizadas. El documento WO 2006/014477 A1divulga anticuerpos anti-TNFa de alta afinidad.

El papel clave del TNF alfa en la psoriasis y la artritis psoriásica está bien establecido (ver, por ejemplo, CORDORO, KM y FLEDMAN SR. Inhibidores de TNF-alpha inhibitors in dermatology. Skin Therapy Letter 2007, vol. 12, pp. 4-6). La psoriasis es una enfermedad frecuente con una prevalencia del 2-3 %. Mientras que las formas más leves pueden tratarse tópicamente con glucocorticoides y/o análogos de la vitamina D3, las formas más graves requieren un tratamiento sistémico que incluye ciclosporina, metotrexato o, finalmente, biológicos (Prieto-Pérez R. y otros, Pharmacogenomics. 2013 Oct; 14 (13): 1623-1634). La introducción de terapias biológicas para el tratamiento sistémico de la psoriasis grave que implican el uso de anticuerpos monoclonales dirigidos, por ejemplo, al TNF alfa (adalimumab, etanercept e infliximab) ha abordado sustancialmente la necesidad médica de los pacientes que padecen formas graves de psoriasis. Si bien son altamente efectivos, estos medicamentos se asocian con una serie de eventos adversos potencialmente graves y graves. Por lo tanto, el perfil beneficio/riesgo de estos fármacos excluye a la mayoría de los pacientes con psoriasis que presentan formas de psoriasis leves a moderadas. Los efectos secundarios podrían, por ejemplo, reducirse mediante la aplicación local de fármacos biológicos, es decir, la administración tópica. Sin embargo, debido a su gran tamaño, los anticuerpos de longitud completa no son adecuados para tal vía de administración.

La hidradenitis supurativa, también denominada acné inverso, es otro trastorno relacionado con el TNF alfa. Dicha enfermedad inflamatoria crónica se caracteriza por agrupaciones de abscesos en la piel de la glándula apocrina, como la axila, la parte interna de los muslos, la ingle y las nalgas (SCHEINFELD, N. Hidradenitis suppurativa: A practical review of possible medical treatments based on over 350 hidradenitis patients. Dermatol Online Journal 2013, vol 19, p.1.) Los inhibidores del TNF alfa se han usado con éxito en el tratamiento de dicha enfermedad huérfana (Brunasso AM, Massone C. Treatment of hidradenitis suppurativa with tumour necrosis factor-alpha inhibitors: An update on infliximab. Acta Derm Venereol. 2011, vol. 91(1), pp.70; Sotiriou E. y otros, Etanercept for the treatment of hidradenitis suppurativa, Acta Derm Venereol. 2009, vol. 89(1), pp. 82-3). Los anticuerpos dirigidos contra el TNF alfa también han sido eficaces en el tratamiento del pioderma gangrenoso, otra enfermedad cutánea huérfana (Reddick CL y otros Successful treatment of superficial pyoderma gangrenosum associated with hidradenitis suppurativa with adalimumab. Dermatol Online J. 2010, vol. 16(8), pp.15). Hasta la fecha, no se ha aprobado ningún fármaco biológico para el tratamiento de tales enfermedades huérfanas; sin embargo, los biológicos disponibles comercialmente se usan fuera de etiqueta.

Sumario

La presente invención se define en las reivindicaciones anexas. En un primer aspecto, se proporciona un miembro de unión para el TNF alfa. En algunas variantes el miembro de unión está humanizado y neutraliza la actividad del TNF alfa soluble. En algunas variantes el miembro de unión es una molécula proteínica de unión con funciones de tipo inmunoglobulina específicas para el TNF alfa. En algunas variantes el miembro de unión es una inmunoglobulina específica para el TNF alfa. En algunas variantes el miembro de unión es un fragmento de anticuerpo específico para el TNF alfa. En algunas variantes el miembro de unión es una inmunoglobulina de mamífero o un fragmento de esta. En algunas variantes el miembro de unión es una inmunoglobulina humanizada o un fragmento de esta. En algunas variantes el miembro de unión es una inmunoglobulina humana o un fragmento de esta.

En la presente divulgación, se proporciona un miembro de unión monovalente que inhibe el TNF alfa soluble con una potencia inferior a 50 picomolar (pM), de acuerdo con se determina al medir la concentración inhibidora media máxima IC⁵⁰con respecto a la inhibición del efecto biológico del TNF alfa humano soluble.

Un miembro de unión, en particular un fragmento de anticuerpo, humanizado o no, que tiene un valor de potencia en el intervalo pM es particular, y un elemento que no se obtiene de forma rutinaria. Esto es particularmente cierto para un fragmento de anticuerpo monovalente, que incluye solo una cadena ligera y pesada variable y, por lo tanto, carece de cualquier efecto de avidez de un anticuerpo bivalente que incluye dos cadenas ligeras y dos pesadas. Además, cuando se convierte un anticuerpo de longitud completa en un fragmento más pequeño, su potencia suele disminuir. Esto no solo se debe al cambio de valencia que lo acompaña (por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede ser solo monovalente mientras que una inmunoglobulina de longitud completa es bi o multivalente) sino que también puede deberse a razones estéricas.

En algunas variantes de la presente divulgación, el miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto incluye una secuencia de CDR definida por las SEQ ID NO: 3 a 8. El miembro de unión incluye en algunas variantes dos o más, preferentemente todas las secuencias de CDR del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3 a 8. El miembro de unión incluye una secuencia de CDR definida por la SEQ ID NO: 3. En algunas variantes el miembro de unión incluye una secuencia CDR definida por una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con la SEQ ID NO: 3. En algunas variantes el miembro de unión incluye una secuencia CDR definida por una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de aminoácidos con la SEQ ID NO: 3. El miembro de unión incluye una secuencia de CDR definida por la SEQ ID NO: 4. En algunas variantes el miembro de unión incluye una secuencia CDR definida por una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad de aminoácidos con la SEQ ID NO: 4. El miembro de unión incluye una secuencia de CDR definida por la SEQ ID NO: 5. En algunas variantes el miembro de unión incluye una secuencia CDR definida por una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con la SEQ ID NO: 5. En algunas variantes el miembro de unión incluye una secuencia CDR definida por una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad de aminoácidos con la SEQ ID NO: 5. En algunas variantes el miembro de unión incluye una secuencia CDR definida por una secuencia que tiene al menos 93 % de identidad de aminoácidos con la SEQ ID NO: 5. El miembro de unión incluye una secuencia de CDR definida por la SEQ ID NO: 6. En algunas variantes el miembro de unión incluye una secuencia CDR definida por una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con la SEQ ID NO: 6. En algunas variantes el miembro de unión incluye una secuencia CDR definida por una secuencia que tiene al menos un 88 % de identidad de aminoácidos con la SEQ ID NO: 6El miembro de unión incluye una secuencia CDR definida por la SEQ ID NO: 7. En algunas variantes el miembro de unión incluye una secuencia CDR definida por una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con la SEQ ID NO: 7. En algunas variantes el miembro de unión incluye una secuencia CDR definida por una secuencia que tiene al menos un 94 % de identidad de aminoácidos con la SEQ ID NO: 7. En algunas variantes el miembro de unión incluye una secuencia CDR definida por una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con la SEQ ID NO: 8. En algunas variantes el miembro de unión incluye una secuencia CDR definida por una secuencia que tiene al menos un 92 % de identidad de aminoácidos con la SEQ ID NO: 8. En algunas variantes el miembro de unión incluye tres o más secuencias del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3 a 8.

En algunas variantes el miembro de unión divulgado en la presente memoria incluye una secuencia de marco de cadena ligera variable que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1; y una secuencia de marco de cadena pesada variable que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 2. En algunas variantes el miembro de unión divulgado en la presente memoria incluye una secuencia de marco de cadena ligera variable que tiene al menos un 97 % de identidad con la SEQ ID NO: 1; y una secuencia de marco de cadena pesada variable que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 2. En algunas variantes el miembro de unión divulgado en la presente memoria incluye una secuencia de marco de cadena ligera variable que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1; y una secuencia de marco de cadena pesada variable que tiene al menos un 96 % de identidad con la SEQ ID NO: 2. El miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto comprende la cadena pesada variable como se establece en la SEQ ID NO: 2, y la cadena ligera variable como se establece en la SEQ ID NO: 1.

El miembro de unión es un fragmento variable de cadena única (scFv). El miembro de unión puede ser un fragmento variable de cadena única (scFv) que consiste esencialmente en la secuencia de la SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, el miembro de unión consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 9.

Los miembros de unión proporcionados en la presente memoria son muy estables, es decir, permanecen monoméricos y funcionalmente activos durante periodos de tiempo prolongados. Esto se aplica en particular a un fragmento de anticuerpo, y más particularmente a un scFv como es divulgado en la presente memoria. Los parámetros de estabilidad son factores cruciales para proporcionar un fármaco viable. Cuanto más estable sea un fármaco, mayor será la vida media en almacenamiento. Los anticuerpos inestables tienden a dimerizarse u oligomerizarse e incluso precipitar, lo que disminuye así la vida útil y finalmente se vuelven menos adecuados para aplicaciones farmacéuticas debido, por ejemplo, a una mayor inmunogenicidad. Un miembro de unión respectivo también permanece monomérico a altas concentraciones, con la ventaja de volúmenes de administración más pequeños.

Para determinadas indicaciones terapéuticas, un fragmento de anticuerpo ofrece ventajas en comparación con una inmunoglobulina de longitud completa, lo que puede atribuirse a su menor tamaño y a la falta de la región constante Fc de la inmunoglobulina. Por ejemplo, un scFv es capaz de penetrar el tejido de manera más eficiente debido a su pequeño tamaño. Además, muestra una retención disminuida en la circulación sistémica, ya que no es capaz de unirse a receptores Fc como FcRn, lo que eventualmente conduce a tasas de aclaramiento renal más altas. Estas características de buena penetración tisular, con posterior distribución uniforme en el tejido y una rápida eliminación de pequeños fragmentos de anticuerpos, como un scFv de la circulación sistémica, son particularmente ventajosas tanto para enfermedades crónicas locales/tópicas como para enfermedades sistémicas agudas. Sin embargo, esta utilidad práctica ha estado severamente limitada en el pasado por la baja estabilidad y baja potencia biológica de un scFv.

Un miembro de unión como se proporciona en la presente memoria ejerce una potencia inhibidora muy alta con respecto al TNF alfa humano. Un miembro de unión biológicamente muy potente es particularmente útil ya que permite, por ejemplo, la administración de pequeñas cantidades de fármaco al paciente, lo que disminuye así los costos globales del tratamiento. Además, se hace factible una neutralización más completa del objetivo molecular de la enfermedad.

Además, pueden imaginarse diferentes rutas de aplicación novedosas en modelos animales, así como en la terapia humana, cuando se aplican miembros de unión de mayor potencia. Por ejemplo, en cuanto a los fármacos aplicados tópicamente (por ejemplo, en la piel), aunque la eficacia de administración puede estar limitada debido a la función de barrera del estrato córneo y/u otras estructuras biológicas, la eficacia del tratamiento se restablece por la alta potencia de la cantidad por lo demás limitada de moléculas de fármaco que atraviesan tales barreras fisiológicas. A menudo, la gran cantidad de un fármaco menos potente que debe administrarse para lograr efectos farmacodinámicos similares a los de un fármaco más potente, se traduce en volúmenes de aplicación intravenosa o subcutánea mucho mayor. Tales volúmenes de aplicación más altos son desventajosos para el uso terapéutico en animales y seres humanos por dos razones: en primer lugar, la impracticabilidad de tratar pacientes con un gran volumen de fármaco y, en segundo lugar, los productos biológicos como una molécula de anticuerpo son caros por unidad de masa.

Las cantidades menores de fármaco necesarias para el tratamiento se traducen en menores costos de producción de los fármacos. En particular, los fragmentos de anticuerpos son susceptibles de costos de producción bajos ya que el uso de, por ejemplo, sistemas de cultivo de bacterias o levaduras generalmente resulta en costos más bajos en comparación con los sistemas de expresión de mamíferos, que se usan típicamente para la producción de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa. La combinación de cantidades más pequeñas del fármaco a administrar y los procedimientos de fabricación más baratos abre la posibilidad de medicamentos más rentables por paciente. Por tanto, un mayor número de pacientes puede beneficiarse de tal fármaco.

En un segundo aspecto, se proporciona una molécula de ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico codifica un miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto. La molécula de ácido nucleico generalmente contiene una secuencia que codifica el miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico consiste esencialmente en una secuencia que codifica el miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico consiste en una secuencia que codifica el miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto. En algunas realizaciones, la secuencia que codifica el miembro de unión está unida operativamente a una región reguladora tal como un promotor. La secuencia que codifica el miembro de unión se incluye en algunas realizaciones en un casete de expresión. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico aislada. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico se incluye en un vector.

En un tercer aspecto, se proporciona un vector que comprende la secuencia de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto. El vector contiene una secuencia que codifica el miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto. El vector puede contener una secuencia de acuerdo con el segundo aspecto.

En un cuarto aspecto, se proporciona una célula huésped. La célula huésped contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto. En algunas realizaciones, la célula huésped contiene un vector de acuerdo con el tercer aspecto.

En un quinto aspecto se proporciona una composición. Una composición respectiva puede contener el miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto, un vector de acuerdo con el tercer aspecto o una célula huésped de acuerdo con el cuarto aspecto. Una composición de este tipo incluye además un portador, diluyente o excipiente adecuado. Tal composición puede formularse para uso cosmético, diagnóstico o farmacéutico.

En la presente divulgación se proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad mediada por el TNF alfa. El procedimiento incluye administrar el miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto a un sujeto que necesite de este. El procedimiento generalmente incluye administrar a un sujeto que necesite de este una composición farmacéutica de acuerdo con el quinto aspecto. Normalmente, se administra una cantidad efectiva del miembro de unión durante un período de tiempo. Por tanto, puede administrarse repetidamente una cantidad efectiva del miembro de unión a un sujeto. Por tanto, puede administrarse una cantidad efectiva del miembro de unión a un sujeto en múltiples dosis. Cuando se administran múltiples dosis, la dosis puede ser constante durante toda la terapia. En algunas variantes la dosis puede cambiarse, como aumentar o disminuir, durante la terapia. En algunas variantes se administra una cantidad efectiva del miembro de unión en forma de dosis única. En algunas variantes una cantidad efectiva del miembro de unión se administra a un sujeto solo una vez.

En algunas variantes el procedimiento de acuerdo con la divulgación anterior incluye interrumpir la administración del miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto. En tales variantes, el procedimiento de acuerdo con el sexto aspecto puede incluir poner en contacto una muestra biológica con un miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto. La muestra biológica puede ser una muestra de fluido corporal. La muestra biológica también puede ser una muestra de biopsia. El contacto de la muestra biológica con el miembro de unión se realiza en condiciones permisivas para la unión específica del miembro de unión al TNF alfa. El procedimiento puede incluir además detectar si se ha formado un complejo entre el miembro de unión y el TNF alfa. En algunas variantes el procedimiento puede incluir medir la cantidad de complejo formado entre el miembro de unión y el TNF alfa. El procedimiento puede incluir cuantificar la cantidad de complejo formado entre el miembro de unión y el TNF alfa.

En algunas variantes la cantidad de complejo formado entre el miembro de unión y el TNF alfa se compara con un valor umbral. El procedimiento de acuerdo con la divulgación anterior puede incluir interrumpir la administración del miembro de unión y la composición farmacéutica, respectivamente, si se ha detectado una cantidad de complejo entre el miembro de unión y el TNF alfa por debajo del valor umbral. En algunas variantes el procedimiento de acuerdo con el sexto aspecto incluye controlar la cantidad de complejo formado entre el miembro de unión y el TNF alfa.

El procedimiento de acuerdo con la divulgación anterior puede incluir continuar la administración del miembro de unión y la composición farmacéutica, respectivamente, si se ha detectado una cantidad de complejo entre el miembro de unión y el TNF alfa que está en o por encima del valor umbral.

Un miembro de unión como es divulgado en la presente memoria puede, por ejemplo, usarse como fármaco. Un miembro de unión respectivo puede, por ejemplo, ser para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por el TNF alfa. En algunas realizaciones, un miembro de unión como es divulgado en la presente memoria se usa en diagnóstico. Un miembro de unión como es divulgado en la presente memoria también puede usarse en cosméticos. En algunas realizaciones, un miembro de unión como es divulgado en la presente memoria se usa con fines de detección. Un miembro de unión como es divulgado en la presente memoria puede usarse, por ejemplo, en un ensayo de unión.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, el miembro de unión es para uso médico. Dicho de otra manera, el miembro de unión puede ser para su uso como agente terapéutico. A este respecto, también se proporciona el uso de un agente aglutinante de acuerdo con el primer aspecto en la fabricación de un fármaco. En algunas realizaciones, el uso es el uso de un agente aglutinante de acuerdo con el primer aspecto en la fabricación de un fármaco para el tratamiento de una enfermedad mediada por el TNF alfa. A este respecto, también se proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad mediada por el TNF alfa. Se proporciona también un agente para el tratamiento de una enfermedad mediada por el TNF alfa. El agente incluye el miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto. El agente puede consistir esencialmente en el miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto.

Además, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto, un vector de acuerdo con el tercer aspecto o una célula huésped de acuerdo con el cuarto aspecto pueden usarse como fármaco. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto, un vector de acuerdo con el tercer aspecto o una célula huésped de acuerdo con el cuarto aspecto pueden, en algunas realizaciones, ser para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por el TNF alfa. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto, un vector de acuerdo con el tercer aspecto o una célula huésped de acuerdo con el cuarto aspecto pueden usarse en el diagnóstico. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto, un vector de acuerdo con el tercer aspecto o una célula huésped de acuerdo con el cuarto aspecto también pueden usarse en cosmética. En algunas realizaciones, se usa una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto, un vector de acuerdo con el tercer aspecto o una célula huésped de acuerdo con el cuarto aspecto con fines de detección. Por tanto, un miembro de unión divulgado en la presente memoria, o una molécula de ácido nucleico que codifica el mismo, un vector o célula huésped correspondiente, puede usarse en la producción de un fármaco útil en el tratamiento de una enfermedad mediada por el TNF alfa.

En la presente divulgación se proporciona un procedimiento para inhibir la interacción entre TNF alfa y TNF-R1 y/o TNF-R2. El procedimiento incluye la etapa de proporcionar el TNF alfa y el TNF-R1 y/o TNF-R2. El procedimiento incluye además la etapa de poner en contacto al TNF alfa con un miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto.

En la presente divulgación también se proporciona un procedimiento para inhibir la actividad biológica del TNF alfa. El procedimiento incluye la etapa de proporcionar el TNF alfa. El procedimiento también incluye la etapa de poner en contacto el TNF alfa con un miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto.

En un sexto aspecto, se proporciona un procedimiento de producción de un miembro de unión divulgado en la presente memoria. El procedimiento incluye cultivar una célula huésped de acuerdo con el cuarto aspecto. Por tanto, el procedimiento incluye permitir que se exprese el miembro de unión. De ese modo puede formarse una mezcla de reacción. El procedimiento también incluye recuperar el miembro de unión, por ejemplo, de una respectiva mezcla de reacción formada. En algunas realizaciones, el procedimiento incluye purificar el miembro de unión.

En algunas realizaciones, el procedimiento de acuerdo con el sexto aspecto puede incluir además al menos una etapa de síntesis química. La etapa de síntesis química puede ser, por ejemplo, una etapa de modificación del miembro de unión una vez que se ha obtenido. Un ejemplo ilustrativo es una modificación postraduccional tal como una glicosilación o una PEGilación. La PEGilación es la unión covalente de una o más moléculas de polietilenglicol (PEG). En algunas realizaciones, la etapa de síntesis química introduce un resto lipídico mediante unión covalente. En algunas realizaciones, la etapa de síntesis química introduce un resto de carbohidrato mediante unión covalente. En algunas realizaciones, la etapa de síntesis química introduce un resto detectable, como un radiomarcador. También puede introducirse un marcador detectable mediante unión covalente.

En un séptimo aspecto, se proporciona un procedimiento de producción de un miembro de unión como es divulgado en la presente memoria. El procedimiento incluye poner en contacto un sistema de expresión libre de células con un molde de producto de ácido nucleico. El molde de producto de ácido nucleico codifica el miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto. En algunas realizaciones, el procedimiento incluye proporcionar el sistema sin células. El procedimiento también puede incluir proporcionar el molde de producto de ácido nucleico. El procedimiento también incluye permitir que se produzca la transcripción y traducción del molde de producto de ácido nucleico. Como resultado, el procedimiento incluye permitir que se forme una mezcla de reacción. Además, el procedimiento incluye recuperar el miembro de unión de la mezcla de reacción.

En algunas realizaciones, el procedimiento de acuerdo con el séptimo aspecto incluye enriquecer el miembro de unión. En algunas realizaciones, el procedimiento de acuerdo con el séptimo aspecto incluye purificar el miembro de unión. En algunas realizaciones, el procedimiento de acuerdo con el séptimo aspecto incluye aislar el miembro de unión. En algunas realizaciones, el procedimiento incluye al menos una etapa de síntesis química. Por consiguiente, la producción del miembro de unión puede incluir una etapa de síntesis química.

En la presente divulgación se proporciona además un procedimiento para detectar la presencia de TNF alfa en una muestra biológica. El procedimiento puede ser un procedimiento in vivo o un procedimiento in vitro. El procedimiento incluye la etapa de poner en contacto la muestra biológica con un miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto. En algunas variantes el procedimiento incluye proporcionar un miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto. El contacto de la muestra biológica con un miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto se realiza en condiciones permisivas para la unión específica del miembro de unión al TNF alfa. El procedimiento incluye además la etapa de detectar si se ha formado un complejo entre el miembro de unión y el TNF alfa.

En algunas variantes el procedimiento de acuerdo con la divulgación anterior puede incluir evaluar la cantidad de complejo formado entre el miembro de unión y el TNF alfa. El procedimiento puede incluir cuantificar la cantidad de complejo formado entre el miembro de unión y el TNF alfa.

En el procedimiento de acuerdo con la divulgación anterior, la muestra biológica es generalmente una muestra de un sujeto. En algunas variantes la muestra biológica es una muestra de fluido corporal del sujeto. En algunas variantes la muestra biológica es una muestra de biopsia. Una muestra de líquido corporal es, en algunas variantes, una muestra de sangre. En algunas variantes una muestra de líquido corporal es una muestra de orina. En algunas variantes una muestra de líquido corporal es una muestra de líquido cefalorraquídeo. En algunas variantes una muestra de líquido corporal es una muestra de líquido sinovial. Una muestra de líquido corporal es, en algunas variantes, una muestra de linfa.

En algunas variantes el procedimiento de acuerdo con la divulgación anterior es un procedimiento de estratificación de un sujeto para la terapia de una enfermedad mediada por el TNF alfa. El procedimiento puede tomarse como un procedimiento para determinar si el sujeto responderá a la terapia de una enfermedad mediada por el TNF alfa mediante el uso del miembro de unión divulgado en la presente memoria. El procedimiento puede incluir comparar la cantidad de complejo formado entre el miembro de unión y el TNF alfa con un valor umbral. Una cantidad de complejo formado entre el miembro de unión y el TNF alfa que está en o por encima del valor umbral indica que el sujeto responderá a la terapia de una enfermedad mediada por el TNF alfa mediante el uso del miembro de unión. Una cantidad de complejo formado entre el miembro de unión y el TNF alfa que está por debajo del valor umbral indica que el sujeto no responderá a la terapia de una enfermedad mediada por el ^tN^falfa mediante el uso del miembro de unión.

