ES2235228T3 - Procedimiento de purificacion de la toxina cm 101 del grupo gbs. - Google Patents
Procedimiento de purificacion de la toxina cm 101 del grupo gbs.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE PURIFICACION DE UN POLISACARIDO DE LAS BACTERIAS DE TIPO STREPTOCOCCUS- BE HEMOLITICO DEL GRUPO B (GBS). DICHO PROCEDIMIENTO CONSISTE EN PONER EN CONTACTO UNA MATERIA DE FERMENTACION BACTERIANA CON UNA RESINA DE CROMATOGRAFIA DE INTERACCION HIDROFOBA (HIC). OTRAS ETAPAS ADICIONALES PUEDEN INCLUIR UNA EXTRACCION EN FENOL/SALINA Y UNA CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO. DICHO PROCEDIMIENTO ORIGINA UN PRODUCTO DE ELEVADA PUREZA. EL PRODUCTO DE LA PURIFICACION PROPORCIONA UNA COMPOSICION QUE ES MUY UTIL, TANTO EN INVESTIGACION COMO EN EL CAMPO TERAPEUTICO.
Description
Procedimiento de purificación de la toxina CM101
del grupo GBS.
Esta invención hace referencia a los
procedimientos mejorados de purificación de un polisacárido
CM101, una toxina de GBS, es una molécula
patogénica aislada de la bacteria Streptococcus del grupo
\beta-hemolítico (GBS). Los recién nacidos pueden
infectarse con GBS, enfermedad conocida como la neumonía por GBS o
"infección de aparición temprana" y padecer sepsis,
granulocitopenia e insuficiencia respiratoria, es decir,
hipertensión pulmonar y edema pulmonar de origen proteico
(Hellerqvist C.G. y col., Studies on group B
\beta-hemolytic streptococcus I. Isolation and
partial characterization of an extra-cellular
toxin., Pediatr. Res., 12:892-898 (1981)).
A pesar de los efectos perjudiciales en los
neonatos expuestos a GBS, no se sabe si CM101 causa toxicidad en
edades superiores. De hecho, la investigación de esta toxina ha
puesto de manifiesto una aplicación terapéutica significativa.
Véase la patente U.S. 5.010.062 y Hellerqvist, C.G. y col., Early
Results of Phase I Trial of CM101 in Cancer Patients,
Proceedings of the American Association of Cancer Research Annual
Meeting (1995), en donde CM101 se utilizó para inhibir la
vascularización de los tumores. Por ello, la obtención de CM101
purificada es crítica tanto para la investigación como para fines
terapéuticos.
CM101 es una toxina de polisacáridos compleja que
tiene un peso molecular de aproximadamente 300.000 daltons y
contiene residuos de
N-acetil-galactosamina,
N-acetil-glucosamina, glucosa,
galactosa y manosa. Los resultados de RMN (resonancia magnética
nuclear) sugieren que los residuos alditol también pueden estar
presentes. También se cree que los grupos funcionales de ácido
carboxílico, probablemente el ácido galacturónico, son también parte
integrante de la molécula. Los epitopos activos repetidos
desempeñan probablemente un papel importante en la respuesta
patofisiológica a CM101 al conectar los receptores con el endotelio
diana (Hellerqvist., C.G. y coll., Early Results of Phase I
Trial of CM101 in Cancer Patients, Proceedings of the American
Association of Cancer Research Annual Meeting (1995); DeVore, R.F.,
y col., A Phase I Study of the Antineovascularization Drug
CM101, J.Clin.Can. Res., 3:365-372 (1997)).
La patente americana U.S. 50.10.062 proporciona
un procedimiento de purificación de una toxina de GBS. El
procedimiento que se muestra en dicha patente es laborioso y además
requiere numerosas etapas, lo que implica una pérdida continua de
actividad biológica.
La purificación de CM101 tal como se conoce
actualmente en la materia proporciona un material final con sólo una
pureza del 40%, cuantificada por análisis químicos y ensayos
biológicos. El otro 60% corresponde a polisacáridos de levaduras y
plantas y a polisacáridos de bacterias endógenas. Los contaminantes
de plantas y levaduras provienen en su mayoría de los aditivos de
los medios de cultivo comerciales utilizados para el crecimiento
óptimo de la bacteria GBS. Los contaminantes endógenos incluyen los
polisacáridos de GBS, incluyendo los antígenos específicos de grupo
y tipo (Paoletti, L.C. y col., Neonatal mouse protection against
infection with multiple group B streptococcal (GBS) serotypes by
maternal immunization with a tetravalent GBS
polysacharide-tetanus toxoid conjugate vaccine,
Infect. Immn. 62(8).3236-43 (1994); Micho,
F., Multiantennary group-specific polysaccharide
of Group B Streptococcus, Biochem., 27:5341-51
(1988)). La CM101 de este nivel de pureza del 40% representa el
grado clínico actual. Es necesario, por lo tanto, un procedimiento
de purificación de CM101 que dé como resultado un producto final
con una pureza global superior, preferentemente gracias a la
eliminación de polisacáridos foráneos de plantas y levaduras y de
los polisacáridos antigénicos de GBS.
Adicionalmente, el esquema de purificación
conocido en la materia incluye etapas contaminantes del medio
ambiente, como lo son la utilización de un gran volumen de fenol en
una extracción fenol:agua. El fenol es un material cáustico bien
conocido.
En consecuencia, los objetivos de la presente
invención son proporcionar un procedimiento de purificación que dé
como resultado (i) un material de alta pureza, (ii) utilizando un
número de etapas mínimo, (iii) minimizando la utilización de
materiales cáusticos o tóxicos como el fenol y (iv) aumentando el
rendimiento del producto final.
Los objetivos anteriores se han logrado con la
invención que aquí se describe. En particular, un esquema de
purificación que incluye una resina de cromatografía de interacción
hidrofóbica (HIC) para la purificación de CM101 a partir del medio
de cultivo bacteriano de GBS y que proporciona un producto con una
pureza mínima del 60%.
