ES2342665T3 - Secuenciacion desde dos extremos. - Google Patents
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Abstract
Método de secuenciación de una molécula de ácido nucleico, que comprende las etapas de: (a) hibridar dos o más cebadores de secuenciación con una o una pluralidad de cadenas individuales de la molécula de ácido nucleico, en la que todos los cebadores excepto uno son cebadores reversiblemente bloqueados, (b) incorporar por lo menos una base en la molécula de ácido nucleico mediante elongación de polimerasa a partir de un cebador no bloqueado, (c) bloquear la elongación adicional de dicho cebador no bloqueado, (d) desbloquear uno de los cebadores reversiblemente bloqueados, formando un cebador desbloqueado, (e) repetir las etapas (b) a (d) hasta que por lo menos uno de los cebadores reversiblemente bloqueados se haya desbloqueado y utilizado para determinar una secuencia mediante secuenciación pirofosfato.
Description
Secuenciación desde dos extremos.
La presente invención se refiere a métodos para
secuenciar tanto la cadena sentido como la cadena antisentido de un
ácido nucleico.
La presente invención se refiere a un método
para la secuenciación de las bases de ácido desoxirribonucleico
(ADN). Más específicamente, la presente invención se refiere a
métodos para secuenciar tanto la cadena sentido como la cadena
antisentido de ADN mediante la utilización de cebadores de
secuenciación bloqueados y no bloqueados.
La secuenciación del genoma ofrece la
posibilidad de diagnóstico, terapia y prevención de enfermedades,
así como la modificación dirigida del genoma humano. Resultan
necesarios métodos de secuenciación rápida que permitan la
utilización de este potencial. La secuenciación de bases del ácido
desoxirribonucleico (ADN) y del ácido ribonucleico (ARN) es una de
las técnicas analíticas más importantes de la biotecnología, la
industria farmacéutica, la industria alimentaria, el diagnóstico
médico y otros campos de aplicación.
Se encuentran disponibles muchos métodos de
secuenciación del ADN, tales como la secuenciación de Sanger
utilizando la terminación dideoxi y la electroforesis en gel
desnaturalizante (Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 75:5463-5467, 1977), la secuenciación de
Maxam-Gilbert utilizando el corte químico y la
electroforesis en gel desnaturalizante (Maxam A.M. y Gilbert W.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-564, 1977), la
pirosecuencación, mediante la detección del pirofosfato (PPi)
liberado durante la reacción de la ADN polimerasa (Ronaghi M. et
al., Science 281:363-365, 1998) y la
secuenciación mediante hibridación (SBH) utilizando oligonucleótidos
(Lysov I. et al., Dok1 Akad Nauk SSSR
303:1508-1511, 1988; Bains W. y Smith G.C., J.
Theor. Biol. 135:303-307, 1988; Dmanac R. et
al., Genomics 4:114-128, 1989; Khrapko K.R.
et al., FEBS Lett. 256:118-122, 1989; Pevzner
P.A., J. Biomol. Struct. Dyn. 7:63-73, 1989;
Southern E.M. et al., Genomics 13:1008-1017,
1992).
Ronaghi et al. (Anal. Biochem.
267:65-71, 1999) se refieren a un método de
secuenciación de ambas cadenas de un ácido nucleico. El método
implica la amplificación por PCR de un ácido nucleico molde con un
cebador biotinilado y un cebador no biotinilado. El producto
amplificado, que comprende una cadena biotinilada y una cadena no
biotinilada se separa en cadenas. Los autores se refieren a la
utilización de perlas recubiertas con estreptavidina para la
separación de cadenas. La cadena biotinilada queda unida a las
perlas, mientras que la cadena no biotinilada se separa de la perla
bajo condiciones desnaturalizantes. Las dos cadenas (biotinilada y
no biotinilada) se secuencian separadamente. Al contrario que en la
presente invención, que utiliza la secuenciación en fase sólida
para ambas cadenas, dicho método utiliza la secuenciación en fase
sólida para la cadena biotinilada y la secuenciación en fase
solución para la secuencia de la cadena no biotinilada. Por lo
tanto, el método de Ronaghi es similar al método tradicional de
secuenciación del ADN que comprende la separación de las cadenas
(por ejemplo utilizando un gel de urea) de un molde antes de la
secuenciación. De esta manera, el método de Ronaghi adolece de la
misma desventaja que los métodos tradicionales: el requisito de una
etapa laboriosa de separación de cadenas y de aislamiento de las
cadenas individuales antes de la secuenciación. Las desventajas del
método de Ronaghi se incrementan geométricamente a medida que se
incrementa el número de reacciones de secuenciación paralela. Por
ejemplo, la secuenciación paralela de 1.000 moldes de doble cadena
requeriría 1.000 separaciones y 2.000 aislamientos de cadenas
individuales. Además, el método de Ronaghi, al igual que todos los
métodos basados en la separación de cadenas, se limita a la
determinación de secuencias a partir de dos cebadores (uno para
cada cadena) por cada molde de doble cadena.
La secuenciación basada en el corte químico ha
demostrado ser difícil de automatizar. Otros métodos de
secuenciación son laboriosos debido a la necesidad de llevar a cabo
una etapa de hibridación por cada esfuerzo de secuenciación. En
muchas situaciones, la etapa de hibridación es la etapa limitante de
la velocidad de una reacción de secuenciación.
Se han realizado intentos para llevar a cabo la
secuenciación a partir de los dos extremos de un ácido nucleico,
utilizando, por ejemplo, dos cebadores de secuenciación marcados
diferentemente (por ejemplo Li-Cor, de Lincoln,
Nebraska) en una reacción de secuenciación de Sanger (Sanger F.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
75:5463-5467, 1977). Estos métodos son variaciones
de la secuenciación manual y requieren una etapa de fraccionamiento
por tamaño (por ejemplo un gel) para determinar una secuencia.
Aunque el fraccionamiento por tamaño puede resultar adecuado para
tamaños de muestra reducidos, la secuenciación genómica que
utilizase técnicas de fraccionamiento por tamaño requeriría
1.500.000 geles de fraccionamiento por tamaño (suponiendo una
capacidad optimista de 2.000 pb por gel). Por estos motivos, los
métodos de secuenciación que implican el fraccionamiento por tamaño
no han sido adaptados para la secuenciación de genomas humanos.
Wiemarn et al., Analytical Biochemistry
234(2):166-174, 1996, páginas 166 a 174,
describen una técnica "dúplex" de secuenciación del ADN que
posibilita obtener simultáneamente dos secuencias independientes a
partir de una reacción de secuenciación con la utilización de
cebadores no marcados y el marcaje interno.
La presente invención proporciona un método de
secuenciación de un ácido nucleico a partir de múltiples cebadores
con una única etapa de hibridación de cebador. En este método, se
hibridan dos o más cebadores de secuenciación al ADN molde que debe
secuenciarse. El ADN molde puede ser de una cadena o de doble cadena
desnaturalizado. A continuación, se bloquean todos los cebadores de
secuenciación excepto uno. Se lleva a cabo nuevamente la
secuenciación (por ejemplo la secuenciación a partir de pirofosfato)
mediante elongación del cebador no bloqueado. Se deja que continúe
la elongación hasta completarse (con polimerasa adicional y dNTPs,
en caso necesario) o se termina (mediante polimerasa, ddNTPs y
opcionalmente dNTPs); en cualquier caso impidiendo la elongación
adicional del cebador no bloqueado. Se eliminan los reactivos de
completado de cadena y/o de terminación. Seguidamente, se
desbloquea uno de los cebadores bloqueados y se lleva a cabo la
secuenciación pirofosfato mediante elongación del cebador
nuevamente desbloqueado. Se continúa este procedimiento hasta
desbloquear y secuenciar todos los cebadores de secuenciación. En
una realización preferente, se utilizan dos cebadores (uno
bloqueado y uno no bloqueado) para secuenciar ambos extremos de un
ácido nucleico de doble cadena.
Figura 1 ilustra un procedimiento ejemplar de
secuenciación desde dos extremos;
Figura 2 ilustra los resultados de la
demostración de la secuenciación desde los dos extremos en un
aparato de pirosecuenciación de 454 Corp.;
Figura 3 ilustra los resultados del análisis de
secuenciación desde los dos extremos, mostrando que se determina la
secuencia de ambos extremos de un molde de ADN. SEC ID nº 6:
atgcacatggttgacacagtggt; SEC ID nº 7: atgcacatggtt
gacacagtgg; SEC ID nº 8: atgccaccgacctagtctcaaactt;
gacacagtgg; SEC ID nº 8: atgccaccgacctagtctcaaactt;
Figura 4 ilustra una perla ejemplar de captura
de ADN;
Figura 5 ilustra la encapsulación de una perla
que comprende dos secuencias oligonucleótidas para la secuenciación
de una doble cadena.
Figura 6 ilustra la PCR en fase solución y el
procedimiento de direccionamiento a perla - una etapa en una
realización preferente de la secuenciación desde dos extremos;
Figura 7 ilustra la rotura de emulsión y la
recuperación de ADN molde amplificado en una perla - una etapa en
una realización preferente de secuenciación desde dos extremos;
Figura 8 es una representación esquemática de un
método preferente de secuenciación desde los dos extremos;
Figura 9 ilustra los resultados de la
secuenciación de un genoma de Staphylococcus aureus;
Figura 10 ilustra las longitudes de lectura
medias en un experimento que implicaba la secuenciación desde los
dos extremos;
Figura 11 ilustra el número de pocillos para
cada tramo del genoma en un experimento de secuenciación desde los
dos extremos; y
Figura 12 ilustra un resultado y cadena de
alineación típicos de un procedimiento de secuenciación desde los
dos extremos. Las secuencias, mostradas en orden, de arriba a abajo,
son: SEC ID nº 9 a SEC ID nº 22.
Tradicionalmente, la secuenciación de dos
extremos de una molécula de ADN de doble cadena requeriría como
mínimo la hibridación de cebador, la secuenciación de un extremo, la
hibridación de un segundo cebador y la secuenciación del otro
extremo. El método alternativo es separar las cadenas individuales
del ácido nucleico de doble cadena y secuenciar individualmente
cada cadena. La presente invención proporciona una tercera
alternativa que es más rápida y menos laboriosa que los primeros
dos métodos.
La presente invención proporciona un método de
secuenciación de una molécula de ácidos nucleicos según se define
posteriormente en las reivindicaciones. La presente invención
también proporciona un método para determinar un haplotipo
molecular de una muestra de ADN en múltiples locus, según se define
posteriormente en las reivindicaciones. La invención según se
define posteriormente en las reivindicaciones se describe, así como
otros métodos que forman parte de la exposición.
La presente invención y la presente exposición
proporcionan un método de secuenciación secuencial de ácidos
nucleicos a partir de múltiples cebadores. Las referencias a la
secuenciación del ADN en la presente solicitud se refieren a la
secuenciación utilizando una polimerasa en la que la secuencia se
determina a medida que se incorporan nucleótidos trifosfato (NTPs)
en la cadena en crecimiento de un cebador de secuenciación. Un
ejemplo de este tipo de secuenciación es el método de
pirosecuenciación de detección de pirofosfatos (ver, por ejemplo,
las patentes US nº 6.274.320, nº 6.258.568 y nº 6.210.891).
En una realización, se proporciona un método de
secuenciación de dos extremos de un ácido nucleico molde de doble
cadena. El ADN de doble cadena comprende dos ADNs de una cadena,
denominados en la presente memoria primer ADN de una cadena y
segundo ADN de una cadena. Se hibrida un primer cebador con el
primer ADN de una cadena y se hibrida un segundo cebador con el
segundo ADN de una cadena. El primer cebador no se encuentra
bloqueado, mientras que el segundo cebador se encuentra
bloqueado.
Las expresiones "bloqueado" o "cebador
bloqueado" se definen en la presente exposición como cualquier
cebador en el que se ha impedido la elongación que realizaría una
polimerasa. El bloqueo puede ser con un grupo de bloqueo químico
que impida que un cebador sea polimerizado por la ADN polimerasa.
