CN101795744A - 用于分选物体的结合方法和仪器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分选物体的仪器和方法，包括提供具有需要的物体和不需要的物体的样品，在样品支架的表面上涂布抗体，将经洗脱的样品放置在样品支架上，将需要的物体中的抗原与样品支架上的抗体结合来将物体分选成需要的物体和不需要的物体，分离需要的物体，以及对需要的物体进行基于PCR的STR分析。在一个实施方式中，使用全息光学捕获来分选需要的物体。在其他实施方式中，需要的物体是精子，并且抗体是人精子特异性抗体，PCR是基于单细胞PCR的STR分析。

Description

用于分选物体的结合方法和仪器

本申请要求2007年9月11日提交的美国临时专利申请No.60/960,004的优先权以及2007年9月13日提交的美国临时专利申请No.60/960,059的优先权，其内容通过将它们完全引用来合并在此。

技术领域

本发明涉及用于在DNA分析中分选物体的方法和仪器。更具体地，本发明涉及使用抗体或者其他识别精子的生物分子在结合方法中分选精子，以及用于分选精子的仪器。在一个实施方式中，在对物体进行分选后，进行聚合酶链式反应(PCR)方法——在有些情况下，进行单细胞PCR方法——从而在法医DNA分析中鉴定性侵犯案件中的人/侵犯者，或者用于医学诊断领域中的其他应用。

背景技术

在常规的法医DNA分析中，在现代执法中通常使用通常基于短串联重复(STR)分析的人类鉴别系统来将样本与被指控的犯罪嫌疑人匹配，所述分析涉及通过聚合酶链式反应(PCR)来扩增存疑的DNA。PCR是强大的工具，其能够将痕量的DNA片段复制/扩增到可以以有意义的方式来分析的数量。这项技术适应于DNA测序、DNA指纹图谱等等，并且具有检测样品中的特定DNA片段的能力。

因此，利用人类基因组中的STR标记物的高度辨别能力和快速分析速度实现了法医DNA分析，现在已经成为法医DNA分析中最流行的所选方法。

虽然STR分析是常用的，但是它具有几项缺陷，其中最显著的缺陷来自于在基于PCR(聚合酶链式反应)的STR分析之前DNA样品的污染，以及对给定的样品进行整个STR分析所花费的时间。

例如，来自性侵犯证据的用于STR的待分析DNA应当理想地来自侵犯者的精子。但是，精子样品常常被(1)作为阴道内衬的上皮细胞，以及偶尔地被(2)来自口腔的上皮细胞(口腔细胞)和(3)来自皮肤的细胞，以及尿液样品中的细胞污染。同样，在性侵犯犯罪现场的样品中，还可能预期会看到红血球、嗜中性细胞、泡沫细胞(非标准上皮细胞)等等。

因此，很明显，如果在进行PCR之前能够从任何或所有的污染性细胞中分离出精子细胞，则会实现更好和更精确的STR分析。

通常使用的微分萃取(differential extraction)方法不能完全地分离法医样品中的男性(侵犯者)精子和女性(受害者)上皮细胞DNA。例如，利用不含还原剂的溶液的初始裂解来裂解上皮细胞(性侵犯法医样品中最常见的污染物)，留下完整精子细胞用于有效地分离DNA级分。但是，差异裂解(differential lysis)引起精子细胞过早发生裂解，导致不期望的DNA与存疑的DNA(仅来自精子)一起被共同扩增。这导致产生混杂的STR分布图，其难以分析并且无法鉴别独特个体。STR分析中的这些问题造成50％的基于STR分析的人类鉴别失败。

此外，在解决法医案件中的另一个限制来自用于分析的细胞的可获得性有限。这可能由于存在有限的证据样品、通常随着时间的流逝DNA和细胞样品发生降解，和/或在性侵犯犯罪样品中存在非常少的精子细胞，从而不能基于标准PCR来解决案件。

因此，需要一种能够防止或减轻上述问题的方法。

发明内容

本发明涉及在DNA分析中使用结合方法，使用抗体或者其他识别精子的生物分子来分选物体的方法和仪器，具体地，本发明涉及从非精子污染物中分离精子。

在一个实施方式中，将识别精子的抗体涂布在基底上，从而从其他污染物中分选和分离出精子。通常地，例如，一种能够以单独方式操作或者与全息光线捕获联合操作来从污染性细胞中分离出精子的方法是使用涂布有抗体的基底，其中抗体选择性地识别人类精子上的表面抗原。

