JPH03184995A

JPH03184995A - 抗腫瘍剤

Info

Publication number: JPH03184995A
Application number: JP1291239A
Authority: JP
Inventors: Juzo Udaka; 重三鵜高
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-11-10
Filing date: 1989-11-10
Publication date: 1991-08-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、抗腫瘍剤に関するものである。

また、本発明は、特に、ピシバニールを併用して効果的
に抗腫瘍活性を高めてなる抗腫瘍剤に関するものである
。

（従来技術及び問題点）従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）の生菌体
を弱毒化して製剤化したものは、すでに制癌剤″ピシバ
ニール″として使用されている。

また、本発明者らは、先に、溶連菌（ストレプトコッカ
ス属菌）の培養濾液又はその限外濾過濃縮液に有機溶剤
を添加して得られる沈澱物から分離したＳＰＦ−ＰＣＯ
−２０，ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０に抗腫瘍活性を認めて特
許出願をした。（特開昭６３−１０１４００、特開昭６
３−１０１３９２）このように、従来、溶連菌に関する抗腫瘍剤については
、単品についてかなりの抗腫瘍効果をあげているのであ
るが、更によりすぐれた抗腫瘍剤の出現が望まれるので
ある。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、溶連菌に関する各種抗腫瘍剤の抗腫瘍効
果を高める研究を行った結果、溶連菌菌体製剤であるピ
シバニールと溶連菌培養濾液沈澱物との併用がすぐれた
抗腫瘍効果を発揮することを見出したのである。

本発明は、ストレプトコッカス属菌の培養濾液２もしくはその限外濾過濃縮液に有機溶剤を添加して得ら
れる沈澱物又はこの沈澱物から分離されたＳＰＦ−ＰＣ
Ｏ−２０もしくはＳＰＦ−ＰＣＯ−３０、と、ビシバー
ルとを併用して効果的に抗腫瘍活性を高めてなる抗腫瘍
剤に関する。

又、本発明は、ストレプトコッカス属菌の培養濾液もし
くはその限外濾過濃縮液に有機溶剤を添加して得られる
沈澱物で抗腫瘍活性を有するＳＰＦ−ｐｃｏに関するも
のである。

本発明に使用する沈澱物は、ストレプトコッカス属菌の
培養濾過もしくはその限外濾過濃縮液に有機溶剤を添加
することによって生じる沈澱物である。

使用するストレプトコッカス属菌は次に例示される。

ストレプトコッカス・ピオゲネス　ＡＴＣＣ２１０６０
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ス
トレプトコッカス・エスピー　　ＡＴＣＣ２１５９７（
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ、）ストレプトコッ
カス・ピオゲネス　ＡＴＣＣ２１５４６３− （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ス
トレプトコッカス・ピオゲネス　ＡＴＣＣ２１５４７（
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）スト
レプトコッカス・ピオゲネス　ＡＴＣＣ２１５４８（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）培養液
は、肉エキス培地、酵母エキス培地、プレイン・ハート
・インフュージョン培地（ＢＨＩ培地）等の天然培地が
よく用いられるが、ストレプトコツカス属細菌の生育に
適した培地であれば任意の培地を使用できる。

培養ｐＨは、５．０〜８，０、好ましくは、６．１〜７
．２であり、温度は３０〜４０℃、好ましくは３５℃〜
３７℃であり、嫌気的に静置培養または攪拌培養を行う
ことができる。

培養時間は、対数増殖期にかかって後↓〜３０時間、好
ましくは２〜２０時間である。

培養液は遠心分離によって菌体を除去し、濾液を得る。

濾液は、硫安を添加し５０〜９０％飽和度の画分とし濃
縮するか、もしくは、限外濾過膜を用いて濃縮すること
もできる。

４− 沈澱物は、培養濾液もしくはその限外濾過濃縮液に、メ
タノール、エタノール等のアルコール類、アセトン等の
有機溶媒を添加することにより、沈澱物として得られる
。

メタノール、エタノール等のアルコール類又はアセトン
等の有機溶媒は、培養濾液又は濃縮液１部に対して０．
６５〜３部、好ましくは０，６５〜１．５部攪拌しなが
ら添加する。

