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KR20180050411A - 올리고핵산 변이체 라이브러리 및 그의 합성 - Google Patents

올리고핵산 변이체 라이브러리 및 그의 합성 Download PDF

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Publication number
KR20180050411A
KR20180050411A KR1020187010998A KR20187010998A KR20180050411A KR 20180050411 A KR20180050411 A KR 20180050411A KR 1020187010998 A KR1020187010998 A KR 1020187010998A KR 20187010998 A KR20187010998 A KR 20187010998A KR 20180050411 A KR20180050411 A KR 20180050411A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
variant
library
sequence
oligonucleotide
acids
Prior art date
Application number
KR1020187010998A
Other languages
English (en)
Inventor
앤서니 콕스
세바스티안 트로이쉬
쓰위엔 천
Original Assignee
트위스트 바이오사이언스 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 filed Critical 트위스트 바이오사이언스 코포레이션
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Abstract

본원에서는 핵산 서열의 소정의 변이체를 코딩하는 고도로 정확한 올리고핵산 라이브러리를 생성하는 방법을 개시한다. 변이 정도는 완전할 수 있고, 이로써 포화된 변이체 라이브러리를 수득할 수 있거나, 또는 덜 완전할 수 있고, 이로써, 변이체의 선택적 라이브러리를 수득할 수 있다. 본원에 기술된 변이체 올리고핵산 라이브러리는 전사 또는 번역에 의해 추가 프로세싱을 위해 디자인될 수 있다. 본원에 기술된 변이체 올리고핵산 라이브러리는 변이체 RNA, DNA 및/또는 단백질 집단 생성을 위해 디자인될 수 있다. 본원에서는 생물학적 기능 조절, 및 질환 치료용 또는 감소용 치료제 디자인에서 응용되는, 활성이 증가 또는 감소된 변이체 종을 확인하는 방법을 추가로 제공한다.

Description

올리고핵산 변이체 라이브러리 및 그의 합성
상호 참조
본 출원은 2015년 9월 18일에 제출된 미국 가출원 제62/220,879호, 2015년 12월 4일에 제출된 미국 가출원 제62/263,548호, 및 2016년 6월 23일에 제출된 미국 가출원 제62/354,034호를 우선권으로 주장하며, 상기 가출원들은 모두 본원에 참고로 인용되어 있다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하고, 이 서열 목록은 그 전체가 본원에 참고로 인용되어 있다. 2016년 9월 12일에 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 44854_718_601_SL.txt이고, 그 크기는 7,841 바이트이다.
합성 생물학의 기초는, 맞춤식 경로 및 유기체의 신속하고 적절한 생성 및 최적화를 위해 접근가능화되어야 하는 디자인, 구축, 및 시험 프로세스(DNA를 필요로 하는 반복 프로세스)이다. 디자인 단계에서, DNA를 구성하는 A, C, T 및 G 뉴클레오티드는 관심의 대상의 되는 좌위 또는 경로를 구성하게 되는 다양한 유전자 서열로 제조되고, 여기서 각 서열 변이체는 시험하고자 하는 구체적인 가설을 나타낸다. 이들 변이체 유전자 서열은 진화 생물학에서 기원이 된 개념인 서열 공간의 서브세트이며, 이는 유전자, 게놈, 트랜스크립톰 및 프로테옴을 구성하는 서열 전체에 관한 것이다.
다수의 상이한 변이체는 전형적으로는 서열 공간의 샘플링이 적절히 이루어질 수 있도록 하고, 최적화된 디자인의 가능성을 최대화시키기 위하여 각각의 디자인-구축-시험 사이클을 위해 디자인된다. 비록 개념은 간단하기는 하지만, 종래 합성 방법의 속도, 처리량 및 품질에 관한 프로세스상의 장애가 상기 사이클 진행 속도를 감소시키고, 이로 인해 개발 시간은 연장된다. 매우 정확한 DNA의 비용은 높고, 현행 합성 기술의 처리량은 한정되어 있기 때문에, 서열 공간을 충분하게 분석하지 못한다는 점이 속도 제한 단계로 여전히 남아있다.
구축 단계로 시작되는 두 프로세스: 올리고핵산 합성 및 유전자 합성은 주목할 만하다. 과거에 상이한 유전자 변이체의 합성은 분자 클로닝을 통해 달성되었다. 이 접근법은 강건하기는 하지만, 확장이 불가능하다. 조기의 화학적 유전자 합성 노력은 중복 서열 상동성을 갖는 다수의 올리고핵산을 제조하는 것에 주력하였다. 이어서, 풀링하고, 다회에 걸쳐 폴리머라제 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction)을 수행하여 중복 올리고핵산을 전장의 이중 가닥 유전자로 연쇄시킬 수 있다. 장시간 소요, 노동 집약적인 구성, 다량의 포스포라미다이트 요구, 고가인 원료, 및 하류 단계에 필요한 양보다 유의적으로 더 적은, 나노몰 정도인 양의 최종 생성물의 제조를 비롯한 다수의 인자가 상기 방법을 방해하고, 다수의 별개의 올리고핵산은 유전자 1개의 합성을 준비하는 데 한 96 웰 플레이트를 필요로 하였다.
마이크로어레이 상에서의 올리고핵산 합성이 유전자 합성 처리량을 유의적으로 증가시켰다. 다수의 올리고핵산은 마이크로어레이 표면 상에서 합성된 후, 절단되고, 함께 풀링될 수 있다. 특정 유전자가 되는 각 올리고핵산은, 올리고뉴클레오티드의 특정 하위집단이 데풀링되도록 하고, 관심의 대상이 되는 유전자로 조립될 수 있도록 하는 독특한 바코드 서열을 함유한다. 본 프로세스 중 상기 단계에서, 각각의 하위풀은 96 웰 플레이트 중의 한 웰로 전달되고, 이를 통해 96개의 유전자로의 처리량은 증가된다. 이러한 방법의 처리량은 고전적 방법보다 100배 정도 더 높지만, 비용 효율이 부족하고, 왕복 소요 시간은 느리기 때문에, 한 번에 수천 개의 서열을 필요로 하는 디자인, 구축, 시험 사이클을 적절히 지원하지 못한다.
본원에서는 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 코딩하는 소정의 서열을 제공하는 단계로서, 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산 각각은 단일 기준 서열과 비교하여 변이체 코돈 서열을 코딩하는 것인 단계; 표면을 갖는 구조물을 제공하는 단계; 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 합성하는 단계로서, 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산 각각이 상기 표면으로부터 신장되는 것인 단계; 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 DNA 폴리머라제 및 단일 기준 서열과 혼합하여 변이체 핵산의 라이브러리를 형성하는 단계; 변이체 핵산의 라이브러리를 세포로 전달하고, 복수의 변이체 단백질을 발현시키는 단계; 및 복수의 변이체 단백질들 중 한 변이체 단백질과 연관된 활성을 확인하는 단계로서, 상기 활성은 단일 기준 서열에 의해 코딩된 단백질과 비교하여 조절되는 것인 단계를 포함하는, 단백질 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 본원에서는 활성이 세포의 생식, 성장, 부착, 사멸, 이동, 에너지 생산, 산소 이용률, 대사 활성, 세포 신호전달, 노화, 자유 라디칼 손상에 대한 반응, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 세포가 진핵 세포 또는 원핵 세포인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 세포가 박테리아, 식물, 마우스 또는 영장류의 세포인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 변이체 핵산의 라이브러리가 변이체 유전자 또는 그의 단편에 대한 서열을 코딩하는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 변이체 단백질이 항체, 효소 또는 펩티드인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 변이체 단백질이 또 다른 분자에 대하여 증진되거나 감소된 결합 친화도를 갖는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 변이체 단백질이 증진되거나 감소된 효소 활성을 갖는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 변이체 핵산의 라이브러리에 의해 코딩된 단일 변이체를 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산이 복수의 동일하지 않은 올리고핵산에 대한 소정의 서열과 비교하여 총 오류율이 1,000개의 염기 중 1개 미만인 방법을 추가로 제공한다.
본원에서는 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 코딩하는 소정의 서열을 제공하는 단계로서, 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산 각각은 단일 기준 서열과 비교하여 소정의 변이체 서열을 코딩하는 것인 단계; 표면을 갖는 구조물을 제공하는 단계; 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 합성하는 단계로서, 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산 각각이 상기 표면으로부터 신장되고, 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산은, 상기 복수의 동일하지 않은 올리고핵산에 대한 소정의 서열과 비교하여 총 오류율이 1,000개의 염기 중 1개 미만인 단계; 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 DNA 폴리머라제 및 단일 기준 서열과 혼합하여 변이체 핵산의 라이브러리를 형성하는 단계; 변이체 핵산의 라이브러리를 제1 세포 세트로 전달하는 단계; 및 세포 활성의 변화를 측정하는 단계로서, 여기서, 세포 활성은 제1 세포 세트 또는 제2 세포 세트에 대하여 측정되고, 여기서, 제2 세포 세트는 제1 세포 세트로부터 단리된 적어도 하나의 발현 생성물로 처리된 것인 단계를 포함하는, 세포 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 본원에서는 세포 활성이 생식, 성장, 부착, 사멸, 이동, 에너지 생산, 산소 이용률, 대사 활성, 세포 신호전달, 자유 라디칼 손상에 대한 반응, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 제1 세포 세트 또는 제2 세포 세트가 진핵 세포 또는 원핵 세포인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 제1 세포 세트 또는 제2 세포 세트가 박테리아, 식물, 마우스 또는 영장류의 세포인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 변이체 핵산의 라이브러리가 변이체 유전자 또는 그의 단편에 대한 서열을 코딩하는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 각각의 변이체 유전자를 번역하여 단백질을 형성하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 단백질이 항체, 효소 또는 펩티드인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 변이체 핵산의 라이브러리가 항체의 가변 영역 또는 불변 영역의 적어도 일부를 코딩하는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 변이체 핵산의 라이브러리가 항체의 적어도 하나의 CDR 영역을 코딩하는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 단백질이 또 다른 분자에 대하여 증진되거나 감소된 결합 친화도를 갖거나, 또는 단백질이 증진되거나 감소된 효소 활성을 갖는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 변이체 핵산의 라이브러리가 전사 조절 서열을 코딩하는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 전사 조절 서열이 프로모터, UTR 또는 터미네이터 서열인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 변이체 핵산의 라이브러리가 전사될 때, mRNA, miRNA, 또는 shRNA를 코딩하는 서열을 코딩하는 것인 방법을 추가로 제공한다.
본원에서는 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 코딩하는 소정의 서열을 제공하는 단계로서, 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산 각각은 단일 기준 서열과 비교하여 변이체 코돈 서열을 코딩하는 것인 단계; 표면을 갖는 구조물을 제공하는 단계; 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 합성하는 단계로서, 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산 각각이 상기 표면으로부터 신장되는 것인 단계; 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 DNA 폴리머라제 및 단일 기준 서열과 혼합하여 변이체 핵산의 라이브러리를 형성하는 단계; 변이체 핵산의 라이브러리를 피험체로부터 수득된 세포로 전달하는 단계; 변이체 핵산의 라이브러리에 의해 코딩된 변이체 핵산과 연관된 유해 활성의 감소를 확인하는 단계; 및 변이체 핵산의 라이브러리에 의해 코딩된 변이체 핵산을, 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하여 질환 상태를 치료하거나 경감하는 단계를 포함하는, 질환 상태를 치료하거나 경감하는 방법을 제공한다. 본원에서는 질환 상태가 세포 증식성, 자가면역, 바이러스성, 또는 박테리아성 장애와 연관된 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산은, 상기 복수의 동일하지 않은 올리고핵산에 대한 소정의 서열과 비교하여 총 오류율이 1,000개의 염기 중 1개 미만인 방법을 추가로 제공한다.
본원에서는 복수의 동일하지 않은 올리고핵산을 코딩하는 소정의 서열을 제공하는 단계로서, 동일하지 않은 올리고핵산 각각의 길이는 20개 이상의 염기이고, 여기서, 복수의 동일하지 않은 올리고핵산은, 적어도 하나의 서열에 대한 3개 이상의 코돈 각각에 대해 약 19종의 변이체를 코딩하고, 여기서, 복수의 동일하지 않은 올리고핵산은 1종 이상의 유전자 및 그의 변이체를 집합적으로 코딩하는 것인 단계; 표면을 갖는 구조물을 제공하는 단계; 복수의 동일하지 않은 올리고핵산을 합성하는 단계로서, 상기 동일하지 않은 올리고핵산 각각이 상기 표면으로부터 신장되는 것인 단계; 및 복수의 동일하지 않은 올리고핵산으로부터 변이체 핵산의 라이브러리를 조립하는 단계를 포함하는, 핵산 합성 방법을 제공한다. 본원에서는 복수의 동일하지 않은 올리고핵산이 75,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 포함하는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 단일 유전자 및 그의 변이체를 집합적으로 코딩하는 복수의 동일하지 않은 올리고핵산의 서브세트가 상기 구조물 표면 상의 단일 클러스터 내에 위치하는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 구조물 표면이 6,000개 이상의 단일 클러스터를 포함하는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 각각의 클러스터가 직경이 약 0.5 내지 2 mm인 채널 내에 위치하는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 단일 클러스터가 핵산 신장을 위한 50 내지 500개의 좌위를 포함하는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 복수의 동일하지 않은 올리고핵산이 1종 초과의 유전자의 변이체를 집합적으로 코딩하는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 복수의 동일하지 않은 올리고핵산이 5,000종 이상의 유전자의 변이체를 집합적으로 코딩하는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 변이체 핵산의 라이브러리가 효소, 펩티드 또는 항체의 적어도 일부를 코딩하는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 각각의 변이체 핵산이 유전자의 적어도 85%에 대한 서열을 코딩하는 것인 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 단백질 라이브러리가, 집합적으로 본원에 기술된 동일하지 않은 올리고핵산을 포함하는 복수의 발현 구축물의 발현에 의해 생성된 것인 방법을 추가로 제공한다.
본원에서는 복수의 동일하지 않은 올리고핵산을 포함하는 올리고핵산 라이브러리로서, 여기서, 동일하지 않은 올리고핵산 각각의 길이는 적어도 12개의 염기이고, 여기서, 복수의 동일하지 않은 올리고핵산은 3개 이상의 코돈 각각에 대해 약 19종의 변이체를 코딩하고, 여기서, 복수의 동일하지 않은 올리고핵산은, 상기 복수의 동일하지 않은 올리고핵산에 대한 소정의 서열과 비교하여 총 오류율이 1,000개의 염기 중 1개 미만인 올리고핵산 라이브러리를 제공한다. 본원에서는 복수의 동일하지 않은 올리고핵산이 복수의 동일하지 않은 올리고핵산에 대한 소정의 서열과 비교하여 총 오류율이 1,500개의 염기 중 1개 미만인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 복수의 동일하지 않은 올리고핵산에 대한 소정의 서열과 비교하여 총 오류율이 2,000개의 염기 중 1개 미만인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 각각의 복수의 동일하지 않은 올리고핵산의 길이가 적어도 30개의 염기인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 각각의 복수의 동일하지 않은 올리고핵산의 길이가 적어도 50개의 염기인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 각각의 복수의 동일하지 않은 올리고핵산의 길이가 12 내지 100개의 염기인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 복수의 동일하지 않은 올리고핵산이 집합적으로 유전자의 적어도 85%에 대한 서열을 코딩하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 복수의 동일하지 않은 올리고핵산이 집합적으로 유전자 중 복수의 엑손에 대한 서열을 코딩하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 유전자가 항체, 효소 또는 펩티드의 적어도 일부를 코딩하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 항체의 가변 영역 또는 불변 영역을 코딩하는 올리고핵산을 포함하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 복수의 동일하지 않은 올리고핵산이 항체의 적어도 하나의 CDR 영역을 코딩하는 올리고핵산을 포함하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 복수의 동일하지 않은 올리고핵산이 집합적으로 발현 카세트의 하나 이상의 세그먼트에 대한 서열을 코딩하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 발현 카세트가 적어도 하나의 프로모터 영역을 포함하고, 복수의 동일하지 않은 올리고핵산이 프로모터 영역의 적어도 일부를 코딩하는 올리고핵산을 포함하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 발현 카세트가 2개의 프로모터 영역을 포함하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 3개 이상의 코돈이 연속적으로 존재하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 3개 이상의 코돈이 연속적으로 존재하지 않는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 3개 이상의 코돈 중 적어도 2개가 서로 적어도 하나의 코돈 위치에 의해 이격되어 있는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 라이브러리가 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 코돈 중 코돈 변이체를 코딩하는 동일하지 않은 올리고핵산을 포함하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 복수의 동일하지 않은 올리고핵산이 적어도 4개의 코돈 중 모든 가능한 코돈 변이체를 코딩하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 동일하지 않은 올리고핵산 중 어느 것도 3개 초과의 히스티딘 잔기에 대한 코돈을 코딩하지 않는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 동일하지 않은 올리고핵산 중 어느 것도 4개 초과의 히스티딘 잔기에 대한 코돈을 코딩하지 않는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다.
본원에서는 75,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 포함하는 올리고핵산 라이브러리로서, 여기서, 각각의 75,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산의 길이가 적어도 30개의 염기이고, 여기서, 75,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산이 적어도 하나의 서열에 대한 3개 이상의 코돈 각각에 대해 적어도 3종의 변이체를 코딩하고, 여기서, 75,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산이 복수의 동일하지 않은 올리고핵산에 대한 소정의 서열과 비교하여 총 오류율이 1,000개의 염기 중 1개 미만인 올리고핵산 라이브러리를 제공한다. 본원에서는 75,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산이 75,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산에 대한 소정의 서열과 비교하여 총 오류율이 1,500개의 염기 중 1개 미만인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 각각의 75,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산이 적어도 50개의 염기를 포함하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 75,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산이 집합적으로 유전자의 적어도 85%에 대한 서열을 코딩하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 75,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산이 집합적으로 동일 유전자 중 복수의 엑손에 대한 서열을 코딩하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 유전자가 항체, 효소, 또는 어댑터 단백질의 적어도 일부를 코딩하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 75,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산이 항체의 가변 영역 또는 불변 영역을 코딩하는 올리고핵산을 포함하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 75,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산이 항체의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR: complementarity-determining region)을 코딩하는 올리고핵산을 포함하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 75,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산이 집합적으로 발현 카세트의 하나 이상의 세그먼트에 대한 서열을 코딩하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 발현 카세트가 적어도 하나의 프로모터 영역을 포함하고, 75,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산이 프로모터 영역의 적어도 일부를 코딩하는 올리고핵산을 포함하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 발현 카세트가 2개의 프로모터 영역을 포함하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 3개 이상의 코돈이 연속적으로 존재하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 3개 이상의 코돈이 연속적으로 존재하지 않는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 3개 이상의 코돈 중 적어도 2개가 서로 적어도 하나의 코돈 위치에 의해 이격되어 있는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 75,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산이 3개 이상의 코돈 중 모든 가능한 코돈 변이체를 코딩하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 동일하지 않은 올리고핵산 중 어느 것도 3개 초과의 히스티딘 잔기에 대한 코돈을 코딩하지 않는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 동일하지 않은 올리고핵산 중 어느 것도 4개 초과의 히스티딘 잔기에 대한 코돈을 코딩하지 않는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 라이브러리가 적어도 100,000개의 동일하지 않은 올리고핵산을 포함하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 라이브러리가 적어도 700,000개의 동일하지 않은 올리고핵산을 포함하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 라이브러리가 적어도 1,000,000개의 동일하지 않은 올리고핵산을 포함하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다.
본원에서는 복수의 동일하지 않은 올리고핵산을 포함하는 올리고핵산 라이브러리로서, 여기서, 각 동일하지 않은 올리고핵산의 길이는 약 20 내지 130개의 염기이고, 여기서, 복수의 동일하지 않은 올리고핵산이 집합적으로 적어도 하나의 서열에 대한 3개 이상의 코돈 각각에 대해 약 19종의 변이체를 코딩하고, 여기서, 복수의 동일하지 않은 올리고핵산은, 상기 복수의 동일하지 않은 올리고핵산에 대한 소정의 서열과 비교하여 총 오류율이 1,000개의 염기 중 1개 미만인 올리고핵산 라이브러리를 제공한다. 본원에서는 복수의 동일하지 않은 올리고핵산이 50 내지 500개의 동일하지 않은 올리고핵산을 포함하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 복수의 동일하지 않은 올리고핵산이 집합적으로 적어도 50종의 변이체 유전자를 코딩하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 50 내지 500개의 동일하지 않은 올리고핵산이 구조물 표면에 부착되어 있고, 별개의 클러스터 내에 위치하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 50 내지 500개의 동일하지 않은 올리고핵산이 집합적으로 적어도 50종의 변이체 유전자를 코딩하는 것인 올리고핵산 라이브러리를 추가로 제공한다.
참고 문헌 인용
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌, 특허, 및 특허 출원은, 마치 각각의 개별 공개문헌, 특허, 또는 특허 출원이 참조로 인용되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 같은 정도로 본원에서 참조로 인용된다.
도 1a-1d는 PCR 돌연변이유발 단계를 도입한 변이체 생물학적 분자 합성을 위한 프로세스 작업 흐름을 도시한 것이다.
도 2a-2d는 단일의 소정의 코돈 부위에서 참조 올리고핵산 서열과 상이한 핵산 서열을 포함하는 올리고핵산 생성을 위한 프로세스 작업 흐름을 도시한 것이다.
도 3a-3f는 각각의 변이체가 단일 코돈 위치에 상이한 핵산 서열을 포함하는 것인 올리고핵산 변이체 세트를 주형 올리고핵산으로 생성하기 위한 대안적 작업 흐름을 도시한 것이다. 각각의 변이체 올리고핵산은 그의 단일 코돈 위치에서 상이한 아미노산을 코딩하고, 상이한 코돈은 X, Y, 및 Z로 표시된다.
도 4a-4e는 각각의 잔기가 단일 동그라미로 표시된, 다수의 아미노산을 갖는 참조 아미노산 서열(도 4a), 및 본원에 기술된 방법을 사용하여 생성된 변이체 아미노산 서열(도 4b, 4c, 4d, & 4e)을 도시한 것이다. 참조 아미노산 서열 및 변이체 서열은 본원에 기술된 프로세스에 의해 생성된 핵산 및 그의 변이체에 의해 코딩된 것이다.
도 5a-5b는 참조 아미노산 서열(도 5a, 서열 번호: 24), 및 각각의 변이체가 ("X"로 표시되는) 단일의 잔기 변이체를 포함하는 것인 변이체 아미노산 서열의 라이브러리(도 5b, 출현 순서대로 각각 서열 번호: 25-31)를 도시한 것이다. 참조 아미노산 서열 및 변이체 서열은 본원에 기술된 프로세스에 의해 생성된 핵산 및 그의 변이체에 의해 코딩된 것이다.
도 6a-6b는 참조 아미노산 서열(도 6a), 및 각각의 변이체가 두 부위에 단일 위치 변이체를 포함하는 것인 변이체 아미노산 서열의 라이브러리(도 6b)를 도시한 것이다. 각각의 변이체는 다르게 패턴화된 동그라미로 표시되어 있다. 참조 아미노산 서열 및 변이체 서열은 본원에 기술된 프로세스에 의해 생성된 핵산 및 그의 변이체에 의해 코딩된 것이다.
도 7a-7b는 참조 아미노산 서열(도 7a), 및 각 스트레치가, 서열이 참조 아미노산 서열과 상이한 (히스티딘을 코딩하는) 3개 부위의 위치 변이체를 갖는 것인 (동그라미 주위에 테두리 상자로 표시된) 아미노산 스트레치를 각각의 변이체가 포함하는 것인 변이체 아미노산 서열의 라이브러리(도 7b)를 도시한 것이다. 참조 아미노산 서열 및 변이체 서열은 본원에 기술된 프로세스에 의해 생성된 핵산 및 그의 변이체에 의해 코딩된 것이다.
도 8a-8b는 참조 아미노산 서열(도 8a), 및 각 스트레치가, 서열이 참조 아미노산 서열과 상이한 (패턴화된 동그라미로 표시된) 1개 부위의 단일 위치 변이체를 갖는 것인 (동그라미 주위에 테두리 상자로 표시된) 2개의 아미노산 스트레치를 각각의 변이체가 포함하는 것인 변이체 아미노산 서열의 라이브러리(도 8b)를 도시한 것이다. 참조 아미노산 서열 및 변이체 서열은 본원에 기술된 프로세스에 의해 생성된 핵산 및 그의 변이체에 의해 코딩된 것이다.
도 9a-9b는 참조 아미노산 서열(도 9a), 및 각 스트레치가, 서열이 참조 아미노산 서열과 상이한 단일 부위의 다중 위치 변이체를 갖는 것인 (패턴화된 동그라미로 표시된) 아미노산 스트레치를 각각의 변이체가 포함하는 것인 아미노산 서열 변이체의 라이브러리(도 9b)를 도시한 것이다. 본 도면에서, 5개 위치는 상이하며, 여기서, 1번 위치는 50/50 K/R 비를 가지고; 2번 위치는 50/25/25 V/L/S 비를 가지고, 3번 위치는 50/25/25 Y/R/D 비를 가지고, 4번 위치는 모든 아미노산에 대하여 동일한 비를 가지고, 5번 위치는 G/P에 대해 75/25 비를 가진다. 참조 아미노산 서열 및 변이체 서열은 본원에 기술된 프로세스에 의해 생성된 핵산 및 그의 변이체에 의해 코딩된 것이다.
도 10은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 갖는 항체를 코딩하는 주형 올리고핵산을 도시하는 것으로서, 여기서, 각 CDR 영역은 변이를 위한 다중 부위를 포함하고, (별표로 표시된) 각 단일 부위는, 주형 올리고핵산 서열과 상이한 임의의 코돈 서열과 상호교환이 가능한 단일 위치 및/또는 다중, 연속 위치의 스트레치를 포함하는 것이다.
도 11은 발현 카세트의 변이체 라이브러리를 생성하기 위해 2개의 발현 카세트 섹션(예컨대, 프로모터, 오픈 리딩 프레임, 및 터미네이터)을 교환함으로써 제조된 예시적인 개수의 변이체를 도시한 것이다.
도 12는 본원에 개시된 바와 같은 유전자 합성을 위한 예시적인 프로세스 작업 흐름을 나타내는 단계 다이어그램을 보여주는 것이다.
도 13은 컴퓨터 시스템의 예를 도시한 것이다.
도 14는 컴퓨터 시스템의 컴퓨터 아키텍처를 도시한 블록 다이어그램이다.
도 15는 복수의 컴퓨터 시스템, 복수의 휴대 전화 및 개인 정보 단말기, 및 네트워크 부착 저장 장치(NAS: Network Attached Storage)를 도입하도록 구성된 네트워크를 나타내는 다이어그램이다.
도 16은 공유 가상 주소 메모리 공간을 사용하는 멀티프로세서 컴퓨터 시스템의 블록 다이어그램이다.
도 17은 겔 전기영동에 의해 분리된 PCR 반응 생성물의 바이오애널라이저(BioAnalyzer) 플롯을 도시한 것이다.
도 18은 각 PCR 생성물 세트가 단일 코돈 위치에서 야생형 주형 핵산과 서열이 상이하고, 여기서, 각 세트의 단일 코돈 위치는 야생형 주형 핵산 서열 중 상이한 부위에 위치하는 것인, 96개의 PCR 생성물 세트를 보여주는 전기영동도를 도시한 것이다. 각 PCR 생성물 세트는, 각각의 변이체가 그의 단일 코돈 위치에서 상이한 아미노산을 코딩하는 것인 19종의 변이체 올리고핵산을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 개시내용은 당업계의 기술 범위 내에 포함되어 있는 종래 분자 생물학 기술을 이용한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업계의 숙련가가 보편적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.
정의
본 개시내용 전역에 걸쳐, 다양한 실시양태가 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식의 설명은 단지 편의 및 간결함을 위한 것이며, 임의의 실시양태의 범주에 대한 변경불가능한 제한으로서 해석되어서는 안 된다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 문맥상 달리 분명하게 명시되지 않은 한, 범위에 관한 설명은 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라, 그 범위 내의 개별 수치 값도 하한 단위의 10분의 1까지 구체적으로 개시한 것으로서 간주되어야 한다. 예를 들어, 예컨대, 1 내지 6이라는 범위에 관한 설명은 하위범위, 예컨대, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등 뿐만 아니라, 그 범위 내의 개별 값, 예를 들어, 1.1, 2, 2.3, 5, 5.9도 구체적으로 개시한 것으로서 간주되어야 한다. 이는 범위 폭과 상관없이 적용된다. 이러한 개재 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위 내에 포함될 수 있고, 이 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계를 제외하고 본 개시내용 내에 포괄된다. 문맥상 달리 분명하게 명시되지 않은 한, 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 배제한 범위 또한 본 개시내용 내에 포함된다.
본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기술하기 위한 것이며, 어느 실시양태도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 사용되는 바, 문맥상 달리 분명하게 명시되지 않은 한, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 단수 형태는 복수 형태도 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 사용될 때, "포함하다" 및 "~을 포함하는"이라는 용어는 언급된 특징, 정수, 단계, 작업, 요소 및/또는 성분이 존재함을 명시하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 작업, 요소, 성분, 및/또는 그의 군의 존재 또는 부가를 배제시키는 것은 아님을 추가로 이해할 것이다. 본원에서 사용되는 바, "및/또는"이라는 용어는 연관된 열거 목록 중 하나 이상의 것의 임의의 및 모든 조합을 포함한다.
문맥상 구체적으로 언급되지 않거나, 또는 문맥으로부터 명백해지지 않는 한, 수치 또는 수치 범위와 관련하여 본원에서 사용되는 "약"이라는 용어는 언급된 수치 및 수치 +/- 그의 10%, 또는 범위로 열거된 값인 경우, 열거된 하한 아래로 10% 내지 열거된 상한 위로 10%를 의미하는 것으로 이해된다.
변이체 라이브러리 합성
본원에 기술된 방법은 각각의 것이 적어도 하나의 소정의 참조 핵산 서열의 소정의 변이체를 코딩하는 것인 올리고핵산의 라이브러리의 합성을 제공한다. 일부 경우에서, 소정의 기준 서열은 단백질을 코딩하는 핵산 서열이고, 변이체 라이브러리는, 합성된 핵산에 의해 코딩된 후속 단백질 중의 단일의 잔기의 복수의 상이한 변이체가 표준 번역 프로세스에 의해 생성되도록 적어도 한 단일 코돈의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 변이를 중복 또는 둔단 올리고핵산 프라이머 내로 도입함으로써 핵산 서열 중 합성된 특정 변경을 도입할 수 있다. 대안적으로, 올리고핵산 집단은 집합적으로 긴 핵산(예컨대, 유전자) 및 그의 변이체를 코딩할 수 있다. 이러한 배열로 올리고핵산 핵산은 하이브리드화될 수 있고, 표준 분자 생물학 기술에 의해 긴 핵산(예컨대, 유전자) 및 그의 변이체를 형성할 수 있다. 긴 핵산(예컨대, 유전자) 및 그의 변이체가 세포에서 발현될 때, 변이체 단백질 라이브러리가 생성된다. 유사하게, 본원에서는 RNA 서열(예컨대, miRNA, shRNA, 및 mRNA) 또는 DNA 서열(예컨대, 인핸서, 프로모터, UTR, 및 터미네이터 영역)을 코딩하는 변이체 라이브러리를 합성하는 방법을 제공한다. 또한, 본원에서는 본원에 기술된 방법을 사용하여 합성된 라이브러리 중 선택된 변이체에 대한 하류 적용을 제공한다. 하류 적용은 생물학적으로 관련된 기능, 예컨대, 생화학적 친화도, 효소 활성, 세포 활성 변화가 증진된 변이체 핵산 또는 단백질 서열, 및 질환 상태 치료용 또는 예방용의 변이체 핵산 또는 단백질 서열을 확인하는 것을 포함한다.
PCR 돌연변이유발이 후속되는 합성
올리고핵산의 변이체 라이브러리의 합성을 위한 제1 프로세스는 PCR 돌연변이유발 방법을 위한 것이다. 본 작업 흐름에서, 각 올리고핵산이, 참조 핵산 서열의 소정의 변이체인 소정의 서열을 코딩하는 것인, 복수의 올리고핵산이 합성된다. 도 1a-1d에 도시된 예시적인 작업 흐름에 관한 도면을 참조하면, 여기서, 올리고핵산은 표면 상에서 생성된다. 도 1a는 121개의 좌위를 포함하는 표면의 단일 클러스터의 확대도를 도시한 것이다. 도 1b에 도시된 각각의 올리고핵산은 도 1c의 변이체 긴 핵산의 라이브러리를 제조하기 위하여 참조 핵산 서열으로부터의 증폭을 위해 사용될 수 있는 프라이머이다. 이어서, 변이체 긴 핵산의 라이브러리를 임의적으로 전사 및/또는 번역시켜 도 1d의 변이체 RNA 또는 단백질 라이브러리를 생성한다. 본 예시도에서, 표면이 실질적으로 평면인 장치는 도 1a에 도시된 올리고핵산의 드 노보 합성을 위해 사용된다. 일부 경우에서, 장치는 좌위의 클러스터를 포함하고, 여기서, 각 좌위는 올리고핵산 신장을 위한 부위이다. 일부 경우에서, 단일 클러스터는 원하는 변이체 서열 라이브러리를 생성하는 데 필요한 모든 올리고핵산 변이체를 포함한다. 대안적 방식에서, 플레이트는 클러스터로 분리되지 않은 좌위의 필드를 포함한다.
본원에 기술된 드 노보 합성된 올리고핵산 라이브러리는, 각각이 제1 위치인 위치 "x*"에 적어도 하나의 변이체 서열을 포함하는 것인 복수의 올리고핵산을 포함할 수 있고, 각각의 변이체 올리고핵산는 제1 신장 생성물을 생성하기 위한 제1 라운드의 PCR에서 프라이머로서 사용된다. 이러한 예에서, 제1 올리고핵산(220) 중 위치 "x"는 기준 서열로부터 변이체 코돈 서열, 즉, 19개의 가능한 변이체 중 하나를 코딩한다. 도 2a를 참조한다. 제1 올리고핵산의 것과 중복된 서열을 포함하는 제2 올리고핵산(225) 또한 제2 신장 생성물을 생성하기 위한 별개인 다른 라운드의 PCR에서 프라이머로서 사용된다. 추가로, 외부 프라이머((215), (230))는 긴 핵산 서열로부터의 단편의 증폭을 위해 사용될 수 있다. 생성된 증폭 생성물은 긴 핵산 서열((235), (240))의 단편이다. 도 2b를 참조한다. 이어서, 긴 핵산 서열((235), (240))의 단편을 하이브리드화하고, 신장 반응에 가하여 긴 핵산(245)의 변이체를 형성한다. 도 2c를 참조한다. 제1 및 제2 신장 생성물의 중복 단부가 제2 라운드의 PCR의 프라이머로서 작용할 수 있고, 이로써, 변이체를 함유하는 제3 신장 생성물이 생성될 수 있다(도 2d). 수율을 증가시키기 위해, 긴 핵산의 변이체는 DNA 폴리머라제, 증폭 시약, 및 외부 프라이머((215), (230))를 포함하는 반응에서 증폭된다. 일부 경우에서, 제2 올리고핵산은 제한하는 것은 아니지만, 변이체 부위에 인접한 서열을 포함한다. 대안적 방식에서, 제2 올리고핵산과 중복되는 영역을 갖는 제1 올리고핵산이 생성된다. 이러한 시나리오에서, 최대 19종의 변이체를 위하여 단일 코돈에 변이를 갖는 제1 올리고핵산이 합성된다. 제2 올리고핵산은 변이체 서열을 포함하지 않는다. 임의적으로, 제1 집단은 제1 올리고핵산 변이체, 및 상이한 코돈 부위에 변이체를 코딩하는 추가의 올리고핵산을 포함한다. 대안적으로, 제1 올리고핵산 및 제2 올리고핵산은 둔단 라이게이션을 위해 디자인될 수 있다.
대안적으로, 돌연변이유발 PCR 방법이 도 3a-3f에 도시되어 있다. 상기 프로세스에서, 제1 및 제2 가닥((305), (310))을 포함하는 주형 핵산 분자(300)를 제1 프라이머(315) 및 제2 프라이머(320)를 함유하는 PCR 반응에서 증폭시킨다(도 3a). 증폭 반응은 뉴클레오티드 시약으로서 우라실을 포함한다. 우라실 표지된 신장 생성물(325)(도 3b)을 생성하고, 임의적으로 정제하고, 제1 올리고핵산(335) 및 복수의 제2 올리고핵산(330)을 사용하여 후속 PCR 반응을 위한 주형으로서의 역할을 하고, 이로써, 제1 신장 생성물((340) 및 (345))이 생성된다(도 3c-3d). 본 프로세스에서, 복수의 제2 올리고핵산(330)은 (도 3c에서 X, Y, 및 Z로 표시된) 변이체 서열을 코딩하는 올리고핵산을 포함한다. 우라실 표지된 주형 핵산을 우라실 특이 절제 시약, 예컨대, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터 상업적으로 이용가능한 USER 다이제스트(USER digest)에 의해 분해시킨다. 변이체(335) 및 변이체 X, Y, 및 Z를 포함하는 상이한 코돈(330)을 부가하고, 제한된 PCR 단계를 수행하여 도 3D를 생성한다. 우라실 함유 주형 분해 후, 신장 생성물의 중복 단부는 제1 외부 프라이머(350) 및 제2 외부 프라이머(355)와 함께 조합하여 프라이머로서 작용하는 제1 신장 생성물((340) 및 (345))을 이용하여 PCR 반응을 프라이밍하는 역할을 하고, 이로써, 도 3f의 변이체 부위에 복수의 변이체 X, Y, 및 Z를 함유하는 핵산 분자(360)의 라이브러리가 생성된다.
긴 핵산의 변이체 및 비변이체 부분을 포함하는 집단의 드 노보 합성
변이체 라이브러리 합성을 위한 제2 프로세스에서, 표면은 긴 핵산의 다중 단편의 드 노보 합성을 위해 사용되며, 여기서, 단편 중 적어도 하나는, 각 버전이 상이한 변이체 서열의 것인 다중 버전으로 합성된다. 상기 방식에서, 변이체 긴 범위의 핵산의 라이브러리를 조립하는 데 필요한 단편 모두 드 노보 합성된다. 합성된 단편은 합성 후, 단편 라이브러리가 하이브리드화될 수 있도록 중복 서열을 가질 수 있다. 하이브리드화 후, 임의의 상보적인 갭을 충전시키기 위해 신장 반응을 수행할 수 있다.
대안적으로, 합성된 단편을 프라이머를 이용하여 증폭시킨 후, 그에 대해 둔단 라이게이션 또는 중복 하이브리드화를 수행할 수 있다. 일부 경우에서, 장치는 좌위의 클러스터를 포함하고, 여기서, 각 좌위는 올리고핵산 신장을 위한 부위이다. 일부 경우에서, 단일 클러스터는 원하는 변이체 서열 라이브러리를 생성하기 위해 모든 올리고핵산 변이체 및 소정의 긴 핵산의 다른 단편 서열을 포함한다. 클러스터는 약 50 내지 500개의 좌위를 포함할 수 있다. 일부 방식에서, 클러스터는 500개 초과의 좌위를 포함할 수 있다.