或者，抗体的另一个选择可以是靶向通常在决定男性的精子上发现的H-Y抗原的抗体。

在另一个实施方式中，基底上的抗体可以是抗免疫球蛋白抗体，其反过来识别靶向精子特异性表面抗原的单克隆抗体。这涉及首先使用精子特异性抗体来识别和与法医样品中的精子结合并且然后允许借助抗免疫球蛋白来识别和捕获抗体标记的精子。

当包含其他污染性细胞的法医样品中存在非常少的精子时，甚至能够使用一前一后的多个精子特异性抗体来选择和分选精子，用于下游分析。

可以利用标准的生物偶联化学(bioconjugation chemistry)来将抗体附着在基底上，基底可以是玻璃或者类似塑料的其他材料。还可以在具有不同几何尺寸的基底上利用本发明，所述基底例如是平直的基底(具有单个或多个孔的形式)或者弯曲的表面，例如埃彭道夫管(Eppendorftube)的表面。可以利用常见的共价或非共价键或者利用吸附，在基底上进行抗体偶联。

本领域技术人员可以设想将该项技术扩展至在精子分选中使用珠子，其中不是使用一种或多种抗体来涂布基底，而是使用涂布有抗体的珠子例如由硅石、聚苯乙烯制成的珠子或磁性珠子来识别和结合精子。

可以用于靶向精子抗原的抗体可以是全长或者裂开的或者甚至短的肽，所述肽识别精子表面上的表位。在依赖于精子的结合但是不涉及基于抗体的精子识别的另一个实施方式中，使用精子表面的结合伴侣来从混合的细胞样品中捕获精子。

本发明将解决长期存在的女性DNA在精子细胞级分中的共同扩增问题，已经指出这种扩增在与性侵犯相关的大约40％的法医样品中发生(参见Korf BR，在”Current Protocols in Human Genetics”，Wiley：New York 1999)。近来的报导指出，所有的性侵犯案件中只有25％的案件鉴别出犯罪者，因为DNA在这些样品中的共同扩增问题导致大多数基于STR的人类鉴别是模棱两可的。

在补充的实施方式中，其中在样品中存在非常少的精子但是主要的细胞类型是来自阴道的上皮细胞，本领域技术人员能够使用抗体手段(使用或者不使用全息光学捕获(HOT))来通过使上皮细胞附着在涂布有上皮细胞特异性抗体的基底上从而首先从精子中分离出上皮细胞。在这种情况下，精子保留在上清液中并且能够直接用于细胞裂解和提取。如果需要进一步的纯化，则可以使用联合抗体手段的HOT来对它们进行分离。存在多种上皮细胞特异性标记物特别是来自人类阴道的那些，以用于该手段。可以使用新型标记物，它们一贯地被发现靶向/鉴别各种细胞类型，包括阴道细胞。在这一实施方式中，还可以使用多种抗体的组合来分离上皮细胞和精子。相似地，还可以使用利用常用的配体受体结合的无抗体的结合手段。

本发明将通过更好地从污染性细胞中分离精子来提高待分析的法医样品中的纯度，由此增加在下游的基于PCR的STR的读出信息中的效力。而且，所提供的方法是能够自动实施的，这是目前的方法所无法做到的。

因此，本发明涉及一种分选物体的方法和仪器，包括：提供具有需要的物体和不需要的物体的样品；在样品支架的表面上涂布抗体；洗脱样品并且将经洗脱的样品放置在样品支架上；将需要的物体中的抗原与样品支架表面上的抗体结合来将物体分选成需要的物体和不需要的物体；分离需要的物体；除去不需要的物体；以及对需要的物体进行基于PCR的STR分析。在一个实施方式中，使用全息光学捕获来分选需要的物体和不需要的物体。在一个实施方式中，需要的物体是精子，并且抗体是人精子特异性抗体。在另一个实施方式中，STR读出利用基于单细胞PCR的扩增。在其他实施方式中，结合是直接的或间接的，例如，使用二次抗体而不是单独使用一次抗体。在另一个实施方式中，使用配体来结合至物体特异性大分子(例如，细胞表面受体)。

因此，已经列出了本发明的一些特征，以便能够更好地理解后面的详细描述，并且能够更好地理解本发明对现有技术的贡献。当然，下面将会描述本发明的附加特征，它们将构成权利要求的主题。

在这一方面，在详细地解释本发明的至少一个实施方式之前，应当理解，本发明在它的应用中不被限制于在下文的说明中阐述的或者在附图中例举的构造的细节和组件的布置。根据本发明的方法和仪器能够采用其他实施方式，并且能够以多种方式实践和实施。而且，应当理解，这里使用的用语和术语以及包括的摘要是为了描述的目的，而不应当认为是限制性的。