Un aspecto de la presente invención es un proceso
para la purificación de una toxina de polisacáridos de la bacteria
GBS, en donde el proceso incluye la utilización de una resina HIC.
La presente invención también incluye una toxina de polisacáridos
pura de la bacteria GBS producida por el procedimiento descrito
aquí y una composición farmacéutica que comprende una toxina
esencialmente pura y un vehículo aceptable farmacéuticamente. La
composición farmacéutica puede utilizarse para tratar a un paciente
con una determinada enfermedad. Por ejemplo, un paciente con un
tumor podría tratarse con la composición de la presente
invención.
La Fig. 1 muestra un esquema de la purificación
de CM101 de la presente invención.
La Fig. 2 muestra un esquema conocido de
purificación de CM101.
La Fig. 3 es una curva estándar de hidrólisis
cuantitativa que muestra la respuesta a la dosis de un detector PAD
para 5, 20 y 50 \mug de dextrano (un polímero de glucosa) con
glucosa 6-desoxi como estándar interno
constante.
La Fig. 4 muestra la separación de las muestras
de azúcar estándares.
Las Figs. 5a-b son los perfiles
de elución de un concentrado del medio en una columna de
butil-Sepharose HIC. La cuantificación se ha
realizado a una absorbancia UV de 206 nm en la Fig. 5a y de 280 nm
en la Fig 5b.
La Fig. 6a es un perfil de HPLC de una fracción
eluída con agua purificada-HIC que contiene CM101
(pico de 16 min) y monitorizada a una absorbancia UV de 203 nm con
un detector de rayo diódico Millenium 2000 (Waters, Millford,
MA).
La Fig. 6b es un espectro de
rayo-diódico que corresponde con la Fig. 6a y que
muestra la presencia mínima de absorción a 260 (RNA y DNA) y la
absorción a 280 (proteína que contiene tirosina) para el pico (16
min) que contiene CM101.
La Fig. 7a es un perfil de elución monitorizado a
203 nm que muestra la pureza del pico del eluido con agua de HIC de
la Fig. 6a, sometido además posteriormente a una extracción
fenol/salina y a una cromatografía DEAE.
La Fig. 7b es un espectro de rayo diódico que
muestra la pureza del pico que contiene CM101 de la Fig. 7a, tal
como se muestra por el pico simétrico y estrecho y la falta de
absorción a 260 nm (RNA/DNA) y 280 nm (proteína).
La Fig. 8 es un perfil de la actividad de
IL-6 por el ensayo ANA-1 de las
fracciones obtenidas de una columna HIC, más específicamente un
perfil de actividad de IL-6 de las fracciones
obtenidas del concentrado 10K5P6 migrado en una columna de 100 ml
de Butil Sepharose (FT = paso de flujo; 1M= fracción de fosfato 1
M; 0,25 M = fracción de fosfato 0,25 M; H_{2}O = fracción de agua;
EtOH = fracción de etanol).
La Fig. 9 muestra un análisis de CM101 purificado
por el procedimiento de la presente invención.
La Fig. 10 es un perfil de HPLC de CM101 del
grado clínico actual sometido a una cromatografía HIC.
La Fig. 11 muestra un análisis de una muestra de
grado clínico actual que se purificó además por HIC y HPLC.
La Fig. 12a es perfil de HPLC de CM101 purificado
por un procedimiento conocido utilizando tampón fosfato
10 mM, pH 8,4.
10 mM, pH 8,4.
La Fig. 12b es un perfil de HPLC de CM101
purificado por el procedimiento de la invención, utilizando las
mismas condiciones de migración que las del perfil HPLC de la Fig.
12a.
Tal como se utiliza aquí, la toxina GBS se define
como cualquier fracción o componente aislado de bacterias GBS
naturales o lisadas, o la derivada de los sobrenadantes del medio o
de las bacterias GBS lisadas y/o autoclavadas que tiene una
actividad biológica evidenciada por la inducción de dificultad
respiratoria en el ensayo con ovejas (Hellerqvist, C.G. y col.,
Studies on group B \beta-hemolytic
streptococcus 1. Isolation and partial characterization of an
extra-cellular toxin., Pediatr. Res.,
12:892-898 (1981)) o la activación del complemento y
la unión a los vasos de nueva formación tal como se demuestra por
un ensayo de peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) de una
muestra de tejido tumoral (Hellerqvist, C.G. y col.,
Anti-tumor effects of GBS toxin: a
polysaccharide exotoxin from group B
\beta-hemolytic streptococcus. J. Canc. Res.
Clin. Oncol., 120:63-70 (1993); y Hellerqvist, C.G.
y col., Early Results of a Phase I Trial of CM101 in Cancer
Patients., Proceedings of the American Association of Cancer
Research Annual Meeting (1995)).
Una toxina GBS esencialmente pura quiere decir
una preparación con una pureza en la toxina GBS superior al 40%
(p.ej., presente a una concentración de al menos un 40% en peso),
preferentemente al menos el 60% pura, más preferentemente al menos
el 90% pura y más preferentemente al menos el 95% pura.
Una fuente del material de inicio de GBS para
utilizar en el procedimiento de la presente invención se puede
obtener cultivando cepas de la bacteria Streptococcus
\beta-hemolítico del grupo B que hayan infectado
recientemente o sean capaces de infectar niños recién nacidos. Los
aislados de dichas cepas pueden obtenerse a partir de la sangre de
los niños.
La producción elevada de CM101 requiere
generalmente la fermentación con el medio complejo THB que contiene
material de alto peso molecular en la forma de polisacáridos y
proteínas para el crecimiento óptimo de GBS y la producción de
CM101. Durante la fermentación, la bacteria produce a partir de los
nutrientes, proteínas ácidos nucleicos y polisacáridos distintos al
de CM101. La concentración estimada de CM101 en el caldo de
fermentación es inferior al 0,1% en peso.