Además, el bloqueo con un grupo químico debería ser reversible, de
manera que, tras la reversión, el oligonucleótido nuevamente pueda
servir como cebador de secuenciación. De esta manera, "bloqueo"
significa lo mismo que "bloqueado", "bloqueado" significa
lo mismo que "protegido", y "desbloqueado" significa lo
mismo que "desbloqueo".
Los términos "protección",
"protegido", "bloqueo" y "bloqueado" se definen en la
presente exposición como la adición de un grupo químico a sitios
reactivos en el cebador que evitan la polimerización de un cebador
por parte de la ADN polimerasa. Además, la adición de dichos grupos
químicos protectores debería ser reversible, de manera que, tras la
reversión, el cebador ahora desprotegido nuevamente es capaz de
servir como cebador de secuenciación. La secuencia de ácidos
nucleicos se determina en una dirección (por ejemplo desde un
extremo del molde) mediante elongación del primer cebador con ADN
polimerasa utilizando métodos convencionales, tales como la
secuenciación de pirofosfato. A continuación, se desprotege el
segundo cebador y se determina la secuencia mediante elongación del
segundo cebador en la otra dirección (por ejemplo desde el otro
extremo del molde) utilizando ADN polimerasa y métodos
convencionales, tales como la secuenciación de pirofosfato. Las
secuencias del primer y segundo cebadores están diseñadas
específicamente para hibridarse con los dos extremos del ADN de
doble cadena o en cualquier localización a lo largo del molde en
este método.
Además de la definición anterior, la protección
y el bloqueo también pueden ser extrínsecos al cebador. Por
ejemplo, puede unirse un anticuerpo u otra proteína a un sitio
cadena abajo (por ejemplo una proteína de unión a ADN específica de
una secuencia) para crear un cebador bloqueado, aunque el cebador no
sea químicamente diferente a un cebador no bloqueado. Por ejemplo,
el bloqueo y la protección pueden estar mediados por una proteína
de unión a ADN que se una cadena abajo de un ácido nucleico cebador
e impida la elongación. En este caso, el cebador se considera
bloqueado o protegido. Además, en el caso de que la proteína de
unión a ADN pueda ser desplazada, el cebador se considera que se
encuentra bloqueado o protegido reversiblemente. Una proteína de
unión a ADN es cualquier proteína de unión a ADN sintética o natural
o equivalente funcional de la misma.
En otra realización se proporciona un método de
secuenciación de un ácido nucleico a partir de múltiples cebadores.
En este método, se hibridan varios cebadores de secuenciación con el
ácido nucleico molde que debe secuenciarse. Todos los cebadores de
secuenciación se encuentran reversiblemente bloqueados excepto uno.
Un cebador bloqueado es un cebador oligonucleótido que no puede
extenderse con una polimerasa y dNTPs utilizados comúnmente en las
reacciones de secuenciación de ADN. Un cebador reversiblemente
bloqueado es un cebador bloqueado que puede desbloquearse. Todos
los cebadores bloqueados a los que se hace referencia en la presente
invención se encuentran reversiblemente bloqueados. Tras el
desbloqueo, un cebador reversiblemente bloqueado funciona como un
cebador de secuenciación normal y es capaz de participar en una
reacción de secuenciación normal.
Se proporciona un método de secuenciación
secuencial de un ácido nucleico a partir de múltiples cebadores. El
método comprende las etapas siguientes: en primer lugar, se
proporciona uno o más ácidos nucleicos de molde que deben
secuenciarse. En segundo lugar, se hibrida una pluralidad de
cebadores de secuenciación con el ácido o ácidos nucleicos de
molde. El número de cebadores de secuenciación puede representarse
con el número n, en donde n puede ser cualquier número positivo
superior a 1. Ese número puede ser, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9, 10 ó superior. De entre los cebadores un número
n-1 puede encontrarse bloqueado con un grupo
bloqueante. Por lo tanto, por ejemplo, en el caso de que n sea 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, n-1 sería 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8 y 9, respectivamente. El cebador remanente (por ejemplo un
número n de cebadores - un número (n-1) de
cebadores bloqueados= un cebador remanente) no se encuentra
bloqueado. En tercer lugar, el cebador no bloqueado se extiende y
se determina la secuencia del ADN molde mediante métodos
convencionales, tales como, por ejemplo, la secuenciación
pirofosfato. En cuarto lugar, tras la secuenciación del primer
cebador, se desbloquea uno de los cebadores bloqueados restantes.
En quinto lugar, se extiende un cebador desbloqueado y se determina
la secuencia del ADN molde mediante métodos convencionales, tales
como, por ejemplo, la secuenciación pirofosfato. Opcionalmente
puede repetirse el método hasta llevar a cabo la secuenciación a
partir de todos los cebadores bloqueados.
En otro aspecto, se proporciona un método de
secuenciación secuencial de un ácido nucleico, que comprende las
etapas siguientes: (a) hibridar 2 ó más cebadores de secuenciación
con el ácido nucleico, en el que todos los cebadores excepto uno se
encuentran reversiblemente bloqueados, (b) determinar una secuencia
de una cadena del ácido nucleico mediante elongación con polimerasa
a partir del cebador no bloqueado, (c) desbloquear uno de los
cebadores reversiblemente bloqueados formando un cebador
desbloqueado, (d) repetir las etapas (b) y (c) hasta el desbloqueo
de todos los cebadores reversiblemente bloqueados y su utilización
para determinar una secuencia. En una realización, el presente
método comprende una etapa adicional entre las etapas (b) y (c), es
decir, la etapa de terminar la elongación del cebador desbloqueado
mediante la puesta en contacto del cebador desbloqueado con ADN
polimerasa y uno o más nucleótidos trifosfato o dideoxinucleótido
trifosfatos. En todavía otra realización, el presente método
comprende además una etapa adicional entre dichas etapas (b) y (c),
es decir, terminar la elongación del cebador desbloqueado mediante
la puesta en contacto del cebador desbloqueado con ADN polimerasa y
un dideoxinucleótido trifosfato de entre ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP
o una combinación de los mismos.
En otro aspecto, se proporciona un método de
secuenciación de un ácido nucleico, que comprende:
(a) hibridar un primer cebador no bloqueado con
una primera cadena del ácido nucleico, (b) hibridar un segundo
cebador bloqueado con una segunda cadena, (c) exponer la primera y
segunda cadenas a polimerasa, de manera que el primer cebador no
bloqueado se extienda a lo largo de la primera cadena, (d) bloquear
la elongación adicional del primer cebador de secuenciación (a lo
que también se hace referencia como completar la extensión del
primer cebador de secuenciación), (e) desbloquear el segundo cebador
de secuenciación, y (f) exponer la primera y segunda cadenas a
polimerasa de manera que se extienda el segundo cebador de
secuenciación a lo largo de la segunda cadena. Puede bloquearse la
elongación adicional (es decir, puede completarse la elongación)
mediante cualquier medio adecuado, incluyendo el permitir que caiga
el cebador o la adición de una caperuza al cebador (por ejemplo con
ddNTPs o por medios químicos). En una realización preferente,
bloquear la elongación adicional o el completado comprende la
adición de caperuza o la terminación de la elongación.
En otra realización, se proporciona un método de
secuenciación de dos extremos de un ácido nucleico molde de doble
cadena que comprende una primer y un segundo ADN de una cadena. En
la presente realización, se hibrida un primer cebador con el primer
ADN de una cadena y se hibrida un segundo cebador con el segundo
ADN de una cadena en la misma etapa. El primer cebador no se
encuentra bloqueado, mientras que el segundo cebador se encuentra
bloqueado.
Tras la hibridación, se determina la secuencia
del ácido nucleico en una dirección (por ejemplo desde un extremo
del molde) mediante elongación del primer cebador con ADN polimerasa
utilizando métodos convencionales, tales como la secuenciación
pirofosfato. En una realización preferente, la polimerasa no
presenta actividad exonucleasa 3' a 5'. Seguidamente se desbloquea
el segundo cebador, y se determina su secuencia mediante elongación
del segundo cebador en la otra dirección (por ejemplo desde el otro
extremo del molde) con ADN polimerasa utilizando métodos
convencionales, tales como la secuenciación pirofosfato. Tal como se
ha indicado anteriormente, las secuencias del primer y segundo
cebadores están diseñadas para hibridarse a los dos extremos del ADN
de doble cadena o en cualquier localización a lo largo del molde.
Esta técnica resulta especialmente útil para la secuenciación de
muchos ADNs de molde que contienen sitios únicos de hibridación de
cebador de secuenciación en los dos extremos. Por ejemplo, muchos
vectores de clonación son provistos de sitios únicos de hibridación
de cebador de secuenciación flanqueando el sitio de inserción para
facilitar la posterior secuenciación de cualquier secuencia clonada
(por ejemplo Bluescript, Stratagene, La Jolla, CA).
Un beneficio de dicho método es que ambos
cebadores pueden hibridarse en una única etapa. Los beneficios de
este método y de otros métodos resultan especialmente útiles en
sistemas de secuenciación en paralelo, en los que las hibridaciones
son más complicadas de lo normal. Se dan a conocer ejemplos de
sistemas de secuenciación paralela en la solicitud copendiente de
patente US nº de serie 10/104, 280, publicada como la solicitud de
patente número 2003/0068629.
Los oligonucleótidos cebadores utilizados en los
métodos descritos en la presente memoria pueden sintetizarse
mediante tecnología convencional, por ejemplo con un sintetizador
comercial de oligonucleótidos y/o mediante ligación entre sí de
subfragmentos que han sido sintetizados de esta manera.
En otra realización, puede determinarse la
longitud del ácido nucleico molde de doble cadena. Los métodos para
determinar la longitud de un ácido nucleico de doble cadena son
conocidos de la técnica. La determinación de la longitud puede
llevarse a cabo antes o después de la secuenciación del ácido
nucleico. Entre los métodos conocidos de determinación de la
longitud de la molécula de ácido nucleico se incluyen la
electroforesis en gel, la electroforesis en gel de campo pulsado,
la espectrometría de masas y similares. Debido a que un ácido
nucleico de doble cadena de extremos romos comprende dos cadenas
individuales de longitud idéntica, la determinación de la longitud
de una cadena de un ácido nucleico resulta suficiente para
determinar la longitud de la doble cadena correspondiente.
La reacción de secuenciación según la presente
invención también permite determinar la longitud del ácido nucleico
molde. En primer lugar, una secuencia completa de un extremo del
ácido nucleico hasta el otro extremo permitirá determinar la
longitud. En segundo lugar, la determinación de la secuencia de los
dos extremos puede solaparse en la parte intermedia, permitiendo
unir las dos secuencias. La secuencia completa puede determinarse y
obtenerse la longitud. Por ejemplo, en el caso de que el molde
presente una longitud de 100 pb, la secuenciación desde un extremo
puede determinar las bases 1 a 75; la secuenciación desde el otro
extremo puede determinar las bases 25 a 100; de esta manera existe
un solapamiento de 51 bases en la parte intermedia entre las bases
25 y 75, y a partir de esta información, puede determinarse la
secuencia completa entre 1 y 100 y obtenerse la longitud, de 100
bases, a partir de la secuencia completa.
Otro método comprende las etapas siguientes. En
primer lugar, una pluralidad de cebadores de secuenciación,
presentando cada uno una secuencia diferente, se hibrida con un ADN
que debe secuenciarse. El número de cebadores de secuenciación
puede ser cualquier valor superior a uno, tal como, por ejemplo, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó más. Todos estos cebadores se encuentran
reversiblemente bloqueados excepto uno. Este cebador no bloqueado
se elonga en una reacción posterior y se determina la secuencia.