제1 올리고핵산 집단 중의 각각의 개별 올리고핵산은 클러스터의 별개의, 개별적으로 주소지정가능한 좌위 상에서 생성될 수 있다. 한 올리고핵산 변이체는 복수의 개별적으로 주소지정가능한 좌위에 의해 제시될 수 있다. 제1 올리고핵산 집단 중 각각의 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상 제시될 수 있다. 일부 경우에서, 제1 올리고핵산 집단 중 각각의 변이체는 3개 이하의 좌위에서 제시된다. 일부 경우에서, 제1 올리고핵산 집단 중 각각의 변이체는 2개의 좌위에서 제시된다. 일부 경우에서, 제1 올리고핵산 집단 중 각각의 변이체는 오직 단 하나의 단일 좌위에서 제시된다.
본원에서는 중복이 감소된 핵산 라이브러리를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 경우에서, 원하는 변이체 올리고뉴클레오티드를 수득하기 위해 1회 초과로 변이체 올리고뉴클레오티드를 합성할 필요없이 변이체 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 일부 경우에서, 본 개시내용은 원하는 변이체 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 1, 2, 3, 4, 5회, 6, 7, 8, 9, 10회 이상 초과로 변이체 올리고뉴클레오티드를 합성할 필요없이 변이체 올리고뉴클레오티드를 생성하는 방법을 제공한다.
원하는 변이체 올리고뉴클레오티드를 수득하기 위해 1개 초과의 별개의 부위에서 변이체 올리고뉴클레오티드를 합성할 필요없이 변이체 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 본 개시내용은 원하는 변이체 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 1개 초과의 부위, 2개 초과의 부위, 3개 초과의 부위, 4개 초과의 부위, 5개 초과의 부위, 6개 초과의 부위, 7개 초과의 부위, 8개 초과의 부위, 9개 초과의 부위, 또는 10개 초과의 부위에서 변이체 올리고뉴클레오티드를 합성할 필요없이 변이체 올리고뉴클레오티드를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드는 최대 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 별개의 부위에서 합성된다. 동일한 올리고뉴클레오티드는 표면 상의 1, 2, 또는 3개의 별개의 좌위에서 합성될 수 있다.
일부 경우에서, 단일 변이체 올리고뉴클레오티드를 나타내는 좌위의 양은 하류 프로세싱, 예컨대, 증폭 반응 또는 세포 검정법에서 필요한 핵산 물질의 양의 함수이다. 일부 경우에서, 단일 변이체 올리고뉴클레오티드를 나타내는 좌위의 양은 단일 클러스터에서 이용가능한 좌위의 함수이다.
본원에서는 참조 핵산 중 복수의 부위에서 상이한 변이체 올리고핵산을 포함하는 올리고핵산의 라이브러리를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 경우에서, 각각의 변이체 라이브러리는 좌위의 클러스터 내의 개별적으로 주소지정가능한 좌위 상에서 생성된다. 올리고핵산 라이브러리에 의해 제시되는 변이체 부위의 개수는 클러스터 중 개별적으로 주소지정가능한 좌위의 개수 및 각 부위에서의 원하는 변이체의 개수에 의해 결정될 것이라는 것을 이해할 것이다. 일부 경우에서, 각각의 클러스터는 약 50 내지 500개의 좌위를 포함한다. 일부 경우에서, 각각의 클러스터는 100 내지 150개의 좌위를 포함한다.
예시적인 방식에서, 19종의 변이체는 19개의 가능한 변이체 아미노산 각각의 것을 코딩하는 코돈에 상응하는 변이체 부위에서 제시된다. 또 다른 예시적인 경우에서, 61종의 변이체는 19개의 가능한 변이체 아미노산 각각의 것을 코딩하는 트리플릿에 상응하는 변이체 부위에서 제시된다. 비제한적인 예에서, 클러스터는 121개의 개별적으로 주소지정가능한 좌위를 포함한다. 상기 예에서, 올리고핵산 집단은 단일 부위 변이체 각각의 것의 6개의 복제물(6개의 복제물 x 1종의 변이체 부위 x 19종의 변이체 = 114개의 좌위), 이중 부위 변이체 각각의 것의 3개의 복제물(3개의 복제물 x 2종의 변이체 부위 x 19종의 변이체 = 114개의 좌위), 또는 삼중 부위 변이체 각각의 것의 2개의 복제물(2개의 복제물 x 3종의 변이체 부위 x 19종의 변이체 = 114개의 좌위)을 포함한다. 일부 경우에서, 올리고핵산 집단은 4, 5, 6개, 또는 6개 초과의 변이체 부위에 변이체를 포함한다.
코돈 변이
본원에 기술된 변이체 올리고핵산 라이브러리는, 각각의 올리고핵산이 참조 핵산 서열과 비교하여 변이체 코돈 서열을 코딩하는 것인 복수의 올리고핵산를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 제1 올리고핵산 집단의 각각의 올리고핵산은 단일 변이체 부위에 변이체를 함유한다. 일부 경우에서, 제1 올리고핵산 집단은 단일 변이체 부위에 복수의 변이체를 함유하고, 이로써, 제1 올리고핵산 집단은 동일한 변이체 부위에 1개 초과의 변이체를 함유한다. 제1 올리고핵산 집단은 동일한 변이체 부위에 다중 코돈 변이체를 집합적으로 코딩하는 올리고핵산을 포함할 수 있다. 제1 올리고핵산 집단은 동일한 위치에서 최대 19개 이상의 코돈을 집합적으로 코딩하는 올리고핵산을 포함할 수 있다. 제1 올리고핵산 집단은 동일한 위치에서 최대 60종의 변이체 트리플릿을 집합적으로 코딩하는 올리고핵산을 포함할 수 있거나, 또는 제1 올리고핵산 집단은 동일한 위치에서 최대 61개의 상이한 코돈 트리플릿을 집합적으로 코딩하는 올리고핵산을 포함할 수 있다. 각각의 변이체는 번역 동안 상이한 아미노산을 생성하는 코돈을 코딩할 수 있다. 하기 표 1은 변이체 부위에 대하여 가능한 각각의 코돈 (및 대표적인 아미노산)에 관한 목록을 제공한다.
Figure pct00001
올리고핵산 집단은 다중 위치에서 최대 20개의 코돈을 집합적으로 코딩하는 다양한 올리고핵산을 포함할 수 있다. 상기 경우에서, 집단 중 각각의 올리고핵산은 동일한 올리고핵산 중 1개 초과의 위치에서 코돈에 대한 변이를 포함한다. 일부 경우에서, 집단 중 각각의 올리고핵산은 단일 올리고핵산 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 코돈에서 코돈에 대한 변이를 포함한다. 일부 경우에서, 각각의 변이체 긴 핵산은 단일의 긴 핵산 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 코돈에서 코돈에 대한 변이를 포함한다. 일부 경우에서, 변이체 올리고핵산 집단은 단일 올리고핵산 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 코돈에서 코돈에 대한 변이를 포함한다. 일부 경우에서, 변이체 올리고핵산 집단은 단일의 긴 핵산 중 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 이상의 코돈에서 코돈에 대한 변이를 포함한다.
본원에서는 제2 올리고핵산 집단이, 복수의 개별적으로 주소지정가능한 좌위를 함유하는 제2 클러스터 상에서 생성되는 것인 프로세스를 제공한다. 제2 올리고핵산 집단은, 각 코돈 위치에 대하여 불변인 (즉, 각 위치에서 동일한 아미노산을 코딩하는) 복수의 제2 올리고핵산을 포함할 수 있다. 제2 올리고핵산은 제1 올리고핵산의 적어도 일부와 중복될 수 있다. 일부 경우에서, 제2 올리고핵산은 제1 올리고핵산에 있는 변이체 부위를 함유하지 않는다. 대안적으로, 제2 올리고핵산 집단은 하나 이상의 코돈 위치에 대한 변이체를 포함하는 복수의 제2 올리고핵산을 포함할 수 있다.
본원에서는 다중 코돈 위치에 변이체를 포함하는 단일의 올리고핵산 집단을 생성하는 것인, 올리고핵산의 라이브러리를 합성하는 방법을 제공한다. 제1 올리고핵산 집단은 복수의 개별적으로 주소지정가능한 좌위를 함유하는 제1 클러스터 상에서 생성될 수 있다. 상기 경우에서, 제1 올리고핵산 집단은 상이한 코돈 위치에 변이체를 포함한다. 일부 경우에서, 상이한 부위는 연속적으로 존재한다(즉, 연속 아미노산을 코딩하는 것이다). 제1 올리고뉴클레오티드 산 집단은 동일한, 또는 추가의 변이체 부위에서 최대 19의 코돈 변이체를 집합적으로 코딩하는 다양한 올리고핵산을 포함할 수 있다. 제1 올리고뉴클레오티드 산 집단은 위치 x에 최대 19종의 변이체, 위치 y에 최대 19종의 변이체, 및 위치 z에 최대 19종의 변이체를 함유하는 복수의 제1 올리고핵산을 포함할 수 있다. 상기 방식에서, 각각의 변이체는 상이한 아미노산을 코딩하고, 이로써, 각각의 상이한 변이체 부위에서 최대 19의 아미노산 변이체가 코딩된다. 추가 경우에서, 제2 올리고핵산 집단은 복수의 개별적으로 주소지정가능한 좌위를 함유하는 제2 클러스터 상에서 생성된다. 제2 올리고핵산 집단은, 각 코돈 위치에 대하여 불변인 (즉, 각 위치에서 동일한 아미노산을 코딩하는) 복수의 제2 올리고핵산을 포함할 수 있다. 제2 올리고핵산은 제1 올리고핵산의 적어도 일부와 중복될 수 있다. 일부 경우에서, 제2 올리고핵산은 제1 올리고핵산에 있는 변이체 부위를 함유하지 않을 수 있다.
본원에 기술된 프로세스에 의해 생성된 변이체 핵산 라이브러리는 변이체 단백질 라이브러리를 생성한다. 제1의 예시적인 방식에서, 주형 올리고핵산은, 전사 및 번역되었을 때, 단일 동그라미로 표시된, 다수의 코돈 위치를 갖는 참조 아미노산 서열(도 4a)을 생성하는 서열을 코딩한다. 주형의 올리고핵산 변이체는 본원에 기술된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 일부 경우에서, 단일 변이체가 올리고핵산 중에 존재하고, 이로써, 단일 아미노산 서열이 생성된다(도 4b). 일부 경우에서, 하나 이상의 코돈에 의해 이격되어 있는 것인 1개 초과의 변이체가 올리고핵산 중에 존재하고, 이로써, 변이체 잔기 사이가 이격되어 있는 단백질이 생성된다(도 4c). 일부 경우에서, 변이체가 일련으로 연속되고, 서로 인접하거나, 또는 연속되어 있는 것인 1개 초과의 변이체가 올리고핵산 중에 존재하고, 이로써, 잔기로 이루어진, 이격화된 변이체 스트레치가 생성된다(도 4d). 일부 경우에서, 각각의 변이체 스트레치가 일련으로 연속되고, 인접한 또는 연속되어 있는 변이체를 포함하는 것인 2종의 변이체 스트레치가 올리고핵산 중에 존재한다(도 4e).
본원에서는 각각의 변이체가 단일 위치 코돈 변이체를 포함하는 것인, 올리고핵산 변이체의 라이브러리를 생성하는 방법을 제공한다. 한 경우에서, 주형 올리고핵산은 도 5a에서 예시적인 아미노산 잔기가 그의 각 1문자 코드 단백질 코돈이 기재된 동그라미로 표시되어 있는 다수의 코돈 위치를 가진다. 도 5b는 변이체 핵산의 라이브러리에 의해 코딩된 아미노산 변이체의 라이브러리를 도시하는 것이며, 여기서, 각각의 변이체는 상이한 단일 부위에 위치하는, "X"로 표시된 단일 위치 변이체를 포함한다. 제1 위치 변이체는 알라닌을 대체하는 임의의 코돈을 가지고, 제2 변이체는 트립토판을 대체하는 변이체 핵산의 라이브러리에 의해 코딩되는 임의의 코돈을 가지고, 제3 변이체는 이소류신을 대체하는 임의의 코돈을 가지고, 제4 변이체는 리신을 대체하는 임의의 코돈을 가지고, 제5 변이체는 아르기닌을 대체하는 임의의 코돈을 가지고, 제6 변이체는 글루탐산을 대체하는 임의의 코돈을 가지고, 제7 변이체는 글루타민을 대체하는 임의의 코돈을 가진다. 모든 코돈 변이체 또는 모든 코돈 변이체보다 적은 개수의 코돈 변이체가 변이체 핵산 라이브러리에 의해 코딩되었을 때, 생성된, 상응하는 아미노산 서열 변이체의 집단은 단백질 발현(즉, DNA 전사, 이어서, 번역 및 프로세싱 이벤트가 수행되는 표준 세포 이벤트) 후에 생성된다.
일부 방식에서, 다중 부위의 단일 위치 변이체를 포함하는 라이브러리가 생성된다. 도 6a에 도시된 바와 같은 야생형 주형을 제공한다. 도 6b는 2개 부위의 단일 위치 코돈 변이체를 포함하는 생성된 아미노산 서열을 도시한 것이며, 여기서, 상이한 아미노산을 코딩하는 각각의 코돈 변이체는 다르게 패턴화된 동그라미로 표시되어 있다.
본원에서는 다중 부위, 단일 위치 변이체의 스트레치를 갖는 라이브러리를 생성하는 방법을 제공한다. 각각의 올리고핵산 스트레치는 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 변이체를 가질 수 있다. 각각의 올리고핵산 스트레치 적어도 1종의 변이체를 가질 수 있다. 각각의 올리고핵산 스트레치는 적어도 2종의 변이체를 가질 수 있다. 각각의 올리고핵산 스트레치는 적어도 3종의 변이체를 가질 수 있다. 예를 들어, 5개의 올리고핵산 스트레치는 1종의 변이체를 가질 수 있다. 5개의 올리고핵산 스트레치는 2종의 변이체를 가질 수 있다. 5개의 올리고핵산 스트레치는 3종의 변이체를 가질 수 있다. 5개의 올리고핵산 스트레치는 4종의 변이체를 가질 수 있다. 예를 들어, 4개의 올리고핵산 스트레치는 1종의 변이체를 가질 수 있다. 4개의 올리고핵산 스트레치는 2종의 변이체를 가질 수 있다. 4개의 올리고핵산 스트레치는 3종의 변이체를 가질 수 있다. 4개의 올리고핵산 스트레치는 4종의 변이체를 가질 수 있다.
일부 경우에서, 단일 위치 변이체는 모두 동일한 아미노산, 예컨대, 히스티딘을 코딩할 수 있다. 도 7a에 도시된 바와 같은 참조 아미노산 서열을 제공한다. 상기 방식에서, 올리고핵산 스트레치는 다중 부위의 단일 위치 변이체를 코딩하고, 도 7b에서와 같이, 발현되었을 때, 모두가 히스티딘을 코딩하는 것인 단일 위치 변이체를 갖는 아미노산 서열이 생성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 의해 합성된 변이체 라이브러리는 생성된 아미노산 서열 중 4개 초과의 히스티딘 잔기를 코딩하지 않는다.
일부 경우에서, 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 핵산의 변이체 라이브러리는 아미노산 서열이 별개의 변이 스트레치를 갖는 것인 아미노산 서열의 발현을 제공한다. 주형 아미노산 서열은 도 8a에 도시되어 있다. 올리고핵산 스트레치는 2개의 스트레치 중에 단 하나의 변이체 코돈을 가질 수 있고, 발현되었을 때, 도 8b에 도시되어 있는 아미노산 서열이 생성될 수 있다. 변이체는 아미노산 변이가 단일 스트레치 중 상이한 위치에 존재한다는 것을 나타내기 위해 도 8b에서 다르게 패턴화된 동그라미로 표시되어 있다.
본원에서는 각 부위에 대한 변이체가 선택적으로 조절되는 것인, 1, 2, 3개 이상의 코돈 변이체를 포함하는 올리고핵산 라이브러리를 합성하는 방법 및 장치를 제공한다. 단일 부위 변이체에 대한 두 아미노산의 비는 약 1:100, 1:50, 1:10, 1:5, 1:3, 1:2, 1:1일 수 있다. 단일 부위 변이체에 대한 3개의 아미노산의 비는 약 1:1:100, 1:1:50, 1:1:20, 1:1:10, 1:1:5, 1:1:3, 1:1:2, 1:1:1, 1:10:10, 1:5:5, 1:3:3, 또는 1:2:2일 수 있다. 도 9a는 야생형 핵산 서열에 의해 코딩된 야생형 참조 아미노산 서열을 도시한 것이다. 도 9b는 각 위치가 생성된 변이체 단백질 라이브러리 중 특정 비로 아미노산을 가질 수 있는 것인 (패턴화된 동그라미로 표시된) 서열 스트레치를 각각의 변이체가 포함하는 것인 아미노산 변이체의 라이브러리를 도시한 것이다. 생성된 변이체 단백질 라이브러리는 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 변이체 핵산 라이브러리에 의해 코딩된다. 이러한 예시에서, 5개의 위치는 달라진다: 제1 위치(900)는 50/50 K/R 비를 가지고; 제2 위치(910)는 50/25/25 V/L/S 비를 가지고, 제3 위치(920)는 50/25/25 Y/R/D 비를 가지고, 제4 위치(930)는 20개의 아미노산 모두에 대하여 동일한 비를 가지고, 제5 위치(940)는 G/P에 대하여 75/25 비를 가진다. 본원에 기술된 비는 단지 예시일 뿐이다.
일부 경우에서, 궁극적으로는 단백질의 아미노산 서열로 번역되는 핵산 서열을 코딩하는 합성된 변이체 라이브러리가 생성된다. 예시적인 아미노산 서열은 작은 펩티드 뿐만 아니라, 큰 펩티드, 예컨대, 항체 서열의 적어도 일부를 코딩하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 합성된 각각의 올리고핵산은 항체 서열의 일부 중의 변이체 코돈을 코딩한다. 합성된 변이체 올리고핵산의 일부가 코딩하는 예시적인 항체 서열은 그의 항원 결합 또는 가변 영역, 또는 그의 단편을 포함한다. 본원에 기술된 올리고핵산이 그의 일부를 코딩하는 것인 항체 단편의 예로는 제한 없이, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 본원에 기술된 올리고핵산이 그의 일부를 코딩하는 것인 항체 영역의 예로는 제한 없이, Fc 영역, Fab 영역, Fab 영역의 가변 영역, Fab 영역의 불변 영역, 중쇄 또는 경쇄(VH 또는 VL)의 가변 도메인, 또는 VH 또는 VL의 특이적인 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 변이체 라이브러리를 통해 본원에 기술된 항체 영역 중 하나 이상의 것을 변이시킬 수 있다. 한 예시적인 프로세스에서, 수개의 CDR을 코딩하는 핵산에 대한 변이체 라이브러리가 생성된다. 도 10을 참조한다. 각 CDR 영역이 변이를 위한 다중 부위를 포함하는 것인 CDR1(1010), CDR2(1020), 및 CDR3(1030) 영역을 갖는 항체를 코딩하는 주형 핵산은 본원에 기술된 방법에 의해 변형된다. 중쇄 또는 경쇄의 단일 가변 도메인 중 3개의 CDR 각각에 대한 변이 (1015), (1025), 및 (1035)가 생성된다. 별표로 표시된 각 부위는, 주형 올리고핵산 서열과 상이한 임의의 코돈 서열과 상호교환이 가능한 단일 위치, 다중, 연속 위치의 스트레치, 또는 그 둘 모두를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 방법을 사용함으로써 변이체 라이브러리의 다양성은 최대 ~1010 이상의 다양도로까지 크게 증가될 수 있다.
발현 카세트의 변이
일부 경우에서, 발현 구축물의 일부를 코딩하는 합성된 변이체 라이브러리가 생성된다. 발현 구축물의 일부의 예로는 프로모터, 오픈 리딩 프레임, 및 종결 종결 영역을 포함한다. 일부 경우에서, 발현 구축물은 1, 2, 3개 이상의 발현 카세트를 코딩한다. 도 11에 도시된 바와 같이, 발현 구축물 카세트의 일부를 구성하는 단일 부위 또는 다중 부위의 별개 영역에서의 코돈 변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 라이브러리가 생성될 수 있다. 2개의 구축물을 발현하는 한 카세트를 생성하기 위해 제1 프로모터(1110), 제1 오픈 리딩 프레임(1120), 제1 터미네이터(1130), 제2 프로모터(1140), 제2 오픈 리딩 프레임(1150), 또는 제2 터미네이터 서열(1160)로 이루어진 변이체 서열의 적어도 일부를 코딩하는 변이체 올리고핵산을 합성하였다. 이전 실시예에서 기술된 바와 같이, 증폭 라운드 후, 1,024개의 발현 구축물로 이루어진 라이브러리가 생성되었다. 도 11은 단지 일례의 방식을 제공하는 것이다. 일부 경우에서, 추가의 조절 서열, 예컨대, 비번역 조절 영역(UTR: untranslated regulatory region) 또는 인핸서 영역 또한 본원에서 언급된 발현 카세트에 포함된다. 발현 카세트는, 그에 대한 변이체 서열이 본원에 기술된 방법에 의해 생성되는 것인 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 구성 요소를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 발현 구축물은 다중시스트론성 벡터 중 1종 초과의 유전자를 포함한다. 한 예에서, 합성된 DNA 올리고핵산을 바이러스 벡터(예컨대, 렌티바이러스) 내로 삽입한 후, 세포로의 형질도입을 위해 패키징하거나, 또는 세포 내로의 전달을 위해 비바이러스 벡터로 삽입한 후, 스크리닝 및 분석을 수행한다.
본원에 개시된 핵산을 삽입하기 위한 발현 벡터는 진핵성 벡터(예컨대, 박테리아 및 진균) 및 원핵성 벡터(예컨대, 포유동물, 식물 및 곤충 발현 벡터)를 포함한다. 예시적인 발현 벡터로는 제한 없이, 포유동물 발현 벡터: pSF-CMV-NEO-NH2-PPT-3XFLAG, pSF-CMV-NEO-COOH-3XFLAG, pSF-CMV-PURO-NH2-GST-TEV, pSF-OXB20-COOH-TEV-FLAG(R)-6His, pCEP4 pDEST27, pSF-CMV-Ub-KrYFP, pSF-CMV-FMDV-daGFP, pEF1a-m체리-N1 벡터(pEF1a-mCherry-N1 Vector), pEF1a-td토마토 벡터(pEF1a-tdTomato Vector), pSF-CMV-FMDV-하이그로(pSF-CMV-FMDV-Hygro), pSF-CMV-PGK-퓨로(pSF-CMV-PGK-Puro), pMCP-tag(m), 및 pSF-CMV-PURO-NH2-CMYC; 박테리아 발현 벡터: pSF-OXB20-베타Gal(pSF-OXB20-BetaGal), pSF-OXB20-Fluc, pSF-OXB20, 및 pSF-Tac; 식물 발현 벡터: pRI 101-AN DNA 및 p캠비아2301(pCambia2301); 및 효모 발현 벡터: pTYB21 및 pKLAC2, 및 곤충 벡터: pAc5.1/V5-His A 및 pDEST8을 포함한다. 예시적인 세포로는 제한 없이, 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함한다. 예시적인 진핵 세포로는 제한 없이, 동물 세포, 식물 세포, 및 진균 세포를 포함한다. 예시적인 동물 세포로는 제한 없이, 곤충 세포, 어류 세포 포유동물 세포를 포함한다. 예시적인 포유동물 세포로는 마우스 세포, 인간 세포 및 영장류의 세포를 포함한다. 본원에 기술된 방법에 의해 합성된 핵산은 제한하는 것은 아니지만, 형질감염, 형질도입, 및 전기천공을 비롯한, 당업계에 공지된 각종 방법에 의해 수행됨으로써 세포 내로 전달될 수 있다. 시험되는 세포 기능의 예로는 제한 없이, 세포 증식, 이동/부착, 대사 활성, 및 세포 신호전달 활성 변화를 포함한다.
고도의 병렬식 핵산 합성
본원에서는 혁신적인 합성 플랫폼을 생성하기 위하여 소형화, 병렬화, 및 규소 상의 나노웰 내에서 올리고핵산 합성에서부터 유전자 조립까지의 종단 간 프로세스의 수직적 통합을 이용하는 플랫폼 접근법을 제공한다. 96 웰 플레이트와 동일한 풋프린트를 갖는 본원에 기술된 장치는, 단일의 고도로 병렬화된 작업에서 최대 대략 1,000,000개 이상의 올리고핵산, 또는 10,000종 이상의 유전자를 생성하는 종래의 합성 방법과 비교하여 최대 1,000배 이상만큼 처리량을 증가시킬 수 있는 규소 합성 플랫폼을 제공한다.
차세대 서열분석이 출현함에 따라, 고해상도 게놈 데이터는 정상적인 생물학 및 질환 발병기전, 둘 모두에서 다양한 유전자의 생물학적 역할을 철저하게 조사하는 연구를 위해 중요한 인자가 되었다. 분자 생물학의 중심 원리 및 "순차적인 정보의 잔기 하나씩 하나씩 이루어지는 전달"이라는 개념이 이러한 연구의 핵심이다. DNA에서 코딩되는 게놈 정보는 메세지로 전사되고, 이는 주어진 생물학적 경로 내에서 활성 생성물인 단백질로 번역된다.
또 다른 흥미로운 연구 영역은 고도로 특이적인 세포 표면에 초점을 맞춘 치료학적 분자의 발견, 개발, 및 제조에 관한 것이다. 고도로 다양한 DNA 서열 라이브러리가 표적화된 치료제의 개발 경로의 핵심이 된다. 유전자 돌연변이체는, 이상적으로 그의 치료학적 표적에 대하여 높은 친화도를 가진 단백질의 고도한 발현을 위해 최적화된 유전자로 종결되는 디자인, 구축, 및 시험 단백질 조작 사이클에서 단백질을 발현시키는 데 사용된다. 한 예로서, 수용체의 결합 포켓을 고려한다. 결합 포켓 내의 모든 잔기의 모든 서열 순열을 시험할 수 있는 능력을 통해 철저히 조사할 수 있고, 성공의 기회를 증가시킬 수 있다. 연구원이 수용체 내의 특정 부위에서 모든 가능한 돌연변이를 생성하기 위해 시도하는 포화 돌연변이유발은 이러한 개발 도전에 대한 한 접근법을 나타낸다. 비록 고가이고, 시간 및 노동 집약적이기는 하지만, 이를 통해 각각의 변이체는 각 위치 내로 도입될 수 있다. 그에 반해, DNA의 짧은 스트레치 또는 소수의 선택된 위치가 광범위하게 변형될 수 있는 조합 돌연변이유발은 편향성을 보이는 불완전한 변이체 레퍼토리를 생성한다.
약물 개발 경로를 가속화시키기 위해, 시험에 이용될 수 있는 알맞은 위치에서 의도된 빈도로 이용가능한 원하는 변이체를 포함하는 라이브러리-다시 말해, 정밀 라이브러리를 통해서 비용을 절감할 수 있을 뿐만 아니라, 스크리닝 작업을 완료해서 회송하는 데 걸리는 시간을 단축시킬 수 있다. 본원에서는 각각의 의도된 변이체를 원하는 빈도로 정밀하게 도입하는 올리고핵산 합성 변이체 라이브러리를 합성하는 방법을 제공한다. 최종 사용자에게 이는 비용은 절감하고, 스크리닝 시간은 단축시키면서, 서열 공간을 철저하게 샘플링할 뿐만 아니라, 효율적인 방식으로 상기와 같은 가설을 질의할 수 있는 능력으로 해석된다. 게놈와이드 편집이 각각의 변이체 및 서열 순열이 최적의 기능을 위해 시험될 수 있고, 수천 개의 유전자가 전체 경로 및 게놈을 재구축시켜 약물 발견을 위한 생물학적 시스템을 재조작하는 데 사용될 수 있는 라이브러리에서 중요한 경로를 설명할 수 있다.
제1 예에서, 약물 그 자체는 본원에 기술된 방법을 사용함으로써 최적화될 수 있다. 예를 들어, 명시된 항체의 기능을 개선시키기 위해, 상기 항체의 일부를 코딩하는 변이체 올리고핵산 라이브러리를 디자인하고, 합성한다. 이어서, 본원에 기술된 프로세스(예컨대, PCR 돌연변이유발, 이어서, 벡터 내로의 삽입)에 의해 항체에 대한 변이체 핵산 라이브러리를 생성할 수 있다. 이어서, 생산 세포주에서 항체를 발현시키고, 증강된 활성에 대해 스크리닝한다. 예시적인 스크린으로는 항원에의 결합 친화도, 안정성, 또는 효과기 기능(예컨대, ADCC, 보체, 또는 아폽토시스) 조절을 조사하는 것을 포함한다. 항체를 최적화시키는 영역의 예로는 제한 없이, Fc 영역, Fab 영역, Fab 영역의 가변 영역, Fab 영역의 불변 영역, 중쇄 또는 경쇄(VH 또는 VL), VH 또는 VL의 특정 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
대안적으로, 최적화되는 분자는 활성화제 또는 경쟁적 억제제로서 사용하기 위한 수용체 결합 에피토프이다. 핵산의 변이체 라이브러리의 합성 후, 핵산의 변이체 라이브러리를 벡터 내로 삽입한 후, 세포에서 발현될 수 있다. 수용체 항원을 세포(예컨대, 곤충, 포유동물, 또는 박테리아)에서 발현시킨 후, 정제할 수 있거나, 또는 세포(예컨대, 포유동물)에서 발현시켜 서열 변이로부터 초래되는 기능적 결과를 조사할 수 있다. 기능적 결과로는 제한 없이, 단백질 발현, 결합 친화도 및 안정성 변화를 포함한다. 세포 기능적 결과로는 제한 없이, 생식, 성장, 부착, 사멸, 이동, 에너지 생산, 산소 이용률, 대사 활성, 세포 신호전달, 노화, 자유 라디칼 손상에 대한 반응, 또는 이들의 임의의 조합의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 최적화를 위해 선택되는 단백질 유형은 효소, 수송체 단백질s, G 단백질 커플링된 수용체, 전압 개폐 이온 채널, 전사 인자, 폴리머라제, 어댑터 단백질(2개의 다른 단백질을 함께 모으는 역할을 하는, 효소 활성이 없는 단백질), 및 세포골격 단백질을 포함한다. 예시적인 효소 유형으로는 제한 없이, 신호전달 효소(예컨대, 단백질 키나제, 단백질 포스파타제, 포스포디에스테라제, 히스톤 데아세틸라제, 및 GTP아제)를 포함한다.
본원에서는 전체 경로 또는 전체 게놈에 관여하는 분자에 대한 변이체를 포함하는 변이체 핵산 라이브러리를 제공한다. 예시적인 경로로는 제한 없이, 대사, 세포 사멸, 세포 주기 진행, 면역 세포 활성화, 염증 반응, 혈관신생, 림프구신생, 저산소증 및 산화적 스트레스 반응, 또는 세포 부착/이동 경로를 포함한다. 세포 사열 경로 중의 단백질의 예로는 제한 없이, Fas, Cadd, 카스파제 3, 카스파제 6, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10, IAP, TNFR1, TNF, TNFR2, NF-kB, TRAFs, ASK, BAD, 및 Akt를 포함한다. 세포 주기 경로 중의 단백질의 예로는 제한 없이, NFkB, E2F, Rb, p53, p21, 사이클린 A, 사이클린 B, 사이클린 D, 사이클린 E, 및 cdc 25를 포함한다. 세포 이동 경로 중의 단백질의 예로는 제한 없이, Ras, Raf, PLC, 코필린, MEK, ERK, MLP,LIMK, ROCK, RhoA, Src, Rac, 미오신 II, ARP2/3, MAPK, PIP2, 인테그린, 탈린, 킨들린, 미그필린 및 필라민을 포함한다.
본원에 기술된 방법에 의해 합성된 핵산 라이브러리는 각종 세포 유형에서 발현될 수 있다. 예시적인 세포 유형으로는 원핵생물(예컨대, 박테리아 및 진균) 및 진핵생물(예컨대, 식물 및 동물)을 포함한다. 예시적인 동물로는 제한 없이, 마우스, 토끼, 영장류, 어류 및 곤충을 포함한다. 예시적인 식물로는 제한 없이, 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물을 포함한다. 예시적인 식물로는 또한 제한 없이, 미세조류, 켈프, 시아노박테리아, 및 녹조류, 갈조류 및 홍조류, 밀, 담배, 및 옥수수, 벼, 목화, 채소류 및 과실류도 포함한다.
본원에 기술된 방법에 의해 합성된 핵산 라이브러리는 질환 상태와 연관된 각종 세포에서 발현될 수 있다. 질환 상태와 연관된 세포로는 세포주, 조직 샘플, 피험체로부터의 1차 세포, 피험체로부터 확장된 배양된 세포, 또는 모델 시스템 중의 세포를 포함한다. 예시적인 모델 시스템으로는 제한 없이, 질환 상태의 식물 및 동물 모델을 포함한다.
본원에 기술된 방법에 의해 합성된 핵산 라이브러리는 세포 활성 변화를 사정하는 각종 세포 유형에서 발현될 수 있다. 예시적인 세포 활성으로는 제한 없이, 증식, 사이클 진행, 세포 사멸, 부착, 이동, 생식, 세포 신호전달, 에너지 생산, 산소 이용률, 대사 활성, 및 노화, 자유 라디칼 손상에 대한 반응, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
질환 상태의 예방, 감소, 또는 치료와 연관된 변이체 분자를 확인하기 위해, 본원에 기술된 변이체 핵산 라이브러리는 질환 상태와 연관된 세포, 또는 질환 상태가 유도될 수 있는 것인 세포에서 발현된다. 일부 경우에서, 작용제는 세포에서 질환 상태를 유도하는 데 사용된다. 질환 상태 유도를 위한 도구의 예로는 제한 없이, Cre/Lox 재조합 시스템, LPS 염증 유도, 및 저혈당증을 유도하는 스트렙토조토신을 포함한다. 질환 상태와 연관된 세포는 특정 질환 상태를 앓는 피험체로부터의 세포 뿐만 아니라, 모델 시스템으로부터의 세포 또는 배양된 세포일 수 있다. 예시적인 질환 상태로는 박테리아성, 진균성, 바이러스성, 자가면역, 또는 증식성 장애(예컨대, 암)를 포함한다. 일부 경우에서, 변이체 핵산 라이브러리는 모델 시스템, 세포주, 또는 피험체로부터 유래된 1차 세포에서 발현되고, 적어도 하나의 세포 활성 변화에 대하여 스크리닝된다. 예시적인 세포 활성으로는 제한 없이, 증식, 사이클 진행, 세포 사멸, 부착, 이동, 생식, 세포 신호전달, 에너지 생산, 산소 이용률, 대사 활성, 및 노화, 자유 라디칼 손상에 대한 반응, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
기판
본원에서는 각각의 클러스터가 올리고핵산의 부착 및 합성을 지원하는 복수의 좌위를 포함하는 것인 복수의 클러스터를 포함하는 기판을 제공한다. 본원에서 사용되는 바, "좌위"라는 용어는 단일의 소정의 서열을 코딩하는 올리고뉴클레오티드가 표면으로부터 연장되는 것을 지원하는 구조 상의 별개의 영역을 지칭한다. 일부 경우에서, 좌위는 2차원 표면, 예컨대, 실질적으로 평면 상에 위치한다. 일부 경우에서, 좌위란, 예컨대, 웰, 마이크로웰, 채널, 또는 포스트와 같은 표면 상의 별개의 돌출된 또는 함몰된 부위를 지칭한다. 일부 경우에서, 좌위의 표면은 올리고핵산 합성을 위해 적어도 하나의 뉴클레오티드에, 또는 바람직하게, 올리고핵산 집단의 합성을 위해 동일한 뉴클레오티드로 이루어진 집단에 부착되도록 능동적으로 관능화된 물질을 포함한다. 일부 경우에서, 올리고핵산은 동일한 핵산 서열을 코딩하는 올리고핵산 집단을 지칭한다. 일부 경우에서, 장치의 표면은 기판의 하나 또는 복수의 표면을 포함한다.
제공된 시스템 및 방법을 사용하여 라이브러리 내에서 합성된 올리고핵산에 대한 평균 오류율은 1/1,000 미만, 1/1,250 미만, 1/1.500 미만, 1/2,000 미만, 1/3,000 미만, 또는 그보다 덜 빈번할 수 있다. 일부 경우에서, 제공된 시스템 및 방법을 사용하여 라이브러리 내에서 합성된 올리고핵산에 대한 평균 오류율은 1/500, 1/600, 1/700, 1/800, 1/900, 1/1,000, 1/1,100, 1/1,200, 1/1,250, 1/1,300, 1/1,400, 1/1,500, 1/1,600, 1/1,700, 1/1,800, 1/1,900, 1/2,000, 1/3,000 미만, 또는 그 미만이다. 일부 경우에서, 제공된 시스템 및 방법을 사용하여 라이브러리 내에서 합성된 올리고핵산에 대한 평균 오류율은 1/1,000 미만이다.
일부 경우에서, 제공된 시스템 및 방법을 사용하여 라이브러리 내에서 합성된 올리고핵산에 대한 총 오류율은 소정의 서열과 비교하여 1/500, 1/600, 1/700, 1/800, 1/900, 1/1,000, 1/1,100, 1/1,200, 1/1,250, 1/1,300, 1/1,400, 1/1,500, 1/1,600, 1/1,700, 1/1,800, 1/1,900, 1/2,000, 1/3,000 미만, 또는 그 미만일 수 있다. 일부 경우에서, 제공된 시스템 및 방법을 사용하여 라이브러리 내에서 합성된 올리고핵산에 대한 총 오류율은 1/500, 1/600, 1/700, 1/800, 1/900, 또는 1/1,000 미만이다. 일부 경우에서, 제공된 시스템 및 방법을 사용하여 라이브러리 내에서 합성된 올리고핵산에 대한 총 오류율은 1/1,000 미만이다.
일부 경우에서, 제공된 시스템 및 방법을 사용하여 라이브러리 내에서 합성된 올리고핵산을 위해 오류 보정 효소가 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 오류 보정된 올리고핵산의 총 오류율은 소정의 서열과 비교하여 1/500, 1/600, 1/700, 1/800, 1/900, 1/1,000, 1/1,100, 1/1,200, 1/1,300, 1/1,400, 1/1,500, 1/1,600, 1/1,700, 1/1,800, 1/1,900, 1/2,000, 1/3,000 미만, 또는 그 미만일 수 있다. 일부 경우에서, 제공된 시스템 및 방법을 사용하여 라이브러리 내에서 합성된 올리고핵산의 경우, 오류 보정된 올리고핵산의 총 오류율은 1/500, 1/600, 1/700, 1/800, 1/900, 또는 1/1,000 미만일 수 있다. 일부 경우에서, 제공된 시스템 및 방법을 사용하여 라이브러리 내에서 합성된 올리고핵산의 경우, 오류 보정된 올리고핵산의 총 오류율은 1/1,000 미만일 수 있다.