De acuerdo con la presente divulgación, también se proporciona una combinación del miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto y una solución de TNF alfa de concentración conocida. Tal solución de TNF alfa puede servir para obtener una solución de referencia, por ejemplo, con fines de calibración. La combinación del miembro de unión y la solución de TNF alfa puede incluirse en un kit. La combinación del miembro de unión y la solución de TNF alfa puede definir un kit. El kit puede incluir dos recipientes, el primer recipiente que incluye el miembro de unión, el segundo recipiente que incluye la solución de TNF alfa. El kit también puede consistir esencialmente en el primer recipiente que incluye el miembro de unión y el segundo recipiente que incluye la solución de TNF alfa. En una variante, el kit consiste del primer recipiente, el segundo recipiente e instrucciones para su uso.

De acuerdo con la presente divulgación, también se proporciona una combinación del miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto y un reactivo de detección. El kit puede incluir dos recipientes, el primer recipiente que incluye el miembro de unión, el segundo recipiente que incluye el reactivo de detección. En algunas variantes el miembro de unión incluye un marcador detectable, como una enzima. El marcador detectable puede requerir la presencia de un reactivo. Como ejemplo ilustrativo, puede requerirse un sustrato enzimático, cuya conversión está siendo catalizada por la enzima. El sustrato enzimático puede generar, por ejemplo, un producto detectable. El reactivo respectivo, por ejemplo, un sustrato enzimático, puede incluirse en el segundo recipiente.

De acuerdo con un octavo aspecto, se proporciona un artículo de fabricación, que es un kit. Tal artículo de fabricación puede incluir el miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto junto con una combinación envasada de reactivos con instrucciones. El artículo de fabricación puede consistir esencialmente en el miembro de unión y una combinación envasada de reactivos con instrucciones. En una realización, el artículo de fabricación consiste del miembro de unión y una combinación envasada de reactivos con instrucciones.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A es un gráfico que muestra los resultados de la unión específica del scFv al TNF alfa humano recombinante (rh) en ELISA. Se añadieron scFv1 (círculo abierto) o scFv DLX105 (cuadrado abierto), que sirven como control positivo, al rhTNF alfa inmovilizado a diversas concentraciones. Los scFv unidos se detectaron mediante el uso de la proteína L-HRP. Se usó un scFv de especificidad diferente, y por tanto irrelevante (DLX1084) como control negativo (triángulo cerrado). La figura 1B muestra que todos los scFv inmovilizados en la placa de ELISA se replegaron adecuadamente y se reconocieron por la proteína L-HRP.

La figura 2 es un gráfico que muestra la inhibición de la citotoxicidad de la célula PK-15 mediada por el rhTNF alfa por scFv a concentraciones picomolares bajas. Se preincubaron diluciones en serie del scFv1 (círculo blanco) o el control positivo scFv DLX105 (cuadrado blanco) con el TNF alfa soluble, seguido de la incubación con las células PK-15.

La figura 3 es un gráfico que muestra la inhibición superior de la citotoxicidad de la célula PK-15 mediada por el TNF alfa soluble por el fragmento de anticuerpo scFv1 en comparación con otros antagonistas del TNF alfa del tipo IgG, disponibles comercialmente. Se preincubaron diluciones seriadas del scFv1 (círculo vacío), golimumab (triángulo relleno), adalimumab (cuadrado relleno) o infliximab (círculo relleno) con el TNF alfa soluble, seguido de incubación con células PK-15.

La figura 4 es un gráfico que muestra que el scFv1 se une y neutraliza la forma transmembrana (tm) del TNF alfa. La figura 4A representa el análisis de citometría de flujo del scFv1 (línea simple) y del control negativo scFv DLX1084 (histograma relleno) con células CHO que expresan el tmTNF alfa. La figura 4B representa la supervivencia celular en diluciones en serie del scFv1 (triángulo abierto), el control positivo scFv DLX105 (cuadrado abierto) y el control negativo scFv DLX1084 (triángulo relleno), que se incubaron con células CHO que expresan el tmTNF alfa, seguidas de la adición de células HEK-Dual sensibles al TNF alfa.

Descripción detallada

Para que las explicaciones sobre los miembros de unión, ácidos nucleicos, vectores, células huésped, composiciones, procedimientos y usos divulgados en la presente memoria puedan entenderse más fácilmente, se definen primero ciertos términos.

Definiciones

A menos que se defina de otra forma, todos los demás términos científicos y técnicos usados en la descripción, figuras y reivindicaciones tienen su significado ordinario como lo entiende comúnmente un experto en la técnica. Aunque los procedimientos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en la presente memoria pueden usarse en la práctica o en las pruebas de los miembros de unión, ácidos nucleicos, vectores, células huésped, composiciones, procedimientos y usos divulgados en la presente memoria, los procedimientos y materiales se describen más abajo. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias mencionadas en la presente memoria se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, que incluye las definiciones. Los materiales, procedimientos y ejemplos son solo ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes.

La palabra "aproximadamente" como se usa en la presente memoria se refiere a un valor que está dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular de acuerdo con lo determinado por un experto en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mide o se determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar dentro de una, o más de una desviación estándar, de acuerdo con la práctica en la técnica. El término "aproximadamente" también se usa para indicar que la cantidad o valor en cuestión puede ser el valor designado o algún otro valor que sea aproximadamente el mismo. La expresión pretende transmitir que valores similares promueven resultados o efectos equivalentes de acuerdo con la invención. En este contexto, "aproximadamente" puede referirse a un intervalo por encima y/o por debajo de hasta el 10 %. La palabra "aproximadamente" se refiere en algunas realizaciones a un intervalo por encima y por debajo de un cierto valor que es hasta el 5 %, tal como hasta el 2 %, hasta el 1 % o hasta el 0,5 % por encima o por debajo de ese valor. En una realización, "aproximadamente" se refiere a un intervalo de hasta un 0,1 % por encima y por debajo de un valor dado.

El término "administrar", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier modo de transferir, entregar, introducir o transportar materia tal como un compuesto, por ejemplo, un compuesto farmacéutico, u otro agente tal como un antígeno, a un sujeto. Los modos de administración incluyen administración oral, contacto tópico, administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intranasal o subcutánea (véase más adelante). La administración "en combinación con" una materia adicional tales como uno o más agentes terapéuticos que incluyen la administración simultánea (concomitante) y consecutiva en cualquier orden.

La palabra "ensayo", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un procedimiento, generalmente conocido en la técnica, para analizar una característica, por ejemplo, una actividad catalítica, la presencia, la formación o la cantidad de materia que se produce en una muestra biológica. Tal materia puede estar presente en un organismo vivo o representar un organismo vivo, como una proteína, un ácido nucleico, un lípido, una célula, un virus, un sacárido, un polisacárido, una vitamina o un ion, por nombrar algunos ejemplos. La palabra "ensayo" enfatiza que se sigue un cierto procedimiento o serie de procedimientos, que pueden tomarse para representar el ensayo respectivo. Un ensayo puede incluir reactivos cuantificados y protocolos establecidos para evaluar la presencia, ausencia, cantidad o actividad de una entidad biológica.

El término "ensayo de unión" generalmente se refiere a un procedimiento para determinar la interacción de la materia. Por tanto, pueden usarse algunas realizaciones de un ensayo de unión para determinar cualitativa o cuantitativamente la capacidad de la materia, por ejemplo, una sustancia, para unirse a otra materia, por ejemplo, una proteína, un ácido nucleico o cualquier otra sustancia. Algunas realizaciones de un ensayo de unión pueden usarse para analizar la presencia y/o la cantidad de materia en base a la unión de la materia a un reactivo tal como una pareja de unión que se usa en el procedimiento/ensayo. Como ejemplo ilustrativo, un ensayo de unión del TNF alfa puede incluir el uso de una pareja de unión tal como un miembro de unión divulgado en la presente memoria que se une específicamente al TNF alfa. Cuando un ensayo de unión se basa en el uso de una inmunoglobulina o una molécula proteínica de unión con funciones similares a las de las inmunoglobulinas como pareja de unión, tal procedimiento/procedimiento también puede denominarse "inmunoensayo". En este sentido, se entiende que las señales obtenidas de un inmunoensayo son resultado directo de complejos formados entre una o más inmunoglobulinas o moléculas proteínicas de unión con funciones similares a las inmunoglobulinas y el analito correspondiente, como el TNF alfa, que contiene el epítopo necesario(s) al que se unen las parejas de unión. Si bien tal ensayo puede detectar el analito de longitud completa y el resultado del ensayo puede expresarse como una concentración de un biomarcador de interés, la señal del ensayo es en realidad el resultado de todas esas moléculas "inmunorreactivas" presentes en la muestra. La cantidad y/o presencia de un analito también puede determinarse por medios distintos a un inmunoensayo, que incluye las mediciones de proteínas como las transferencias de puntos, las transferencias Western, los procedimientos cromatográficos, la espectrometría de masas y las mediciones de ácidos nucleicos tal como la cuantificación de ARNm.

Tal como se usa en la presente memoria, los términos "modificación conservadora" y "sustitución conservadora" se refieren a una modificación y una sustitución, respectivamente, que mantiene física, biológica, química o funcionalmente las propiedades con respecto a la referencia correspondiente. Una molécula que incluye una secuencia con sustitución conservadora, por ejemplo, tiene un tamaño, forma, carga eléctrica, propiedades químicas similares, que incluye una capacidad comparable para formar enlaces covalentes o de hidrógeno y/o una polaridad comparable. Tales modificaciones conservadoras incluyen, pero no se limitan a, una o más nucleobases y sustituciones, adiciones y eliminaciones de aminoácidos.

Por ejemplo, las sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen aquellas en las cuales el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos que no son esenciales con respecto a la unión a un antígeno pueden reemplazarse con otro residuo de aminoácidos de esta familia de cadenas laterales, por ejemplo, la treonina puede sustituirse por serina. Los residuos de aminoácidos generalmente se dividen en familias en base a propiedades comunes de la cadena lateral similares, tales como:

1. cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina),

2. cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, prolina, cisteína, triptófano),

3. cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina, prolina),

4. cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico),

5. cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y

6. cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Esta clasificación puede segmentarse adicionalmente. Como una orientación adicional, los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que normalmente pueden tomarse para definir sustituciones conservadoras entre sí:

1) Alanina (Ala), Glicina (Gly);

2) Ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu);

3) Asparagina (Asn), Glutamina (Gln);

4) Arginina (Arg), Lisina (Lys);

5) Isoleucina (Ile), Leucina (Leu), Metionina (Met), Valina (Val);

6) Fenilalanina (Phe), Tirosina (Tyr), Triptófano (Trp);

7) Serina (Ser), Treonina (Thr); y

8) Cisteína (Cys), Metionina (Met).

Puede considerarse que una sustitución conservadora es una sustitución de un primer aminoácido dentro de uno de los seis grupos anteriores por otro aminoácido dentro de este grupo de los seis grupos. Las sustituciones conservadoras son generalmente las siguientes sustituciones, enumeradas de acuerdo con el aminoácido que va a mutarse, cada una seguida de una o más sustituciones que pueden considerarse conservadoras: Ala ^ Gly, Ser, Val; Arg ^ Lys; Asn ^ Gln, His; Asp ^ Glu; Cys ^ Ser; Gln ^ Asn; Glu ^ Asp; Gly ^ Ala; His ^ Arg, Asn, Gln; Ile ^ Leu, Val; Leu ^ Ile, Val; Lys ^ Arg, Gln, Glu; Met ^ Leu, Tyr, Ile; Phe ^ Met, Leu, Tyr; Ser ^ Thr; Thr ^ Ser; Trp ^ Tyr; Tyr ^ Trp, Phe; Val ^ Ile, Leu. También se permiten otras sustituciones y pueden determinarse empíricamente o de acuerdo con otras sustituciones conservadoras o no conservadoras conocidas. Una sustitución conservadora también puede implicar el uso de un aminoácido no natural.

Las sustituciones no conservadoras, es decir, el intercambio de miembros de una familia por miembros de otra familia, pueden conducir a cambios sustanciales, por ejemplo, con respecto a la carga, momento dipolar, tamaño, hidrofilicidad, hidrofobicidad o conformación del miembro de unión, lo que puede conducir a una caída significativa en la actividad de unión, en particular si se ven afectados los aminoácidos que son esenciales para unirse a la molécula objetivo. Una sustitución no conservadora también puede implicar el uso de un aminoácido no natural.

Pueden introducirse modificaciones conservadoras y no conservadoras en los miembros de unión parentales mediante una variedad de técnicas estándares conocidas en la técnica, tales como química combinatoria, mutagénesis de ADN dirigida al sitio, mutagénesis de casete y/o mediada por PCR, síntesis química de péptidos/proteínas, reacción química que modifica específicamente grupos reactivos en el miembro de unión parental. Las variantes pueden probarse mediante procedimientos de rutina para determinar sus propiedades químicas, biológicas, biofísicas y/o bioquímicas. Preferentemente, la sustitución conservadora de aminoácidos no cambia sustancialmente las características funcionales y generalmente también estructurales de la secuencia parental. Por consiguiente, las características de unión de un miembro de unión que incluye una sustitución conservadora están al menos esencialmente inalteradas. Además, una sustitución conservadora de aminoácidos generalmente no modifica ni altera sustancialmente una estructura secundaria de la secuencia parental.

El término "marcador detectable" se usa en la presente memoria para referirse a cualquier sustancia cuya detección o medición, directa o indirectamente, por medios físicos o químicos, es indicativa de la presencia de una bioentidad objetivo seleccionada en una muestra. Los ejemplos representativos de marcadores detectables útiles incluyen, pero no se limitan a, moléculas o iones detectables directa o indirectamente en base a la absorbancia de luz, fluorescencia, reflectividad, dispersión de luz, fosforescencia o propiedades de luminiscencia, moléculas o iones detectables por sus propiedades o moléculas radiactivas o iones detectables por su resonancia magnética nuclear o propiedades paramagnéticas. En algunas realizaciones, un marcador detectable puede ser una molécula que puede detectarse indirectamente en base a la absorbancia de luz o fluorescencia, por ejemplo, varias enzimas que hacen que los sustratos apropiados se conviertan, por ejemplo, de moléculas que no absorben luz a moléculas que absorben la luz, o de moléculas no fluorescentes a fluorescentes.

Una "cantidad efectiva" o una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un elemento como un compuesto, que incluye un miembro de unión divulgado en la presente memoria, es una cantidad, ya sea como una dosis única o como parte de una serie de dosis, que en el régimen de dosificación aplicado produce el efecto terapéutico deseado, es decir, para alcanzar un determinado objetivo de tratamiento. Una cantidad terapéuticamente efectiva es generalmente una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de la afección patológica relevante, o para retrasar o minimizar uno o más síntomas asociados con la presencia de la condición. La dosis dependerá de varios factores, que incluyen factores clínicos y del paciente (por ejemplo, edad, peso, sexo, historial clínico del paciente, gravedad del trastorno y/o respuesta al tratamiento), la naturaleza del trastorno que se está tratando, la composición particular a administrar, la vía de administración y otros factores.

Un "epítopo" es antigénico y, por tanto, un epítopo también puede tomarse para definir una "estructura antigénica" o "determinante antigénico". Por tanto, un dominio de unión de una inmunoglobulina o de una molécula proteínica de unión con funciones de tipo inmunoglobulina es un "sitio de interacción antígeno". El término "sitio de interacción antígeno" define, de acuerdo con la presente memoria descriptiva, un motivo de un polipéptido, que es capaz de interactuar específicamente con un antígeno específico o un grupo específico de antígenos, por ejemplo, el TNF alfa en diferentes especies. Esta unión/interacción también se entiende que define un "reconocimiento específico". Un epítopo normalmente consiste en agrupaciones superficiales espacialmente accesibles de restos de una o más entidades químicas tales como cadenas polipeptídicas o mono o polisacáridos. Las agrupaciones superficiales que definen un epítopo pueden ser, por ejemplo, agrupaciones de aminoácidos o cadenas laterales de azúcar. Un epítopo normalmente tiene características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión al primero pero no al último se pierde en la presencia de disolventes desnaturalizantes.

El término "epítopo" también se refiere a un sitio en un antígeno tal como el TNF alfa, con el que una inmunoglobulina, un receptor de células T o una molécula proteínica de unión con funciones similares a las de las inmunoglobulinas forman un complejo. En algunas realizaciones, un epítopo es un sitio en una molécula contra el cual se producirá una inmunoglobulina o una molécula proteínica de unión con funciones de tipo inmunoglobulina y/o al que se unirá un anticuerpo. Por ejemplo, un epítopo puede ser reconocido por una inmunoglobulina o una molécula proteínica de unión con funciones similares a las de las inmunoglobulinas. El epítopo puede ser un "epítopo lineal", que es un epítopo donde una secuencia primaria de aminoácidos contiene el epítopo reconocido. Un epítopo lineal típicamente incluye al menos 3, y usualmente más, al menos 5 aminoácidos en una secuencia única. Un epítopo lineal puede incluir, por ejemplo, de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos en una secuencia única. El epítopo también puede ser un "epítopo conformacional", que, en contraste con un epítopo lineal, es un epítopo donde la secuencia primaria de los aminoácidos que incluye el epítopo no es el único componente definitorio del epítopo reconocido (por ejemplo, un epítopo en el que la secuencia primaria de aminoácidos no es necesariamente reconocida por el anticuerpo que define el epítopo). Normalmente, un epítopo conformacional incluye un mayor número de aminoácidos que un epítopo lineal. Con respecto al reconocimiento de epítopos conformacionales, una inmunoglobulina o una molécula proteínica de unión con funciones similares a las de las inmunoglobulinas reconoce una estructura en 3 dimensiones del antígeno, tal como un péptido o proteína, o un fragmento de un péptido o proteína. Como ejemplo ilustrativo, cuando una molécula de proteína se pliega para formar una estructura tridimensional, ciertos aminoácidos y/o la totalidad o partes de la cadena principal polipeptídica que forman el epítopo conformacional se yuxtaponen, lo que permite que un anticuerpo reconozca el epítopo. Los procedimientos para determinar la conformación de epítopos incluyen, pero no se limitan a, la cristalografía de rayos X, espectroscopía de resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones, marcaje de espín dirigido al sitio y espectroscopía de resonancia paramagnética electrónica.

Por el uso del término "enriquecido" en referencia a un polipéptido, un ácido nucleico o una célula se entiende que la célula o secuencia de aminoácidos/nucleótidos específica, que incluye la población celular, constituye una fracción significativamente mayor (2 - 5 veces) de las secuencias de aminoácidos totales o la secuencia de ácidos nucleicos presentes en la muestra de interés que en la fuente natural de la que se obtuvo la muestra. El polipéptido, un ácido nucleico o una célula también puede constituir una fracción significativamente mayor que en un organismo normal o enfermo o que en células normales o enfermas o en las células de las que se tomó la secuencia. Esto podría deberse a una reducción preferencial en la cantidad de otras secuencias de aminoácidos/nucleótidos o células presentes, o por un aumento preferencial en la cantidad de la secuencia de aminoácidos/nucleótidos o célula de interés específica, o por una combinación de los dos. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que enriquecido no implica que no haya otras secuencias de aminoácidos, secuencias de nucleótidos o células presentes. El término simplemente define que la cantidad relativa de la secuencia de interés se ha incrementado significativamente. El término significativo aquí se usa para indicar que el nivel de aumento es útil para la persona que logra tal aumento, y generalmente significa un aumento con respecto a otras secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos de aproximadamente al menos 2 veces, por ejemplo, al menos aproximadamente 5 a 10 veces o incluso más. El término está destinado a cubrir solo aquellas situaciones en las que el hombre ha intervenido para aumentar la proporción de la secuencia de aminoácidos, secuencia de nucleótidos o célula deseada.

Se entiende que el término "consiste esencialmente en" permite la presencia de componentes adicionales en una muestra o composición que no afectan las propiedades de la muestra o composición. Como ejemplo ilustrativo, una composición farmacéutica puede incluir excipientes si consiste esencialmente en un ingrediente activo.

Los términos "que expresa" y "expresión" en referencia a un biomarcador deben entenderse en el sentido corriente como se usa en la técnica. Una célula expresa un péptido/proteína mediante la transcripción de un ácido nucleico en ARNm, seguida de la traducción a un polipéptido, que se pliega y posiblemente se procesa adicionalmente. Por tanto, la afirmación de que una célula expresa un péptido/proteína implica que el péptido/proteína se ha sintetizado por la maquinaria de expresión de la célula respectiva.

El término "casete de expresión" se refiere a una secuencia codificante y un promotor, opcionalmente en combinación con una o más secuencias de control. Los casetes de expresión para enzimas incluyen, por ejemplo y sin limitación, una secuencia de control de inicio de la traducción.

El término "secuencia de control" se refiere a secuencias de ácido nucleico en un gen o casete de expresión que regulan la transcripción de una secuencia codificante y, por tanto, incluyen promotores, potenciadores, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias de inicio de la traducción.

Con respecto al procedimiento biológico respectivo en sí, los términos "expresión", "expresión génica" o "que expresa" se refieren a la totalidad de las vías reguladoras que convierten la información codificada en la secuencia de ácido nucleico de un gen primero en ARN mensajero (ARNm) y después a una proteína. Por consiguiente, la expresión de un gen incluye su transcripción en un ARNh primario, el procesamiento de este ARNh en un ARN maduro y la traducción de la secuencia de ARNm en la correspondiente secuencia de aminoácidos de la proteína. En este contexto, también se observa que el término "producto génico" se refiere no solo a una proteína, que incluye, por ejemplo, una proteína final (que incluye una variante de empalme de esta) codificada por ese gen y una proteína precursora respectiva cuando corresponda, sino también el ARNm respectivo, que puede considerarse como el "primer producto génico" durante el curso de la expresión génica.

Dentro del ámbito de la presente divulgación, el término "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina de longitud completa, así como a un fragmento de esta. Tal inmunoglobulina de longitud completa puede ser monoclonal, policlonal, quimérica, humanizada, recubierta o un anticuerpo humano. Un anticuerpo como es divulgado en la presente memoria puede estar glicosilado en algunas realizaciones. En algunas realizaciones, un anticuerpo como es divulgado en la presente memoria puede no estar glicosilado.

Por "fragmento" en referencia a un polipéptido tal como una inmunoglobulina o una molécula proteínica de unión se entiende cualquier secuencia de aminoácidos presente en un polipéptido correspondiente, siempre que sea más corta que la secuencia de longitud completa y siempre que sea capaz de realizar la función de interés de la proteína - en el caso de una inmunoglobulina que se une específicamente al objetivo deseado, por ejemplo, un antígeno (TNF alfa, por ejemplo). El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de una inmunoglobulina, a menudo la región hipervariable y porciones de las cadenas pesadas y ligeras circundantes que muestran afinidad de unión específica por un objetivo particular, típicamente una molécula. Una región hipervariable es una parte de una inmunoglobulina que se une físicamente al polipéptido objetivo. Por tanto, un fragmento de anticuerpo incluye o consiste de una o más porciones de una inmunoglobulina de longitud completa que retiene la especificidad de direccionamiento de la inmunoglobulina. Tal fragmento de anticuerpo puede, por ejemplo, carecer al menos parcialmente de la región constante (región Fc) de la inmunoglobulina de longitud completa. En algunas realizaciones, se produce un fragmento de anticuerpo por digestión de la inmunoglobulina de longitud completa. Un fragmento de anticuerpo también puede ser una construcción sintética o recombinante que contiene una o más partes de la inmunoglobulina o cadenas de inmunoglobulina (ver, por ejemplo, HOLLIGER, P. y Hudson, J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology 2005, vol. 23, no. 9, p. 1126 1136). Los ejemplos de un fragmento de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, un scFv, un Fab, un Fv, un Fab', un F (ab')²fragmento, un dAb, un VHH, un nanocuerpo, un V (NAR) o la denominada unidad mínima de reconocimiento.