Habitualmente, tras elongarse por completo un cebador, no puede
extenderse y no afectará a la secuenciación posterior a partir de
otro cebador. Si se desea, el cebador secuenciado puede terminarse
utilizando un exceso de polimerasa y dNTPs, o utilizando ddNTPs. En
el caso de que se realiza una etapa de terminación, los reactivos de
terminación (dNTPs y ddNTPs) deben eliminarse tras la etapa. A
continuación, se desbloquea uno de los cebadores reversiblemente
bloqueados y se produce la secuenciación a partir del segundo
cebador. Las etapas de desbloqueo de un cebador, la secuenciación a
partir del cebador desbloqueado y, opcionalmente, la terminación de
la secuenciación a partir del cebador se repiten hasta el
desbloqueo de todos los cebadores bloqueados y su utilización en la
secuenciación.
Los cebadores reversiblemente bloqueados
deberían bloquearse con diferentes grupos químicos. Mediante la
elección del método apropiado de desbloqueo, puede desbloquearse un
cebador sin afectar a los grupos bloqueantes de los demás
cebadores. En una realización preferente, el grupo bloqueante es
PO_{4}. Es decir, el segundo cebador se bloquea con PO_{4} y el
desbloqueo se lleva a cabo con la polinucleótido quinasa de T4
(utilizando su actividad de 3'-fosfatasa) o
fosfatasa alcalina intestinal bovina (CLAP) o cualquier fosfatasa
adecuada. En otra realización preferente, el bloqueante es un grupo
tiol o un grupo fosforotiol.
El ácido nucleico molde puede ser un ADN, ARN o
ácido nucleico péptido (APN). Aunque el ADN es el molde preferente,
puede convertirse el ARN y el APN en ADN mediante técnicas
conocidas, tales como la PCR con cebadores aleatorios, la
transcripción inversa, la RT-PCR o cualquier
combinación de estas técnicas. Además, los métodos de la invención
resultan útiles para secuenciar ácidos nucleicos de secuencia
desconocida y conocida. La secuenciación de un ácido nucleico de
secuencia conocida resultaría útil, por ejemplo, para confirmar la
secuencia del ADN sintetizado o para confirmar la identidad del
patógeno sospechado con una secuencia de ácidos nucleicos conocida.
Los ácidos nucleicos pueden ser una mezcla de más de una población
de ácidos nucleicos. Es conocido que un cebador de secuenciación
con suficiente especificidad (por ejemplo 20 bases, 25 bases, 30
bases, 35 bases, 40 bases, 45 bases o 50 bases) puede utilizarse
para secuenciar un subconjunto de secuencias en un ácido nucleico
largo o en una población de ácidos nucleicos no relacionados. De
esta manera, por ejemplo, el molde puede ser una secuencia de 10 Kb
o diez secuencias de 1 Kb cada una. En una realización preferente,
el ADN molde presenta una longitud de entre 50 pb y 700 pb. El ADN
puede ser de una cadena o de doble cadena.
En el caso de que el ácido nucleico molde sea de
una cadena, pueden hibridarse varios cebadores con el ácido
nucleico molde, tal como se muestra a continuación:
En el presente caso, resulta preferente que el
cebador no bloqueado inicial sea el cebador que se hibrida en el
extremo más 5' del molde. Ver el cebador 1 en la ilustración
anterior. En esta orientación, la elongación del cebador 1 no
desplazaría (mediante desplazamiento de cadena) el cebador 2, 3 ó 4.
Tras finalizar la secuenciación desde el cebador 1, puede
desbloquearse el cebador 2 e iniciarse la secuenciación del ácido
nucleico. La secuenciación a partir del cebador 2 puede desplazar
el cebador 1 o la versión elongada del cebador uno, pero no
presentará ningún efecto sobre los cebadores bloqueados restantes
(cebadores 3 y 4). Utilizando este orden, puede utilizarse cada
cebador secuencialmente y una reacción de secuenciación a partir de
un cebador que no afectaría a la secuenciación a partir de un
cebador posterior.
Una característica de la invención es la
capacidad de utilizar múltiples cebadores de secuenciación en uno o
más ácidos nucleicos y la capacidad de secuenciar a partir de
múltiples cebadores utilizando únicamente una etapa de hibridación.
En la etapa de hibridación, pueden hibridarse todos los cebadores de
secuenciación (por ejemplo el número n de cebadores de
secuenciación) con el ácido o ácidos nucleicos molde
simultáneamente. En la secuenciación convencional, habitualmente
resulta necesaria una etapa de hibridación para la secuenciación a
partir de un cebador. Una característica de la invención es que la
secuenciación a partir de n cebadores (tal como se ha definido
anteriormente) puede llevarse a cabo mediante una única etapa de
hibridación. Esto elimina efectivamente n-1 etapas
de hibridación.
En una realización preferente, las secuencias de
los n cebadores son suficientemente diferentes para que los
cebadores no se hibriden cruzadamente o se autohibriden. La
hibridación cruzada se refiere a la hibridación de un cebador con
otro cebador debido a la complementariedad de secuencias. Una forma
de hibridación cruzada se denomina comúnmente "cebador
dímero". En el caso de un cebador dímero, los extremos 3' de los
dos cebadores son complementarios y forman una estructura que, al
elongarse, es aproximadamente la suma de la longitud de los dos
cebadores. La autohibridación se refiere a la situación en la que el
extremo 5' de un cebador es complementario al extremo 3' del
cebador. En este caso, el cebador presenta una tendencia a
autohibridarse para formar una estructura similar a una
horquilla.
Un cebador puede interaccionar o asociarse
específicamente con la molécula de molde. Los términos
"interaccionar" o "asociarse" se refieren en la presente
memoria a que dos sustancias o compuestos (por ejemplo cebador y
molde, grupo químico y nucleótido) se unen (por ejemplo se enlazan,
se unen, se hibridan, se juntan, se unen covalentemente o se
asocian de otra manera) entre sí suficientemente para que el ensayo
pretendido pueda llevarse a cabo. Los términos "específico" o
"específicamente" se refieren en la presente memoria a que dos
componentes se unen selectivamente entre sí. Los parámetros
requeridos para conseguir interacciones específicas pueden
determinarse rutinariamente, por ejemplo utilizando métodos
convencionales de la técnica.
Para obtener más sensibilidad o para ayudar en
el análisis de mezclas complejas, los cebadores bloqueados pueden
modificarse (por ejemplo derivatizarse) con grupos químicos
diseñados para proporcionar señales únicas claras. Por ejemplo,
cada cebador bloqueado puede derivatizarse con un aminoácido natural
o sintético diferente unido mediante un enlace amida a la cadena
oligonucleótida en una o más posiciones a lo largo de la parte
hibridante de la cadena. La modificación química puede detectarse,
evidentemente, después de escindirse del ácido nucleico diana, o
mientras se encuentra asociada al ácido nucleico diana. Permitiendo
que cada ácido nucleico diana bloqueado se identifique de una
manera distinguible resulta posible someter a ensayo (por ejemplo
para el cribado) un gran número de diferentes ácidos nucleicos diana
en un único ensayo. Pueden llevarse a cabo muchos ensayos de este
tipo de manera rápida y fácil. Este tipo de ensayo o conjunto de
ensayos puede llevarse a cabo, por lo tanto, con eficiencia de alto
rendimiento según se define en la presente invención.
En los métodos de la exposición, tras elongarse
un primer cebador y determinarse la secuencia del ADN molde, se
desbloquea y se secuencia un segundo cebador. No se produce
interferencia entre la reacción de secuenciación del primer cebador
y la reacción de secuenciación del segundo, ahora desbloqueado,
cebador, debido a que el primer cebador se ha elongado
completamente o se ha terminado. Debido a que el primer cebador se
ha elongado por completo, la secuenciación a partir del segundo
cebador, utilizando métodos convencionales tales como la
secuenciación pirofosfato, no resultará afectada por la presencia
del primer cebador elongado. La exposición también proporciona un
método para reducir cualquier posible señal contaminante del primer
cebador. La contaminación de las señales se refiere a las
incidencias en las que el primer cebador no se ha elongado por
completo. En este caso, el primer cebador continuará elongándose al
desbloquear y elongar un cebador posterior. La elongación de tanto
el primer como segundo cebadores podría interferir con la
determinación de la secuencia del ADN.
En una realización preferente, la reacción de
secuenciación (por ejemplo la reacción de elongación de cadena) a
partir de un cebador en primer lugar se termina o se completa antes
de iniciar una reacción de secuenciación en un segundo cebador. Una
reacción de elongación de cadena de ADN puede terminarse mediante
la puesta en contacto del ADN molde con ADN polimerasa y
dideoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs), tales como ddATP, ddTTP,
ddGTP y ddCTP. Tras la terminación, los dideoxinucleótidos
trifosfato pueden eliminarse mediante lavado de la reacción con una
solución sin ddNTPs. Un segundo método para bloquear la elongación
adicional de un cebador es añadir nucleótidos trifosfato (dNTPs,
tales como dATP, dTTP, dGTP y dCTP) y ADN polimerasa a una reacción
para extender por completo cualquier cebador no completamente
extendido. Tras completarse la extensión, los dNTPs y las
polimerasas se eliminan antes de desbloquear el siguiente cebador.
Mediante el completado o terminación de un cebador antes de
desbloquear otro cebador, puede mejorarse la relación
señal-ruido de la reacción de secuenciación (por
ejemplo la secuenciación pirofosfato). Un tercer método puede
implicar enzimas, proteínas u otros agentes que puedan reconocer
una región de doble cadena >25 bases y cortar en la parte no
extendida de la región de una cadena.
Las etapas de: (a) opcionalmente terminar o
completar la secuenciación, (b) desbloquear un nuevo cebador, y (c)
secuenciar a partir del cebador desbloqueado pueden repetirse hasta
determinar una secuencia a partir de la elongación de cada cebador.
En este método, la etapa de hibridación comprende "n" cebadores
y un cebador no bloqueado. El cebador no bloqueado se secuencia en
primer lugar y las etapas (a), (b) y (c) anteriormente indicadas
pueden repetirse.
En una realización preferente, se utiliza la
secuenciación pirofosfato para todas las secuenciaciones realizadas
de acuerdo con el método de la presente exposición.
En otra realización preferente, la secuenciación
desde los dos extremos se lleva a cabo según el procedimiento
descrito de manera general en la figura 1. Este procedimiento puede
dividirse en seis etapas: (1) creación de una perla de captura
(figuras 1A y B), (2) amplificación mediante PCR en emulsión (figura
1C), (3) hibridación de cebadores bloqueados y desbloqueados
(figura 1D), (4) secuenciación de la primera cadena mediante
extensión del cebador desbloqueado (por ejemplo mediante
secuenciación pirofosfato) (figura 1E), (4A) terminación/completado
opcional de la secuenciación a partir de la primera cadena (figura
1E), seguido de la extracción de los reactivos de
terminación/completado (figura 1F), (5) preparación de la segunda
cadena mediante desbloqueo de un cebador previamente bloqueado
(figuras 1H), (6) secuenciación de la segunda cadena mediante la
adición de polimerasa (figuras 11) y secuenciación mediante
elongación del cebador desbloqueado (figura 1J). Los datos recogidos
de la secuenciación de ambas cadenas se muestran en la figura 2.
Estos datos se analizaron adicionalmente para proporcionar los
datos de secuencia en la figura 3.
En la etapa 1, se acopló una perla de captura
activada con N-hidroxisuccinimida (NHS) (por ejemplo
Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) (figura 1A, figura 4) a dos
cebadores diferentes mediante un grupo marcado con
5'-amina. Los dos cebadores corresponden al extremo
5' de la cadena sentido (cebador de captura directo) y antisentido
(cebador de captura inverso) del molde que debe amplificarse (figura
1B). Lo anterior resultaría en una perla con ambos cebadores de
captura en la orientación 5' a 3'. Estos cebadores son
40-meros y consisten de dos partes: un cebador de
PCR de 20 bases unido a un cebador de secuenciación de 20 bases. Los
cebadores de PCR 20-meros se utilizan para la
amplificación mediante PCR y los cebadores de secuenciación
20-meros se utilizan para derivar información de
secuencia de moléculas de ADN extendidas a partir de los cebadores
de captura de ADN. El acoplamiento a NHS forma un enlace amida
químicamente estable con ligandos que contienen grupos de amina
primaria. Además, puede acoplarse biotina a la perla de captura
además de utilizar biotina marcada en la amina. El grupo biotina
proporciona un mecanismo útil para la unión de reactivos de
secuenciación adicionales (por ejemplo reactivos de secuenciación
pirofosfato) a la perla. Las perlas (es decir, los soportes sólidos
de captura de ácidos nucleicos) utilizados en la presente invención
pueden ser de cualquier tamaño conveniente y fabricarse a partir de
cualquier número de materiales conocidos.