因此，本领域技术人员将理解，本公开内容所基于的构思可以容易地用作设计用于实施本发明的不同目的的其他结构、方法和系统的基础。因此，重要的是，权利要求被认为包括了这些等价的构造，前提是它们不背离根据本发明的方法和仪器的精神和范围。

附图说明

图1是根据本发明的一个实施方式，分选物体的方法中的步骤的流程图。

图2描述图1的分选物体的仪器和方法。

图3A和图3B描述根据本发明的其他实施方式，分选物体的仪器和方法。

图4是根据本发明的另一个实施方式，使用全息光学捕获来分选物体的方法和仪器的示意图。

具体实施方式

本发明涉及使用结合方法和/或全息光学捕获(HOT)来分选物体的方法和仪器。

抗体方法

在一个实施方式中，使用涂布有抗体的基底来分选物体，例如，精子细胞。通常地，所述实施方式可以以单独的方式操作或者与全息光学捕获(HOT)联合操作来从污染性细胞中分离出精子，并且使用涂布有抗体的基底，其中抗体选择性地识别人类精子上的表面抗原。

或者，抗体的另一个选择可以是靶向通常在决定男性的精子上发现的H-Y抗原的抗体。

具体地，根据本发明的一个实施方式，采取如图1和图2中所示的以下步骤来使用抗体方法和仪器，从而从污染物中分离出精子并且确定法医案件中的个体的DNA。

在步骤100中，通过用棉签201从例如性侵犯的受害者身上取得法医样本来制备样品200，在步骤101中，使用洗脱溶液洗脱样品200(见图1)。

例如经洗脱的样品200通常含有来自侵犯者的精子细胞202，来自受害者的上皮细胞，以及其他污染物203。

在步骤102中，在试管204、埃彭道夫容器205、载玻片206、微流控芯片207或者其他预期用于精子分离的容器(平台)的表面上涂布人精子特异性抗体或者另一种生物分子例如配体、肽、蛋白质208，等等，所述抗体或生物分子将与精子上的相应的结合伴侣结合。精子特异性抗体涂层208可以施加到任何表面或样品室-即，试管204、埃彭道夫容器205、盖玻片206、芯片207上。对于将抗体和肽、蛋白质、配体或其他生物分子附着至玻璃基底，存在多种已经确立的技术。例如，可以在容器(即，试管204、埃彭道夫管205)的整个内壁/内部区域或者仅在盖玻片206或芯片207上的特定区域或小片区域上施加表面涂层。

在步骤103中，例如使用移液管或者其他有源机构例如泵或者无源机构例如重力流动机构，将待分析的洗脱法医样品200放置在涂布抗体的样品室/容器204-206中。

在步骤104中，使抗原300(见图3A(i))(位于精子202上)和精子特异性抗体208(可能位于容器204-206的表面上)结合。因此，抗体208直接地识别精子202的细胞表面上的抗原300并且选择性地与表面抗原300结合，而上皮细胞和其他污染性细胞203保持不结合。可以用于靶向精子抗原300的抗体208可以是全长或者裂开的或者甚至短的肽，所述肽识别精子202表面上的表位。而且，能够使用精子202表面受体的结合伴侣来从混合细胞样品200中捕获精子202。

在步骤105中使用具有所需pH和盐浓度的合适缓冲溶液或者精子洗脱缓冲液209，从样品室204-206的表面温和地洗去非精子(即，非粘附细胞或污染物203)(可能需要多次洗涤)，并且如果需要在步骤106中进行收集，仅仅留下结合有抗体的精子细胞202，用于下游分析(见图3A(i))。取决于分析所需的在基底204-206表面上捕获的精子202的数目，可以重复洗涤步骤。

在步骤107中，检查、扫描分选的成分(即，结合有抗体的精子202)并且观察其品质(纯度)。这可以(但不限于)使用亮视野显微镜(基于形态的鉴别)或者使用荧光标签来进行，从而鉴别精子细胞202，其中在处理过程中形态可能已经发生改变。荧光法还会使得精子202鉴别的成像过程更加容易(因为荧光比亮视野图像提供更好的对比度)并且更加快速。

在步骤108中，然后可以裂解精子细胞202并且可以在步骤109中将含有精子的样品室204-206转移到台子210上，在这里进行原位PCR，然后进行STR法医分析。