Un "fragmento variable de cadena sencilla" o un "anticuerpo de cadena sencilla" o un "scFv" son ejemplos de un tipo de fragmento de anticuerpo. Un scFv es una proteína de fusión que incluye los dominios VH y VL de una inmunoglobulina conectados por un enlazador. Por tanto, carece de la región Fc constante que presenta una inmunoglobulina de longitud completa.

Un "miembro de unión", como se usa en la presente memoria, se refiere a una inmunoglobulina de longitud completa, un fragmento de anticuerpo, una plataforma proteínica no inmunoglobulínica y/u otro compuesto de unión, que tiene una función similar a la de las inmunoglobulinas. Normalmente, el miembro de unión es una molécula proteínica de unión. Tal miembro de unión puede ser monovalente o multivalente, es decir, tener uno o más sitios de unión a antígeno. Los ejemplos no limitantes de miembros de unión monovalentes incluyen el scFv, los fragmentos Fab, dAb, VHH, DARPins, filinas y nanocuerpos. Un miembro de unión multivalente puede tener dos, tres, cuatro o más sitios de unión a antígenos mediante los cuales pueden reconocerse uno o más antígenos diferentes. Las inmunoglobulinas de longitud completa, F(ab')²los fragmentos, bis-scFv (o scFv en tándem) y los diacuerpos son ejemplos no limitantes de miembros de unión multivalentes; en los miembros de unión multivalentes ejemplares, están presentes dos sitios de unión, es decir, el miembro de unión es bivalente.

En algunas realizaciones, el miembro de unión multivalente es biespecífico, es decir, el miembro de unión se dirige contra dos objetivos diferentes o dos sitios de destino diferentes en una molécula objetivo. Los anticuerpos biespecíficos se revisan, por ejemplo, en MULLER, D. y Kontermann, R.E. Bispecific antibodies. Edited by DÜBEL, S. Weinheim: Wiley-VCH, 2007. ISBN 3527314539. p. 345-378. En algunas realizaciones, el miembro de unión multivalente incluye más de dos, por ejemplo, tres o cuatro sitios de unión diferentes para tres o cuatro, respectivamente, antígenos diferentes. Tal miembro de unión es multivalente y multiespecífico, en particular tri o tetraespecífico, respectivamente.

Las "Plataformas sin anticuerpos" son polipéptidos de unión a antígeno que se describen, por ejemplo, en FIELDER, M. y Skerra, A. Non-antibody scaffolds. Edited by DÜBEL, S. Weinheim: Wiley-VCH, 2007. ISBN 3527314539. p.

467-500; o GILBRETH, RN y Koide, S. S. Structural insights for engineering binding proteins based on non-antibody scaffolds. Curr Opin Struct Biol 2012, vol. 22, p. 413-420. Los ejemplos no limitantes incluyen afficuerpos, moléculas de filina, una AdNectin, una muteína en base a un polipéptido de la familia de las lipocalinas (Anticalin®), una DARPin, Knottin, un dominio de tipo Kunitz, un Avimer, una tetranectina y un transcuerpo. Los Avimer contienen los llamados dominios A que ocurren como cadenas de múltiples dominios en varios receptores de la superficie celular (Silverman, J. y otros, Nature Biotechnology (2005) 23, 1556-1561). Las tetranectinas, derivadas de la proteína homotrimérica humana respectiva, también contienen regiones de bucle en un dominio de lectina de tipo C que puede modificarse para la unión deseada (ibid.).

Los "compuestos de unión" son moléculas químicas o biológicas que se unen a un objetivo y que no pertenecen a la clase de inmunoglobulinas de longitud completa, fragmentos de anticuerpos y plataformas sin anticuerpos como se definió anteriormente. Los ejemplos de compuestos de unión, sin limitarse a ellos, incluyen los macrólidos (GUNDLURU, MK y otros Design, synthesis and initial biological evaluation of a novel pladienolide analog scaffold. Medchemcomm. 2011, vol. 2, p. 904-908; PATERSON, I. y otros Total synthesis and biological evaluation of a series of macrocyclic hybrids and analogies of the antimitotic natural products dictyostatin, discodermolide and taxol. Chem Asian J. 2011, vol. 6, p. 459-473; MORITA, H. y otros Synthesis of unnatural alkaloid scaffolds by exploiting plant polyketide synthase. PNAS 2011, vol. 108, p. 13504-13509), polímeros impresos moleculares (HOSHINO, Y. y otros Recognition, neutralization and clearance of target peptides in the blood stream of living mice by molecular imprinted polymer nanoparticles: a plastic antibody. JAm Chem Soc, 2010, vol. 19, p. 664-6645), aptámeros (STREHLITZ, B. y otros Aptamers for pharmaceuticals and their application in environmental analytics. Bioanal Rev 2012, vol. 4, p. 1 30; YE, M. y otros Generating Aptamers by Cell-SELEX for Applications in Molecular Medicine. Int J Mol Sci 2012, vol. 13, p. 3341-3353), Spiegelmers (ver, por ejemplo, MAASCH, C. y otros Polyethylenimine-Polyplexes of Spiegelmer NOX-A50 directed against intracellular high mobility group protein A1 (HMGA1) reduce tumor growth in vivo. JBC 2010, vol. 285, p. 40012-40018), o péptidos (cíclicos o lineales; ver, por ejemplo, GOULD, A. y otros Cyclotides, a novel ultrastable polypeptide scaffold for drug discovery. Curr Pharm Des. 2011, vol. 17, p. 4294-4307). Los peptoides, que pueden actuar como ligandos de proteínas, son oligo (N-alquil) glicinas que se diferencian de los péptidos en que la cadena lateral está conectada al nitrógeno de la amida en lugar del átomo de carbono a. Los peptoides suelen ser resistentes a las proteasas y otras enzimas modificadoras y pueden tener una permeabilidad celular mucho mayor que los péptidos (ver, por ejemplo, Kwon, Y.-U. y Kodadek, T., J. Am. Chem. Soc. (2007) 129, 1508-1509).

Un miembro de unión como es divulgado en la presente memoria puede estar PEGilado o hiperglicosilado si se desea, ver también más abajo. En algunas realizaciones, un miembro de unión es una proteína de fusión de una de las moléculas proteínicas de unión ejemplares anteriores y un dominio de unión a albúmina, por ejemplo, un dominio de unión a albúmina de la proteína G estreptocócica. En algunas realizaciones, un miembro de unión es una proteína de fusión de un fragmento de inmunoglobulina, tal como un diacuerpo de cadena sencilla, y un dominio de unión a inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio de unión a inmunoglobulina bacteriana. Como ejemplo ilustrativo, un diacuerpo monocatenario puede fusionarse con el dominio B de la proteína A estafilocócica como es divulgado en Unverdorben y otros (Protein Engineering, Design & Selection [2012] 25, 81-88).

El "IC⁵⁰" o "concentración inhibidora semimáxima" es una medida de la potencia del antagonista y divulga cuantitativamente la eficacia de un compuesto para inhibir una función biológica o bioquímica. Por consiguiente, este valor indica qué cantidad de un determinado elemento, como un miembro de unión, se necesita para inhibir en un 50 % un determinado procedimiento o función biológica o bioquímica. Aunque no son un indicador directo de afinidad, los valores de IC⁵⁰y de la Kⁱestán correlacionados y pueden determinarse mediante la ecuación de Cheng-Prusoff (CHENG Y. y Prusoff W.H. Relationship between the inhibition constant (Ki) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (IC⁵⁰) of an enzymatic reaction. Biochem Pharmacol 1973, vol. 22, p. 3099-3108; RAMMES, G. y otros Identification of a domain which affects kinetics and antagonistic potency of clozapine at 5-HT3 receptors. PLO^sone 2009, vol. 4, p. 1-14; ZHEN, J. y otros Concentration of receptor and ligand revisited in a modified receptor binding protocol for high-affinity radioligands: [3H] spiperone binding to D2 and D3 dopamine receptors. J Neurosci Methods 2010, vol. 188, p. 32-38).

El término "marco" (FR) se refiere a la estructura del dominio de inmunoglobulina variable, ya sea la cadena ligera variable (VL) o la cadena pesada variable (VH), que incluye las respectivas CDR. Un marco VL y/o VH incluye típicamente cuatro secciones del marco, FR1, FR2, FR3 y FR4, flanqueando las regiones CDR. Por tanto, como se conoce en la técnica, una VL tiene la estructura general: (FR-L1) -(CDR-L1) -(FR-L2) -(CDR-L2) -(FR-L3) -(CDR-L3) -(FR-L4), mientras que un VH tiene la estructura general: (FR-H1) -(CDR-H1) -(FR-H2) -(CDR-H2) -(FR-H3) -(CDR-H3) -(FR-H4).

El término "CDR" se refiere a las regiones hipervariables del anticuerpo que contribuyen principalmente a la unión del antígeno. Normalmente, un sitio de unión a antígeno incluye seis CDR, incrustadas en una plataforma de estructura. En la presente memoria, las CDR de VL se denominan CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, mientras que las CDR de VH se denominan CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3. Estos pueden identificarse como es divulgado en KABAT, EA y otros Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5ta edición. Editado por U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES. NIH Publications, 1991. p. 91-3242. Sin embargo, el CDR-H1, como se usa en la presente memoria, difiere de la definición de Kabat en que comienza con la posición 27 y termina antes de la posición 36 (ver figura 5 para la ilustración).

Como se usa en la presente memoria, el sistema de numeración para identificar las posiciones de los residuos de aminoácidos en el VH y VL del anticuerpo corresponde al sistema "AHo" divulgado por HONEGGER, A. y Plückthun, A. Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: An automatic modelling and analysis tool. JMB 2001, vol. 309, p. 657-670. La publicación proporciona además las tablas de conversión entre el sistema AHo y el Kabat (KABAT, EA y otros Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th edition. Edited by U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES. NIH Publications, 1991. p. 91-3242).

Los anticuerpos "humanizados" se refieren a anticuerpos que incluyen una o más, típicamente las seis regiones CDR de un anticuerpo parental no humano o variantes de este o CDR sintéticas, y cuyo marco es, por ejemplo, (i) un marco humano, que incluye potencialmente uno o más residuos del marco del anticuerpo parental no humano, o (ii) un marco de un anticuerpo no humano modificado para aumentar la similitud con los marcos humanos producidos naturalmente. Methods of humanizing antibodies are known in the art, ver, por ejemplo, LEGER, O. y Saldanha, J. Antibody Drug Discovery. Edited by WOOD, C. London: Imperial College Press, 2011. ISBN 1848166281. p.1-23.

Los términos "inmunizar', "inmunización" o "inmunizar' se refieren a exponer el sistema inmunológico de un animal a un antígeno o a un epítopo de este como se ilustra con más detalle más abajo. El antígeno puede introducirse en el animal mediante el uso de una vía de administración deseada, como inyección, inhalación o ingestión. Tras una segunda exposición al mismo antígeno, se potencia la respuesta inmune adaptativa, en particular las respuestas de células T y células B.

El término "aislado" indica que una materia tal como un péptido o una molécula de ácido nucleico se ha eliminado de su entorno fisiológico normal, por ejemplo, una fuente natural, o que se sintetiza un péptido o ácido nucleico. El uso del término "aislado" indica que una secuencia de origen natural se ha eliminado de su entorno celular normal (es decir, cromosómico). Por tanto, la secuencia puede estar en una solución sin células o colocada en un entorno celular diferente. Por "aislado" en referencia a un polipéptido o molécula de ácido nucleico se entiende un polímero de aminoácidos (2 o más aminoácidos) o nucleótidos acoplados entre sí, que incluye un polipéptido o molécula de ácido nucleico que está aislado de una fuente natural o que se sintetiza. El término "aislado" no implica que la secuencia sea la única cadena de aminoácidos o de nucleótidos presente, sino que está esencialmente libre, por ejemplo, aproximadamente 90 - 95 % de pureza o más, de, por ejemplo, material sin aminoácidos y/o sin -material de ácido nucleico, respectivamente, asociado naturalmente con él.

El término "identidad", como se usa en la presente memoria, se refiere a la coincidencia de secuencias entre dos proteínas o ácidos nucleicos. Las secuencias de proteínas o ácidos nucleicos que se van a comparar se alinean para proporcionar la máxima identidad, por ejemplo, mediante el uso de herramientas bioinformáticas como EMBOSS Needle (alineación por pares; disponible en www.ebi.ac.uk). Cuando la misma posición en las secuencias a comparar está ocupada por la misma base nucleotídica o residuo de aminoácido, entonces las moléculas respectivas son idénticas en esa misma posición. Por consiguiente, el "porcentaje de identidad" es una función del número de posiciones coincidentes dividido por el número de posiciones comparadas y multiplicado por 100 %. Por ejemplo, si 6 de cada 10 posiciones de secuencia son idénticas, entonces la identidad es del 60 %. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de proteínas puede determinarse, por ejemplo, mediante el uso del algoritmo de Needleman y Wunsch (NEEDLEMAN, S.B. y Wunsch, C.D. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. JMB 1970, vol. 48, p. 443-453) que se ha incorporado en EMBOSS Needle, mediante el uso de una matriz BLOSUM62, una "penalización de apertura de espacio" de 10, una "penalización de extensión de espacio" de 0,5, una "penalización de espacio final" falsa, una "penalización de apertura de espacio final" de 10 y una "penalización de extensión del espacio final" de 0,5. Dos moléculas que tienen la misma secuencia de aminoácidos primarios o de ácidos nucleicos son idénticas independientemente de cualquier modificación química y/o biológica. Por ejemplo, dos anticuerpos que tienen la misma secuencia de aminoácidos primaria pero diferentes patrones de glicosilación son idénticos de acuerdo con esta definición. En el caso de ácidos nucleicos, por ejemplo, dos moléculas que tienen la misma secuencia, pero diferentes componentes de enlace, como el tiofosfato en lugar del fosfato, son idénticas de acuerdo con esta definición.

El término "molécula de ácido nucleico" como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier ácido nucleico en cualquier configuración posible, tal como monocatenario, bicatenario o una combinación de estos. Los ejemplos de ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN, moléculas de ARN, análogos del ADN o ARN generados mediante el uso de análogos de nucleótidos o mediante el uso de química de ácidos nucleicos, moléculas de ácido nucleico bloqueadas (LNA), moléculas de ácidos nucleicos de proteínas (PNA), moléculas de ácido nucleicos alquilfosfonato y alquilfosfotriéster y moléculas de tecto-ARN (por ejemplo, Liu, B. y otros, J. Am. Chem. Soc. (2004) 126, 4076-4077). El LNA tiene un esqueleto de ARN modificado con un puente de metileno entre C4' y O2', lo que proporciona a la molécula respectiva una mayor estabilidad dúplex y resistencia a nucleasas. Las moléculas de ácido nucleico de alquilfosfonato y alquilfosfotriéster pueden verse como una molécula de ADN o ARN, en la que los grupos fosfato de la cadena principal del ácido nucleico se neutralizan al intercambiar los grupos P-OH de los grupos fosfato en la cadena principal del ácido nucleico por un alquilo y por un grupo alcoxi, respectivamente. El ADN o ARN puede ser de origen genómico o sintético y puede ser mono o bicatenario. Tal ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ARNm, ARNc, ARN sintético, ADN genómico, ADN sintético de ADNc, un copolímero de ADN y a Rn , oligonucleótidos, etc. Un ácido nucleico respectivo puede contener además análogos de nucleótidos no naturales y/o estar ligado a una etiqueta o un marcador de afinidad.

Se conocen muchos análogos de nucleótidos y pueden usarse en ácidos nucleicos usados en los procedimientos divulgados en esta memoria descriptiva. Un análogo de nucleótido es un nucleótido que contiene una modificación en, por ejemplo, los restos de base, azúcar o fosfato. Como ejemplo ilustrativo, se sabe que una sustitución de residuos 2'-OH de ARNip por residuos 2'F, 2'O-Me o 2'H mejora la estabilidad in vivo del ARN respectivo. Las modificaciones en el resto de la base pueden ser una modificación natural o sintética de A, C, G y T/U, una base de purina o pirimidina diferente, como uracil-5-ilo, hipoxantina-9-ilo y 2-aminoadenina-9-ilo, así como una base de nucleótidos no purina o no pirimidina. Otros análogos de nucleótidos sirven como bases universales. Los ejemplos de bases universales incluyen 3-nitropirrol y 5-nitroindol. Las bases universales pueden formar un par de bases con cualquier otra base. Las modificaciones de base a menudo pueden combinarse con, por ejemplo, una modificación de azúcar, tal como, por ejemplo, 2'-O-metoxietilo, por ejemplo, para lograr propiedades únicas tales como una mayor estabilidad dúplex.

Como se usa en este documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a los compuestos, materiales, composiciones, portadores y/o formas de dosificación que, dentro del ámbito del criterio médico acertado, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica excesivas u otros problemas o complicaciones, proporcional a una relación beneficio/riesgo razonable.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero de residuos de aminoácidos y no se limitan a una cierta longitud mínima del producto. Cuando ambos términos se usan al mismo tiempo, esta doble denominación explica el uso de ambos términos uno al lado del otro en la técnica.

El término "prevenir" en el contexto médico/fisiológico, es decir, en el contexto de un estado fisiológico, se refiere a disminuir la probabilidad de que un organismo contraiga o desarrolle una afección anormal.

Se entiende que el término "purificado" es una indicación relativa en comparación con el entorno original de un miembro de unión, lo que representa una indicación de que el miembro de unión es relativamente más puro que en el entorno natural. Por lo tanto, incluye, pero no solo se refiere a, un valor absoluto en el sentido de pureza absoluta de otras moléculas proteínicas de unión con función similar a inmunoglobulina, inmunoglobulinas o fragmentos de anticuerpos. En comparación con el nivel original, el nivel después de purificar el miembro de unión será generalmente al menos 2-5 veces mayor (por ejemplo, en términos de mg/mL). Se contempla expresamente la purificación de al menos un orden de magnitud, tal como aproximadamente dos o tres órdenes, que incluyen, por ejemplo, aproximadamente cuatro o cinco órdenes de magnitud. Puede desearse obtener el miembro de unión al menos esencialmente libre de contaminación, en particular libre de otra materia proteínica, a un nivel funcionalmente significativo, por ejemplo, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o 99 % puro. Con respecto a otra materia, como una molécula de ácido nucleico, un péptido o una proteína, o una célula, lo anterior se aplica mutatis mutandis.

Las secuencias de proteínas "similares" son aquellas que, cuando se alinean, comparten residuos de aminoácidos similares y, más a menudo, pero no obligatoriamente, residuos de aminoácidos idénticos en las mismas posiciones de las secuencias a comparar. Los residuos de aminoácidos similares se agrupan en familias de acuerdo con las características químicas de las cadenas laterales. Estas familias se describen a continuación para "sustituciones conservadoras de aminoácidos". El "porcentaje de similitud" entre secuencias es el número de posiciones que contienen residuos idénticos o similares en las mismas posiciones de secuencia de las secuencias a comparar dividido por el número total de posiciones comparadas y multiplicado por 100 %. Por ejemplo, si 6 de 10 posiciones de secuencia tienen residuos de aminoácidos idénticos y 2 de 10 posiciones contienen residuos similares, entonces las secuencias tienen un 80 % de similitud. La similitud entre dos secuencias puede determinarse, por ejemplo, mediante el uso de EMBOSS Needle.

Se entiende que el término "específico" como se usa en la presente memoria indica que un miembro de unión está dirigido contra, se une o reacciona con un objetivo definido, tal como un TNF alfa. Por tanto, estar dirigido, unirse o reaccionar con incluye que el miembro de unión se una específicamente al TNF alfa. El término "específicamente" en este contexto significa que el miembro de unión reacciona con TNF alfa, o/y una porción de este, pero al menos esencialmente no con otra proteína. El término "otra proteína" incluye cualquier proteína, que incluye las proteínas estrechamente relacionadas o que son homólogas a, por ejemplo, el TNF alfa contra el que se dirige el miembro de unión. El término "no se une esencialmente" significa que el miembro de unión no tiene una afinidad particular por otra proteína, es decir, muestra una reactividad cruzada de menos de aproximadamente el 30 %, en comparación con la afinidad por el TNF alfa. En algunas realizaciones, el miembro de unión muestra una reactividad cruzada de menos de aproximadamente el 20 %, tal como menos de aproximadamente el 10 %. En algunas realizaciones, el miembro de unión muestra una reactividad cruzada de menos de aproximadamente 9, 8 o 7 %, cuando se compara con la afinidad por el TNF alfa. En algunas realizaciones, el miembro de unión muestra una reactividad cruzada de menos de aproximadamente 6 %, tal como menos de aproximadamente 5 %, en comparación con la afinidad por el TNF alfa. Si el miembro de unión reacciona específicamente como se define en la presente memoria anterior puede probarse fácilmente, entre otras cosas, al comparar la reacción de un miembro de unión respectivo con el TNF alfa, y la reacción del miembro de unión con (una) otra(s) proteína(s). El término "reconocer específicamente", que puede usarse indistintamente con los términos "dirigido a" o "reaccionando con", significa en el contexto de la presente divulgación que una molécula particular, generalmente una inmunoglobulina, un fragmento de inmunoglobulina o una molécula proteínica de unión con funciones de tipo inmunoglobulina son capaces de interactuar específicamente con y/o unirse a al menos dos, que incluye al menos tres, tales como al menos cuatro o incluso más aminoácidos de un epítopo como se define en la presente memoria. Generalmente, la inmunoglobulina o molécula proteínica de unión puede formar de ese modo un complejo con el epítopo respectivo de, por ejemplo, el TNF alfa. Tal unión puede ejemplificarse por la especificidad de un "principio de cerradura y llave". La "unión específica" también puede determinarse, por ejemplo, de acuerdo con una transferencia de Western, ELISA, RIA, ECL, IRMA, FACS, IHC y una exploración de péptidos.

Los términos "estratificar" y "estratificación" como se usan en la presente memoria indican que un individuo está asignado a un cierto grupo de acuerdo con características que coinciden con el grupo respectivo, tales como una probabilidad correspondiente de responder a un miembro de unión divulgado en la presente memoria. Los grupos pueden ser, por ejemplo, para probar, prescribir, suspender o abandonar un miembro de unión. Por consiguiente, en algunas variantes de un procedimiento o uso de acuerdo con la invención, un sujeto puede estratificarse en un subgrupo de un ensayo clínico de una terapia.

