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ES2235228T3 - Procedimiento de purificacion de la toxina cm 101 del grupo gbs. - Google Patents

Procedimiento de purificacion de la toxina cm 101 del grupo gbs.

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Publication number
ES2235228T3
ES2235228T3 ES97910725T ES97910725T ES2235228T3 ES 2235228 T3 ES2235228 T3 ES 2235228T3 ES 97910725 T ES97910725 T ES 97910725T ES 97910725 T ES97910725 T ES 97910725T ES 2235228 T3 ES2235228 T3 ES 2235228T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
toxin
hic
procedure
gbs
approximately
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES97910725T
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English (en)
Inventor
Carl G. Hellerqvist
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vanderbilt University
Original Assignee
Vanderbilt University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Vanderbilt University filed Critical Vanderbilt University
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE PURIFICACION DE UN POLISACARIDO DE LAS BACTERIAS DE TIPO STREPTOCOCCUS- BE HEMOLITICO DEL GRUPO B (GBS). DICHO PROCEDIMIENTO CONSISTE EN PONER EN CONTACTO UNA MATERIA DE FERMENTACION BACTERIANA CON UNA RESINA DE CROMATOGRAFIA DE INTERACCION HIDROFOBA (HIC). OTRAS ETAPAS ADICIONALES PUEDEN INCLUIR UNA EXTRACCION EN FENOL/SALINA Y UNA CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO. DICHO PROCEDIMIENTO ORIGINA UN PRODUCTO DE ELEVADA PUREZA. EL PRODUCTO DE LA PURIFICACION PROPORCIONA UNA COMPOSICION QUE ES MUY UTIL, TANTO EN INVESTIGACION COMO EN EL CAMPO TERAPEUTICO.

Description

Procedimiento de purificación de la toxina CM101 del grupo GBS.
Campo técnico
Esta invención hace referencia a los procedimientos mejorados de purificación de un polisacárido
Antecedentes
CM101, una toxina de GBS, es una molécula patogénica aislada de la bacteria Streptococcus del grupo \beta-hemolítico (GBS). Los recién nacidos pueden infectarse con GBS, enfermedad conocida como la neumonía por GBS o "infección de aparición temprana" y padecer sepsis, granulocitopenia e insuficiencia respiratoria, es decir, hipertensión pulmonar y edema pulmonar de origen proteico (Hellerqvist C.G. y col., Studies on group B \beta-hemolytic streptococcus I. Isolation and partial characterization of an extra-cellular toxin., Pediatr. Res., 12:892-898 (1981)).
A pesar de los efectos perjudiciales en los neonatos expuestos a GBS, no se sabe si CM101 causa toxicidad en edades superiores. De hecho, la investigación de esta toxina ha puesto de manifiesto una aplicación terapéutica significativa. Véase la patente U.S. 5.010.062 y Hellerqvist, C.G. y col., Early Results of Phase I Trial of CM101 in Cancer Patients, Proceedings of the American Association of Cancer Research Annual Meeting (1995), en donde CM101 se utilizó para inhibir la vascularización de los tumores. Por ello, la obtención de CM101 purificada es crítica tanto para la investigación como para fines terapéuticos.
CM101 es una toxina de polisacáridos compleja que tiene un peso molecular de aproximadamente 300.000 daltons y contiene residuos de N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, glucosa, galactosa y manosa. Los resultados de RMN (resonancia magnética nuclear) sugieren que los residuos alditol también pueden estar presentes. También se cree que los grupos funcionales de ácido carboxílico, probablemente el ácido galacturónico, son también parte integrante de la molécula. Los epitopos activos repetidos desempeñan probablemente un papel importante en la respuesta patofisiológica a CM101 al conectar los receptores con el endotelio diana (Hellerqvist., C.G. y coll., Early Results of Phase I Trial of CM101 in Cancer Patients, Proceedings of the American Association of Cancer Research Annual Meeting (1995); DeVore, R.F., y col., A Phase I Study of the Antineovascularization Drug CM101, J.Clin.Can. Res., 3:365-372 (1997)).
La patente americana U.S. 50.10.062 proporciona un procedimiento de purificación de una toxina de GBS. El procedimiento que se muestra en dicha patente es laborioso y además requiere numerosas etapas, lo que implica una pérdida continua de actividad biológica.
La purificación de CM101 tal como se conoce actualmente en la materia proporciona un material final con sólo una pureza del 40%, cuantificada por análisis químicos y ensayos biológicos. El otro 60% corresponde a polisacáridos de levaduras y plantas y a polisacáridos de bacterias endógenas. Los contaminantes de plantas y levaduras provienen en su mayoría de los aditivos de los medios de cultivo comerciales utilizados para el crecimiento óptimo de la bacteria GBS. Los contaminantes endógenos incluyen los polisacáridos de GBS, incluyendo los antígenos específicos de grupo y tipo (Paoletti, L.C. y col., Neonatal mouse protection against infection with multiple group B streptococcal (GBS) serotypes by maternal immunization with a tetravalent GBS polysacharide-tetanus toxoid conjugate vaccine, Infect. Immn. 62(8).3236-43 (1994); Micho, F., Multiantennary group-specific polysaccharide of Group B Streptococcus, Biochem., 27:5341-51 (1988)). La CM101 de este nivel de pureza del 40% representa el grado clínico actual. Es necesario, por lo tanto, un procedimiento de purificación de CM101 que dé como resultado un producto final con una pureza global superior, preferentemente gracias a la eliminación de polisacáridos foráneos de plantas y levaduras y de los polisacáridos antigénicos de GBS.
Adicionalmente, el esquema de purificación conocido en la materia incluye etapas contaminantes del medio ambiente, como lo son la utilización de un gran volumen de fenol en una extracción fenol:agua. El fenol es un material cáustico bien conocido.