오류율이 유전자 변이체의 라이브러리의 제조를 위한 유전자 합성의 값을 제한할 수 있다. 오류율이 1/300인 경우, 1,500개의 염기쌍을 가진 유전자에서 클론 중 약 0.7%가 정확할 것이다. 올리고뉴클레오티드 합성으로부터의 오류 대부분이 프레임 쉬프트 돌연변이를 초래하기 때문에, 상기 라이브러리에서 99% 초과의 클론이 전장의 단백질을 생성하지 못할 것이다. 오류율을 75%만큼 감소시키면, 정확한 클론의 분율이 40배만큼 증가하게 될 것이다. 개선된 합성 품질, 및 대량 병렬식 및 시간 효율적 방식으로 가능해지는 오류 보정 방법의 적용가능성, 이 둘 모두에 기인하여, 본 개시내용의 방법 및 조성물은 통상적으로 관찰된 유전자 합성 방법보다 더 낮은 오류율로 큰 올리고뉴클레오티드 및 유전자 라이브러리를 빠르게 드 노보 합성할 수 있다. 따라서, 라이브러리는 라이브러리에 걸쳐, 또는 라이브러리의 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9%, 99.95%, 99.98%, 99.99% 초과, 또는 그 초과인 것에 걸쳐 1/300, 1/400, 1/500, 1/600, 1/700, 1/800, 1/900, 1/1,000, 1/1,250, 1/1,500, 1/2,000, 1/2,500, 1/3,000, 1/4,000, 1/5,000, 1/6,000, 1/7,000, 1/8,000, 1/9,000, 1/10,000, 1/12,000, 1/15,000, 1/20,000, 1/25,000, 1/30,000, 1/40,000, 1/50,000, 1/60,000, 1/70,000, 1/80,000, 1/90,000, 1/100,000, 1/125,000, 1/150,000, 1/200,000, 1/300,000, 1/400,000, 1/500,000, 1/600,000, 1/700,000, 1/800,000, 1/900,000, 1/1,000,000 미만, 또는 그 미만인 염기 삽입, 결실, 치환 또는 총 오류율로 합성될 수 있다. 본 개시내용의 방법 및 조성물은 추가로 라이브러리의 적어도 서브세트 내의 올리고뉴클레오티드 또는 유전자의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9%, 99.95%, 99.98%, 99.99% 이상이 소정의/미리 선택된 서열과 비교하여 오류 부재 서열에 관한 것과 연관된 낮은 오류율을 가진 큰 합성 올리고뉴클레오티드 및 유전자 라이브러리에 관한 것이다. 일부 경우에서, 라이브러리 내에서 단리된 부피 내의 올리고뉴클레오티드 또는 유전자의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9%, 99.95%, 99.98%, 99.99% 이상이 동일한 서열을 가진다. 일부 경우에서, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 초과, 또는 그 초과의 유사성 또는 동일성과 관련된 임의의 올리고뉴클레오티드 또는 유전자의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9%, 99.95%, 99.98%, 99.99% 이상이 동일한 서열을 가진다. 일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드 또는 유전자 상의 특정된 좌위와 관련된 오류율이 최적화된다. 따라서, 큰 라이브러리의 일부로서 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 유전자의 주어진 좌위 또는 복수의 선택된 좌위들은 각각 1/300, 1/400, 1/500, 1/600, 1/700, 1/800, 1/900, 1/1,000, 1/1,250, 1/1,500, 1/2,000, 1/2,500, 1/3,000, 1/4,000, 1/5,000, 1/6,000, 1/7,000, 1/8,000, 1/9,000, 1/10,000, 1/12,000, 1/15,000, 1/20,000, 1/25,000, 1/30,000, 1/40,000, 1/50,000, 1/60,000, 1/70,000, 1/80,000, 1/90,000, 1/100,000, 1/125,000, 1/150,000, 1/200,000, 1/300,000, 1/400,000, 1/500,000, 1/600,000, 1/700,000, 1/800,000, 1/900,000, 1/1,000,000 미만, 또는 그 미만인 오류율을 가질 수 있다. 다양한 경우에서, 상기 오류 최적화된 좌위는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 30,000, 50,000, 75,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 2,000,000, 3,000,000종 이상의 좌위를 포함할 수 있다. 오류 최적화된 좌위는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 30,000, 75,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 2,000,000, 3,000,000개 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 유전자에 분포될 수 있다.
오류율은 오류 보정하에 또는 오류 보정 없이 달성될 수 있다. 오류율은 라이브러리에 걸쳐, 또는 라이브러리의 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9%, 99.95%, 99.98%, 99.99% 초과, 또는 그 초과인 것에 걸쳐 달성될 수 있다.
본원에서는 통상의 지지체 상의 주소지정가능한 위치에 상이한 소정의 서열을 갖는, 복수의 올리고핵산의 합성을 지원하는 표면을 포함할 수 있는 구조물을 제공한다. 일부 경우에서, 장치는 2,000; 5,000; 10,000; 20,000; 30,000; 50,000; 75,000; 100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 1,200,000; 1,400,000; 1,600,000; 1,800,000; 2,000,000; 2,500,000; 3,000,000; 3,500,000; 4,000,000; 4,500,000; 5,000,000; 10,000,000개 초과, 또는 그 초과의 동일하지 않은 올리고핵산의 합성을 지원한다. 일부 경우에서, 장치는 상이한 서열을 코딩하는, 2,000; 5,000; 10,000; 20,000; 30,000; 50,000; 75,000; 100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 1,200,000; 1,400,000; 1,600,000; 1,800,000; 2,000,000; 2,500,000; 3,000,000; 3,500,000; 4,000,000; 4,500,000; 5,000,000; 10,000,000개 초과, 또는 그 초과의 올리고핵산의 합성을 지원한다. 일부 경우에서, 올리고핵산 중 적어도 일부는 동일한 서열을 갖거나, 또는 동일한 서열로 합성되도록 구성된다.
본원에서는 길이가 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 또는 2,000개의 염기인 올리고핵산의 제조 및 성장을 위한 방법 및 장치를 제공한다. 일부 경우에서, 형성된 올리고핵산의 길이는 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 또는 225개의 염기이다. 올리고핵산의 길이는 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 염기일 수 있다. 올리고핵산의 길이는 10 내지 225개의 염기, 12 내지 100개의 염기, 20 내지 150개의 염기, 20 내지 130개의 염기, 또는 30 내지 100개의 염기일 수 있다.
일부 경우에서, 올리고핵산은, 각 좌위가 올리고핵산 집단의 합성을 지원하는 것인, 기판의 상이한 좌위 상에서 합성된다. 일부 경우에서, 각 좌위는 또 다른 좌위 상에서 성장된 올리고핵산 집단과는 상이한 서열을 갖는 올리고핵산 집단의 합성을 지원한다. 일부 경우에서, 장치의 좌위는 복수의 클러스터 내에 위치한다. 일부 경우에서, 장치는 적어도 10, 500, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000개 이상의 클러스터를 포함한다. 일부 경우에서, 장치는 2,000; 5,000; 10,000; 100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 1,100,000; 1,200,000; 1,300,000; 1,400,000; 1,500,000; 1,600,000; 1,700,000; 1,800,000; 1,900,000; 2,000,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 1,200,000; 1,400,000; 1,600,000; 1,800,000; 2,000,000; 2,500,000; 3,000,000; 3,500,000; 4,000,000; 4,500,000; 5,000,000; 또는 10,000,000개 초과, 또는 그 초과의 상이한 좌위를 포함한다. 일부 경우에서, 장치는 약 10,000개의 상이한 좌위를 포함한다. 단일 클러스터 내의 좌위의 양은 다른 경우에서는 달라진다. 일부 경우에서, 각각의 클러스터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 150, 200, 300, 400, 500종 이상의 좌위를 포함한다. 일부 경우에서, 각각의 클러스터는 약 50-500개의 좌위를 포함한다. 일부 경우에서, 각각의 클러스터는 약 100-200개의 좌위. 일부 경우에서, 각각의 클러스터는 약 100-150개의 좌위를 포함한다. 일부 경우에서, 각각의 클러스터는 약 109, 121, 130 또는 137개의 좌위를 포함한다. 일부 경우에서, 각각의 클러스터는 약 19, 20, 61, 64종 이상의 좌위를 포함한다.
장치 상에서 합성된 상이한 올리고핵산의 개수는 기판에서 이용가능한 상이한 좌위의 개수에 의존할 수 있다. 일부 경우에서, 장치의 클러스터 내의 좌위의 밀도는 적어도 또는 약 1개의 좌위/㎟, 10개의 좌위/㎟, 25개의 좌위/㎟, 50개의 좌위/㎟, 65개의 좌위/㎟, 75개의 좌위/㎟, 100개의 좌위/㎟, 130개의 좌위/㎟, 150개의 좌위/㎟, 175개의 좌위/㎟, 200개의 좌위/㎟, 300개의 좌위/㎟, 400개의 좌위/㎟, 500개의 좌위/㎟, 1,000개의 좌위/㎟ 이상이다. 일부 경우에서, 장치는 약 10개의 좌위/㎟ 내지 약 10개의 좌위/약 500 ㎟, 약 25개의 좌위/㎟ 내지 약 25개의 좌위/약 400 ㎟, 약 50개의 좌위/㎟ 내지 약 50개의 좌위/약 500 ㎟, 약 100개의 좌위/㎟ 내지 약 100개의 좌위/약 500 ㎟, 약 150개의 좌위/㎟ 내지 약 150개의 좌위/약 500 ㎟, 약 10개의 좌위/㎟ 내지 약 10개의 좌위/약 250 ㎟, 약 50개의 좌위/㎟ 내지 약 50개의 좌위/약 250 ㎟, 약 10개의 좌위/㎟ 내지 약 10개의 좌위/약 200 ㎟, 또는 약 50개의 좌위/㎟ 내지 약 50개의 좌위/약 200 ㎟를 포함한다. 일부 경우에서, 클러스터 내의 2개의 인접한 좌위의 중심부 사이의 거리는 약 10 um 내지 약 500 um, 약 10 um 내지 약 200 um, 또는 약 10 um 내지 약 100 um이다. 일부 경우에서, 인접한 좌위의 두 중심부 사이의 거리는 약 10 um, 20 um, 30 um, 40 um, 50 um, 60 um, 70 um, 80 um, 90 um 또는 100 um 초과이다. 일부 경우에서, 2개의 인접한 좌위의 중심부 사이의 거리는 약 200 um, 150 um, 100 um, 80 um, 70 um, 60 um, 50 um, 40 um, 30 um, 20 um 또는 10 um 미만이다. 일부 경우에서, 각 좌위의 너비는 약 0.5 um, 1 um, 2 um, 3 um, 4 um, 5 um, 6 um, 7 um, 8 um, 9 um, 10 um, 20 um, 30 um, 40 um, 50 um, 60 um, 70 um, 80 um, 90 um 또는 100 um이다. 일부 경우에서, 각 좌위의 너비는 약 0.5 um 내지 100um, 약 0.5 um 내지 50 um, 약 10 um 내지 75 um, 또는 약 0.5 um 내지 50 um이다.
일부 경우에서, 장치내 클러스터의 밀도는 적어도 또는 약 1개의 클러스터/100 ㎟, 1개의 클러스터/10 ㎟, 1개의 클러스터/5 ㎟, 1개의 클러스터/4 ㎟, 1개의 클러스터/3 ㎟, 1개의 클러스터/2 ㎟, 1개의 클러스터/1 ㎟, 2개의 클러스터/1 ㎟, 3개의 클러스터/1 ㎟, 4개의 클러스터/1 ㎟, 5개의 클러스터/1 ㎟, 10개의 클러스터/1 ㎟, 50개의 클러스터/1 ㎟ 이상이다. 일부 경우에서, 장치는 약 1개의 클러스터/10 ㎟ 내지 약 10개의 클러스터/1 ㎟를 포함한다. 일부 경우에서, 2개의 인접한 클러스터의 중심부 사이의 거리는 약 50 um, 100 um, 200 um, 500 um, 1,000 um, 또는 2000 um, 또는 5000 um 미만이다. 일부 경우에서, 2개의 인접한 클러스터의 중심부 사이의 거리는 약 50 um 내지 약 100 um, 약 50 um 내지 약 200 um, 약 50 um 내지 약 300 um, 약 50 um 내지 약 500 um, 및 약 100 um 내지 약 2,000 um이다. 일부 경우에서, 2개의 인접한 클러스터의 중심부 사이의 거리는 0.05 mm 내지 약 50 mm, 약 0.05 mm 내지 약 10 mm, 약 0.05 mm 내지 약 5 mm, 약 0.05 mm 내지 약 4 mm, 약 0.05 mm 내지 약 3 mm, 약 0.05 mm 내지 약 2 mm, 약 0.1 mm 내지 10 mm, 약 0.2 mm 내지 10 mm, 약 0.3 mm 내지 약 10 mm, 약 0.4 mm 내지 약 10 mm, 약 0.5 mm 내지 10 mm, 약 0.5 mm 내지 약 5 mm, 또는 약 0.5 mm 내지 약 2 mm이다. 일부 경우에서, 1차원 선을 따라 각각의 클러스터의 직경 또는 너비는 약 0.5 내지 2 mm, 약 0.5 내지 1 mm, 또는 약 1 내지 2 mm이다. 일부 경우에서, 1차원 선을 따라 각각의 클러스터의 직경 또는 너비는 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2 mm이다. 일부 경우에서, 1차원 선을 따라 각각의 클러스터의 내부 직경 또는 너비는 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.15, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2 mm이다.
장치의 크기는 대략 표준 96 웰 플레이트의 크기, 예를 들어, 약 100 내지 200 mm x 약 50 내지 150 mm일 수 있다. 일부 경우에서, 장치의 직경은 약 1,000 mm, 500 mm, 450 mm, 400 mm, 300 mm, 250 nm, 200 mm, 150 mm, 100 mm 또는 50 mm 이하이다. 일부 경우에서, 장치의 직경은 약 25 mm 내지 1,000 mm, 약 25 mm 내지 약 800 mm, 약 25 mm 내지 약 600 mm, 약 25 mm 내지 약 500 mm, 약 25 mm 내지 약 400 mm, 약 25 mm 내지 약 300 mm, 또는 약 25 mm 내지 약 200 mm이다. 장치 크기의 비제한적인 예로는 약 300 mm, 200 mm, 150 mm, 130 mm, 100 mm, 76 mm, 51 mm 및 25 mm를 포함한다. 일부 경우에서, 장치의 평면적은 적어도 약 100 ㎟; 200 ㎟; 500 ㎟; 1,000 ㎟; 2,000 ㎟; 5,000 ㎟; 10,000 ㎟; 12,000 ㎟; 15,000 ㎟; 20,000 ㎟; 30,000 ㎟; 40,000 ㎟; 50,000 ㎟ 이상이다. 일부 경우에서, 장치의 두께는 약 50 mm 내지 약 2,000 mm, 약 50 mm 내지 약 1,000 mm, 약 100 mm 내지 약 1,000 mm, 약 200 mm 내지 약 1,000 mm, 또는 약 250 mm 내지 약 1,000 mm이다. 장치 두께의 비제한적인 예로는 275 mm, 375 mm, 525 mm, 625 mm, 675 mm, 725 mm, 775 mm 및 925 mm를 포함한다. 일부 경우에서, 장치의 두께는 직경에 따라 달라지며, 기판 조정에 의존한다. 예를 들어, 규소 이외의 다른 물질을 포함하는 장치는 직경이 동일한 규소 장치와 다른 두께를 가진다. 장치 두께는 사용되는 물질의 기계적 강도에 의해 측정될 수 있고, 장치는 취급하는 동안 균열 없이 그 자신의 중량을 지탱할 수 있을 정도로 충분히 두꺼워야 한다. 일부 경우에서, 구조물은 본원에 기술된 복수의 장치를 포함한다.
표면 재료
본원에서는 본원에 기술된 방법 및 조성물에 적합한 임의의 다양한 물질로부터 제작된 기판, 장치 및 반응기를 제공한다. 특정 경우에서, 장치 재료는 낮은 수준의 뉴클레오티드 결합을 보이도록 제작된다. 일부 경우에서, 장치 재료는 높은 수준의 뉴클레오티드 결합을 보이는 상이한 표면을 생성하도록 개질된다. 일부 경우에서, 장치 재료는 가시광 및/또는 UV 광에 대하여 투과성을 나타낸다. 일부 경우에서, 장치 재료는 충분한 전도성을 띠고, 예컨대, 기판 전체 또는 그 일부에 걸쳐 균일한 전지강을 형성할 수 있다. 일부 경우에서, 전도성 재료는 전기 접지에 연결된다. 일부 경우에서, 장치는 열 전도성이거나, 또는 절연 처리가 된 것이다. 일부 경우에서, 재료는 화학적 또는 생화학적 반응, 예를 들어, 올리고핵산 합성 반응 프로세스를 견딜 수 있을 정도로 내화학성 및 내열성을 띤다. 일부 경우에서, 장치는 가요성 재료를 포함한다. 가요성 재료로는 제한 없이, 개질된 나일론, 비개질된 나일론, 니트로셀룰로스, 폴리프로필렌 등을 포함한다. 일부 경우에서, 장치는 강성 재료를 포함한다. 강성 재료로는 제한 없이, 유리, 훈연 실리카, 규소, 이산화규소, 질화규소, 플라스틱(예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 및 그의 브렌드 등), 및 금속(예를 들어, 금, 백금 등)을 포함한다. 일부 경우에서, 장치는 규소, 폴리스티렌, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스계 중합체, 폴리아크릴아미드, 폴리디메틸실록산(PDMS), 유리, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 재료로부터 제작된다. 일부 경우에서, 장치는 본원에 열거된 재료, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 재료의 조합을 이용하여 제작된다.
표면 아키텍처
본원에서는 돌출된 및/또는 함몰된 특징부를 포함하는 장치를 제공한다. 상기와 같은 특징부를 갖는 것의 한가지 이점은 올리고핵산 합성을 지원할 수 있는 표면적이 증가한다는 점이다. 일부 경우에서, 돌출된 및/또는 함몰된 특징부를 갖는 장치는 3차원 기판으로 지칭된다. 일부 경우에서, 3차원 장치는 하나 이상의 채널을 포함한다. 일부 경우에서, 하나 이상의 좌위는 채널을 포함한다. 일부 경우에서, 채널은 증착 장치, 예컨대, 올리고핵산 합성기를 통한 시약 증착에 접근가능하다. 일부 경우에서, 시약 및/또는 유체는 유체 소통하는 하나 이상의 채널 중 더욱 큰 웰 중에 수집된다. 예를 들어, 장치는 클러스터를 포함하는 복수의 좌위에 상응하는 복수의 채널을 포함하고, 복수의 채널은 클러스터의 한 웰과 유체 소통한다. 일부 방법에서, 올리고핵산 라이브러리는 클러스터의 복수의 좌위에서 합성된다.
일부 경우에서, 구조물은 표면 상에서의 올리고핵산 합성을 위해 조절된 방식의 유동 및 물질 전달 경로를 허용하도록 구성된다. 일부 경우에서, 장치의 구성은 올리고핵산 합성 동안의 조절된 방식 및 고른 분포의 물질 전달 경로, 화학적 노출 시간, 및/또는 세척 효능을 허용한다. 일부 경우에서, 장치의 구성은 예를 들어, 성장하는 올리고핵산을 위해 충분한 부피를 제공함으로써 성장하는 올리고핵산에 의해 배재된 부피가, 올리고핵산을 성장시키는 데 이용가능하거나, 또는 그에 적합한 초기의 이용가능한 부피의 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 이하보다 더 큰 부피를 차지하지 않도록 함으로써 스윕 효율(sweep efficiency)을 증가시킬 수 있다. 일부 경우에서, 3차원 구조물은 관리된 방식의 유체 유동이 화학적 노출을 빠르게 교체할 수 있게 허용한다.
본원에서는 1 fM, 5 fM, 10 fM, 25 fM, 50 fM, 75 fM, 100 fM, 200 fM, 300 fM, 400 fM, 500 fM, 600 fM, 700 fM, 800 fM, 900 fM, 1 pM, 5 pM, 10 pM, 25 pM, 50 pM, 75 pM, 100 pM, 200 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 600 pM, 700 pM, 800 pM, 900 pM 이상의 DNA 양을 합성하는 방법을 제공한다. 일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드 라이브러리는 유전자의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%의 길이를 포괄할 수 있다. 유전자는 최대 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%까지로 달라질 수 있다.
동일하지 않은 올리고핵산은 집합적으로 유전자의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%를 코딩할 수 있다. 일부 경우에서, 올리고핵산은 유전자의 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 서열을 코딩할 수 있다. 일부 경우에서, 올리고핵산은 유전자의 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 서열을 코딩할 수 있다.
일부 경우에서, 분리는 물리적 구조에 의해 달성된다. 일부 경우에서, 분리는 표면을 차별적으로 관능화하여 올리고핵산 합성을 위한 능동적 및 수동적 영역을 생성함으로써 달성된다. 차별적 관능화는 또한 기판 표면에 걸쳐 교대로 소수성을 띠게 만들어 증착된 시약의 비딩(beading) 또는 습윤화를 유발하는 물 접촉각 효과를 일으킴으로써 달성된다. 더욱 큰 구조물을 사용하면, 이웃 스폿의 시약에 의한 상이한 올리고핵산 합성 위치의 튀김(splashing) 또는 교차 오염을 감소시킬 수 있다. 일부 경우에서, 장치, 예컨대, 올리고핵산 합성기는 상이한 올리고핵산 합성 위치에 시약을 증착시키는 데 사용된다. 3차원 특징부를 갖는 기판은 낮은 오류율(예컨대, 약 1:500, 1:1000, 1:1500, 1:2,000; 1:3,000; 1:5,000; 또는 1:10,000 미만)로 다수의 올리고핵산(예컨대, 약 10,000개 초과)을 합성할 수 있도록 하는 방식으로 구성된다. 일부 경우에서, 장치는 1 ㎟당 약 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400 또는 500개의 특징부, 또는 그 초과의 밀도로 특징부를 포함한다.
장치의 한 웰은 기판의 또 다른 웰과 동일하거나, 또는 상이한 너비, 높이, 및/또는 부피를 가질 수 있다. 장치의 한 채널은 기판의 또 다른 채널과 동일하거나, 또는 상이한 너비, 높이, 및/또는 부피를 가질 수 있다. 일부 경우에서, 클러스터의 너비는 약 0.05 mm 내지 약 50 mm, 약 0.05 mm 내지 약 10 mm, 약 0.05 mm 내지 약 5 mm, 약 0.05 mm 내지 약 4 mm, 약 0.05 mm 내지 약 3 mm, 약 0.05 mm 내지 약 2 mm, 약 0.05 mm 내지 약 1 mm, 약 0.05 mm 내지 약 0.5 mm, 약 0.05 mm 내지 약 0.1 mm, 약 0.1 mm 내지 10 mm, 약 0.2 mm 내지 10 mm, 약 0.3 mm 내지 약 10 mm, 약 0.4 mm 내지 약 10 mm, 약 0.5 mm 내지 10 mm, 약 0.5 mm 내지 약 5 mm, 또는 약 0.5 mm 내지 약 2 mm이다. 일부 경우에서, 클러스터를 포함하는 웰의 너비는 약 0.05 mm 내지 약 50 mm, 약 0.05 mm 내지 약 10 mm, 약 0.05 mm 내지 약 5 mm, 약 0.05 mm 내지 약 4 mm, 약 0.05 mm 내지 약 3 mm, 약 0.05 mm 내지 약 2 mm, 약 0.05 mm 내지 약 1 mm, 약 0.05 mm 내지 약 0.5 mm, 약 0.05 mm 내지 약 0.1 mm, 약 0.1 mm 내지 10 mm, 약 0.2 mm 내지 10 mm, 약 0.3 mm 내지 약 10 mm, 약 0.4 mm 내지 약 10 mm, 약 0.5 mm 내지 10 mm, 약 0.5 mm 내지 약 5 mm, 또는 약 0.5 mm 내지 약 2 mm이다. 일부 경우에서, 클러스터의 너비는 약 5 mm, 4 mm, 3 mm, 2 mm, 1 mm, 0.5 mm, 0.1 mm, 0.09 mm, 0.08 mm, 0.07 mm, 0.06 mm 또는 0.05 mm 이하이다. 일부 경우에서, 클러스터의 너비는 약 1.0 내지 1.3 mm이다. 일부 경우에서, 클러스터의 너비는 약 1.150 mm이다. 일부 경우에서, 웰의 너비는 약 5 mm, 4 mm, 3 mm, 2 mm, 1 mm, 0.5 mm, 0.1 mm, 0.09 mm, 0.08 mm, 0.07 mm, 0.06 mm 또는 0.05 mm 이하이다. 일부 경우에서, 웰의 너비는 약 1.0 내지 1.3 mm이다. 일부 경우에서, 웰의 너비는 약 1.150 mm이다. 일부 경우에서, 클러스터의 너비는 약 0.08 mm이다. 일부 경우에서, 웰의 너비는 약 0.08 mm이다. 클러스터의 너비는 2차원 또는 3차원 기판 내의 클러스터를 지칭할 수 있다.
일부 경우에서, 웰의 높이는 약 20 um 내지 약 1,000 um, 약 50 um 내지 약 1,000 um, 약 100 um 내지 약 1,000 um, 약 200 um 내지 약 1,000 um, 약 300 um 내지 약 1,000 um, 약 400 um 내지 약 1,000 um, 또는 약 500 um 내지 약 1,000 um이다. 일부 경우에서, 웰의 높이는 약 1,000 um 미만, 약 900 um 미만, 약 800 um 미만, 약 700 um 미만, 또는 약 600 um 미만이다.
일부 경우에서, 장치는 클러스터 내의 복수의 좌위에 상응하는 복수의 채널을 포함하고, 여기서, 채널의 높이 또는 깊이는 약 5 um 내지 약 500 um, 약 5 um 내지 약 400 um, 약 5 um 내지 약 300 um, 약 5 um 내지 약 200 um, 약 5 um 내지 약 100 um, 약 5 um 내지 약 50 um, 또는 약 10 um 내지 약 50 um이다. 일부 경우에서, 채널의 높이는 100 um 미만, 80 um 미만, 60 um 미만, 40 um 미만, 또는 20 um 미만이다.
일부 경우에서, 채널, 좌위(예컨대, 실질적으로 평평한 기판에서), 또는 채널 및 좌위 둘 모두(예컨대, 좌위가 채널에 상응하는 것인 3차원 장치에서)의 직경은 약 1 um 내지 약 1,000 um, 약 1 um 내지 약 500 um, 약 1 um 내지 약 200 um, 약 1 um 내지 약 100 um, 약 5 um 내지 약 100 um, 또는 약 10 um 내지 약 100 um, 예를 들어, 약 90 um, 80 um, 70 um, 60 um, 50 um, 40 um, 30 um, 20 um, 또는 10 um이다. 일부 경우에서, 채널, 좌위 또는 채널 및 좌위 둘 모두의 직경은 약 100 um, 90 um, 80 um, 70 um, 60 um, 50 um, 40 um, 30 um, 20 um, 또는 10 um 미만이다. 일부 경우에서, 2개의 인접한 채널, 좌위, 또는 채널 및 좌위의 중심부 사이의 거리는 약 1 um 내지 약 500 um, 약 1 um 내지 약 200 um, 약 1 um 내지 약 100 um, 약 5 um 내지 약 200 um, 약 5 um 내지 약 100 um, 약 5 um 내지 약 50 um, 또는 약 5 um 내지 약 30 um, 예를 들어, 약 20 um이다.
표면 개질
다양한 경우에서, 표면 개질은 장치 표면, 또는 장치 표면의 선택된 부위 또는 영역의 하나 이상의 화학적 및/또는 물리적 특성을 변화시키기 위해 추가 또는 공제 프로세스에 의해 표면을 화학적으로 및/또는 물리적으로 변경시키는 데 사용된다. 예를 들어, 표면 개질으로는 제한 없이, (1) 표면의 습윤화 특성을 변화시키는 것, (2) 표면을 관능화하는 것, 즉, 표면 작용기를 제공하거나, 개질시키거나, 또는 치환하는 것, (3) 표면을 탈관능화하는 것, 즉, 표면 작용기를 제거하는 것, (4) 다르게는, 예컨대, 에칭을 통해 표면의 화학적 조성을 변경시키는 것, (5) 표면 조도를 증가 또는 감소시키는 것, (6) 표면 상에 코팅, 예컨대, 표면의 습윤화 특성과 상이한 습윤화 특성을 나타내는 코팅을 제공하는 것, 및/또는 (7) 표면 상에 미립자를 침착시키는 것을 포함한다.
일부 경우에서, 표면 위에 (부착 프로모터로 지칭되는) 화학층을 추가하는 것이 기판의 표면 상에의 좌위의 구조화된 패턴화를 촉진시킨다. 부착 프로모션 적용을 위한 예시적인 표면으로는 제한 없이, 유리, 규소, 이산화규소 및 질화규소를 포함한다. 일부 경우에서, 부착 프로모터는 표면 에너지가 높은 화학물질이다. 일부 경우에서, 제2 화학층을 기판의 표면 상에 증착시킨다. 일부 경우에서, 제2 화학층의 표면 에너지는 낮다. 일부 경우에서, 표면 상에 코팅된 화학층의 표면 에너지는 표면 상의 액적의 국재화를 지원한다. 선택된 패턴화 배열에 의존하여, 좌위의 근접성 및/또는 좌위에서의 유체 접촉 면적은 변경가능하다.
일부 경우에서, 예컨대, 올리고핵산 합성을 위해 그 위에 핵산 또는 다른 모이어티가 증착되어 있는 것인 장치 표면, 또는 분해된 좌위는 평활하거나, 또는 실질적으로 평평하거나(예컨대, 2차원), 또는 요철, 예컨대, 돌출된 또는 함몰된 특징부(예컨대, 3차원 특징부)를 가진다. 일부 경우에서, 장치 표면은 하나 이상의 상이한 화합물 층으로 개질된다. 관심의 대상이 되는 상기와 같은 개질 층으로는 제한 없이, 무기 및 유기 층, 예컨대, 금속, 금속 산화물, 중합체, 소형 유기 분자 등을 포함한다. 비제한적인 중합체 층은 펩티드, 단백질, 핵산 또는 그의 모방체(예컨대, 펩티드 핵산 등), 다당류, 인지질, 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리우레아, 폴리아미드, 폴리에틸렌아민, 폴리아릴렌 술피드, 폴리실록산, 폴리이미드, 폴리아세테이트, 및 본원에 기술되거나, 또는 다르게는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 화합물을 포함한다. 일부 경우에서, 중합체는 이종중합체이다. 일부 경우에서, 중합체는 동종중합체이다. 일부 경우에서, 중합체는 작용성 모이어티를 포함하거나, 또는 접합된 것이다.
일부 경우에서, 장치의 분해된 좌위는 표면 에너지를 증가 및/또는 감소시키는 하나 이상의 모이어티로 관능화된다. 일부 경우에서, 모이어티는 화학적으로 불활성이다. 일부 경우에서, 모이어티는 원하는 화학 반응, 반응, 예를 들어, 올리고핵산 합성 반응 중 하나 이상의 프로세스를 지원하도록 구성된다. 표면의 표면 에너지, 또는 소수성은 표면 상에 부착되는 뉴클레오티드의 친화도를 결정짓는 인자이다. 일부 경우에서, 장치 관능화 방법은 (a) 이산화규소를 포함하는 표면을 갖는 장치를 제공하는 단계; 및 (b) 본원에 기술되어 있거나, 또는 다르게는 당업계에 공지된 적합한 실란화제, 예를 들어, 유기작용성 알콕시실란 분자를 사용하여 표면을 실란화시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 유기작용성 알콕시실란 분자로는 디메틸클로로-옥토데실-실란, 메틸디클로로-옥토데실-실란, 트리클로로-옥토데실-실란, 트리메틸-옥토데실-실란, 트리에틸-옥토데실-실란, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에서, 장치 표면은 폴리에틸렌/폴리프로필렌(감마 방사선 조사 또는 크롬산 산화, 및 하이드록시알킬 표면으로의 환원에 의해 관능화됨), 고도로 가교결합된 폴리스티렌-디비닐벤젠(클로로메틸화에 의해 유도체화되고, 벤질아민 작용성 표면으로 아민화됨), 나일론(말단 아미노헥실 기는 직접적인 반응성을 나타냄)으로 관능화, 또는 환원된 폴리테트라플루오로에틸렌으로 에칭된 것을 포함한다. 다른 방법 및 관능화제는 미국 특허 번호 5474796(상기 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.
일부 경우에서, 장치 표면은 전형적으로 장치 표면 상에 존재하는 반응성 친수성 모이어티를 통해 실란을 장치 표면에 커플링시키는 데에 효과적인 반응 조건하에서 실란의 혼합물을 함유하는 유도체화 조성물과의 접촉에 의해 관능화된다. 실란화는 일반적으로 유기작용성 알콕시실란 분자와의 자가 조립을 통해 표면을 커버한다.
다양한 실록산 관능화 시약은 현재 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 예컨대, 표면 에너지를 낮추거나, 또는 증가시키기 위해 추가로 사용될 수 있다. 유기작용성 알콕시실란은 그의 유기 작용기에 따라 분류될 수 있다.
본원에서는 뉴클레오시드에 커플링할 수 있는 작용제의 패턴화를 함유할 수 있는 장치를 제공한다. 일부 경우에서, 장치는 활성제로 코팅될 수 있다. 일부 경우에서, 장치는 부동화제로 코팅될 수 있다. 본원에 기술된 코팅 물질에 포함되는 예시적인 활성제로는 제한 없이, N-(3-트리에톡시실릴프로필)-4-하이드록시부티르아미드(HAPS), 11-아세톡시운데실트리에톡시실란, n-데실트리에톡시실란, (3-아미노프로필)트리메톡시실란, (3-아미노프로필)트리에톡시실란, 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GOPS), 3-아이오도-프로필트리메톡시실란, 부틸-알데하이드르-트리메톡시실란, 이량체 2차 아미노알킬 실록산, (3-아미노프로필)-디에톡시-메틸실란, (3-아미노프로필)-디메틸-에톡시실란, 및 (3-아미노프로필)-트리메톡시실란, (3-글리시독시프로필)-디메틸-에톡시실란, 글리시독시-트리메톡시실란, (3-메르캅토프로필)-트리메톡시실란, 3-4 에폭시시클로헥실-에틸트리메톡시실란, 및 (3-메르캅토프로필)-메틸-디메톡시실란, 알릴 트리클로로클로로실란, 7-옥트-1-에닐 트리클로로클로로실란, 또는 비스(3-트리메톡시실릴프로필) 아민을 포함한다.
본원에 기술된 코팅 물질에 포함되는 예시적인 부동화제로는 제한 없이, 퍼플루오로옥틸트리클로로실란; 트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸)트리클로로실란; 1H,1H,2H,2H-플루오로옥틸트리에톡시실란(FOS); 트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)실란; tert-부틸-[5-플루오로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보로란-2-일)인돌-1-일]-디메틸-실란; CYTOP™; 플루오리너트(Fluorinert)™; 퍼플루오록틸트리클로로실란(PFOTCS); 퍼플루오로옥틸디메틸클로로실란(PFODCS); 퍼플루오로데실트리에톡시실란(PFDTES); 펜타플루오로페닐-디메틸프로필클로로-실란(PFPTES); 퍼플루오로옥틸트리에톡시실란; 퍼플루오로옥틸트리메톡시실란; 옥틸클로로실란; 디메틸클로로-옥토데실-실란; 메틸디클로로-옥토데실-실란; 트리클로로-옥토데실-실란; 트리메틸-옥토데실-실란; 트리에틸-옥토데실-실란; 또는 옥타데실트리클로로실란을 포함한다.
일부 경우에서, 관능화제로는 탄화수소 실란, 예컨대, 옥타데실트리클로로실란을 포함한다. 일부 경우에서, 관능화제로는 11-아세톡시운데실트리에톡시실란, n-데실트리에톡시실란, (3-아미노프로필)트리메톡시실란, (3-아미노프로필)트리에톡시실란, 글리시딜옥시프로필/트리메톡시실란 및 N-(3-트리에톡시실릴프로필)-4-하이드록시부티르아미드를 포함한다.
올리고뉴클레오티드 합성
본 개시내용의 올리고핵산 합성 방법은 포스포라미다이트 화학법을 포함하는 프로세스를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 올리고핵산 합성은 염기를 포스포라미다이트와 커플링하는 것을 포함한다. 올리고핵산 합성은 커플링 조건하에서 포스포라미다이트를 증착시켜 염기를 커플링하는 것을 포함할 수 있고, 여기서, 동일한 염기가 임의적으로 1회 초과로 포스포라미다이트로 증착되고, 즉, 이중으로 커플링된다. 올리고핵산 합성은 비반응 부위의 캡핑을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 캡핑은 임의적이다. 올리고핵산 합성은 또한 산화 또는 산화 단계 또는 산화 단계들을 포함할 수 있다. 올리고핵산 합성은 탈차단, 탈트리틸화, 및 황화를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 올리고핵산 합성은 산화 또는 황화 중 어느 하나를 포함한다. 일부 경우에서, 올리고핵산 합성 반응 동안 한 단계 또는 각 단계 동안 예를 들어, 테트라졸 또는 아세토니트릴을 사용하여 장치를 세척한다. 포스포라미다이트 합성 방법에서 어느 한 단계 동안의 시간은 약 2 min, 1 min, 50 sec, 40 sec, 30 sec, 20 sec 및 10 sec 미만일 수 있다.
포스포라미다이트를 사용하는 올리고핵산 합성 방법은 포스파이트 트리에스테르 결합 형성을 위해 성장하는 올리고핵산 쇄에의 포스포라미다이트 빌딩 블록(예컨대, 뉴클레오시드 포스포라미다이트)의 잇따른 부가를 포함할 수 있다. 포스포라미다이트 올리고핵산 합성은 3'에서 5' 방향으로 진행된다. 포스포라미다이트 올리고핵산 합성을 통해 합성 사이클에 따라 하나의 뉴클레오티드를 성장하는 핵산 쇄에 조절된 방식으로 부가할 수 있다. 일부 경우에서, 각 합성 사이클은 커플링 단계를 포함한다. 포스포라미다이트 커플링은 활성화된 뉴클레오시드 포스포라미다이트와, 예를 들어, 링커를 통해 기판에 결합된 뉴클레오시드 사이의 포스파이트 트리에스테르 결합의 형성을 포함한다. 일부 경우에서, 뉴클레오시드 포스포라미다이트를 활성화된 장치에 제공한다. 일부 경우에서, 뉴클레오시드 포스포라미다이트를 활성화제와 함께 장치에 제공한다. 일부 경우에서, 뉴클레오시드 포스포라미다이트를 기판에 결합된 뉴클레오시드 대비 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100배 이상의 과량으로 장치에 제공한다. 일부 경우에서, 뉴클레오시드 포스포라미다이트를 부가하는 것은 무수 환경에서, 예를 들어, 무수 아세토니트릴 중에서 수행된다. 뉴클레오시드 포스포라미다이트 부가 후, 장치를 임의적으로 세척한다. 일부 경우에서, 커플링 단계는 1회 이상의 추가 회차로 반복되고, 임의적으로, 세척 단계는 기판에 뉴클레오시드 포스포라미다이트를 부가하는 단계들 사이에 이루어진다. 일부 경우에서, 본원에서 사용되는 올리고핵산 합성 방법은 1, 2, 3회 이상의 순차적인 커플링 단계를 포함한다. 다수 경우에서, 커플링 이전에, 장치에 결합된 뉴클레오시드는 보호기 제거에 의해 탈보호화되고, 여기서, 보호기는 중합화를 막는 작용을 한다. 통상의 보호기는 4,4'-디메톡시트리틸(DMT)이다.
커플링 후, 포스포라미다이트 올리고핵산 합성 방법은 임의적으로 캡핑 단계를 포함한다. 캡핑 단계에서, 성장하는 올리고핵산을 캡핑제로 처리한다. 캡핑 단계는, 내부 염기가 결실된 올리고핵산이 형성되지 못하게 막으면서, 커플링 이후의 비반응 기판 결합 5'-OH 기의 추가의 쇄 신장을 차단하는 데 유용하다. 추가로, 1H-테트라졸로 활성화된 포스포라미다이트는 작게 구아노신의 O6 위치와 반응할 수 있다. 이론으로 제한하지 않으면서, I2/물에 의한 산화시, 상기 부산물은 가능하게는 O6-N7 이동을 통해 탈퓨린화될 수 있다. 퓨린 결여(apurinic) 부위는 올리고뉴클레오티드의 최종 탈보호화의 과정에서 절단된 상태로 종결되어, 전장의 생성물의 수율을 감소시킬 수 있다. O6 변형은 I2/물을 사용한 산화 이전에 캡핑 시약을 사용한 처리에 의해 제거될 수 있다. 일부 경우에서, 올리고핵산 합성 동안 캡핑 단계를 포함하는 것이 캡핑을 포함하지 않는 합성과 비교하여 오류율을 감소시킨다. 한 예로서, 캡핑 단계는 아세트산 무수물과 1-메틸이미다졸의 혼합물로 기판 결합 올리고핵산을 처리하는 것을 포함한다. 캡핑 단계 후, 장치를 임의적으로 세척한다.