El procedimiento de purificación de la presente
invención utiliza la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)
que elimina el volumen de moléculas contaminantes endógenas y
exógenas como las proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos de
forma más eficiente que los procedimientos conocidos y da como
resultado un producto final que contiene CM101 pura al
10-50%. En tan sólo una etapa de contacto del
material de inicio GBS con la resina HIC, con lo que se consigue
purificar el material inicial unas 100-500
veces.
La utilización de una resina HIC para la
purificación de un polisacárido es sorprendente y novedosa porque
las columnas de HIC están diseñadas para la purificación de
proteínas hidrofóbicas y no se pensó que fueran útiles para obtener
polisacáridos sin proteínas y lípidos. Los polisacáridos se
caracterizan generalmente por ser hidrofílicos debido a sus
numerosos grupos hidroxilo. La aplicación de un material de partida
a una columna HIC en las condiciones recomendadas por el fabricante
y su utilización por los expertos en la materia debería en
consecuencia realizarse con la intención de retener proteínas y
permitir a los polisacáridos que pasen a través de la columna sin
unirse a ésta.
El descubrimiento sorprendente estriba en que
CM101 tiene propiedades hidrofóbicas que permiten utilizar el
esquema de purificación de la presente invención para lograr un
nivel de pureza elevado. Especialmente sorprendente es que CM101
tiene características significativamente más hidrofóbicas que la
mayoría de proteínas y los polisacáridos presentes en el
sobrenadante a partir de donde se aísla CM101. Más del 98% de estas
proteínas y polisacáridos contaminantes pasan a través de la
columna HIC. Aunque la resina HIC se utiliza generalmente en una
columna HIC, esta etapa puede realizarse alternativamente
contactando con la resina y con el material de inicio de alguna otra
manera. Por ejemplo, la fuente GBS y la resina pueden colocarse
juntos en un recipiente en un proceso discontinuo y a continuación
separarse mediante centrifugación la porción que contiene la toxina
de la resina.
Se pueden incluir etapas adicionales de
purificación, como una extracción fenol/salina en un volumen pequeño
relativo a los procedimientos anteriores (aproximadamente reducidos
unas 1000 veces) y una columna de intercambio iónico. Estas etapas
de purificación adicionales contribuyen a obtener un producto final
con una pureza superior al 95%.
La HIC es un procedimiento utilizado para separar
proteínas, como por ejemplo proteínas de membrana, según su
naturaleza hidrofóbica. Una resina HIC se define como una resina
que tiene grupos hidrofóbicos interactivos que generalmente están
unidos covalentemente a un soporte, de modo que los grupos
hidrofóbicos son libres de interactuar con sustancias en contacto
con la resina. Ejemplos de grupos hidrofóbicos incluyen los grupos
alquil, alcoxil y aril. La resina HIC preferida para utilizar de
acuerdo con la presente invención tiene un soporte con grupos
alifáticos unidos de dos o más carbonos, preferentemente grupos
alquil en el intervalo de 2 a 12 carbonos y más preferentemente
grupos butil normales o ramificados. Los grupos fenil o alcoxil de
hasta 20 carbonos también son grupos hidrofóbicos interactivos
preferidos. Los grupos hidrofóbicos interactivos están unidos
preferentemente a soportes de Sepharose (Pharmacia), acrilamida
(Toso Haas, Montgomeryville, PA), o sílice. De acuerdo con el
procedimiento estándar de utilización de una columna HIC, el
material de inicio que contiene la proteína de interés se aplica a
la columna en una solución acuosa con una concentración salina de
hasta 2 M y las proteínas unidas se eluyen y separan mediante
disminuciones de las interacciones hidrofóbicas al reducir la
fuerza iónica del tampón de revelado. También pueden utilizarse
cambios de pH y/o temperatura para alterar las interacciones
hidrofóbicas.
La purificación de CM101 de Streptococcus
del Grupo B requiere un cultivo bacteriano de GBS. El inóculo de
bacterias se incuba más allá de la fase logarítmica en medio Todd
Hewitt (THB) modificado por suplementación con 2 g/l o más de
glucosa y Na_{2}HPO_{4}. Tal como se indica en la Fig. 1, el
cultivo se autoclava a continuación. CM101 está presente en el
sobrenadante del cultivo de fermentación de GBS a una concentración
de 2-15 mg/l después de su autoclavado. El medio
contiene aproximadamente 15 g/l de otros componentes bacterianos y
del medio. En consecuencia, CM101 constituye aproximadamente el
0,01-0,1% de los componentes en el sobrenadante.
Después de autoclavar el medio, éste se filtra. Y el filtrado se
concentra preferentemente mediante un filtro de corte de 10.000
daltons (10 KD), aunque también puede utilizarse un filtro con un
corte de 50.000 daltons (50 KD) o menos.
A continuación, se purifica CM101 de acuerdo con
la presente invención, tal como se muestra en la Fig. 1, aplicando
un concentrado de sobrenadante o un precipitado con alcohol
reconstituido en 0,75-2 M de fosfato potásico u otra
sal, como el fosfato sódico, sulfato sódico o potásico, cloruro o
acetato, a una columna de HIC equilibrada preferentemente en la
misma sal y con la misma molaridad. Es preferible el procedimiento
en donde el material de inicio del concentrado del medio, o el
10KD-50KD, se utiliza sin precipitación con alcohol,
porque el material de inicio del concentrado del medio proporciona
un rendimiento superior de CM101 que el precipitado con alcohol
reconstituido.