En consecuencia, los objetivos de la presente invención son proporcionar un procedimiento de purificación que dé como resultado (i) un material de alta pureza, (ii) utilizando un número de etapas mínimo, (iii) minimizando la utilización de materiales cáusticos o tóxicos como el fenol y (iv) aumentando el rendimiento del producto final.
Resumen de la invención
Los objetivos anteriores se han logrado con la invención que aquí se describe. En particular, un esquema de purificación que incluye una resina de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) para la purificación de CM101 a partir del medio de cultivo bacteriano de GBS y que proporciona un producto con una pureza mínima del 60%.
Un aspecto de la presente invención es un proceso para la purificación de una toxina de polisacáridos de la bacteria GBS, en donde el proceso incluye la utilización de una resina HIC. La presente invención también incluye una toxina de polisacáridos pura de la bacteria GBS producida por el procedimiento descrito aquí y una composición farmacéutica que comprende una toxina esencialmente pura y un vehículo aceptable farmacéuticamente. La composición farmacéutica puede utilizarse para tratar a un paciente con una determinada enfermedad. Por ejemplo, un paciente con un tumor podría tratarse con la composición de la presente invención.
Descripción resumida de las figuras
La Fig. 1 muestra un esquema de la purificación de CM101 de la presente invención.
La Fig. 2 muestra un esquema conocido de purificación de CM101.
La Fig. 3 es una curva estándar de hidrólisis cuantitativa que muestra la respuesta a la dosis de un detector PAD para 5, 20 y 50 \mug de dextrano (un polímero de glucosa) con glucosa 6-desoxi como estándar interno constante.
La Fig. 4 muestra la separación de las muestras de azúcar estándares.
Las Figs. 5a-b son los perfiles de elución de un concentrado del medio en una columna de butil-Sepharose HIC. La cuantificación se ha realizado a una absorbancia UV de 206 nm en la Fig. 5a y de 280 nm en la Fig 5b.
La Fig. 6a es un perfil de HPLC de una fracción eluída con agua purificada-HIC que contiene CM101 (pico de 16 min) y monitorizada a una absorbancia UV de 203 nm con un detector de rayo diódico Millenium 2000 (Waters, Millford, MA).
La Fig. 6b es un espectro de rayo-diódico que corresponde con la Fig. 6a y que muestra la presencia mínima de absorción a 260 (RNA y DNA) y la absorción a 280 (proteína que contiene tirosina) para el pico (16 min) que contiene CM101.
La Fig. 7a es un perfil de elución monitorizado a 203 nm que muestra la pureza del pico del eluido con agua de HIC de la Fig. 6a, sometido además posteriormente a una extracción fenol/salina y a una cromatografía DEAE.
La Fig. 7b es un espectro de rayo diódico que muestra la pureza del pico que contiene CM101 de la Fig. 7a, tal como se muestra por el pico simétrico y estrecho y la falta de absorción a 260 nm (RNA/DNA) y 280 nm (proteína).
La Fig. 8 es un perfil de la actividad de IL-6 por el ensayo ANA-1 de las fracciones obtenidas de una columna HIC, más específicamente un perfil de actividad de IL-6 de las fracciones obtenidas del concentrado 10K5P6 migrado en una columna de 100 ml de Butil Sepharose (FT = paso de flujo; 1M= fracción de fosfato 1 M; 0,25 M = fracción de fosfato 0,25 M; H_{2}O = fracción de agua; EtOH = fracción de etanol).
La Fig. 9 muestra un análisis de CM101 purificado por el procedimiento de la presente invención.
La Fig. 10 es un perfil de HPLC de CM101 del grado clínico actual sometido a una cromatografía HIC.
La Fig. 11 muestra un análisis de una muestra de grado clínico actual que se purificó además por HIC y HPLC.
La Fig. 12a es perfil de HPLC de CM101 purificado por un procedimiento conocido utilizando tampón fosfato
10 mM, pH 8,4.
La Fig. 12b es un perfil de HPLC de CM101 purificado por el procedimiento de la invención, utilizando las mismas condiciones de migración que las del perfil HPLC de la Fig. 12a.
Descripción de las realizaciones específicas
Tal como se utiliza aquí, la toxina GBS se define como cualquier fracción o componente aislado de bacterias GBS naturales o lisadas, o la derivada de los sobrenadantes del medio o de las bacterias GBS lisadas y/o autoclavadas que tiene una actividad biológica evidenciada por la inducción de dificultad respiratoria en el ensayo con ovejas (Hellerqvist, C.G. y col., Studies on group B \beta-hemolytic streptococcus 1. Isolation and partial characterization of an extra-cellular toxin., Pediatr. Res., 12:892-898 (1981)) o la activación del complemento y la unión a los vasos de nueva formación tal como se demuestra por un ensayo de peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) de una muestra de tejido tumoral (Hellerqvist, C.G. y col., Anti-tumor effects of GBS toxin: a polysaccharide exotoxin from group B \beta-hemolytic streptococcus. J. Canc. Res. Clin. Oncol., 120:63-70 (1993); y Hellerqvist, C.G. y col., Early Results of a Phase I Trial of CM101 in Cancer Patients., Proceedings of the American Association of Cancer Research Annual Meeting (1995)).
Una toxina GBS esencialmente pura quiere decir una preparación con una pureza en la toxina GBS superior al 40% (p.ej., presente a una concentración de al menos un 40% en peso), preferentemente al menos el 60% pura, más preferentemente al menos el 90% pura y más preferentemente al menos el 95% pura.
Una fuente del material de inicio de GBS para utilizar en el procedimiento de la presente invención se puede obtener cultivando cepas de la bacteria Streptococcus \beta-hemolítico del grupo B que hayan infectado recientemente o sean capaces de infectar niños recién nacidos. Los aislados de dichas cepas pueden obtenerse a partir de la sangre de los niños.