或者，在步骤108中，例如可以使用裂解剂或者通过改变/更换缓冲溶液(例如改变缓冲液pH以影响抗原-抗体结合)或者通过改变盐浓度以影响有效电荷屏蔽，从而从样品室204-206的涂布有抗体的表面释放结合的精子细胞202。分选的精子202可以在分选容器204-206中借助重力沉降，或者如果需要，在步骤109中的将分选的精子细胞202从样品室204-206转移到用于STR分析的PCR平台210上之前，通过离心使分选的精子细胞202进一步形成小球。

应当注意，在敞开的或者封闭的容器204-206中进行分选的能力在平台设计和与现有仪器的一起使用方面提供了灵活性。在封闭的室中进行分选的能力提供了在PCR前的处理过程中避免任何污染的额外优点。

在步骤110中，可以得到显示精子数目、测试样品200的纯度水平以及其他相关性能参数的结果报告。在步骤111中的实际的基于PCR的STR分析之前的这些报告将在法医分析中提供更好的质量控制。类似HOT(将在下面详细描述)的观察方法提供的优点是，追踪阴道得到最终结果的中间步骤。

进行基于PCR的STR分析(步骤111)以鉴别其DNA与精子202的DNA匹配的个体。还可以对污染物或不需要的物体例如受害者的上皮细胞上进行基于PCR的STR分析，用于交叉核对提交的犯罪指控的正确性。基于PCR的STR分析本身是本领域熟知的技术并且已经广泛地商业化，因此在本文中不再做任何详细讨论。

可以在一台机器210上在任何给定时间进行多个PCR反应。但是，为了避免在从芯片到试管的转移期间DNA发生损失，可以使用平台热循环器(flatbed thermocycle)在芯片207上进行PCR。

在步骤112中，得到被分析的精子202的最终STR报告，并且产生STR图谱的统计数据。

在步骤113中，例如，如果得到的数据打算用于法医应用，则将得到的数据与CODIS数据库相匹配，用于人的鉴别。

在本发明的另一个实施方式中，步骤100-103保持不变。但是，在步骤104中，基底204-207上的抗体208是识别结合至精子特异性抗原300的抗体208的抗-IgG(见图3A(ii)(a))。因此，基底204-207的表面上的抗体208可以是抗免疫球蛋白抗体208，其进而识别靶向精子特异性表面抗原300的单克隆抗体。在含有其他污染性细胞203的法医样品200中存在非常少的精子202的情况下，甚至可以使用一前一后的多个精子特异性抗体208来选择和分选精子202用于下游分析，而抗免疫球蛋白表面抗体可以保持不变。

在该实施方式的两步结合过程中，在步骤I中，借助特异性抗体208识别精子特异性抗原300。现在结合至精子202表面的抗体可以用二次(2°)抗体例如抗-IgG来识别(见图3A(ii)(b))。

可以在埃彭道夫容器中的缓冲溶液中实施步骤I(见图3A(ii)(a))，在存在过量抗体208的情况下温育精子202。然后通过简单的离心旋转洗去过量的抗体208。然后回收抗体208标记的精子202用于步骤II(见图3A(ii)(b))，步骤II例如可以在固体支持物(基底)206上进行。

在步骤II中，在支持物206上的二次抗体(2°)301中接收一次抗体(1°)208。在使用二次抗体301来捕获精子202的第二种情况下，二次抗体301(取决于可获得的结合位点)能够捕获多个精子细胞202。能够通过牢记空间位阻来优化二次抗体301的表面密度。二次抗体301例如可以是IgG或者IgM，其中IgM是具有多个结合(十个)位点的五聚体，或者IgG的每个分子具有两个结合位点。

之后，步骤例如步骤105-113基本上保持不变，检查和制备精子202，用于最终的STR分析，以确定精子支架的DNA。

在本发明的另一个实施方式中，步骤100-103保持不变，但是，在步骤104中，不是像前面的实施方式中所描述的那样将抗体208固定化在基底206上例如用于直接地或者间接地捕获精子202，而是能够将配体302(通常是小分子)固定化在基底206上，例如使用商业上已知的各种方法来固定，从而借助精子202表面上的细胞表面受体303来识别配体302(见图3A(iii))，因此，有效地从污染物203中分选精子202。

之后，步骤例如步骤105-113基本上保持不变，检查和制备精子202，用于基于PCR的STR分析。

在本发明的另一个实施方式中，步骤100-103保持不变，但是在步骤104中，使用间接手段——如图3A(ii)(b)所示——来实施用于捕获精子202的两步法。第一步骤涉及使用配体302来结合精子特异性蛋白质、肽、细胞表面分子(糖肽，等等)304。之后，然后使用第二步骤，借助抗体301捕获结合配体302的精子202。