El material de inicio que contiene CM101 se
aplica a una columna de HIC y se lava con fosfato acuoso a
0,75-2 M. Después de un lavado con
0,75-2M, la columna se revela con sal
0,5-1 M y luego con 0,25 M, preferentemente de una
sal de fosfato. En la realización preferida, CM101 se eluye de la
columna con agua como un pico único que contiene CM101 al
10-50%. Alternativamente, se reemplaza el agua para
la elución de CM101 de la columna de HIC con fosfato 10 mM, pH 6,8
en etanol al 10% en agua (Tampón A), seguido por etanol al 20% en
agua. La actividad de CM101 se recupera en el tampón A y en las
fracciones de etanol al 20%. La utilización del tampón A no es
generalmente suficiente para eliminar toda la CM101 de la columna
de HIC, por lo que después del lavado con tampón A se prosigue con
un lavado adicional de etanol al 20%. Aunque, a mayor escala, el
etanol es una sustancia tóxica para el medio ambiente así como la
consiguiente extracción fenol/salina del pico acuoso o del tampón A
y de las fracciones del pico de etanol al 20%, al final se produce
CM101 de aproximadamente igual pureza. El procedimiento HIC elimina
más del 98% de proteínas y polisacáridos del medio que permanecían
en el concentrado 10K o en el precipitado de alcohol
reconstituido.
La CM101 enriquecida de la columna HIC puede
además purificarse mediante extracción con fenol y una solución
salina acuosa, preferentemente solución salina 0,05 M. Esta etapa
adicional proporciona una fracción de CM101 de aproximadamente el
95% de pureza.
El agua o el tampón A combinado y las fracciones
de etanol al 20% eluidas de la columna HIC se dializan contra agua y
se liofilizan y reconstituyen en solución salina 0,05 M, o se
dializan contra una solución salina después de concentrarse. En
general, se añade fenol al material y la solución se calienta
rápidamente a 70-80ºC. Cuando se ha formado una
sola fase, la solución se enfría a 4ºC. La fase salina resultante
de la extracción fenol/salina contiene CM101, por lo que a
continuación puede aplicarse a una columna de intercambio catiónico,
como la DEAE.
Para el procedimiento de la columna de DEAE, en
primer lugar la columna de DEAE se equilibra con agua y luego se
lava con solución salina 0,1 M, NaOAc 0,05 M, pH 7,4 y se revela
con un gradiente de NaCl 0,34 M. La elución de CM101 se controla y
cuantifica con un ensayo ANA-1. Al igual que con la
etapa de la resina de HIC, una resina de intercambio iónico puede
contactarse con el material que contiene la toxina gracias a la
utilización de un equipo distinto al de la columna. A continuación,
la fracción que contiene CM101 se dializa con agua y se liofiliza.
Después de las etapas de extracción fenol/salina y de intercambio
iónico, CM101 tiene una pureza superior al 95%.
Los eluidos de la columna, o el material
resultante de las etapas de contacto con la resina, se analizan
para su actividad biológica con ANA-1 y/o el ensayo
de transferencia de mancha ("dot blot" en inglés). La actividad
biológica se confirma a continuación con un ensayo en ovejas. La
Tabla 1 muestra varias separaciones de material PA 10 K obtenido a
partir de lotes distintos de materiales de partida y aplicados a la
columna HIC. La eliminación de la proteína desnaturalizada y de los
polisacáridos del medio y otros materiales es similar.
Aunque el orden preferido de purificación es
realizar primero la etapa de HIC seguida por la de extracción
fenol/salina y luego la etapa de intercambio iónico, la
purificación puede también realizarse en otro orden.
La Fig. 2 presenta un ejemplo de un procedimiento
conocido de purificación CM101. Se utiliza una etapa de
precipitación con etanol al 70%, seguida a continuación de una
extracción con fenol/agua. Los volúmenes grandes de etanol y fenol
que se requieren en estas etapas tempranas del procedimiento de
purificación conocido representan prácticas tóxicas para el medio
ambiente. El procedimiento representado en la Fig. 2 también
requiere una columna de intercambio iónico, una columna de
filtración en gel y una columna de lentejas de lectina.
El procedimiento anterior contiene numerosas
etapas, incluyendo las tóxicas para el medio ambiente. Por otra
parte, el procedimiento de la presente invención es efectivo,
proporciona una pureza superior y de 2 a 25 veces más de
rendimiento al mismo tiempo que minimiza la utilización de
materiales tóxicos para el medio ambiente.
La etapa de extracción con
fenol-agua tóxica para el medio ambiente se redujo
1000 veces comparada con los procedimientos utilizados con
anterioridad. Además, se eliminó la purificación adicional, por
ejemplo la del procedimiento de filtración en gel. También se
eliminó la etapa de cromatografía de lentejas de lectina del
procedimiento anterior. El producto final de las etapas de la
columna HIC, extracción fenol/salina y columna de intercambio iónico
tiene aproximadamente una pureza del 95%, por lo que otros
tratamientos son innecesarios.
La CM101 purificada por el procedimiento de la
presente invención puede utilizarse para la investigación o con
fines terapéuticos. CM101 es especialmente útil cuando se combina
con un vehículo aceptable farmacéuticamente, p.ej., reconstituida
en solución salina y administrada a un paciente intravenosamente.
También pueden ser útiles otras formas de dosificación para
administrar CM101 purificada. La composición farmacéutica de la
presente invención comprende la toxina GBS esencialmente pura de la
presente invención en combinación con un vehículo aceptable
farmacéuticamente. En general, el vehículo será uno que pueda
mezclarse rápidamente con la toxina para formar una composición que
sea administrable intravenosamente (i.v.). Por ello, el vehículo es
preferentemente agua, pudiendo incluir otros excipientes aceptables
farmacéuticamente para asegurar su adecuación para la administración
intravenosa. La composición resultante será estéril y tendrá
propiedades osmóticas aceptables. En general, una formulación i.v.
adecuada se prepara de acuerdo con técnicas estándares conocidas
por los expertos en la materia. Por ejemplo, capítulo 85 titulado
"Intravenous Admixtures" por Salvatore J. Turco en la 18ª
edición de Remington's Pharmaceutical Sciences, Mach Publishing Co.
(1990), incorporado como referencia, proporciona técnicas estándares
para la preparación de una composición i.v. aceptable
farmacéuticamente y de utilidad de acuerdo con la presente
invención.
invención.