La producción elevada de CM101 requiere generalmente la fermentación con el medio complejo THB que contiene material de alto peso molecular en la forma de polisacáridos y proteínas para el crecimiento óptimo de GBS y la producción de CM101. Durante la fermentación, la bacteria produce a partir de los nutrientes, proteínas ácidos nucleicos y polisacáridos distintos al de CM101. La concentración estimada de CM101 en el caldo de fermentación es inferior al 0,1% en peso.
El procedimiento de purificación de la presente invención utiliza la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) que elimina el volumen de moléculas contaminantes endógenas y exógenas como las proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos de forma más eficiente que los procedimientos conocidos y da como resultado un producto final que contiene CM101 pura al 10-50%. En tan sólo una etapa de contacto del material de inicio GBS con la resina HIC, con lo que se consigue purificar el material inicial unas 100-500 veces.
La utilización de una resina HIC para la purificación de un polisacárido es sorprendente y novedosa porque las columnas de HIC están diseñadas para la purificación de proteínas hidrofóbicas y no se pensó que fueran útiles para obtener polisacáridos sin proteínas y lípidos. Los polisacáridos se caracterizan generalmente por ser hidrofílicos debido a sus numerosos grupos hidroxilo. La aplicación de un material de partida a una columna HIC en las condiciones recomendadas por el fabricante y su utilización por los expertos en la materia debería en consecuencia realizarse con la intención de retener proteínas y permitir a los polisacáridos que pasen a través de la columna sin unirse a ésta.
El descubrimiento sorprendente estriba en que CM101 tiene propiedades hidrofóbicas que permiten utilizar el esquema de purificación de la presente invención para lograr un nivel de pureza elevado. Especialmente sorprendente es que CM101 tiene características significativamente más hidrofóbicas que la mayoría de proteínas y los polisacáridos presentes en el sobrenadante a partir de donde se aísla CM101. Más del 98% de estas proteínas y polisacáridos contaminantes pasan a través de la columna HIC. Aunque la resina HIC se utiliza generalmente en una columna HIC, esta etapa puede realizarse alternativamente contactando con la resina y con el material de inicio de alguna otra manera. Por ejemplo, la fuente GBS y la resina pueden colocarse juntos en un recipiente en un proceso discontinuo y a continuación separarse mediante centrifugación la porción que contiene la toxina de la resina.
Se pueden incluir etapas adicionales de purificación, como una extracción fenol/salina en un volumen pequeño relativo a los procedimientos anteriores (aproximadamente reducidos unas 1000 veces) y una columna de intercambio iónico. Estas etapas de purificación adicionales contribuyen a obtener un producto final con una pureza superior al 95%.
La HIC es un procedimiento utilizado para separar proteínas, como por ejemplo proteínas de membrana, según su naturaleza hidrofóbica. Una resina HIC se define como una resina que tiene grupos hidrofóbicos interactivos que generalmente están unidos covalentemente a un soporte, de modo que los grupos hidrofóbicos son libres de interactuar con sustancias en contacto con la resina. Ejemplos de grupos hidrofóbicos incluyen los grupos alquil, alcoxil y aril. La resina HIC preferida para utilizar de acuerdo con la presente invención tiene un soporte con grupos alifáticos unidos de dos o más carbonos, preferentemente grupos alquil en el intervalo de 2 a 12 carbonos y más preferentemente grupos butil normales o ramificados. Los grupos fenil o alcoxil de hasta 20 carbonos también son grupos hidrofóbicos interactivos preferidos. Los grupos hidrofóbicos interactivos están unidos preferentemente a soportes de Sepharose (Pharmacia), acrilamida (Toso Haas, Montgomeryville, PA), o sílice. De acuerdo con el procedimiento estándar de utilización de una columna HIC, el material de inicio que contiene la proteína de interés se aplica a la columna en una solución acuosa con una concentración salina de hasta 2 M y las proteínas unidas se eluyen y separan mediante disminuciones de las interacciones hidrofóbicas al reducir la fuerza iónica del tampón de revelado. También pueden utilizarse cambios de pH y/o temperatura para alterar las interacciones hidrofóbicas.
La purificación de CM101 de Streptococcus del Grupo B requiere un cultivo bacteriano de GBS. El inóculo de bacterias se incuba más allá de la fase logarítmica en medio Todd Hewitt (THB) modificado por suplementación con 2 g/l o más de glucosa y Na_{2}HPO_{4}. Tal como se indica en la Fig. 1, el cultivo se autoclava a continuación. CM101 está presente en el sobrenadante del cultivo de fermentación de GBS a una concentración de 2-15 mg/l después de su autoclavado. El medio contiene aproximadamente 15 g/l de otros componentes bacterianos y del medio. En consecuencia, CM101 constituye aproximadamente el 0,01-0,1% de los componentes en el sobrenadante. Después de autoclavar el medio, éste se filtra. Y el filtrado se concentra preferentemente mediante un filtro de corte de 10.000 daltons (10 KD), aunque también puede utilizarse un filtro con un corte de 50.000 daltons (50 KD) o menos.
A continuación, se purifica CM101 de acuerdo con la presente invención, tal como se muestra en la Fig. 1, aplicando un concentrado de sobrenadante o un precipitado con alcohol reconstituido en 0,75-2 M de fosfato potásico u otra sal, como el fosfato sódico, sulfato sódico o potásico, cloruro o acetato, a una columna de HIC equilibrada preferentemente en la misma sal y con la misma molaridad. Es preferible el procedimiento en donde el material de inicio del concentrado del medio, o el 10KD-50KD, se utiliza sin precipitación con alcohol, porque el material de inicio del concentrado del medio proporciona un rendimiento superior de CM101 que el precipitado con alcohol reconstituido.