之后，步骤105-113基本上保持不变，检查和制备精子202，用于PCR-STR分析。

应当注意，可以利用标准的生物偶合化学来将抗体208附着在基底205-207上，基底可以是玻璃或者其他类似塑料的材料。在基底上偶合抗体可以利用常见的共价键或非共价键或者利用吸附来进行。

因此，这里讨论的所有手段都可以以超出在固体支持物例如玻璃或塑料206上的固定化的形式来实现。这将包括具有不同几何形状的基底，例如平直基底(呈单孔或多孔形式)或者弯曲表面例如埃彭道夫管的弯曲表面。

在另一个实施方式中，如图3B(v)所示，替代性的仪器可以包括使用涂布有抗体的珠子(例如，硅石珠子、磁性珠子、聚苯乙烯珠子)305，从而直接地或者间接地结合至精子202用于捕获精子。

而且，在本发明的另一个实施方式中，如图3B(vi)所示，能够使用蛋白质A306和蛋白质G307之间的朝向结合抗体208的强亲和力来提供本发明的替代形式。因此，在上面针对间接结合方法进行讨论的实施方式中，不是使用二次抗体301来识别结合精子202的一次抗体208，而是能够使用珠子305和/或蛋白质A306或蛋白质G307来识别和捕获结合有精子202的一次抗体208。

之后，步骤105-113基本上保持不变，检查和制备精子202，用于基于PCR的STR分析。

全息光学捕获

在本发明的另一个实施方式中，对于具有需要超出如上所述基于抗原-抗体结合的分选或者基于蛋白质-配体结合的分选的额外纯度水平(例如，在分选精子中)的法医样品，可以在进行上述步骤101-103之后使用HOT400(见图4)。

HOT仪器是本领域熟知的，并且详细地描述在例如Grier等人的U.S.专利No.6,055,106中，该专利的内容通过引用全部并入本文。

因此，HOT可以与前面描述的抗体手段结合使用，其中存在多种细胞特异性标记物特别是那些识别和结合人类精子的标记物，用于使用和分选。可以使用一贯地被发现靶向/鉴别各种细胞类型包括上皮细胞的新型标记物。在该实施方式中，还可以使用多种抗体的组合来从物体/精子中分离上皮细胞。本发明将解决现有的挑战，即，不能完全将精子DNA与上皮细胞DNA分离开，这导致需要的DNA和不需要的DNA共同扩增。这进而导致产生混杂的STR分布图，而不是独特的STR分布图。

具体地，在样品中存在非常少的物体/精子并且大多数细胞类型是来自阴道的上皮细胞(污染物)的情况下，使用HOT是有利的。在这种情况下，能够使用前面描述的抗体手段(使用或不使用HOT)，通过导致上皮细胞附着在涂布有上皮细胞特异性抗体的基底(即，载玻片或者微流控芯片)，从而首先将上皮细胞与精子分离开。在这种情况下，精子将会保留在上清液中并且能够直接用于细胞裂解和提取。

因此，在结合了基底上的标记有抗体的精子细胞后，使用光学捕获来完全对非粘附污染物(可能没有借助使用缓冲液洗涤而完全被除去)进一步分选，在基底上仅仅留下精子细胞。因此，在该实施方式中，使用HOT并且额外地使用抗体方法或者择一地使用HOT或抗体方法从样品中的污染性细胞中分选物体(即，精子)。

之后，步骤105-113保持不变，如图1中所描述的。

微流控芯片知单细胞PCR-STR分析

注意，在前面的实施方式中，可以使用微流控芯片207。在2008年9月11日提交的、名称为“Methods and Apparatus in Sorting Objects in DNAAnalysis”的共同未决的申请中详细描述了微流控芯片在分选物体中的应用，所述申请的内容通过引用全部并入本文。

如本文中所描述的，使用HOT400来分选物体例如精子，并且与本文描述的抗体方法结合使用(参见图2和图4)，并且使用包含输入室401和各个输出室402的微流控芯片207，能够使用HOT将精子202分选到各个室402中。在该实施方式中，例如，通过使光学捕获的精子202从微流控芯片207的一个区域移动到同一芯片207上的各个室402中，借助视觉(显微镜或监测器)检查，使用HOT将法医样品200中的精子细胞202与其他污染性细胞203分离开。