El término "sujeto" como se usa en la presente memoria, también tratado como un individuo, se refiere a un animal humano o no humano, generalmente un mamífero. Un sujeto puede ser una especie de mamífero como un conejo, un ratón, una rata, un conejillo de indias, un hámster, un perro, un gato, un cerdo, una vaca, una cabra, una oveja, un caballo, un mono, un simio o un humano. Por tanto, los procedimientos, usos y composiciones que se describen en la presente memoria son aplicables tanto a enfermedades humanas como veterinarias. Como se explica con más detalle a continuación, la muestra se ha obtenido del sujeto. Por tanto, se entiende que las conclusiones extraídas de los niveles de expresión en la muestra y las decisiones basadas en ellos se refieren al sujeto de quien/del que se ha tomado la muestra. Además, aunque un sujeto es típicamente un organismo vivo, un procedimiento o uso que se describe en la presente memoria también puede usarse en el análisis post-mortem. Cuando el sujeto es un ser humano vivo que recibe atención médica por una enfermedad o afección, también se le considera "paciente".

Los términos "tratamiento" y "tratar' como se usan en la presente memoria, se refieren a una medida profiláctica o preventiva que tiene un efecto terapéutico y que previene, ralentiza (disminuye) o al menos parcialmente alivia o anula una afección anormal, que incluye la patológica, en el organismo de un sujeto. El tratamiento de acuerdo con la presente divulgación implica la administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de una molécula como es divulgado en la presente memoria, es decir, entre otros, el miembro de unión (tal como un anticuerpo), ácido nucleico, vector o célula huésped divulgado en la presente memoria, a un sujeto que necesite de este para prevenir, curar, retrasar el inicio y/o progresión, reducir la gravedad de, estabilizar, modular, curar o mejorar uno o más síntomas de un trastorno relacionado con el TNF alfa. Normalmente, el miembro de unión, ácido nucleico, vector o célula huésped se proporciona en una composición farmacéutica que incluye las que se describen en la presente memoria. Aquellos que necesitan del tratamiento incluyen aquellos que ya están con el trastorno, así como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en los que el trastorno debe prevenirse (profilaxis). Generalmente un tratamiento reduce, estabiliza, o inhibe la progresión de un síntoma que está asociado con la presencia y/o progresión de una enfermedad o afección patológica. El término "administrar" se refiere a un procedimiento para incorporar un compuesto en células, fluidos corporales o tejidos de un sujeto. El término "efecto terapéutico" se refiere a la inhibición o activación de factores que causan o contribuyen a la afección anormal. Un efecto terapéutico alivia en cierta medida uno o más de los síntomas de una enfermedad o afección anormal. El término "afección anormal" se refiere a una función en las células o tejidos de un organismo que se desvía de sus funciones normales en ese organismo.

El término "unión específica de TNF alfa" como se usa en la presente memoria divulga que un miembro de unión se une al TNF alfa con mayor afinidad que a un antígeno estructuralmente diferente que no contiene el epítopo de TNF alfa al que se une el miembro de unión anti-TNF alfa. La unión específica se refleja mediante una constante de equilibrio de disociación (K^d) de menos de 1 micromolar. Esta constante puede determinarse, por ejemplo, mediante el uso de una microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) en un instrumento Attana, o la tecnología de resonancia de plasma superficial (SPR) en un instrumento BIACORE.

Como se usa en la presente memoria, "hTNF alfa" se refiere al TNF alfa humano e incluye el hTNF alfa natural y el rhTNF alfa. "rTNF alfa" se refiere a TNF alfa recombinante. El TNF alfa recombinante puede tener o no un residuo de metionina amino terminal, en dependencia del procedimiento mediante el cual se prepara. "rhTNF alfa" beta se refiere a TNF alfa humano recombinante. El rhTNF alfa puede obtenerse, por ejemplo, de Peprotech, EE. UU., núm. de cat. 300-01A. El TNF alfa también puede obtenerse mediante aislamiento de muestras biológicas de origen humano o no humano.

Una "variante" se refiere a una secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos que difiere de la secuencia parental en virtud de la adición (que incluye las inserciones), la eliminación y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos o nucleobases conservando al menos una actividad deseada de la secuencia parental divulgada en la presente memoria. En el caso de anticuerpos tal actividad deseada puede incluir la unión de antígenos específicos. De manera similar, una secuencia de ácido nucleico variante puede modificarse cuando se compara con la secuencia original en virtud de la adición, eliminación y/o sustitución de una o más bases nucleicas, pero el anticuerpo codificado retiene la actividad deseada como se describió anteriormente. Las variantes pueden ser de origen natural, tales como variantes alélicas o de empalme, o pueden construirse artificialmente.

Las reacciones de hibridación de ácidos nucleicos pueden realizarse en condiciones de diferente rigurosidad. Las "condiciones rigurosas" son ampliamente conocidas y publicadas en la técnica. Normalmente, durante la reacción de hibridación puede usarse un tampón basado en SSC en el que SSC es NaCl 0,15 M y tampón citrato 15 mM que tiene un pH de 7,0. El aumento de las concentraciones de tampón y la presencia de un agente desnaturalizante aumentan la rigurosidad de la etapa de hibridación. Por ejemplo, las condiciones de hibridación de alta rigurosidad pueden implicar el uso de (i) 50 % (vol/vol) de formamida, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), 0,1 % de sodio pirofosfato, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/ml), SDS al 0,1 % y sulfato de dextrano al 10 % a 42 °C con lavados a 42 °C en 0,2 x SSC y SDS al 0,1 %; (ii) 50 % (vol/vol) de formamida con 0,1 % de albúmina de suero bovino/0,1 % Ficoll/0,1 % polivinilpirrolidona/tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C, o (iii) Sulfato de dextrano al 10 %, 2 x SSC y formamida al 50 % a 55 °C, seguido de un lavado muy riguroso que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55 °C. Adicional o alternativamente, pueden incluirse uno, dos o más pasos de lavado mediante el uso de soluciones de lavado de baja fuerza iónica y alta temperatura en el protocolo de hibridación mediante el uso de, por ejemplo, cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecilsulfato de sodio 0,1 % a 50 °C.

El ámbito y significado de cualquier uso de un término será evidente a partir del contexto específico en el que se usa el término. Ciertas definiciones adicionales para los términos seleccionados que se usan a lo largo de este documento se dan en el contexto apropiado de la divulgación detallada, como corresponda.

Los términos "que comprende", "que incluye", "que contiene", "que tiene" etc. se leerán expansivamente o abierto y sin limitación. Los términos singulares tales como "un", "una" o "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra forma. Así, por ejemplo, la referencia a un "vector" incluye un solo vector, así como una pluralidad de vectores, ya sean iguales, por ejemplo, el mismo operón - o diferentes. De igual forma la referencia a una "célula" incluye una sola célula, así como una pluralidad de células. A menos que se indique de otra forma, el término "al menos" que precede a una serie de elementos debe entenderse que se refiere a todos los elementos de la serie. Los términos "al menos uno" y "al menos uno de' incluyen, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o cinco o más elementos. Además, se entiende que pueden usarse ligeras variaciones por encima y por debajo de los intervalos establecidos para lograr sustancialmente los mismos resultados que los valores dentro de los intervalos. Además, a menos que se indique de otra forma, la divulgación de intervalos está destinada a ser un intervalo continuo que incluye cada valor entre los valores mínimo y máximo.

Varios aspectos de la divulgación se describen en detalle adicional en las siguientes subsecciones. Se entiende que las diversas realizaciones, preferencias e intervalos pueden combinarse a voluntad. Además, en dependencia de la realización específica, las definiciones, realizaciones o intervalos seleccionados pueden no aplicarse.

Caracterización del miembro de unión/anticuerpo

El miembro de unión proporcionado en la presente memoria es en algunas variantes una molécula proteínica de unión específica para el TNF alfa. La molécula proteínica de unión generalmente tiene una función similar a la de las inmunoglobulinas. En algunas variantes el miembro de unión consiste esencialmente en una molécula proteínica de unión específica para el TNF alfa. En algunas variantes el miembro de unión incluye una molécula proteínica de unión específica para el TNF alfa. En algunas variantes el miembro de unión es un fragmento de anticuerpo específico para el TNF alfa. El miembro de unión consiste esencialmente en un fragmento de anticuerpo específico para el TNF alfa. En algunas variantes el miembro de unión incluye un fragmento de anticuerpo específico para el TNF alfa. En algunas variantes el miembro de unión es una molécula de inmunoglobulina de longitud completa específica para el TNF alfa. En algunas variantes el miembro de unión consiste esencialmente en una molécula de inmunoglobulina de longitud completa específica para el TNF alfa. En algunas variantes el miembro de unión incluye una molécula de inmunoglobulina de longitud completa específica para el TNF alfa. El miembro de unión es en algunas variantes una plataforma no inmunoglobulínica específica para el TNF alfa. La plataforma no inmunoglobulínica generalmente tiene una función similar a la inmunoglobulina. En algunas variantes el miembro de unión consiste esencialmente en una plataforma no inmunoglobulínica específica para el TNF alfa. En algunas variantes el miembro de unión incluye una plataforma no inmunoglobulínica específica para el TNF alfa.

El miembro de unión tiene una especificidad de unión al TNF alfa, es decir, se une específicamente al TNF alfa. El miembro de unión solo se une específicamente al TNF alfa, y no a ningún objetivo adicional. En algunas variantes el miembro de unión es biespecífico porque se une específicamente al TNF alfa, donde se une a dos epítopos diferentes. En algunas variantes el miembro de unión es biespecífico porque se une específicamente al TNF alfa, y además también a un objetivo adicional. En algunas variantes el miembro de unión es multiespecífico, es decir, se une específicamente al TNF alfa, y además también a más de un objetivo adicional. El miembro de unión es en algunas realizaciones un miembro de unión monovalente contra el TNF alfa. El miembro de unión se une al TNF alfa de una manera similar a una inmunoglobulina. En algunas variantes el miembro de unión es una inmunoglobulina o un fragmento de esta. El miembro de unión dirigido específicamente contra el TNF alfa se define generalmente mediante una única molécula. Tal molécula es típicamente proteínica. El miembro de unión puede tener una, dos o más cadenas. Cuando se incluye una pluralidad de cadenas en el miembro de unión, dos o más de tales cadenas pueden estar acopladas covalentemente o no covalentemente entre sí.

El miembro de unión, tal como el miembro de unión monovalente, inhibe el efecto biológico del TNF alfa humano soluble con un IC⁵⁰de menos de 50 pM. En algunas realizaciones la IC⁵⁰es inferior a aproximadamente 40 pM. La IC⁵⁰tiene en algunas realizaciones un valor de aproximadamente 30 pM o menos.

El miembro de unión monovalente es un fragmento de anticuerpo. Un fragmento de anticuerpo respectivo generalmente tiene un peso molecular de aproximadamente 60 kDa o menos. En algunas realizaciones el fragmento de anticuerpo tiene un peso molecular de aproximadamente 55 kDa o menos. En algunas realizaciones el peso molecular del fragmento de anticuerpo es de aproximadamente 50 kDa o menos. En algunas realizaciones el fragmento de anticuerpo tiene un peso molecular de aproximadamente 45 kDa o menos. En algunas realizaciones el peso molecular es de aproximadamente 40 kDa o aproximadamente de 35 kDa o menos. En algunas realizaciones el peso molecular del fragmento de anticuerpo es de aproximadamente 30 kDa o 25 kDa. En algunas realizaciones el fragmento de anticuerpo tiene un peso molecular de menos de 30 kDa o menos de 25 kDa. En algunas realizaciones el peso molecular del fragmento de anticuerpo es de aproximadamente 23 kDa o menos, o aproximadamente 24 kDa o menos. En algunas realizaciones el fragmento de anticuerpo tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kDa o menos, o aproximadamente 26 kDa o menos. En algunas realizaciones el peso molecular del fragmento de anticuerpo es de 27 kDa o menos.

En un aspecto, se proporciona un miembro de unión dirigido contra el TNF alfa. La especificidad de unión del miembro de unión puede verificarse mediante el uso de técnicas bien conocidas en la técnica. Se encuentra disponible una pluralidad de tecnologías de presentación convencionales para medir las características de unión de un miembro de unión, tal como una inmunoglobulina, un fragmento de inmunoglobulina o una molécula proteínica de unión. Li y otros (Organic & Biomolecular Chemistry (2006), 4, 3420-3426) han demostrado, por ejemplo, cómo puede obtenerse un fragmento Fv monocatenario capaz de formar un complejo con un adaptador de ADN seleccionado mediante el uso de la presentación en fagos. Las técnicas de presentación, por ejemplo, permiten la generación de inmunoglobulinas y ligandos diseñados con altas afinidades por una molécula objetivo seleccionada. Por tanto, también es posible la presentación de una serie de péptidos o proteínas que difieren solo ligeramente, típicamente mediante ingeniería genética. De este modo es posible cribar y posteriormente desarrollar proteínas o péptidos en términos de propiedades de interacción y parámetros biofísicos. Las rondas iterativas de mutación y selección pueden aplicarse en una base in vitro.

La tecnología in vitro de presentación para la selección de péptidos y proteínas se basa en un enlace físico entre el péptido o proteína y un ácido nucleico que codifica el mismo. Se ha establecido un gran panel de técnicas para este propósito, siendo las más usadas la presentación de fagos/virus, presentación de ribosomas, presentación de superficie celular, 'péptidos en plásmidos', presentación de ARNm, presentación de ADN y la compartimentación in vitro, que incluye la presentación de microperlas (para revisiones, ver, por ejemplo, Rothe, A. y otros, FASEB J. (2006) 20, 1599-1610; Sergeeva, A., y otros, Advanced Drug Delivery Reviews (2006) 58, 1622-1654).

También se encuentran disponibles diferentes medios para unir físicamente un péptido, que incluye una proteína, y un ácido nucleico. La expresión en una célula con una molécula de superficie celular, la expresión como un polipéptido de fusión con una proteína de cubierta viral/fago, un complejo in vitro estabilizado de una molécula de ARN, el ribosoma y el polipéptido respectivo, el acoplamiento covalente in vitro mediante una molécula de puromicina o mediante microperlas son ejemplos de formas de unir la proteína/péptido y el ácido nucleico actualmente usados en la técnica. Otra técnica de presentación se basa en una emulsión de agua en aceite. Las gotículas de agua sirven como compartimentos en cada uno de los cuales se transcribe y traduce un solo gen (Tawfik, DS y Griffiths, AD, Nature Biotech. (1998) 16, 652-656, Solicitud de patente estadounidense 2007/0105117). Este enlace físico entre el péptido que incluye la proteína y el ácido nucleico (que lo codifica) proporciona la posibilidad de recuperar el ácido nucleico que codifica el péptido/proteína seleccionado. En comparación con técnicas como la inmunoprecipitación, en las técnicas de presentación no solo pueden identificarse o seleccionarse las parejas de unión de una molécula objetivo seleccionada, sino que el ácido nucleico de esta pareja de unión se puede recuperar y usar para el procesamiento adicional. Las técnicas de presentación actuales proporcionan así medios para, por ejemplo, el descubrimiento de objetivos, el descubrimiento de líderes y la optimización de líderes. Pueden cribarse potencialmente a gran escala amplias bibliotecas de péptidos o proteínas, por ejemplo, anticuerpos.

El TNF alfa, al que se une específicamente el miembro de unión, es una citocina, que entre otros está implicada en la regulación de las células inmunitarias. El TNF alfa está involucrado en trastornos relacionados con el sistema inmunológico de un organismo, que incluyen los trastornos autoinmunitarios y los trastornos inmunomediados. El TNF alfa es en algunas realizaciones el TNF alfa humano, que existe como forma soluble y como forma de membrana. La forma de membrana tiene un dominio intracelular, un dominio transmembrana y un dominio extracelular. La forma soluble corresponde a las posiciones de aminoácidos 77 a 233 de los 233 aminoácidos de la forma de membrana. La forma de membrana del TNF alfa humano tiene el número de acceso Uniprot/Swissprot P01375 (versión 202 de 4 de marzo de 2015).

El TNF alfa de otras especies también existe en forma de molécula soluble y proteína transmembrana. Por ejemplo, el TNF alfa canino tiene una longitud de 233 aminoácidos, de los cuales el dominio extracelular se extiende desde los aminoácidos 57 a 233. La forma soluble abarca las posiciones de los aminoácidos 77 a 233 (véase Uniprot/Swissprot número de acceso P51742, versión 112 del 4 de marzo de 2015. En algunas realizaciones, el TNF alfa, al que se une específicamente el miembro de unión, es el TNF alfa murino, que tiene el número de acceso Uniprot/Swissprot P06804 (versión 167 del 4 de marzo de 2015). En algunas realizaciones, el TNF alfa, al que se une específicamente el miembro de unión, es el TNF alfa felino, que tiene el número de acceso Uniprot/Swissprot P19101 (versión 110 del 7 de enero de 2015). El TNF alfa, al que se une específicamente el miembro de unión, es en algunas realizaciones el TNF alfa bovino, que tiene el número de acceso Uniprot/Swissprot Q06599 (versión 129 del 4 de marzo de 2015). En algunas realizaciones el TNF alfa es el TNF alfa de cobaya, que tiene el número de acceso Uniprot/Swissprot P51435 (versión 106 del 4 de marzo de 2015). El TNF alfa es en algunas realizaciones el TNF alfa de perro, que tiene el número de acceso Uniprot/Swissprot P51742 (versión 112 del 4 de marzo de 2015). En algunas realizaciones el TNF alfa, al que se une específicamente el miembro de unión, es el TNF alfa de macaco rhesus, que tiene el número de acceso Uniprot/Swissprot P48094 (versión 108 del 4 de marzo de 2015).

El miembro de unión divulgado en la presente memoria puede, de acuerdo con las variantes siguientes, incluir al menos una de las secuencias CDR de VH CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 como se establece en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, o variantes de estas. En algunas realizaciones el miembro de unión incluye más de una de las secuencias CDR de VH CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, como se establece en las S^eQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, o variantes de estas. El miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto incluye todas las secuencias de CDR de VH CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, como se establece en las S^eQ ID ⁿO: 6, 7 y 8, respectivamente, o variantes de estas. De acuerdo con algunas variantes, el miembro de unión también puede incluir al menos una de las secuencias CDR de VL CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se establece en las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, o variantes de estas. En algunas realizaciones el miembro de unión incluye más de una de las secuencias CDR de VL CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se establece en las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, o variantes de estas. El miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto incluye todas las secuencias CDR de VL CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se establece en las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, o variantes de estas.

En algunas variantes de la presente divulgación el miembro de unión incluye al menos una de las secuencias de CDR de VH CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 como se establece en las SeQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, o variantes de estas, pero ninguna de las secuencias CDR VL CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se establece en las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, o variantes de estas. En algunas variantes de la presente divulgación el miembro de unión incluye al menos una de las secuencias de CDR de VH CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 como se establece en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, o variantes de estas, y al menos una de las secuencias CDR VL CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se establece en las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, o variantes de estas. En algunas variantes de la presente divulgación, el miembro de unión incluye todas las secuencias de CDR de VH CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 como se establece en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, o variantes de estas, y al menos una de las secuencias CDR VL CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se establece en las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, o variantes de estas. En algunas variantes de la presente divulgación el miembro de unión incluye al menos una de las secuencias de CDR de VH CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 como se establece en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, o variantes de estas, y todas las secuencias de VL CDR CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se establece en las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, o variantes de estas. El miembro de unión de acuerdo con el primer aspecto incluye todas las secuencias CDR de VH CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 como se establece en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, o variantes de estas, y todas las secuencias de VL CDR CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se establece en las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, o variantes de estas.

Tal miembro de unión es capaz de neutralizar el TNF alfa humano soluble con una IC⁵⁰de menos de 50 pM. En algunas realizaciones el miembro de unión es capaz de neutralizar el TNF alfa humano soluble con una IC⁵⁰de menos de aproximadamente 40 pM. En algunas realizaciones el miembro de unión es capaz de neutralizar el TNF alfa humano soluble con una IC⁵⁰de menos de aproximadamente 30 pM o menos.

La IC⁵⁰puede, por ejemplo, determinarse mediante el uso de un ensayo de potencia basado en células. En algunas realizaciones el valor de IC⁵⁰anterior se determina mediante la citotoxicidad inducida por el TNF alfa en células PK-15 en presencia de rhTNF alfa 1,4 pM. En realizaciones típicas, se usan aproximadamente 10 000 células y el miembro de unión se titula a 37 °C. Las células se incuban típicamente con la mezcla de miembro de unión y TNF alfa soluble durante 12 a 16 horas, en algunas realizaciones durante 16 horas. Preferentemente, el valor de IC⁵⁰es el valor medio obtenido de al menos tres repeticiones independientes de tal ensayo. En una realización, tal ensayo es el ensayo PK-15 divulgado en el Ejemplo 3.

El miembro de unión también puede ser capaz de neutralizar el TNF alfa humano transmembrana (tm) con una IC⁵⁰de menos de aproximadamente 100 nM. En algunas realizaciones, esta IC⁵⁰puede ser menor de aproximadamente 80 nM o de aproximadamente 75 nM. En algunas realizaciones el miembro de unión puede ser capaz de neutralizar el TNF alfa humano con una IC⁵⁰de menos de aproximadamente 70 nM. El miembro de unión también puede ser capaz de neutralizar el TNF alfa humano tm con una IC⁵⁰de menos de aproximadamente 65 nM o de aproximadamente 60 nM. En algunas realizaciones la IC⁵⁰puede ser inferior a aproximadamente 50 nM. En algunas realizaciones el miembro de unión puede ser capaz de neutralizar el TNF alfa humano con una IC⁵⁰de menos de aproximadamente 10 nM.

La IC⁵⁰para el tmTNF alfa puede, por ejemplo, medirse en un ensayo mediante el uso de células HEK-Dual TNF alfa sensibles estimuladas con células CHO que expresan el tmTNF alfa. Por ejemplo, tal ensayo es divulgado en detalle en el ejemplo 3. En un ejemplo típico, se usan 10.000 células CHO/pocillo que se han preincubado con el miembro de unión y 20.000 células/pocillo sensibles a HEK-Dual TNF alfa y se cultivan a 37 °C durante 24 horas.

Por tanto, en algunas realizaciones, se proporciona un miembro de unión con la condición de que es capaz de neutralizar el TNF alfa humano soluble en mayor medida que el TNF alfa transmembrana humano, donde el valor de IC⁵⁰del TNF alfa humano soluble es al menos 100 veces mejor que el valor de IC⁵⁰del TNF alfa transmembrana humano. Dicho de otra manera, el valor de IC⁵⁰de un miembro de unión respectivo para el TNF alfa humano soluble es 100 veces más bajo en comparación con el valor de IC⁵⁰de este miembro de unión para el TNF alfa transmembrana humano. Por tanto, el miembro de unión es mucho más efectivo para neutralizar el TNF alfa humano soluble que para neutralizar el TNF alfa transmembrana humano.

El miembro de unión divulgado en la presente memoria puede ser, por ejemplo, un anticuerpo (como una inmunoglobulina de longitud completa) o un fragmento de anticuerpo, como un Fab, Fab', F(ab')², scFv, fragmento Fv, nanocuerpo, VHH o unidad de reconocimiento mínima) o una plataforma sin anticuerpos.

El miembro de unión y en particular un miembro de unión monovalente como se describió anteriormente es un scFv. Los dominios VH y VL pueden conectarse en cualquier orientación, VL-enlazador-VH o VH-enlazador-VL, mediante un enlazador flexible. En una realización preferente, la orientación es VL-enlazador-VH, es decir, la región variable de la cadena ligera está en el extremo N-terminal y la región variable de la cadena pesada está en el extremo C-terminal del polipéptido.