일부 경우에서, 뉴클레오시드 포스포라미다이트의 부가 후, 및 임의적으로 캡핑 및 1회 이상의 세척 단계 이후에, 장치에 결합된, 성장하는 핵산을 산화시킨다. 산화 단계는 포스파이트 트리에스테르가, 자연적으로 발생된 포스페이트 디에스테르 뉴클레오시드간 결합의 보호된 전구체인 4 배위 포스페이트 트리에스테르로 산화되는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 성장하는 올리고핵산의 산화는 임의적으로 약염기(예컨대, 피리딘, 루티딘 또는 콜리딘)의 존재하에서 아이오딘 및 물로 처리함으로써 달성된다. 산화는 무수 조건하에서, 예컨대, tert-부틸 하이드로퍼옥시드 또는 (1S)-(+)-(10-캄포술포닐)-옥사지리딘(CSO)을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 방법에서, 캡핑 단계는 산화 이후에 수행된다. 지속될 수 있는, 산화로부터의 잔류성 물이 후속 커플링을 억제시킬 수 있는 바, 제2 캡핑 단계는 장치를 건조시킬 수 있다. 산화 후, 장치 및 성장하는 올리고핵산을 임의적으로 세척한다. 일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드 포스포로티오에이트를 수득하기 위해 산화 단계를 황화 단계로 치환하고, 여기서, 임의의 캡핑 단계는 황화 이후에 수행될 수 있다. 3-(디메틸아미노메틸리덴)아미노)-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온, DDTT, 보카주(Beaucage) 시약으로도 공지되어 있는 3H-1,2-벤조디티올-3-온 1,1-디옥시드, 및 N,N,N'N'-테트라에틸티우람 디술피드(TETD)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다수의 시약이 황을 효율적으로 전달할 수 있다.
뉴클레오시드를 도입하는 후속 사이클이 커플링을 통해 이루어지도록 하기 위해, 장치에 결합된, 성장하는 올리고핵산의 보호된 5' 단부를 제거하면, 이로써, 1차 하이드록실 기는 다음 뉴클레오시드 포스포라미다이트와 반응한다. 일부 경우에서, 보호기는 DMT이고, 탈차단은 디클로로메탄 중 트리클로로아세트산으로 이루어진다. 연장된 시간 동안, 또는 권장된 산 용액보다 더욱 강한 산을 이용하여 탈트리틸화를 수행하면, 고체 지지체에 결합된 올리고뉴클레오티드의 탈퓨린화는 증가될 수 있고, 이로써 원하는 전장의 생성물의 수율은 감소된다. 본원에 기술된 본 개시내용의 방법 및 조성물은 원하지 않는 탈퓨린화 반응을 제한하는 조절된 탈차단 조건을 제공한다. 일부 경우에서, 탈차단 이후에 장치에 결합된 올리고핵산을 세척한다. 일부 경우에서, 탈차단 이후의 효율적인 세척이 합성된 올리고핵산이 낮은 오류율을 갖는 데 기여한다.
올리고핵산 합성 방법은 전형적으로 하기 단계 순서를 반복하는 것을 포함한다: 보호된 단량체를 능동적으로 관능화된 표면(예컨대, 좌위)에 적용시켜 활성화된 표면과, 링커 또는 사전에 탈보호화된 단량체와 연결시키는 단계; 적용된 단량체를 탈보호화하여 후속하여 적용되는 보호된 단량체와 반응을 하도록 하는 단계; 및 연결을 위해 또 다른 보호된 단량체를 적용시키는 단계. 하나 이상의 중가 단계는 산화 또는 황화를 포함한다. 일부 경우에서, 1회 이상의 세척 단계가 상기 단계 중 한 단계 또는 그들 모두 이전에 또는 그 이후에 진행된다.
포스포라미다이트 기반의 올리고핵산 합성 방법은 일련의 화학적 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 합성 방법 중 하나 이상의 단계는 시약 사이클링을 포함하고, 여기서, 방법 중 하나 이상의 단계는 단계에 유용한 시약을 장치에 적용시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 시약은 일련의 액체 증착 및 진공 건조 단계에 의해 사이클링된다. 3차원 특징부를 포함하는 기판, 예컨대, 웰, 마이크로웰, 채널 등의 경우, 시약이 임의적으로 웰 및/또는 채널을 통해 장치의 하나 이상의 영역을 통해 통과하도록 한다.
본원에 기술된 방법 및 시스템은 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 올리고뉴클레오티드 합성 장치에 관한 것이다. 합성은 동시에 진행될 수 있다. 예를 들어 적어도 또는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1,000, 10,000, 50,000, 75,000, 100,000개 이상의 올리고뉴클레오티드가 동시에 합성될 수 있다. 동시에 합성될 수 있는 올리고핵산의 총 개수는 2-100,000, 3-50,000, 4-10,000, 5-1,000, 6-900, 7-850, 8-800, 9-750, 10-700, 11-650, 12-600, 13-550, 14-500, 15-450, 16-400, 17-350, 18-300, 19-250, 20-200, 21-150, 22-100, 23-50, 24-45, 25-40, 30-35개일 수 있다. 동시에 합성된 올리고뉴클레오티드의 총 개수는 상기 값 중 임의의 것에 의해 제한된 임의 범위, 예를 들어, 25-100 내에 포함될 수 있다는 것을 당업자는 이해한다. 동시에 합성된 올리고뉴클레오티드의 총 개수는 상기 범위의 종점으로서 작용한 상기 값 중 임의의 것에 의해 정의된 임의 범위 내에 포함될 수 있다. 장치 내에서 합성된 올리고뉴클레오티드의 총 몰 질량, 또는 각 올리고뉴클레오티드의 몰 질량은 적어도 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250, 500, 750, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 25,000, 50,000, 75,000, 100,000 피코몰 이상일 수 있다. 각 올리고뉴클레오티드의 길이 또는 장치 내의 올리고뉴클레오티드의 평균 길이는 적어도 또는 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500개의 뉴클레오티드 길이 그 이상일 수 있다. 각 올리고뉴클레오티드의 길이 또는 장치 내의 올리고뉴클레오티드의 평균 길이는 최대 또는 최대 약 500, 400, 300, 200, 150, 100, 50, 45, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10개의 뉴클레오티드 길이 그 이하일 수 있다. 각 올리고뉴클레오티드의 길이 또는 장치 내의 올리고뉴클레오티드의 평균 길이는 10-500, 9-400, 11-300, 12-200, 13-150, 14-100, 15-50, 16-45, 17-40, 18-35, 19-25인 것을 포함할 수 있다. 각 올리고뉴클레오티드의 길이 또는 장치 내의 올리고뉴클레오티드의 평균 길이는 상기 값 중 임의의 것에 의해 제한된 임의 범위, 예를 들어, 100-300 내에 포함될 수 있다는 것을 당업자는 이해한다. 각 올리고뉴클레오티드의 길이 또는 장치 내의 올리고뉴클레오티드의 평균 길이는 상기 범위의 종점으로서 작용한 상기 값 중 임의의 것에 의해 정의된 임의 범위 내에 포함될 수 있다.
본원에서 제공된, 표면 상에서 올리고핵산을 합성하는 방법을 통해 빠른 속도로 합성할 수 있다. 한 예로서, 시간당 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200개의 뉴클레오티드 그 이상이 합성된다. 뉴클레오티드로는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 우리딘 빌딩 블록, 또는 그의 유사체/변형된 버전을 포함한다. 일부 경우에서, 올리고핵산 라이브러리는 기판 상에서 동시에 합성된다. 예를 들어, 약 또는 적어도 약 100; 1,000; 10,000; 30,000; 75,000; 100,000; 1,000,000; 2,000,000; 3,000,000; 4,000,000; 또는 5,000,000개의 분해된 좌위를 포함하는 장치가 적어도 동일한 개수의 상이한 올리고핵산의 합성을 지지하며, 여기서, 상이한 서열을 코딩하는 올리고핵산은 분해된 좌위 상에서 합성된다. 일부 경우에서, 올리고핵산 라이브러리는 약 3개월, 2개월, 1개월, 3주, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2일, 24시간 이하인 시간 이내에 본원에 기술된 낮은 오류율로 장치 상에서 합성된다. 일부 경우에서, 본원에 기술된 기판 및 방법을 사용하여 낮은 오류율로 합성된 올리고핵산 라이브러리로부터 조립된 더욱 큰 핵산은 약 3개월, 2개월, 1개월, 3주, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2일, 24시간 이하인 시간 이내에 제조된다.
일부 경우에서, 본원에 기술된 방법은 복수의 코돈 부위에서 상이한 변이체 올리고핵산을 포함하는 올리고핵산 라이브러리를 생성하는 것을 제공한다. 일부 경우에서, 올리고핵산은 변이체 코돈 부위 중 1개 부위, 2개 부위, 3개 부위, 4개 부위, 5개 부위, 6개 부위, 7개 부위, 8개 부위, 9개 부위, 10개 부위, 11개 부위, 12개 부위, 13개 부위, 14개 부위, 15개 부위, 16개 부위, 17개 부위 18개 부위, 19개 부위, 20개 부위, 30개 부위, 40개 부위, 50개 부위, 또는 그 초과를 가질 수 있다.
일부 경우에서, 변이체 코돈 부위 중 하나 이상의 부위가 인접해 있을 수 있다. 변이체 코돈 부위 중 하나 이상의 부위는 인접해 있지 않고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 코돈에 의해 이격화되어 있을 수 있다.
일부 경우에서, 올리고핵산은 모든 변이체 코돈 부위가 서로 인접해 있고, 이로써, 변이체 스트레치 코돈 부위를 형성하는 것인 변이체 코돈 부위의 다중 부위를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 올리고핵산은 변이체 코돈 부위 중 어느 것도 서로 인접해 있지 않은 것인 변이체 코돈 부위의 다중 부위를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 올리고핵산은 일부 변이체 코돈 부위가 서로 인접해 있고, 이로써, 변이체 스트레치 코돈 부위를 형성하고, 변이체 코돈 부위 중 일부는 서로 인접해 있지 않은 것인 변이체 코돈 부위의 다중 부위를 포함할 수 있다.
도면을 참조하면, 도 12는 더 짧은 올리고핵산으로부터 핵산(예컨대, 유전자)을 합성하기 위한 예시적인 프로세스 작업 흐름을 도시한 것이다. 작업 흐름은 일반적으로 (1) 단일 가닥 올리고핵산 라이브러리의 드 노보 합성 단계, (2) 올리고핵산을 연결하여 더 큰 단편을 형성하는 단계, (3) 오류 보정 단계, (4) 품질 관리 단계, 및 (5) 운반 단계로 나뉜다. 드 노보 합성 이전에, 의도하는 핵산 서열 또는 핵산 서열 군을 미리 선택한다. 예를 들어, 생성을 위해 유전자 군을 미리 선택한다.
일단 생성을 위해 큰 올리고핵산을 선택하였으면, 드 노보 합성을 위해 소정의 올리고핵산 라이브러리를 디자인한다. 고밀도 올리고핵산 어레이 생성을 위한 각종의 적합한 방법이 공지되어 있다. 작업 흐름 예에서, 장치 표면 층(1201)을 제공한다. 상기 예에서, 올리고핵산 합성 프로세스를 개선시키기 위해 표면의 화학적 성질을 변경시킨다. 액체에는 반발력을 가하기 위해 표면 에너지가 낮은 면적을 생성하고, 동시에, 액체에 인력을 가하기 위해 표면 에너지가 높은 면적을 생성한다. 표면 그 자체는 평면 형태일 수 있거나, 예컨대, 표면적을 증가시키는 돌출부 또는 마이크로웰과 같은 형상 변화를 함유할 수 있다. 작업 흐름 예에서, 선택된 고에너지 표면 분자는 국제 특허 출원 공개 WO/2015/021080(이 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같이, DNA 화학적 성질을 지원하는 이중적 기능을 한다.
올리고핵산 어레이의 반응계내 제조는 고체 지지체 상에서 생성되고, 이는 단일 뉴클레오티드 신장 프로세스를 이용하여 다중 올리고머를 동시에 신장시킨다. 물질 증착 장치, 예컨대, 올리고핵산 합성기는 다중 올리고핵산이 동시에 잔기를 한 번에 하나씩 신장시켜 소정의 핵산 서열을 갖는 올리고머를 생성하게 하는 단계적 방식으로 시약을 이형시킬 수 있도록 디자인된다(1202). 일부 경우에서, 이 단계에서 올리고핵산을 표면으로부터 절단한다. 절단은 예컨대, 암모니아 또는 메틸아민을 이용한 기체 절단을 포함한다.
생성된 올리고핵산 라이브러리를 반응 챔버에 배치한다. 본 예시적인 작업 흐름에서, 반응 챔버(이는 또한 "나노반응기"로도 지칭됨)는 PCR 시약을 함유하는 규소 코팅된 웰이고, 올리고핵산 라이브러리 상에 내려 놓는다(1203). 올리고핵산의 밀봉(1204) 이전 또는 이후에, 시약을 첨가하여 올리고핵산을 기판으로부터 이형시킨다. 예시적인 작업 흐름에서, 나노반응기의 밀봉(1205) 이후에, 올리고핵산을 이형시킨다. 일단 이형되고 나면, 단일 가닥 올리고핵산의 단편은 전체 긴 범위의 DNA 서열에 걸쳐 포괄하도록 하기 위해 하이브리드화한다. 각각의 합성된 올리고핵산은 풀에서 적어도 하나의 다른 올리고핵산과 작은 일부분이 중복되도록 디자인되었기 때문에 부분적 하이브리드화(1205)가 가능하다.
하이브리드화 후, PCA 반응을 개시한다. 폴리머라제 사이클 동안, 올리고핵산은 상보성 단편에 어닐링되고, 갭은 폴리머라제에 의해 충전된다. 각 사이클은 올리고핵산이 서로 어느 것을 찾게 되는지에 따라 무작위적으로 각종 단편의 길이를 증가시킨다. 단편 사이의 상보성을 통해서 완전한 큰 범위의 이중 가닥 DNA가 형성될 수 있다(1206).
PCA 완료 후, 나노반응기를 장치로부터 분리시키고(1207), PCR용 프라이머가 있는 장치와의 상호작용을 위해 배치한다(1208). 밀봉 후, 나노반응기에 대해 PCR을 수행하고(1209), 더욱 큰 핵산을 증폭시킨다. PCR(1210) 후, 나노챔버를 개봉하고(1211), 오류 보정 시약을 첨가하고(1212), 챔버를 밀봉하고(1213), 오류 보정 반응을 통해 이중 가닥 PCR 증폭 생성물로부터 미스매칭된 염기쌍 및/또는 상보성이 부족한 가닥을 제거한다(1214). 나노반응기를 개봉하고, 분리시킨다(1215). 이어서, 오류 보정된 생성물에 추가 프로세싱 단계, 예컨대, PCR 및 분자 바 코딩을 수행한 후, 운반(1223)을 위해 패키징한다(1222).
일부 경우에서, 품질 관리 조치를 취하다. 오류 보정 후, 품질 관리 단계는 오류 보정된 생성물의 증폭을 위해 서열분석 프라이머를 갖는 웨이퍼와의 상호작용(1216), 오류 보정된 증폭 생성물을 함유하는 챔버에의 웨이퍼 밀봉(1217), 및 추가 라운드의 증폭 수행(1218)을 포함한다. 나노반응기를 개봉하고(1219), 생성물을 풀링하고(1220), 서열분석한다(1221). 허용되는 품질 관리 측정 후, 패키징된 생성물(1222)을 운반(1223)을 승인한다.
일부 경우에서, 본원에 개시된 중복 프라이머를 이용하여 예컨대, 도 12에서의 것과 같은 작업 흐름에 의해 생성된 핵산에 대해 돌연변이유발을 수행한다. 일부 경우에서, 프라이머 라이브러리는 고체 지지체 상에서의 반응계내 제조에 의해 생성되고, 이는 단일 뉴클레오티드 신장 프로세스를 사용하여 동시에 다중 올리고머를 신장시킨다. 증착 장치, 예컨대, 올리고핵산 합성기는 다중 올리고핵산이 동시에 잔기를 한 번에 하나씩 신장시켜 소정의 핵산 서열을 갖는 올리고머를 생성하게 하는 단계적 방식으로 시약을 이형시킬 수 있도록 디자인된다(1202).
컴퓨터 시스템
본원에 기술된 시스템 중 임의의 시스템은 컴퓨터에 작동가능하게 연결될 수 있고, 근거리 방식으로 또는 원격적으로 컴퓨터를 통해 자동화될 수 있다. 다양한 경우에서, 본 개시내용의 방법 및 시스템은 컴퓨터 시스템상의 소프트웨어 프로그램 및 그의 사용을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 분배/진공/재충전 기능의 동시화, 예컨대, 물질 증착 장치 이동, 분배 작용 및 진공 작동의 조직화 및 동시화를 위한 전산화된 조절은 본 개시내용의 범위 내에 있다. 컴퓨터 시스템은 사용자에 의해 특정된 염기 서열과 물질 증착 장치의 위치를 접속시켜 올바른 시약을 기판의 특정된 영역에게 전달하도록 프로그래밍될 수 있다.
도 13에 도시된 컴퓨터 시스템(1300)은 고정된 매체(1312)를 가진 서버(1309)에 임의적으로 연결될 수 있는 매체(1311) 및/또는 네트워크 포트(1305)로부터의 지시를 판독할 수 있는 논리 장치로서 이해될 수 있다. 예컨대, 도 13에 제시된 시스템은 CPU(1301), 디스크 드라이브(1303), 임의적 입력 장치, 예컨대, 키보드(1315) 및/또는 마우스(1316), 및 임의적 모니터(1307)를 포함할 수 있다. 데이터 통신은 제시된 통신 매체를 통해 근거리 또는 원거리에 위치하는 서버 쪽으로 달성될 수 있다. 통신 매체는 데이터를 전송하고/거나, 수신하는 임의의 수단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 통신 매체는 네트워크 연결, 무선 연결 또는 인터넷 연결일 수 있다. 상기 연결은 월드 와이드 웹(World Wide Web)상에서의 통신을 제공할 수 있다. 본 개시내용과 관련된 데이터는 도 13에 도시된 바와 같이, 관계자(1322)에 의한 접수 및/또는 검토를 위해 상기와 같은 네트워크 또는 연결 상에서 전송될 수 있다는 것이 구상된다.
도 14는 본 개시내용의 예시적 일례와 관련하여 사용될 수 있는 컴퓨터 시스템(1400)의 첫 번째 예시적 아키텍처를 도시한 블록 다이어그램이다. 도 14에 도시된 바와 같이, 예시적 컴퓨터 시스템은 지시를 프로세싱하기 위한 프로세서(1402)를 포함할 수 있다. 프로세서의 비제한적인 예로는 인텔(Intel) 제온(Xeon)™ 프로세서, AMD 옵테론(Opteron)™ 프로세서, 삼성(Samsung) 32-비트 RISC ARM 1176JZ(F)-S v10™ 프로세서, ARM 코텍스(Cortex)-A8 삼성 S5PC100™ 프로세서, ARM 코텍스-A8 애플 A4(ARM Cortex-A8 Apple A4)™ 프로세서, 마벨(Marvell) PXA 930™ 프로세서, 또는 기능적으로 등가인 프로세서를 포함한다. 다중의 실행 쓰레드가 병렬식 프로세싱을 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 다중 프로세서 또는 다중 코어를 가진 프로세서 또한 단일 컴퓨터 시스템, 클러스터, 또는 복수의 컴퓨터, 휴대 전화, 및/또는 개인 정보 단말기 장치를 포함하는, 네트워크상에 걸쳐 분산된 시스템에서 사용될 수 있다.
도 14에 도시된 바와 같이, 고속 캐시(1404)를 프로세서(1402)에 연결하거나, 또는 그에 도입하여 프로세서(1402)에 의해 최근에 사용되었거나, 또는 빈번하게 사용되는 지시 또는 데이터를 위한 고속 메모리를 제공할 수 있다. 프로세서(1402)는 프로세서 버스(1408)에 의해 노쓰 브리지(1406)에 연결된다. 노쓰 브리지(1406)는 메모리 버스(1412)에 의해 랜덤 액세스 메모리(RAM: random access memory)(1410)에 연결되고, 프로세서(1402)에 의해 RAM(1410)에의 접근을 관리한다. 노쓰 브리지(1406)는 또한 칩셋 버스(1416)에 의해 사우쓰 브리지(1414)에도 연결된다. 결국, 사우쓰 브리지(1414)는 주변 장치 버스(1418)에 연결된다. 주변 장치 버스는 예를 들면, PCI, PCI-X, PCI 익스프레스(Express) 또는 다른 주변 장치 버스일 수 있다. 노쓰 브리지 및 사우쓰 브리지는 종종 프로세서 칩셋으로 지칭되고, 프로세서, RAM, 및 주변 장치 버스(1418) 상의 주변 구성 요소 사이의 데이터 전달을 관리한다. 일부 대안적 구성에서, 별개의 노쓰 브리지 칩을 사용하는 대신, 노쓰 브리지의 기능성을 프로세서 내로 도입할 수 있다. 일부 경우에서, 시스템(1400)은 주변 장치 버스(1418)에 부착된 액셀러레이터 카드(1422)를 포함할 수 있다. 액셀러레이터는 필드 프로그램 가능 게이트 어레이(FPGA: field programmable gate array), 또는 특정 프로세싱을 가속화하기 위한 다른 하드웨어를 포함할 수 있다. 예를 들어, 액셀러레이터는 적응 데이터 재구조화를 위해, 또는 확장된 세트 프로세싱에서 사용된 대수식 평가를 위해 사용될 수 있다
소프트웨어 및 데이터는 외부 저장 장치(1424) 내에 저장되고, 프로세서에 의한 사용을 위해 RAM(1410) 및/또는 캐시(1404) 내에 로딩될 수 있다. 시스템(1400)은 시스템 자원을 관리하기 위한 운용 시스템을 포함하고; 운용 시스템의 비제한적인 예로는 본 개시내용의 예시적인 경우에 따라 데이터 저장 및 최적화를 관리하기 위한 운용 시스템의 상부 상에서 실행되는 응용 소프트웨어 뿐만 아니라, 리눅스(Linux), 윈도우즈(Windows)™, MACOS™, 블랙베리(BlackBerry) OS™, iOS™ 및 다른 기능적으로 등가인 운용 시스템도 포함한다. 본 예에서, 시스템(1400)은 외부 저장 장치, 예컨대, 네트워크 부착 저장 장치(NAS)에의 네트워크 접속을 제공하기 위해 주변 장치 버스에 연결된 네트워크 접속 카드들(NIC: network interface card)((1420) 및 (1421)), 및 분산된 병렬식 프로세싱을 위해 이용될 수 있는 다른 컴퓨터 시스템도 포함한다.
도 15는 복수의 컴퓨터 시스템((1502a) 및 (1502b)), 복수의 휴대 전화 및 개인 정보 단말기(1502c) 및 네트워크 부착 저장 장치(NAS)((1504a) 및 (1504b))를 포함하는 네트워크(1500)를 보여주는 다이어그램이다. 예시적인 경우에서, 시스템((1502a), (1502b) 및 (1502c))은 데이터 저장을 관리할 수 있고, 네트워크 부착 저장 장치(NAS)((1504a) 및 (1504b))에 저장된 데이터에 대한 데이터 접근을 최적화할 수 있다. 수학적 모델은 데이터를 위해 이용할 수 있고, 컴퓨터 시스템((1502a) 및 (1502b)), 및 휴대 전화 및 개인 정보 단말기 시스템(1502c)에 걸쳐 분산된 병렬식 프로세싱을 이용하여 평가될 수 있다. 스템((1502a) 및 (1502b)), 및 휴대 전화 및 개인 정보 단말기 시스템(1502c)은 또한 네트워크 부착 저장 장치((1504a) 및 (1504b))에 저장된 데이터의 적응 데이터 재구조화를 위한 병렬식 프로세싱을 제공할 수 있다. 도 15는 단지 일례만을 보여주는 것이며, 매우 다양한 다른 컴퓨터 아키텍처 및 시스템이 본 개시내용의 다양한 경우와 함께 이용될 수 있다. 예를 들어, 블레이드 서버를 이용하여 병렬식 프로세싱을 제공할 수 있다. 후면판을 통해 프로세서 블레이드를 연결하여 병렬식 프로세싱을 제공할 수 있다. 저장 장치 또한 후면판에 연결될 수 있거나, 또는 별개의 네트워크 접속을 통해 네트워크 부착 저장 장치(NAS)로서 연결될 수 있다. 일부 예시적인 경우에서, 프로세서는 별개의 메모리 공간을 유지할 수 있고, 다른 프로세서에 의한 병렬식 프로세싱을 위해 네트워크 접속, 후면판 또는 다른 연결기를 통해 데이터를 전송할 수 있다. 다른 경우에서, 프로세서 중 일부 또는 그들 모두는 공유 가상 주소 메모리 공간을 이용할 수 있다.
도 16은 예시적인 경우에 따라 공유 가상 주소 메모리 공간을 이용하는 멀티프로세서 컴퓨터 시스템(1600)의 블록 다이어그램이다. 상기 시스템은 공유된 메모리 서브시스템(1604)에 접근할 수 있는 복수의 프로세서(1602a-f)를 포함한다. 상기 시스템은 복수의 프로그램 가능 하드웨어 메모리 알고리즘 프로세서(MAP: memory algorithm processor)(1606a-f)를 메모리 서브시스템(1604)에 도입한다. 각각의 MAP(1606a-f)는 메모리(1608a-f) 및 하나 이상의 필드 프로그램 가능 게이트 어레이(FPGA)(1610a-f)를 포함할 수 있다. MAP는 설정가능한 기능 단위를 제공하고, 특정 알고리즘 또는 알고리즘의 일부는 각각의 프로세서로 세심하게 조정된 프로세싱을 위해 FPGA들(1610a-f)에게 제공될 수 있다. 예를 들어, 예시적 경우에서, MAP를 이용하여 데이터 모델에 관한 대수식을 평가하고, 적응 데이터 재구조화를 수행할 수 있다. 이러한 예에서, 각각의 MAP는 본 목적을 위해 모든 프로세서에 의해 전체적으로 접근가능하다. 한 구성에서, 각각의 MAP는 직접 메모리 접근(DMA: Direct Memory Access)을 이용하여 연관된 메모리(1608a-f)에 접근함으로써, 상기 메모리가 각각의 마이크로프로세서(1602a-f)로부터 독립적으로 및 비동기적으로 과제를 실행하게 할 수 있다. 이러한 구성에서, MAP는 알고리즘의 파이프라이닝 및 병렬식 실행을 위해 결과를 또 다른 MAP에게 직접 공급할 수 있다.
상기 컴퓨터 아키텍처 및 시스템은 단지 예일 뿐이고, 범용 프로세서, 보조프로세서, FPGA 및 다른 프로그램 가능 논리 장치의 임의의 조합을 이용하는 시스템, 시스템온칩(SOC: system on chip), 응용 주문형 집적 회로(ASIC: application specific integrated circuit), 및 다른 프로세싱 및 논리 소자를 비롯한, 매우 다양한 다른 컴퓨터, 휴대 전화 및 개인 정보 단말기 아키텍처 및 시스템이 예시적인 경우와 관련하여 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 컴퓨터 시스템 모두 또는 그의 일부가 소프트웨어 또는 하드웨어에서 실행될 수 있다. 랜덤 액세스 메모리, 하드 드라이브, 플래쉬 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 어레이, 네트워크 부착 저장 장치(NAS), 및 다른 근거리 또는 분산된 데이터 저장 장치 및 시스템을 비롯한, 임의의 다양한 데이터 저장 매체가 예시적인 경우와 관련하여 사용될 수 있다.
예시적인 경우에서, 상기 또는 다른 컴퓨터 아키텍처 및 시스템 중 임의의 컴퓨터 아키텍처 및 시스템 상에서 실행하는 소프트웨어 모듈을 이용하여 컴퓨터 시스템을 실행할 수 있다. 다른 경우에서, 펌웨어, 프로그램 가능 논리 장치, 예컨대, 도 13에서 참조된 필드 프로그램 가능 게이트 어레이(FPGA), 시스템온칩(SOC), 응용 주문형 집적 회로(ASIC), 또는 다른 프로세싱 및 논리 소자에서 시스템의 기능을 부분적으로 또는 완전히 실행할 수 있다. 예를 들어, 하드웨어 액셀러레이터 카드, 예컨대, 도 13에 도시된 액셀러레이터 카드(1322)의 사용을 통한 하드웨어 가속으로 세트 프로세서(Set Processor) 및 옵티마이저(Optimizer)를 실행할 수 있다.
하기 실시예는 당업자에게 본원에 개시된 실시양태의 원리 및 실시를 더욱 명확하게 예시하기 위해 기술된 것이며, 임의의 청구된 실시양태의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 부(part) 및 백분율은 중량 기준으로 한다.
실시예
하기 실시예는 본 개시내용의 다양한 실시양태를 예시하기 위한 목적으로 제공되는 것이며, 어느 방식으로든 본 개시내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 기술된 방법과 함께 본 실시예는 이제 바람직한 실시양태를 나타내고, 예시적인 것이며, 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 특허청구범위의 범주에 의해 정의되는 바와 같이, 본 개시내용의 정신 내에 포함되는 그 안에서의 변형 및 다른 사용이 당업자에게 일어날 것이다.
실시예 1: 장치 표면의 관능화
올리고핵산 라이브러리의 부착 및 합성을 지원하기 위해 장치를 관능화시켰다. 먼저, 90% H2SO4 및 10% H2O2를 포함하는 피라나 용액을 이용하여 장치 표면을 20분 동안 습식 방식으로 세정하였다. 수개의 비커에서 DI 물을 이용하여 장치를 헹구고, DI 물 거위목형 수도 꼭지하에서 5 min 동안 유지시키고, N2를 이용하여 건조시켰다. 이어서, 장치를 NH4OH(1:100; 3 mL:300 mL) 중에 5 min 동안 침지시키고, 핸드건(handgun)을 이용하여 DI 물로 헹구고, 3개의 연속된 비커에서 DI 물을 이용하여 매회 1 min 동안 침지시킨 후, 다시 핸드건을 이용하여 DI 물로 헹구었다. 이어서, 장치 표면을 O2에 노출시켜 장치를 플라즈마 세정하였다. SAMCO PC-300 기계를 사용하여 하류 모드에서 1 min 동안 250 와트에서 O2 플라즈마 에칭을 실시하였다.
하기 파라미터를 이용하여 YES-1224P 기상 증착 오븐 시스템을 사용함으로써 N-(3-트리에톡시실릴프로필)-4-하이드록시부티르아미드를 포함하는 용액으로 세정 장치 표면을 능동적으로 관능화시켰다: 0.5 내지 1 토르, 60 min, 70℃, 135℃ 증발기. 브루어 사이언스(Brewer Science) 200X 스핀 코터를 이용하여 장치 표면을 레지스트 코팅하였다. SPR™ 3612 포토레지스트를 40 sec 동안 2,500 rpm으로 장치 상에 스핀 코팅하였다. 장치를 브루어 핫 플레이트 상에서 90℃에서 30 min 동안 미리 베이킹하였다. 칼 수스(Karl Suss) MA6 마스크 얼라이너 기계를 사용하여 장치에 대해 포토리소그래피를 실시하였다. 장치를 2.2 sec 동안 노출시키고, MSF 26A 중에서 1 min 동안 발색시켰다. 잔류 발색제는 핸드건으로 헹구고, 장치를 5 min 동안 물 중에 침지시켰다. 장치를 오븐에서 100℃에서 30 min 동안 베이킹한 후, 니콘(Nikon) L200을 이용하여 리소그래피 결함에 대하여 시각적으로 검사하였다. 디스컴(descum) 프로세스를 이용함으로써 SAMCO PC-300 기계를 사용하여 잔류 레지스트를 제거하여 1 min 동안 250 와트에서 O2 플라즈마 에칭을 실시하였다.
장치 표면을 10 ㎕ 경질 미네랄 오일과 함께 혼합된 퍼플루오로옥틸트리클로로실란 용액 100 ㎕로 수동적으로 관능화시켰다. 장치를 챔버에 배치하고, 10 min 동안 펌핑한 후, 밸브를 펌프에 대해 닫고, 10 min 동안 정치시켰다. 챔버를 대기로 환기로 시켰다. 최대 전력으로 (Crest 시스템 상에서 9) 초음파처리하면서, 70℃에서 5 min 동안 500 mL NMP 중에 2회에 걸쳐 침지시킴으로써 장치를 레지스트 스트리핑시켰다. 이어서, 최대 전력으로 초음파처리하면서, 실온에서 5 min 동안 500 mL 이소프로판올 중에 장치를 침지시켰다. 장치를 200 푸르프 에탄올 300 mL 중에 디핑하고, N2를 이용하여 드라이 건조시켰다. 관능화된 표면을 활성화시켰고, 이는 올리고핵산 합성을 위한 지지체로서 작용하였다.
실시예 2: 올리고뉴클레오티드 합성 장치 상에서의 50-mer 서열 합성
2차원 올리고뉴클레오티드 합성 장치를 플로우셀로 조립하고, 이를 플로우셀 (Applied Biosystems (ABI394 DNA Synthesizer")에 연결시켰다. 2차원 올리고뉴클레오티드 합성 장치를 N-(3-트리에톡시실릴프로필)-4-하이드록시부티르아미드 (Gelest)로 균일하게 관능화시키고, 이를 이용하여 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드 합성 방법을 사용함으로써 50 bp의 예시적인 올리고뉴클레오티드("50-mer 올리고뉴클레오티드")를 합성하였다.
50-mer의 서열은 서열 번호: 20으로 기술하였다. 5'AGACAATCAACCATTTGGGGTGGACAGCCTTGACCTCTAGACTTCGGCAT##TTTTTTTTTT3'(서열 번호: 20), 여기서, #는 탈보호 동안 표면으로부터 올리고를 유리시킬 수 있는 절단가능한 링커인, 티미딘-숙시닐 헥사미드 CED 포스포라미다이트(ChemGenes로부터의 CLP-2244)를 나타낸다.
하기 표 2의 프로토콜에 따른 표문 DNA 합성 화학법(커플링, 캡핑, 산화, 및 탈차단) 및 ABI 합성기를 이용하여 합성을 수행하였다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
플로우셀을 통한 벌크 시약 전달과 유사한 방식으로 포스포라미다이트/활성화제 조합을 전달하였다. 전 기간 동안 시약으로 인해 환경은 "습윤" 상태로 유지되는 바, 건조 단계는 수행하지 않았다.
더욱 빠르게 유동할 수 있도록 하기 위해 ABI 394 합성기로부터 유동 제한기를 제거하였다. (유동 제한기가 있는 경우, 모든 시약에 대하여 ~50 uL/sec인 것과 비교하여) 유동 제한기가 없는 경우, 아미다이트(ACN 중 0.1 M), 활성화제, (ACN 중 0.25 M 벤조일티오테트라졸("BTT"; GlenResearch로부터의 30-3070-xx)), 및 Ox(20% 피리딘, 10% 물, 및 70% THF 중 0.02 M I2)에 대한 유동 속도는 대략 ~100 uL/sec였고, 아세토니트릴("ACN") 및 캡핑 시약(CapA 및 CapB의 1:1 믹스, 여기서, CapA는 THF/피리딘 중의 아세트산 무수물이고, CapB는 THF 중의 16% 1-메틸이미디졸이다)에 대한 유동 속도는 대략 ~200 uL/sec였고, 데블록(Deblock)(톨루엔 중 3% 디클로로아세트산)대한 유동 속도는 대략 ~300 uL/sec였다. 산화제를 완전히 압출시키는 데 소요되는 시간을 관찰하였고, 그에 맞춰 화학물질 유도 시간을 위한 타이밍을 조정하였고, 추가의 ACN 세척을 상이한 화학물질 사이에 도입하였다. 올리고뉴클레오티드 합성 후, 칩을 75 psi에서 밤새도록 기체 암모니아 중에서 탈보호화하였다. 물 5방울을 표면에 가하여 올리고핵산을 회수하였다. 이어서, 회수된 올리고핵산을 바이오애널라이저 소형 RNA 칩 상에서 분석하였다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 3: 올리고뉴클레오티드 합성 장치 상에서의 100-mer 서열 합성
50-mer 서열 합성을 위해 실시예 2에 기술된 것과 동일한 프로세스를, 첫 번째 것은 N-(3-트리에톡시실릴프로필)-4-하이드록시부티르아미드로 균일하게 관능화된 것이고, 두 번째 것은 11-아세톡시운데실트리에톡시실란 및 n-데실트리에톡시실란의 5/95 믹스로 관능화된 것인, 2개의 상이한 규소 칩 상에서 100-mer 올리고뉴클레오티드 ("100-mer 올리고뉴클레오티드"; 5' CGGGATCCTTATCGTCATCGTCGTACAGATCCCGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATACCATGATGATGATGATGATGAGAACCCCGCAT##TTTTTTTTTT3', 여기서, #는 티미딘-숙시닐 헥사미드 CED 포스포라미다이트(ChemGenes로부터의 CLP-2244)를 나타낸다; 서열 번호: 21)를 합성하는 데 사용하였고, 표면으로부터 추출된 올리고핵산을 바이오애널라이저 기계 상에서 분석하였다(데이터는 나타내지 않음).
하기 열 사이클링 프로그램을 사용하여 50 uL PCR 믹스(25 uL NEB Q5 마스터믹스, 2.5 uL 10 uM 정방향 프라이머, 2.5 uL 10 uM 역방향 프라이머, 표면으로부터 추출된 1 uL 올리고핵산, 및 전체가 50 uL가 될 때까지의 물) 중에서 정방향 프라이머(5'ATGCGGGGTTCTCATCATC3'; 서열 번호: 22) 및 역방향 프라이머(5'CGGGATCCTTATCGTCATCG3'; 서열 번호: 23)를 이용함으로써 상기 두 칩으로부터의 10개의 샘플 모두 추가로 PCR 증폭시켰다:
98 C, 30 sec
98 C, 10 sec; 63C, 10 sec; 72C, 10 sec; 사이클 12회 반복
72C, 2 min.
PCR 생성물을 또한 바이오애널라이저 상에서 전개시켰고(데이터는 나타내지 않음), 이를 통해 100-mer 위치에 뾰족한 피크가 존재한다는 것이 입증되었다. 이어서, PCR 증폭 샘플을 클로닝하고, 생어(Sanger) 서열분석하였다. 하기 표 3에는 칩 1로부터의 스폿 1-5로부터 채취된 샘플, 및 칩 2로부터의 스폿 6-10으로부터 채취된 샘플에 대하여 수행된 생어 서열분석의 결과가 요약되어 있다.
Figure pct00005
이로써, 상이한 표면 화학법을 통해 2개의 칩 상에서 고품질이고, 균일한 합성된 올리고뉴클레오티드가 반복되었다. 전체적으로, 서열분석된 262개의 100-mer 중 233개에 상응하는 89%가 오류가 없는 완변한 서열이었다.
마지막으로, 하기 표 4에는 스폿 1-10으로부터의 올리고뉴클레오티드 샘플로부터 수득된 서열에 대한 오류 특징이 요약되어 있다.