之后，与上面描述的步骤105-113相似，在PCR210台上进行基于PCR的STR分析，以鉴别其DNA标签(DNA signature)与精子的DNA标签匹配的个体。

常规地，需要大量的细胞来获得可靠的STR读数信号。但是，使用基于HOT的精子分离的温和方法和改善的灵敏性，能够更可靠地分离精子和污染性非精子细胞，并且能够将以基于PCR的STR分析所需的精子细胞的数量而言的样品收集量从大约200(这是常规方法所需要的)按比例减少到几个细胞，或者甚至减少到单细胞PCR的水平——大大增大了其效率(参见芯片上的室)。这进而提供了单细胞PCR在法医分析中的所有优点，其包括在多个性侵犯者的案件中或者在只能获得非常少的精子细胞用于标准的大规模PCR分析的情况下，鉴别攻击者的可能性更高。

因此，使用标准的PCR方法(在多个室的芯片中，在各个室中裂解各个精子，提取DNA并且同时在所有室中从单个细胞扩增DNA)，能够在多个室中在每个单独的精子上进行单细胞PCR。

具体地，将芯片200放置在平台热循环器上，其中使用STR引物通过PCR来扩增提取的DNA，所述STR引物可以商业上获得用于法医案件。或者是，在不涉及法医案件时，能够使用定制的合适的引物。增加热循环的次数，从而在PCR循环结束时留下来自各个细胞的足够的DNA。

可以通过离心(在细胞裂解后)或通过附着到磁性珠子上来提取DNA，其中通过改变pH值(改变DNA上的电荷，即，从而影响DNA与珠子的结合)将DNA从珠子(磁性的或其他类型)上洗脱下来。

一旦完成了PCR，就能够进行标准STR分析。这包括凝胶在扩增的DNA上跑动，用于STR读出，其中每个PCR反应相应于来自单个精子的扩增DNA。商业上可以获得的仪器可用于这个目的。

因此，除了在试管中或在平板上进行的标准PCR/STR分析之外，在一个实施方式中，还可以在单个芯片上进行所述分析(芯片上PCR)。在这个实施方式中，样品中的精子可以被原位裂解，或每个孔或室中的精子可以被裂解并运动经过滤器来分离细胞碎片和DNA，仅容许DNA进入下一个室，在其中进行PCR(大量)(即，对来自几个精子的DNA进行PCR)。室连接到具有STR读出能力的芯片上PCR设备。

如上所述，然后对每个被分析的精子产生最终的STR报告，对STR分布图产生统计数据。例如，如果是用于法医用途，则将产生的数据与用于人类鉴别的CODIS数据库匹配。

基于各个精子(单细胞)的STR读出的优点是：

(1)它提高了根据STR读出的统计显著性(标准法规所公认的)来检测多个侵犯者的可能性(如果在性侵犯案件涉及多个侵犯者)；和

(2)它提供了分析由于样品精子细胞的有限可获得性导致获得200个精子细胞成为挑战的那些犯罪案件的能力，因而，例如，增强了在性侵犯案件中排除被指控的人的概率。

因而，人们可以设想改革基于STR的法医学的性质和范围，提供对之前采集足够的样品成为难题的更多案件的解决方案。对一个或少数细胞的分析也将减少样品采集时间。

在等位基因遗失是难题并且STR分布图(根据标准的巨量PCR分析)不能与CODIS数据库匹配(显性等位基因屏蔽了另一个)的罕有情况中，更加可能来利用相关的统计计算将从单细胞PCR获得的STR标签与数据库匹配，来达到所需的概率。

通过对各个精子细胞进行STR分析，以及一个接一个地对来自给定样品的多个精子细胞进行重复分析，人们现在可以可靠地解决涉及多个侵犯者的性侵犯案件，例如在轮奸犯罪中。因而，在分辨来自细胞混合物集合的个体的STR分布图时不需要解缠绕。

进一步的，基于单细胞PCR的法医学将提供进行重复测量的能力，并且，在解决犯罪案件时可以获得统计学上更可靠的数据。而且，如步骤108中所描述的，可以对一次抗体和/或二次抗体进行荧光标记，并且借助HOT的自动化精子分离的产量将会更高，因为对比度更好导致荧光样品的图像识别效率更高。

本发明的方法与自动化和多重化(multiplexing)是兼容的，即，能够进行多个法医样品分析，从而提高产量；并且可以与机器人集成在一起，从而可以同时洗脱、分离和测试多个犯罪样品，从而提高分析能力。与机器人的结合包括额外的优点，因为它是平台独立性的，即，可以在载玻片(盖玻片)上或在试管中或在埃彭道夫管中或甚至以96孔形式进行(假定现在存在可以以96孔或更多孔形式进行PCR的机器，利用这样的分离，原位PCR是可能的)。