Adicionalmente, un paciente que tiene una
enfermedad que responda ventajosamente a CM101 puede tratarse con
una composición farmacéutica de la presente invención. Por ejemplo,
un paciente que tenga un tumor podría tratarse ventajosamente
mediante administración intravenosa de la composición farmacéutica
de la presente invención. La patente americana U.S. 5.010.062
describe el tratamiento de ciertos tumores en humanos y se incorpora
aquí como referencia.
La pureza y la cantidad de CM101 obtenida de una
muestra después de la cromatografía de HIC se determinó mediante
análisis de filtración en gel en una cromatografía líquida de alta
presión (HPLC). La columna de filtración en gel se equilibra
generalmente con acetonitrilo al 10% y agua y la CM101 se eluye
activa biológicamente como un pico estrecho y homogéneo.
Alternativamente, se puede utilizar el tampón fosfato 10 mM, pH 8,4
que produce picos más estrechos. También se puede utilizar tampón
de acetato (NH_{4}OAc), pH 8,4 como una alternativa al tampón
fosfato
10 mM.
10 mM.
Una respuesta de detección característica
(absorción UV 203), utilizando 30, 50 y 100 \mug de estándares de
CM101 pura inyectados en 100 \mul de tampón de revelado en una
columna de Hydragel 1000 (Waters, Millford, MA) corresponde a
26x10^{6}, 48x10^{6} y 97x10^{6} unidades por área,
respectivamente, lo que produce una curva-respuesta
para la cuantificación de las muestras desconocidas.
El peso molecular de CM101 puede también
cuantificarse mediante cromatografía en gel filtración. Un tampón
no-desnaturalizante como el acetonitrilo, el
fosfato, o los tampones de acetato de amonio anteriores se utilizan
para migrar la columna. La elución de CM101 se comparó con la de
los marcadores estándares de polisacáridos de dextrano de distinto
peso molecular. En estas condiciones, CM101 tiene un peso molecular
de aproximadamente 300.000 Daltons.
El análisis cuantitativo y cualitativo
automatizado de los aminoácidos puede realizarse con un equipo
disponible comercialmente, p.ej., PicoTag, disponible de Waters,
Millford, MA.
Para monitorizar la actividad biológica de las
distintas etapas de fermentación y purificación, se puede utilizar
un ensayo in vitro que emplea una línea celular de
macrófagos de ratón transformados. Los ensayos cuantifican la
producción de IL-6 de los macrófagos de ratón
ANA-1 en respuesta a la exposición a CM101.
En particular, CM101 induce la respuesta in
vitro de la línea celular ANA-1 de macrófagos
de médula ósea murina araf/myc transformados a producir
IL-6. También se pueden utilizar otras células de
tipo macrófago y leucocitos de sangre periférica frescos.
Para realizar el ensayo ANA-1, en
primer lugar se diluyeron las muestras a un volumen adecuado
(dependiendo del grado de actividad esperada de CM101) y se
analizaron de cuatro a ocho concentraciones a diluciones 1:4. Se
generó una curva estándar de CM101 utilizando CM101 de grado
clínico reconstituido en PBS. Después de añadir las células, se
realizó una solución de 4000 ng/ml, correspondiendo con una
concentración final de 2000 ng/ml en PBS, junto con las seis
diluciones seriadas 1:2. Se pueden utilizar las células a una
concentración de 2x10^{6}/ml. Por ejemplo, la sensibilidad del
ensayo se incrementó añadiendo 200 U/ml de
IFN-\gamma murino a las células
ANA-1. Los cultivos finales fueron de 100 U/ml de
IFN-\gamma.
La placa de microtitulación con los cultivos
debería colocarse a 37ºC, en un incubador humidificado, con CO_{2}
al 5% y durante la noche (16-18 horas) y luego
proseguirse con un ensayo ELISA para IL-6 (R.D.
Systems. Minneapolis, MN). A continuación, los sobrenadantes de los
cultivos se transfieren a la placa de ensayo de
IL-6 y ésta se mantiene a 4ºC hasta finalizar el
ensayo de IL-6.
Un procedimiento rápido y alternativo para
detectar cuantitativamente CM101 en soluciones o fluidos biológicos
es transferir muestras sobre membranas de polivinilidin difluoruro
(PVDF) en diluciones seriadas. La cantidad de CM101 se cuantifica
utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón marcado con
fluorescencia dirigido contra CM101 o un anticuerpo monoclonal de
ratón contra CM101, seguido por una IgG anti-ratón
marcada con fluorescencia. El anticuerpo 7A3 dirigido contra el
antígeno CM101 es de utilidad para este propósito. Las cantidades
de CM101 en las distintas fracciones se determinan mediante
comparación con una curva estándar de CM101 diluida
seriadamente.
La toxina afecta a los pulmones de las ovejas al
incrementar la hipertensión arterial, lo que se manifiesta por un
aumento de la presión arterial pulmonar y de la permeabilidad
vascular del pulmón.
Las muestras de CM101 en tampón fosfato salino
(PBS) pueden administrarse a los corderos mediante infusión y a
continuación se registran los cambios en la presión arterial a
intervalos de 15 minutos. Estos cambios en la presión se
correlacionan con la actividad de CM101. Hellerqvist C.G. y col.,
Studies on group B \beta-hemolytic
streptococcus I. Isolation and partial characterization of an
extra-cellular toxin, Pediatr. Res.,
15:892-898 (1981)).
Una cantidad de 100 \mug de una muestra se
hidrolizó durante 2 horas a 100ºC en una mezcla de ácido
trifluoroacético (TFA), ácido acético (HOAc) y agua en una
proporción de 5:70:25. La solución se evaporó y la muestra se
hidrolizó posteriormente durante dos horas a 100ºC en una mezcla de
TFA y agua en una proporción de 2:8. Este proceso hidroliza
completamente todas las uniones glicosídicas en la muestra. También
se eliminaron los grupos N-acetil presentes en los
amino-azúcares.
Las muestras se analizaron a continuación con el
sistema de análisis de azúcares de Dionex utilizando un detector
PAD (Pulsed Amperometric Detection). La resolución se
muestra en la Fig. 4.