得られた溶連菌培養濾液沈澱物は、濾取して。

凍結乾燥等によって乾燥物とし、このまま抗腫瘍剤とし
て使用することもできる。この溶連菌培養濾液沈澱物を
ＳＰＦ−ＰＣＯと名付けた。

この溶連菌培養濾液沈澱物ＳＰＦ−ＰＣＯは各種成分の
混合物であるが、次に示す一定の理化学的性質を示す。

溶連菌培養濾液沈澱物の理化学的性質Ｊ、塩基性、酸性、中性の区別本物質の０．１％の水溶液のＰＨは５．３〜５．８であ
る。

２、物質の色白ないし微黄色３、本物質は２１０℃で褐変し、３００℃で全体が褐色となる。

４、　元素分析Ｃ：　　４３．７９％Ｈ’：　　　６．８６％０　　：　　４５．’６４％Ｎ　　：　　　２．４１％５、紫外線吸収スペクある。

６゜赤外線吸収スペクある。

７、比旋光度〔α〕′Ｄ。＝＋１０５．３°（Ｃ＝　１．Ｈ２Ｏ）８
、呈色反応ローリ−反応　　　　　十ビューレット反応　　　十ニンヒドリン反応　　　十アンスロン硫酸反応　　十システィン硫酸反応　　十オルシン反応　　　　　士トルは第２図に示す通りでトルは第１図に示す通りで２５８℃で一部融解し、９、分子量ゲル濾過法による測定では、分子量１０，０００以上で
ある。

】０．蛋白質吸着体に対する挙動ハイドロキシアパタイトにほとんどが吸着される。

１１、溶剤に対する溶解性水に可溶であるが、メタノール、エタノール、ｎ−プロ
パツール、アセトン、エチルエーテル、ｎ−ヘキサン、
クロロホルム、酢酸エチル等の有機溶剤には、難溶又は
不溶である。

溶連菌培養濾液沈澱物は、水もしくは緩衝液に溶解し、
ハイドロキシアパタイトに吸着させ、０．０１１ン酸緩
衝液で充分洗浄後０．１ＭＩＪン酸緩衝液で溶出させる
とき、抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−２０を得ることが
できる。溶出成分は脱イオン水に対して透析し、凍結乾
燥することによってＳＰＦ−ＰＣＯ−２０乾燥標品を得
ることができる。

０．１Ｍリン酸緩衝液でＳＰＦ−ＰＣＯ−２０を溶出さ
せた後は、０．２５Ｍリン酸緩衝液で溶出させるとき、
抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０を得ることができる
。溶出成分は脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥する
ことによってＳＰＦ−ＰＣＯ−３０乾燥標品を得ること
ができる。

次に、実施例２で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦＰＣ：０
−２０の凍結乾燥標品は次の理化学的性質を示す。

抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−２０の理化学的性質。

１、元素分析０　　３８．２〜４０．５Ｈ５，５〜６，６Ｎ　　２．３〜３．２０　５０．９〜４６．３Ａｓｈ　　　３．１〜３．４２、分解点本物質は１８５℃で褐変し、２６７℃になると黒色とな
り分解する。

３、比旋光度〔α］２１′＝　８０°　〜１５０°　（Ｃ＝　１．０
０）８− ４、紫外線吸収スペクトル本物質の水溶液の紫外線吸収スペクトルは第３図に示さ
れる。

５、赤外線吸収スペクトル第４図に示される。

６、塩基性、酸性、中性の区別本物質の０．１％の水溶液のｐＨは５．３〜５．７であ
る。

７、物質の色白ないし微黄色８、呈色反応ローリ−反応　　　　　十ビューレット反応　　　十ニンヒドリン反応　　　十アンスロン硫酸反応　　十システィン硫酸反応　　十オルシン反応９、分子量ゲル濾過法による測定では、分子量ｉｏ、ｏｏｏ以」二
である。