El material de inicio que contiene CM101 se aplica a una columna de HIC y se lava con fosfato acuoso a 0,75-2 M. Después de un lavado con 0,75-2M, la columna se revela con sal 0,5-1 M y luego con 0,25 M, preferentemente de una sal de fosfato. En la realización preferida, CM101 se eluye de la columna con agua como un pico único que contiene CM101 al 10-50%. Alternativamente, se reemplaza el agua para la elución de CM101 de la columna de HIC con fosfato 10 mM, pH 6,8 en etanol al 10% en agua (Tampón A), seguido por etanol al 20% en agua. La actividad de CM101 se recupera en el tampón A y en las fracciones de etanol al 20%. La utilización del tampón A no es generalmente suficiente para eliminar toda la CM101 de la columna de HIC, por lo que después del lavado con tampón A se prosigue con un lavado adicional de etanol al 20%. Aunque, a mayor escala, el etanol es una sustancia tóxica para el medio ambiente así como la consiguiente extracción fenol/salina del pico acuoso o del tampón A y de las fracciones del pico de etanol al 20%, al final se produce CM101 de aproximadamente igual pureza. El procedimiento HIC elimina más del 98% de proteínas y polisacáridos del medio que permanecían en el concentrado 10K o en el precipitado de alcohol reconstituido.
La CM101 enriquecida de la columna HIC puede además purificarse mediante extracción con fenol y una solución salina acuosa, preferentemente solución salina 0,05 M. Esta etapa adicional proporciona una fracción de CM101 de aproximadamente el 95% de pureza.
El agua o el tampón A combinado y las fracciones de etanol al 20% eluidas de la columna HIC se dializan contra agua y se liofilizan y reconstituyen en solución salina 0,05 M, o se dializan contra una solución salina después de concentrarse. En general, se añade fenol al material y la solución se calienta rápidamente a 70-80ºC. Cuando se ha formado una sola fase, la solución se enfría a 4ºC. La fase salina resultante de la extracción fenol/salina contiene CM101, por lo que a continuación puede aplicarse a una columna de intercambio catiónico, como la DEAE.
Para el procedimiento de la columna de DEAE, en primer lugar la columna de DEAE se equilibra con agua y luego se lava con solución salina 0,1 M, NaOAc 0,05 M, pH 7,4 y se revela con un gradiente de NaCl 0,34 M. La elución de CM101 se controla y cuantifica con un ensayo ANA-1. Al igual que con la etapa de la resina de HIC, una resina de intercambio iónico puede contactarse con el material que contiene la toxina gracias a la utilización de un equipo distinto al de la columna. A continuación, la fracción que contiene CM101 se dializa con agua y se liofiliza. Después de las etapas de extracción fenol/salina y de intercambio iónico, CM101 tiene una pureza superior al 95%.
Los eluidos de la columna, o el material resultante de las etapas de contacto con la resina, se analizan para su actividad biológica con ANA-1 y/o el ensayo de transferencia de mancha ("dot blot" en inglés). La actividad biológica se confirma a continuación con un ensayo en ovejas. La Tabla 1 muestra varias separaciones de material PA 10 K obtenido a partir de lotes distintos de materiales de partida y aplicados a la columna HIC. La eliminación de la proteína desnaturalizada y de los polisacáridos del medio y otros materiales es similar.
Aunque el orden preferido de purificación es realizar primero la etapa de HIC seguida por la de extracción fenol/salina y luego la etapa de intercambio iónico, la purificación puede también realizarse en otro orden.
La Fig. 2 presenta un ejemplo de un procedimiento conocido de purificación CM101. Se utiliza una etapa de precipitación con etanol al 70%, seguida a continuación de una extracción con fenol/agua. Los volúmenes grandes de etanol y fenol que se requieren en estas etapas tempranas del procedimiento de purificación conocido representan prácticas tóxicas para el medio ambiente. El procedimiento representado en la Fig. 2 también requiere una columna de intercambio iónico, una columna de filtración en gel y una columna de lentejas de lectina.
El procedimiento anterior contiene numerosas etapas, incluyendo las tóxicas para el medio ambiente. Por otra parte, el procedimiento de la presente invención es efectivo, proporciona una pureza superior y de 2 a 25 veces más de rendimiento al mismo tiempo que minimiza la utilización de materiales tóxicos para el medio ambiente.
La etapa de extracción con fenol-agua tóxica para el medio ambiente se redujo 1000 veces comparada con los procedimientos utilizados con anterioridad. Además, se eliminó la purificación adicional, por ejemplo la del procedimiento de filtración en gel. También se eliminó la etapa de cromatografía de lentejas de lectina del procedimiento anterior. El producto final de las etapas de la columna HIC, extracción fenol/salina y columna de intercambio iónico tiene aproximadamente una pureza del 95%, por lo que otros tratamientos son innecesarios.
La CM101 purificada por el procedimiento de la presente invención puede utilizarse para la investigación o con fines terapéuticos. CM101 es especialmente útil cuando se combina con un vehículo aceptable farmacéuticamente, p.ej., reconstituida en solución salina y administrada a un paciente intravenosamente. También pueden ser útiles otras formas de dosificación para administrar CM101 purificada. La composición farmacéutica de la presente invención comprende la toxina GBS esencialmente pura de la presente invención en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente. En general, el vehículo será uno que pueda mezclarse rápidamente con la toxina para formar una composición que sea administrable intravenosamente (i.v.). Por ello, el vehículo es preferentemente agua, pudiendo incluir otros excipientes aceptables farmacéuticamente para asegurar su adecuación para la administración intravenosa. La composición resultante será estéril y tendrá propiedades osmóticas aceptables. En general, una formulación i.v. adecuada se prepara de acuerdo con técnicas estándares conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, capítulo 85 titulado "Intravenous Admixtures" por Salvatore J. Turco en la 18ª edición de Remington's Pharmaceutical Sciences, Mach Publishing Co. (1990), incorporado como referencia, proporciona técnicas estándares para la preparación de una composición i.v. aceptable farmacéuticamente y de utilidad de acuerdo con la presente
invención.