En algunas realizaciones, el miembro de unión es un miembro de unión humanizado. En algunas realizaciones el miembro de unión es un anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo humanizado.

Un fragmento de anticuerpo como es divulgado en la presente memoria incluye una región de cadena pesada variable del subtipo VH3. En algunas variantes un anticuerpo y, en particular, un fragmento de anticuerpo como es divulgado en la presente memoria incluye una región de cadena ligera variable del subtipo Vkappal. En algunas variantes un anticuerpo y un fragmento de anticuerpo como es divulgado en la presente memoria incluyen tanto una región de cadena pesada variable del subtipo VH3 como una región de cadena ligera variable del subtipo Vkappal. En algunas variantes un anticuerpo y un fragmento de anticuerpo como es divulgado en la presente memoria incluye solo una región de cadena pesada variable del subtipo VH3, pero no una región de cadena ligera variable del subtipo Vkappal. En algunas variantes un anticuerpo y un fragmento de anticuerpo como es divulgado en la presente memoria incluye solo una región de cadena ligera variable del subtipo Vkappa1, pero no una región de cadena pesada variable del subtipo VH3.

También se proporcionan variantes de las secuencias divulgadas en la presente memoria. En algunas variantes la secuencia VH es una variante de la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. En algunas variantes la secuencia VH es una variante de la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. En algunas variantes la secuencia VH es una variante de la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. En algunas variantes la secuencia VH es una variante de la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos un 91 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. En algunas variantes la secuencia VH es una variante de la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos un 92 % o 93 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. En algunas variantes una variante respectiva de la SEQ ID NO: 2 tiene al menos un 93 % o 94 % de identidad con la SEQ ID NO: 2. En algunas variantes la secuencia VH es una variante de la SEQ ID NO: 2 y tiene al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. En algunas variantes la secuencia VH es una variante de la SEQ ID NO: 2 y tiene la identidad de secuencia del 100 % con la SEQ ID NO: 2.

Adicional o alternativamente, no abarcado por las reivindicaciones adjuntas, el miembro de unión divulgado en la presente memoria es un anticuerpo que incluye una variante de la secuencia VL de la SEQ ID NO: 1 que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En algunas variantes el anticuerpo o variante incluye una cadena ligera variable que incluye una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. En algunas variantes el anticuerpo o variante incluye una cadena ligera variable que consiste esencialmente en una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. En algunas variantes el anticuerpo o variante incluye una cadena ligera variable que consiste en una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. En algunas variantes el miembro de unión es un anticuerpo que incluye una variante de la secuencia VL de la SEQ ID NO: 1 que tiene un 91 % o más, que incluye un 92 % o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. En algunas variantes el miembro de unión es un anticuerpo que contiene una variante de la secuencia VL de la SEQ ID NO: 1 con una secuencia que tiene un 93 % o más, que incluye un 94 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 1. En algunas variantes el miembro de unión es un anticuerpo que contiene una variante de la secuencia VL de la SEQ ID NO: 1 que tiene un 95 % o más, que incluye un 96 % o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. En algunas variantes la secuencia VL es una variante de la SEQ ID NO: 1 y tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. En algunas variantes la secuencia VL es una variante de la SEQ ID NO: 1 y tiene un 97 % o más, que incluye un 98 % o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. En algunas variantes el miembro de unión es un anticuerpo que incluye una variante de la secuencia VL de la SEQ ID NO: 1 que tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En algunas variantes la secuencia VL es una variante de la SEQ ID NO: 1 y tiene la identidad de secuencia del 100 % con la SEQ ID NO: 1.

En una variante, tal anticuerpo incluye una secuencia VH que tiene un 85 % o más, como un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más y preferentemente un 100 % de similitud de secuencia con la SEQ ID NO: 2. Adicional o alternativamente, el anticuerpo incluye una secuencia VL que tiene un 85 % o más, como un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más, y preferentemente una similitud de secuencia del 100 % con la SEQ ID NO: 1.

El miembro de unión de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas incluye el VH como se establece en la SEQ ID NO: 1 y el VL como se establece en la SEQ ID NO: 2 o variantes de esta. Las secuencias marco de las SEQ ID NO: I y 2 se derivan de una inmunoglobulina humana que se describe en el documento WO 03/097697 A (ESBATech a G). Sus secuencias marco VH y VL se han modificado para la humanización y estabilización de anticuerpos de conejo, ver, por ejemplo, el documento WO 2009/155726 A (ESBATech, AN ALCON BIOMEDICAL RESEARCH UNIT LLC); BORRAS, L. y otros Generic approach for the generation of stable humanized single-chain Fv fragments from rabbit monoclonal antibodies. JBC 2010, vol. 285, no. 12, p. 9054-9066. Las variantes de las SEQ ID NO: 1, 2, I I o 12 deben permanecer estables en un formato scFv, es decir, permanecen monoméricos en un alto grado después de una incubación prolongada. Por ejemplo, "permanecer monomérico en un alto grado después de una incubación prolongada" como se usa en la presente memoria se refiere, por ejemplo, a un contenido de monómero de al menos el 80 % a 10 mg/mL en PBS pH 7,2 (solución salina tamponada con fosfato) a 4 °C, 22 °C o 37 °C después de 2 semanas de incubación.

El miembro de unión, que es un scFv, puede incluir una secuencia enlazadora. Tal secuencia enlazadora tiene típicamente de diez a aproximadamente 25 aminoácidos. Normalmente, tal péptido enlazador es rico en glicinas, que confieren flexibilidad, así como serinas y/o treoninas para mejorar la solubilidad. En una realización preferente, se usa un enlazador (GGGGS⁾⁴(SEQ ID NO: 10) o una variante de este. También pueden usarse variaciones de este motivo que tengan de tres a cinco repeticiones. Otros enlazadores adecuados se describen, por ejemplo, en ALFTHAN, K. Properties of a single-chain antibody containing different linker peptides. Prot Eng 1995, vol. 8, no. 7, p. 725-731.

Por tanto, en algunas realizaciones, el miembro de unión tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la SEQ ID NO 9. En algunas realizaciones el miembro de unión tiene una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en la SEQ ID NO 9. En una realización, el miembro de unión tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO 9.

En la presente divulgación se contemplan variantes del miembro de unión proporcionado en la presente memoria. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la unión al antígeno, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), para reducir la susceptibilidad a la proteólisis y/o la susceptibilidad a la oxidación, para aumentar la estabilidad o solubilidad, para disminuir la inmunogenicidad y/o alterar otras propiedades biológicas, bioquímicas o biofísicas del miembro de unión. En algunas variantes la variante no muestra ninguna mejora con respecto al miembro de unión principal. En algunas variantes una variante puede ser una molécula proteínica que difiere de un miembro de unión dado en una, dos o más posiciones de su secuencia de aminoácidos. Normalmente la diferencia con un miembro de unión dado es una sustitución. En algunas variantes la diferencia con un miembro de unión dado es una eliminación. Una variante puede ser una muteína, es decir, un péptido/proteína obtenido de la expresión de una secuencia genética alterada por mutagénesis específica de sitio.

Las variantes de los miembros de unión proporcionados en la presente memoria pueden prepararse mediante ingeniería de proteínas y/o química, al introducir modificaciones apropiadas en la secuencia de ácido nucleico que codifica el miembro de unión, o mediante síntesis de proteína/péptido. Puede obtenerse una variante mediante cualquier combinación o combinaciones de una o más eliminaciones, sustituciones, adiciones e inserciones en el marco o en las CDR, con la condición de que el miembro de unión generado posea las características deseadas para las que puede cribarse mediante el uso de procedimientos apropiados. En algunas variantes una variante de un miembro de unión difiere de una secuencia particular de un miembro de unión definido en la presente memoria por una o dos sustituciones. En algunas variantes una variante de un miembro de unión se diferencia de una secuencia particular de un miembro de unión definido en la presente memoria en hasta cinco sustituciones. Una sustitución en una secuencia de aminoácidos de un miembro de unión puede ser una sustitución conservadora como se describió anteriormente. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen:

1. Sustituir alanina (A) por valina (V);

2. Sustituir arginina (R) por lisina (K);

3. Sustituir asparagina (N) por glutamina (Q);

4. Sustituir ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E);

5. Sustituir cisteína (C) por serina (S);

6. Sustituir ácido glutámico (E) por ácido aspártico (D);

7. Sustituir glicina (G) por alanina (A);

8. Sustituir histidina (H) por arginina (R) o lisina (K);

9. Sustituir isoleucina (I) por leucina (L);

10. Sustituir metionina (M) por leucina (L);

11. Sustituir fenilalanina (F) por tirosina (Y);

12. Sustituir prolina (P) por alanina (A);

13. Sustituir serina (S) por treonina (T);

14. Sustituir triptófano (W) por tirosina (Y);

15. Sustituir fenilalanina (F) por triptófano (W);

y/o

16. Sustituir valina (V) por leucina (L)

y viceversa.

Las secuencias que se describen en la presente memoria pueden incluir una o más, como dos o tres de tales sustituciones conservadoras. En algunas variantes un miembro de unión divulgado en la presente memoria incluye una secuencia que tiene cuatro o más sustituciones conservadoras en comparación con una secuencia que se describe en la presente memoria. En algunas variantes un miembro de unión incluye una secuencia que tiene cinco o más sustituciones conservadoras. En algunas variantes un miembro de unión contiene seis o más, tales como siete o más sustituciones conservadoras con respecto a una secuencia divulgada en la presente memoria. En algunas variantes un miembro de unión puede incluir ocho, nueve, diez, once, doce o más de tales sustituciones conservadoras.

Las sustituciones no conservadoras pueden conducir a cambios más sustanciales, por ejemplo, con respecto a la carga, momento dipolar, tamaño, hidrofilicidad, hidrofobicidad o conformación del polipéptido. En una variante el miembro de unión incluye una o más, tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más de tales sustituciones no conservadoras.

Pueden estar presentes modificaciones en las CDR o en las secuencias marco. Por ejemplo, las CDR proporcionadas en la presente memoria pueden incluir una, dos, tres, cuatro, cinco o incluso más modificaciones. Por ejemplo, las secuencias de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 tomadas en su conjunto son 75 % o más, como 76 % o más, 77 % o más, 78 % o más, 79 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 91 % o más, 92 % o más, 93 % o más, 94 % o más, 95 % o más, 96 % o más, 97 % o más, 98 % o más, y preferentemente 99 % o más idénticas a las CDR proporcionadas en la presente memoria, en particular a (i) las SEQ ID NO: 3, 4 y 5. Adicional o alternativamente, las secuencias CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 tomadas en su conjunto son al menos un 80 %, como al menos 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 95 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o preferentemente un 99 % idénticas a las CDR proporcionadas en la presente memoria, en particular a (i) las SEQ ID NO: 6, 7 y 8. En una versión, el CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 tomados en su conjunto son al menos un 85 %, como el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o preferentemente 99 % similares a las CDR proporcionadas en la presente memoria. Adicional o alternativamente, el CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 tomados en conjunto son al menos un 85 %, como 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o preferentemente un 99 % similares a las CDR proporcionadas en la presente memoria.

Adicional o alternativamente, una variante puede incluir una o dos sustituciones en cualquiera de las secuencias la SEQ ID NO: 1 a 10. En algunas variantes una variante incluye tres sustituciones en cualquiera de las secuencias la SEQ ID NO: 1 a 10. En algunas variantes una variante incluye cuatro sustituciones en cualquiera de las secuencias la SEQ ID NO: 1 a 10.

Un tipo de variante es aquel en el que se reemplazan uno o más CDR completos. Normalmente, el CDR-H3 y CDR-L3 contribuyen de manera más significativa a la unión del antígeno. Por ejemplo, toda la CDR-L1, CDR-L2, CDR-H1 y/o CDR-H2 puede reemplazarse por una CDR diferente de origen natural o artificial. En algunas variantes una o más CDR se reemplazan por un casete de alanina.

Adicional o alternativamente, el VH del anticuerpo puede incluir una o más mutaciones puntuales potenciadoras de la solubilidad. El documento WO2009/155725 (ESBATech, una empresa de Novartis) describe un motivo, que ha demostrado aumentar la solubilidad general del anticuerpo. Los residuos se colocan en posiciones ubicadas en la interfaz del dominio variable y el dominio constante de un anticuerpo y estabilizan en particular fragmentos de anticuerpos tales como el scFv, que carecen del dominio constante. En particular, están presentes uno o dos de los siguientes residuos:

(i) serina (S) en la posición 12 del aminoácido de la cadena pesada (de acuerdo con la numeración AHo);

(ii) serina (S) o treonina (T) en la posición 103 del aminoácido de la cadena pesada (de acuerdo con la numeración AHo); y/o

(iii) serina (S) o treonina (T) en la posición 144 del aminoácido de la cadena pesada (de acuerdo con la numeración AHo).

En algunas variantes están presentes los tres de estos residuos.

En algunas variantes el anticuerpo tiene una serina en la posición 12 de la VH; una serina en la posición 103 de la VH; y una treonina en la posición 144 de la VH (todas las numeraciones AHo).

En algunas realizaciones, una variante de un miembro de unión como es divulgado en la presente memoria conserva, en comparación con el miembro de unión, la unión específica al TNF alfa. La variante puede, por ejemplo, conservar la unión específica al TNF alfa humano. En algunas realizaciones, un miembro de unión variante como es divulgado en la presente memoria tiene una potencia (IC⁵⁰) con respecto a la inhibición del efecto biológico del TNF alfa humano soluble inferior a aproximadamente 500 pM. En algunas realizaciones la potencia de la variante con respecto a la inhibición del efecto biológico del TNF alfa humano soluble es inferior a aproximadamente 400 pM. La IC⁵⁰de la variante, cuando se compara con el miembro de unión, en algunas realizaciones puede ser inferior a aproximadamente 300 pM, que incluye aproximadamente 200 pM, aproximadamente 100 pM o aproximadamente 50 pM. En una realización una variante de un miembro de unión tiene una potencia (IC⁵⁰) con respecto a la inhibición del efecto biológico del TNF alfa humano soluble inferior a aproximadamente 40 pM, en relación con el miembro de unión.

Una variante de un miembro de unión es en algunas realizaciones capaz de inhibir el TNF alfa transmembrana con una potencia (IC⁵⁰) de menos de aproximadamente 100 nM, preferentemente de aproximadamente 80 nM o menos. En algunas realizaciones una variante es capaz de inhibir el TNF alfa transmembrana con una potencia (IC⁵⁰) de aproximadamente 75 nM o menos. En algunas realizaciones una variante es capaz de inhibir el TNF alfa transmembrana con una potencia (IC⁵⁰) de aproximadamente 70 nM o menos, tal como aproximadamente 65 nM o menos. En algunas realizaciones una variante es capaz de inhibir el TNF alfa transmembrana con una potencia (IC⁵⁰) de aproximadamente 60 nM o menos.

En algunas realizaciones una variante de un miembro de unión tiene reacción cruzada con el TNF alfa humano y no humano. En algunas realizaciones una variante de un miembro de unión es capaz de unirse a la misma especie de TNF alfa que el miembro de unión (parental) se une a, por ejemplo, el TNF alfa de mono cynomolgus, canino, felino y/o macaco rhesus. En algunas realizaciones una variante de un miembro de unión compite con el miembro de unión divulgado en la presente memoria por la unión al TNF alfa. Una variante puede competir, por ejemplo, con el miembro de unión divulgado en la presente memoria por la unión al TNF alfa humano. En algunas realizaciones la variante es capaz de competir con el miembro de unión divulgado en la presente memoria por unirse al mismo TNF alfa no humano al que el miembro de unión es capaz de unirse.

En algunas realizaciones, un miembro de unión variante como es divulgado en la presente memoria conserva la unión específica al TNF alfa; tiene una potencia (IC⁵⁰) con respecto a la inhibición del efecto biológico del TNF alfa humano soluble inferior a aproximadamente 500 pM, tal como inferior a 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, preferentemente inferior a 40 pM; inhibe el TNF alfa transmembrana con una potencia IC⁵⁰de menos de 100 nM, preferentemente de menos de aproximadamente 80 nM, 75 nM, 70 nM, 65 nM o 60 nM; tiene reactividad cruzada con el TNF alfa humano y no humano y se une a la misma especie de TNF alfa al que el miembro de unión original se une, por ejemplo, el TNF alfa de mono cynomolgus, canino, felino y/o macaco rhesus; y compite con el miembro de unión divulgado en la presente memoria por unirse al TNF alfa, tal como TNF alfa humano y preferentemente al mismo TNF alfa no humano al que se unen los miembros de unión.

También pueden prepararse variantes mediante la mezcla de cadenas ligeras y pesadas. Puede combinarse una única cadena ligera con una biblioteca de cadenas pesadas para producir una biblioteca de variantes. En una variante, la cadena ligera única es seleccionada del grupo de secuencias VL enumeradas anteriormente y/o la biblioteca de cadenas pesadas incluye una o más de las secuencias VH enumeradas anteriormente. De la misma manera, una sola cadena pesada puede combinarse con una biblioteca de cadenas ligeras. En algunas variantes la cadena pesada única es seleccionada del grupo de secuencias VH enumeradas anteriormente y/o la biblioteca de cadenas ligeras incluye una o más de las secuencias VL enumeradas anteriormente.

Un miembro de unión de acuerdo con la presente divulgación puede incluir cualquiera de las secuencias VL y/o VH mencionadas anteriormente. Los miembros de unión que tienen un formato de dominio único, como un nanocuerpo o un VHH, incluyen solo una de las secuencias VL o Vh mencionadas anteriormente, preferentemente la secuencia VH y son monovalentes. Los miembros de unión multivalentes, como F (abólos fragmentos bis-scFv (también conocidos como scFv en tándem) o diacuerpos, en particular miembros de unión biespecíficos, pueden incluir una o más de las secuencias VL mencionadas anteriormente y/o una o más de las secuencias VH mencionadas anteriormente. Los miembros de unión multivalentes pueden incluir secuencias VH y/o VL que se dirigen a antígenos diferentes al TNF alfa.

Los miembros de unión divulgados en la presente memoria son particularmente estables. En particular los fragmentos de anticuerpos monovalentes divulgados en la presente memoria y los scFv divulgados en la presente memoria son particularmente estables. Como se usa en la presente memoria, el término "estabilidad" se refiere a la propiedad biofísica del polipéptido de permanecer monomérico en solución después de una incubación prolongada y/o incubación a temperatura elevada. Los polipéptidos inestables tienden a dimerizarse u oligomerizar e incluso precipitar, lo que disminuye así la vida útil y se vuelven menos adecuados para aplicaciones farmacéuticas.

Los miembros de unión proporcionados en la presente memoria y en particular el fragmento de anticuerpo monovalente anterior permanecen monoméricos al menos hasta el 75 %, preferentemente al menos hasta el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % y con la máxima preferencia al 97 % después de incubarse durante 1 semana a 37 °C a una concentración de 10 mg/mL en PBS a pH 7,2. Adicional o alternativamente, el miembro de unión proporcionado en la presente memoria y en particular el fragmento de anticuerpo monovalente anterior permanece monomérico al 90% o más después de 1 semana a 4 °C o 22 °C a una concentración de 10 mg/mL en PBS a pH 7,2. En algunas realizaciones el miembro de unión divulgado en la presente memoria permanece monomérico al 92 % o más, tal como al 94 % o más después de 1 semana a 4 °C o a 22 °C a una concentración de 10 mg/mL en PBS a pH 7,2. En algunas realizaciones el miembro de unión permanece monomérico al 95 % o más, como 96 % o más, o 97 % o más después de 1 semana a 4 °C o a 22 °C a una concentración de 10 mg/mL en PBS a pH 7,2. En una realización el miembro de unión permanece monomérico al 99 % o más después de 1 semana a 4 °C o a 22 °C a una concentración de 10 mg/mL en PBS a pH 7,2.

La fracción de monómeros puede determinarse, por ejemplo, mediante SE-HPLC (exclusión de tamaño -cromatografía líquida de alta resolución). Una fase móvil adecuada para tales pruebas es, por ejemplo, PBS pH 7,2. El contenido de monómero puede cuantificarse mediante la integración de picos de la señal UV280 medida durante la cromatografía de proteínas. Un sistema adecuado es, por ejemplo, un Dionex UltiMate 3000 RS HPLC controlado por el software Chromeleon® 6.5 que también permite el análisis cromatográfico posterior y la cuantificación de picos.

El miembro de unión, tal como un fragmento de anticuerpo monovalente, que incluye un scFv de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas, puede tener un punto isoeléctrico teórico (pl) en el intervalo de 5 a 10, preferentemente de 7 a 9. El pl teórico puede calcularse, por ejemplo, mediante el uso de la herramienta ProtParam en ExPASy Server (disponible en http://web.expasy.org/protparam/; ver también GASTEIGER E. y otros Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. (In) The Proteomics Protocols Handbook. Edited by WALKER J.M. Totowa: Humana Press Inc., 2005. ISBN 9781588295934. p. 571-607).

El miembro de unión, por ejemplo, el scFv de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas, puede concentrarse en PBS pH 7,2 a concentraciones superiores a 35 mg/mL, preferentemente superiores a 40 mg/mL, 45 mg/mL, 47 mg/mL, 48 mg/mL. ml, 49 mg/mL, con la máxima preferencia superior a 50 mg/mL. Cuanto más pueda concentrarse el miembro de unión, mayor será la solubilidad del miembro de unión.

El miembro de unión puede tener reactividad cruzada con el TNF alfa de especies no humanas, tales como, sin limitarse a, el TNF alfa felino, TNF alfa de macaco rhesus, TNF alfa canino. Esto es particularmente útil para propósitos de pruebas preclínicas, por ejemplo, estudios en animales. Preferentemente, el miembro de unión no presenta reactividad cruzada con la linfotoxina alfa2/beta1 humana, linfotoxina alfa1/beta2 humana, el ligando de CD40 humano/TNFSF5 y/o el TNFF beta/TNFSF1 humano.

Se proporciona también un miembro de unión que compite con un anticuerpo como es divulgado en la presente memoria, siendo el miembro de unión para unirse al TNF alfa humano. Por ejemplo, tal miembro de unión competitivo (o de bloqueo cruzado) puede ser neutralizante. En realizaciones típicas tal miembro de unión tiene una potencia IC⁵⁰de menos de 50 pM cuando se inhibe la citotoxicidad inducida por el rhTNF alfa soluble 1,4 pM en células PK-15.

Como se usa en la presente memoria, el término "competir" se refiere a la competencia entre miembros de unión para unirse al mismo objetivo. La competencia puede determinarse mediante ensayos de unión competitiva en los que el miembro de unión de interés previene o inhibe o reduce la unión específica de los miembros de unión divulgados en la presente memoria a un antígeno común (aquí, el hTNF alfa o un fragmento de este). Tales ensayos de unión competitivos son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitarse a ellos, el radioinmunoensayo directo o indirecto (RIA) en fase sólida e inmunoensayo enzimático directo o indirecto (EIA) en fase sólida. Normalmente, tal ensayo implica el uso del antígeno purificado unido a una superficie sólida, un miembro de unión a ensayar y el miembro de unión de referencia como es divulgado en la presente memoria. La inhibición competitiva se mide al determinar la cantidad de (i) el elemento de unión de referencia unido a la superficie sólida en presencia del elemento de unión a ensayar, o (ii) el elemento de unión a ensayar unido a la superficie sólida en la presencia del miembro de unión de referencia. Un miembro de unión competitivo puede unirse (i) al mismo epítopo que el miembro de unión de referencia, (ii) a un epítopo superpuesto, o (iii) a un epítopo diferente en la misma molécula objetivo, pero impidiendo estéricamente la unión del miembro de unión de referencia a su objetivo.