Figure pct00006
실시예 4: 단일 부위, 단일 위치 돌연변이유발에 의한 올리고핵산 라이브러리 생성
일련의 PCR 반응에서 사용하기 위한 올리고핵산 프라이머를 드 노보 합성하여 주형 핵산의 올리고핵산 변이체의 라이브러리를 생성하였다(도 2a-2d 참조). 도 2a에서 4가지 유형의 프라이머가 생성되었다: 외부 5' 프라이머(215), 외부 3' 프라이머(230), 내부 5' 프라이머(225), 및 내부 3' 프라이머(220). 일반적으로 표 2에 개략적으로 서술되어 있는 바와 같은 올리고핵산 합성 방법을 사용하여 내부 5' 프라이머/제1 올리고핵산(220) 및 내부 3' 프라이머/제2 올리고핵산(225)을 생성하였다. 내부 5' 프라이머/제1 올리고핵산(220)은 소정의 서열로 이루어진 최대 19의 프라이머로 구성된 세트를 나타내며, 여기서, 세트 내 각각의 프라이머는 서열 중의 단일 부위 중 단일 코돈에서 또 다른 것과 상이하다.
각각의 클러스터가 121개의 개별적으로 주소지정가능한 좌위를 갖는, 적어도 2개의 클러스터가 있는 장치 상에서 올리고핵산 합성을 수행하였다.
내부 5' 프라이머(225) 및 내부 3' 프라이머(220)를 별개의 클러스터에서 합성하였다. 내부 5' 프라이머(225)를 121회 복제하여 단일 클러스터 내의 121개의 좌위 상에서 연장시켰다. 내부 3' 프라이머(220)의 경우, 변이체 서열로 이루어지 19개의 프라이머 각각의 것을 각각 6개의 상이한 좌위에서 연장시켜 114개의 상이한 좌위 상에서 114개의 올리고핵산을 연장시켰다.
합성된 올리고핵산을 장치 표면으로부터 절단하고, 플라스틱 바이알로 전달하였다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 긴 핵산 서열(235), (240)의 단편을 이용하여 제1 PCR 반응을 수행하였다. 도 2c-2d에 도시된 바와 같이, 프라이머 조합 및 주형으로서 제1 PCR 반응의 생성물을 이용하여 제2 PCR 반응을 수행하였다. 바이오애널라이저 상에서 제2 PCR 생성물 분석을 수행하였고, 이는 도 17의 트레이스에 제시된 바와 같았다.
실시예 5: 96개의 상이한 단일 위치 변이체의 세트를 포함하는 올리고핵산 라이브러리 생성
드 노보 올리고핵산 합성을 사용하여 일반적으로 도 2a에 제시되어 있고, 실시예 2에서 다루어진 것과 같은 4개의 프라이머 세트를 생성하였다. 내부 5' 프라이머(220)를 위해, 각 프라이머 세트가 주형 올리고핵산의 단일 부위 내에 배치된 상이한 단일 코돈을 표적화하는 것인 96개의 상이한 프라이머 세트를 생성하였다. 각 프라이머 세트를 위해, 각각의 변이체가 단일 부위의 상이한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 것인 19개의 상이한 변이체를 생성하였다. 일반적으로 도 2a-2d에 제시되어 있고, 실시예 2에서 기술된 바와 같이, 생성된 프라이머를 사용하여 2 라운드에 걸쳐 PCR을 수행하였다. 96개의 증폭 생성물 세트를 전기영동도(도 18)로 시각화하였고, 이를 사용하여 100% 증폭 성공률을 산출하였다.
실시예 6: 500개의 상이한 단일 위치 변이체의 세트를 포함하는 올리고핵산 라이브러리 생성
드 노보 올리고핵산 합성을 사용하여 일반적으로 도 2a에 제시되어 있고, 실시예 2에서 다루어진 것과 같은 4개의 프라이머 세트를 생성하였다. 내부 5' 프라이머(220)를 위해, 각 프라이머 세트가 주형 올리고핵산의 단일 부위 내에 배치된 상이한 단일 코돈을 표적화하는 것인 500개의 상이한 프라이머 세트를 생성하였다. 각 프라이머 세트를 위해, 각각의 변이체가 단일 부위의 상이한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 것인 19개의 상이한 변이체를 생성하였다. 일반적으로 도 2a에 제시되어 있고, 실시예 2에서 기술된 바와 같이, 생성된 프라이머를 사용하여 2 라운드에 걸쳐 PCR을 수행하였다. 전기영동도는 상이한 단일 부위에 19종의 변이체를 포함하는 것인 핵산의 집단을 포함하는 500개의 PCR 생성물 세트 각각의 것을 나타낸다(데이터는 나타내지 않음). 라이브러리의 종합 서열분석 분석 결과, 미리 선택된 코돈 돌연변이에 걸쳐 99% 초과의 성공률을 보였다(서열 트레이스 및 분석 데이터는 나타내지 않음).
실시예 7: 1번 위치에 대한 단일 부위 돌연변이유발 프라이머
코돈 변이 디자인의 한 예가 황색 형광 단백질에 대해 하기 표 3에 제시되어 있다. 이러한 경우, 서열 50-mer로부터의 단일 코돈을 19회에 걸쳐 다르게 하였다. 변이체 핵산 서열은 굵은체로 표시되어 있다. 야생형 프라이머 서열은 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCAT(서열 번호: 1)이다. 본 경우에서, 야생형 코돈은 서열 번호: 1에서 밑줄로 표시되어 있는 발린을 코딩한다. 그러므로, 하기의 19종의 변이체는 발린을 코딩하는 코돈은 배제한다. 대안적 예에서, 모든 트리플릿이 고려되어야 한다면, 이때는 야생형 코돈에 대한 대안적 서열을 포함하는 60종의 변이체 모두가 생성될 것이다.
[표 3]
Figure pct00007
실시예 8: 단일 부위, 이중 위치 올리고핵산 변이체
실시예 2에 기술된 것과 유사한 조건하에서 드 노보 올리고핵산 합성을 수행하였다. 단일 부위에서, 각 위치가 아미노산을 코딩하는 코돈인 2개의 연속된 코돈 위치에 대해 합성된 올리고핵산의 소정의 변이체를 함유하는 것인, 장치 상의 단일 클러스터를 생성하였다. 이러한 방식에서, 2개의 위치에 대해 위치당 19종의 변이체가 생성되었고, 여기서, 각각의 올리고핵산에 대해 3개의 복제물을 포함하며, 이로써, 114개의 올리고핵산이 합성되었다.
실시예 9: 다중 부위, 이중 위치 올리고핵산 변이체
실시예 2에 기술된 것과 유사한 조건하에서 드 노보 올리고핵산 합성을 수행하였다. 각 위치가 아미노산을 코딩하는 코돈인 2개의 비연속 코돈 위치에 대해 합성된 올리고핵산의 소정의 변이체를 함유하는 것인, 장치 상의 단일 클러스터를 생성하였다. 이러한 방식에서, 2개의 위치에 대해 위치당 19종의 변이체가 생성되었다.
실시예 10: 단일 스트레치, 삼중 위치 올리고핵산 변이체
실시예 2에 기술된 것과 유사한 조건하에서 드 노보 올리고핵산 합성을 수행하였다. 3개의 연속된 코돈 위치에 대해 합성된 참조 올리고핵산의 소정의 변이체를 함유하는 것인, 장치 상의 단일 클러스터를 생성하였다. 3개의 연속된 코돈 위치 방식에서, 3개의 위치에 대해 위치당 19종의 변이체가 생성되었고, 여기서, 각각의 올리고핵산에 대해 2개의 복제물을 포함하며, 이로써, 114개의 올리고핵산이 합성되었다.
실시예 11: 다중 부위, 삼중 위치 올리고핵산 변이체
실시예 2에 기술된 것과 유사한 조건하에서 드 노보 올리고핵산 합성을 수행하였다. 적어도 3개의 비연속 코돈 위치에 대해 합성된 참조 올리고핵산의 소정의 변이체를 함유하는 것인, 장치 상의 단일 클러스터를 생성하였다. 소정의 영역 내에서, 3개의 히스티딘 잔기를 코딩하는 코돈의 위치는 다양하였다.
실시예 12: 다중 부위, 다중 위치 올리고핵산 변이체
실시예 2에 기술된 것과 유사한 조건하에서 드 노보 올리고핵산 합성을 수행하였다. 1개 이상의 스트레치 중 1개 이상의 코돈 위치에 대해 합성된 참조 올리고핵산의 소정의 변이체를 함유하는 것인, 장치 상의 단일 클러스터를 생성하였다. 라이브러리에서 5개의 위치는 다양하였다. 제1 위치는 발현 단백질 중 50/50 K/R 비의 생성물에 대한 코돈을 코딩하였고; 제2 위치는 발현 단백질 중 50/25/25 V/L/S 비의 생성물에 대한 코돈을 코딩하였고, 제3 위치는 발현 단백질 중 50/25/25 Y/R/D 비의 생성물에 대한 코돈을 코딩하였고, 제4 위치는 발현 단백질 중 모든 아미노산에 대하여 동일한 비의 생성물에 대한 코돈을 코딩하였고, 제5 위치는 발현 단백질 중 75/25 G/P 비의 생성물에 대한 코돈을 코딩하였다.
실시예 13: 다중 변이체 부위를 갖는 CDR 중의 스트레치
변이체가 각 위치에서 미리 선택되어 있는 것인, 단일 부위 또는 다중 부위에서의 코돈 변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 라이브러리를 실시예 4-6 및 8-12에서와 같이 생성한다. 변이체 영역은 CDR의 적어도 일부를 코딩한다. 예를 들어, 도 10을 참조한다. 합성된 올리고핵산을 장치 표면으로부터 유리시키고, 프라이머로서 사용하여 핵산 라이브러리를 생성하고, 이를 세포에서 발현시켜 변이체 단백질 라이브러리를 생성한다. 변이체 항체를 에피토프에의 결합 친화도 증가에 관하여 사정한다.
실시예 14: 다양한 펩티드를 발현하기 위한 모듈식 플라스미드 성분
도 11에 도시된 바와 같이, 발현 구축물 카세트의 일부를 구성하는 각각의 별개 영역에 대한 단일 부위 또는 다중 부위에서의 코돈 변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 라이브러리를 실시예 4-6 및 8-12에서와 같이 생성한다. 2개의 구축물을 발현하는 한 카세트를 생성하기 위해 제1 프로모터(1110), 제1 오픈 리딩 프레임(1120), 제1 터미네이터(1130), 제2 프로모터(1140), 제2 오픈 리딩 프레임(1150), 또는 제2 터미네이터 서열(1160)로 이루어진 변이체 서열의 적어도 일부를 코딩하는 변이체 올리고핵산을 합성하였다. 이전 실시예에서 기술된 바와 같이, 증폭 라운드 후, 1,024개의 발현 구축물로 이루어진 라이브러리가 생성된다.
실시예 15: 다중 부위, 단일 위치 변이체
핵산의 적어도 일부를 코딩하는 영역 중의 단일 부위 또는 다중 부위에서의 코돈 변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 라이브러리를 실시예 4-6 및 8-12에서와 같이 생성한다. 라이브러리가 다중 부위, 단일 위치 변이체로 구성된 것인, 올리고핵산 변이체의 라이브러리가 생성된다. 예를 들어, 도 6b를 참조한다.
실시예 16: 변이체 라이브러리 합성
실시예 2에 기술된 것과 유사한 조건하에서 드 노보 올리고핵산 합성을 수행한다. 각각의 동일하지 않은 올리고핵산은 아미노산 서열의 상이한 코돈 변이체를 코딩하는 것인, 적어도 30,000개의 동일하지 않은 올리고핵산을 드 노보 합성한다. 적어도 30,000개의 동일하지 않은 올리고핵산 각각의 것에 대한 소정의 서열과 비교하였을 때, 합성된 적어도 30,000개의 동일하지 않은 올리고핵산은 1,000개의 염기 중 1개 미만인 총 오류율을 가진다. 라이브러리는 긴 핵산의 PCR 돌연변이유발을 위해 사용되고, 적어도 30,000개의 동일하지 않은 변이체 핵산이 형성된다.
실시예 17: 웰에서의 변이체 라이브러리 합성
실시예 2에 기술된 것과 유사한 조건하에서 드 노보 올리고핵산 합성을 수행한다. 2개의 코돈 위치에 대해 합성된 참조 올리고핵산의 소정의 변이체를 함유하는 것인, 장치 상의 단일 클러스터를 생성한다. 2개의 연속된 코돈 위치 방식에서, 2개의 위치에 대해 위치당 19종의 변이체가 생성되었고, 여기서, 각각의 올리고핵산에 대해 2개의 복제물을 포함하며, 이로써, 38개의 올리고핵산이 합성되었다. 각각의 변이체 서열의 길이는 40개의 염기이다. 동일한 클러스터에서, 추가의 비변이체 올리고핵산 서열이 생성되고, 여기서, 추가의 비변이체 올리고핵산 및 변이체 핵산은 집합적으로 유전자의 코딩 서열의 38종의 변이체를 코딩한다. 각 올리고핵산은 또 다른 올리고핵산에 대해 역상보성인 적어도 하나의 영역을 가진다. 클러스터 중 올리고핵산을 기체 암모니아 절단에 의해 유리시킨다. 물을 포함하는 핀을 클러스터와 접촉시키고, 올리고핵산을 취하고, 올리고핵산을 작은 바이알로 옮겨 놓는다. 바이알은 또한 중합효소 사이클링 조립(PCA: polymerase cycling assembly) 반응을 위해 DNA 폴리머라제 시약을 함유한다. 올리고핵산은 어닐링하고, 갭은 연장 반응에 의해 충전되고, 생성된 이중 가닥 DNA 분자가 형성되며, 이로써, 변이체 핵산 라이브러리가 형성된다. 변이체 핵산 라이브러리를 임의적으로 제한 효소에 가한 후, 이어서, 발현 벡터로 라이게이션시킨다.
실시예 18: 단백질 결합 친화도 변화에 관한 변이체 핵산 라이브러리 스크리닝
실시예 16 또는 17에 기술된 바와 같이 복수의 발현 벡터를 생성한다. 본 실시예에서, 발현 벡터는 HIS 태그부착된 박테리아 발현 벡터이다. 벡터 라이브러리를 박테리아 세포 내로 전기천공시킨 후, HIS 태그부착된 변이체 단백질의 발현 및 정제를 위해 클론을 선택한다. 표적 분자에의 결합 친화도의 변화에 대하여 변이체 단백질을 스크리닝한다.
방법에 의해, 예컨대, 금속 이온 코팅된 수지(예컨대, IDA-아가로스 또는 NTA-아가로스)를 사용하여 HIS 태그부착된 단백질을 단리시키는 것인 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC: metal affinity chromatography)를 사용하여 친화도를 조사한다. 히스티딘 잔기 스트링이 특이적인 완충제 조건하에서 니켈, 코발트 및 구리를 비롯한, 여러 유형의 고정화된 금속 이온에 결합하기 때문에 발현된 His 태그부착된 단백질을 정제할 수 있고, 검출할 수 있다. 예시적인 결합/세척 완충제는 10-25 mM 이미다졸을 함유하는, pH 7.2의 트리스 완충제 염수(TBS: Tris-buffer saline)를 구성한다. IMAC 칼럼으로부터 포획된 His 태그부착된 단백질의 용리 및 회수는 고농도의 이미다졸(적어도 200 mM)(용리제), 낮은 pH(예컨대, 0.1 M 글리신-HCl, pH 2.5) 또는 과량의 강한 킬레이터(예컨대, EDTA)로 수행된다.
대안적으로, 항His-태그 항체는 His 태그부착된 단백질을 포함하는 검정 방법, 예컨대, His 태그부착된 단백질을 단리시키는 풀-다운 검정법, 또는 His 태그부착된 단백질을 검출하는 면역블롯팅 검정법에서 사용하기 위한 용도로 상업적으로 이용가능하다.
실시예 19: 세포 부착 및 이동의 조절인자에 대한 활성 변화에 관한 변이체 핵산 라이브러리 스크리닝
실시예 16 또는 17에 기술된 바와 같이 복수의 발현 벡터를 생성한다. 본 실시예에서, 발현 벡터는 GFP 태그부착된 포유동물 발현 벡터이다. 라이브러리로부터 단리된 클론을 포유동물 세포에 일시적으로 형질감염시킨다. 대안적으로, 단백질을 발현시키고, 발현 구축물을 함유하는 세포로부터 단리시킨 후, 추가 측정을 위해 단백질을 세포로 전달한다. 면역형광 검정법을 수행하여 GFP 태그부착된 변이체 발현 생성물의 세포 국재화의 변화를 사정한다. FACS 검정법을 수행하여 GFP 태그부착된 변이체 단백질 발현 생성물의 비변이체 버전과 상호작용하는 막횡단 단백질의 입체형태적 상태의 변화를 사정한다. 상처 치유 검정법을 수행하여 GFP 태그부착된 변이체 단백질을 발현하는 세포의, 세포 배양 디쉬 상의 스크레이프에 의해 생성된 공간을 침입할 수 있는 능력의 변화를 사정한다. 형광 광원 및 카메라를 이용하여 GFP 태그부착된 단백질을 발현하는 세포를 확인하고, 추적한다.
실시예 20: 바이러스성 장애 진행을 억제하는 펩티드에 대한 변이체 핵산 라이브러리 스크리닝
실시예 16 또는 17에 기술된 바와 같이 복수의 발현 벡터를 생성하였다. 본 실시예에서, 발현 벡터는 FLAG 태그부착된 포유동물 발현 벡터이고, 변이체 핵산 라이브러리는 펩티드 서열을 코딩한다. 1차 포유동물 세포는 바이러스성 장애를 앓는 피험체로부터 수득한 것이다. 대안적으로, 건강한 피험체로부터의 1차 세포를 바이러스로 감염시킨다. 세포를 일련의 마이크로웰 디쉬 상에 플레이팅한다. 변이체 라이브러리로부터 단리된 클론을 세포에 일시적으로 형질감염시킨다. 대안적으로, 단백질을 발현시키고, 발현 구축물을 함유하는 세포로부터 단리시킨 후, 추가 측정을 위해 단백질을 세포로 전달한다. 세포 생존 검정법을 수행하여 변이체 펩티드와 연관된 생존 증진에 대해 감염된 세포를 사정한다. 예시적인 바이러스로는 제한 없이, 조류 독감 바이러스, 지카 바이러스, 한타바이러스, C형 간염 바이러스, 두창 바이러스를 포함한다.
한 예시적인 검정법은, 세포에 첨가되었을 때, 원형질막을 가로질러 확산되고, 경미하게 양이온성을 띠는 뉴트럴 레드의 특성에 기인하여 산성 리소좀 구획에 축적되는 것인 뉴트럴 레드 염료를 사용하여 뉴트럴 레드 세포독성 검정법이다. 바이러스 유도성 세포 변성은 막의 단편화 및 리소좀 ATP 주동 양성자 전위 활성 손실을 유도한다. 그 결과에 따른 세포내 뉴트럴 레드의 감소는 다중웰 플레이트 포맷으로 분광 광도법을 사용하여 사정될 수 있다. 변이체 펩티드를 발현하는 세포를 신호 색상 획득(gain-of-signal color) 검정법에서 세포내 뉴트럴 레드의 증가에 의해 점수화한다. 바이러스 유도성 세포 변성을 억제시키는 펩티드에 대해 세포를 사정한다.
실시예 21: 세포의 대사 활성을 증가 또는 감소시키는 변이체 단백질에 관한 스크리닝
세포의 대사 활성을 변화시키는 발현 생성물을 확인하기 위한 목적으로 실시예 16 또는 17에 기술된 바와 같이 복수의 발현 벡터를 생성하였다. 본 실시예에서, 발현 벡터를 (예컨대, 형질감염 또는 형질도입을 통해) 일련의 마이크로웰 디쉬 상에 플레이팅된 세포로 전달한다. 이어서, 세포를 하나 이상의 대사 활성 변화에 관하여 스크리닝한다. 대안적으로, 단백질을 발현시키고, 발현 구축물을 함유하는 세포로부터 단리시킨 후, 대사 활성을 측정하기 위해 단백질을 세포로 전달한다. 임의적으로, 하나 이상의 대사 활성 변화에 관하여 스크리닝하기 이전에 대사 활성을 측정하기 위한 세포를 독소로 처리한다. 투여되는 독소의 예로는 제한 없이, 보툴리늄 독소(면역학적 유형: A, B, C1, C2, D, E, F, 및 G 포함), 스타필로코구스(staphylococcus) 장내 독소 B, 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), C형 간염, 머스타드 작용제, 중금속, 시아나이드, 내독소, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 지카 바이러스, 조류 독감, 제초제, 살충제, 수은, 유기포스페이트, 및 리신을 포함한다.
기초 에너지 요구량은 호기성 트리카복실산(TCA: aerobic tricarboxylic acid) 또는 크레브스(Kreb's) 회로, 또는 혐기성 해당 반응을 포함하는 산화성 인산화에 의해 대사 기질, 예컨대, 글루코스의 산화로부터 도출된다. 해당 반응이 주된 에너지 공급원일 때, 세포의 대사 활성은 세포가 산성을 띠는 대사 생성물, 예컨대, 락테이트 및 CO2를 배출하는 속도를 모니터링함으로써 추정될 수 있다. 호기성 대사인 경우, 세포외 산소 소비 및 산화성 자유 라디칼 생성이 세포의 에너지 요구량을 반영한다. 세포내 산화-환원 전위는 NADH 및 NAD+의 자가 형광 측정값에 의해 측정될 수 있다. 예컨대, 열과 같이, 세포에 의해 방출된 에너지의 양은 정상 환경하에서 산소 소비량(예컨대, 4.8 kcal/l O2)으로부터 예측될 수 있는, 대사 동안 생산 및/또는 소비된 물질에 대한 분석 값으로부터 도출된다. 열 생산과 산소 이용률 사이의 커플링은 독소에 의해 교란될 수 있다. 직접 미세 열량 측정법은 열적으로 격리된 샘플의 온도 상승을 측정한다. 따라서, 산소 소비 측정과 함께 조합되었을 때, 열량 측정법은 독소의 비커플링 활성을 검출하는 데 사용될 수 있다.
대사 활성의 각종 마커의 변화를 측정하는 다양한 방법 및 장치가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 방법, 장치, 및 마커는 미국 특허 번호 7,704,745(상기 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에서 논의된다. 간략하면, 하기 특징들 중 임의의 것의 측정값을 각 세포 집단에 대하여 기록한다: 글루코스, 락테이트, CO2, NADH 및 NAD+ 비, 열, O2 소비, 및 자유 라디칼 생산. 스크리닝된 세포로는 간세포, 대식세포 또는 신경아세포종 세포를 포함할 수 있다. 스크리닝된 세포로는 세포주, 피험체로부터의 1차 세포, 또는 모델 시스템(예컨대, 마우스 모델)으로부터의 세포를 포함할 수 있다.
다중웰 플레이트의 챔버 내에 위치하는 단일 세포, 또는 세포 집단의 산소 소비 속도를 측정하는 데 다양한 기술이 이용가능하다. 예를 들어, 세포를 포함하는 챔버는 온도, 전류 또는 형광 변화를 기록하기 위한 센서 뿐만 아니라, 광학 시스템, 예컨대, 형광을 모니터링하기 위해 각 챔버에 결합된, 섬유 결합형 광학 시스템을 가질 수 있다. 본 실시예에서, 각 챔버는 조명원이 챔버 내부의 분자를 여기시킬 수 있도록 하기 위해 창을 가진다. 섬유 결합형 광학 시스템은 자가 형광을 검출하여 세포내 NADH/NAD 비를 측정할 수 있고, 전압 및 칼슘 감수성 염료를 검출하여 막횡단 전위 및 세포내 칼슘을 측정할 수 있다. 추가로, CO2 및/또는 O2 감수성 형광 염료 신호의 변화를 검출한다.
실시예 22: 암 세포의 선택적 표적화에 관한 변이체 핵산 라이브러리 스크리닝
실시예 16 또는 17에 기술된 바와 같이 복수의 발현 벡터를 생성한다. 본 실시예에서, 발현 벡터는 FLAG 태그부착된 포유동물 발현 벡터이고, 변이체 핵산 라이브러리는 펩티드 서열을 코딩한다. 변이체 라이브러리로부터 단리된 클론을 암 세포 및 비암 세포에 따로따로 일시적으로 형질감염시킨다. 각각이 변이체 핵산에 의해 코딩되는 변이체 펩티드를 발현하는 것인 암 세포 및 비암 세포, 둘 모두에 대하여 세포 생존 및 세포 사멸 검정법을 수행한다. 변이체 펩티드와 연관된 선택적 암 세포 사멸에 관하여 세포를 사정한다. 암 세포는 임의적으로 암 진단을 받은 피험체로부터의 암 세포주 또는 원발성 암 세포이다. 암 진단을 받은 피험체로부터의 원발성 암 세포인 경우, 스크리닝 검정법에서 확인된 변이체 펩티드는 임의적으로 피험체에게로의 투여를 위해 선택된다. 대안적으로, 단백질을 발현시키고, 단백질 발현 구축물을 함유하는 세포로부터 단리시킨 후, 추가 측정을 위해 단백질을 암 세포 및 비암 세포로 전달한다.
본 개시내용의 바람직한 실시양태가 본원에 제시 및 기술되어 있지만, 상기 실시양태는 단지 예로서 제공된 것이라는 것이 자명할 것이다. 이에 본 발명을 벗어나지 않으면서 다수의 변형, 변화, 및 치환이 당업자에게 이루어질 수 있을 것이다. 본원에 기술된 본 개시내용의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 개시내용을 실시하는 데 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 하기 특허청구범위는 본 개시내용의 범주를 정의하고, 이들 특허청구범위의 내의 방법 및 구조, 및 그의 등가물이 특허청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> TWIST BIOSCIENCE CORPORATION <120> OLIGONUCLEIC ACID VARIANT LIBRARIES AND SYNTHESIS THEREOF <130> 44854-718.601 <140> <141> <150> 62/354,034 <151> 2016-06-23 <150> 62/263,548 <151> 2015-12-04 <150> 62/220,879 <151> 2015-09-18 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 atgtttagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 atgttaagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 atgattagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Any amino acid <400> 31 Ala Trp Ile Lys Arg Glu Xaa 1 5

Claims (35)

  1. a) 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 코딩하는 소정의 서열을 제공하는 단계로서, 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산 각각은 단일 기준 서열과 비교하여 변이체 코돈 서열을 코딩하는 것인 단계;
    b) 표면을 갖는 구조물을 제공하는 단계;
    c) 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 합성하는 단계로서, 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산 각각이 상기 표면으로부터 신장되는 것인 단계;
    d) 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 DNA 폴리머라제 및 단일 기준 서열과 혼합하여 변이체 핵산의 라이브러리를 형성하는 단계;
    e) 변이체 핵산의 라이브러리를 세포로 전달하고, 복수의 변이체 단백질을 발현시키는 단계; 및
    f) 복수의 변이체 단백질들 중 한 변이체 단백질과 연관된 활성을 확인하는 단계로서, 상기 활성은 단일 기준 서열에 의해 코딩된 단백질과 비교하여 조절되는 것인 단계
    를 포함하는, 단백질 활성을 조절하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 활성이 세포의 생식, 성장, 부착, 사멸, 이동, 에너지 생산, 산소 이용률, 대사 활성, 세포 신호전달, 노화, 자유 라디칼 손상에 대한 반응, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 세포가 진핵 세포 또는 원핵 세포인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 세포가 박테리아, 식물, 마우스 또는 영장류의 세포인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 변이체 핵산의 라이브러리가 변이체 유전자 또는 그의 단편에 대한 서열을 코딩하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 변이체 단백질이 항체, 효소 또는 펩티드인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 변이체 단백질이 또 다른 분자에 대하여 증진되거나 감소된 결합 친화도를 갖는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 변이체 단백질은 증진되거나 감소된 효소 활성을 갖는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 변이체 핵산의 라이브러리에 의해 코딩된 단일 변이체 핵산을, 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산은, 상기 복수의 동일하지 않은 올리고핵산에 대한 소정의 서열과 비교하여 총 오류율이 1,000개의 염기 중 1개 미만인 방법.
  11. a) 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 코딩하는 소정의 서열을 제공하는 단계로서, 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산 각각은 단일 기준 서열과 비교하여 소정의 변이체 서열을 코딩하는 것인 단계;
    b) 표면을 갖는 구조물을 제공하는 단계;
    c) 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 합성하는 단계로서, 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산 각각이 상기 표면으로부터 신장되고, 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산은, 상기 복수의 동일하지 않은 올리고핵산에 대한 소정의 서열과 비교하여 총 오류율이 1,000개의 염기 중 1개 미만인 단계;
    d) 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 DNA 폴리머라제 및 단일 기준 서열과 혼합하여 변이체 핵산의 라이브러리를 형성하는 단계;
    e) 변이체 핵산의 라이브러리를 제1 세포 세트로 전달하는 단계; 및
    f) 세포 활성의 변화를 측정하는 단계로서, 세포 활성은 제1 세포 세트 또는 제2 세포 세트에 대하여 측정하고, 제2 세포 세트는 제1 세포 세트로부터 단리된 적어도 하나의 발현 생성물로 처리된 것인 단계
    를 포함하는, 세포 활성을 조절하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 세포 활성이 생식, 성장, 부착, 사멸, 이동, 에너지 생산, 산소 이용률, 대사 활성, 세포 신호전달, 자유 라디칼 손상에 대한 반응, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 제1 세포 세트 또는 제2 세포 세트가 진핵 세포 또는 원핵 세포인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 제1 세포 세트 또는 제2 세포 세트가 박테리아, 식물, 마우스 또는 영장류의 세포인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 변이체 핵산의 라이브러리가 변이체 유전자 또는 그의 단편에 대한 서열을 코딩하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 각각의 변이체 유전자를 번역하여 단백질을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 단백질이 항체, 효소 또는 펩티드인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 변이체 핵산의 라이브러리가 항체의 가변 영역 또는 불변 영역의 적어도 일부를 코딩하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 변이체 핵산의 라이브러리가 항체의 적어도 하나의 CDR 영역을 코딩하는 것인 방법.
  20. 제16항에 있어서, 단백질이 또 다른 분자에 대하여 증진되거나 감소된 결합 친화도를 갖거나, 또는 단백질이 증진되거나 감소된 효소 활성을 갖는 것인 방법.
  21. 제11항에 있어서, 변이체 핵산의 라이브러리가 전사 조절 서열을 코딩하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 전사 조절 서열이 프로모터, UTR 또는 터미네이터 서열인 방법.
  23. 제11항에 있어서, 변이체 핵산의 라이브러리는, 전사될 때 mRNA, miRNA 또는 shRNA를 코딩하는 서열을 코딩하는 것인 방법.
  24. a) 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 코딩하는 소정의 서열을 제공하는 단계로서, 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산 각각은 단일 기준 서열과 비교하여 변이체 코돈 서열을 코딩하는 것인 단계;
    b) 표면을 갖는 구조물을 제공하는 단계;
    c) 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 합성하는 단계로서, 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산 각각이 상기 표면으로부터 신장되는 것인 단계;
    d) 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 DNA 폴리머라제 및 단일 기준 서열과 혼합하여 변이체 핵산의 라이브러리를 형성하는 단계;
    e) 변이체 핵산의 라이브러리를 피험체로부터 수득된 세포로 전달하는 단계;
    f) 변이체 핵산의 라이브러리에 의해 코딩된 변이체 핵산과 연관된 유해 활성의 감소를 확인하는 단계; 및
    g) 변이체 핵산의 라이브러리에 의해 코딩된 변이체 핵산을, 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하여, 질환 상태를 치료하거나 경감하는 단계
    를 포함하는, 질환 상태를 치료하거나 경감하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 질환 상태가 세포 증식성 장애, 자가면역 장애, 바이러스성 장애 또는 박테리아성 장애와 연관된 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 약 30,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산은, 상기 복수의 동일하지 않은 올리고핵산에 대한 소정의 서열과 비교하여 총 오류율이 1,000개의 염기 중 1개 미만인 방법.
  27. a) 복수의 동일하지 않은 올리고핵산을 코딩하는 소정의 서열을 제공하는 단계로서, 동일하지 않은 올리고핵산 각각의 길이는 20개 이상의 염기이고, 상기 복수의 동일하지 않은 올리고핵산은, 적어도 하나의 서열에 대한 3개 이상의 코돈 각각에 대해 최대 19종의 변이체를 코딩하며, 상기 복수의 동일하지 않은 올리고핵산은 1 이상의 유전자 및 그의 변이체를 집합적으로 코딩하는 것인 단계;
    b) 표면을 갖는 구조물을 제공하는 단계;
    c) 복수의 동일하지 않은 올리고핵산을 합성하는 단계로서, 상기 동일하지 않은 올리고핵산 각각이 상기 표면으로부터 신장되는 것인 단계; 및
    d) 복수의 동일하지 않은 올리고핵산으로부터 변이체 핵산의 라이브러리를 조립하는 단계
    를 포함하는 핵산 합성 방법.
  28. 제27항에 있어서, 복수의 동일하지 않은 올리고핵산이 75,000 이상의 동일하지 않은 올리고핵산을 포함하는 것인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 단일 유전자 및 그의 변이체를 집합적으로 코딩하는 복수의 동일하지 않은 올리고핵산의 서브세트가 상기 구조물 표면 상의 단일 클러스터 내에 위치하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 구조물 표면이 6,000개 이상의 단일 클러스터를 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 각각의 클러스터는 직경이 약 0.5 내지 2 mm인 채널 내에 위치하는 것인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 단일 클러스터가 핵산 신장을 위한 50 내지 500개의 좌위를 포함하는 것인 방법.
  33. 제27항에 있어서, 복수의 동일하지 않은 올리고핵산이 1종 초과의 유전자의 변이체를 집합적으로 코딩하는 것인 방법.
  34. 제27항에 있어서, 복수의 동일하지 않은 올리고핵산이 5,000종 이상의 유전자의 변이체를 집합적으로 코딩하는 것인 방법.
  35. 제27항에 있어서, 변이체 핵산의 라이브러리가 효소, 펩티드 또는 항체의 적어도 일부를 코딩하는 것인 방법.
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Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201600853UA (en) 2013-08-05 2016-03-30 Twist Bioscience Corp De novo synthesized gene libraries
US10669304B2 (en) 2015-02-04 2020-06-02 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
WO2016172377A1 (en) 2015-04-21 2016-10-27 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
KR20180050411A (ko) 2015-09-18 2018-05-14 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 올리고핵산 변이체 라이브러리 및 그의 합성
KR20180058772A (ko) 2015-09-22 2018-06-01 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 합성을 위한 가요성 기판
CA3006867A1 (en) 2015-12-01 2017-06-08 Twist Bioscience Corporation Functionalized surfaces and preparation thereof
GB2568444A (en) 2016-08-22 2019-05-15 Twist Bioscience Corp De novo synthesized nucleic acid libraries
EP3516528A4 (en) 2016-09-21 2020-06-24 Twist Bioscience Corporation NUCLEIC ACID BASED DATA STORAGE
WO2018112426A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
JP2020508661A (ja) 2017-02-22 2020-03-26 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション 核酸ベースのデータ保存
WO2018170169A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
GB2575576A (en) * 2017-03-15 2020-01-15 Twist Bioscience Corp De novo synthesized combinatorial nucleic acid libraries
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
IL271205B1 (en) 2017-06-12 2024-10-01 Twist Bioscience Corp Methods for assembling contiguous nucleic acids
JP2020536504A (ja) 2017-09-11 2020-12-17 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション Ｇｐｃｒ結合タンパク質およびその合成
US10894242B2 (en) 2017-10-20 2021-01-19 Twist Bioscience Corporation Heated nanowells for polynucleotide synthesis
SG11202006460SA (en) 2018-01-04 2020-08-28 Twist Bioscience Corp Dna-based digital information storage
SG11202011467RA (en) 2018-05-18 2020-12-30 Twist Bioscience Corp Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization
US11492728B2 (en) 2019-02-26 2022-11-08 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for antibody optimization
AU2020229349A1 (en) 2019-02-26 2021-10-14 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for GLP1 receptor
CA3144644A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Twist Bioscience Corporation Barcode-based nucleic acid sequence assembly
EP4034566A4 (en) 2019-09-23 2024-01-24 Twist Bioscience Corporation VARIANT NUCLEIC ACID LIBRARIES FOR CRTH2
US20210395344A1 (en) 2020-04-27 2021-12-23 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for coronavirus
EP4150080A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Codex Dna, Inc. On demand synthesis of polynucleotide sequences
US11970697B2 (en) 2020-10-19 2024-04-30 Twist Bioscience Corporation Methods of synthesizing oligonucleotides using tethered nucleotides
US20220411784A1 (en) * 2021-05-03 2022-12-29 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for glycans
KR20240101677A (ko) 2021-11-18 2024-07-02 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 Dickkopf-1 변이체 항체 및 사용 방법

Family Cites Families (936)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3549368A (en) 1968-07-02 1970-12-22 Ibm Process for improving photoresist adhesion
US3920714A (en) 1972-11-16 1975-11-18 Weber Heinrich Process for the production of polymeric hydrocarbons with reactive silyl side groups
GB1550867A (en) 1975-08-04 1979-08-22 Hughes Aircraft Co Positioning method and apparatus for fabricating microcircuit devices
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
EP0090789A1 (en) 1982-03-26 1983-10-05 Monsanto Company Chemical DNA synthesis
US4994373A (en) 1983-01-27 1991-02-19 Enzo Biochem, Inc. Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes
JPS59224123A (ja) 1983-05-20 1984-12-17 Oki Electric Ind Co Ltd ウエハアライメントマ−ク
US5118605A (en) 1984-10-16 1992-06-02 Chiron Corporation Polynucleotide determination with selectable cleavage sites
JPS61141761A (ja) 1984-12-12 1986-06-28 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 硬化性組成物
US5242794A (en) 1984-12-13 1993-09-07 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
US4613398A (en) 1985-06-06 1986-09-23 International Business Machines Corporation Formation of etch-resistant resists through preferential permeation
US4981797A (en) 1985-08-08 1991-01-01 Life Technologies, Inc. Process of producing highly transformable cells and cells produced thereby
US4726877A (en) 1986-01-22 1988-02-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Methods of using photosensitive compositions containing microgels
US4808511A (en) 1987-05-19 1989-02-28 International Business Machines Corporation Vapor phase photoresist silylation process
JPH07113774B2 (ja) 1987-05-29 1995-12-06 株式会社日立製作所 パタ−ンの形成方法
US4988617A (en) 1988-03-25 1991-01-29 California Institute Of Technology Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
DE69028725T2 (de) 1989-02-28 1997-03-13 Canon Kk Partiell doppelsträngiges Oligonukleotid und Verfahren zu seiner Bildung
US5556750A (en) 1989-05-12 1996-09-17 Duke University Methods and kits for fractionating a population of DNA molecules based on the presence or absence of a base-pair mismatch utilizing mismatch repair systems
US5459039A (en) 1989-05-12 1995-10-17 Duke University Methods for mapping genetic mutations
US6008031A (en) 1989-05-12 1999-12-28 Duke University Method of analysis and manipulation of DNA utilizing mismatch repair systems
US5102797A (en) 1989-05-26 1992-04-07 Dna Plant Technology Corporation Introduction of heterologous genes into bacteria using transposon flanked expression cassette and a binary vector system
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US6919211B1 (en) 1989-06-07 2005-07-19 Affymetrix, Inc. Polypeptide arrays
US5527681A (en) 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US6309822B1 (en) 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
US5242974A (en) 1991-11-22 1993-09-07 Affymax Technologies N.V. Polymer reversal on solid surfaces
CA2036946C (en) 1990-04-06 2001-10-16 Kenneth V. Deugau Indexing linkers
US5494810A (en) 1990-05-03 1996-02-27 Cornell Research Foundation, Inc. Thermostable ligase-mediated DNA amplifications system for the detection of genetic disease
US6087482A (en) 1990-07-27 2000-07-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
DE69133389T2 (de) 1990-09-27 2005-06-02 Invitrogen Corp., Carlsbad Direkte Klonierung von PCR amplifizierten Nukleinsäuren
GB9025236D0 (en) 1990-11-20 1991-01-02 Secr Defence Silicon-on porous-silicon;method of production
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
DE69132843T2 (de) 1990-12-06 2002-09-12 Affymetrix, Inc. (N.D.Ges.D.Staates Delaware) Identifizierung von Nukleinsäuren in Proben
ATE199054T1 (de) 1990-12-06 2001-02-15 Affymetrix Inc A Delaware Corp Verbindungen und ihre verwendung in einer binären synthesestrategie
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
US5137814A (en) 1991-06-14 1992-08-11 Life Technologies, Inc. Use of exo-sample nucleotides in gene cloning
US5449754A (en) 1991-08-07 1995-09-12 H & N Instruments, Inc. Generation of combinatorial libraries
US5474796A (en) 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US5846717A (en) 1996-01-24 1998-12-08 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage
US7045289B2 (en) 1991-09-09 2006-05-16 Third Wave Technologies, Inc. Detection of RNA Sequences
US5994069A (en) 1996-01-24 1999-11-30 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acids by multiple sequential invasive cleavages
US7150982B2 (en) 1991-09-09 2006-12-19 Third Wave Technologies, Inc. RNA detection assays
US6759226B1 (en) 2000-05-24 2004-07-06 Third Wave Technologies, Inc. Enzymes for the detection of specific nucleic acid sequences
US5384261A (en) 1991-11-22 1995-01-24 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths
WO1993009668A1 (en) 1991-11-22 1993-05-27 Affymax Technology N.V. Combinatorial strategies for polymer synthesis
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
ATE173767T1 (de) 1992-04-03 1998-12-15 Perkin Elmer Corp Proben zusammensetzung und verfahren
JP2553322Y2 (ja) 1992-05-11 1997-11-05 サンデン株式会社 飲料抽出装置のフィルタ送り機構
JPH07509365A (ja) 1992-07-31 1995-10-19 デイド・ベーリング・マルブルク・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング ポリヌクレオチド類の３’末端に特定配列を導入する方法
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
JP3176444B2 (ja) 1992-10-01 2001-06-18 株式会社リコー 水性インク及びこれを用いた記録方法
DE4241045C1 (de) 1992-12-05 1994-05-26 Bosch Gmbh Robert Verfahren zum anisotropen Ätzen von Silicium
US5368823A (en) 1993-02-11 1994-11-29 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Automated synthesis of oligonucleotides
US5395753A (en) 1993-02-19 1995-03-07 Theratech, Inc. Method for diagnosing rheumatoid arthritis
DE69433010T2 (de) 1993-04-12 2004-06-09 Northwestern University, Evanston Verfahren zur darstellung von oligonukleotiden
US7135312B2 (en) 1993-04-15 2006-11-14 University Of Rochester Circular DNA vectors for synthesis of RNA and DNA
US5455239A (en) 1993-08-05 1995-10-03 Merck & Co. Inc. 3-aryl of heteroaryl-7-heteroaralkylamido cephalosporin compounds, compositions and methods of use
US5482845A (en) 1993-09-24 1996-01-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for construction of normalized cDNA libraries
CN1039623C (zh) 1993-10-22 1998-09-02 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 一种防治运动病综合征的药物组合物及其制备方法
US6893816B1 (en) 1993-10-28 2005-05-17 Houston Advanced Research Center Microfabricated, flowthrough porous apparatus for discrete detection of binding reactions
ES2176308T3 (es) 1993-10-28 2002-12-01 Houston Advanced Res Ct Dispositivo de microestructura porosa que permite un flujo.