Adicionalmente, un paciente que tiene una enfermedad que responda ventajosamente a CM101 puede tratarse con una composición farmacéutica de la presente invención. Por ejemplo, un paciente que tenga un tumor podría tratarse ventajosamente mediante administración intravenosa de la composición farmacéutica de la presente invención. La patente americana U.S. 5.010.062 describe el tratamiento de ciertos tumores en humanos y se incorpora aquí como referencia.
Análisis cuantitativo y cualitativo Análisis por HPLC
La pureza y la cantidad de CM101 obtenida de una muestra después de la cromatografía de HIC se determinó mediante análisis de filtración en gel en una cromatografía líquida de alta presión (HPLC). La columna de filtración en gel se equilibra generalmente con acetonitrilo al 10% y agua y la CM101 se eluye activa biológicamente como un pico estrecho y homogéneo. Alternativamente, se puede utilizar el tampón fosfato 10 mM, pH 8,4 que produce picos más estrechos. También se puede utilizar tampón de acetato (NH_{4}OAc), pH 8,4 como una alternativa al tampón fosfato
10 mM.
Una respuesta de detección característica (absorción UV 203), utilizando 30, 50 y 100 \mug de estándares de CM101 pura inyectados en 100 \mul de tampón de revelado en una columna de Hydragel 1000 (Waters, Millford, MA) corresponde a 26x10^{6}, 48x10^{6} y 97x10^{6} unidades por área, respectivamente, lo que produce una curva-respuesta para la cuantificación de las muestras desconocidas.
El peso molecular de CM101 puede también cuantificarse mediante cromatografía en gel filtración. Un tampón no-desnaturalizante como el acetonitrilo, el fosfato, o los tampones de acetato de amonio anteriores se utilizan para migrar la columna. La elución de CM101 se comparó con la de los marcadores estándares de polisacáridos de dextrano de distinto peso molecular. En estas condiciones, CM101 tiene un peso molecular de aproximadamente 300.000 Daltons.
Análisis de aminoácidos
El análisis cuantitativo y cualitativo automatizado de los aminoácidos puede realizarse con un equipo disponible comercialmente, p.ej., PicoTag, disponible de Waters, Millford, MA.
Ensayo ANA-1
Para monitorizar la actividad biológica de las distintas etapas de fermentación y purificación, se puede utilizar un ensayo in vitro que emplea una línea celular de macrófagos de ratón transformados. Los ensayos cuantifican la producción de IL-6 de los macrófagos de ratón ANA-1 en respuesta a la exposición a CM101.
En particular, CM101 induce la respuesta in vitro de la línea celular ANA-1 de macrófagos de médula ósea murina araf/myc transformados a producir IL-6. También se pueden utilizar otras células de tipo macrófago y leucocitos de sangre periférica frescos.
Para realizar el ensayo ANA-1, en primer lugar se diluyeron las muestras a un volumen adecuado (dependiendo del grado de actividad esperada de CM101) y se analizaron de cuatro a ocho concentraciones a diluciones 1:4. Se generó una curva estándar de CM101 utilizando CM101 de grado clínico reconstituido en PBS. Después de añadir las células, se realizó una solución de 4000 ng/ml, correspondiendo con una concentración final de 2000 ng/ml en PBS, junto con las seis diluciones seriadas 1:2. Se pueden utilizar las células a una concentración de 2x10^{6}/ml. Por ejemplo, la sensibilidad del ensayo se incrementó añadiendo 200 U/ml de IFN-\gamma murino a las células ANA-1. Los cultivos finales fueron de 100 U/ml de IFN-\gamma.
La placa de microtitulación con los cultivos debería colocarse a 37ºC, en un incubador humidificado, con CO_{2} al 5% y durante la noche (16-18 horas) y luego proseguirse con un ensayo ELISA para IL-6 (R.D. Systems. Minneapolis, MN). A continuación, los sobrenadantes de los cultivos se transfieren a la placa de ensayo de IL-6 y ésta se mantiene a 4ºC hasta finalizar el ensayo de IL-6.
Ensayo de transferencia de mancha
Un procedimiento rápido y alternativo para detectar cuantitativamente CM101 en soluciones o fluidos biológicos es transferir muestras sobre membranas de polivinilidin difluoruro (PVDF) en diluciones seriadas. La cantidad de CM101 se cuantifica utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón marcado con fluorescencia dirigido contra CM101 o un anticuerpo monoclonal de ratón contra CM101, seguido por una IgG anti-ratón marcada con fluorescencia. El anticuerpo 7A3 dirigido contra el antígeno CM101 es de utilidad para este propósito. Las cantidades de CM101 en las distintas fracciones se determinan mediante comparación con una curva estándar de CM101 diluida seriadamente.
Ensayo de la presión arterial pulmonar en ovejas
La toxina afecta a los pulmones de las ovejas al incrementar la hipertensión arterial, lo que se manifiesta por un aumento de la presión arterial pulmonar y de la permeabilidad vascular del pulmón.
Las muestras de CM101 en tampón fosfato salino (PBS) pueden administrarse a los corderos mediante infusión y a continuación se registran los cambios en la presión arterial a intervalos de 15 minutos. Estos cambios en la presión se correlacionan con la actividad de CM101. Hellerqvist C.G. y col., Studies on group B \beta-hemolytic streptococcus I. Isolation and partial characterization of an extra-cellular toxin, Pediatr. Res., 15:892-898 (1981)).
Análisis de azúcares
Una cantidad de 100 \mug de una muestra se hidrolizó durante 2 horas a 100ºC en una mezcla de ácido trifluoroacético (TFA), ácido acético (HOAc) y agua en una proporción de 5:70:25. La solución se evaporó y la muestra se hidrolizó posteriormente durante dos horas a 100ºC en una mezcla de TFA y agua en una proporción de 2:8. Este proceso hidroliza completamente todas las uniones glicosídicas en la muestra. También se eliminaron los grupos N-acetil presentes en los amino-azúcares.