Normalmente, cuando un miembro de unión competitivo está presente en exceso, reducirá la unión específica del miembro de unión como es divulgado en la presente memoria al TNF alfa, es decir, bloquea la unión en forma cruzada, en un 40-45 % o más. Cuando está presente en exceso, un miembro de unión competitivo reducirá en algunas realizaciones la unión específica del miembro de unión al TNF alfa en un 45-50 % o más, tal como un 50-55 % o más, o un 55-60 % o más. En algunas realizaciones la unión de un miembro de unión en presencia del miembro de unión competitivo se reduce en un 60-65 % o más, 65-70 % o más, 70-75 % o más, o 75 % o más. Preferentemente, la unión de un miembro de unión divulgado en la presente memoria en presencia del miembro de unión competitivo se reduce en un 80-85 % o más. En algunas realizaciones la unión de un miembro de unión en presencia del miembro de unión competitivo se reduce en un 85-90 % o más, que incluye un 90-95 % o más. En algunas realizaciones la unión de un miembro de unión en presencia del miembro de unión competitivo se reduce en un 95-97 % o más. En algunas realizaciones la unión de un miembro de unión en presencia del miembro de unión competitivo se reduce en un 97 % o más.

En algunas realizaciones, el miembro de unión competitivo se une al hTNF alfa con una afinidad Kd de aproximadamente 1 pM o más. En algunas realizaciones, el miembro de unión competitivo se une al hTNF alfa con una K^dde aproximadamente 10 pM o más. En algunas realizaciones, el miembro de unión competitivo se une al hTNF alfa con una afinidad Kd de aproximadamente 100 pM o más, tal como 500 pM o más. El miembro de unión competitivo se une en algunas realizaciones al hTNF alfa con una Kd de aproximadamente 1 nM o más. En algunas realizaciones, el miembro de unión competitivo se une al hTNF alfa con una K^dde aproximadamente 10 nM o más.

Por tanto, en un aspecto, se proporciona un miembro de unión, que

(i) es capaz de unirse al TNF alfa soluble y transmembrana;

(ii) neutraliza el TNF alfa soluble con una CI⁵⁰de aproximadamente 30 ± 6 pM medido mediante la inhibición de la citotoxicidad inducida por rhTNF alfa 1,4 pM en células PK-15;

(iii) neutraliza el tmTNF alfa con una IC⁵⁰de aproximadamente 50 nM cuando se mide en células sensibles a HEK-Dual TNF alfa estimuladas con células CHO que expresan tm; y/o

(iv) tiene reactividad cruzada con el TNF alfa soluble humano, de macaco rhesus, mono cynomolgus, canino y felino. En una variante, el miembro de unión incluye al menos uno, tal como al menos CDR-L3 y CDR-H3, preferentemente todas las CDR como se establece en las la SEQ ID NO 3-8. En una realización, el miembro de unión es un scFv que incluye la SEQ ID NO: 9 y tiene además una o más características de

(v) ser estable al menos al 90 % a 4 °C y una concentración de 10 mg/mL en PBS pH 7,2 durante 6 meses; (vi) ser estable al menos al 95 % a 4 °C y una concentración de 10 mg/mL en PBS pH 7,2 durante 2 semanas; (vii) que tiene una Tm de 76 °C; y/o

(viii) que tiene un pI de 8,27.

En una variante, el miembro de unión divulgado en la presente memoria es monovalente, tal como un scFv o un fragmento Fab. En otra variante, el miembro de unión es multivalente. Tal molécula multivalente puede ser bivalente (como una inmunoglobulina de longitud completa o un fragmento de F(ab')²) o incluye al menos tres sitios de unión al objetivo.

El miembro de unión multivalente puede ser un anticuerpo biespecífico tal como un diacuerpo, un diacuerpo de cadena sencilla o un scFv en tándem (ver, por ejemplo, KONTERMANN, R.E. Methods in Molecular Biology. Edited by LO, B. Totowa, N.J.: Humana Press, 2004. ISBN 1588290921. p. 227-242). Un anticuerpo biespecífico respectivo bien puede usar enlazadores más cortos que los que se describen anteriormente para el scFv, es decir, que tiene solo de una a tres repeticiones del motivo básico de SEQ ID NO: 14 (ver, por ejemplo, HOLLIGER, P. y otros Diabodies: small bivalent and bispecific antibody fragments. PNAS 1993, vol. 90, no. 14, p. 6444-6448). En otra variante el miembro de unión multivalente es un triacuerpo, un minicuerpo o tetracuerpo.

En la presente divulgación también se proporcionan cuerpos T que incluyen un anticuerpo como es divulgado en la presente memoria. Los cuerpos T son receptores de células T de inmunoglobulina (cIgTCR) que combinan el reconocimiento de antígenos de anticuerpos con la señal y las propiedades efectoras del complejo receptor de células T. En tales construcciones, el anticuerpo es en algunas variantes un fragmento de anticuerpo tal como un Fv, un Fab, un scFv o un scFv-Fc. En una variante el anticuerpo es un scFv. Para una discusión adicional sobre el diseño general de los cuerpos T y sus aplicaciones, ver, por ejemplo, SCHIRRMANN, T. y Pecher, G. Handbook of Therapeutic Antibodies. Edited by DÜBEL, S. Weinheim: Wiley-VCH, 2009. ISBN 3527314539. p.533-561.

Un miembro de unión de acuerdo con la presente divulgación puede incluir en algunas realizaciones un resto de captura tal como una etiqueta de unión de estreptavidina, por ejemplo, el STREP-TAGS® divulgado en la solicitud de patente de EE. UU.US 2003/0083474, Patente de Estados Unidos 5.506.121o6,103,493. Los ejemplos adicionales de un resto de captura incluyen, pero no se limitan a, proteína de unión a maltosa, glutatión-S-transferasa (GST), péptido de unión a calmodulina (CBP), péptido FLAG (por ejemplo, de la secuencia Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Gly), el epítopo T7 (Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly), proteína de unión a maltosa (MBP), el epítopo de HSV de la secuencia Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp de la glicoproteína D del virus del herpes simple, el epítopo de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) de la secuencia Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys, el epítopo de hemaglutinina (HA) de la secuencia Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala y el epítopo "myc" del factor de transcripción c-myc de la secuencia Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu.

Un ejemplo de un resto de captura es un quelante de metales, que es capaz de unirse a un ion metálico. Un resto de captura respectivo puede ser etilendiamina, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), N,N-bis(carboximetil)glicina (también llamado ácido nitrilotriacético, NTA), ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético (BAPTA), 2,3-dimercapto-1-propanol (dimmercaprol), porfina o hemo. De acuerdo con el procedimiento estándar de cromatografía de afinidad de metales inmovilizados usado en la técnica, por ejemplo, una etiqueta de oligohistidina es capaz de formar un complejo con cobre (Cu2+), níquel (Ni2+), cobalto (Co2+), o zinc (Zn2+) iones, que pueden presentarse, por ejemplo, con fines cromatográficos mediante el quelante ácido nitrilotriacético (NTA).

Ácidos nucleicos, vectores, células huésped y procedimiento de producción.

Un miembro de unión como es divulgado en la presente memoria puede estar codificado por una única secuencia de ácido nucleico o en una variante por una pluralidad de secuencias de ácido nucleico. En el caso de una pluralidad de secuencias de ácido nucleico, cada secuencia puede codificar una región variable. En algunas variantes una secuencia de ácido nucleico puede codificar dos o más regiones variables. Generalmente, una pluralidad de secuencias de ácido nucleico codifica las regiones variables de un miembro de unión. Normalmente, cada región variable está codificada por una secuencia de ácido nucleico distinta. Las respectivas secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones variables pueden incluirse en una única molécula de ácido nucleico. En algunas variantes dos o más secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones variables se incluyen en una única molécula de ácido nucleico. En algunas variantes cada secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable se incluye en una única molécula de ácido nucleico distinta. Por consiguiente, puede usarse una pluralidad de moléculas de ácido nucleico en la producción de un miembro de unión, por ejemplo, cada una de las cuales codifica al menos una región variable. En algunas variantes una molécula de ácido nucleico respectiva puede definir un casete de expresión. Como se indicó anteriormente, un casete de expresión es una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos particular en una célula huésped apropiada.

Un casete de expresión incluye un promotor operativamente ligado a la secuencia de nucleótidos de interés, que está operativamente ligado a una o más señales de terminación. También puede incluir las secuencias requeridas para una adecuada traducción de la secuencia de nucleótidos. La región codificante puede codificar un polipéptido de interés y también puede codificar un ARN funcional de interés, que incluye, pero no se limita a, el ARN antisentido o un ARN no traducido, en la dirección sentido o antisentido. El casete de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérico, lo que significa que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. El casete de expresión también puede ser uno que es de origen natural pero que se ha obtenido en una forma recombinante útil para su expresión heteróloga. En algunas realizaciones, sin embargo, el casete de expresión es heterólogo con respecto al huésped; es decir, la secuencia de ácido nucleico particular del casete de expresión no se produce de forma natural en la célula huésped y se introdujo en la célula huésped o un antepasado de la célula huésped mediante un evento de transformación. La expresión de la secuencia de nucleótidos en el casete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible que inicia la transcripción solo cuando la célula huésped se expone a algún estímulo externo en particular. En el caso de un organismo multicelular tal como una planta o un animal, el promotor puede también ser específico para un tejido u órgano o etapa de desarrollo en particular.

Conociendo la secuencia del miembro de unión o de sus partes, los ADNc que codifican la secuencia polipeptídica pueden generarse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante síntesis génica. Estos ADNc pueden clonarse mediante técnicas estándar de clonación y mutagénesis en un vector adecuado, tal como un vector de expresión o un vector de clonación. Opcionalmente, la cadena ligera variable está codificada por un ácido nucleico separado de la cadena pesada variable del anticuerpo. Además, secuencias adicionales como una etiqueta (por ejemplo, una etiqueta de His), un dominio constante para la producción de un Fab o una inmunoglobulina de longitud completa, un enlazador, la secuencia codificante de una segunda especificidad de unión u otro polipéptido funcional como puede incluirse una enzima para generar una construcción de fusión o una molécula biespecífica en la construcción genética.

En base a la estrategia de clonación elegida, las construcciones genéticas pueden generar un miembro de unión que tiene uno o más residuos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal. Por ejemplo, una metionina N-terminal derivada del codón de inicio o una alanina adicional puede estar presente en un polipéptido expresado, a menos que se haya recortado postraduccionalmente. Por lo tanto, debe entenderse que los anticuerpos divulgados en la presente memoria incluyen las secuencias divulgadas en lugar de consistir en ellas. Por tanto, en una variante, el miembro de unión tiene la secuencia de la SEQ ID NO 9 o 19.

Los protocolos básicos de clonación estándar, mutagénesis y técnicas de biología molecular se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning, A Laboratory Manual (GREEN, M. y Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 4th edition. Cold Spring Harbor Laboratory, 2012. ISBN 1936113422.).

Las células huésped apropiadas para la expresión de las construcciones genéticas pueden ser procariotas o eucariotas. Las células huésped procariotas adecuadas son gramnegativas o grampositivas e incluyen especies de las familias Escherichia, Erwinina, Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonas o Bacillus. En algunas realizaciones, la célula huésped es Escherichia coli, tal como una o más cepas de E. coli BL21 (DE3) (Life Technologies™, núm. de cat. C6000-03) y Origami™ 2 (DE3) (Novagen, núm. de cat. 71345).

Si se desean modificaciones postraduccionales tales como glicosilación o fosforilación, puede ser ventajoso usar una célula huésped eucariota. Por ejemplo, los microbios eucariotas como las cepas de Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris comúnmente usadas pueden servir como célula huésped. Los ejemplos adecuados de una célula huésped también incluyen una célula vegetal o animal, en particular células de insecto o de mamífero. Las células de mamífero adecuadas incluyen, sin limitarse a, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionarias humanas (HEK), células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) o células de mieloma NS0.

El miembro de unión puede producirse mediante la expresión en una célula huésped adecuada. Por ejemplo, los vectores de expresión que se describen anteriormente se introducen en una célula huésped mediante técnicas estándar tales como electroporación o transformación química. A continuación, las células transformadas se cultivan en condiciones adecuadas para la expresión de proteínas recombinantes, típicamente en medios nutricionales apropiados, opcionalmente modificados para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar secuencias codificantes de interés. El miembro de unión se recupera del cultivo y opcionalmente se purifica mediante el uso de técnicas estándar en la técnica. El rendimiento de la proteína recombinante puede mejorarse al optimizar los medios y las condiciones de cultivo, como la temperatura o el suministro de oxígeno. En los procariotas, el miembro de unión puede producirse en el periplasma, intracelularmente como cuerpos de inclusión o secretarse al medio. Tras la recolección, la proteína puede purificarse mediante el uso de procedimientos bien conocidos en la técnica tales como filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, interacción hidrófoba, cromatografía de modo mixto y/o cromatografía de afinidad.

En una realización el miembro de unión se produce en un sistema sin células. Esto normalmente involucra la transcripción in vitro seguida de la traducción in vitro de los moldes de productos de ácido nucleico que codifican una proteína como es divulgado en la presente memoria, por ejemplo, el ADN plasmídico o moldes de productos de PCR. Por ejemplo, se usan lisados brutos de células en crecimiento, que proporcionan las enzimas necesarias, así como la maquinaria de síntesis de proteínas celulares. Los componentes básicos necesarios, como los aminoácidos o las nucleobases, así como las moléculas de suministro de energía y otros, pueden suministrarse de forma exógena. Los sistemas de expresión sin células pueden, por ejemplo, ser en base a reticulocitos lisados de conejo (por ejemplo, Rabbit Reticulcyte Lysate System, Promega, núm. de cat. L4540), células HeLa (por ejemplo, 1-Step Human In Vitro Translation Kit, Thermo Scientific, núm. de cat. 88881), células de insectos (por ejemplo, EasyXpress Insect Kit II, Qiagen, núm. de cat. 32561), gérmenes de trigo (por ejemplo, extracto de germen de trigo, Promega, núm. de cat. L4380) o células de E. coli (por ejemplo, kit de síntesis de proteínas in vitro PURExpress®, NEB, núm. de cat. E6800S). También, para la producción pueden usarse sistemas optimizados de expresión de anticuerpos libres de células para una generación mejorada de enlaces disulfuro. Los kits disponibles comercialmente incluyen los lisados de células de insectos (por ejemplo, EasyXpress Disulfide Insect Kit, Qiagen, núm. de cat. 32582) o lisados de células de E. coli (por ejemplo, EasyXpress Disulfide E. coli Kit, Qiagen, núm. de cat. 32572). La síntesis de proteínas libre de células tiene, por ejemplo, la ventaja de ser rápida, al lograr altos rendimientos de producto, lo que permite una fácil modificación de las condiciones de reacción, formando un bajo grado o incluso ningún subproducto. La síntesis de proteínas libre de células puede implicar etapas biológicas y/o químicas que no pueden realizarse en sistemas de producción puramente biológicos o químicos. Por ejemplo, los aminoácidos no naturales o modificados químicamente pueden incorporarse a la proteína en las posiciones deseadas. Las proteínas de fusión de la toxina scFv se han producido con éxito en sistemas libres de células (NICHOLLS, P.J. y otros Characterization of single-chain antibody (sFv)-toxin fusion proteins produced in vitro in rabbit reticulocyte lysate. JBC 1993, vol. 268, pp. 5302-5308). Por tanto, en una realización se proporciona un procedimiento de producción del miembro de unión divulgado en la presente memoria o el cuerpo T anterior, que incluye las etapas de (a) proporcionar un sistema libre de células, (b) proporcionar un molde de producto de ácido nucleico que codifica al unión miembro anterior o el cuerpo T anterior, (c) permitir la transcripción y traducción del molde de producto de ácido nucleico; (d) recuperarse; y opcionalmente (e) purificar el miembro de unión o el cuerpo T, respectivamente.

Adicional o alternativamente, un procedimiento de producción del miembro de unión divulgado en la presente memoria incluye al menos una etapa de síntesis química. Por ejemplo, el procedimiento puede ser completamente químico. En otra realización, los sistemas de producción basados en células o sin células que se describen anteriormente incluyen tal al menos una etapa de síntesis química.

En algunas realizaciones un miembro de unión como es divulgado en la presente memoria se produce en un sistema basado en células mediante el uso de un vector de expresión para la expresión intracelular en E. coli. Tras la expresión el polipéptido se genera como un cuerpo de inclusión dentro de la célula huésped que se separa de otras partículas celulares seguido de solubilización en un agente desnaturalizante tal como clorhidrato de guanidina (GndHCl) y se repliega mediante procedimientos de renaturalización bien conocidos por el experto.

El miembro de unión deseado también puede producirse en un animal transgénico. Puede obtenerse un animal transgénico adecuado de acuerdo con los procedimientos estándares, por ejemplo, al incluir las etapas de (i) fabricar el embrión transgénico, por ejemplo, al microinyectar construcciones de ^aDⁿque incluyen la secuencia codificante de los miembros de unión así como secuencias de control adecuadas en los óvulos; (ii) transferir los óvulos a hembras receptoras pseudoembarazadas; (iii) seguir la gestación o embarazo; y (iv) seleccionar un descendiente que exprese el anticuerpo deseado.

Debe entenderse que los ácidos nucleicos, los vectores, las células huésped y el procedimiento de producción que se describe anteriormente también se aplican a los miembros de unión (en la medida en que sean una proteína) y/o a los cuerpos T que se describen en la presente memoria.

Modificaciones químicas y/o biológicas

En un aspecto el miembro de unión divulgado en la presente memoria está modificado química y/o biológicamente. Tal modificación puede incluir, pero no se limita a, glicosilación, PEGilación, HESilación, tecnología de fusión de albúmina, PASilación, marcaje con colorantes y/o radioisótopos, conjugación con enzimas y/o toxinas, fosforilación, hidroxilación y/o sulfatación. De igual manera, cualquier miembro de unión, la secuencia de ácido nucleico, el vector y/o la célula huésped que se describen anteriormente pueden modificarse en consecuencia.

Pueden realizarse modificaciones químicas y/o biológicas para optimizar la farmacodinámica o la solubilidad en agua de la proteína o para reducir sus efectos secundarios. Por ejemplo, pueden aplicarse la PEGilación, PASilación y/o HESilación para ralentizar el aclaramiento renal y aumentar así el tiempo de semivida plasmática del miembro de unión. Adicional o alternativamente, una modificación puede añadir una funcionalidad diferente a la proteína, por ejemplo, una toxina para combatir más eficazmente las células cancerosas, o una molécula de detección con fines de diagnóstico.

La glicosilación se refiere a un procedimiento que une los carbohidratos a las proteínas. En los sistemas biológicos, este procedimiento se realiza enzimáticamente dentro de la célula como una forma de modificación cotraduccional y/o postraduccional. Una proteína, aquí el miembro de unión, también puede glicosilarse químicamente. Normalmente, pero sin limitarse a ello, la glicosilación está (i) N-unida a un nitrógeno de las cadenas laterales de asparagina o arginina; (ii) O-unido al hidroxi oxígeno de las cadenas laterales de serina, treonina, tirosina, hidroxilisina o hidroxiprolina; (iii) implica la unión de xilosa, fucosa, manosa y N-acetilglucosamina a una fosfoserina; o (iv) en forma de C-manosilación en la que se añade un azúcar manosa a un residuo de triptófano que se encuentra en una secuencia de reconocimiento específica. Los patrones de glicosilación pueden controlarse, por ejemplo, al elegir líneas celulares apropiadas, medios de cultivo, modos de fabricación de ingeniería de proteínas y estrategias de procedimiento (HOSSLER, P. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology 2009, vol. 19, no. 9, p. 936-949.).

La ingeniería de proteínas para controlar o alterar el patrón de glicosilación puede implicar la eliminación y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación. La creación de sitios de glicosilación puede realizarse convenientemente al introducir la secuencia de reconocimiento enzimático correspondiente en la secuencia de aminoácidos del miembro de unión o al añadir o sustituir uno o más de los residuos de aminoácidos enumerados anteriormente.

Puede ser deseable PEGilar el miembro de unión. La pegilación puede alterar las propiedades farmacodinámicas y farmacocinéticas de una proteína. El polietilenglicol (PEG) de un peso molecular apropiado se une covalentemente al esqueleto de la proteína (ver, por ejemplo, PASUT, G. y Veronese, F. State of the art in PEGylation: the great versatility achieved after forty years of research. J Control Release 2012, vol. 161, no. 2, p. 461-472). La PEGilación puede reducir adicionalmente la inmunogenicidad al proteger la proteína PEGilada del sistema inmunológico y/o alterar su farmacocinética mediante, por ejemplo, el aumento de la estabilidad in vivo del miembro de unión, la protección de la degradación proteolítica, lo que extiende su tiempo de vida media y mediante la alteración de su biodistribución.

Pueden conseguirse efectos similares mediante los miméticos de PEG, por ejemplo, a1HESilar o PASilar el anticuerpo. La HESilación usa derivados de hidroxietil almidón ("HES"), mientras que durante la PASilación el anticuerpo se une a secuencias polipeptídicas con alteraciones conformacionales compuestas por los aminoácidos prolina, alanina y serina. Estos miméticos de PEG y compuestos relacionados se describen, por ejemplo, en BINDER, U. y Skerra, A. Half-Life Extension of Therapeutic Proteins via Genetic Fusion to Recombinant PEG Mimetics, in Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives. Edited by KONTERMANN, R., Weinheim, Germany: Wiley-VCH, 2012. ISBN: 9783527328499. p. 63-81.

El miembro de unión puede incluir un epítopo tal como un epítopo de unión al receptor de rescate. Tal epítopo de unión al receptor de rescate se refiere típicamente a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) y tiene el efecto de aumentar la vida media in vivo de la molécula.

Adicional o alternativamente, el miembro de unión se marca o se conjuga con un segundo resto que atribuye funciones auxiliares después de la unión del objetivo. El segundo resto puede, por ejemplo, tener una función efectora inmunológica adicional, ser efectivo en el direccionamiento de fármacos o útil para la detección, sin estar limitado a ello. El segundo resto puede, por ejemplo, unirse químicamente o fusionarse genéticamente al miembro de unión mediante el uso de procedimientos conocidos en la técnica.

Las moléculas que pueden servir como segundo resto incluyen, sin limitarse a, un radionúclido, también llamado radioisótopo, una apoenzima, una enzima, un cofactor, un resto peptídico como una etiqueta HIS, una proteína, un carbohidrato como una etiqueta manosa-6-fosfato, un fluoróforo como el isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina, una proteína verde/azul/roja u otra fluorescente, aloficocianina (APC), un cromóforo, una vitamina como la biotina, un quelante, un antimetabolito como metotrexato, un liposoma, una toxina como un fármaco citotóxico o una radiotoxina. Ejemplos ilustrativos de un radionúclido son 35S,32P,14C,18F, y 125I. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, beta galactosidasa y angiogenina. Un ejemplo ilustrativo de una proteína adecuada es una lectina. Los ejemplos de fármacos citotóxicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, taxol, gramicidina D y colchicina.