US6027877A (en) 1993-11-04 2000-02-22 Gene Check, Inc. Use of immobilized mismatch binding protein for detection of mutations and polymorphisms, purification of amplified DNA samples and allele identification
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US6015880A (en) 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US5824531A (en) 1994-03-29 1998-10-20 Novid Nordisk Alkaline bacilus amylase
US5514789A (en) 1994-04-21 1996-05-07 Barrskogen, Inc. Recovery of oligonucleotides by gas phase cleavage
SE512382C2 (sv) 1994-04-26 2000-03-06 Ericsson Telefon Ab L M Anordning och förfarande för att placera långsträckta element mot eller invid en yta
JP2909216B2 (ja) 1994-04-29 1999-06-23 パーキン‐エルマー コーポレイション 核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置
US6287850B1 (en) 1995-06-07 2001-09-11 Affymetrix, Inc. Bioarray chip reaction apparatus and its manufacture
US5739386A (en) 1994-06-23 1998-04-14 Affymax Technologies N.V. Photolabile compounds and methods for their use
US5641658A (en) 1994-08-03 1997-06-24 Mosaic Technologies, Inc. Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support
US5530516A (en) 1994-10-04 1996-06-25 Tamarack Scientific Co., Inc. Large-area projection exposure system
US6635226B1 (en) 1994-10-19 2003-10-21 Agilent Technologies, Inc. Microanalytical device and use thereof for conducting chemical processes
US6613560B1 (en) 1994-10-19 2003-09-02 Agilent Technologies, Inc. PCR microreactor for amplifying DNA using microquantities of sample fluid
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
WO1996015861A1 (en) 1994-11-22 1996-05-30 Complex Fluid Systems, Inc. Non-aminic photoresist adhesion promoters for microelectronic applications
US5688642A (en) 1994-12-01 1997-11-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Selective attachment of nucleic acid molecules to patterned self-assembled surfaces
US6017434A (en) 1995-05-09 2000-01-25 Curagen Corporation Apparatus and method for the generation, separation, detection, and recognition of biopolymer fragments
US5830655A (en) 1995-05-22 1998-11-03 Sri International Oligonucleotide sizing using cleavable primers
US5700642A (en) 1995-05-22 1997-12-23 Sri International Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers
US5877280A (en) 1995-06-06 1999-03-02 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Thermostable muts proteins
US6446682B1 (en) 1995-06-06 2002-09-10 James P. Viken Auto-loading fluid exchanger and method of use
US5707806A (en) 1995-06-07 1998-01-13 Genzyme Corporation Direct sequence identification of mutations by cleavage- and ligation-associated mutation-specific sequencing
US5780613A (en) 1995-08-01 1998-07-14 Northwestern University Covalent lock for self-assembled oligonucleotide constructs
US5712126A (en) 1995-08-01 1998-01-27 Yale University Analysis of gene expression by display of 3-end restriction fragments of CDNA
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US6537776B1 (en) 1999-06-14 2003-03-25 Diversa Corporation Synthetic ligation reassembly in directed evolution
US6352842B1 (en) 1995-12-07 2002-03-05 Diversa Corporation Exonucease-mediated gene assembly in directed evolution
US5922539A (en) 1995-12-15 1999-07-13 Duke University Methods for use of mismatch repair systems for the detection and removal of mutant sequences that arise during enzymatic amplification
US5962271A (en) 1996-01-03 1999-10-05 Cloutech Laboratories, Inc. Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end
US5976846A (en) 1996-01-13 1999-11-02 Passmore; Steven E. Method for multifragment in vivo cloning and mutation mapping
US7527928B2 (en) 1996-11-29 2009-05-05 Third Wave Technologies, Inc. Reactions on a solid surface
US6706471B1 (en) 1996-01-24 2004-03-16 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage
US5985557A (en) 1996-01-24 1999-11-16 Third Wave Technologies, Inc. Invasive cleavage of nucleic acids
US7122364B1 (en) 1998-03-24 2006-10-17 Third Wave Technologies, Inc. FEN endonucleases
US7432048B2 (en) 1996-11-29 2008-10-07 Third Wave Technologies, Inc. Reactions on a solid surface
US6090606A (en) 1996-01-24 2000-07-18 Third Wave Technologies, Inc. Cleavage agents
US6274369B1 (en) 1996-02-02 2001-08-14 Invitrogen Corporation Method capable of increasing competency of bacterial cell transformation
US6013440A (en) 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
US6020481A (en) 1996-04-01 2000-02-01 The Perkin-Elmer Corporation Asymmetric benzoxanthene dyes
US6706875B1 (en) 1996-04-17 2004-03-16 Affyemtrix, Inc. Substrate preparation process
US5869245A (en) 1996-06-05 1999-02-09 Fox Chase Cancer Center Mismatch endonuclease and its use in identifying mutations in targeted polynucleotide strands
US5863801A (en) 1996-06-14 1999-01-26 Sarnoff Corporation Automated nucleic acid isolation
US6780982B2 (en) 1996-07-12 2004-08-24 Third Wave Technologies, Inc. Charge tags and the separation of nucleic acid molecules
US5853993A (en) 1996-10-21 1998-12-29 Hewlett-Packard Company Signal enhancement method and kit
WO1998022541A2 (en) 1996-11-08 1998-05-28 Ikonos Corporation Method for coating substrates
US5750672A (en) 1996-11-22 1998-05-12 Barrskogen, Inc. Anhydrous amine cleavage of oligonucleotides
EP0966542B1 (en) 1996-11-29 2008-11-12 Third Wave Technologies, Inc. Fen-1 endonucleases, mixtures and cleavage methods
CA2389358C (en) 1996-12-31 2008-07-15 Genometrix Incorporated Multiplexed molecular analysis apparatus and method
ATE294229T1 (de) 1997-02-12 2005-05-15 Invitrogen Corp Verfahren zur trocknung von kompetenten zellen
US5882496A (en) 1997-02-27 1999-03-16 The Regents Of The University Of California Porous silicon structures with high surface area/specific pore size
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
AU751956B2 (en) 1997-03-20 2002-09-05 University Of Washington Solvent for biopolymer synthesis, solvent microdroplets and methods of use
US6419883B1 (en) 1998-01-16 2002-07-16 University Of Washington Chemical synthesis using solvent microdroplets
US6028189A (en) 1997-03-20 2000-02-22 University Of Washington Solvent for oligonucleotide synthesis and methods of use
CA2283635A1 (en) 1997-03-21 1998-10-01 Stratagene Polymerase enhancing factor (pef) extracts, pef protein complexes, isolated pef protein, and methods for purifying and identifying
US6969488B2 (en) 1998-05-22 2005-11-29 Solexa, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
US5922593A (en) 1997-05-23 1999-07-13 Becton, Dickinson And Company Microbiological test panel and method therefor
EP0991930B1 (en) 1997-06-26 2004-06-16 Perseptive Biosystems, Inc. High density sample holder for analysis of biological samples
GB9714716D0 (en) 1997-07-11 1997-09-17 Brax Genomics Ltd Characterising nucleic acids
US5989872A (en) 1997-08-12 1999-11-23 Clontech Laboratories, Inc. Methods and compositions for transferring DNA sequence information among vectors
US6027898A (en) 1997-08-18 2000-02-22 Transgenomic, Inc. Chromatographic method for mutation detection using mutation site specifically acting enzymes and chemicals
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6136568A (en) 1997-09-15 2000-10-24 Hiatt; Andrew C. De novo polynucleotide synthesis using rolling templates
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
ES2340857T3 (es) 1997-09-16 2010-06-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Metodo para la sintesis quimica completa y emsamblaje de genes y genomas.
US5976842A (en) 1997-10-30 1999-11-02 Clontech Laboratories, Inc. Methods and compositions for use in high fidelity polymerase chain reaction
US8182991B1 (en) 1997-11-26 2012-05-22 Third Wave Technologies, Inc. FEN-1 endonucleases, mixtures and cleavage methods
US6408308B1 (en) 1998-01-29 2002-06-18 Incyte Pharmaceuticals, Inc. System and method for generating, analyzing and storing normalized expression datasets from raw expression datasets derived from microarray includes nucleic acid probe sequences
US6287776B1 (en) 1998-02-02 2001-09-11 Signature Bioscience, Inc. Method for detecting and classifying nucleic acid hybridization
US6251588B1 (en) 1998-02-10 2001-06-26 Agilent Technologies, Inc. Method for evaluating oligonucleotide probe sequences
EP2332645A1 (en) 1998-02-11 2011-06-15 The University Of Houston Apparatus for chemical and biochemical reactions using photo-generated reagents
DE69942272D1 (de) 1998-02-23 2010-06-02 Wisconsin Alumni Res Found Deranordnungen
WO1999049079A1 (en) 1998-03-25 1999-09-30 Ulf Landegren Rolling circle replication of padlock probes
US6284497B1 (en) 1998-04-09 2001-09-04 Trustees Of Boston University Nucleic acid arrays and methods of synthesis
US7321828B2 (en) 1998-04-13 2008-01-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. System of components for preparing oligonucleotides
AU762397B2 (en) 1998-04-13 2003-06-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Identification of genetic targets for modulation by oligonucleotides and generation of oligonucleotides for gene modulation
US6376285B1 (en) 1998-05-28 2002-04-23 Texas Instruments Incorporated Annealed porous silicon with epitaxial layer for SOI
US6274725B1 (en) 1998-06-02 2001-08-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Activators for oligonucleotide synthesis
US6130045A (en) 1998-06-11 2000-10-10 Clontech Laboratories, Inc. Thermostable polymerase
US6251595B1 (en) 1998-06-18 2001-06-26 Agilent Technologies, Inc. Methods and devices for carrying out chemical reactions
ATE313548T1 (de) 1998-06-22 2006-01-15 Affymetrix Inc Reagenz und verfahren zu fester phase synthese
US7399844B2 (en) 1998-07-09 2008-07-15 Agilent Technologies, Inc. Method and reagents for analyzing the nucleotide sequence of nucleic acids
US6218118B1 (en) 1998-07-09 2001-04-17 Agilent Technologies, Inc. Method and mixture reagents for analyzing the nucleotide sequence of nucleic acids by mass spectrometry
US6787308B2 (en) 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
US20030022207A1 (en) 1998-10-16 2003-01-30 Solexa, Ltd. Arrayed polynucleotides and their use in genome analysis
US6222030B1 (en) 1998-08-03 2001-04-24 Agilent Technologies, Inc. Solid phase synthesis of oligonucleotides using carbonate protecting groups and alpha-effect nucleophile deprotection
US6991922B2 (en) 1998-08-12 2006-01-31 Proteus S.A. Process for in vitro creation of recombinant polynucleotide sequences by oriented ligation
US6951719B1 (en) 1999-08-11 2005-10-04 Proteus S.A. Process for obtaining recombined nucleotide sequences in vitro, libraries of sequences and sequences thus obtained
US6107038A (en) 1998-08-14 2000-08-22 Agilent Technologies Inc. Method of binding a plurality of chemicals on a substrate by electrophoretic self-assembly
DE19940750A1 (de) 1998-08-28 2000-06-21 Febit Ferrarius Biotech Gmbh Träger für Analytbestimmungsverfahren und Verfahren zur Herstellung des Trägers
US6258454B1 (en) 1998-09-01 2001-07-10 Agilent Technologies Inc. Functionalization of substrate surfaces with silane mixtures
US6461812B2 (en) 1998-09-09 2002-10-08 Agilent Technologies, Inc. Method and multiple reservoir apparatus for fabrication of biomolecular arrays
US6458583B1 (en) 1998-09-09 2002-10-01 Agilent Technologies, Inc. Method and apparatus for making nucleic acid arrays
WO2000015779A2 (en) 1998-09-15 2000-03-23 Yale University Molecular cloning using rolling circle amplification
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
US6399516B1 (en) 1998-10-30 2002-06-04 Massachusetts Institute Of Technology Plasma etch techniques for fabricating silicon structures from a substrate
US6309828B1 (en) 1998-11-18 2001-10-30 Agilent Technologies, Inc. Method and apparatus for fabricating replicate arrays of nucleic acid molecules
GB9900298D0 (en) 1999-01-07 1999-02-24 Medical Res Council Optical sorting method
WO2000042559A1 (en) 1999-01-18 2000-07-20 Maxygen, Inc. Methods of populating data structures for use in evolutionary simulations
US6376246B1 (en) 1999-02-05 2002-04-23 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US20070065838A1 (en) 1999-01-19 2007-03-22 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
CA2320697C (en) 1999-01-19 2014-11-18 Maxygen, Inc. Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination
US6251685B1 (en) 1999-02-18 2001-06-26 Agilent Technologies, Inc. Readout method for molecular biological electronically addressable arrays
EP1728860B1 (de) 1999-02-19 2010-01-27 febit holding GmbH Verfahren zur Herstellung von Polymeren
ATE469699T1 (de) 1999-02-23 2010-06-15 Caliper Life Sciences Inc Manipulation von mikroteilchen in mikrofluiden systemen
US20030186226A1 (en) 1999-03-08 2003-10-02 Brennan Thomas M. Methods and compositions for economically synthesizing and assembling long DNA sequences
US6824866B1 (en) 1999-04-08 2004-11-30 Affymetrix, Inc. Porous silica substrates for polymer synthesis and assays
US6284465B1 (en) 1999-04-15 2001-09-04 Agilent Technologies, Inc. Apparatus, systems and method for locating nucleic acids bound to surfaces
US6469156B1 (en) 1999-04-20 2002-10-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Rapid and sensitive method for detecting histoplasma capsulatum
US6221653B1 (en) 1999-04-27 2001-04-24 Agilent Technologies, Inc. Method of performing array-based hybridization assays using thermal inkjet deposition of sample fluids
US6773676B2 (en) 1999-04-27 2004-08-10 Agilent Technologies, Inc. Devices for performing array hybridization assays and methods of using the same
US6518056B2 (en) 1999-04-27 2003-02-11 Agilent Technologies Inc. Apparatus, systems and method for assaying biological materials using an annular format
US6300137B1 (en) 1999-04-28 2001-10-09 Agilent Technologies Inc. Method for synthesizing a specific, surface-bound polymer uniformly over an element of a molecular array
US6323043B1 (en) 1999-04-30 2001-11-27 Agilent Technologies, Inc. Fabricating biopolymer arrays
US6242266B1 (en) 1999-04-30 2001-06-05 Agilent Technologies Inc. Preparation of biopolymer arrays
US7276336B1 (en) 1999-07-22 2007-10-02 Agilent Technologies, Inc. Methods of fabricating an addressable array of biopolymer probes
CA2368679C (en) 1999-05-01 2010-11-09 Qinetiq Limited Derivatized porous silicon
CA2395874C (en) 1999-05-06 2011-09-20 Frank Carter Bancroft Dna-based steganography
US7056661B2 (en) 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
US6593464B1 (en) 1999-05-24 2003-07-15 Invitrogen Corporation Method for deblocking of labeled oligonucleotides
US6472147B1 (en) 1999-05-25 2002-10-29 The Scripps Research Institute Methods for display of heterodimeric proteins on filamentous phage using pVII and pIX, compositions, vectors and combinatorial libraries
US6132997A (en) 1999-05-28 2000-10-17 Agilent Technologies Method for linear mRNA amplification
US6815218B1 (en) 1999-06-09 2004-11-09 Massachusetts Institute Of Technology Methods for manufacturing bioelectronic devices
WO2000079009A2 (en) 1999-06-22 2000-12-28 Invitrogen Corporation Improved primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
DE19928410C2 (de) 1999-06-22 2002-11-28 Agilent Technologies Inc Gerätegehäuse mit einer Einrichtung zum Betrieb eines Labor-Mikrochips
US6709852B1 (en) 1999-06-22 2004-03-23 Invitrogen Corporation Rapid growing microorganisms for biotechnology applications
US6399394B1 (en) 1999-06-30 2002-06-04 Agilent Technologies, Inc. Testing multiple fluid samples with multiple biopolymer arrays
US6465183B2 (en) 1999-07-01 2002-10-15 Agilent Technologies, Inc. Multidentate arrays
US7504213B2 (en) 1999-07-09 2009-03-17 Agilent Technologies, Inc. Methods and apparatus for preparing arrays comprising features having degenerate biopolymers
US6461816B1 (en) 1999-07-09 2002-10-08 Agilent Technologies, Inc. Methods for controlling cross-hybridization in analysis of nucleic acid sequences
US6346423B1 (en) 1999-07-16 2002-02-12 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for producing biopolymeric arrays
US6306599B1 (en) 1999-07-16 2001-10-23 Agilent Technologies Inc. Biopolymer arrays and their fabrication
US6180351B1 (en) 1999-07-22 2001-01-30 Agilent Technologies Inc. Chemical array fabrication with identifier
US6201112B1 (en) 1999-07-22 2001-03-13 Agilent Technologies Inc. Method for 3′ end-labeling ribonucleic acids
EP1218545B1 (en) 1999-08-18 2012-01-25 Illumina, Inc. Methods for preparing oligonucleotide solutions
US6262490B1 (en) 1999-11-05 2001-07-17 Advanced Semiconductor Engineering, Inc. Substrate strip for use in packaging semiconductor chips
US6743585B2 (en) 1999-09-16 2004-06-01 Agilent Technologies, Inc. Methods for preparing conjugates
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7211390B2 (en) 1999-09-16 2007-05-01 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US6319674B1 (en) 1999-09-16 2001-11-20 Agilent Technologies, Inc. Methods for attaching substances to surfaces
US7078167B2 (en) 1999-09-17 2006-07-18 Agilent Technologies, Inc. Arrays having background features and methods for using the same
US7122303B2 (en) 1999-09-17 2006-10-17 Agilent Technologies, Inc. Arrays comprising background features that provide for a measure of a non-specific binding and methods for using the same
EP1218543A2 (en) 1999-09-29 2002-07-03 Solexa Ltd. Polynucleotide sequencing
DE19947495C2 (de) 1999-10-01 2003-05-28 Agilent Technologies Inc Mikrofluidischer Mikrochip
WO2001027327A2 (en) 1999-10-08 2001-04-19 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for performing large numbers of reactions using array assembly
US6232072B1 (en) 1999-10-15 2001-05-15 Agilent Technologies, Inc. Biopolymer array inspection
US6451998B1 (en) 1999-10-18 2002-09-17 Agilent Technologies, Inc. Capping and de-capping during oligonucleotide synthesis
US6171797B1 (en) 1999-10-20 2001-01-09 Agilent Technologies Inc. Methods of making polymeric arrays
US6387636B1 (en) 1999-10-22 2002-05-14 Agilent Technologies, Inc. Method of shielding biosynthesis reactions from the ambient environment on an array
US7115423B1 (en) 1999-10-22 2006-10-03 Agilent Technologies, Inc. Fluidic structures within an array package
US6077674A (en) 1999-10-27 2000-06-20 Agilent Technologies Inc. Method of producing oligonucleotide arrays with features of high purity
US6689319B1 (en) 1999-10-29 2004-02-10 Agilent Technologies, Ind. Apparatus for deposition and inspection of chemical and biological fluids
US8268605B2 (en) 1999-10-29 2012-09-18 Agilent Technologies, Inc. Compositions and methods utilizing DNA polymerases
US6406849B1 (en) 1999-10-29 2002-06-18 Agilent Technologies, Inc. Interrogating multi-featured arrays
US20010055761A1 (en) 1999-10-29 2001-12-27 Agilent Technologies Small scale dna synthesis using polymeric solid support with functionalized regions
US6329210B1 (en) 1999-10-29 2001-12-11 Agilent Technologies, Inc. Method and apparatus for high volume polymer synthesis
US6428957B1 (en) 1999-11-08 2002-08-06 Agilent Technologies, Inc. Systems tools and methods of assaying biological materials using spatially-addressable arrays
US6440669B1 (en) 1999-11-10 2002-08-27 Agilent Technologies, Inc. Methods for applying small volumes of reagents
US7041445B2 (en) 1999-11-15 2006-05-09 Clontech Laboratories, Inc. Long oligonucleotide arrays
US6446642B1 (en) 1999-11-22 2002-09-10 Agilent Technologies, Inc. Method and apparatus to clean an inkjet reagent deposition device
US6582938B1 (en) 2001-05-11 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Amplification of nucleic acids
US6800439B1 (en) 2000-01-06 2004-10-05 Affymetrix, Inc. Methods for improved array preparation
AU2788101A (en) 2000-01-11 2001-07-24 Maxygen, Inc. Integrated systems and methods for diversity generation and screening
EP1118661A1 (en) 2000-01-13 2001-07-25 Het Nederlands Kanker Instituut T cell receptor libraries
AU2001237965A1 (en) 2000-01-25 2001-08-07 Affymetrix, Inc. Method, system and computer software for providing a genomic web portal
US6587579B1 (en) 2000-01-26 2003-07-01 Agilent Technologies Inc. Feature quality in array fabrication
US6406851B1 (en) 2000-01-28 2002-06-18 Agilent Technologies, Inc. Method for coating a substrate quickly and uniformly with a small volume of fluid
US6458526B1 (en) 2000-01-28 2002-10-01 Agilent Technologies, Inc. Method and apparatus to inhibit bubble formation in a fluid
US7198939B2 (en) 2000-01-28 2007-04-03 Agilent Technologies, Inc. Apparatus for interrogating an addressable array
US6235483B1 (en) 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
GB0002389D0 (en) 2000-02-02 2000-03-22 Solexa Ltd Molecular arrays
US6403314B1 (en) 2000-02-04 2002-06-11 Agilent Technologies, Inc. Computational method and system for predicting fragmented hybridization and for identifying potential cross-hybridization
US6833450B1 (en) 2000-03-17 2004-12-21 Affymetrix, Inc. Phosphite ester oxidation in nucleic acid array preparation
US6365355B1 (en) 2000-03-28 2002-04-02 The Regents Of The University Of California Chimeric proteins for detection and quantitation of DNA mutations, DNA sequence variations, DNA damage and DNA mismatches
US20020025561A1 (en) 2000-04-17 2002-02-28 Hodgson Clague Pitman Vectors for gene-self-assembly
US7776021B2 (en) 2000-04-28 2010-08-17 The Charles Stark Draper Laboratory Micromachined bilayer unit for filtration of small molecules
US7163660B2 (en) 2000-05-31 2007-01-16 Infineon Technologies Ag Arrangement for taking up liquid analytes
US6716634B1 (en) 2000-05-31 2004-04-06 Agilent Technologies, Inc. Increasing ionization efficiency in mass spectrometry
JP2004509609A (ja) 2000-06-02 2004-04-02 ブルー　ヘロン　バイオテクノロジー　インコーポレイテッド 合成二本鎖オリゴヌクレオチドの配列忠実度を改善するための方法
US7312043B2 (en) 2000-07-10 2007-12-25 Vertex Pharmaceuticals (San Diego) Llc Ion channel assay methods
WO2002010443A1 (en) 2000-07-27 2002-02-07 The Australian National University Combinatorial probes and uses therefor
US7135565B2 (en) 2000-07-28 2006-11-14 Agilent Technologies, Inc. Synthesis of polynucleotides using combined oxidation/deprotection chemistry
US6613893B1 (en) 2000-07-31 2003-09-02 Agilent Technologies Inc. Array fabrication
EP1180548B1 (en) 2000-07-31 2005-11-02 Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) Array based methods for synthesizing nucleic acid mixtures
US6890760B1 (en) 2000-07-31 2005-05-10 Agilent Technologies, Inc. Array fabrication
US7205400B2 (en) 2000-07-31 2007-04-17 Agilent Technologies, Inc. Array fabrication
US6599693B1 (en) 2000-07-31 2003-07-29 Agilent Technologies Inc. Array fabrication
GB0018876D0 (en) 2000-08-01 2000-09-20 Applied Research Systems Method of producing polypeptides
WO2002016583A2 (en) 2000-08-24 2002-02-28 Maxygen, Inc. Constructs and their use in metabolic pathway engineering
JP2004507565A (ja) 2000-09-08 2004-03-11 ユニバーシティー・テクノロジーズ・インターナショナル・インコーポレイテッド オリゴヌクレオチド合成用のリンカーホスホルアミダイト
US6966945B1 (en) 2000-09-20 2005-11-22 Goodrich Corporation Inorganic matrix compositions, composites and process of making the same
WO2002027029A2 (en) 2000-09-27 2002-04-04 Lynx Therapeutics, Inc. Method for determining relative abundance of nucleic acid sequences
NO20004869D0 (no) 2000-09-28 2000-09-28 Torbjoern Rognes Metode for hurtig optimal lokal sekvensjustering ved bruk av parallell prosessering
US7097809B2 (en) 2000-10-03 2006-08-29 California Institute Of Technology Combinatorial synthesis system
JP4361271B2 (ja) 2000-10-10 2009-11-11 バイオトローブ・インコーポレイテツド アッセイ、合成、および保存用の器具、ならびに、その作製、使用、および操作の方法
US6693187B1 (en) 2000-10-17 2004-02-17 Lievre Cornu Llc Phosphinoamidite carboxlates and analogs thereof in the synthesis of oligonucleotides having reduced internucleotide charge
DE10051396A1 (de) 2000-10-17 2002-04-18 Febit Ferrarius Biotech Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur integrierten Synthese und Analytbestimmung an einem Träger
WO2002033669A1 (en) 2000-10-18 2002-04-25 Ultra Proizvodnja Elektronskih Naprav D.O.O. System for payment data exchange and payment terminal device used therein
DE60125312T2 (de) 2000-10-26 2007-06-06 Agilent Technologies, Inc. (n.d. Ges. d. Staates Delaware), Santa Clara Mikroarray
US6905816B2 (en) 2000-11-27 2005-06-14 Intelligent Medical Devices, Inc. Clinically intelligent diagnostic devices and methods
US20020155439A1 (en) 2000-12-04 2002-10-24 Ana Rodriguez Method for generating a library of mutant oligonucleotides using the linear cyclic amplification reaction
US20040253242A1 (en) 2000-12-05 2004-12-16 Bowdish Katherine S. Rationally designed antibodies
US6768005B2 (en) 2000-12-20 2004-07-27 Avecia Limited Process
AU2002220870A1 (en) 2000-12-05 2002-06-18 Avecia Limited Process for the preparation of phosphorothionate oligonucleotides
DE10060433B4 (de) 2000-12-05 2006-05-11 Hahn-Schickard-Gesellschaft für angewandte Forschung e.V. Verfahren zur Herstellung eines Fluidbauelements, Fluidbauelement und Analysevorrichtung
US6660475B2 (en) 2000-12-15 2003-12-09 New England Biolabs, Inc. Use of site-specific nicking endonucleases to create single-stranded regions and applications thereof
AUPR259301A0 (en) 2001-01-18 2001-02-15 Polymerat Pty Ltd Polymers having co-continuous architecture
JP2004533228A (ja) 2001-01-19 2004-11-04 エジー バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコンピューターに従うアセンブリ
US6958217B2 (en) 2001-01-24 2005-10-25 Genomic Expression Aps Single-stranded polynucleotide tags
US7166258B2 (en) 2001-01-31 2007-01-23 Agilent Technologies, Inc. Automation-optimized microarray package
US6879915B2 (en) 2001-01-31 2005-04-12 Agilent Technologies, Inc. Chemical array fabrication and use
US7027930B2 (en) 2001-01-31 2006-04-11 Agilent Technologies, Inc. Reading chemical arrays
US20020164824A1 (en) 2001-02-16 2002-11-07 Jianming Xiao Method and apparatus based on bundled capillaries for high throughput screening
US6660338B1 (en) 2001-03-08 2003-12-09 Agilent Technologies, Inc. Functionalization of substrate surfaces with silane mixtures
DE60207995T2 (de) 2001-03-08 2006-08-03 Applera Corp., Foster City Verfahren zum entschützen von oligonukleotiden
US7211654B2 (en) 2001-03-14 2007-05-01 Regents Of The University Of Michigan Linkers and co-coupling agents for optimization of oligonucleotide synthesis and purification on solid supports
WO2002074988A2 (en) 2001-03-16 2002-09-26 The Chancellor, Master And Scholars Of The University Of Oxford Arrays and methods of use
US6610978B2 (en) 2001-03-27 2003-08-26 Agilent Technologies, Inc. Integrated sample preparation, separation and introduction microdevice for inductively coupled plasma mass spectrometry
US7179659B2 (en) 2001-04-02 2007-02-20 Agilent Technologies, Inc. Sensor surfaces for detecting analytes and methods of use
US20030022240A1 (en) 2001-04-17 2003-01-30 Peizhi Luo Generation and affinity maturation of antibody library in silico
US6943036B2 (en) 2001-04-30 2005-09-13 Agilent Technologies, Inc. Error detection in chemical array fabrication
CA2446417A1 (en) 2001-05-03 2002-11-14 Sigma Genosys, L.P. Methods for assembling protein microarrays
EP1392868B2 (en) 2001-05-18 2013-09-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for the synthesis of dna sequences using photo-labile linkers
US20040175710A1 (en) 2001-05-22 2004-09-09 Haushalter Robert C. Method for in situ, on-chip chemical synthesis
US6880576B2 (en) 2001-06-07 2005-04-19 Nanostream, Inc. Microfluidic devices for methods development
US6613523B2 (en) 2001-06-29 2003-09-02 Agilent Technologies, Inc. Method of DNA sequencing using cleavable tags
US6649348B2 (en) 2001-06-29 2003-11-18 Agilent Technologies Inc. Methods for manufacturing arrays
US20040161741A1 (en) 2001-06-30 2004-08-19 Elazar Rabani Novel compositions and processes for analyte detection, quantification and amplification
US6989267B2 (en) 2001-07-02 2006-01-24 Agilent Technologies, Inc. Methods of making microarrays with substrate surfaces having covalently bound polyelectrolyte films
US6753145B2 (en) 2001-07-05 2004-06-22 Agilent Technologies, Inc. Buffer composition and method for hybridization of microarrays on adsorbed polymer siliceous surfaces
US7205399B1 (en) 2001-07-06 2007-04-17 Sirna Therapeutics, Inc. Methods and reagents for oligonucleotide synthesis
US7314599B2 (en) 2001-07-17 2008-01-01 Agilent Technologies, Inc. Paek embossing and adhesion for microfluidic devices
US6702256B2 (en) 2001-07-17 2004-03-09 Agilent Technologies, Inc. Flow-switching microdevice
US7128876B2 (en) 2001-07-17 2006-10-31 Agilent Technologies, Inc. Microdevice and method for component separation in a fluid
US20030108903A1 (en) 2001-07-19 2003-06-12 Liman Wang Multiple word DNA computing on surfaces
WO2003025118A2 (en) 2001-07-26 2003-03-27 Stratagene Multi-site mutagenesis
US20030130827A1 (en) 2001-08-10 2003-07-10 Joerg Bentzien Protein design automation for protein libraries
US6682702B2 (en) 2001-08-24 2004-01-27 Agilent Technologies, Inc. Apparatus and method for simultaneously conducting multiple chemical reactions
US7371580B2 (en) 2001-08-24 2008-05-13 Agilent Technologies, Inc. Use of unstructured nucleic acids in assaying nucleic acid molecules
JP2003101204A (ja) 2001-09-25 2003-04-04 Nec Kansai Ltd 配線基板及び配線基板の製造方法並びに電子部品
US20030082618A1 (en) 2001-10-15 2003-05-01 Guangshan Li Methods for detecting genetic aberrations
US20050124022A1 (en) 2001-10-30 2005-06-09 Maithreyan Srinivasan Novel sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase
US6902921B2 (en) 2001-10-30 2005-06-07 454 Corporation Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase
US7524950B2 (en) 2001-10-31 2009-04-28 Agilent Technologies, Inc. Uses of cationic salts for polynucleotide synthesis
US6858720B2 (en) 2001-10-31 2005-02-22 Agilent Technologies, Inc. Method of synthesizing polynucleotides using ionic liquids
US6852850B2 (en) 2001-10-31 2005-02-08 Agilent Technologies, Inc. Use of ionic liquids for fabrication of polynucleotide arrays
WO2003040410A1 (en) 2001-11-02 2003-05-15 Nimblegen Systems, Inc. Detection of hybridization oligonucleotide microarray through covalently labeling microarray probe
AU2002360361A1 (en) 2001-11-09 2003-06-10 Biomicroarrays, Inc. High surface area substrates for microarrays and methods to make same
US7482118B2 (en) 2001-11-15 2009-01-27 Third Wave Technologies, Inc. Endonuclease-substrate complexes
EP1314783B1 (de) 2001-11-22 2008-11-19 Sloning BioTechnology GmbH Nukleinsäure-Linker und deren Verwendung in der Gensynthese
US20030099952A1 (en) 2001-11-26 2003-05-29 Roland Green Microarrays with visible pattern detection
WO2003048395A1 (en) 2001-12-03 2003-06-12 Zymogenetics, Inc. Methods for the selection and cloning of nucleic acid molecules free of unwanted nucleotide sequence alterations
US6927029B2 (en) 2001-12-03 2005-08-09 Agilent Technologies, Inc. Surface with tethered polymeric species for binding biomolecules
WO2003054232A2 (en) 2001-12-13 2003-07-03 Blue Heron Biotechnology, Inc. Methods for removal of double-stranded oligonucleotides containing sequence errors using mismatch recognition proteins
US6838888B2 (en) 2001-12-13 2005-01-04 Agilent Technologies, Inc. Flow cell humidity sensor system
US7932070B2 (en) 2001-12-21 2011-04-26 Agilent Technologies, Inc. High fidelity DNA polymerase compositions and uses therefor
US6790620B2 (en) 2001-12-24 2004-09-14 Agilent Technologies, Inc. Small volume chambers
US7282183B2 (en) 2001-12-24 2007-10-16 Agilent Technologies, Inc. Atmospheric control in reaction chambers
US6846454B2 (en) 2001-12-24 2005-01-25 Agilent Technologies, Inc. Fluid exit in reaction chambers
US7025324B1 (en) 2002-01-04 2006-04-11 Massachusetts Institute Of Technology Gating apparatus and method of manufacture
WO2003057924A1 (en) 2002-01-04 2003-07-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Proofreading, error deletion, and ligation method for synthesis of high-fidelity polynucleotide sequences
CA2473434A1 (en) 2002-01-14 2003-07-24 Diversa Corporation Methods for making polynucleotides and purifying double-stranded polynucleotides
US20040009498A1 (en) 2002-01-14 2004-01-15 Diversa Corporation Chimeric antigen binding molecules and methods for making and using them
US6673552B2 (en) 2002-01-14 2004-01-06 Diversa Corporation Methods for purifying annealed double-stranded oligonucleotides lacking base pair mismatches or nucleotide gaps
US7141368B2 (en) 2002-01-30 2006-11-28 Agilent Technologies, Inc. Multi-directional deposition in array fabrication
US7157229B2 (en) 2002-01-31 2007-01-02 Nimblegen Systems, Inc. Prepatterned substrate for optical synthesis of DNA probes
US20040126757A1 (en) 2002-01-31 2004-07-01 Francesco Cerrina Method and apparatus for synthesis of arrays of DNA probes
US7037659B2 (en) 2002-01-31 2006-05-02 Nimblegen Systems Inc. Apparatus for constructing DNA probes having a prismatic and kaleidoscopic light homogenizer
US7422851B2 (en) 2002-01-31 2008-09-09 Nimblegen Systems, Inc. Correction for illumination non-uniformity during the synthesis of arrays of oligomers
US7083975B2 (en) 2002-02-01 2006-08-01 Roland Green Microarray synthesis instrument and method
US20030148291A1 (en) 2002-02-05 2003-08-07 Karla Robotti Method of immobilizing biologically active molecules for assay purposes in a microfluidic format
US6728129B2 (en) 2002-02-19 2004-04-27 The Regents Of The University Of California Multistate triple-decker dyads in three distinct architectures for information storage applications
US6958119B2 (en) 2002-02-26 2005-10-25 Agilent Technologies, Inc. Mobile phase gradient generation microfluidic device
US6914229B2 (en) 2002-02-28 2005-07-05 Agilent Technologies, Inc. Signal offset for prevention of data clipping in a molecular array scanner
US6770892B2 (en) 2002-02-28 2004-08-03 Agilent Technologies, Inc. Method and system for automated focus-distance determination for molecular array scanners
US6929951B2 (en) 2002-02-28 2005-08-16 Agilent Technologies, Inc. Method and system for molecular array scanner calibration
US20050084907A1 (en) 2002-03-01 2005-04-21 Maxygen, Inc. Methods, systems, and software for identifying functional biomolecules
US6919181B2 (en) 2002-03-25 2005-07-19 Agilent Technologies, Inc. Methods for generating ligand arrays
JP2005521419A (ja) 2002-04-01 2005-07-21 ブルー ヘロン バイオテクノロジー インコーポレイテッド ポリヌクレオチド作製のための固相方法
EP1350853A1 (en) 2002-04-05 2003-10-08 ID-Lelystad, Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid B.V. Detection of polymorphisms
US6773888B2 (en) 2002-04-08 2004-08-10 Affymetrix, Inc. Photoactivatable silane compounds and methods for their synthesis and use
EP1501947B1 (en) 2002-04-22 2008-07-16 Genencor International, Inc. Method of creating a library of bacterial clones with varying levels of gene expression
GB0209539D0 (en) 2002-04-26 2002-06-05 Avecia Ltd Monomer Polymer and process
US7125523B2 (en) 2002-04-29 2006-10-24 Agilent Technologies, Inc. Holders for arrays
US6946285B2 (en) 2002-04-29 2005-09-20 Agilent Technologies, Inc. Arrays with elongated features
US6621076B1 (en) 2002-04-30 2003-09-16 Agilent Technologies, Inc. Flexible assembly for transporting sample fluids into a mass spectrometer
US7094537B2 (en) 2002-04-30 2006-08-22 Agilent Technologies, Inc. Micro arrays with structured and unstructured probes
WO2003093504A1 (de) 2002-05-06 2003-11-13 Noxxon Pharma Ag Verfahren zur amplifikation von nukleinsäuren
US20030211478A1 (en) 2002-05-08 2003-11-13 Gentel Corporation Transcription factor profiling on a solid surface
US7221785B2 (en) 2002-05-21 2007-05-22 Agilent Technologies, Inc. Method and system for measuring a molecular array background signal from a continuous background region of specified size
EP1546378B1 (en) 2002-05-24 2011-06-22 Roche NimbleGen, Inc. Microarrays and method for running hybridization reaction for multiple samples on a single microarray
US7273730B2 (en) 2002-05-24 2007-09-25 Invitrogen Corporation Nested PCR employing degradable primers
US6789965B2 (en) 2002-05-31 2004-09-14 Agilent Technologies, Inc. Dot printer with off-axis loading
US7537936B2 (en) 2002-05-31 2009-05-26 Agilent Technologies, Inc. Method of testing multiple fluid samples with multiple biopolymer arrays
US7078505B2 (en) 2002-06-06 2006-07-18 Agilent Technologies, Inc. Manufacture of arrays with varying deposition parameters
US6939673B2 (en) 2002-06-14 2005-09-06 Agilent Technologies, Inc. Manufacture of arrays with reduced error impact
US7371348B2 (en) 2002-06-14 2008-05-13 Agilent Technologies Multiple array format
US7919308B2 (en) 2002-06-14 2011-04-05 Agilent Technologies, Inc. Form in place gaskets for assays
US7351379B2 (en) 2002-06-14 2008-04-01 Agilent Technologies, Inc. Fluid containment structure
US20070275411A1 (en) 2006-05-25 2007-11-29 Mcgall Glenn H Silane mixtures
US7220573B2 (en) 2002-06-21 2007-05-22 Agilent Technologies, Inc. Array assay devices and methods of using the same
US6713262B2 (en) 2002-06-25 2004-03-30 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for high throughput identification of protein/nucleic acid binding pairs
US7894998B2 (en) 2002-06-26 2011-02-22 Agilent Technologies, Inc. Method for identifying suitable nucleic acid probe sequences for use in nucleic acid arrays
US7202358B2 (en) 2002-07-25 2007-04-10 Agilent Technologies, Inc. Methods for producing ligand arrays
US7452712B2 (en) 2002-07-30 2008-11-18 Applied Biosystems Inc. Sample block apparatus and method of maintaining a microcard on a sample block
US6835938B2 (en) 2002-07-31 2004-12-28 Agilent Technologies, Inc. Biopolymer array substrate thickness dependent automated focus-distance determination method for biopolymer array scanners
US7101508B2 (en) 2002-07-31 2006-09-05 Agilent Technologies, Inc. Chemical array fabrication errors
US7153689B2 (en) 2002-08-01 2006-12-26 Agilent Technologies, Inc. Apparatus and methods for cleaning and priming droplet dispensing devices
US8946387B2 (en) 2002-08-14 2015-02-03 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
US7205128B2 (en) 2002-08-16 2007-04-17 Agilent Technologies, Inc. Method for synthesis of the second strand of cDNA
US7563600B2 (en) 2002-09-12 2009-07-21 Combimatrix Corporation Microarray synthesis and assembly of gene-length polynucleotides
JP2006517090A (ja) 2002-09-26 2006-07-20 コーサン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 合成遺伝子
US7498176B2 (en) 2002-09-27 2009-03-03 Roche Nimblegen, Inc. Microarray with hydrophobic barriers
CA2500936C (en) 2002-09-30 2012-10-30 Nimblegen Systems, Inc. Parallel loading of arrays
JP2006500954A (ja) 2002-10-01 2006-01-12 ニンブルゲン システムズ インコーポレイテッド 単一のアレイ特徴部に複数のオリゴヌクレオチドを有するマイクロアレイ
US7129075B2 (en) 2002-10-18 2006-10-31 Transgenomic, Inc. Isolated CEL II endonuclease
US8283148B2 (en) 2002-10-25 2012-10-09 Agilent Technologies, Inc. DNA polymerase compositions for quantitative PCR and methods thereof
JP2006503586A (ja) 2002-10-28 2006-02-02 ゼオトロン コーポレイション アレイオリゴマー合成および使用
US7364896B2 (en) 2002-10-31 2008-04-29 Agilent Technologies, Inc. Test strips including flexible array substrates and method of hybridization
US7402279B2 (en) 2002-10-31 2008-07-22 Agilent Technologies, Inc. Device with integrated microfluidic and electronic components
US7390457B2 (en) 2002-10-31 2008-06-24 Agilent Technologies, Inc. Integrated microfluidic array device
US7422911B2 (en) 2002-10-31 2008-09-09 Agilent Technologies, Inc. Composite flexible array substrate having flexible support
US7629120B2 (en) 2002-10-31 2009-12-08 Rice University Method for assembling PCR fragments of DNA
AU2003287449A1 (en) 2002-10-31 2004-05-25 Nanostream, Inc. Parallel detection chromatography systems
US20040086892A1 (en) 2002-11-06 2004-05-06 Crothers Donald M. Universal tag assay
US7029854B2 (en) 2002-11-22 2006-04-18 Agilent Technologies, Inc. Methods designing multiple mRNA transcript nucleic acid probe sequences for use in nucleic acid arrays
US7062385B2 (en) 2002-11-25 2006-06-13 Tufts University Intelligent electro-optical nucleic acid-based sensor array and method for detecting volatile compounds in ambient air
EP1578799B8 (en) 2002-12-02 2011-03-23 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to tumor necrosis factor and uses thereof
US20040110133A1 (en) 2002-12-06 2004-06-10 Affymetrix, Inc. Functionated photoacid generator for biological microarray synthesis
US7879580B2 (en) 2002-12-10 2011-02-01 Massachusetts Institute Of Technology Methods for high fidelity production of long nucleic acid molecules
US7932025B2 (en) 2002-12-10 2011-04-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods for high fidelity production of long nucleic acid molecules with error control
US20060076482A1 (en) 2002-12-13 2006-04-13 Hobbs Steven E High throughput systems and methods for parallel sample analysis
US6987263B2 (en) 2002-12-13 2006-01-17 Nanostream, Inc. High throughput systems and methods for parallel sample analysis
US7247337B1 (en) 2002-12-16 2007-07-24 Agilent Technologies, Inc. Method and apparatus for microarray fabrication
US20040191810A1 (en) 2002-12-17 2004-09-30 Affymetrix, Inc. Immersed microarrays in conical wells
GB0229443D0 (en) 2002-12-18 2003-01-22 Avecia Ltd Process
US7960157B2 (en) 2002-12-20 2011-06-14 Agilent Technologies, Inc. DNA polymerase blends and uses thereof
DE10260805A1 (de) 2002-12-23 2004-07-22 Geneart Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Optimieren einer Nucleotidsequenz zur Expression eines Proteins
AU2003288675B2 (en) 2002-12-23 2010-07-22 Medimmune Limited Antibodies against PD-1 and uses therefor
WO2004058391A2 (de) 2002-12-23 2004-07-15 Febit Biotech Gmbh Photoaktivierbare zweistufige schutzgruppen für die synthese von biopolymeren
ES2246748T1 (es) 2002-12-23 2006-03-01 Agilent Technologies, Inc. Ensayos de hibridacion genomica comparativos que utilizan caracteristicas oligonucleotidicas inmovilizadas y composiciones para ponerlos en practica.