Las muestras se analizaron a continuación con el sistema de análisis de azúcares de Dionex utilizando un detector PAD (Pulsed Amperometric Detection). La resolución se muestra en la Fig. 4.
La pureza de la muestra se determinó mediante análisis cuantitativo y cualitativo de los azúcares. El principio se muestra en las Figs. 3 y 4. Una muestra de polisacáridos cuantificada por HPLC se suplementa con un estándar interno 6-desoxi-D-glucosa, se hidroliza y se analiza. El procedimiento descrito en esta sección proporciona una respuesta a la dosis lineal en el intervalo analizado. El análisis cualitativo se logra comparando los tiempos de retención de las muestras a analizar con los estándares.
Ejemplos Ejemplo 1 Un esquema de purificación a gran escala para CM101
Se utilizó un aislado de la solución de trabajo de serotipo III de Streptococcus del Grupo B junto con un fermentador de 3.000 galones. Se utilizó un inóculo de 25 ml del cultivo bacteriano para un recipiente de 80 l con un volumen de trabajo (vtl) de 65 litros y éste a su vez se utilizó para inocular un recipiente de 750 vtl y éste para inocular por último un fermentador de 7500 vtl (3.000 galones). Alternativamente, el 65 vtl se puede utilizar para inocular directamente el fermentador de 7500 vtl.
Los cultivos se finalizaron en la fase logarítmica tardía mediante autoclavado. A continuación, se eliminaron las bacterias mediante centrifugación continua a 10.000 g, y filtración en un casete de 0,45 micras (Millipore Corporation, Bedford, MA).
El sobrenadante del cultivo resultante se concentró 15 veces a través del casete de filtración utilizando un nivel de corte de 10 KD a 50 KD (Millipore) para 500 litros. El material concentrado se llevó a continuación a una concentración en sal de 2 M, preferentemente con fosfato sódico pH 7,4 (tampón de carga) mediante diálisis.
El sobrenadante concentrado se sometió a una cromatografía de interacción hidrofóbica, mediante la utilización de una columna de 60 litros de n-butil Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Suecia) utilizando un sistema BioPilot (Pharmacia). La capacidad de la resina n-butil Sepharose para la actividad biológica de CM101 en el concentrado del medio sin paso de actividad es aproximadamente de 80 litros de medio por cada litro de resina. Después de cargar el sobrenadante concentrado en la columna, ésta se lava con el tampón de carga, luego con tampón fosfato 0,5-1 M y después con tampón fosfato 0,25 M, pH 7,4. La fracción que contiene CM101 se eluye con agua en aproximadamente 120 litros o dos volúmenes de columna y se concentra hasta 2 litros en un casete de nivel de corte de 10 KD a 50 KD. La elución de la columna se controla mediante un programa preestablecido en el BioPilot y el eluido se controla mediante absorción UV a 206 y 280 nm, conductividad y pH.
La fracción de 2 litros que contiene CM101 se dializa contra solución salina 0,05 M, pH 7,0 y luego se calienta a 75-80ºC y se añaden 0,2-2 litros de fenol. La mezcla se calienta a continuación a 80ºC y se mantiene a dicha temperatura durante 5 minutos. A continuación, la mezcla se enfría a 4ºC. La fase acuosa resultante de esta etapa se extrae preferentemente dos veces con 0,2 volúmenes de cloroformo antes de su aplicación a la columna de DEAE Sephacel FF (Pharmacia, Uppsala, Suecia) equilibrada con agua. La columna se lava con solución salina 100 mM, NaOAc 0,05 M, pH 7,4 y el material activo biológicamente, CM101, se eluye de la columna de DEAE con un gradiente de NaCl. La actividad biológica se detecta mediante un ensayo de IL-6 y análisis por HPLC. La calidad de CM101 purificada por este procedimiento se determina mediante HPLC y el análisis de azúcares, así como ensayos de actividad biológica mediante ensayos de IL-6 y ensayos con ovejas.
Este esquema de purificación a gran escala proporciona la ventaja de evitar el procedimiento de extracción fenol-agua en gran volumen del precipitado por alcohol utilizado en el procedimiento anterior.
Resultados
Las Figs. 5a-b muestran perfiles de elución de un concentrado del medio en una columna de butil-Sepharose HIC en K_{2}HPO_{4} 2 M, pH 7,2. Los diversos picos son el resultado de cambios paulatinos producidos en el gradiente de elución. La Fig. 5a representa el perfil cuantificado a una absorbancia UV 206, que cuantifica las fracciones de los picos para el material orgánico total y muestra CM101 en el último pico estrecho (aproximadamente a los 383 minutos). La Fig. 5b representa el perfil cuantificado a una absorbancia UV 280, que cuantifica la cantidad de proteína en las distintas fracciones.
Durante la etapa de la columna HIC, CM101 se une a la columna mientras que hasta un 99,7% de proteína y hasta el 98,5% de los polisacáridos neutros y cargados pasan a través de ella, tal como se indica en la Tabla 1.
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TABLA 1
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1
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En la Tabla 1 se muestran los resultados de someter lotes de fermentación distintos: los precipitados por alcohol (PA), PA1, PA2 y PA6 y los concentrados 10K a una cromatografía HIC, y de eluirlos con agua o tampón A. Ambos procesos rindieron aproximadamente la misma eficacia de eliminación de proteína exógena y endógena (UV 280 nm) y de polisacáridos y orgánicos generales (UV 206).
Las Figs. 6a-b presentan un perfil HPLC y un espectro de Rayos diódicos de una fracción eluida en agua y purificada por HIC que contiene CM101 y se monitoriza a una absorbancia UV 203. Estas figuras muestran la presencia mínima de la absorbancia a 260 (RNA y DNA) y a 280 para el pico que contiene CM101.