Entre los ejemplos de dichos materiales se
incluyen: compuestos inorgánicos, polímeros naturales y polímeros
sintéticos. Entre los ejemplos específicos de estos materiales se
incluyen: celulosa, derivados de celulosa, resinas acrílicas,
vidrio, geles de sílice, poliestireno, gelatina,
polivinilpirrolidona, copolímeros de vinilo y acrilamida,
poliestireno entrecruzado con divinilbenceno o similar (ver
Merrifield, Biochemistry 3:1385-1390, 1964),
poliacrilamidas, geles de látex, poliestireno, dextrano, caucho,
silicona, plásticos, nitrocelulosa, celulosas, esponjas naturales,
geles de sílice, vidrio, metales plásticos, celulosa, dextranos
entrecruzados (por ejemplo Sephadex^{TM}) y gel de agarosa
(Sepharose^{TM}) y soportes de fase sólida conocidos por el
experto en la materia. En una realización preferente, las perlas de
captura son perlas de sefarosa de diámetro comprendido entre
aproximadamente 25 y 30 \mum.
El ácido nucleico molde puede unirse a la perla
de captura de cualquier manera conocida de la técnica. Existen
numerosos métodos en la técnica para unir el ADN a una perla
microscópica. La unión química covalente del ADN a la perla puede
conseguirse mediante la utilización de agentes acoplantes
estándares, tales como carbodiimida soluble en agua, para unir el
fosfato 5' en el ADN a microesferas recubiertas de amina mediante
un enlace fosfoamidato. Otra alternativa es acoplar en primer lugar
línkers oligonucleótidos específicos a la perla utilizando una
reacción química similar, y después utilizar ADN ligasa para unir el
ADN al línker en la perla. Entre otras químicas de unión se
incluyen la utilización de N-hidroxisuccinamida
(NHS) y derivados de la misma, para unir el oligonucleótido a las
perlas. En este método, un extremo del oligonucleótido puede
contener un grupo reactivo (tal como un grupo amida) que forma un
enlace covalente con el soporte sólido, mientras que el otro
extremo del línker contiene otro grupo reactivo que puede unirse con
el oligonucleótido que debe inmovilizarse. En una realización
preferente, el oligonucleótido se une a la perla de captura de ADN
mediante enlace covalente. Sin embargo, los enlaces no covalentes,
tales como la quelación o los complejos de
antígeno-anticuerpo, pueden utilizarse para unir el
oligonucleótido a la perla.
Pueden utilizarse línkers oligonucleótidos que
se hibridan específicamente a secuencias únicas en el extremo del
fragmento de ADN, tal como el extremo solapante de un sitio de
enzima de restricción o los "extremos cohesivos" de los
vectores de clonación basados en el bacteriófago lambda, aunque las
ligaciones de extremos romos también pueden utilizarse
beneficiosamente. Estos métodos se describen en detalle en la
patente US nº 5.674.743. Resulta preferente que en cualquier método
utilizado para inmovilizar las perlas se continúe uniendo el
oligonucleótido inmovilizado durante todas las etapas en los métodos
de la invención. En una realización preferente, el oligonucleótido
se une a la perla de captura de ADN mediante enlace covalente. Sin
embargo, los enlaces no covalentes, tales como la quelación o los
complejos de antígeno-anticuerpo, pueden utilizarse
para unir el oligonucleótido a la perla.
En la etapa 2, se añade el ADN molde que
presenta los cebadores directos e inversos como adaptadores y el
ADN se amplifica mediante una estrategia de amplificación mediante
PCR (figura 1C). En una realización, el ADN molde presenta un ADN
adaptador ligado tanto en el extremo 5' como en el extremo 3'. Los
adaptadores son 40-meros que contienen en tándem en
una sola unidad las secuencias para la amplificación por PCR y la
secuenciación. Se unen dos adaptadores diferentes a los extremos del
ADN molde como parte del procedimiento de preparación de las
muestras. En una realización, el ADN se amplifica mediante reacción
en cadena de la polimerasa en emulsión, reacción en cadena de
polimerasa dirigida a perlas, amplificación por círculo rodante o
amplificación isotérmica mediante bucles. En una realización
preferente, el ADN molde con adaptadores se añade de manera que una
cadena de la molécula de ADN se hibride con uno de los cebadores en
la perla de captura de ADN (contiene millones de cebadores de
captura directos e inversos en la orientación 5' a 3'). Las perlas
de captura de ADN seguidamente se resuspenden en una mezcla de
reacción de PCR, que contiene los cebadores directos e inversos, se
emulsiona y después se amplifica. La reacción de amplificación
también consiste de dos etapas: a) cebadores de amplificación por
PCR en fase solución que ayudan a amplificar el ADN molde a partir
de una única molécula, y b) etapa de dirección a perla para capturar
las moléculas de ADN amplificadas en la perla. En todas las
situaciones, la cadena capturada sirve como molde para la extensión
del cebador de captura. Debido a que los cebadores de captura se
encuentran unidos covalentemente a las perlas, la cadena extendida
a partir del cebador de captura también se encuentra covalentemente
unida a las perlas. Un aspecto importante de este procedimiento es
la orientación de las dos cadenas. Los dos cebadores de captura
contienen secuencias que corresponden a los cebadores directos e
inversos. Debido a que los dos cebadores de captura pueden
hibridarse con dos cadenas separadas aunque complementarias del ADN,
las perlas de captura contienen ambas cadenas del ADN molde.
Además, debido a que los cebadores de captura se encuentran
inmovilizados en el extremo 5', las dos cadenas se inmovilizan en
la dirección 5' a 3'. Tras la amplificación, cada cebador de
captura contiene una cadena inmovilizada y una cadena
complementaria. A continuación, se agrupan las perlas y se tratan
con álcali para liberar la cadena no inmovilizada. Las perlas ahora
contienen un molde monocatenario que se encuentra listo para la
secuenciación.
En la etapa 3, se añaden enzimas y reactivos de
secuenciación a la reacción para facilitar la secuenciación
mediante elongación del cebador (figura 1E). En una realización
preferente, se suministran sulfurilasa y luciferasa (enzimas de
secuenciación pirofosfato) en forma inmovilizada en una perla
separada o acopladas a la perla de ADN mediante interacción
biotina-estreptavidina. La adición de enzimas
auxiliares durante un método de secuenciación ha sido dada a
conocer en U.S.S.N. nº 10/104.280, publicada como la solicitud de
patente US nº 2003/0068629.
En la etapa 4, se secuencia la primera cadena
del ADN mediante elongación de un cebador no bloqueado. El método
de secuenciación puede ser cualquier método conocido por el experto
ordinario en la materia (por ejemplo la secuenciación pirofosfato)
(figura 1E). En una realización preferente, las perlas de captura se
cargan en una placa PicoTiter (PTP) y se secuencian automáticamente
mediante secuenciación pirofosfato. En algunos casos, la secuencia
de ácidos nucleicos que debe determinarse se encuentra próxima al
extremo de un ADN molde. En este caso, la elongación del cebador de
secuenciación se terminará naturalmente al alcanzar la polimerasa
el final del ADN. En la mayoría de casos, el cebador de
secuenciación no se encuentra próximo al extremo del ADN molde y
tras determinar suficiente información a partir de la reacción de
secuenciación, se termina la secuenciación mediante completado o
terminación de la reacción de secuenciación.
La figura 1F muestra un método preferente para
terminar la reacción de secuenciación mediante la adición de ddNTPs
a la reacción. En la etapa 5, se prepara la segunda cadena del ácido
nucleico mediante la adición de apirasa para eliminar los ddNTPs
(figura 1G) y la polinucleótido quinasa (PNK), o fosfatasa alcalina
intestinal bovina u otros enzimas capaces de eliminar el grupo 3'
fosfato de la cadena del cebador bloqueado (figura 1H).
En la etapa 6, seguidamente se añade polimerasa
para cebar la segunda cadena (figura 1I), seguido de la
secuenciación de la segunda cadena según un método estándar conocido
por el experto ordinario en la materia (fig. 1J). En la etapa 7, la
secuencia tanto de la primera como de la segunda cadenas se analizan
de manera que se determina una secuencia de ADN contiguo (figura
2).
Los métodos de la invención pueden llevarse a
cabo a cualquier escala. Por ejemplo, puede utilizarse una única
perla para la secuenciación en una probeta. En una realización
preferente, se llevan a cabo los métodos de secuenciación en
paralelo mediante la carga de las perlas sobre obleas. Se define una
oblea como un sustrato con sitios posicionalmente definidos sobre
la que puede inmovilizarse una pluralidad de perlas durante un
periodo de tiempo suficientemente prolongado para que pueda llevarse
a cabo una reacción de secuenciación en un ácido nucleico unido a
la perla. Una oblea permite la secuenciación de dobles cadenas en
paralelo a partir de una pluralidad de perlas. El diseño de las
obleas (también denominadas placas PicoTiter y FORA) ha sido dado a
conocer en los documentos USSN nº 10/104.280 y nº 09/14.338
(publicados como solicitudes de patente US nº 2003/0068629 y nº
7.244.559, respectivamente) y la patente US nº 6.274.320, publicada
el 14 de agosto de 2001.
En un aspecto, la invención comprende un método
de secuenciación de una molécula de ácido nucleico, que comprende
las etapas de: a) hibridar dos o más cebadores de secuenciación a
una cadena o a una pluralidad de cadenas de la molécula de ácido
nucleico, en la que todos los cebadores excepto uno son cebadores
reversiblemente bloqueados, b) incorporar por lo menos una base en
la molécula de ácido nucleico mediante elongación por la polimerasa
a partir de un cebador no bloqueado, c) bloquear la elongación
adicional del cebador no bloqueado, d) desbloquear uno de los
cebadores reversiblemente bloqueados para formar un cebador
desbloqueado, y e) repetir las etapas (b) a (d) hasta que por lo
menos uno de los cebadores reversiblemente bloqueados haya sido
desbloqueado y utilizado para determinar una secuencia mediante
secuenciación pirofosfato.
Para la utilización con dicho método, la etapa
(c) de bloquear la elongación adicional puede comprender: i)
completar la elongación a partir del cebador no bloqueado con
polimerasa y dNTPs, o ii) terminar la elongación con polimerasa en
un tampón que contenga manganeso, dNTPs y por lo menos un ddNTP, o
iii) terminar la elongación químicamente. El método puede
comprender además la etapa de eliminar la polimerasa, los dNTPs y
ddNTPs antes de la etapa (d).
En dicho método, puede bloquearse por lo menos
un cebador reversiblemente bloqueado con un grupo químico
seleccionado de entre el grupo que consiste de un grupo PO_{4}, un
grupo tio y un grupo fosforotiol. Además, por lo menos un cebador
reversiblemente bloqueado puede incluir un extremo 3' desapareado
que puede desbloquearse mediante la puesta en contacto del cebador
con una exonucleasa. Por lo menos un cebador reversiblemente
bloqueado puede incluir una o más bases no complementarias que
forman un bucle y no se hibridan con la molécula de ácido nucleico,
en la que la base o bases no se encuentran en el extremo 5' o 3' del
cebador reversiblemente bloqueado, y en el que el cebador
reversiblemente bloqueado comprende un dideoxinucleótido en su
extremo 3'. Además, por lo menos un cebador reversiblemente
bloqueado se desbloquea mediante digestión de endonucleasas de la
base o bases no complementarias que forman una muesca en la base o
bases no complementarias.