US7372982B2 (en) 2003-01-14 2008-05-13 Agilent Technologies, Inc. User interface for molecular array feature analysis
US6809277B2 (en) 2003-01-22 2004-10-26 Agilent Technologies, Inc. Method for registering a deposited material with channel plate channels, and switch produced using same
CA2727850C (en) 2003-01-29 2013-04-30 454 Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
US7202264B2 (en) 2003-01-31 2007-04-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Supports for oligomer synthesis
US8073626B2 (en) 2003-01-31 2011-12-06 Agilent Technologies, Inc. Biopolymer array reading
US6950756B2 (en) 2003-02-05 2005-09-27 Agilent Technologies, Inc. Rearrangement of microarray scan images to form virtual arrays
US7413709B2 (en) 2003-02-12 2008-08-19 Agilent Technologies, Inc. PAEK-based microfluidic device with integrated electrospray emitter
GB2398383B (en) 2003-02-12 2005-03-09 Global Genomics Ab Method and means for nucleic acid sequencing
US7244513B2 (en) 2003-02-21 2007-07-17 Nano-Proprietary, Inc. Stain-etched silicon powder
US7070932B2 (en) 2003-02-25 2006-07-04 Agilent Technologies, Inc. Methods and devices for detecting printhead misalignment of an in situ polymeric array synthesis device
US7252938B2 (en) 2003-02-25 2007-08-07 Agilent Technologies, Inc. Methods and devices for producing a polymer at a location of a substrate
US6977223B2 (en) 2003-03-07 2005-12-20 Massachusetts Institute Of Technology Three dimensional microfabrication
JP2004268394A (ja) 2003-03-07 2004-09-30 Canon Inc インクジェット記録装置及びその制御方法
US20050053968A1 (en) 2003-03-31 2005-03-10 Council Of Scientific And Industrial Research Method for storing information in DNA
EP1613776A1 (en) 2003-04-02 2006-01-11 Blue Heron Biotechnology, Inc. Error reduction in automated gene synthesis
US7534561B2 (en) 2003-04-02 2009-05-19 Agilent Technologies, Inc. Nucleic acid array in situ fabrication methods and arrays produced using the same
US7206439B2 (en) 2003-04-30 2007-04-17 Agilent Technologies, Inc. Feature locations in array reading
US7269518B2 (en) 2003-04-30 2007-09-11 Agilent Technologies, Inc. Chemical array reading
US20040219663A1 (en) 2003-04-30 2004-11-04 Page Robert D. Biopolymer array fabrication using different drop deposition heads
US6916113B2 (en) 2003-05-16 2005-07-12 Agilent Technologies, Inc. Devices and methods for fluid mixing
WO2004103563A2 (en) 2003-05-20 2004-12-02 Fluidigm Corporation Method and system for microfluidic device and imaging thereof
NZ544952A (en) 2003-05-30 2009-12-24 Univ Illinois Gene expression profiles that identify genetically elite ungulate mammals
WO2004108081A2 (en) 2003-06-02 2004-12-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide synthesis with alternative solvents
US8133670B2 (en) 2003-06-13 2012-03-13 Cold Spring Harbor Laboratory Method for making populations of defined nucleic acid molecules
US6938476B2 (en) 2003-06-25 2005-09-06 Agilent Technologies, Inc. Apparatus and methods for sensing fluid levels
US7534563B2 (en) 2003-06-30 2009-05-19 Agilent Technologies, Inc. Methods for producing ligand arrays
US20050016851A1 (en) 2003-07-24 2005-01-27 Jensen Klavs F. Microchemical method and apparatus for synthesis and coating of colloidal nanoparticles
US6843281B1 (en) 2003-07-30 2005-01-18 Agilent Techinologies, Inc. Methods and apparatus for introducing liquids into microfluidic chambers
US7353116B2 (en) 2003-07-31 2008-04-01 Agilent Technologies, Inc. Chemical array with test dependent signal reading or processing
WO2005014850A2 (en) 2003-08-06 2005-02-17 University Of Massachusetts Systems and methods for analyzing nucleic acid sequences
US7028536B2 (en) 2004-06-29 2006-04-18 Nanostream, Inc. Sealing interface for microfluidic device
US7348144B2 (en) 2003-08-13 2008-03-25 Agilent Technologies, Inc. Methods and system for multi-drug treatment discovery
US7229497B2 (en) 2003-08-26 2007-06-12 Massachusetts Institute Of Technology Method of preparing nanocrystals
US7427679B2 (en) 2003-08-30 2008-09-23 Agilent Technologies, Inc. Precursors for two-step polynucleotide synthesis
US7193077B2 (en) 2003-08-30 2007-03-20 Agilent Technologies, Inc. Exocyclic amine triaryl methyl protecting groups in two-step polynucleotide synthesis
US7417139B2 (en) 2003-08-30 2008-08-26 Agilent Technologies, Inc. Method for polynucleotide synthesis
US7385050B2 (en) 2003-08-30 2008-06-10 Agilent Technologies, Inc. Cleavable linker for polynucleotide synthesis
US7585970B2 (en) 2003-08-30 2009-09-08 Agilent Technologies, Inc. Method of polynucleotide synthesis using modified support
US20050049796A1 (en) 2003-09-03 2005-03-03 Webb Peter G. Methods for encoding non-biological information on microarrays
EP1664343B1 (en) 2003-09-09 2014-05-07 Integrigen, Inc. Methods and compositions for generation of germline human antibody genes
EP1687445A4 (en) 2003-09-23 2007-03-28 Atom Sciences Inc POLYMERIC NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION SUBSTANCES
US7488607B2 (en) 2003-09-30 2009-02-10 Agilent Technologies, Inc. Electronically readable microarray with electronic addressing function
US7147362B2 (en) 2003-10-15 2006-12-12 Agilent Technologies, Inc. Method of mixing by intermittent centrifugal force
US7075161B2 (en) 2003-10-23 2006-07-11 Agilent Technologies, Inc. Apparatus and method for making a low capacitance artificial nanopore
US20050277125A1 (en) 2003-10-27 2005-12-15 Massachusetts Institute Of Technology High-density reaction chambers and methods of use
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
US7276338B2 (en) 2003-11-17 2007-10-02 Jacobson Joseph M Nucleotide sequencing via repetitive single molecule hybridization
DE10353887A1 (de) 2003-11-18 2005-06-16 Febit Ag Hochparalleler DNA-Synthesizer auf Matrizenbasis
US7851192B2 (en) 2004-11-22 2010-12-14 New England Biolabs, Inc. Modified DNA cleavage enzymes and methods for use
US7282705B2 (en) 2003-12-19 2007-10-16 Agilent Technologies, Inc. Microdevice having an annular lining for producing an electrospray emitter
EP3175914A1 (en) 2004-01-07 2017-06-07 Illumina Cambridge Limited Improvements in or relating to molecular arrays
WO2005073410A2 (en) 2004-01-28 2005-08-11 454 Corporation Nucleic acid amplification with continuous flow emulsion
US7084180B2 (en) 2004-01-28 2006-08-01 Velocys, Inc. Fischer-tropsch synthesis using microchannel technology and novel catalyst and microchannel reactor
ATE451478T1 (de) 2004-02-12 2009-12-15 Population Genetics Technologi Genetische analyse mittels sequenzspezifischem sortieren
US7125488B2 (en) 2004-02-12 2006-10-24 Varian, Inc. Polar-modified bonded phase materials for chromatographic separations
CA2558749A1 (en) 2004-02-27 2005-09-29 President And Fellows Of Harvard College Polynucleotide synthesis
US7875463B2 (en) 2004-03-26 2011-01-25 Agilent Technologies, Inc. Generalized pulse jet ejection head control model
WO2005093092A2 (en) 2004-03-26 2005-10-06 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with g-protein coupled receptor 44 (gpr44)
US20050214778A1 (en) 2004-03-29 2005-09-29 Peck Bill J Methods for in situ generation of nucleic acid arrays
US20050214779A1 (en) 2004-03-29 2005-09-29 Peck Bill J Methods for in situ generation of nucleic acid arrays
US8825411B2 (en) 2004-05-04 2014-09-02 Dna Twopointo, Inc. Design, synthesis and assembly of synthetic nucleic acids
CA2565987A1 (en) 2004-05-11 2005-11-24 Wyeth Oligonucleotide arrays to monitor gene expression and methods for making and using same
ES2459367T3 (es) 2004-05-19 2014-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Modelos tridimensionales de enfermedades de células/tejidos perfundidos
US7302348B2 (en) 2004-06-02 2007-11-27 Agilent Technologies, Inc. Method and system for quantifying and removing spatial-intensity trends in microarray data
US20060024711A1 (en) 2004-07-02 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Methods for nucleic acid amplification and sequence determination
ES2372503T3 (es) * 2004-07-06 2012-01-20 Bioren, Inc. Mutagénesis revisada para desarrollar polipéptidos alterados con propiedades potenciadas.
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
US20060012793A1 (en) 2004-07-19 2006-01-19 Helicos Biosciences Corporation Apparatus and methods for analyzing samples
US7276720B2 (en) 2004-07-19 2007-10-02 Helicos Biosciences Corporation Apparatus and methods for analyzing samples
US20060019084A1 (en) 2004-07-23 2006-01-26 Pearson Laurence T Monolithic composition and method
US20060024678A1 (en) 2004-07-28 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Use of single-stranded nucleic acid binding proteins in sequencing
KR101222628B1 (ko) 2004-08-03 2013-01-16 게네아르트 아게 ＣｐＧ 함량을 변화시키는 것에 의해 유전자 발현을조절하는 방법
WO2006073504A2 (en) 2004-08-04 2006-07-13 President And Fellows Of Harvard College Wobble sequencing
WO2006018044A1 (en) 2004-08-18 2006-02-23 Agilent Technologies, Inc. Microfluidic assembly with coupled microfluidic devices
US7034290B2 (en) 2004-09-24 2006-04-25 Agilent Technologies, Inc. Target support with pattern recognition sites
US7943046B2 (en) 2004-10-01 2011-05-17 Agilent Technologies, Inc Methods and systems for on-column protein delipidation
EP1812598A1 (en) 2004-10-18 2007-08-01 Codon Devices, Inc. Methods for assembly of high fidelity synthetic polynucleotides
US20070122817A1 (en) 2005-02-28 2007-05-31 George Church Methods for assembly of high fidelity synthetic polynucleotides
US7141807B2 (en) 2004-10-22 2006-11-28 Agilent Technologies, Inc. Nanowire capillaries for mass spectrometry
US20060110744A1 (en) 2004-11-23 2006-05-25 Sampas Nicolas M Probe design methods and microarrays for comparative genomic hybridization and location analysis
US8380441B2 (en) 2004-11-30 2013-02-19 Agilent Technologies, Inc. Systems for producing chemical array layouts
US11268149B2 (en) 2004-12-08 2022-03-08 Cedars-Sinai Medical Center Diagnosis and treatment of inflammatory bowel disease
US7977119B2 (en) 2004-12-08 2011-07-12 Agilent Technologies, Inc. Chemical arrays and methods of using the same
US7439272B2 (en) 2004-12-20 2008-10-21 Varian, Inc. Ultraporous sol gel monoliths
US20090285825A1 (en) 2004-12-22 2009-11-19 National University Of Singapore Novel snake toxin
US20070099196A1 (en) 2004-12-29 2007-05-03 Sakari Kauppinen Novel oligonucleotide compositions and probe sequences useful for detection and analysis of micrornas and their target mRNAs
JP2008526259A (ja) 2005-01-13 2008-07-24 コドン デバイシズ インコーポレイテッド 蛋白質デザインのための組成物及び方法
US20060171855A1 (en) 2005-02-03 2006-08-03 Hongfeng Yin Devices,systems and methods for multi-dimensional separation
US20090088679A1 (en) 2005-02-07 2009-04-02 Massachusetts Institute Of Technology Electronically-Degradable Layer-by-Layer Thin Films
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
JP4641199B2 (ja) 2005-02-28 2011-03-02 国立感染症研究所長 Ｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計装置、ｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の作製方法、及びｒｎａ干渉ポリヌクレオチド混合物の設計プログラム
US20060203236A1 (en) 2005-03-08 2006-09-14 Zhenghua Ji Sample cell
US20060286569A1 (en) 2005-03-10 2006-12-21 Bar-Or Yuval A Method, apparatus, and system for authentication using labels containing nucleotide sequences
EP1623763A1 (en) 2005-03-11 2006-02-08 Agilent Technologies, Inc. Chip with cleaning cavity
US7618777B2 (en) 2005-03-16 2009-11-17 Agilent Technologies, Inc. Composition and method for array hybridization
US20060219637A1 (en) 2005-03-29 2006-10-05 Killeen Kevin P Devices, systems and methods for liquid chromatography
WO2006116476A1 (en) 2005-04-27 2006-11-02 Sigma-Aldrich Co. Activators for oligonucleotide and phosphoramidite synthesis
US7572907B2 (en) 2005-04-29 2009-08-11 Agilent Technologies, Inc. Methods and compounds for polynucleotide synthesis
ATE474937T1 (de) 2005-04-29 2010-08-15 Synthetic Genomics Inc Amplifikation und klonierung einzelner dna- moleküle mittels rolling-circle-amplifikation
WO2006119770A1 (en) 2005-05-12 2006-11-16 Hempel A/S Method for the establishment of a crack resistant epoxy paint coat and paint compositions suitable for said method
US7396676B2 (en) 2005-05-31 2008-07-08 Agilent Technologies, Inc. Evanescent wave sensor with attached ligand
CA2611743C (en) 2005-06-15 2019-12-31 Callida Genomics, Inc. Nucleic acid analysis by forming and tracking aliquoted fragments of a target polynucleotide
US7919239B2 (en) 2005-07-01 2011-04-05 Agilent Technologies, Inc. Increasing hybridization efficiencies
US7718365B2 (en) 2005-07-09 2010-05-18 Agilent Technologies, Inc. Microarray analysis of RNA
US8076064B2 (en) 2005-07-09 2011-12-13 Agilent Technologies, Inc. Method of treatment of RNA sample
ATE510930T1 (de) 2005-08-02 2011-06-15 Rubicon Genomics Inc Zusammensetzungen und verfahren zur bearbeitung und amplifikation von dna mit verwendung mehrerer enzyme in einer einzigen reaktion
DE102005037351B3 (de) 2005-08-08 2007-01-11 Geneart Ag Verfahren für die kontinuierliche zielgerichtete Evolution von Proteinen in vitro
US7749701B2 (en) 2005-08-11 2010-07-06 Agilent Technologies, Inc. Controlling use of oligonucleotide sequences released from arrays
US9404882B2 (en) 2005-08-11 2016-08-02 New Mexico Tech Research Foundation Method of producing a multi-microchannel, flow-through element and device using same
WO2007032837A2 (en) 2005-08-11 2007-03-22 The J. Craig Venter Institute Method for in vitro recombination
CA2618699C (en) 2005-08-11 2012-10-02 J. Craig Venter Institute, Inc. In vitro recombination method
US7805252B2 (en) 2005-08-16 2010-09-28 Dna Twopointo, Inc. Systems and methods for designing and ordering polynucleotides
WO2007025059A1 (en) 2005-08-26 2007-03-01 Surmodics, Inc. Silane coating compositions, coating systems, and methods
US20070196834A1 (en) 2005-09-09 2007-08-23 Francesco Cerrina Method and system for the generation of large double stranded DNA fragments
CN101277758A (zh) 2005-09-14 2008-10-01 Illumina公司 连续聚合物合成器
US20100233429A1 (en) 2005-09-16 2010-09-16 Yamatake Corporation Substrate for Biochip, Biochip, Method for Manufacturing Substrate for Biochip and Method for Manufacturing Biochip
US20080308884A1 (en) 2005-10-13 2008-12-18 Silex Microsystems Ab Fabrication of Inlet and Outlet Connections for Microfluidic Chips
US7759471B2 (en) 2005-10-31 2010-07-20 Agilent Technologies, Inc. Monomer compositions for the synthesis of RNA, methods of synthesis, and methods of deprotection
US8202985B2 (en) 2005-10-31 2012-06-19 Agilent Technologies, Inc. Monomer compositions for the synthesis of polynucleotides, methods of synthesis, and methods of deprotection
US8552174B2 (en) 2005-10-31 2013-10-08 Agilent Technologies, Inc. Solutions, methods, and processes for deprotection of polynucleotides
US7368550B2 (en) 2005-10-31 2008-05-06 Agilent Technologies, Inc. Phosphorus protecting groups
GB0522310D0 (en) 2005-11-01 2005-12-07 Solexa Ltd Methods of preparing libraries of template polynucleotides
US7291471B2 (en) 2005-11-21 2007-11-06 Agilent Technologies, Inc. Cleavable oligonucleotide arrays
GB0524069D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Solexa Ltd Preparation of templates for solid phase amplification
US8137936B2 (en) 2005-11-29 2012-03-20 Macevicz Stephen C Selected amplification of polynucleotides
JP5198284B2 (ja) 2005-12-22 2013-05-15 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 高処理量配列決定技術を使用する転写産物の特徴づけのための改良された戦略
JP5106416B2 (ja) 2006-01-06 2012-12-26 アジレント・テクノロジーズ・インク 濃縮（ｐａｃｋｅｄ）ＤＮＡポリメラーゼを含む核酸複製のための反応緩衝液組成物
EP3913375A1 (en) 2006-01-11 2021-11-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic devices and methods of use in the formation and control of nanoreactors
WO2007087310A2 (en) 2006-01-23 2007-08-02 Population Genetics Technologies Ltd. Nucleic acid analysis using sequence tokens
US20070207487A1 (en) 2006-01-25 2007-09-06 Emig Christopher J Photoelectrochemical synthesis of high density combinatorial polymer arrays
WO2008057127A2 (en) 2006-02-06 2008-05-15 Massachusetts Institute Of Technology Self-assembly of macromolecules on multilayered polymer surfaces
US8809876B2 (en) 2006-02-14 2014-08-19 Massachusetts Institute Of Technology Absorbing film
US7807356B2 (en) 2006-03-09 2010-10-05 Agilent Technologies, Inc. Labeled nucleotide composition
TW200806317A (en) 2006-03-20 2008-02-01 Wyeth Corp Methods for reducing protein aggregation
US7572908B2 (en) 2006-03-23 2009-08-11 Agilent Technologies, Inc. Cleavable linkers for polynucleotides
US7855281B2 (en) 2006-03-23 2010-12-21 Agilent Technologies, Inc. Cleavable thiocarbonate linkers for polynucleotide synthesis
US20070231800A1 (en) 2006-03-28 2007-10-04 Agilent Technologies, Inc. Determination of methylated DNA
CN101460953B (zh) 2006-03-31 2012-05-30 索雷克萨公司 用于合成分析的序列的系统和装置
US20070238104A1 (en) 2006-04-07 2007-10-11 Agilent Technologies, Inc. Competitive oligonucleotides
AU2007234733A1 (en) 2006-04-07 2007-10-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibody compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US20070238106A1 (en) 2006-04-07 2007-10-11 Agilent Technologies, Inc. Systems and methods of determining alleles and/or copy numbers
US20070238108A1 (en) 2006-04-07 2007-10-11 Agilent Technologies, Inc. Validation of comparative genomic hybridization
US8058055B2 (en) 2006-04-07 2011-11-15 Agilent Technologies, Inc. High resolution chromosomal mapping
JP5654749B2 (ja) 2006-04-11 2015-01-14 ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド 改良された増幅のための核酸の修復
US20090062129A1 (en) 2006-04-19 2009-03-05 Agencourt Personal Genomics, Inc. Reagents, methods, and libraries for gel-free bead-based sequencing
US8383338B2 (en) 2006-04-24 2013-02-26 Roche Nimblegen, Inc. Methods and systems for uniform enrichment of genomic regions
US20070259346A1 (en) 2006-05-03 2007-11-08 Agilent Technologies, Inc. Analysis of arrays
US20070259345A1 (en) 2006-05-03 2007-11-08 Agilent Technologies, Inc. Target determination using compound probes
US20070259347A1 (en) 2006-05-03 2007-11-08 Agilent Technologies, Inc. Methods of increasing the effective probe densities of arrays
US20070259344A1 (en) 2006-05-03 2007-11-08 Agilent Technologies, Inc. Compound probes and methods of increasing the effective probe densities of arrays
US20070281309A1 (en) 2006-05-19 2007-12-06 Massachusetts Institute Of Technology Microfluidic-based Gene Synthesis
US20090087840A1 (en) 2006-05-19 2009-04-02 Codon Devices, Inc. Combined extension and ligation for nucleic acid assembly
WO2008054543A2 (en) 2006-05-20 2008-05-08 Codon Devices, Inc. Oligonucleotides for multiplex nucleic acid assembly
US8962532B2 (en) 2006-06-19 2015-02-24 Yeda Research And Development Co. Ltd. Programmable iterated elongation: a method for manufacturing synthetic genes and combinatorial DNA and protein libraries
AT503861B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von t-zell-rezeptoren
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
US20080193772A1 (en) 2006-07-07 2008-08-14 Bio-Rad Laboratories, Inc Mass spectrometry probes having hydrophobic coatiings
US7572585B2 (en) 2006-07-31 2009-08-11 Agilent Technologies, Inc. Enzymatic labeling of RNA
US9328378B2 (en) 2006-07-31 2016-05-03 Illumina Cambridge Limited Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers
US7524942B2 (en) 2006-07-31 2009-04-28 Agilent Technologies, Inc. Labeled nucleotide composition
PL2056845T3 (pl) 2006-08-08 2018-01-31 Univ Bonn Rheinische Friedrich Wilhelms Struktura i zastosowanie oligonukleotydów z 5'-fosforanem
DE102006039479A1 (de) 2006-08-23 2008-03-06 Febit Biotech Gmbh Programmierbare Oligonukleotidsynthese
US8932994B2 (en) 2006-08-24 2015-01-13 Illumina, Inc. Method for retaining even coverage of short insert libraries
WO2008027558A2 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Codon Devices, Inc. Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits
US8415138B2 (en) 2006-08-31 2013-04-09 Agilent Technologies, Inc. Apparatuses and methods for oligonucleotide preparation
US8097711B2 (en) 2006-09-02 2012-01-17 Agilent Technologies, Inc. Thioether substituted aryl carbonate protecting groups
US20080311628A1 (en) 2006-10-03 2008-12-18 Ghc Technologies, Inc. Methods and compositions for rapid amplification and capture of nucleic acid sequences
EP2078077A2 (en) 2006-10-04 2009-07-15 Codon Devices, Inc Nucleic acid libraries and their design and assembly
US20080085511A1 (en) 2006-10-05 2008-04-10 Peck Bill J Preparation of biopolymer arrays
JP2008097189A (ja) 2006-10-10 2008-04-24 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 塩基配列断片の転写物特異性又は遺伝子特異性を判定する方法
US20080085514A1 (en) 2006-10-10 2008-04-10 Peck Bill J Methods and devices for array synthesis
US7867782B2 (en) 2006-10-19 2011-01-11 Agilent Technologies, Inc. Nanoscale moiety placement methods
US7999087B2 (en) 2006-11-15 2011-08-16 Agilent Technologies, Inc. 2′-silyl containing thiocarbonate protecting groups for RNA synthesis
WO2008063134A1 (en) 2006-11-24 2008-05-29 Agency For Science, Technology And Research Method of producing a pattern of discriminative wettability
WO2008063135A1 (en) 2006-11-24 2008-05-29 Agency For Science, Technology And Research Apparatus for processing a sample in a liquid droplet and method of using the same
US8242258B2 (en) 2006-12-03 2012-08-14 Agilent Technologies, Inc. Protecting groups for RNA synthesis
CA2671581A1 (en) 2006-12-05 2008-06-12 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins
US7989396B2 (en) 2006-12-05 2011-08-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biomolecule immobilization on biosensors
US7862999B2 (en) 2007-01-17 2011-01-04 Affymetrix, Inc. Multiplex targeted amplification using flap nuclease
US8314220B2 (en) 2007-01-26 2012-11-20 Agilent Technologies, Inc. Methods compositions, and kits for detection of microRNA
US20080182296A1 (en) 2007-01-31 2008-07-31 Chanda Pranab K Pcr-directed gene synthesis from large number of overlapping oligodeoxyribonucleotides
KR100827449B1 (ko) 2007-02-07 2008-05-07 삼성전자주식회사 광분해성 화합물과 상기 화합물이 커플링된 올리고머프로브 어레이용 기판, 올리고머 프로브 어레이 및 이의제조 방법
WO2008115632A2 (en) 2007-02-09 2008-09-25 The Regents Of The University Of California Method for recombining dna sequences and compositions related thereto
NZ579010A (en) 2007-02-20 2012-03-30 Anaptysbio Inc Somatic hypermutation systems
US9029085B2 (en) 2007-03-07 2015-05-12 President And Fellows Of Harvard College Assays and other reactions involving droplets
US7651762B2 (en) 2007-03-13 2010-01-26 Varian, Inc. Methods and devices using a shrinkable support for porous monolithic materials
JP5646987B2 (ja) 2007-04-04 2014-12-24 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ナノポアを使用するための組成物、デバイス、システム、及び方法
WO2008141248A2 (en) 2007-05-10 2008-11-20 Agilent Technologies, Inc. Thiocarbon-protecting groups for rna synthesis
US20100286290A1 (en) 2007-06-04 2010-11-11 Jakob Schwalbe Lohmann Enzyme activity assay using rolling circle amplification
US20080318334A1 (en) 2007-06-20 2008-12-25 Robotti Karla M Microfluidic devices comprising fluid flow paths having a monolithic chromatographic material
US20090023190A1 (en) 2007-06-20 2009-01-22 Kai Qin Lao Sequence amplification with loopable primers
US8194244B2 (en) 2007-06-29 2012-06-05 Intel Corporation Solution sample plate with wells designed for improved Raman scattering signal detection efficiency
US7659069B2 (en) 2007-08-31 2010-02-09 Agilent Technologies, Inc. Binary signaling assay using a split-polymerase
US8685642B2 (en) 2007-07-30 2014-04-01 Agilent Technologies, Inc. Allele-specific copy number measurement using single nucleotide polymorphism and DNA arrays
US7979215B2 (en) 2007-07-30 2011-07-12 Agilent Technologies, Inc. Methods and systems for evaluating CGH candidate probe nucleic acid sequences
US20090036664A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Brian Jon Peter Complex oligonucleotide primer mix
EP2190988A4 (en) 2007-08-07 2010-12-22 Agency Science Tech & Res INTEGRATED MICROFLUID DEVICE FOR GENE SYNTHESIS
US9440231B2 (en) 2007-08-14 2016-09-13 Fluidigm Corporation Polymer microfluidic biochip fabrication
WO2009023257A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Massachusetts Institute Of Technology Microstructures for fluidic ballasting and flow control
US20090053704A1 (en) 2007-08-24 2009-02-26 Natalia Novoradovskaya Stabilization of nucleic acids on solid supports
US9598737B2 (en) 2012-05-09 2017-03-21 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Next generation genomic sequencing methods
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
CA2699518A1 (en) 2007-09-17 2009-03-26 Twof, Inc. Supramolecular nanostamping printing device
US7790387B2 (en) 2007-09-24 2010-09-07 Agilent Technologies, Inc. Thiocarbonate linkers for polynucleotides
US8003330B2 (en) 2007-09-28 2011-08-23 Pacific Biosciences Of California, Inc. Error-free amplification of DNA for clonal sequencing
EP2053132A1 (en) 2007-10-23 2009-04-29 Roche Diagnostics GmbH Enrichment and sequence analysis of geomic regions
US8617811B2 (en) 2008-01-28 2013-12-31 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions
WO2009070665A1 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Massachusetts Institute Of Technology Near field detector for integrated surface plasmon resonance biosensor applications
US20100272711A1 (en) 2007-12-12 2010-10-28 Thomas Jefferson University Compositions and methods for the treatment and prevention of cardiovascular diseases
US9286439B2 (en) 2007-12-17 2016-03-15 Yeda Research And Development Co Ltd System and method for editing and manipulating DNA
WO2009089384A1 (en) 2008-01-09 2009-07-16 Life Technologies Method of making a paired tag library for nucleic acid sequencing
US9540637B2 (en) 2008-01-09 2017-01-10 Life Technologies Corporation Nucleic acid adaptors and uses thereof
US7682809B2 (en) 2008-01-11 2010-03-23 Agilent Technologies, Inc. Direct ATP release sequencing
EP2238459B1 (en) 2008-01-23 2019-05-08 Roche Diagnostics GmbH Integrated instrument performing synthesis and amplification
WO2009131724A2 (en) 2008-01-24 2009-10-29 Massachusetts Institute Of Technology Insulated nanogap devices and methods of use thereof
US20090194483A1 (en) 2008-01-31 2009-08-06 Robotti Karla M Microfluidic device having monolithic separation medium and method of use
JP5725540B2 (ja) 2008-02-15 2015-05-27 シンセティック ジェノミクス インコーポレーテッド 核酸分子のインビトロでの連結および組み合わせアセンブリのための方法
WO2009113709A1 (ja) 2008-03-11 2009-09-17 国立大学法人東京大学 粘着末端を有するｄｎａ断片の調製方法
US20090230044A1 (en) 2008-03-13 2009-09-17 Agilent Technologies, Inc. Microfluid Chip Cleaning
US20090238722A1 (en) 2008-03-18 2009-09-24 Agilent Technologies, Inc. Pressure-Reinforced Fluidic Chip
EP2286217B1 (en) 2008-03-31 2015-02-18 Pacific Biosciences of California, Inc. Single molecule loading methods and compositions
US20090246788A1 (en) 2008-04-01 2009-10-01 Roche Nimblegen, Inc. Methods and Assays for Capture of Nucleic Acids
JP2011516547A (ja) 2008-04-09 2011-05-26 コーネル ユニバーシティー コフェロンならびにその作製および使用方法
US8911948B2 (en) 2008-04-30 2014-12-16 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers
EP2113255A1 (en) 2008-05-02 2009-11-04 f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Cytotoxic immunoglobulin
JP4582224B2 (ja) 2008-05-02 2010-11-17 ソニー株式会社 マイクロビーズ作製方法及びマイクロビーズ
EP2636756B2 (en) 2008-05-27 2019-11-20 Dako Denmark A/S Compositions and methods for detection of chromosomal aberrations with novel hybridization buffers
WO2010002822A1 (en) 2008-06-30 2010-01-07 Morphotek, Inc. Anti-gd2 antibodies and methods and uses related thereto
GB2461546B (en) 2008-07-02 2010-07-07 Argen X Bv Antigen binding polypeptides
JP4667490B2 (ja) 2008-07-09 2011-04-13 三菱電機株式会社 加熱調理器
WO2010014903A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 Massachusetts Institute Of Technology Multiplexed olfactory receptor-based microsurface plasmon polariton detector
WO2010021936A1 (en) 2008-08-16 2010-02-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Digital pcr calibration for high throughput sequencing
WO2010021692A1 (en) 2008-08-22 2010-02-25 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration
WO2010025310A2 (en) 2008-08-27 2010-03-04 Westend Asset Clearinghouse Company, Llc Methods and devices for high fidelity polynucleotide synthesis
US8034917B2 (en) 2008-08-28 2011-10-11 Agilent Technologies, Inc. Primer-directed chromosome painting
US8586310B2 (en) 2008-09-05 2013-11-19 Washington University Method for multiplexed nucleic acid patch polymerase chain reaction
CN102639552B (zh) 2008-09-05 2016-05-25 高端学术皇家研究会/麦吉尔大学 含有O-缩醛乙酰丙酸酯基团(O-acetal levulinyl ester)的RNA单体及其在RNA微阵列中的应用
US20100129810A1 (en) 2008-09-05 2010-05-27 Life Technologies Corporation Methods and systems for nucleic acid sequencing validation, calibration and normalization
US8541569B2 (en) 2008-09-06 2013-09-24 Chemgenes Corporation Phosphoramidites for synthetic RNA in the reverse direction, efficient RNA synthesis and convenient introduction of 3'-end ligands, chromophores and modifications of synthetic RNA
JP5714490B2 (ja) 2008-09-06 2015-05-07 ケムジーンズ コーポレーション Ｒｎａ合成、リバース方向での合成ｒｎａためのホスホラミダイト、及びｒｎａオリゴマーの合成のための５’から３’方向に対する結合形成によるオリゴヌクレオチドを調製する方法
WO2010030776A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 Genscript Corporation Homologous recombination-based dna cloning methods and compositions
US20100076183A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Dellinger Douglas J Protected monomer and method of final deprotection for rna synthesis
US8213015B2 (en) 2008-09-25 2012-07-03 Agilent Technologies, Inc. Integrated flow cell with semiconductor oxide tubing
CA2736430A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Abbott Laboratories Improved antibody libraries
US20100090341A1 (en) 2008-10-14 2010-04-15 Molecular Imprints, Inc. Nano-patterned active layers formed by nano-imprint lithography
US20100301398A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
JP2012507513A (ja) 2008-11-06 2012-03-29 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ バイオポリマー合成用器具
US8357489B2 (en) 2008-11-13 2013-01-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for detecting hepatocellular carcinoma
WO2010062960A2 (en) 2008-11-26 2010-06-03 Cedars-Sinai Medical Center METHODS OF DETERMINING RESPONSIVENESS TO ANTI-TNFα THERAPY IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE
RU2015151857A (ru) 2008-12-02 2019-01-15 Уэйв Лайф Сайенсес Джапан, Инк. Способ синтеза модифицированных по атому фосфора нуклеиновых кислот
US8963262B2 (en) 2009-08-07 2015-02-24 Massachusettes Institute Of Technology Method and apparatus for forming MEMS device
JO3382B1 (ar) 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
TW201104253A (en) 2008-12-31 2011-02-01 Nat Health Research Institutes Microarray chip and method of fabricating for the same
US9409969B2 (en) 2009-02-09 2016-08-09 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Repertoire of allo-restricted peptide-specific T cell receptor sequences and use thereof
WO2010094772A1 (en) 2009-02-20 2010-08-26 Febit Holding Gmbh Synthesis of sequence-verified nucleic acids
US8569046B2 (en) 2009-02-20 2013-10-29 Massachusetts Institute Of Technology Microarray with microchannels
KR101979188B1 (ko) * 2009-03-09 2019-05-16 바이오아트라, 엘엘씨 미락 단백질
US8709717B2 (en) 2009-04-03 2014-04-29 Illumina, Inc. Generation of uniform fragments of nucleic acids using patterned substrates
JP2010248084A (ja) 2009-04-10 2010-11-04 Invitrogen Japan Kk 新規洗浄溶媒を用いるオリゴヌクレオチド合成法
US7862716B2 (en) 2009-04-13 2011-01-04 Sielc Technologies Corporation HPLC schematic with integrated sample cleaning system
EP2424669B1 (en) 2009-04-29 2020-06-03 Sicpa Holding Sa Method for depositing a biological fluid onto a substrate
US9085798B2 (en) 2009-04-30 2015-07-21 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
EP2248914A1 (en) 2009-05-05 2010-11-10 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. The use of class IIB restriction endonucleases in 2nd generation sequencing applications
US9309557B2 (en) 2010-12-17 2016-04-12 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
US20100292102A1 (en) 2009-05-14 2010-11-18 Ali Nouri System and Method For Preventing Synthesis of Dangerous Biological Sequences
US20100300882A1 (en) 2009-05-26 2010-12-02 General Electric Company Devices and methods for in-line sample preparation of materials
ES2532891T3 (es) 2009-06-02 2015-04-01 The Regents Of The University Of California Descubrimiento de virus mediante secuenciación y ensamblaje de ARNip, miARN, ARNpi derivados de virus
WO2010141249A2 (en) 2009-06-02 2010-12-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Generation, characterization and uses thereof of anti-notch3 antibodies
US8309710B2 (en) 2009-06-29 2012-11-13 Agilent Technologies, Inc. Use of N-alkyl imidazole for sulfurization of oligonucleotides with an acetyl disulfide
US8642755B2 (en) 2009-06-30 2014-02-04 Agilent Technologies, Inc. Use of thioacetic acid derivatives in the sulfurization of oligonucleotides with phenylacetyl disulfide
GB0912909D0 (en) 2009-07-23 2009-08-26 Olink Genomics Ab Probes for specific analysis of nucleic acids
US8329208B2 (en) 2009-07-28 2012-12-11 Methylation Sciences International Srl Pharmacokinetics of S-adenosylmethionine formulations
CN102482714B (zh) 2009-07-30 2018-04-06 霍夫曼-拉罗奇有限公司 寡核苷酸探针组以及与其相关的方法和用途
EP2467401B1 (en) 2009-08-19 2017-01-18 Merck Patent GmbH Antibodies for the detection of integrin complexes in ffpe material
EP3029141A1 (en) 2009-08-20 2016-06-08 Population Genetics Technologies Ltd. Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement
US8476598B1 (en) 2009-08-31 2013-07-02 Sionyx, Inc. Electromagnetic radiation imaging devices and associated methods
US20110082055A1 (en) 2009-09-18 2011-04-07 Codexis, Inc. Reduced codon mutagenesis
US20120184724A1 (en) 2009-09-22 2012-07-19 Agilent Technologies, Inc. Protected monomers and methods of deprotection for rna synthesis
US20130053252A1 (en) 2009-09-25 2013-02-28 President & Fellows Of Harvard College Nucleic acid amplification and sequencing by synthesis with fluorogenic nucleotides
US8975019B2 (en) 2009-10-19 2015-03-10 University Of Massachusetts Deducing exon connectivity by RNA-templated DNA ligation/sequencing
EP2494062B1 (en) 2009-10-28 2016-12-28 Janssen Biotech, Inc. Anti-glp-1r antibodies and their uses
WO2011053957A2 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Gen9, Inc. Compositions and methods for the regulation of multiple genes of interest in a cell
WO2011056872A2 (en) 2009-11-03 2011-05-12 Gen9, Inc. Methods and microfluidic devices for the manipulation of droplets in high fidelity polynucleotide assembly
US20110114549A1 (en) 2009-11-13 2011-05-19 Agilent Technolgies, Inc. Microfluidic device comprising separation columns
US9216414B2 (en) 2009-11-25 2015-12-22 Gen9, Inc. Microfluidic devices and methods for gene synthesis
WO2011066186A1 (en) 2009-11-25 2011-06-03 Gen9, Inc. Methods and apparatuses for chip-based dna error reduction
US8500979B2 (en) 2009-12-31 2013-08-06 Intel Corporation Nanogap chemical and biochemical sensors
WO2011085075A2 (en) 2010-01-07 2011-07-14 Gen9, Inc. Assembly of high fidelity polynucleotides
US9758817B2 (en) 2010-01-13 2017-09-12 Agilent Technologies, Inc. Method for identifying a nucleic acid in a sample
KR101230350B1 (ko) 2010-01-27 2013-02-06 주식회사 엘지화학 구조적 안정성이 우수한 전지팩
KR20110094878A (ko) 2010-02-18 2011-08-24 삼성전자주식회사 올리고머 어레이 제조용 조성물 및 올리고머 어레이 제조 방법
GB201003036D0 (en) 2010-02-23 2010-04-07 Fermentas Uab Restriction endonucleases and their applications
US20120027786A1 (en) 2010-02-23 2012-02-02 Massachusetts Institute Of Technology Genetically programmable pathogen sense and destroy
US8716467B2 (en) 2010-03-03 2014-05-06 Gen9, Inc. Methods and devices for nucleic acid synthesis
JP2013520989A (ja) 2010-03-05 2013-06-10 シンセティック ジェノミクス インコーポレーテッド ゲノムのクローニングおよび操作のための方法
EP2703491B1 (en) 2010-04-09 2017-03-08 The Catholic University Of America Protein and nucleic acid delivery vehicles, components and mechanisms thereof
US10240194B2 (en) 2010-05-13 2019-03-26 Gen9, Inc. Methods for nucleotide sequencing and high fidelity polynucleotide synthesis
US9187777B2 (en) 2010-05-28 2015-11-17 Gen9, Inc. Methods and devices for in situ nucleic acid synthesis
KR101339064B1 (ko) 2010-05-28 2014-01-06 한양대학교 에리카산학협력단 바이오칩을 이용하여 암호를 해독하는 방법 및 이를 이용하여 바코드의 위조 여부를 확인하는 방법
GB2481425A (en) 2010-06-23 2011-12-28 Iti Scotland Ltd Method and device for assembling polynucleic acid sequences
DE102010027122A1 (de) 2010-07-14 2012-01-19 Airbus Operations Gmbh Aufenthaltsmodul mit separatem Privatbereich
BR112013003647A2 (pt) 2010-07-28 2017-11-07 Immunocore Ltd receptores de células t.