Después de someter la fracción HIC a la extracción fenol/salina y a las etapas de intercambio iónico, se mejoró la pureza del pico eluido con agua de la HIC, tal como se observa en las Figs. 7a-b. Se ha de remarcar el pico simétrico estrecho a aproximadamente 16 minutos del tiempo cero y de la falta de absorbancia a 260 (RNA/DNA) y 280 (proteína). Para los perfiles de elución que se muestran en las Figs. 6a-b y 7a-b, se realizó una HPLC con acetonitrilo al 10% en agua, siendo la velocidad de flujo de aproximadamente 0,3 ml/min.
Estos perfiles de elución, así como la actividad biológica son similares a los obtenidos cuando se utiliza el precipitado por alcohol como material de partida para la columna de HIC.
En la Fig. 8, se muestra la capacidad de las fracciones de HIC del material de inicio 10K para inducir la síntesis de IL-6 en las células ANA-1. La cromatografía HIC proporcionó una recuperación de aproximadamente el 50% de toda la actividad biológica en el sobrenadante del medio, según se cuantificó por un ensayo ANA-1. Los ensayos de transferencia de mancha del mismo material que muestra inmunoreactividad en presencia del antígeno CM101 se utilizaron para confirmar los resultados del ensayo ANA-1.
Las fracciones distintas obtenidas del concentrado 10K después de la cromatografía HIC también se utilizaron en el modelo de ovejas para la actividad biológica. La actividad de CM101 se determinó según una curva de dosis-respuesta utilizando el CM101 de grado clínico actual (1 unidad de actividad corresponde a 7,5 \mug/Kg). Los resultados se muestran en la Tabla 2, en donde se comparan los fraccionamientos de HIC del precipitado por alcohol (PA) y del concentrado del medio (10K).
TABLA 2
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2
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La actividad biológica de CM101, purificada por el procedimiento de la presente invención también se cuantificó con el ensayo de la presión arterial pulmonar en las ovejas y luego se comparó con la actividad de CM101 purificada por el procedimiento antiguo, por ejemplo, tal como se indica en la patente americana U.S. 5.010.062. El material purificado de acuerdo con la invención presentó una actividad específica de dos o tres grados superior al material que se purificó mediante el proceso antiguo, es decir, que no se había puesto en contacto con la resina HIC.
También se pone en evidencia el rendimiento de producto del procedimiento de la presente invención, dado que los procedimientos conocidos hasta ahora proporcionan aproximadamente 300 \mug de CM101 por litro de volumen de fermentación, según se compara con el valor de 7.520 \mug/l mostrado más arriba.
La CM101 purificada que se muestra en las Figs. 7a-b obtenida por el procedimiento de la presente invención también se sometió al análisis de azúcares. Los rendimientos de azúcares se muestran en la Fig. 9.
Cuantitativamente, la CM101 obtenida por el procedimiento de la presente invención tiene una pureza de carbohidratos superior al 95% y contiene al menos un 5% de proteína cuantificada cuantitativa y cualitativamente tal como se presentó anteriormente y mediante el análisis automatizado de aminoácidos (Pico Tag, Water, Millford, MA).
Ejemplo 2 Comparación del grado clínico actual y de la nueva composición
La CM101 obtenida por el procedimiento de la presente invención ha mejorado el actual grado clínico de CM101. En particular, el perfil de elución por HPLC de la Fig. 10 comparado con el de la Fig. 7a muestra una pureza superior en la muestra producida de acuerdo con la presente invención. La Fig. 7a muestra un pico principal estrecho y simétrico, en lugar de varios picos.
Para demostrar la utilización ventajosa de la columna de HIC y para proporcionar evidencias de la purificación de la toxina conocida como CM101, se sometió CM101 de grado clínico a una columna de HIC y se realizó una purificación por HPLC y un análisis de azúcares. Los resultados, mostrados en la Fig. 11, pueden compararse con los de la Fig. 9. El análisis de azúcares muestra productos finales similares tanto cuantitativa como cualitativamente y demuestra que el proceso de cromatografía por HIC elimina los azúcares no relacionados con la CM101 activa biológicamente. Este resultado se muestra también en la Tabla 3.
TABLA 3
3
La tabla de residuos de azúcares presentada anteriormente ofrece aproximadamente proporciones molares. Los residuos concretos de CM101 purificada de acuerdo con el procedimiento de la presente invención (la primera columna) se hallan en un intervalo de (0,2-1 manosa): (2,5-3,5 galactosa):(0,5-1 glucosa):(1 N-acetil glucosamina):(0,5-1 N-acetil galactosamina). Los números están normalizados para la N-acetil glucosamina, por lo que la N-acetil glucosamina se ha fijado en 1.
Para establecer una comparación, las Figs. 12a-b muestran perfiles de HPLC de CM101 producidos por el antiguo procedimiento (Fig. 12a) y de acuerdo con el procedimiento de la presente invención (Fig. 12b). La columna de filtración en gel (Ultragel 100, Waters, Milford, MA) se desarrolló en tampón fosfato 10 mM, pH 8,4. Tal como se observa en la Fig. 12b, el CM101 purificado de acuerdo con el procedimiento de la invención se eluye en un pico relativamente estrecho durante un intervalo de aproximadamente 5 minutos. El tiempo de elución es de aproximadamente 24 minutos a partir del tiempo 0 con una velocidad de flujo de 0,3 ml/min. Por el contrario, el material purificado por el procedimiento antiguo se eluye en un pico ancho durante aproximadamente 12 minutos.