这种方法还与法医样品的原位PCR是相容的。因此，原位PCR的所有优点是成立的，例如：

(i)降低污染的几率，因为原位PCR将包括更少的步骤并且避免从一个容器向另一个容器转移样品；以及

(ii)通过限制可能与更多步骤和样品的转移相关的供应成本，减少这种法医分析的成本。

本文描述的发明优于常用的微分萃取方法，微分萃取方法具有若干缺点，例如将男性和女性级分混合在一起并且经常发生细胞的过早裂解。而且，作为用于分离精子和上皮细胞DNA的广泛使用的方法的微分萃取是劳动量大的、耗时的并且缺乏自动化的余地。本发明避免了这些问题并且在STR分析之前的分离过程中提供了更好的质量和可靠性。

尽管存在替代性的技术例如使用双膜过滤器，其中过滤器的明确限定的精密的孔尺寸被设计成允许来自消化的上皮细胞的DNA通过但是捕获精子(参见Ladd Carl et al.，″Decelopment of a high throughput method to isolatesperm DNA in sexual assault cases″，August 2006)，但是该方法被认为过于粗糙并且导致精子的过早裂解。基于抗体-抗原结合或蛋白质-配体结合的精子分选防止机械分离的粗糙。

其他替代方法已经使用了相似的手段，其中使用尼龙网薄膜代替具有精密孔尺寸的膜。通过将真空泵耦联至该系统，这种基于膜的分离能够部分地自动进行或者提供比手动操作的分离更好的速度。但是，增加泵降低了分离的分辨力——即，来自混合细胞样品的不需要的组分能够被吸入膜分离的部分中。

而且，本发明具有以下优点：其能够通过直接显微观察来操作，在样品的品质(纯度)方面提供更好的控制。

在用于细胞类型分离的法医样品分析领域的另一种方法称作激光捕获显微切割(micro dissection)。尽管该方法在分离精子和上皮细胞方面比微分萃取效果更好，但是，该方法是昂贵的，需要额外的中间步骤来进行细胞固定，并且当细胞相互分离且位于单个层中而不是成簇分布时效果最好。因此，现有的技术/方法都不满足分离上皮细胞和精子细胞的所有标准。本文中描述的本发明可以单独地或者与HOT联合地克服现有技术的缺陷和困难并且能够完全自动化。

尽管在本文中针对解决性侵犯法医案件具体描述了本发明(包括大约三分之二的法医案件(参见文献“Forensics DNA Typing”，2nd edition by JamesButler))，但是其在法医学领域的应用超出了细胞类型分离所需的应用范围。

在其他实施方式中，由于大多数细胞具有细胞类型特异性表面标记物，因此将基于抗体的分离扩展到法医学之外的领域例如基础研究或者癌症诊断是可能的。

在法医学领域中，对于本发明的一种扩展就是在基于DNA的亲子鉴定中利用这一基于抗体的细胞分离方法。这种鉴定是在性侵犯后经常发生的怀孕失败或流产的情况下鉴别胚胎或胎儿的生物学父亲所必需的。使用胎儿遗体或者流产物作为胎儿DNA的来源。但是，如果可识别的胎儿部分不能确信地用于亲子鉴定的鉴别，则对来自死后样品进行显微检查或遗传羊膜穿刺是辨别回收产物的母体(蜕膜的)与胎儿(绒毛)组分的唯一方法。但是，同样，传统地，细胞分离远非完美的方法。但是，借助本发明，结合HOT的基于抗体的分离能够在对提取的DNA进行PCR扩增之前分离母体和绒毛组分。该方法提供了在需要的任何场合直接观察样品的能力。

要强调的是，上文描述的本发明的实施方式仅仅是为了清楚理解本发明的原则来阐述的可能的实施实例。变化和改变可以对本发明的上述实施方式来进行，而不背离本发明的精神和原理。所有这样的改变和变化意图在此被包括在本发明的范围内，由以下的权利要求保护。

Claims (29)