La pureza de la muestra se determinó mediante
análisis cuantitativo y cualitativo de los azúcares. El principio
se muestra en las Figs. 3 y 4. Una muestra de polisacáridos
cuantificada por HPLC se suplementa con un estándar interno
6-desoxi-D-glucosa,
se hidroliza y se analiza. El procedimiento descrito en esta
sección proporciona una respuesta a la dosis lineal en el intervalo
analizado. El análisis cualitativo se logra comparando los tiempos
de retención de las muestras a analizar con los estándares.
Se utilizó un aislado de la solución de trabajo
de serotipo III de Streptococcus del Grupo B junto con un
fermentador de 3.000 galones. Se utilizó un inóculo de 25 ml del
cultivo bacteriano para un recipiente de 80 l con un volumen de
trabajo (vtl) de 65 litros y éste a su vez se utilizó para inocular
un recipiente de 750 vtl y éste para inocular por último un
fermentador de 7500 vtl (3.000 galones). Alternativamente, el 65
vtl se puede utilizar para inocular directamente el fermentador de
7500 vtl.
Los cultivos se finalizaron en la fase
logarítmica tardía mediante autoclavado. A continuación, se
eliminaron las bacterias mediante centrifugación continua a 10.000
g, y filtración en un casete de 0,45 micras (Millipore Corporation,
Bedford, MA).
El sobrenadante del cultivo resultante se
concentró 15 veces a través del casete de filtración utilizando un
nivel de corte de 10 KD a 50 KD (Millipore) para 500 litros. El
material concentrado se llevó a continuación a una concentración en
sal de 2 M, preferentemente con fosfato sódico pH 7,4 (tampón de
carga) mediante diálisis.
El sobrenadante concentrado se sometió a una
cromatografía de interacción hidrofóbica, mediante la utilización de
una columna de 60 litros de n-butil Sepharose
(Pharmacia, Uppsala, Suecia) utilizando un sistema BioPilot
(Pharmacia). La capacidad de la resina n-butil
Sepharose para la actividad biológica de CM101 en el concentrado
del medio sin paso de actividad es aproximadamente de 80 litros de
medio por cada litro de resina. Después de cargar el sobrenadante
concentrado en la columna, ésta se lava con el tampón de carga,
luego con tampón fosfato 0,5-1 M y después con
tampón fosfato 0,25 M, pH 7,4. La fracción que contiene CM101 se
eluye con agua en aproximadamente 120 litros o dos volúmenes de
columna y se concentra hasta 2 litros en un casete de nivel de
corte de 10 KD a 50 KD. La elución de la columna se controla
mediante un programa preestablecido en el BioPilot y el eluido se
controla mediante absorción UV a 206 y 280 nm, conductividad y
pH.
La fracción de 2 litros que contiene CM101 se
dializa contra solución salina 0,05 M, pH 7,0 y luego se calienta a
75-80ºC y se añaden 0,2-2 litros de
fenol. La mezcla se calienta a continuación a 80ºC y se mantiene a
dicha temperatura durante 5 minutos. A continuación, la mezcla se
enfría a 4ºC. La fase acuosa resultante de esta etapa se extrae
preferentemente dos veces con 0,2 volúmenes de cloroformo antes de
su aplicación a la columna de DEAE Sephacel FF (Pharmacia, Uppsala,
Suecia) equilibrada con agua. La columna se lava con solución
salina 100 mM, NaOAc 0,05 M, pH 7,4 y el material activo
biológicamente, CM101, se eluye de la columna de DEAE con un
gradiente de NaCl. La actividad biológica se detecta mediante un
ensayo de IL-6 y análisis por HPLC. La calidad de
CM101 purificada por este procedimiento se determina mediante HPLC
y el análisis de azúcares, así como ensayos de actividad biológica
mediante ensayos de IL-6 y ensayos con ovejas.
Este esquema de purificación a gran escala
proporciona la ventaja de evitar el procedimiento de extracción
fenol-agua en gran volumen del precipitado por
alcohol utilizado en el procedimiento anterior.
Las Figs. 5a-b muestran perfiles
de elución de un concentrado del medio en una columna de
butil-Sepharose HIC en K_{2}HPO_{4} 2 M, pH 7,2.
Los diversos picos son el resultado de cambios paulatinos
producidos en el gradiente de elución. La Fig. 5a representa el
perfil cuantificado a una absorbancia UV 206, que cuantifica las
fracciones de los picos para el material orgánico total y muestra
CM101 en el último pico estrecho (aproximadamente a los 383
minutos). La Fig. 5b representa el perfil cuantificado a una
absorbancia UV 280, que cuantifica la cantidad de proteína en las
distintas fracciones.
Durante la etapa de la columna HIC, CM101 se une
a la columna mientras que hasta un 99,7% de proteína y hasta el
98,5% de los polisacáridos neutros y cargados pasan a través de
ella, tal como se indica en la Tabla 1.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 1 se muestran los resultados de
someter lotes de fermentación distintos: los precipitados por
alcohol (PA), PA1, PA2 y PA6 y los concentrados 10K a una
cromatografía HIC, y de eluirlos con agua o tampón A. Ambos procesos
rindieron aproximadamente la misma eficacia de eliminación de
proteína exógena y endógena (UV 280 nm) y de polisacáridos y
orgánicos generales (UV 206).
Las Figs. 6a-b presentan un
perfil HPLC y un espectro de Rayos diódicos de una fracción eluida
en agua y purificada por HIC que contiene CM101 y se monitoriza a
una absorbancia UV 203. Estas figuras muestran la presencia mínima
de la absorbancia a 260 (RNA y DNA) y a 280 para el pico que
contiene CM101.
Después de someter la fracción HIC a la
extracción fenol/salina y a las etapas de intercambio iónico, se
mejoró la pureza del pico eluido con agua de la HIC, tal como se
observa en las Figs. 7a-b. Se ha de remarcar el pico
simétrico estrecho a aproximadamente 16 minutos del tiempo cero y
de la falta de absorbancia a 260 (RNA/DNA) y 280 (proteína). Para
los perfiles de elución que se muestran en las Figs.