Ejemplo 3 Análisis de CM101 por SDS-PAGE/transferencia de Western
La electroforesis en gel de poliacrilamida y sodio dodecil sulfato se realizó utilizando un gel de gradiente del 4-20%. Las muestras de CM101 se incubaron en un tampón de SDS al 2%, Tris-HCl 0,5 M, glicerol al 5%, azul de bromofenol al 0,05% y \beta-mercaptoetanol al 5% a pH 8,0, a 55ºC durante 10 minutos y se aplicaron a un gel apilante del 4% en un gel de SDS-PAGE del 4 al 20%. A continuación, las muestras se migraron en el gel a 200 voltios durante 90 minutos.
El gel se reveló en un tampón de transferencia de western (Tris 25 mM, glicina 192 mM y metanol al 20%) y se transfirió a 100 Voltios durante 2 horas. El gel se bloqueó con leche desnatada al 5% en PBS a temperatura ambiente durante 1 hora y se lavó dos veces con un tampón de unión (BBT, compuesto de tampón fosfato salino, suero bovino fetal al 2% y el detergente Tween-20), luego se incubó 1 hora con 10 \mug/ml de 7A3 (anticuerpo monoclonal anti-CM101).
El gel se incubó 4 veces durante 10 minutos con BBT y se incubó con el anticuerpo anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina durante 45 minutos, se lavó 4 veces con BBT y se reveló con el revelador Pierce Single-Step PA durante 50 minutos.
El análisis de transferencia de Western del SDS-PAGE sugiere que CM101 tiene un componente de 26.000 daltons o un múltiplo de éste cuando se analiza en estas condiciones.
Por ello, el procedimiento de la presente invención proporciona un procedimiento mejorado de purificación que minimiza la dificultad de las etapas tóxicas y proporciona una pureza excelente. Además, el producto producido por el procedimiento de la presente invención está mejorado respecto a la CM101 disponible en la actualidad.
Todas las publicaciones y las solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación se han incorporado aquí como referencias.

Claims (17)

1. Procedimiento de purificación de una toxina de polisacáridos de la bacteria Streptococcus \beta-hemolítico del grupo B(GBS), el cual comprende:
(a)
poner en contacto una mezcla acuosa que contiene la toxina con una resina de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) y
(b)
separar la toxina de la resina de HIC.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la pureza de la toxina procedente de la etapa de separación de la toxina de la resina HIC se aumenta aproximadamente 100-500 veces en relación con la pureza de la toxina en la mezcla acuosa.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende además la extracción de la toxina con una mezcla acuosa de fenol para formar una fase acuosa que incluye la toxina.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, 2 o 3 que además comprende:
(a)
poner en contacto la toxina con una resina de intercambio iónico y
(b)
separar la toxina de la resina de intercambio iónico.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la etapa (b) es una etapa de elución de la columna de HIC para obtener un eluido de HIC que incluye la toxina, que es seguido de:
(c)
extraer el eluido HIC con una combinación de fenol y una solución acuosa para formar una fase acuosa que incluye la toxina,
(d)
aplicar la fase acuosa a una columna de intercambio iónico,
(e)
eluir la columna de intercambio iónico para obtener un eluido de intercambio iónico, en donde el eluido del intercambio iónico comprende una toxina esencialmente pura.
6. Toxina de polisacáridos de la bacteria Streptococcus \beta-hemolítico del grupo B (GBS) purificada por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
7. Toxina de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la toxina tiene además un peso molecular de aproximadamente 300.000 daltons tal como se cuantifica por cromatografía de filtración en gel en condiciones no desnaturalizantes e incluye residuos de azúcares de manosa, galactosa, glucosa, N-acetil glucosamina y N-acetil galactosamina en una proporción molar de (0,2-1 de manosa):(2,5-3,5 de galactosa):(0,5-1 de glucosa):(1 de N-acetil glucosamina):(0,5-1 de N-acetil galactosamina).
8. Toxina de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7 para utilizar en un procedimiento de terapia.
9. Toxina de acuerdo con la reivindicación 6, 7 u 8, en donde la toxina tiene una actividad específica aproximadamente dos o tres veces mayor que la actividad específica de la toxina de GBS que no se ha puesto en contacto con una resina HIC, según se cuantificó mediante un ensayo para aumentar la presión arterial pulmonar en ovejas.
10. Composición que consiste esencialmente en una toxina de polisacáridos de la bacteria Streptococcus \beta-hemolítico del grupo B (GBS), en donde la toxina es al menos 60% pura.
11. Composición de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la toxina es al menos aproximadamente un 90% pura.
12. Composición de la reivindicación 10 u 11, en donde la toxina incluye residuos de azúcar de manosa, galactosa, glucosa, N-acetil glucosamina y N-acetil galactosamina en una proporción molar de (0,2-1 manosa):(2,5-3,5 galactosa):(0,5-1 glucosa):(1 N-acetil glucosamina):(0,5-1 N-acetil galactosamina).
13. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en donde la toxina tiene un peso molecular de aproximadamente 300.000 daltons según se cuantificó por cromatografía de filtración en gel en condiciones no desnaturalizantes.
14. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en donde la toxina se eluye en un pico simétrico estrecho, que se cuantifica a una absorbancia de 203 nm a aproximadamente 16 minutos desde el tiempo cero cuando se analiza por HPLC en un tampón de acetonitrilo al 10% con una velocidad de flujo de aproximadamente 0,3 ml/minuto.
15. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en donde la toxina se eluye en un pico simétrico estrecho que se cuantifica a una absorbancia de 203 nm a aproximadamente 24 minutos desde el tiempo cero cuando se analiza por HPLC en un tampón fosfato 10 mM, pH 8,4.
16. Composición farmacéutica que comprende la toxina de polisacáridos de la bacteria Streptococcus \beta-hemolítico del grupo B (GBS) y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde la toxina es al menos un 60% pura.
17. Procedimiento de preparación de una composición farmacéutica de utilidad para el tratamiento de una enfermedad, en particular un tumor, en donde el procedimiento comprende combinar la composición de cualquiera de las reivindicaciones 10-15 con un vehículo aceptable farmacéuticamente.
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