Un miembro de unión marcado es particularmente útil para fines de detección o diagnóstico in vitro e in vivo. Por ejemplo, un miembro de unión marcado con un radioisótopo, enzima, fluoróforo o cromóforo adecuado puede detectarse mediante radioinmunoensayo (RIA), ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) o análisis de células individuales basado en citometría de flujo (por ejemplo, análisis FACS), respectivamente. De manera similar, los ácidos nucleicos y/o vectores divulgados en la presente memoria pueden usarse con fines de detección o diagnóstico, por ejemplo, mediante el uso de fragmentos marcados de estos como sondas en ensayos de hibridación. Los protocolos de marcado pueden encontrarse, por ejemplo, en JOHNSON, I. y Spence, M.T.Z. Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. Life Technologies, 2010. ISBN: 0982927916.

Debe entenderse que lo divulgado anteriormente también se aplica a los cuerpos T.

Composiciones

Puede proporcionarse un miembro de unión, una secuencia de ácido nucleico y/o un vector como es divulgado en la presente memoria en una composición que además incluye un portador, excipiente o diluyente adecuado. En realizaciones típicas una composición respectiva incluye un anticuerpo divulgado en la presente memoria.

Tal composición puede ser, por ejemplo, una composición de diagnóstico, cosmética o farmacéutica. Con fines terapéuticos o cosméticos, la composición es una composición farmacéutica que incluye un portador, excipiente o diluyente farmacéutico, es decir, que no es tóxica a las dosis y concentración empleadas.

El "portador", "excipientes" o "diluyentes" adecuados incluyen, sin limitarse a: (i) tampones tales como fosfato, citrato u otros ácidos orgánicos; (ii) antioxidantes tales como ácido ascórbico y tocoferol; (iii) conservantes tales como 3-pentanol, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, alcohol bencílico, alquil parabeno, catecol o ciclohexanol; (iv) aminoácidos, como, por ejemplo, histidina, arginina; (v) péptidos, preferentemente hasta 10 residuos tales como polilisina; (vi) proteínas, tales como albúmina de suero bovino o humano; (vii) polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; (viii) monosacáridos, disacáridos, polisacáridos y/u otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, sacarosa, manitol, trehalosa, sorbitol, aminodextrano o poliamidoaminas; (ix) agentes quelantes, por ejemplo, EDTA; (x) iones formadores de sal como sodio; (xi) complejos metálicos (por ejemplo, complejos Znproteína); y/o (xii) tensioactivos iónicos y no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Muchos de los compuestos ejemplares tienen diferentes funciones y pueden, por ejemplo, actuar como portador y como diluyente. También debe entenderse que la composición puede incluir más de uno de cada portador, diluyente o excipiente.

El miembro de unión, las secuencias de ácido nucleico o el vector pueden proporcionarse sobre materiales de soporte sólidos tales como perlas y micropartículas. Normalmente, una molécula miembro de unión se une a tal portador mediante un enlace covalente (que implica opcionalmente un enlazador), un enlace no covalente o ambos. Las perlas y micropartículas pueden incluir, por ejemplo, almidón, celulosa, poliacrilato, poliglicolato de poliacetato, poli (lactida-co-glicólido), látex o dextrano.

En una realización, se proporciona una composición farmacéutica, que incluye el miembro de unión, las secuencias de ácido nucleico o el vector como se describió anteriormente. La composición puede incluir además uno o más compuestos terapéuticamente activos adicionales en una cantidad terapéuticamente efectiva. En algunas realizaciones el compuesto terapéuticamente activo adicional es un compuesto activo contra una enfermedad mediada por el TNF.

Aplicaciones terapéuticas

Una molécula como es divulgada en la presente memoria, en particular el miembro de unión, la molécula de ácido nucleico o el vector, es útil como fármaco. Normalmente, tal fármaco incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula como se proporciona en la presente memoria. Por consiguiente, puede usarse una molécula respectiva para la producción de un fármaco útil en el tratamiento de uno o más trastornos relacionados con el TNF alfa.

En un aspecto, se proporciona un procedimiento para tratar un trastorno relacionado con el TNF alfa. El procedimiento incluye las etapas de administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de una molécula como es divulgado en la presente memoria, a un sujeto que necesite de este. En una realización, se administra al sujeto la composición farmacéutica que se describe anteriormente, que incluye tal cantidad farmacéuticamente efectiva del miembro de unión. El fármaco mencionado anteriormente puede administrarse a un sujeto.

El sujeto que necesita un tratamiento puede ser un ser humano o un animal no humano. Normalmente el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ratón, una rata, un conejo, un hámster, un perro, un gato, un mono, un mono, una cabra, una oveja, un caballo, un pollo, un conejillo de indias o un cerdo. En realizaciones típicas, al sujeto se le diagnostica un trastorno relacionado con el TNF alfa o puede adquirir dicho trastorno. En el caso de un modelo animal, el animal podría ser modificado genéticamente para desarrollar un trastorno relacionado con el TNF alfa. En un modelo animal un animal también puede modificarse mediante ingeniería genética de tal manera que muestre las características de una enfermedad mediada por el TNF alfa.

Se conocen diversos trastornos relacionados con el TNF alfa, en los que un antagonista del TNF alfa ha mostrado un efecto terapéutico. En algunas realizaciones, el trastorno relacionado con el TNF alfa es la retinopatía diabética proliferativa (LIMB GA y otros Distribution of TNF alpha and its reactive vascular adhesion molecules in fibrovascular membranes of proliferative diabetic retinopathy. Br J Ophthalmol. 1996 Feb; 80(2):168-73). En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es al menos uno de entre artritis gotosa, artritis gotosa aguda y artritis gotosa crónica (TAUSCHE AK y otros, Severe gouty arthritis refractory to anti-inflammatory drugs: treatment with anti-tumour necrosis factor alpha as a new therapeutic option. Ann Rheum Dis. 2004 Oct;63 (10): 1351-2). El trastorno relacionado con el TNF alfa es en algunas realizaciones el síndrome de Schnitzler. En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es la artritis idiopática juvenil sistémica (KOTANIEMI K y otros, Long-term efficacy of adalimumab in the treatment of uveitis associated with juvenile idiopathic arthritis. Clin Ophthalmol. 2011;5:1425-9, Epub 2011 3 de octubre). En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es la artritis reumatoide (PARAMESWARAN, N. y PAIAL S. Tumor Necrosis Factor-a Signaling in Macrophages. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 2010; vol. 20(2), pp. 87-103). El trastorno relacionado con el TNF alfa también puede ser urticaria (SAND FL y ThOMSEN SF. TNF-Alpha Inhibitors for Chronic Urticaria: Experience in 20 Patients. J Allergy (Cairo). 2013;2013:130905. Publicación electrónica del 18 de septiembre de 2013). En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es vasculitis (CHUNG SA y SEO P. Advances in the use of biologic agents for the treatment of systemic vasculitis. Curr Opin Rheumatol. 2009 Jan;21(1):3-9). En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es la diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2. El trastorno relacionado con el TNF alfa es en algunas realizaciones la osteomielitis multifocal recurrente. En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es la policondritis recidivante (CARTER JD. Treatment of relapsing polychondritis with a TNF antagonist. J Rheumatol. 2005 Jul;32(7):1413). El trastorno relacionado con el TNF alfa es en algunas realizaciones el síndrome periódico asociado a la criopirina (CAPS). En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es la enfermedad de Behget (PERRA D y otros Adalimumab for the treatment of Behget's disease: experience in 19 patients. Rheumatology (Oxford). 2012 Oct;51(10):1825-31. Epub 201220 de junio). En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es la fiebre mediterránea familiar. El trastorno relacionado con el TNF alfa también puede ser la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es la polimialgia reumática. En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa se basa en una o más mutaciones de la proteína 3 que contiene los dominios NACHT, LRR y PYD (NALP3). En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es el pioderma gangrenoso (PATEL F y otros Effective Strategies for the Management of Pyoderma Gangrenosum: A Comprehensive Review. Acta Derm Venereol. 2014 Nov 12). El trastorno relacionado con el TNF alfa es, en algunas realizaciones, la urticaria idiopática crónica. En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es la psoriasis (ver, por ejemplo, CORDORO, KM y FLEDMAN SR. TNF-alpha inhibitors in dermatology. Skin Therapy Letter 2007, vol. 12, pp. 4-6). En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es la osteoartritis. En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es la degeneración macular húmeda relacionada con la edad. En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es el síndrome del ojo seco. El trastorno relacionado con el TNF alfa es en algunas realizaciones el síndrome de sinovitis-acné-pustulosis-hiperostosis-osteítis. En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es el síndrome de activación de macrófagos. En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es la fiebre periódica (Di Gangi M y otros Long-term efficacy of adalimumab in hyperimmunoglobulin D and periodic fever syndrome. Isr Med Assoc J. 2014 Oct;16(10):605-7). El trastorno relacionado con el TNF alfa es en algunas realizaciones la adenitis. En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es la faringitis o el síndrome de úlcera aftosa. El trastorno relacionado con el TNF alfa es en algunas realizaciones la enfermedad de Still del adulto. El trastorno relacionado con el TNF alfa también puede ser la deficiencia de mevalonato quinasa. En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es la uveítis (KOTANIEMI K y otros, Long-term efficacy of adalimumab in the treatment of uveitis associated with juvenile idiopathic arthritis. Clin Ophthalmol. 2011;5:1425-9. Epub 2011 3 de octubre). En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es una enfermedad inflamatoria intestinal (PARAMESWARAN, N. y PAIAL S. Tumor Necrosis Factor-a Signaling in Macrophages. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 2010; vol. 20(2), pp. 87-103). El trastorno relacionado con el TNF alfa es en algunas realizaciones la aterosclerosis (PARAMESWARAN, N. y PAIAL S. Tumor Necrosis Factor-a Signaling in Macrophages. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 2010; vol. 20(2), pp. 87-103). En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es el síndrome periódico asociado al receptor de TNF (TRAPS). En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es la espondilitis anquilosante (PARAMESWARAN, N. y PAIAL S. Tumor Necrosis Factor-a Signaling in Macrophages. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 2010; vol. 20(2), pp. 87-103). El trastorno relacionado con el TNF alfa también puede ser la hidradenitis supurativa (Brunasso AM, Massone C. Treatment of hidradenitis suppurativa with tumour necrosis factor-alpha inhibitors: An update on infliximab. Acta Derm Venereol. 2011, vol. 91(1), pp.70; Sotiriou E. y otros, Etanercept for the treatment of hidradenitis suppurativa, Acta Derm Venereol. 2009, vol. 89(1), pp. 82-83). En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es la psoriasis (PARAMESWARAN, N. y PAIAL S. Tumor Necrosis Factor-a Signaling in Macrophages. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 2010; vol. 20(2), pp. 87-103). En algunas realizaciones el trastorno relacionado con el TNF alfa es la acné vulgar.

El término "CAPS" o síndrome periódico asociado a criopirina debe entenderse que incluye el síndrome autoinflamatorio familiar por frío (FCAS), el síndrome de Muckle-Wells (MWS) y la enfermedad inflamatoria multisistémica de inicio neonatal, también conocida como enfermedad inflamatoria neurológica, cutánea y articular crónica (CINCA).

La composición farmacéutica puede aplicarse mediante una o más de varias vías de administración adecuadas. La administración puede realizarse, por ejemplo, por vía parenteral. En algunas variantes la administración se realiza por vía intramuscular. En algunas variantes la administración se realiza por vía intravenosa en forma de bolo o mediante infusión continua. En algunas variantes la administración se realiza por vía intraarticular. En algunas variantes la administración se realiza por vía intrasinovial. En algunas variantes la administración puede ser subcutánea. En algunas variantes la administración se realiza por vía tópica, por ejemplo, en la piel o el ojo. En algunas variantes la administración se realiza por vía rectal. En algunas variantes la administración se realiza por vía dérmica, tal como por vía intradérmica, subcutánea o transdérmica. En algunas variantes la administración puede realizarse localmente. Otros modos de administración adecuados incluyen, pero no se limitan a, intracerebral, intracerebrospinal, intratecal, epidural o intraperitoneal; oralmente; urogenitalmente; intravítreamente; sistémicamente por vía intravenosa; intraocularmente; óticamente; intranasalmente; por inhalación; sublingualmente; bucalmente, por ejemplo. Se prefieren las vías de administración tópica, rectal, local, intranasal, intravenosa y/o intradérmica.

Pueden combinarse un miembro de unión divulgado en la presente memoria, una secuencia de ácido nucleico, un vector o una célula huésped que divulgados en la presente memoria con uno o más compuestos terapéuticamente eficaces adicionales. En algunas variantes tal compuesto puede ser capaz de interrumpir la señalización a través de un receptor de TNF alfa. En algunas variantes un compuesto respectivo puede ser capaz de inhibir uno o más objetivos adicionales tales como, por ejemplo, otros mediadores de respuestas inflamatorias. Tal(es) compuesto(s) pueden administrarse simultáneamente o secuencialmente.

Para aplicaciones terapéuticas, el miembro de unión también puede marcarse radiactivamente o unirse a una toxina o unirse a otra función efectora como se describió anteriormente.

Aplicaciones de diagnóstico y/o fines de detección

Un miembro de unión como es divulgado en la presente memoria puede usarse para fines de detección o diagnóstico in vivo y/o in vitro. Por ejemplo, el experto conoce una amplia gama de inmunoensayos que implican anticuerpos para detectar la expresión en células o tejidos específicos. De igual manera, cualquier miembro de unión, la secuencia de ácido nucleico, el vector y/o la célula huésped que se describe en el texto anterior puede usarse en consecuencia como se detalla en esta sección.

Para tales aplicaciones, el miembro de unión, la secuencia de ácido nucleico, el vector o la célula huésped divulgados en la presente memoria pueden incluir un marcador detectable. En algunas realizaciones, el miembro de unión, la secuencia de ácido nucleico, el vector o la célula huésped divulgados en la presente memoria no incluyen un marcador detectable. Como un ejemplo ilustrativo, un anticuerpo no marcado puede usarse y detectarse mediante un anticuerpo secundario que se une específicamente a un epítopo en el miembro de unión, por ejemplo, un anticuerpo, divulgado en la presente memoria.

En algunas realizaciones el miembro de unión, la secuencia de ácido nucleico, el vector y/o la célula huésped se acopla a una o más sustancias que pueden reconocerse por una sustancia detectora. Como un ejemplo, el miembro de unión puede unirse covalentemente a biotina, que puede detectarse mediante su capacidad para unirse a estreptavidina. De igual manera, los ácidos nucleicos y/o vectores divulgados en la presente memoria pueden usarse con fines de detección o diagnóstico, por ejemplo, mediante el uso de fragmentos marcados de estos como sondas en ensayos de hibridación.

En ciertas realizaciones, cualquiera de las moléculas proporcionadas en la presente memoria es útil para detectar la presencia de TNF alfa en una muestra, preferentemente una muestra de origen biológico. El término "TNF alfa" como se usa en este contexto incluye el TNF alfa de longitud completa, fragmentos de este y/o precursores de este, es decir, TNF alfa transmembrana y TNF alfa soluble. El término "detectar" abarca la detección cuantitativa y/o cualitativa. En ciertas realizaciones una muestra biológica incluye una célula o tejido de pacientes humanos. Los ejemplos no limitantes de muestras biológicas incluyen sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, biopsia, tejidos linfáticos y/o no sanguíneos.

De acuerdo con la presente divulgación, el procedimiento incluye poner en contacto la muestra biológica con un miembro de unión al TNF alfa (tal como un anticuerpo anti TNF alfa) como es divulgado en la presente memoria en condiciones permisivas para la unión del inhibidor a su TNF alfa objetivo, si está presente, y detectar el complejo inhibidor-objetivo. Tal procedimiento puede ser un procedimiento in vitro o in vivo. En una variante tal miembro de unión se usa para seleccionar sujetos elegibles para la terapia con los miembros de unión que se describen en la presente memoria, por ejemplo, cuando el TNF alfa es un biomarcador para la selección de pacientes. De manera similar, en lugar del miembro de unión, tal procedimiento puede implicar el uso de un cuerpo T divulgado en la presente memoria.

En otro aspecto, el miembro de unión se usa en aplicaciones cosméticas, por ejemplo, para mejorar el aspecto estético de la piel.

De igual manera, un cuerpo T, una secuencia de ácido nucleico, un vector y/o una célula huésped que se describen anteriormente pueden usarse en consecuencia como se detalla anteriormente.

Artículo de Fabricación

En un aspecto adicional, se proporciona un artículo de fabricación, un kit. El artículo de fabricación incluye materia, por ejemplo, material, útil para (i) el tratamiento, la prevención del retraso en la progresión de los trastornos relacionados con el TNF alfa; (ii) el diagnóstico de (iii) fines cosméticos. El artículo de fabricación puede incluir instrucciones para su uso y uno o más recipientes. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, cartuchos, placas y tubos de ensayo y pueden estar hechos de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. Al menos un recipiente contiene una composición que incluye un miembro de unión como es divulgado en la presente memoria. El recipiente puede tener un puerto de acceso estéril. Un recipiente respectivo suele estar etiquetado.

Los reactivos se proporcionan típicamente en cantidades predeterminadas de polvos secos, normalmente liofilizados, que incluyen excipientes que después de la disolución proporcionarán una solución de reactivo con la concentración apropiada. También pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizadores y/o tampones. Si el miembro de unión está marcado con una enzima, el kit típicamente incluirá los sustratos y cofactores correspondientes.

Las instrucciones para su uso pueden proporcionar indicaciones de que la composición se usa para el tratamiento, la prevención y/o retraso de la progresión de un trastorno deleción; o las instrucciones para realizar un ensayo de detección o diagnóstico. Las instrucciones pueden proporcionarse en una etiqueta y/o en un prospecto de envase. Secuencias referidas a

Las secuencias divulgadas en la presente memoria son:

SEQ ID NO: VL del scFvl ErVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSlSSYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLASGVPS RFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQSYYYTSNNSDGFWAFGQGTKLTVLG

SEQ ID NO: 2 - VH del scFvl

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGIDFSNSGITWVRQAPGKGLEWVGYIYPGFGIRN Y AN S VRGRFTIS RDT SKNTVYLQMN S LRAEDT A VY YC ARDPIY AS S SGYADIWGQGTL VTVSS

SEQ ID No: 3 - CDR-L1 del scFvl

QASQSISSYLA SEQ ID No: 4 - CDR-L2 del scFvl

WASTLAS SEQ ID No: 5 - CDR-L3 del scFvl

QSYYYTSNNSDGFWA SEQ ID No: 6 - CDR-H1 del scFvl

IDFSNSGIT SEQ ID No: 7 -CDR-H2 del scFvl

YIYPGFGIRNYANSVRG SEQ ID No: 8 -CDR-H3 del scFvl

DPIYASSSGYADI

SEQ ID NO: 9 - scFvl EIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLASGVPS RF SGSGSGTEFTLTIS SLQPDDF ATYYCQSYYYTSNNSDGFWAFGQGTKLTVLGGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGIDFSNSGITWVRQAPGK GLEW V GYIYPGF GIRN YAN S VRGRF TI SRDTSKNTVYLQMNSLRAEDT A V Y Y C ARDPIY ASSSGYADIWGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 10 - enlazador

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO: 11 - DLX105 MADIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYT GVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSG GGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPG KGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARER GD AMD YWGQGTL VTVSS

Los siguientes son ejemplos que ilustran los procedimientos y composiciones divulgados en la presente memoria. Se entiende que otras varias realizaciones pueden ponerse en práctica, dada la divulgación general proporcionada anteriormente.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Identificación de scFv neutralizantes de TNF alfa

Inmunización de conejos: Se inmunizaron conejos con TNF alfa humano recombinante (rh) (Peprotech, EE. UU., núm. de cat. 300-01A). Los ganglios linfáticos se extrajeron después del refuerzo final y las células se criopreservaron.

Clasificación por citometría de flujo de las células B de conejo y cultivo: Las células B de memoria específicas al TNF alfa se clasificaron como células individuales en microplacas de 96 pocillos mediante el uso de FACSAria III (BD Biosciences). Se cultivaron clones de células B individuales en presencia de células alimentadoras y medio acondicionado que contiene suero de ternero fetal (FCS) al 10 %.

En total, se clasificaron 3150 clones de células B individuales, se cultivaron y los sobrenadantes de cultivos celulares se analizaron mediante ELISA para determinar la presencia de IgG específicas anti TNF alfa. Brevemente, se revistió rhTNF alfa (Peprotech, núm. de cat. 300-01A) a una concentración de 2 mcg/mL durante la noche a 4 °C sobre microplacas Maxisorp de 96 pocillos en PBS. Después de bloquear con leche en polvo desnatada al 5 %, se añadieron sobrenadantes de cultivo celular. Las IgG específicas de TNF alfa se detectaron mediante IgG-HRP anti conejo (Southern Biotech, núm. de cat. 4050-05). El ELISA se desarrolló con sustrato BM Blue POD (Roche Applied Science). En total, se identificaron 566 clones de células B productores de IgG específicos de TNF alfa seleccionados y se analizaron adicionalmente los anticuerpos IgG para determinar su capacidad neutralizante en el ensayo de células PK-15. Se encontró que doscientos clones de células B productoras de IgG neutralizaban la actividad citotóxica de rhTNF alfa.

Secuenciación de IgG neutralizantes de TNF alfa: todos los clones de células B de conejo productoras de anticuerpos IgG anti TNF alfa neutralizantes se sometieron a aislamiento de ARNm mediante el uso del Mini Kit RNeasy (Qiagen Alemania, núm. de cat. 74106). El ARNm se usó como molde para la transcripción inversa de acuerdo con el protocolo del fabricante (kit OneStep RT-PCR, Qiagen Alemania, núm. de cat. 210212). Posteriormente, se realizaron las reacciones de PCR mediante el uso de oligonucleótidos para amplificar específicamente las secuencias codificantes de la cadena ligera y pesada de IgG de conejo (Biometra Thermocycler T3). Los fragmentos de PCR de cadena pesada y ligera se secuenciaron de forma independiente (ABI, Sanger 3730x1; Microsynth AG, Balgach, Suiza) y las secuencias de nucleótidos obtenidas se tradujeron a secuencias de aminoácidos mediante el uso de EMBOSS Transeq (http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) y alineado mediante el uso de CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/).

Construcción de genes scFv anti TNF alfa y expresión de la proteína scFv: se identificaron las regiones CDR de IgG de conejo de la cadena ligera variable y las cadenas pesadas variables como se definió anteriormente y se injertaron en las estructuras aceptoras de cadenas ligeras y pesadas humanas. En algunos, se introdujeron mutaciones puntuales. Se generaron vectores de expresión bacterianos que codifican proteínas scFv con la cadena ligera variable N-terminal unida por la secuencia la SEQ ID NO: 10 a la cadena pesada variable C-terminal. Las proteínas ScFv se expresaron en E. coli BL21 (DE3); Novagen, Estados Unidos, núm. de cat. 69450-3) como cuerpos de inclusión, que se purificaron, solubilizaron y las proteínas se replegaron. Los scFv replegados se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño y se recogieron las fracciones de los picos monoméricos correspondientes a aproximadamente 26 kDa. Los scFv purificados se analizaron para determinar la unión de TNF alfa mediante ELISA. Los scFv se evaluaron adicionalmente para determinar la capacidad neutralizante de TNF alfa en un ensayo de células PK-15. Mediante este procedimiento, de 72 scFv probados, se identificaron cinco scFv específicos de TNF alfa como potentes inhibidores del TNF alfa humano.