6a-b y 7a-b, se realizó una HPLC con
acetonitrilo al 10% en agua, siendo la velocidad de flujo de
aproximadamente 0,3 ml/min.
Estos perfiles de elución, así como la actividad
biológica son similares a los obtenidos cuando se utiliza el
precipitado por alcohol como material de partida para la columna de
HIC.
En la Fig. 8, se muestra la capacidad de las
fracciones de HIC del material de inicio 10K para inducir la
síntesis de IL-6 en las células
ANA-1. La cromatografía HIC proporcionó una
recuperación de aproximadamente el 50% de toda la actividad
biológica en el sobrenadante del medio, según se cuantificó por un
ensayo ANA-1. Los ensayos de transferencia de mancha
del mismo material que muestra inmunoreactividad en presencia del
antígeno CM101 se utilizaron para confirmar los resultados del
ensayo ANA-1.
Las fracciones distintas obtenidas del
concentrado 10K después de la cromatografía HIC también se
utilizaron en el modelo de ovejas para la actividad biológica. La
actividad de CM101 se determinó según una curva de
dosis-respuesta utilizando el CM101 de grado
clínico actual (1 unidad de actividad corresponde a 7,5 \mug/Kg).
Los resultados se muestran en la Tabla 2, en donde se comparan los
fraccionamientos de HIC del precipitado por alcohol (PA) y del
concentrado del medio (10K).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad biológica de CM101, purificada por
el procedimiento de la presente invención también se cuantificó con
el ensayo de la presión arterial pulmonar en las ovejas y luego se
comparó con la actividad de CM101 purificada por el procedimiento
antiguo, por ejemplo, tal como se indica en la patente americana
U.S. 5.010.062. El material purificado de acuerdo con la invención
presentó una actividad específica de dos o tres grados superior al
material que se purificó mediante el proceso antiguo, es decir, que
no se había puesto en contacto con la resina HIC.
También se pone en evidencia el rendimiento de
producto del procedimiento de la presente invención, dado que los
procedimientos conocidos hasta ahora proporcionan aproximadamente
300 \mug de CM101 por litro de volumen de fermentación, según se
compara con el valor de 7.520 \mug/l mostrado más arriba.
La CM101 purificada que se muestra en las Figs.
7a-b obtenida por el procedimiento de la presente
invención también se sometió al análisis de azúcares. Los
rendimientos de azúcares se muestran en la Fig. 9.
Cuantitativamente, la CM101 obtenida por el
procedimiento de la presente invención tiene una pureza de
carbohidratos superior al 95% y contiene al menos un 5% de proteína
cuantificada cuantitativa y cualitativamente tal como se presentó
anteriormente y mediante el análisis automatizado de aminoácidos
(Pico Tag, Water, Millford, MA).
La CM101 obtenida por el procedimiento de la
presente invención ha mejorado el actual grado clínico de CM101. En
particular, el perfil de elución por HPLC de la Fig. 10 comparado
con el de la Fig. 7a muestra una pureza superior en la muestra
producida de acuerdo con la presente invención. La Fig. 7a muestra
un pico principal estrecho y simétrico, en lugar de varios
picos.
Para demostrar la utilización ventajosa de la
columna de HIC y para proporcionar evidencias de la purificación de
la toxina conocida como CM101, se sometió CM101 de grado clínico a
una columna de HIC y se realizó una purificación por HPLC y un
análisis de azúcares. Los resultados, mostrados en la Fig. 11,
pueden compararse con los de la Fig. 9. El análisis de azúcares
muestra productos finales similares tanto cuantitativa como
cualitativamente y demuestra que el proceso de cromatografía por
HIC elimina los azúcares no relacionados con la CM101 activa
biológicamente. Este resultado se muestra también en la Tabla 3.
La tabla de residuos de azúcares presentada
anteriormente ofrece aproximadamente proporciones molares. Los
residuos concretos de CM101 purificada de acuerdo con el
procedimiento de la presente invención (la primera columna) se
hallan en un intervalo de (0,2-1 manosa):
(2,5-3,5 galactosa):(0,5-1
glucosa):(1 N-acetil
glucosamina):(0,5-1 N-acetil
galactosamina). Los números están normalizados para la
N-acetil glucosamina, por lo que la
N-acetil glucosamina se ha fijado en 1.
Para establecer una comparación, las Figs.
12a-b muestran perfiles de HPLC de CM101 producidos
por el antiguo procedimiento (Fig. 12a) y de acuerdo con el
procedimiento de la presente invención (Fig. 12b). La columna de
filtración en gel (Ultragel 100, Waters, Milford, MA) se desarrolló
en tampón fosfato 10 mM, pH 8,4. Tal como se observa en la Fig.
12b, el CM101 purificado de acuerdo con el procedimiento de la
invención se eluye en un pico relativamente estrecho durante un
intervalo de aproximadamente 5 minutos. El tiempo de elución es de
aproximadamente 24 minutos a partir del tiempo 0 con una velocidad
de flujo de 0,3 ml/min. Por el contrario, el material purificado
por el procedimiento antiguo se eluye en un pico ancho durante
aproximadamente 12 minutos.
La electroforesis en gel de poliacrilamida y
sodio dodecil sulfato se realizó utilizando un gel de gradiente del
4-20%. Las muestras de CM101 se incubaron en un
tampón de SDS al 2%, Tris-HCl 0,5 M, glicerol al 5%,
azul de bromofenol al 0,05% y
\beta-mercaptoetanol al 5% a pH 8,0, a 55ºC
durante 10 minutos y se aplicaron a un gel apilante del 4% en un
gel de SDS-PAGE del 4 al 20%. A continuación, las
muestras se migraron en el gel a 200 voltios durante 90
minutos.