Según dicho método, la etapa (b) puede incluir
la elongación por la polimerasa desde el corte mediante una
polimerasa con capacidad de desplazamiento de cadena. Además, por lo
menos un cebador reversiblemente bloqueado puede comprender una
secuencia de 5'-NUX-3', en la que N
representa una secuencia oligonucleótida de cualquier longitud, U
es uracilo y X es un dideoxinucleótido. El cebador reversiblemente
bloqueado puede desbloquearse con uracilo ADN glucosilasa y AP
endonucleasa, generando un cebador desbloqueado con un extremo 3'
extensible. Alternativamente, por lo menos un cebador
reversiblemente bloqueado puede comprender una secuencia de
5'-NYZ-3', en la que N representa
una secuencia oligonucleótida de cualquier longitud, es un
nucleótido modificado y representa una única base de nucleótido, y
en la que el nucleótido modificado puede desbloquearse con
formamidopirimidina (fapy)-ADN glucosilasa.
Esta base modificada puede ser, por ejemplo,
8-oxoguanina, 8-oxoadenina,
fapy-guanina, metil-fapyguanina,
fapy-adenina, aflatoxina
B_{1}-fapy-guanina,
5-hidroxicitosina y
5-hidroxiuracilo.
A título de ejemplos, la molécula de ácido
nucleico utilizada con dicho método puede ser ADN genómico, ADNc o
ADN episómico y puede presentar una longitud de entre 100 y 1.000
pb. Además, por lo menos una cadena de la molécula de ácido
nucleico o de los cebadores puede unirse a un soporte sólido.
Preferentemente se inmoviliza por lo menos un
cebador en un soporte sólido, formando un cebador inmovilizado, y
se une por lo menos una cadena a un soporte sólido mediante
hibridación con el cebador inmovilizado. El soporte sólido puede
ser un soporte sólido móvil esférico. En algunos casos por lo menos
un cebador comprende un marcaje detectable. Además, por lo menos un
cebador de secuenciación puede hibridarse con una cadena sentido
del ácido nucleico y por lo menos un cebador de secuenciación se
hibrida con una cadena antisentido de la molécula de ácido nucleico
en la etapa (a).
Según dicho método, la elongación por la
polimerasa puede ser de entre 1 y 250 bases. El método puede
llevarse a cabo, por ejemplo, en un recipiente de reacción tal como
una probeta, una cámara de reacción de una placa PicoTiter, una
cámara de reacción de una matriz, o una cámara de reacción
microencapsulada de una emulsión de agua en aceite. La
secuenciación puede llevarse a cabo mediante secuenciación
pirofosfato o secuenciación de Sanger. Preferentemente la
polimerasa no presenta actividad de exonucleasa 3' a 5'. La etapa de
desbloqueo puede implicar poner en contacto un cebador
reversiblemente bloqueado con un agente para eliminar un grupo
PO_{4} en el cebador reversiblemente bloqueado. Este agente puede
ser, por ejemplo, polinucleótido quinasa o fosfatasa alcalina. En
una aplicación, el método puede utilizarse para determinar una
primera secuencia de ácido nucleico próxima a un extremo de la
molécula de ácido nucleico y una segunda secuencia de ácido nucleico
próxima al segundo extremo de la molécula de ácido nucleico.
En otro aspecto, la invención comprende un
método de secuenciación de una molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 1, en donde el método comprende: a) hibridar un
primer cebador de secuenciación no bloqueado con una primera cadena
de la molécula de ácido nucleico, b) hibridar un segundo cebador de
secuenciación bloqueado con una segunda cadena de la molécula de
ácido nucleico, c) incorporar por lo menos una base en la primera
cadena mediante extensión del primer cebador no bloqueado con una
polimerasa, d) bloquear la elongación adicional del cebador no
bloqueado, e) desbloquear el segundo cebador de secuenciación, y f)
incorporar por lo menos una base a la segunda cadena mediante
extensión del segundo cebador con una polimerasa, en donde las
etapas (a) y (b) se llevan a cabo en cualquier orden o
simultáneamente.
Con dicho método, la etapa (d) puede incluir: i)
completar la elongación a partir del cebador no bloqueado con una
polimerasa y dNTPs, o b) terminar la elongación con polimerasa en un
tampón que contenga manganeso, dNTPs y por lo menos un ddNTP, o c)
terminar la elongación químicamente. El método puede comprender
además una etapa de eliminación de la polimerasa, dNTPs y ddNTPs
tras la etapa de bloqueo. En diversos aspectos el segundo cebador
puede bloquearse con un grupo químico, tal como un grupo PO_{4},
un grupo tio y un grupo fosforotiol. El método puede utilizarse,
por ejemplo, para determinar por lo menos una primera secuencia de
ácido nucleico próxima a un primer extremo de la molécula de ácido
nucleico y para determinar una segunda secuencia de ácido nucleico
próxima a un segundo extremo de la molécula de ácido nucleico.
La invención también comprende un método para
determinar un haplotipo molecular de una muestra de ADN en
múltiples locus, que comprende las etapas de: a) hibridar 2 ó más
cebadores de secuenciación contiguos a una pluralidad de locus en
una muestra de ADN, en la que todos los cebadores excepto uno son
cebadores reversiblemente bloqueados y en el que cada locus
contiene una secuencia de ácido nucleico que determina un haplotipo,
b) determinar un haplotipo en un locus mediante elongación por la
polimerasa a partir de un cebador no bloqueado, c) bloquear la
elongación adicional del cebador no bloqueado, d) desbloquear uno de
los cebadores reversiblemente bloqueados, formando un cebador no
bloqueado, e) repetir las etapas (b) a (d) hasta que todos los
cebadores reversiblemente bloqueados han sido desbloqueados y
utilizados para determinar un haplotipo molecular, y en donde la
secuenciación se lleva a cabo mediante secuenciación
pirofosfato.
En dicho método, la etapa (c) de bloquear la
elongación adicional puede comprender: i) completar la elongación a
partir del cebador no bloqueado con la polimerasa y dNTPs, o ii)
terminar la elongación con polimerasa en un tampón que contenga
manganeso, dNTPs y por lo menos un ddNTP, o iii) terminar la
elongación químicamente. El método puede comprender además la etapa
de eliminar la polimerasa, los dNTPs y los ddNTPs tras la etapa de
bloqueo.
Además, la exposición comprende un método de
secuenciación de una molécula de ácido nucleico que comprende las
etapas de: a) hibridar un cebador de secuenciación con una cadena de
la molécula de ácido nucleico, b) incorporar por lo menos una base
en una cadena del ácido nucleico mediante elongación por la
polimerasa a partir del cebador de secuenciación, c) bloquear la
elongación adicional del cebador, y d) repetir las etapas (a) a (c)
en la misma cadena de ácido nucleico o en una cadena diferente de
ácido nucleico hasta determinar una cantidad deseada de
secuencia.
Para determinados aspectos, la etapa (c) de
dicho método comprende: i) completar la elongación a partir del
cebador no bloqueado con polimerasa y dNTPs, o ii) terminar la
elongación con polimerasa en un tampón que contenga manganeso,
dNTPs y por lo menos un ddNTP, o iii) terminar la elongación
químicamente. Además, el método puede comprender además la etapa de
eliminar la polimerasa, los dNTPs y los ddNTPs después de la etapa
de bloqueo.
La exposición comprende además un método de
secuenciación de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico de
doble cadena, que comprende las etapas de: a) para cada una de las
moléculas de doble cadena, separar dos cadenas de cada ácido
nucleico de doble cadena y unir cada una de las dos cadenas
complementarias a una única perla, generando una pluralidad de
perlas en un único reactor, cada perla con ambas cadenas de la
molécula de ácido nucleico unidas a la misma, b) determinar la
identidad de por lo menos una base de una de las cadenas, y c)
determinar la identidad de por lo menos una base de la cadena
complementaria de la molécula de ácido nucleico.
El éxito de la reacción de PCR en emulsión, una
primera etapa en los métodos de la presente exposición, se encontró
que se relacionaba con la calidad de la especie de molde
monocatenario. De acuerdo con lo anterior, se evaluó la calidad del
material de molde con dos controles de calidad separados antes de
iniciar el protocolo de PCR en emulsión. En primer lugar, se corrió
una alícuota del molde monocatenario en el analizador 2100
BioAnalyzer (Agilent). Se utilizó un chip RNA Pico para verificar
que la muestra incluía una población heterogénea de fragmentos, de
tamaño comprendido entre aproximadamente 200 y 500 bases. En segundo
lugar, se cuantificó la biblioteca utilizando el ensayo de
fluorescencia RiboGreen en un fluorímetro de placas
Bio-Tek FL600. Las muestras en las que se determinó
que las concentraciones de ADN eran inferiores a 5 ng/\mul se
consideraron excesivamente diluidas para ser utilizadas.
Se extrajeron de la columna perlas empaquetadas
de una columna de afinidad HP de sefarosa activada con 1 ml de
éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) (Amersham
Biosciences, Piscataway, NJ). Las perlas de tamaño comprendido
entre 25 y 30 \mum se seleccionaron mediante pase en serie a
través de secciones de malla de filtro de poro de 30 \mum y 25
\mum (Sefar America, Depew, NY, USA). Las perlas que pasaron a
través del primer filtro pero que resultaron retenidas por el
segundo se recogieron y se activaron tal como se describe en la
literatura del producto (protocolo de Amersham Pharmacia nº
71700600AP). Se obtuvieron dos cebadores de captura largos
diferentes marcados en la amina con HEG (hexaetilenglicol),
correspondientes al extremo 5' de las cadenas sentido y antisentido
del molde que debía amplificarse
(5'-amina-3-espaciadores
HEG gcttacctgaccgacctctgcctatcccetgttgcgtgtc-3',
SEC ID nº 23, y 5'-amina-3
espaciadores HEG
ccattccccagctcgtcttgccatctgttccctccctgtc-3', SEC ID
nº 24) (IDT Technologies, Coralville, IA, USA). Los cebadores se
diseñaron para capturar ambas cadenas de los productos de
amplificación, permitiendo la secuenciación desde los dos extremos,
es decir, la secuenciación de la primera y segunda cadenas de los
productos de amplificación. Los cebadores de captura se disolvieron
en tampón fosfato 20 mM, pH 8,0, obteniendo una concentración final
de 1 mM. Se unieron tres microlitros de cada cebador a las perlas
tamizadas a través de 30-25 \mum (ver la figura
5). A continuación, las perlas se almacenaron en un tampón de
almacenamiento de perlas (Tris 50 mM, Tween al 0,02% y azida sódica
al 0,02%, pH 8).
Las perlas se cuantificaron utilizando un
hemocitómetro (Hausser Scientific, Horsham, PA, USA) y se
almacenaron a 4ºC hasta que se necesitaron.
Al igual que en cualquier técnica de
amplificación de moléculas individuales, la contaminación de las
reacciones con amplicón foráneo o residual de otros experimentos
podría interferir con un análisis de secuenciación. Para reducir la
probabilidad de contaminación, la mezcla de reacción PCR se preparó
en una campana de flujo laminar tratada con UV situada en una sala
para PCR limpia. Por cada 600.000 reacciones de PCR en emulsión de
perlas, se mezclaron los reactivos siguientes en un tubo de 1,5 ml:
225 \mul de mezcla de reacción (tampón HiFi Platinum 1X
(Invitrogen), dNTPs 1 mM, MgSO_{4} 2,5 mM (Invitrogen), BSA al
0,1%, Tween al 0,01%, PPi-asa termoestable 0,003
U/\mul (NEB), cebador directo 0,125 \muM
(5'-gcttacctgaccgacctctg-3', SEC ID
nº 1) y cebador inverso 0,125 \muM
(5'-ccattcccagctcgtcttg-3', SEC ID
nº 2) (IDT Technologies, Coralville, IA, USA) y polimerasa Taq
Hi-Fi Platinum 0,2 U/\mul (Invitrogen). Se
extrajeron veinticinco microlitros de la mezcla de reacción y se
almacenaron en un tubo para PCR individual de 200 \mul para la
utilización como control negativo. Se almacenó tanto la mezcla de
reacción como los controles negativos en hielo hasta que se
necesitaron.