Ejemplo 2 - Unión del TNFalfa soluble y transmembrana humano

En primer lugar, el reconocimiento específico del TNF alfa se confirmó mediante ELISA (Figura 1). Brevemente, se revistió rhTNF alfa a una concentración de 2 mcg/mL durante la noche a 4 °C en microplacas Maxisorp de 96 pocillos en PBS. Después del bloqueo con leche desnatada en polvo al 5 %, se añadieron concentraciones crecientes de los cinco scFv preseleccionados (10 a 3000 ng/ml) y los scFv se detectaron mediante la proteína L-HRP (Sigma-Aldrich, núm. de cat. P3226). El ELISA se desarrolló con sustrato BM Blue POD (Roche Applied Science). El scFv DLX105 específico de TNF alfa se usó como control positivo. Sin embargo, los CDR son los mismos. Se usó DLX1084, un scFv de especificidad irrelevante como control negativo. La Figura 1A muestra que el scFv1 se une específicamente al rhTNF alfa. Todos los scFv, cuando se inmovilizaron directamente en las microplacas, fueron reconocidos por la proteína L-HRP (Figura 1 B). Esto muestra que (i) los scFv se replegaron adecuadamente, (ii) el scFv DLX1084 de control no se unió al rhTNF alfa, y (iii) confirma que el scFv1 identificado es específico para el rhTNF alfa.

El reconocimiento del TNF alfa humano producido naturalmente se evaluó mediante un ELISA tipo sándwich. La forma natural del TNF alfa humano se derivó de la línea celular de monocitos THP-1 humano (DSMZ Alemania, núm. de cat. ACC 16). Se cultivaron células THP-1 en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos y se estimularon con 10 ng/ml de 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA; Sigma-Aldrich, núm. de cat. P1585) durante 6 horas, y posteriormente se estimularon con 1 mcg/mL de LPS (Sigma-Aldrich, núm. de cat. L4391) durante 16 horas a 37 °C. Se recogieron los sobrenadantes celulares y se cuantificó el TNF alfa secretado mediante el uso del TNF alfa humano/TNFSF1A ELISA DuoSet (R&D Systems, núm. de cat. DY210). Las muestras de scFv se inmovilizaron en microplacas de 96 pocillos (Maxisorp, Nunc) a 5 mcg/mL en PBS pH 7,2. Después del bloqueo y lavado, se aplicó la forma natural del TNF alfa humano o TNF alfa humano expresado de forma recombinante (Peprotech, núm. de cat.

300-01A) a concentraciones finales de 5 ng/ml. El TNF alfa unido se detectó con el anticuerpo policlonal anti TNF alfa biotinilado y estreptavidina-HRP (BD Pharmingen, núm. de cat. 554060). Los cinco scFv seleccionados se unen igualmente bien tanto al rhTNF alfa como a la forma natural del TNF alfa humano.

Reconocimiento del TNF alfa transmembrana: Las células CHO que expresan la variante A1-12 de TNF alfa humano, que permanece asociada a la membrana, se marcaron con los cinco scFv seleccionados o scFv de control y se analizaron mediante citometría de flujo. Las células se incubaron con cantidades crecientes de scFv y los scFv unidos se detectaron mediante el uso de la proteína L biotinilada y marcaje posterior con estreptavidina marcada con PE. Las cinco muestras de scFv, que incluye el scFv1, se unen eficazmente al tmTNF alfa, mientras que el control negativo scFv DLX1084 no se unía al tmTNF alfa. Los histogramas de citometría de flujo para scFv1 y el control negativo scFv DLX1084 se muestran en la Figura 4A.

Ejemplo 3 - Neutralización del TNF alfa humano soluble y transmembrana

Se ensayaron anticuerpos de longitud completa y scFv para determinar su capacidad de neutralización del TNF alfa en un ensayo de células PK-15 (células epiteliales de riñón porcino, DSMZ, Alemania, núm. de cat. ACC640). El control positivo scFv DLX105, así como los anticuerpos disponibles comercialmente (infliximab, golimumab y adalimumab) se usaron para la comparación. El ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® se adaptó para determinar los valores de IC⁵⁰para los scFvs específicos de TNF alfa. En este ensayo, la generación de una señal luminiscente es proporcional a la cantidad de ATP presente que es directamente proporcional al número de células viables presentes en el cultivo. Brevemente, la forma soluble de rhTNF alfa (1,4 pM) se preincubó con concentraciones crecientes de scFv (200 pg/mL a 3 mcg/mL) y se añadió a las células PK-15 (10.000/pocillo). El reactivo CellTiter-Glo® (Promega, núm. de cat. G7572) se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La luminiscencia se midió en un luminómetro de microplacas GloMax® 96. Se trazaron las curvas de inhibición y los valores de IC⁵⁰se calcularon mediante el uso del software GraphPad Prism®, versión 6.04. El scFv1 bloqueó eficazmente la citotoxicidad del rhTNF alfa con una IC⁵⁰de 30 ± 6 pM, mientras que el valor de IC⁵⁰para el control positivo monovalente scFv DLX105 (260 ± 34 pM) fue significativamente mayor (Figura 2, Tabla 1). El ScFvs 2-5 inhibió de forma potente la actividad citotóxica de rhTNF alfa con valores de IC⁵⁰que van desde 25 pM a 40 pM. Los valores de IC⁵⁰para los cinco scFv monovalentes fueron comparables a los de los anticuerpos bivalentes comercializados infliximab, adalimumab y golimumab (Figura 3).

En el Ejemplo 2, se muestra que todos los scFv seleccionados se unen a la forma transmembrana del TNF alfa. Con el fin de investigar si los scFv neutralizan la actividad biológica del tmTNF alfa, se aprovechó el efecto citotóxico del tmTNF alfa sobre las células sensibles a HEK-Dual TNF alfa (InvivoGen, núm. de cat. Hkd-tnfa). Las células HEK-Dual TNF alfa sensibles se diseñaron para controlar la bioactividad de TNF alfa mediante la evaluación de la activación de NF-kB. Las células se derivaron de las células 293 de riñón embrionario humano mediante cotransfección estable de dos construcciones reporteras inducibles por NF-kB. Como resultado, las células HEK-Dual TNF alfa sensibles secretan luciferasa y fosfatasa alcalina embrionaria en respuesta a la activación de NF-kB inducida por el TNF alfa. Ambos productos del gen reportero se miden en el sobrenadante del cultivo celular mediante el uso de Quanti-Luc (InvivoGen, núm. de cat. Rep-qlc1) y Quanti-Blue (InvivoGen, núm. de cat. Rep-qb1). Las células CHO que expresan el tmTNF alfa se sembraron en placas a 10.000 células/pocillo en microplacas de fondo plano de 96 pocillos en 100 pl de RPMI 1640 que contiene 5 % de FCS. Se incubaron diluciones en serie de scFv1, el control positivo scFv DLX105 o el control negativo scFv DLX1084 (10 a 300 nM) con células CHO que expresan el tmTNF alfa a 37 °C durante 20 min. Las células HEK-dual se añadieron después a 20.000 células/pocillo y se cocultivaron a 37 °C durante 24 h. Los sobrenadantes de cultivos celulares resultantes se usaron para medir las actividades de luciferasa y fosfatasa alcalina embrionaria secretada. Se trazaron las curvas de inhibición y los valores de IC⁵⁰se calcularon mediante el uso del software GraphPad Prism®, versión 6.04. Los cinco scFv seleccionados inhibieron la actividad del TNF alfa transmembrana con valores de IC⁵⁰que van desde 10 nM a 50 nM, con scFv5 teniendo el valor más alto de IC⁵⁰. El scFv1 y el control positivo scFv DLX105 inhibieron la actividad del tmTNF alfa con una IC⁵⁰de 50 nM y 32 nM, respectivamente (Figura 4B, tabla 1). Se obtuvieron resultados similares cuando se usó Quanti-Blue para medir la actividad de la fosfatasa alcalina. Por tanto, en estas condiciones experimentales, 400 nM de scFv1 inhibieron el 50 % de la actividad de tmTNF alfa.

Tabla 1: Potencias de neutralización frente al TNF alfa soluble y transmembrana

Ejemplo 4 - Reactividad cruzada de especies y familia de TNF alfa de scFv

El perfil de reactividad cruzada de los cinco scFv seleccionados con homólogos de TNF alfa de otras especies distintas de los seres humanos se evaluó mediante el uso de ELISA. Se investigaron las siguientes proteínas de TNF alfa expresadas de forma recombinante: macaco rhesus (R&D Systems, EE. UU., núm. de cat. 1070-RM-025/CF), mono cynomolgus (Sinobiological, núm. de cat. 90018 CNAE), canino (Kingfisher Biotech, EE. UU., núm. de cat. RP0261D-025) y felino (R&D systems, núm. de cat., 2586FTCF), conejo (Kingfisher, núm. de cat. RP0429U), rata (Peprotech, núm. de cat. 400-14) murino (Peprotech, núm. de cat. 315-01A), conejillo de indias (R&D Systems, núm. de cat. 5035-TG-025/CF), porcino (R&D Systems, núm. de cat. 690-PT-025/CF). Brevemente, se recubrieron proteínas a una concentración de 2 mcg/mL durante la noche a 4 °C en microplacas Maxisorp de 96 pocillos en PBS pH 7,2. Después del bloqueo con leche desnatada en polvo al 5 %, se añadieron a los pocillos concentraciones crecientes de scFv (0,1, 0,3 y 1,0 mcg/mL). El recubrimiento exitoso de cada proteína se confirmó por separado con anticuerpos de control específicos de TNF alfa. Mientras que el scFv1 fue detectado por la proteína L-HR^p(Sigma-Aldrich, EE. UU., núm. de cat. P3226), los anticuerpos de control IgG de longitud completa se detectaron mediante estreptavidina-HRP (BD Pharmingen, EE. UU., núm. de cat. 554060) u otros anticuerpos secundarios elegibles marcados con HRP. El ELISA se desarrolló con sustrato BM Blue POD (Roche Applied Science) y se midió la absorbancia a 450 nm. Se comparó la reactividad cruzada del scFvs1-5 con el scFv DLX2481. El DLX2481 es una variante del scFv EP-34 como es divulgado en el documento WO2009/155723(ESBATech, una Alcon Biomedical Research Unit LLC), que incluye varias mutaciones puntuales en las regiones marco. Los scFv1, scFv3 y scFv4 reconocieron específicamente cinco especies de ortólogos de TNF alfa, a saber, proteínas de TNF alfa humano, macaco rhesus, mono cynomolgus, felino y canino. El scFv2 reconoció específicamente al rhTNF alfa, pero no reaccionó de forma cruzada con ninguna otra especie probada. El scFv DLX2481 reconoció solo el TNF alfa humano recombinante. Además, se midió la reactividad cruzada del scFv1 a miembros de la familia del TNF mediante un ELISA directo con linfotoxina humana recombinante a2/p1 recubierta (R&D systems, EE. UU., núm. de cat. 679-TX-010/CF), linfotoxina humana recombinante a1/p2 (sistemas de I D, núm. de cat. 678-LY-010/CF), ligando CD40/TNFSF5 humano recombinante (sistemas de I D, núm. de cat. 6420-CL-025/CF) y TNF beta/TNFSFI humano recombinante (sistemas de I D, núm. de cat. 211-TB-010/CF). El scFvl no reaccionó de forma cruzada con estas proteínas de la familia de TNF hasta una concentración de 40 nM.

Ejemplo 5 - Estabilidad de los scFvs

Pueden observarse dos procedimientos diferentes que pueden afectar la estabilidad del scFv. En primer lugar, el scFv podría ser propenso a la dimerización, seguido a menudo por oligomerización y agregación y precipitación adicionales. En segundo lugar, la degradación del scFv, que conduce a fragmentos más pequeños, puede ocurrir con el tiempo.

Se investigó la estabilidad de los cinco scFv seleccionados formulados en PBS pH 7,2 tras el almacenamiento a diferentes condiciones de temperatura. Los scFv se almacenaron a una concentración de 10 mg/mL a 4 °C, 22 °C, 37 °C y -20 °C en tubos de polipropileno de 1,5 ml. En los puntos de tiempo indicados, cada muestra se inspeccionó visualmente y se midió la concentración de proteína a 280 nm. Mientras que el scFv 3 y 4 mostraron menor estabilidad a 4 °C y a 37 °C después de 1 semana de incubación, no se observó precipitación de proteína visible ni pérdida significativa de proteína para scFv1. Las muestras se analizaron por SE-HPLC para determinar los niveles (%) de monómeros, dímeros y oligómeros de alto peso molecular en relación al área total del pico: una columna TOSOH TSKgel G2000 SWXL, fase diol, L * DI 30 cm * 7,8 mm, se usó un tamaño de partícula de 5 pm (Sigma, núm. de cat. 08540). Se cargaron 5 pl de scFv1 a 1 mg/mL. Como fase móvil se eligió PBS pH 7,2.

El análisis SE-HPLC no mostró productos de degradación de bajo peso molecular detectables en las condiciones experimentales que se describen anteriormente. No se observó dimerización significativa del scFv1 tras el almacenamiento durante 4 semanas a 4 °C, 22 °C y -20 °C. El scFv1 formó hasta un 2,61 %, 6,09 %, 8,75 % y 11,02 % de dímeros después de 1, 2, 3 o 4 semanas de almacenamiento a 37 °C, respectivamente (Tabla 2), y solo se observaron cantidades menores de moléculas de alto peso molecular tras el almacenamiento durante 3 y 4 semanas a 37 °C.

Tabla 2: contenido de monómero scFv1 (%) medido mediante el uso de SE-HPLC tras el almacenamiento en las condiciones indicadas

La medición de la estabilidad se amplió para el scFv1 hasta 6 meses. Después de seis meses a 4 °C, la preparación de scFv1 contiene un 91,17 % de monómeros.

La estabilidad térmica de scFv1 también se evaluó mediante fluorimetría de barrido diferencial (DSF). El scFv1 a 0,54 mg/mL formulado en PBS pH 7,2 se calentó de 30 °C a 95 °C a una velocidad de escaneo de 1 °C/5 segundos en un dispositivo de PCR en tiempo real (Corbett, Rotor-Gene) en presencia de 20x SYPRO® Orange (Sigma-Aldrich, núm. de cat. S5692, 5000x) en PBS pH 7,2. Los valores de fluorescencia se midieron (longitud de onda de excitación de 470 nm; longitud de onda de emisión de 555 nm) durante el recorrido del gradiente. Las temperaturas de fusión del punto medio (Tm) de scFvl calculadas mediante el uso del software Rotor-Gene 6000 Series 1.7. era de 76,0 °C. para scFv1

Los biológicos proteínicos pueden quedar expuestos al estrés por congelación/descongelación durante la fabricación, el almacenamiento y el envío, lo que puede causar agregación y degradación. Para evaluar la estabilidad del scFv1 durante los ciclos de congelación/descongelación, se formuló en PBS pH 7,2 a 10 mg/mL en tubos de polipropileno de 1,5 ml. Los viales se sumergieron en nitrógeno líquido durante 5 min. Para descongelar se incubaron en baño maría a temperatura ambiente durante 10 min. Se realizaron uno, 3, 5, 7 o 10 ciclos de congelación/descongelación y las muestras se analizaron por SE-HPLC como se mencionó anteriormente. Prácticamente el 100 % de scFv1 permaneció monomérico después de 10 ciclos de congelación/descongelación y no se observó pérdida o precipitación de proteínas.

Para una caracterización adicional, el scFv1 es seleccionado del grupo de cinco scFv preseleccionados debido a sus excelentes parámetros de estabilidad, su alta potencia y su amplio espectro de reactividad cruzada.

Ejemplo 6 - Estabilidad en suero humano al 90 %

Los cinco scFv scFv1-5 se diluyeron a 0,1 mg/mL en PBS, pH 7,2. Se añadió una alícuota de scFv al suero humano (Sigma, núm. de cat. H4522) para dar una concentración final de 10 mcg/mL en suero humano al 90% v/v. Paralelamente, los scFv se diluyeron en PBS, pH 7,2 que contiene 1 % de BSA. Las muestras se incubaron a 4 °C y a 37 °C durante 1, 4 y 20 horas. La capacidad de unión al TNF alfa de las muestras se midió mediante un ELISA directo con TNF alfa inmovilizado como es divulgado en el ejemplo 2. Se probó el scFv1 expuesto al suero a concentraciones crecientes (de 20 a 500 ng/ml) y se detectó mediante la proteína L-HRP. Los resultados indican que una exposición de 20 horas a suero humano a 37 °C no alteró significativamente la capacidad de scFv1 y scFv2-5 de unión al TNF alfa.

Ejemplo 7 -Solubilidad de scFvs

Los cinco scFv scFv1-5 seleccionados se purificaron y almacenaron en tampón PBS pH 7,2 (solución salina tamponada con fosfato IX, Gibco, Life TechnologiesTM, núm. de cat. 20012). El scFv1 se concentró mediante el uso de concentradores centrífugos Vivaspin 20 (Sartorius Stedim Biotech, núm. de cat. VS2001) a temperatura ambiente hasta 50 mg/mL y se analizó visualmente y por HPLC analítica (columna TOSOH TSKgel G2000 SWXL, núm. de cat. 08540). Las soluciones resultantes de scFv1 eran claras y sin precipitados, y el 100 % de la proteína era monomérica. Por tanto, la solubilidad de scFv1 en PBS pH 7,2 es >50 mg/mL.

Ejemplo 8 - Neutralización del TNF alfa canino, de macaco rhesus y del mono cynomolgus

El scFvl se ensayó para inhibir la actividad citotóxica de las proteínas de TNF alfa canino, de macaco rhesus y del mono cynomolgus contra células PK-15 como se describió anteriormente. Se preincubaron diluciones seriadas de scFv1 con 50 pg/mL de proteínas recombinantes de TNF alfa canino, de macaco rhesus o del mono cynomolgus. Las mezclas se agregaron a las células PK-15, se incubaron adicionalmente y se analizaron como es divulgado en el ejemplo 3. El scFvl fue muy potente en la neutralización de las proteínas del TNF alfa canino, de macaco rhesus y del mono cynomolgus.

Ejemplo 9 - Eficacia in vivo

La capacidad del scFv1 para bloquear la actividad biológica del TNF alfa humano in vivo se demostró mediante el uso del ratón Tg1278TNF-ko, una cepa de ratón que contiene un transgén que codifica el gen de TNF alfa humano completo con regiones flanqueantes. Estos ratones expresan el TNF alfa humano normalmente regulado en ausencia del TNF alfa de ratón y presentan un desarrollo normal sin patología aparente.

La susceptibilidad de los ratones al lipopolisacárido (LPS) derivado de bacterias Gramnegativas aumenta con el tratamiento con D-galactosamina (D-gal), un agente hepatotóxico, que aumenta la sensibilidad a los efectos letales del LPS en 100.000 veces. El efecto de D-gal se restringe exclusivamente a los hepatocitos donde causa el agotamiento de los nucleótidos de uracilo que da como resultado una biosíntesis deficiente de ARN y proteínas. La administración de LPS/D-gal en ratones conduce a una mortalidad constante observada dentro de las 48 horas causada por una lesión hepática fulminante caracterizada por una muerte apoptótica generalizada de los hepatocitos que resulta principalmente de la señalización de TNF alfa a través del receptor 1 de TNF. El tratamiento de los ratones con un anticuerpo neutralizante anti TNF alfa los protege de los efectos letales de la toxicidad hepática por LPS/D-gal.

El scFvl y el control positivo scFv DLX105 se administraron dos veces por vía intraperitoneal a dosis de 10,0 mg/kg de peso corporal a los ratones transgénicos de hTNF alfa de 8-9 semanas de edad 1 h antes y 1 h después de la exposición ip con LPS/D-Gal (10 ng/dosis de LPS, 20 mg/dosis de D-gal). Dos horas después de la prueba de reto con LPS/D-gal, se tomaron muestras de sangre y se midieron los niveles séricos de IL-6 de ratón mediante el uso del kit ELISA de IL-6 DuoSet de ratón de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R&D Systems, núm. de cat.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un miembro de unión que tiene una especificidad de unión al TNF alfa, comprendiendo el miembro de unión (i) la cadena pesada variable como se establece en la SEQ ID NO: 2; y

(ii) la cadena ligera variable como se establece en la SEQ ID NO: 1;

en el que el miembro de unión es un fragmento variable de cadena sencilla scFv.

2. El miembro de unión de la reivindicación 1, en el que el scFv comprende una secuencia enlazadora como se establece en la SEQ ID NO: 10.

3. El miembro de unión de la reivindicación 1, en el que el scFv consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 9.

4. El miembro de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que está modificado química o biológicamente.

5. El miembro de unión de la reivindicación 4, que está glicosilado, PEGilado o HESilado.

6. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica el miembro de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un vector que comprende una secuencia de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6 o el vector de la reivindicación 7.

9. Una composición cosmética, de diagnóstico o farmacéutica que comprende el miembro de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6, el vector de la reivindicación 7 o la célula huésped de la reivindicación 8; y además un portador, diluyente o excipiente adecuado.

10. El miembro de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6, el vector de la reivindicación 7 o la célula huésped de la reivindicación 8,

(i) para su uso en el tratamiento, prevención o retraso de la progresión de una enfermedad mediada por el TNF alfa, tal como

retinopatía diabética proliferativa, artritis gotosa, artritis gotosa aguda y artritis gotosa crónica, síndrome de Schnitzler, artritis idiopática juvenil sistémica, artritis reumatoide, urticaria, vasculitis, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, osteomielitis multifocal recurrente, policondritis recidivante, síndrome periódico asociado a la criopirina (CAPS), enfermedad de Behget, fiebre mediterránea familiar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, polimialgia reumática, las mutaciones en NALP3, pioderma gangrenoso, urticaria idiopática crónica, osteoartritis, degeneración macular húmeda relacionada con la edad, síndrome del ojo seco, psoriasis, síndrome de sinovitis-acné-pustulosis-hiperostosis-osteítis, síndrome de activación de macrófagos, fiebre periódica, adenitis, faringitis, síndrome de úlcera aftosa, la enfermedad de Still del adulto, deficiencia de mevalonato quinasa, uveítis, enfermedad inflamatoria intestinal, aterosclerosis, síndrome periódico asociado al receptor de TNF (TRAPS), espondilitis anquilosante, hidradenitis supurativa, psoriasis y/o acné común; (ii) para su uso en diagnóstico;

(iii) para su uso en cosmética; y/o

(iv) con fines de detección.

11. Un procedimiento de producción del miembro de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo el procedimiento las etapas tanto de:

(A)

(i) cultivar la célula huésped de la reivindicación 8 lo que permite de ese modo que se exprese el miembro de unión;

(ii) recuperar el miembro de unión; y

(iii) opcionalmente purificar el miembro de unión; o

(B)

(i) poner en contacto un sistema de expresión libre de células con un molde de producto de ácido nucleico, el molde de producto de ácido nucleico codifica el miembro de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;

(ii) permitir que se produzca la transcripción y traducción del molde del producto de ácido nucleico, lo que permite de ese modo que se forme una mezcla de reacción;

(iii) recuperar el miembro de unión de la mezcla de reacción; y

(iv) purificar opcionalmente el miembro de unión.

12. Un kit que comprende el miembro de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 junto con una combinación envasada de reactivos con instrucciones.