El gel se reveló en un tampón de transferencia de
western (Tris 25 mM, glicina 192 mM y metanol al 20%) y se
transfirió a 100 Voltios durante 2 horas. El gel se bloqueó con
leche desnatada al 5% en PBS a temperatura ambiente durante 1 hora
y se lavó dos veces con un tampón de unión (BBT, compuesto de tampón
fosfato salino, suero bovino fetal al 2% y el detergente
Tween-20), luego se incubó 1 hora con 10 \mug/ml
de 7A3 (anticuerpo monoclonal anti-CM101).
El gel se incubó 4 veces durante 10 minutos con
BBT y se incubó con el anticuerpo anti-ratón
conjugado con fosfatasa alcalina durante 45 minutos, se lavó 4
veces con BBT y se reveló con el revelador Pierce
Single-Step PA durante 50 minutos.
El análisis de transferencia de Western del
SDS-PAGE sugiere que CM101 tiene un componente de
26.000 daltons o un múltiplo de éste cuando se analiza en estas
condiciones.
Por ello, el procedimiento de la presente
invención proporciona un procedimiento mejorado de purificación que
minimiza la dificultad de las etapas tóxicas y proporciona una
pureza excelente. Además, el producto producido por el
procedimiento de la presente invención está mejorado respecto a la
CM101 disponible en la actualidad.
Todas las publicaciones y las solicitudes de
patentes mencionadas en esta especificación se han incorporado aquí
como referencias.
Claims (17)
1. Procedimiento de purificación de una toxina de
polisacáridos de la bacteria Streptococcus
\beta-hemolítico del grupo B(GBS), el cual
comprende:
- (a)
- poner en contacto una mezcla acuosa que contiene la toxina con una resina de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) y
- (b)
- separar la toxina de la resina de HIC.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, en donde la pureza de la toxina procedente de la etapa de
separación de la toxina de la resina HIC se aumenta aproximadamente
100-500 veces en relación con la pureza de la toxina
en la mezcla acuosa.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1 o la reivindicación 2 que comprende además la extracción de la
toxina con una mezcla acuosa de fenol para formar una fase acuosa
que incluye la toxina.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, 2 o 3 que además comprende:
- (a)
- poner en contacto la toxina con una resina de intercambio iónico y
- (b)
- separar la toxina de la resina de intercambio iónico.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1 o la reivindicación 2, en donde la etapa (b) es una etapa de
elución de la columna de HIC para obtener un eluido de HIC que
incluye la toxina, que es seguido de:
- (c)
- extraer el eluido HIC con una combinación de fenol y una solución acuosa para formar una fase acuosa que incluye la toxina,
- (d)
- aplicar la fase acuosa a una columna de intercambio iónico,
- (e)
- eluir la columna de intercambio iónico para obtener un eluido de intercambio iónico, en donde el eluido del intercambio iónico comprende una toxina esencialmente pura.
6. Toxina de polisacáridos de la bacteria
Streptococcus \beta-hemolítico del grupo B
(GBS) purificada por el procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores.
7. Toxina de acuerdo con la reivindicación 6, en
donde la toxina tiene además un peso molecular de aproximadamente
300.000 daltons tal como se cuantifica por cromatografía de
filtración en gel en condiciones no desnaturalizantes e incluye
residuos de azúcares de manosa, galactosa, glucosa,
N-acetil glucosamina y N-acetil
galactosamina en una proporción molar de (0,2-1 de
manosa):(2,5-3,5 de
galactosa):(0,5-1 de glucosa):(1 de
N-acetil glucosamina):(0,5-1 de
N-acetil galactosamina).
8. Toxina de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7
para utilizar en un procedimiento de terapia.
9. Toxina de acuerdo con la reivindicación 6, 7 u
8, en donde la toxina tiene una actividad específica
aproximadamente dos o tres veces mayor que la actividad específica
de la toxina de GBS que no se ha puesto en contacto con una resina
HIC, según se cuantificó mediante un ensayo para aumentar la presión
arterial pulmonar en ovejas.
10. Composición que consiste esencialmente en una
toxina de polisacáridos de la bacteria Streptococcus
\beta-hemolítico del grupo B (GBS), en donde la
toxina es al menos 60% pura.
11. Composición de acuerdo con la reivindicación
10, en donde la toxina es al menos aproximadamente un 90% pura.
12. Composición de la reivindicación 10 u 11, en
donde la toxina incluye residuos de azúcar de manosa, galactosa,
glucosa, N-acetil glucosamina y
N-acetil galactosamina en una proporción molar de
(0,2-1 manosa):(2,5-3,5
galactosa):(0,5-1 glucosa):(1
N-acetil glucosamina):(0,5-1
N-acetil galactosamina).
13. Composición de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 10-12, en donde la toxina tiene un
peso molecular de aproximadamente 300.000 daltons según se
cuantificó por cromatografía de filtración en gel en condiciones no
desnaturalizantes.
14. Composición de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 10-13, en donde la toxina se eluye
en un pico simétrico estrecho, que se cuantifica a una absorbancia
de 203 nm a aproximadamente 16 minutos desde el tiempo cero cuando
se analiza por HPLC en un tampón de acetonitrilo al 10% con una
velocidad de flujo de aproximadamente 0,3 ml/minuto.
15. Composición de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 14, en donde la toxina se eluye en un pico
simétrico estrecho que se cuantifica a una absorbancia de 203 nm a
aproximadamente 24 minutos desde el tiempo cero cuando se analiza
por HPLC en un tampón fosfato 10 mM, pH 8,4.
16. Composición farmacéutica que comprende la
toxina de polisacáridos de la bacteria Streptococcus
\beta-hemolítico del grupo B (GBS) y un vehículo
farmacéuticamente aceptable, en donde la toxina es al menos un 60%
pura.
17. Procedimiento de preparación de una
composición farmacéutica de utilidad para el tratamiento de una
enfermedad, en particular un tumor, en donde el procedimiento
comprende combinar la composición de cualquiera de las
reivindicaciones 10-15 con un vehículo aceptable
farmacéuticamente.
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