La amplificación de ADN clonal exitosa para la
secuenciación se refiere al direccionamiento de un número
controlado de especies de molde a cada perla. Para los experimentos
descritos en la presente memoria, la concentración típica de molde
diana se determinó que era de 0,5 copias de molde por cada perla de
captura. A esta concentración, la distribución de Poisson dicta que
61% de las perlas no presentan asociado ningún molde, 30% presenta
una especie de molde y 9% presentan dos o más especies de molde. La
administración de un exceso de especies puede resultar en la unión
y posterior amplificación de una población mixta (2 ó más especies)
en una única perla, impidiendo la generación de datos de secuencia
significativos. Sin embargo, la administración de un número
excesivamente reducido de especies resultará en un menor número de
pocillos que contengan molde (una especie por perla), reduciendo el
grado de cobertura de la secuenciación. En consecuencia se consideró
que la concentración de molde en la biblioteca de cadenas
individuales era importante.
Se hibridaron moléculas de molde a cebadores
complementarios en las perlas de captura de ADN mediante el método
siguiente, llevado a cabo en una campana de flujo laminar tratada
con UV. Se transfirieron seiscientas mil perlas de captura de ADN
suspendidas en tampón de almacenamiento de perlas (ver el Ejemplo 9,
posteriormente) a un tubo para PCR de 200 \mul. El tubo se
centrifugó en una minicentrífuga de laboratorio durante 10 segundos,
se hizo girar 180º y se centrifugó durante 10 segundos adicionales
para asegurarse de que el pellet se formaba de manera uniforme. Se
extrajo el sobrenadante y las perlas se lavaron con 200 \mul de
tampón de hibridación (Tris 20 mM, pH 7,5 y acetato de magnesio 5
mM). El tubo se agitó con vórtex durante 5 segundos para resuspender
las perlas y éstas se peletizaron tal como anteriormente. La
totalidad excepto aproximadamente 10 \mul del sobrenadante
presente sobre las perlas fue extraído y se añadieron 200 \mul
adicionales de tampón de hibridación. Las perlas se agitaron con
vórtex nuevamente durante 5 segundos, se dejaron reposar durante 1
minuto y después se peletizaron tal como anteriormente. Se descartó
la totalidad excepto 10 \mul de sobrenadante.
A continuación, se añadieron a las perlas 1,5
\mul de 300.000 moléculas/\mul de biblioteca de molde. El tubo
se agitó con vórtex durante 5 segundos para mezclar el contenido y
los moldes se hibridaron con las perlas en un programa de
desnaturalización/hibridación controlados preformado en un
termociclador MJ. El programa permitió la incubación durante 5
minutos a 80ºC, seguido de una reducción de 0,1ºC/s hasta 70ºC, la
incubación durante 1 minuto a 70ºC, la reducción en 0,1ºC/s hasta
60ºC, el mantenimiento a 60ºC durante 1 minuto, la reducción en
0,1ºC/s hasta 50ºC, el mantenimiento a 50ºC durante 1 minuto, la
reducción en 0,1ºC/s hasta 20ºC, el mantenimiento a 20ºC. Tras
completar el procedimiento de hibridación, se extrajeron las perlas
del termociclador, se centrifugaron tal como se ha indicado
anteriormente y se decantó cuidadosamente el tampón de hibridación.
Las perlas de captura incluían, de promedio, 0,5 copias de ADN molde
monocatenario unido a cada perla, y se almacenaron en hielo hasta
que se necesitaron.
El procedimiento de emulsificación crea una
emulsión de agua en aceite termoestable que contiene 10.000
microrreactores de PCR discretos por microlitro. Esto sirve como
matriz para la amplificación clonal de cada molécula individual de
las moléculas individuales de la biblioteca de diana. La mezcla de
reacción y las perlas de captura de ADN para una sola reacción se
emulsionaron de la manera siguiente. En una campana de flujo laminar
tratada con UV se añadieron 200 \mul de solución para PCR (del
Ejemplo 3) a un tubo que contenía 600.000 perlas de captura de ADN
(del Ejemplo 4). Las perlas se resuspendieron mediante pipeteado
repetido. A continuación, la mezcla de perlas para PCR se incubó a
temperatura ambiente durante por lo menos 2 minutos, dejando que
las perlas se equilibrasen con la solución para PCR.
Simultáneamente, se añadió una alícuota de 450 \mul de aceite de
emulsión (Span 80 al 4,5% (p/p), Atlox 4912 al 1% (p/p) (Uniqema,
Delaware) en aceite mineral ligero (Sigma)) a un tubo de centrífuga
de 2 ml de tapa plana (Dot Scientific) que contenía una barra de
agitación magnética estéril de 1/4 de pulgada (Fischer). Este tubo
seguidamente se introdujo en un soporte de plástico para tubos
construido al efecto, que seguidamente se centró en una placa
calefactora digital con agitación Fisher Isotemp (Fisher
Scientific) funcionando a 450 rpm.
La solución de perlas para PCR se agitó con
vórtex durante 15 segundos para resuspender las perlas. A
continuación, se extrajo la solución con una jeringa de plástico
desechable de 1 ml (Benton-Dickenson) en la que se
había fijado una aguja de jeringa de seguridad de plástico (Henry
Schein). La jeringa se introdujo en una bomba de jeringa
(Cole-Parmer) modificada con una unidad de base de
aluminio que orientaba la bomba verticalmente y no horizontalmente.
El tubo con el aceite de emulsión se alineó en la placa de agitación
de manera que se encontrase centrada en la parte inferior de la
aguja de jeringa de plástico y la barra de agitación magnética
girase correctamente. La bomba de jeringa se ajustó para dispensar
0,6 ml a un caudal de 5,5 ml/hora. La solución de perlas para PCR
se añadió al aceite de emulsión gota a gota. Se procuró que las
gotas no entrasen en contacto con las paredes del tubo al caer en
el aceite bajo agitación.
Tras formarse la emulsión, se tuvo gran cuidado
en minimizar la agitación de la emulsión durante el procedimiento
de emulsificación y durante las etapas de distribución de alícuotas
posteriores a la emulsificación. Se encontró que la agitación con
vórtex, el pipeteado rápido o la mezcla excesiva podían provocar la
rotura de la emulsión, destruyendo los microrreactores discretos.
Al formar la emulsión, las dos soluciones se convirtieron en una
mezcla blanca lechosa homogénea con la viscosidad de la mayonesa. Se
vació el contenido de la jeringa en el aceite bajo agitación. A
continuación, se sacó el tubo de emulsión del soporte y se golpeó
suavemente con los dedos hasta que desaparecer cualquier capa
residual de aceite presente en la parte superior de la emulsión.
Se devolvió el tubo al dispositivo de soporte y se agitó con la
barra de agitación magnética durante un minuto adicional. Se
extrajo la barra de agitación de la emulsión haciendo correr una
herramienta magnética de extracción a lo largo del exterior del
tubo y se descartó la barra magnética.
Se extrajeron veinte microlitros de la emulsión
de la parte intermedia del tubo utilizando una pipeta P100 y se
vertieron sobre un portaobjetos de microscopía. Se utilizaron las
puntas de pipeta más grandes, para minimizar las fuerzas de
cizalla. Se observó la emulsión a una magnificación de 50X para
garantizar que comprendía predominantemente perlas individuales en
solución para PCR de microrreactores de 30 a 150 micrómetros de
diámetro en aceite (figura esquemática mostrada en la figura 5).
Tras el examen visual, se amplificaron inmediatamente las
emulsiones.
Se distribuyeron alícuotas de la emulsión en 7 ó
8 tubos para PCR separados. Cada tubo incluía aproximadamente 75
\mul de la emulsión. Se sellaron los tubos y se introdujeron en un
termociclador MJ conjuntamente con los 25 \mul de control
negativo indicados anteriormente. Se utilizaron los tiempos de
ciclado siguientes: 1 ciclo de incubación durante 4 minutos a 94ºC
(inicio en caliente), 30 ciclos de incubación durante 30 segundos a
94ºC y 150 segundos a 68ºC (amplificación) y 40 ciclos de incubación
durante 30 segundos a 94ºC y 360 segundos a 68ºC (hibridación y
extensión). Tras completar el programa de PCR, se sacaron los tubos
y se rompieron las emulsiones inmediatamente o se
almacenaron las reacciones a 10ºC durante, como máximo, 16 horas para iniciar el proceso de rotura (ver la figura 6).
almacenaron las reacciones a 10ºC durante, como máximo, 16 horas para iniciar el proceso de rotura (ver la figura 6).
Tras la amplificación, se examinaron las
emulsiones para rotura (separación de las fases aceitosa y acuosa).
Las emulsiones no rotas se agruparon en un único tubo de
microcentrífuga de 1,5 ml, mientras que la ocasional emulsión rota
se descartó. Debido a que las muestras de emulsión eran bastante
viscosas, quedaron cantidades significativas en cada tubo para PCR.
La emulsión restante en los tubos se recuperó mediante la adición
de 75 \mul de aceite mineral en cada tubo para PCR y pipeteando la
mezcla. Esta mezcla se añadió al tubo de 1,5 ml que contenía la
parte principal de material emulsionado. A continuación, se agitó
con vórtex el tubo de 1,5 ml durante 30 segundos. Seguidamente, el
tubo se centrifugó durante 20 minutos en la microcentrífuga de
laboratorio a 13,2 Krpm (velocidad máxima).
Tras la centrifugación, la emulsión se separó en
dos fases, con una gran interfase blanca. La fase aceite superior
transparente se descartó, mientras que el material turbio de la
interfase se dejó en el tubo. En una campana de humos químicos, se
añadió 1 ml de hexanos a la fase inferior y capa de interfase. La
mezcla se agitó con vórtex durante 1 minuto y se centrifugó a
velocidad máxima durante 1 minuto en una microcentrífuga de
laboratorio. La fase superior de aceite/hexano se separó y se
descartó. A continuación, se añadió 1 ml de etanol al 80%/tampón de
hibridación 1X a la fase acuosa, interfase y perlas restantes. Esta
mezcla se agitó con vórtex durante 1 minuto o hasta disolver el
material blanco de la interfase. Seguidamente se centrifugó la
muestra en una microcentrífuga de laboratorio durante 1 minuto a
velocidad máxima. El tubo se hizo girar 180 grados y se centrifugó
nuevamente durante un minuto adicional. A continuación, se separó
cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el pellet de
perlas.
El pellet blanco de perlas se lavó dos veces con
1 ml de tampón de hibridación que contenía Tween 20 al 0,1%. Se
descartó la solución de lavado y las perlas se peletizaron tras cada
lavado, tal como se ha indicado anteriormente. El pellet se lavó
con 1 ml de agua picopura. Las perlas se peletizaron mediante el
método de
centrifugación-giro-centrifugación
utilizado anteriormente. Se separó cuidadosamente la fase acuosa. A
continuación, las perlas se lavaron con 1 ml de EDTA 1 mM tal como
anteriormente, excepto en que las perlas se agitaron con vórtex
brevemente a un ajuste intermedio durante 2 segundos antes de la
peletización y eliminación del sobrenadante.