一１０、蛋白質吸着体に対する挙動ハイドロキシアパタイトに吸着され、０．１Ｍリン酸緩
衝液により溶出される。

１１、溶剤に対する溶解性水に可溶であるが、メタノール、エタノール、ｎ−プロ
パツール、アセトン、エチルエーテル。

ｎ−ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル等の溶剤には
、難溶又は不溶である。

１２、温度に対する安定性本物質の水溶液は、４５℃３０分の加熱後もインビトロ
で測定される抗腫瘍性活性の多くを保持する。

１３、蛋白質分解酵素に対する安定性本物質は、トリプシン又はプロナーゼによる処理後もイ
ンビトロで測定される抗腫瘍性活性の多くを保持する。

１４．８ＤＳアクリルアミドゲル電気泳動で糖と蛋白に
分離するのが確認される。

また、実施例３で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ
−３０の凍結乾燥標品は次の理化学的性質を示す。

１０抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣ：０−３０の理化学的性質１
１元素分析Ｃ３７，１〜３９．３Ｈ５，４〜６．４Ｎ　　３．５〜４．８０　５０．５〜４５．７Ａｓｈ　　　３．５−３．８２、分解点本物質は１８５℃で褐変し、２５５℃になると黒色とな
り分解する。

３、比旋光度〔α〕２０＝３０°　〜８０″’　　（Ｃ＝　１．００
）４、紫外線吸収スペクトル本物質の水溶液の紫外線吸収スペク５図に示される。

５、赤外線吸収スペクトル第６図に示される。

６、塩基性、酸性、中性の区別トルは第１１− 本物質の０゜１％の水溶液のＰＨは５．５〜５．８であ
る。

７、物質の色白ないし微黄色８、呈色反応ローリ−反応　　　　　十ビューレット反応　　　十ニンヒドリン反応　　　十アンスロン硫酸反応　　十システィン硫酸反応　　十オルシン反応９、分子量ゲル濾過法による測定では、分子量１０，０００以上で
ある。

ＩＯ９蛋白質吸着体に対する挙動ハイドロキシアパタイトに吸着され、０．２５Ｍリン酸
緩衝液により溶出される。

１１、溶剤に対する溶解性水に可溶であるが、メタノール、エタノール、ｎ−プロ
パツール、アセトン、エチルエーテル、ｎ−ヘキサン、
クロロホルム、酢酸エチル等の溶１２剤には、難溶又は不溶である。

１２、温度に対する安定性本物質の水溶液は、４５℃、３０分の加熱によりインビ
トロで測定される抗腫瘍性活性を保持する。

１３、蛋白質分解酵素に対する安定性本物質は、トリプシンによる処理後もインビトロで測定
される抗腫瘍性活性において活性保持する。しかし、プ
ロナーゼによる処理後は抗腫瘍活性がやや低下する。

本発明においては、溶連菌の培養濾液もしくはその限外
濾過濃縮液に有機溶剤を添加して得られる沈澱物そのも
のを抗腫瘍剤とするものであり、そして沈澱物又はこの
沈澱物から分離されたＳＰＦ−ＰＣＯ−２０もしくはＳ
ＰＦ−ＰＣＯ−３０，と、ビシバニールとを併用して抗
腫瘍剤とするものである。

本発明に使用するビシバニールは溶連菌の生菌体を弱毒
化して製剤化したものであるが、すでに３− 市販されているものであるから、容易に入手し得るもの
である。

投与に際しては、溶連菌培養濾液沈澱物を筋肉注射によ
って投与し、また、溶連菌培養濾液沈澱物、ＳＰＦ−Ｐ
ＣＯ−２０及びＳＰＦ−ＰＣＯ−３０から選んだ１種以
上をビシバニールと混合溶解して筋肉注射によって投与
するのがよい。投与量としては、溶連菌培養濾液沈澱物
、　ＳＰＦ−ＰＣＯ−２０及びＳＰＦ−ＰＣＯ−３０か
ら選んだ１種以上が０．１〜１００■／ｋｇ体重７日程
度がピシバニールの投与適量とともに投与するのがよい
。

次に、本発明の実施例を示す。

実施例１ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）　
ＡＴＣＣ２１０６０をＢＨＩ培地１００ｍ１２に接種し
て３７℃、８時間静置培養をおこなって得た種培養液を
第１表に示す培地Ａ１Ｍに接種し、種培養と同一条件で
嫌気的に前培養を行った。