1.一种分选物体的方法，包括：

提供具有需要的物体和不需要的物体的样品；

在样品支架的表面上涂布抗体；

洗脱所述样品并且将经洗脱的所述样品放置在所述样品支架上；

将所述样品中的需要的物体中的抗原与所述样品支架的所述表面上的所述抗体结合，来将所述物体分选成需要的物体和不需要的物体；

分离所述需要的物体；

除去所述不需要的物体；以及

对所述需要的物体进行基于PCR的STR分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其中进行全息光学捕获，从而从所述不需要的物体中分选所述需要的物体。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品支架是光学透明的材料，包括以下之一：埃彭道夫管、试管、载玻片、盖玻片，或者微流控芯片。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述需要的物体是精子，所述抗体是人精子特异性抗体。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述PCR是以下之一：在相同类型的多个分选物体上的巨量PCR，或者基于单细胞PCR的STR分析。

6.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

从所述表面释放物体；以及

使用亮视野显微镜或者荧光显微镜来检查所述需要的物体的品质和纯度。

7.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

在同一个芯片上或者在不同的芯片上进行所述分选和所述基于PCR的STR分析。

8.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

将所述抗原与一次抗体结合；以及

将所述一次抗体与二次抗体结合。

9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

将配体固定在所述样品支架上；以及

将所述需要的物体的表面上的细胞表面受体与所述配体结合。

10.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

将配体与物体特异性有机分子结合；以及

使用抗体捕获结合所述配体的物体。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品支架包含涂布有所述抗体的珠子，从而直接地或者间接地结合至所述需要的物体。

12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括：

将所述抗原与一次抗体结合；以及

将所述一次抗体与二次抗体结合，

其中所述珠子涂布有蛋白质A或者蛋白质G，并且

其中所述珠子识别和捕获结合有所述一次抗体的所述需要的物体。

13.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

在所述样品支架的表面上涂布蛋白质A或者蛋白质G；

将所述抗原与一次抗体结合；以及

将所述一次抗体与二次抗体结合，

其中所述蛋白质A或者蛋白质G识别和捕获使用抗体标记的所述需要的物体。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述PCR进行步骤与自动化和多重化是兼容的。

15.根据权利要求2所述的方法，其中在进行基于PCR的STR分析来鉴定DNA用于亲子鉴定之前，结合全息光学捕获的使用基于抗体的分选的所述分选步骤分离母体和绒毛组分。

16.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

在所述不需要的物体上进行基于PCR的STR分析。

17.一种分选物体的仪器，包括：

涂布有抗体的样品支架，所述样品支架包含具有需要的物体和不需要的物体的样品，所述需要的物体含有抗原；

其中涂布在所述样品支架上的所述抗体与所述需要的物体上的所述抗原结合；

芯片，在其上分选所述需要的物体；以及

用于对所述需要的物体进行基于PCR的STR分析的仪器。

18.根据权利要求17所述的仪器，其进一步包括：

全息光学捕获仪器，其从所述样品中的所述不需要的物体中光学捕获和分选所述需要的物体。

19.根据权利要求17所述的仪器，其中所述需要的物体是细胞，所述不需要的物体是污染物。

20.根据权利要求17所述的仪器，其中所述PCR仪器进行以下分析之一：在相同类型的多个分选物体上的巨量PCR，或者基于单细胞PCR的STR分析。

21.根据权利要求17所述的仪器，其中所述芯片是微流控芯片。

22.根据权利要求17所述的仪器，其中所述样品支架和在其上所述仪器进行所述基于PCR的STR分析的基底是单个芯片。

23.根据权利要求18所述的仪器，其中用于进行所述PCR的所述仪器是自动化和多重化的。

24.根据权利要求18所述的仪器，其进一步包括：

放置在所述样品支架上的多个配体；

其中所述需要的物体的表面上的细胞表面受体与所述配体结合。

25.根据权利要求18所述的仪器，其进一步包括：

放置在所述样品支架上的多个配体；

其中所述配体与物体特异性有机分子结合；以及

其中结合所述配体的物体使用对抗所述配体的所述抗体。

26.根据权利要求18所述的仪器，其中所述样品支架是涂布有所述抗体的珠子，从而直接地或者间接地结合至所述需要的物体。

27.根据权利要求18所述的仪器，其中所述样品支架涂布有蛋白质A或者蛋白质G。

28.根据权利要求26所述的仪器，其中所述抗体进一步包括一次抗体和二次抗体；

其中所述一次抗体与所述抗原结合；以及

其中所述一次抗体与二次抗体结合，

其中所述珠子涂布有蛋白质A或者蛋白质G，并且

其中所述珠子识别和捕获结合有所述一次抗体的所述需要的物体。

29.根据权利要求17所述的仪器，其中基于PCR的STR分析是在不需要的物体上进行的。

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