El ADN amplificado, inmovilizado sobre las
perlas de captura, se trató para obtener ADN monocatenario. La
segunda cadena se separó mediante incubación en una solución básica
de disociación. Posteriormente se añadió un ml de solución de
disociación (NaOH 0,125 M, NaCl 0,2 M) a las perlas. El pellet se
resuspendió mediante agitación con vórtex a un ajuste intermedio
durante 2 segundos, y el tubo se introdujo en un agitador orbital
para tubos Thermolyne LabQuake durante 3 minutos. A continuación,
las perlas se peletizaron tal como anteriormente, y el sobrenadante
se separó cuidadosamente y se descartó. La solución residual de
disociación se neutralizó mediante la adición de 1 ml de tampón de
hibridación. Seguidamente, las perlas se agitaron con vórtex a
velocidad intermedia durante 2 segundos. Las perlas se peletizaron
y el sobrenadante se eliminó tal como anteriormente. Se repitió el
lavado con tampón de hibridación, excepto en que únicamente se
separaron 800 \mul del tampón de hibridación tras la
centrifugación. Las perlas y el tampón de hibridación restante se
transfirieron a un tubo para PCR de 0,2 ml. Las perlas se
utilizaron inmediatamente o se almacenaron a 4ºC durante, como
máximo, 48 horas antes de continuar con el procedimiento de
enriquecimiento.
El procedimiento en esta etapa se muestra
esquemáticamente en la figura 7.
La masa de perlas incluía perlas con cadenas de
ADN inmovilizadas amplificadas y perlas vacías o nulas. Tal como se
ha indicado anteriormente, se calculó que 61% de las perlas no
presentaba ADN molde durante el procedimiento de amplificación. Se
utilizó el enriquecimiento para aislar selectivamente las perlas con
ADN molde, maximizando de esta manera la eficiencia de la
secuenciación. El procedimiento de enriquecimiento se describe en
detalle posteriormente.
Las perlas con cadenas individuales del ejemplo
anterior se peletizaron mediante el método de
centrifugación-giro-centrifugación,
y se eliminó la máxima cantidad posible de sobrenadante sin
perturbar las perlas. Se añadieron quince microlitros de tampón de
hibridación a las perlas, seguido de 2 \mul de cebador de
enriquecimiento de 40 bases biotinilado 100 \muM
(5'-biotina-espaciadores
tetraetilenglicol
ccattccccagctcgtcttgccatctgttccctccctgtctcag-3', SEC
ID nº 3). El cebador era complementario a los sitios agrupados de
amplificación y secuenciación (cada uno de 20 bases de longitud) en
el extremo 3' de la perla-molde inmovilizado. La
solución se mezcló mediante vórtex a un ajuste intermedio durante 2
segundos, y se hibridaron los cebadores de enriquecimiento con las
cadenas de ADN inmovilizadas utilizando un programa de
desnaturalización/hibridación controlada en un termociclador MJ. El
programa consistía de los tiempos de ciclado y temperaturas
siguientes: incubación durante 30 segundos a 65ºC, reducción de
0,1ºC/s hasta 58ºC, incubación durante 90 segundos a 58ºC y
mantenimiento a 10ºC.
Aunque los cebadores se hibridaban, se
resuspendieron perlas recubiertas de estreptavidina MyOne^{TM} de
Dynal mediante movimientos circulares suaves. A continuación, se
añadieron 20 \mul de las perlas MyOne^{TM} a un tubo de
microcentrífuga de 1,5 ml que contenía 1 ml de líquido Potenciador
(NaCl 2 M, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5). La
mezcla de perlas MyOne se agitó con vórtex durante 5 segundos y el
tubo se introdujo en un imán MPC-S de Dynal. Las
perlas paramagnéticas se peletizaron contra las paredes del tubo de
microcentrífuga. Se eliminó cuidadosamente el sobrenadante y se
descartó sin perturbar las perlas MyOne^{TM}. Se sacó el tubo del
imán y se añadieron 100 \mul de líquido potenciador. El tubo se
agitó con vórtex durante 3 segundos para resuspender las perlas y
se almacenó en hielo hasta que se necesitó.
Tras completar el programa de hibridación, se
añadieron 100 \mul de tampón de hibridación al tubo para PCR que
contenía las perlas de captura de ADN y cebador de enriquecimiento.
El tubo se agitó con vórtex durante 5 segundos y el contenido se
transfirió a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 ml. El tubo
para PCR en el que se había hibridado el cebador de enriquecimiento
a las perlas de captura se lavó una vez con 200 \mul de tampón de
hibridación y se añadió la solución de lavado al tubo de 1,5 ml. Las
perlas se lavaron tres veces con 1 ml de tampón de hibridación, se
agitaron con vórtex durante 2 segundos y se peletizaron tal como
anteriormente. Se eliminó cuidadosamente el sobrenadante. Tras el
tercer lavado, las perlas se lavaron dos veces con 1 ml de líquido
potenciador helado. Las perlas se agitaron con vórtex, se
peletizaron y el sobrenadante se eliminó tal como anteriormente.
Las perlas se resuspendieron en 150 \mul de líquido potenciador
helado y la solución de perlas se añadió a las perlas MyOne^{TM}
lavadas.
La mezcla de perlas se agitó con vórtex durante
3 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 3 minutos en
un agitador orbital para tubos LabQuake. Las perlas MyOne^{TM}
recubiertas de estreptavidina se unieron a los cebadores de
enriquecimiento biotinilados hibridados a los moldes inmovilizados
en las perlas de captura de ADN. A continuación, las perlas se
centrifugaron a 2.000 rpm durante 3 minutos, después de los cuales
las perlas se agitaron con vórtex con pulsos de 2 segundos hasta su
resuspensión. Las perlas resuspendidas se dejaron sobre hielo
durante 5 minutos. Seguidamente, se añadieron 500 \mul de líquido
potenciador frío a las perlas y el tubo se insertó en un imán
MPC-S de Dynal. Las perlas se dejaron en reposo
durante 60 segundos para permitir la peletización contra el imán. A
continuación, el sobrenadante con exceso de MyOne^{TM} y de
perlas de captura de ADN nulas se separó cuidadosamente y se
descartó.
El tubo se sacó del imán MPC-S y
se añadió 1 ml de líquido potenciador frío a las perlas. Las perlas
se resuspendieron con ligeros toques de los dedos. Era importante no
agitar con vórtex las perlas en este momento, debido a que la
mezcla vigorosa podría romper el enlace entre las perlas de captura
MyOne^{TM} y las de captura de ADN. Las perlas se devolvieron al
imán y se eliminó el sobrenadante. Este lavado se repitió tres
veces adicionales para asegurarse de que se habían eliminado todas
las perlas de captura nulas. Para separar los cebadores de
enriquecimiento hibridados y las perlas MyOne^{TM}, se
resuspendieron las perlas de captura de ADN en 400 \mul de
solución de disociación, se agitaron con vórtex durante 5 segundos y
se peletizaron con el imán. El sobrenadante con las perlas
enriquecidas se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml
separado. Para una recuperación máxima de las perlas enriquecidas,
se añadió una segunda alícuota de 400 \mul de solución de
disociación al tubo que contenía las perlas MyOne^{TM}. Las perlas
se agitaron con vórtex y se peletizaron tal como anteriormente. El
sobrenadante del segundo lavado se separó y se agrupó con el primer
bolo de perlas enriquecidas. El tubo de perlas MyOne^{TM}
utilizadas se descartó.
El tubo de microcentrífuga de perlas de captura
de ADN enriquecido se introdujo en el imán MPC-S de
Dynal para peletizar cualquier perla MyOne^{TM} residual. Las
perlas enriquecidas en el sobrenadante se transfirieron a un
segundo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se centrifugaron. Se
separó el sobrenadante y las perlas se lavaron 3 veces con 1 ml de
tampón de hibridación para neutralizar la solución de disociación
residual. Tras el tercer lavado, se separaron 800 \mul del
sobrenadante, y las perlas y solución restantes se transfirieron a
un tubo para PCR de 0,2 ml. Las perlas enriquecidas se centrifugaron
a 2.000 rpm durante 3 minutos y se decantó el sobrenadante. A
continuación, se añadieron 20 \mul de tampón de hibridación y 3
\mul de dos cebadores de secuenciación 100 \muM diferentes
(5'-ccatctgttccctccctgtc-3', SEC ID
nº 4, y 5'-cctatcccctgttgcgtgtc-3'
fosfato, SEC ID nº 5). El tubo se agitó con vórtex durante 5
segundos y se introdujo en un termociclador MJ para el programa de
hibridación en 4 etapas siguiente: incubación durante 5 minutos a
65ºC, reducción a 0,1ºC/s hasta 50ºC, incubación durante 1 minuto a
50ºC, reducción a 0,1ºC/s hasta 40ºC, mantenimiento a 40ºC durante
1 minuto, reducción a 0,1ºC/s hasta 15ºC y mantenimiento a 15ºC.
Tras completar el programa de hibridación, las
perlas se extrajeron del termociclador y se peletizaron mediante
centrifugación durante 10 sgundos. El tubo se hizo girar 180º y se
centrifugó durante 10 segundos adicionales. Se decantó el
sobrenadante y se descartó y se añadieron 200 \mul de tampón de
hibridación al tubo. Las perlas se resuspendieron con una segunda
agitación con vórtex de 5 segundos y se peletizaron tal como
anteriormente. Se separó el sobrenadante y las perlas se
resuspendieron en 100 \mul de tampón de hibridación. En este
punto las perlas se cuantificaron con un contador Coulter Multisizer
3 (Beckman Coulter). Las perlas se almacenaron a 4ºC y se
mantuvieron estables durante por lo menos 1 semana.
Para la secuenciación de dobles cadenas, se
utilizaron dos cebadores de secuenciación diferentes: un cebador
MMP7A no modificado y un cebador MMP2Bp 3' fosforilado. En el
procedimiento se siguen múltiples etapas. Este procedimiento se
muestra esquemáticamente en la figura 8.
- 1)
- Secuenciación de la primera cadena. La secuenciación de la primera cadena implica la extensión del cebador no modificado mediante una ADN polimerasa mediante la adición secuencial de nucleótidos durante un número predeterminado de ciclos.
- 2)
- Adición de caperuza: la secuenciación de la primera cadena se terminó haciendo fluir un tampón de adición de caperuza que contenía tricina 25 mM, acetato de magnesio 5 mM, DTT 1 mM, PVP 0,4 mg/ml, BSA 0,1 mg/ml, Tween al 0,01% y 2 \muM de cada dideoxinucleótido y 2 \muM de cada desoxinucleótido.
- 3)
- Lavado: los desoxinucleótidos y dideoxinucleótidos residuales se eliminaron haciendo fluir tampón apirasa que contenía tricina 25 mM, acetato de magnesio 5 mM, DTT 1 mM, PVP 0,4 mg/ml, BSA 0,1 mg/ml, Tween al 0,01% y 8,5 unidades/l de apirasa.
- 4)
- Corte: el segundo cebador bloqueado se desbloqueó eliminando el grupo fosfato del extremo 3' del cebador 3' fosforilado modificado haciendo fluir un tampón de corte que contenía 5 unidades/ml de fosfatasas intestinales bovinas.
- 5)
- Continuación: el segundo cebador desbloqueado se activó mediante la adición de polimerasa haciendo fluir 1.000 unidades/ml de ADN polimerasas para capturar todos los sitios de cebador disponibles.
- 6)
- Secuenciación de la segunda cadena: la secuenciación de la segunda cadena mediante una ADN polimerasa mediante la adición secuencial de nucleótidos durante un número predeterminado de ciclos.
Mediante la utilización de los métodos descritos
anteriormente, se secuenció el ADN genómico de Staphylococcus
aureus. Los resultados se presentan en la figura 9. Se obtuvo un
total de 31.785 lecturas basadas en 15.770 lecturas de la primera
cadena y 16.015 lecturas de la segunda cadena. De entre éstas, un
total de 11.799 lecturas se encontraban apareadas y 8.187 lecturas
se encontraban desapareadas, obteniendo una cobertura total de
38%.
Las longitudes de lectura se encontraban
comprendidas entre 60 y 130, con una media de 95 +/- 9 bases
(figura 10).
La distribución del tramo genómico y el número
de pocillos de cada tramo genómico se muestran en la figura 11. En
la figura 12 se muestran series de alineación representativas de
dicha secuenciación genómica.