CA2811185C (en) 2010-09-21 2020-09-22 Population Genetics Technologies Ltd. Increasing confidence of allele calls with molecular counting
US8715933B2 (en) 2010-09-27 2014-05-06 Nabsys, Inc. Assay methods using nicking endonucleases
US20130289246A1 (en) 2010-09-30 2013-10-31 Vanderbilt University Influenza virus antibodies and immunogens and uses therefor
WO2012051327A2 (en) 2010-10-12 2012-04-19 Cornell University Method of dual-adapter recombination for efficient concatenation of multiple dna fragments in shuffled or specified arrangements
WO2012154201A1 (en) 2010-10-22 2012-11-15 President And Fellows Of Harvard College Orthogonal amplification and assembly of nucleic acid sequences
WO2012061832A1 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
EP2637780B1 (en) 2010-11-12 2022-02-09 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
CA3132011A1 (en) 2010-11-12 2012-06-14 Gen9, Inc. Methods and devices for nucleic acids synthesis
CN118086471A (zh) 2010-12-17 2024-05-28 生命技术公司 用于核酸扩增的方法、组合物、系统、仪器和试剂盒
US20120164633A1 (en) 2010-12-27 2012-06-28 Ibis Biosciences, Inc. Digital droplet sequencing
WO2012092260A1 (en) 2010-12-27 2012-07-05 Ibis Biosciences, Inc. Compositions and methods for producing single-stranded circular dna
ES2899186T3 (es) 2010-12-31 2022-03-10 Bioatla Inc Humanización rápida de anticuerpos
CN104673670A (zh) 2011-03-30 2015-06-03 独立行政法人国立长寿医疗研究中心 膜分选培养器、膜分选培养试剂盒、和使用其的干细胞分选方法、以及分离膜
US10131903B2 (en) 2011-04-01 2018-11-20 The Regents Of The University Of California Microfluidic platform for synthetic biology applications
US9384920B1 (en) 2011-04-04 2016-07-05 Eric J. Bakulich Locking knob
US20140357497A1 (en) 2011-04-27 2014-12-04 Kun Zhang Designing padlock probes for targeted genomic sequencing
US8722585B2 (en) 2011-05-08 2014-05-13 Yan Wang Methods of making di-tagged DNA libraries from DNA or RNA using double-tagged oligonucleotides
CN112592960B (zh) 2011-05-20 2024-08-27 富鲁达公司 核酸编码反应
US9752176B2 (en) 2011-06-15 2017-09-05 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods for preparative in vitro cloning
PL2723764T3 (pl) 2011-06-21 2018-05-30 Vib Vzw Domeny wiążące skierowane przeciwko kompleksom GPCR: białko G i związane z nimi zastosowania
CA2840542A1 (en) 2011-06-28 2013-01-03 Igor Kutyavin Methods and compositions for enrichment of nucleic acids in mixtures of highly homologous sequences
US20130045483A1 (en) * 2011-07-01 2013-02-21 Whitehead Institute For Biomedical Research Yeast cells expressing amyloid beta and uses therefor
WO2013019361A1 (en) 2011-07-07 2013-02-07 Life Technologies Corporation Sequencing methods
US20130017978A1 (en) 2011-07-11 2013-01-17 Finnzymes Oy Methods and transposon nucleic acids for generating a dna library
WO2013010062A2 (en) 2011-07-14 2013-01-17 Life Technologies Corporation Nucleic acid complexity reduction
CN104066844B (zh) 2011-08-26 2016-12-07 Gen9股份有限公司 用于核酸的高保真组装的组合物和方法
US20150203839A1 (en) 2011-08-26 2015-07-23 Gen9, Inc. Compositions and Methods for High Fidelity Assembly of Nucleic Acids
WO2013030827A1 (en) 2011-09-01 2013-03-07 Genome Compiler Corporation System for polynucleotide construct design, visualization and transactions to manufacture the same
EP2753714B1 (en) 2011-09-06 2017-04-12 Gen-Probe Incorporated Circularized templates for sequencing
US8840981B2 (en) 2011-09-09 2014-09-23 Eastman Kodak Company Microfluidic device with multilayer coating
US20130109596A1 (en) 2011-09-26 2013-05-02 Life Technologies Corporation High efficiency, small volume nucleic acid synthesis
WO2013055822A2 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Life Technologies Corporation Systems and methods for analysis and interpretation of nucleic acid sequence data
WO2013059746A1 (en) 2011-10-19 2013-04-25 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing
US8987174B2 (en) 2011-10-28 2015-03-24 Prognosys Biosciences, Inc. Methods for manufacturing molecular arrays
US8815782B2 (en) 2011-11-11 2014-08-26 Agilent Technologies, Inc. Use of DNAzymes for analysis of an RNA sample
EP2599785A1 (en) 2011-11-30 2013-06-05 Agilent Technologies, Inc. Novel methods for the synthesis and purification of oligomers
US8450107B1 (en) 2011-11-30 2013-05-28 The Broad Institute Inc. Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors
US20130137173A1 (en) 2011-11-30 2013-05-30 Feng Zhang Nucleotide-specific recognition sequences for designer tal effectors
US9279154B2 (en) 2011-12-21 2016-03-08 Illumina, Inc. Apparatus and methods for kinetic analysis and determination of nucleic acid sequences
WO2013093693A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Rinat Neuroscience Corp. Staphylococcus aureus specific antibodies and uses thereof
US20130217071A1 (en) 2011-12-30 2013-08-22 Luz Montesclaros Methods and compositions for performing nucleic acid amplification reactions
EP3495499A1 (en) 2011-12-30 2019-06-12 Quest Diagnostics Investments Incorporated Nucleic acid analysis using emulsion pcr
SG10201606285YA (en) 2012-02-01 2016-09-29 Synthetic Genomics Inc Materials and methods for the synthesis of error-minimized nucleic acid molecules
WO2013130512A2 (en) 2012-02-27 2013-09-06 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and uses for molecular tags
ES2741099T3 (es) 2012-02-28 2020-02-10 Agilent Technologies Inc Método de fijación de una secuencia de recuento para una muestra de ácido nucleico
EP2825653A4 (en) 2012-03-14 2016-01-20 Innovative Targeting Solutions Inc PRODUCTION OF TARGETED SEQUENCE DIVERSITY IN FUSION PROTEINS
US9150853B2 (en) 2012-03-21 2015-10-06 Gen9, Inc. Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis
EP2830555B1 (en) 2012-03-28 2017-08-02 KCI Licensing, Inc. Reduced-pressure systems and dressings facilitating separation of electronic and clinical component parts
US9732384B2 (en) 2012-04-02 2017-08-15 Lux Bio Group, Inc. Apparatus and method for molecular separation, purification, and sensing
EP2836821B1 (en) 2012-04-10 2018-09-26 The Trustees of Princeton University Ultra-sensitive sensor
US20150353921A9 (en) 2012-04-16 2015-12-10 Jingdong Tian Method of on-chip nucleic acid molecule synthesis
US10081807B2 (en) 2012-04-24 2018-09-25 Gen9, Inc. Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning
US20130281308A1 (en) 2012-04-24 2013-10-24 Gen9, Inc. Methods for sorting nucleic acids and preparative in vitro cloning
US9969813B2 (en) * 2012-05-10 2018-05-15 Bioatla, Llc Multi-specific monoclonal antibodies
EP4148142A1 (en) 2012-05-21 2023-03-15 The Scripps Research Institute Methods of sample preparation
EP3346404A1 (en) 2012-06-01 2018-07-11 European Molecular Biology Laboratory High-capacity storage of digital information in dna
US10308979B2 (en) 2012-06-01 2019-06-04 Agilent Technologies, Inc. Target enrichment and labeling for multi-kilobase DNA
US9102936B2 (en) 2012-06-11 2015-08-11 Agilent Technologies, Inc. Method of adaptor-dimer subtraction using a CRISPR CAS6 protein
WO2013188840A1 (en) 2012-06-14 2013-12-19 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for sensitive mutation detection in nucleic acid molecules
WO2014004393A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Gen9, Inc. Methods for nucleic acid assembly and high throughput sequencing
WO2014008447A1 (en) 2012-07-03 2014-01-09 Integrated Dna Technologies, Inc. Tm-enhanced blocking oligonucleotides and baits for improved target enrichment and reduced off-target selection
US9255245B2 (en) 2012-07-03 2016-02-09 Agilent Technologies, Inc. Sample probes and methods for sampling intracellular material
WO2014011800A1 (en) 2012-07-10 2014-01-16 Pivot Bio, Inc. Methods for multipart, modular and scarless assembly of dna molecules
WO2014012071A1 (en) 2012-07-12 2014-01-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods and apparatus for assembly
JP6239813B2 (ja) 2012-07-18 2017-11-29 株式会社Ｓｃｒｅｅｎセミコンダクターソリューションズ 基板処理装置および基板処理方法
WO2014014991A2 (en) 2012-07-19 2014-01-23 President And Fellows Of Harvard College Methods of storing information using nucleic acids
EP3636664A1 (en) 2012-07-27 2020-04-15 The Board of Trustees of the University of Illinois Engineering t-cell receptors
WO2014021938A1 (en) 2012-08-02 2014-02-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and apparatus for nucleic acid synthesis using oligo-templated polymerization
CN108285896A (zh) 2012-08-16 2018-07-17 合成基因组股份有限公司 数字生物转化器
PT2890836T (pt) * 2012-08-31 2019-09-16 Scripps Research Inst Métodos relacionados a moduladores de células eucariotóticas
US9328376B2 (en) 2012-09-05 2016-05-03 Bio-Rad Laboratories, Inc. Systems and methods for stabilizing droplets
WO2014062717A1 (en) 2012-10-15 2014-04-24 Life Technologies Corporation Compositions, methods, systems and kits for target nucleic acid enrichment
KR20140048733A (ko) 2012-10-16 2014-04-24 삼성전자주식회사 다중 웰 플레이트 및 상기 다중 웰 플레이트를 이용한 표적 물질 분석 방법
US9410173B2 (en) 2012-10-24 2016-08-09 Clontech Laboratories, Inc. Template switch-based methods for producing a product nucleic acid
EP2928500B1 (en) 2012-12-04 2019-03-06 Phosphorex Inc. Microparticles and nanoparticles having negative surface charges
JP6335918B2 (ja) 2012-12-06 2018-05-30 アジレント・テクノロジーズ・インクＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． 制限酵素を用いない標的富化
EP2929027B1 (en) 2012-12-06 2018-02-21 Agilent Technologies, Inc. Molecular fabrication
US9976162B2 (en) 2012-12-10 2018-05-22 Agilent Technologies, Inc. Pairing code directed assembly
CA2892646A1 (en) 2012-12-10 2014-06-19 Resolution Bioscience, Inc. Methods for targeted genomic analysis
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
EP2962110A4 (en) 2013-02-28 2016-11-02 Univ Nanyang Tech METHOD FOR MANUFACTURING DEVICE FOR SUPPORTING CULTURE OF BIOLOGICAL SUBSTANCE AND DEVICE THEREOF
EP2964778B1 (en) 2013-03-05 2019-10-09 Agilent Technologies, Inc. Detection of genomic rearrangements by sequence capture
US9580746B2 (en) 2013-03-05 2017-02-28 Agilent Technologies, Inc. Synthesis of long fish probes
EP2971034B1 (en) 2013-03-13 2020-12-02 Gen9, Inc. Compositions, methods and apparatus for oligonucleotides synthesis
US10053719B2 (en) 2013-03-13 2018-08-21 Gen9, Inc. Compositions and methods for synthesis of high fidelity oligonucleotides
US10273471B2 (en) 2013-03-15 2019-04-30 Gen 9, Inc. Compositions and methods for multiplex nucleic acids synthesis
WO2014151117A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Identification and use of circulating nucleic acid tumor markers
US20140274729A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Nugen Technologies, Inc. Methods, compositions and kits for generation of stranded rna or dna libraries
US20140274741A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Translational Genomics Research Institute Methods to capture and sequence large fragments of dna and diagnostic methods for neuromuscular disease
AR095517A1 (es) 2013-03-15 2015-10-21 Genentech Inc ANTICUERPOS CONTRA EL RECEPTOR QUIMIOATRAYENTE EXPRESADO EN CÉLULAS T HELPER 2 (ANTI-CRTh2) Y MÉTODOS DE USO
US9279149B2 (en) 2013-04-02 2016-03-08 Molecular Assemblies, Inc. Methods and apparatus for synthesizing nucleic acids
US9771613B2 (en) 2013-04-02 2017-09-26 Molecular Assemblies, Inc. Methods and apparatus for synthesizing nucleic acid
US10683536B2 (en) 2013-04-02 2020-06-16 Molecular Assemblies, Inc. Reusable initiators for synthesizing nucleic acids
US20150293102A1 (en) 2013-04-13 2015-10-15 Jung-Uk Shim Detecting low-abundant analyte in microfluidic droplets
ITRM20130278A1 (it) 2013-05-10 2014-11-11 Consiglio Nazionale Ricerche Procedimento di fabbricazione di film autoassemblati di copolimeri a blocchi
AU2014301777B2 (en) 2013-06-26 2017-03-30 Xlifesc, Ltd. High-stability T-cell receptor and preparation method and application thereof
US20150010953A1 (en) 2013-07-03 2015-01-08 Agilent Technologies, Inc. Method for producing a population of oligonucleotides that has reduced synthesis errors
KR20150005062A (ko) 2013-07-04 2015-01-14 삼성전자주식회사 미니-코어를 사용하는 프로세서
US10421957B2 (en) 2013-07-29 2019-09-24 Agilent Technologies, Inc. DNA assembly using an RNA-programmable nickase
EP3027771B1 (en) 2013-07-30 2019-01-16 Gen9, Inc. Methods for the production of long length clonal sequence verified nucleic acid constructs
SG11201600853UA (en) 2013-08-05 2016-03-30 Twist Bioscience Corp De novo synthesized gene libraries
US20150044648A1 (en) 2013-08-07 2015-02-12 Nike, Inc. Activity recognition with activity reminders
CN104371019B (zh) 2013-08-13 2019-09-10 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与glp-1r特异性结合的抗体及其与glp-1的融合蛋白质
GB201314721D0 (en) 2013-08-16 2013-10-02 Almagen Ltd A method of selectively masking one or more sites on a surface and a method of synthesising an array of molecules
EP3039161B1 (en) 2013-08-30 2021-10-06 Personalis, Inc. Methods and systems for genomic analysis
JP6571663B2 (ja) 2013-09-14 2019-09-04 ケムジーンズ コーポレーション 逆方向アプローチを使用した長いｒｎａの非常に効果的な合成
WO2015040075A1 (en) 2013-09-18 2015-03-26 Genome Research Limited Genomic screening methods using rna-guided endonucleases
US9422325B2 (en) 2013-10-04 2016-08-23 Trustees Of Tufts College Glycosylation reactions using phenyl(trifluoroethyl)iodonium salts
WO2015054292A1 (en) 2013-10-07 2015-04-16 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
EP3063301A4 (en) 2013-10-29 2017-07-19 Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC Next generation genomic sequencing methods
WO2015081142A1 (en) 2013-11-26 2015-06-04 Xenco Medical, Llc Lock and release implant delivery system
CN110219055A (zh) * 2013-11-27 2019-09-10 Gen9股份有限公司 核酸文库及其制造方法
US20160297883A1 (en) 2013-12-04 2016-10-13 Innovative Targeting Solutions, Inc. G-protein coupled receptor agonists and methods
KR20240134226A (ko) 2013-12-04 2024-09-06 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 화합물의 농도에 따라 항원 결합능이 변화되는 항원 결합 분자 및 그의 라이브러리
WO2015089053A1 (en) 2013-12-09 2015-06-18 Integrated Dna Technologies, Inc. Long nucleic acid sequences containing variable regions
KR20160089531A (ko) 2013-12-17 2016-07-27 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제 및 항-her2 항체를 사용하여 her2-양성 암을 치료하는 방법
GB2521387B (en) 2013-12-18 2020-05-27 Ge Healthcare Uk Ltd Oligonucleotide data storage on solid supports
US10537889B2 (en) 2013-12-31 2020-01-21 Illumina, Inc. Addressable flow cell using patterned electrodes
US9587268B2 (en) 2014-01-29 2017-03-07 Agilent Technologies Inc. Fast hybridization for next generation sequencing target enrichment
WO2015120403A1 (en) 2014-02-08 2015-08-13 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Multiplexed linking pcr
US10208338B2 (en) 2014-03-03 2019-02-19 Swift Biosciences, Inc. Enhanced adaptor ligation
KR102290829B1 (ko) 2014-03-14 2021-08-18 이뮤노코어 리미티드 Tcr 라이브러리
US10675618B2 (en) 2014-03-27 2020-06-09 University Of Maryland, College Park Integration of ex situ fabricated porous polymer monoliths into fluidic chips
US10190161B2 (en) 2014-04-03 2019-01-29 Stmicroelectronics S.R.L. Apparatus and method for nucleic acid sequencing based on nanowire detectors
WO2015160004A1 (ko) 2014-04-15 2015-10-22 볼보 컨스트럭션 이큅먼트 에이비 건설기계의 엔진, 유압펌프의 제어장치 및 그 제어방법
GB201407852D0 (en) 2014-05-02 2014-06-18 Iontas Ltd Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules
ES2876432T3 (es) 2014-05-16 2021-11-12 Illumina Inc Técnicas de síntesis de ácidos nucleicos
US20150361422A1 (en) 2014-06-16 2015-12-17 Agilent Technologies, Inc. High throughput gene assembly in droplets
US20150361423A1 (en) 2014-06-16 2015-12-17 Agilent Technologies, Inc. High throughput gene assembly in droplets
US10870845B2 (en) 2014-07-01 2020-12-22 Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd Methods for capturing nucleic acids
US10472620B2 (en) 2014-07-01 2019-11-12 General Electric Company Method, substrate and device for separating nucleic acids
WO2016007604A1 (en) 2014-07-09 2016-01-14 Gen9, Inc. Compositions and methods for site-directed dna nicking and cleaving
EP3169776A4 (en) 2014-07-14 2018-07-04 The Regents of The University of California Crispr/cas transcriptional modulation
EP3169781B1 (en) 2014-07-15 2020-04-08 Life Technologies Corporation Compositions and methods for nucleic acid assembly
WO2016022557A1 (en) 2014-08-05 2016-02-11 Twist Bioscience Corporation Cell free cloning of nucleic acids
ES2880335T3 (es) 2014-09-09 2021-11-24 Igenomx Int Genomics Corporation Métodos y composiciones para la preparación rápida de bibliotecas de ácidos nucleicos
EP3201356A1 (en) 2014-10-03 2017-08-09 Life Technologies Corporation Genetic sequence verification compositions, methods and kits
US9879283B2 (en) 2014-10-09 2018-01-30 Life Technologies Corporation CRISPR oligonucleotides and gene editing
US10648103B2 (en) 2014-10-10 2020-05-12 Invitae Corporation Universal blocking oligo system and improved hybridization capture methods for multiplexed capture reactions
JP2017538234A (ja) 2014-10-18 2017-12-21 マリク、ギリクMALIK, Girik データ保管システム
US10434507B2 (en) 2014-10-22 2019-10-08 The Regents Of The University Of California High definition microdroplet printer
US9890417B2 (en) 2014-11-03 2018-02-13 Agilent Technologies, Inc. Signal amplification of fluorescence in situ hybridization
US10233490B2 (en) 2014-11-21 2019-03-19 Metabiotech Corporation Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations
CN104562213A (zh) 2014-12-26 2015-04-29 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 扩增子文库及其构建方法
WO2016126987A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Compositions and methods for synthetic gene assembly
US10669304B2 (en) * 2015-02-04 2020-06-02 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
US9834774B2 (en) 2015-02-11 2017-12-05 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for rapid seamless DNA assembly
EP3256624A4 (en) 2015-02-13 2018-07-25 Vaccine Research Institute of San Diego Materials and methods to analyze rna isoforms in transcriptomes
CN104734848A (zh) 2015-03-02 2015-06-24 郑州轻工业学院 基于重组dna技术对信息进行加密与隐藏的方法及应用
CA2981517A1 (en) 2015-04-01 2016-10-06 The Scripps Research Institute Methods and compositions related to gpcr agonist polypeptides
US10730911B2 (en) 2015-04-08 2020-08-04 Universitat Zurich Backbone-cyclized peptidomimetics with GLP-1R modulating activity
WO2016164779A1 (en) 2015-04-10 2016-10-13 University Of Washington Integrated system for nucleic acid-based storage of digital data
US10125198B2 (en) 2015-04-17 2018-11-13 Distributed Bio, Inc. Method for mass humanization of non-human antibodies
WO2016172377A1 (en) 2015-04-21 2016-10-27 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
EP3288973B1 (en) 2015-04-30 2021-10-20 AbCheck s.r.o. Method for mass humanization of rabbit antibodies
US20160333340A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Twist Bioscience Corporation Compositions and methods for nucleic acid amplification
JP6920275B2 (ja) 2015-07-13 2021-08-18 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸を用いた回収可能な情報記憶のための方法
KR20180050411A (ko) 2015-09-18 2018-05-14 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 올리고핵산 변이체 라이브러리 및 그의 합성
KR20180058772A (ko) 2015-09-22 2018-06-01 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 합성을 위한 가요성 기판
US20180320166A1 (en) 2015-10-01 2018-11-08 University Of Washington Multiplex pairwise assembly of dna oligonucleotides
US20170141793A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 Microsoft Technology Licensing, Llc Error correction for nucleotide data stores
CA3006867A1 (en) 2015-12-01 2017-06-08 Twist Bioscience Corporation Functionalized surfaces and preparation thereof
AU2016366231B2 (en) 2015-12-08 2022-12-15 Twinstrand Biosciences, Inc. Improved adapters, methods, and compositions for duplex sequencing
CN108473987B (zh) 2016-01-08 2024-01-02 马可讯治疗有限公司 具有改变的多样性支架结构域的结合成员
GB201604492D0 (en) 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Transfected t-cells and t-cell receptors for use in immunotherapy against cancers
WO2017214557A1 (en) 2016-06-10 2017-12-14 Counsyl, Inc. Nucleic acid sequencing adapters and uses thereof
EP3469499A4 (en) 2016-06-10 2020-10-21 Twist Bioscience Corporation SYSTEMS AND METHODS FOR AUTOMATED BIOLOGICAL SEQUENCE ANNOTATION AND SCREENING
CN110088281A (zh) 2016-08-03 2019-08-02 特韦斯特生物科学公司 用于多核苷酸合成的纹理化表面
GB2568444A (en) 2016-08-22 2019-05-15 Twist Bioscience Corp De novo synthesized nucleic acid libraries
JP7160482B2 (ja) 2016-09-02 2022-10-25 レンティジェン・テクノロジー・インコーポレイテッド Ｄｕｏｃａｒを用いてがんを処置するための組成物および方法
EP3516528A4 (en) 2016-09-21 2020-06-24 Twist Bioscience Corporation NUCLEIC ACID BASED DATA STORAGE
EP3541973B1 (en) 2016-11-18 2024-03-27 Twist Bioscience Corporation Polynucleotide libraries having controlled stoichiometry and synthesis thereof
WO2018112426A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
PE20191497A1 (es) 2016-12-21 2019-10-21 Cephalon Inc Anticuerpos que se unen especificamente a il-15 humana y usos de estos
JP2020508661A (ja) 2017-02-22 2020-03-26 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション 核酸ベースのデータ保存
GB2575576A (en) 2017-03-15 2020-01-15 Twist Bioscience Corp De novo synthesized combinatorial nucleic acid libraries
WO2018170169A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
EA201992220A1 (ru) 2017-03-23 2020-02-11 Кьюбиотикс Пти Лтд Комбинированная терапия для лечения или предупреждения опухолей
US11274344B2 (en) 2017-03-30 2022-03-15 Grail, Inc. Enhanced ligation in sequencing library preparation
DK3615690T3 (da) 2017-04-23 2021-11-15 Illumina Cambridge Ltd Sammensætninger og fremgangsmåder til forbedring af prøveidentificering i indekserede nukleinsyrebiblioteker
FI3622089T3 (fi) 2017-05-08 2024-10-23 Illumina Inc Menetelmä sekvensoimiseksi käyttämällä lyhyitä yleisadaptereita polynykleotidinäytteiden indeksoimiseksi
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
IL271205B1 (en) 2017-06-12 2024-10-01 Twist Bioscience Corp Methods for assembling contiguous nucleic acids
CA3070249C (en) 2017-07-18 2024-04-16 Investigaciones Forestales Bioforest S.A. Method and device for asymmetric polarity inversion in electromembrane processes
JP2020536504A (ja) 2017-09-11 2020-12-17 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション Ｇｐｃｒ結合タンパク質およびその合成
US10894242B2 (en) 2017-10-20 2021-01-19 Twist Bioscience Corporation Heated nanowells for polynucleotide synthesis
WO2019084500A1 (en) 2017-10-27 2019-05-02 Twist Bioscience Corporation SYSTEMS AND METHODS FOR CLASSIFYING POLYNUCLEOTIDES
US11427867B2 (en) 2017-11-29 2022-08-30 Xgenomes Corp. Sequencing by emergence
SG11202006460SA (en) 2018-01-04 2020-08-28 Twist Bioscience Corp Dna-based digital information storage
US10722916B2 (en) 2018-01-19 2020-07-28 Caulk Garbage Can LLC Caulk gun attachment for wiping excess caulk
SG11202011467RA (en) 2018-05-18 2020-12-30 Twist Bioscience Corp Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization
EP3814494B1 (en) 2018-06-29 2023-11-01 Thermo Fisher Scientific GENEART GmbH High throughput assembly of nucleic acid molecules
US10963953B2 (en) 2018-10-10 2021-03-30 Alliance Inspection Management, LLC Reserve management for continuous bidding portal
US10969965B2 (en) 2018-12-24 2021-04-06 Western Digital Technologies, Inc. Dynamic performance density tuning for data storage device
WO2020139871A1 (en) 2018-12-26 2020-07-02 Twist Bioscience Corporation Highly accurate de novo polynucleotide synthesis
CN113728100A (zh) 2019-02-25 2021-11-30 特韦斯特生物科学公司 用于下一代测序的组合物和方法
US11492728B2 (en) 2019-02-26 2022-11-08 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for antibody optimization
AU2020229349A1 (en) 2019-02-26 2021-10-14 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for GLP1 receptor
CA3144644A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Twist Bioscience Corporation Barcode-based nucleic acid sequence assembly
US20220243195A1 (en) 2019-06-21 2022-08-04 Twist Bioscience Corporation Barcode-based nucleic acid sequence assembly
US20220259638A1 (en) 2019-07-22 2022-08-18 Igenomx International Genomics Corporation Methods and compositions for high throughput sample preparation using double unique dual indexing
US20220411780A1 (en) 2019-09-13 2022-12-29 University Health Network Detection of circulating tumor dna using double stranded hybrid capture
CA3155630A1 (en) 2019-09-23 2021-04-01 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for single domain antibodies
EP4034566A4 (en) 2019-09-23 2024-01-24 Twist Bioscience Corporation VARIANT NUCLEIC ACID LIBRARIES FOR CRTH2
MX2022006995A (es) 2019-12-09 2022-10-27 Twist Bioscience Corp Bibliotecas de acidos nucleicos variantes para receptores de adenosina.
US20210395344A1 (en) 2020-04-27 2021-12-23 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for coronavirus
CN116472302A (zh) 2020-07-07 2023-07-21 特韦斯特生物科学公司 用于光引导聚合物合成的装置和方法
US20220106586A1 (en) 2020-08-25 2022-04-07 Twist Bioscience Corporation Compositions and methods for library sequencing
WO2022046944A2 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Twist Bioscience Corporation Methods and compositions relating to glp1r variants
CA3190917A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Andres Fernandez Devices and methods for synthesis
CA3194398A1 (en) 2020-10-05 2022-04-14 Twist Bioscience Corporation Hybridization methods and reagents
US11970697B2 (en) 2020-10-19 2024-04-30 Twist Bioscience Corporation Methods of synthesizing oligonucleotides using tethered nucleotides
WO2022087293A1 (en) 2020-10-22 2022-04-28 Twist Bioscience Corporation Methods and systems for detecting coronavirus
US20220135965A1 (en) 2020-10-26 2022-05-05 Twist Bioscience Corporation Libraries for next generation sequencing
WO2022098662A2 (en) 2020-11-03 2022-05-12 Twist Bioscience Corporation Methods and compositions relating to chemokine receptor variants
KR20230147617A (ko) 2021-01-21 2023-10-23 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 아데노신 수용체에 관한 방법 및 조성물
US20220277808A1 (en) 2021-02-19 2022-09-01 Twist Bioscience Corporation Libraries for identification of genomic variants
WO2022204301A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Twist Bioscience Corporation Electrochemical polynucleotide synthesis
US20220307010A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for tigit
WO2022204316A2 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for cd3
WO2022217004A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Twist Bioscience Corporation Libraries for mutational analysis
US20220356468A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for ion channels
US20220411784A1 (en) 2021-05-03 2022-12-29 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for glycans
US20230002478A1 (en) 2021-06-22 2023-01-05 Twist Bioscience Corporation Methods and compositions relating to covid antibody epitopes
WO2023023190A2 (en) 2021-08-17 2023-02-23 Twist Bioscience Corporation Single domain antibodies for sars-cov-2
US20230192818A1 (en) 2021-08-17 2023-06-22 Twist Bioscience Corporation Sars-cov-2 antibodies and related compositions and methods of use
EP4388118A2 (en) 2021-08-19 2024-06-26 Twist Bioscience Corporation Methods and compositions relating to covalently closed nucleic acids

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