Aunque en la presente memoria se han dado a
conocer realizaciones particulares en detalle, ello se ha llevado a
cabo a título de ejemplo con fines únicamente ilustrativos, y no se
pretende que sean limitativas del alcance de la invención según las
reivindicaciones adjuntas, proporcionadas posteriormente.
<110> Chen, Yi-Ju
\hskip1cmLeamon, John H.
\hskip1cmLohman, Ken
\hskip1cmRonan, Michael T.
\hskip1cmSrinivasan, Maithreyan
\hskip1cmRothberg, Jonathan
\hskip1cmWeiner, Michael
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Secuenciación desde los dos
extremos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 21465-509 UTIL
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/443,471
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-01-29
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/465,071
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-04-23
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/476,592
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-06-06
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/476,504
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-06-06
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/476,592
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-06-06
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/476,602
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-06-06
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/497,985
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-08-25
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttacctga ccgacctctg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccattcccca gctcgtcttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccattcccca gctcgtcttg ccatctgttc cctccctgtc tcag
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatctgttc cctccctgtc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctatcccct gttgcgtgtc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgcacatgg ttgacacagt ggt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgcacatgg ttgacacagt gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgccaccga cctagtctca aactt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resultado de secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptattgttgat gctgtaaaaa gaagctactg gtgtagtatt tttatgaagt t
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resultado de secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctcaaaga attcatttaa aatatgacca tatttcattg tatcttt
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resultado de secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcgaacag tcaagtacca cagtcagttg acttttacac aagcggat
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resultado de secuenciación
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptacaggtgtt ggtatgccat ttgcgatttg ttgcgcttgg ttagccg
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resultado de secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacatataaa catcccctat ctcaatttcc gcttccatgt aacaaaaaaa gc
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resultado de secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagatatcac ttgcgtgtta ctggtaagca ggcatgag
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resultado de secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattcaactct ggaaatgctt tcttgatacg cctcgatgat g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resultado de secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgaggagc tgcaatggca atgggttaaa ggcatcatcg
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resultado de secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtatctcga tttggattag ttgctttttg catcttcatt agacc
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resultado de secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattaacatc tgcaccagaa atagcttcta atacgattgc
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resultado de secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgacgacgt ccagctaata acgctgcacc taaggctaat gataat
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resultado de secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaccatgca gatgctaaca aagctcaagc attaccagaa act
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resultado de secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgttgctgca tcataattta atactacatc atttaattct ttgg
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resultado de secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagatggtg tgactaacca agttggtcaa aatgccctaa atacaaaaga t
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttacctga ccgacctctg cctatcccct gttgcgtgt
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccattcccca gctcgtcttg ccatctgttc cctccctgtc
\hfill40
Claims (34)
1. Método de secuenciación de una molécula de
ácido nucleico, que comprende las etapas de:
(a) hibridar dos o más cebadores de
secuenciación con una o una pluralidad de cadenas individuales de la
molécula de ácido nucleico, en la que todos los cebadores excepto
uno son cebadores reversiblemente bloqueados,
(b) incorporar por lo menos una base en la
molécula de ácido nucleico mediante elongación de polimerasa a
partir de un cebador no bloqueado,
(c) bloquear la elongación adicional de dicho
cebador no bloqueado,
(d) desbloquear uno de los cebadores
reversiblemente bloqueados, formando un cebador desbloqueado,
(e) repetir las etapas (b) a (d) hasta que por
lo menos uno de los cebadores reversiblemente bloqueados se haya
desbloqueado y utilizado para determinar una secuencia mediante
secuenciación pirofosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha etapa (c) de bloquear la elongación adicional comprende:
(a) completar la elongación a partir del cebador
no bloqueado con polimerasa y dNTPS, o
(b) terminar la elongación con polimerasa en un
tampón que contiene manganeso, dNTPs y por lo menos un ddNTP, o
(c) terminar la elongación químicamente.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Método según la reivindicación 1, que
comprende además la etapa de eliminar dicha polimerasa, dNTPs y
ddNTPs antes de dicha etapa (d).
4. Método según la reivindicación 1, en el que
por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado se bloquea con un
grupo químico seleccionado de entre el grupo que consiste de un
grupo PO_{4}, un grupo tio y un grupo fosforotiol.
5. Método según la reivindicación 1, en el que
por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado presenta un
extremo 3' desapareado que puede desbloquearse mediante la puesta en
contacto de dicho cebador con una exonucleasa.
6. Método según la reivindicación 1, en el que
por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado presenta una o
más bases no complementarias que forman un bucle y que no se
hibridan con la molécula de ácido nucleico, en la que dicha base o
bases no se encuentran en el extremo 5' ó 3' de dicho cebador
reversiblemente bloqueado, y en el que dicho cebador
reversiblemente bloqueado comprende un nucleótido dideoxi en su
extremo 3'.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
dicho por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado resulta
desbloqueado mediante digestión de endonucleasa de dicha base o
bases no complementarias, formando una muesca en dicha base o bases
no complementarias.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
la etapa (b) comprende la elongación por polimerasa en dicha muesca
por parte de una polimerasa con capacidad de desplazamiento de
cadena.
9. Método según la reivindicación 1, en el que
por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado presenta una
secuencia de 5'-NUX-3', en la que N
representa una secuencia oligonucleótida de cualquier longitud, U
es uracilo y X es un dideoxinucleótido.
10. Método según la reivindicación 9, en el que
dicho cebador reversiblemente bloqueado resulta desbloqueado por la
uracilo-ADN glucosilasa y AP endonucleasa, generando
un cebador desbloqueado con un extremo 3' extensible.
11. Método según la reivindicación 1, en el que
por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado presenta una
secuencia de 5'-NYZ-3', en la que N
representa una secuencia oligonucleótida de cualquier longitud, Y
es un nucleótido modificado, y Z representa una única base
nucleótida, y en el que dicho nucleótido modificado puede ser
desbloqueado por la formamidopirimidina (fapy)-ADN
glucosilasa.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
dicha base modificada se selecciona de entre el grupo que consiste
de 8-oxoguanina, 8-oxoadenina,
fapy-guanina,
metil-fapy-guanina,
fapy-adenina,
aflatoxina-B_{1}-fapy-guanina,
5-hidroxicitosina y
5-hidroxiuracilo.
13. Método según la reivindicación 1, en el que
la molécula de ácido nucleico es un ADN genómico, ADNc o ADN
episómico.
14. Método según la reivindicación 1, en el que
por lo menos un cebador de secuenciación se hibrida con una cadena
sentido del ácido nucleico y por lo menos un cebador de
secuenciación se hibrida con una cadena antisentido de la molécula
de ácido nucleico en la etapa (a).
15. Método según la reivindicación 1, en el que
la elongación por polimerasa es de entre 1 y 250 bases.
16. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho método se lleva a cabo en un recipiente de reacción
seleccionado de entre el grupo que consiste de una probeta, una
cámara de reacción de una placa PicoTiter, una cámara de reacción
de una matriz, y una cámara de reacción microencapsulada de una
emulsión de agua en aceite.
17. Método según la reivindicación 1, en el que
la molécula de ácido nucleico presenta una longitud de entre 100 y
1.000 pb.
18. Método según la reivindicación 1, en el que
por lo menos una de dichas cadenas de molécula de ácido nucleico o
por lo menos uno de dichos cebadores se une a un soporte sólido.
19. Método según la reivindicación 1, en el que
por lo menos una cadena de dicha molécula de ácido nucleico se une
a un soporte sólido.
20. Método según la reivindicación 18, en el que
por lo menos uno de dichos cebadores se inmoviliza en un soporte
sólido para formar un cebador inmovilizado y una de dichas cadenas
se une a un soporte sólido mediante hibridación con dicho cebador
inmovilizado.
21. Método según la reivindicación 20, en el que
el soporte sólido es un soporte sólido móvil esférico.
22. Método según la reivindicación 1, en el que
por lo menos un cebador comprende un marcaje detectable.
23. Método según la reivindicación 1, en el que
la etapa de desbloqueo comprende poner en contacto un cebador
reversiblemente bloqueado con un agente para eliminar un grupo
PO_{4} de dicho cebador reversiblemente bloqueado.
24. Método según la reivindicación 23, en el que
dicho agente se selecciona de entre el grupo que consiste de
polinucleótido quinasa y fosfatasa alcalina.
25. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha polimerasa no presenta actividad exonucleasa 3' a 5'.
26. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho método determina una primera secuencia de ácido nucleico
próxima a un extremo de dicha molécula de ácido nucleico y una
segunda secuencia de ácido nucleico próxima a un segundo extremo de
dicha molécula de ácido nucleico.
27. Método de secuenciación de una molécula de
ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende:
(a) hibridar un primer cebador de secuenciación
no bloqueado con una primera cadena de la molécula de ácido
nucleico,
(b) hibridar un segundo cebador de secuenciación
bloqueado con una segunda cadena de la molécula de ácido
nucleico,
(c) incorporar por lo menos una base en dicha
primera cadena mediante extensión de dicho primer cebador no
bloqueado con una polimerasa,
(d) bloquear la elongación adicional de dicho
cebador no bloqueado,
(e) desbloquear el segundo cebador de
secuenciación, y
(f) incorporar por lo menos una base en dicha
segunda cadena mediante extensión de dicho segundo cebador con una
polimerasa,
en donde las etapas (a) y (b) se llevan a cabo
en cualquier orden o simultáneamente.
\vskip1.000000\baselineskip
28. Método según la reivindicación 27, en el que
dicha etapa (d) de bloquear la elongación adicional comprende:
(a) completar la elongación a partir del cebador
no bloqueado con polimerasa y dNTPS, o
(b) terminar la elongación con polimerasa en un
tampón que contiene manganeso, dNTPs y por lo menos un ddNTP, o
(c) terminar la elongación químicamente.
\vskip1.000000\baselineskip
29. Método según la reivindicación 28, que
comprende además la eliminación de dichos polimerasa, dNTPs y ddNTPs
después de dicha etapa de bloqueo.
30. Método según la reivindicación 27, en el que
dicho segundo cebador se bloquea con un grupo químico seleccionado
de entre el grupo que consiste de un grupo PO_{4}, un grupo tio y
un grupo fosforotiol.
31. Método según la reivindicación 27, en el que
dicho método determina por lo menos una primera secuencia de ácido
nucleico próxima a un primer extremo de dicha molécula de ácido
nucleico y determina una segunda secuencia de ácido nucleico
próxima a un segundo extremo de dicha molécula de ácido
nucleico.
32. Método para determinar un haplotipo
molecular de una muestra de ADN en múltiples locus, que comprende
las etapas de:
(a) hibridar 2 ó más cebadores de secuenciación
contiguos a una pluralidad de locus en una muestra de ADN, en la
que todos los cebadores excepto uno son cebadores reversiblemente
bloqueados y en la que cada locus contiene una secuencia de ácido
nucleico que determina un haplotipo,
(b) determinar un haplotipo en un locus mediante
elongación de polimerasa a partir de un cebador no bloqueado,
(c) bloquear la elongación adicional de dicho
cebador no bloqueado,
(d) desbloquear uno de los cebadores
reversiblemente bloqueados, formando un cebador desbloqueado,
(e) repetir las etapas (b) a (d) hasta que la
totalidad de los cebadores reversiblemente bloqueados ha sido
desbloqueada y utilizada para determinar un haplotipo molecular,
y en el que la secuenciación se lleva a cabo
mediante secuenciación pirofosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
33. Método según la reivindicación 32, en el que
dicha etapa (c) de bloquear la elongación adicional comprende:
(a) completar la elongación a partir del cebador
no bloqueado con polimerasa y dNTPs, o
(b) terminar la elongación con polimerasa en un
tampón que contiene manganeso, dNTPs y por lo menos un ddNTP, o
(c) terminar la elongación químicamente.
\vskip1.000000\baselineskip
34. Método según la reivindicación 33, que
comprende además la etapa de eliminar dichos polimerasa, dNTPs y
ddNTPs después de dicha etapa de bloqueo.
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