第１表　培地Ａマルトース　　　　　　　０．２５％１４肉エキス　　　　　　　　１．０％ポリペプトン　　　　　　１．０％酵母エキス　　　　　　　０．２５％に８２ＰＯ４０，１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％ＮａＣＱ０．１％ＰＨ６，５１１１ジャーファーメンタ−に培地Ａ８Ｑを投入して１
２０℃、１０分間加熱殺菌後、３７℃まで冷却して、前
培養液ＩＩｌを接種し、３７℃、１５．５時間、ｐＨ６
，５，５０ｒ、ｐ、ｍ、で攪拌しながら嫌気的に培養す
る。

得られた培養液を遠心分離にかけて菌体を除去し、培養
濾液を得た。培養濾液の濃縮方法は次の通り行った。

培養濾液は、分画分子量１０，０００の限外濾過膜（米
国、ロミコン社）を用いて、　ｉ、ｓＱに濃縮した。

この濃縮液を用いて下記の通り精製した。

濃縮液は、充分冷却しつつ、あらかじめ冷却しておいた
メチルアルコール１．０Ｑを少量づつ攪拌下に加え、４
時間放置した。この場合、１０℃を超え５ないように処理した。生じた沈澱物は、冷却下遠心分離
機を用いて集め、凍結乾燥した。

得られた溶連菌培養濾液沈澱物は４５０■であった。

実施例２実施例１で得られた溶連菌培養濾液沈澱物４５０■を水
に溶解後、０．０１Ｍリン酸緩衝液で平衡化したハイド
ロキシアパタイトカラムに吸着させ、０．０１Ｍリン酸
緩衝液で充分洗浄後０．１Ｍリン酸緩衝液で溶出してく
るフラクションをプール後、脱イオン水に対して透析し
、凍結乾燥した。この凍結乾燥標品は抗腫瘍性成分ＳＰ
Ｆ−ＰＣＯ−２０であり、１１５■を得た。

実施例３実施例２で０．１Ｍリン酸緩衝液でＳＰＦ−ＰＣＯ−２
０を溶離させた後のハイドロキシアパタイトカラムを。

０．１Ｍリン酸緩衝液で充分洗浄後０．２５Ｍリン酸緩
衝液で溶出してくるフラクションをプール後、脱イオン
水に対して透析し、凍結乾燥した。この凍結乾燥標品は
抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０であり、８６■６を得た。

実施例４実施例１〜３で得た溶連菌培養濾液沈澱物（以下、ＳＰ
Ｆ−ＰＣＯという）、ＳＰＦ−ＰＣＯ−２０及びＳＰＦ
−ＰＣＯ−３０のそれぞれをピシバニールと併用してマ
ウスにおける抗腫瘍活性をみた。

ピシバニール（以下、ＰＣＢという）（中外製薬（株）
製）については市販品を用い、その０．１ＫＥを投与直
前に上記併用剤溶液と混合して投与した。

インビボにおける抗腫瘍性活性試験は、Ｃｒｊ　；ＣＤ
、１　（ＩＣＲ系、雄性５週齢）マウスを使用した。腫
瘍細胞としては、Ｓａｒｃｏｍａ−１８０腹水癌細胞を
用い、これを生理食塩水に浮遊させ、マウスの腹腔内に
１×１０″’ｃｅｌｌｓ／マウス接種した。

癌細胞接種２４時間後から、１日１回５日間連続して検
体を腹腔内に投与してその生存数を観察しその結果を第
１表に示す。

なお、延命率ＩＬＳ　（％）は、６０日間飼育後、それ
ぞれの条件下における平均生存日数を計算し、コントロ
ールにおける日数で割った値で示している。

１７８−

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＳＰＦ−ＰＣＯの紫外線吸収スペクトルを示
し、第２図は同じ＜　ＫＢｒ法による赤外線吸収スペク
トルを示し、第３図は抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−２
０の紫外線吸収スペクトルを示し、第４図は同じ＜　Ｋ
Ｂｒ法による赤外線吸収スペクトルを示し、第５図は、
抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０の紫外吸収スペクト
ルを示し、第６図は同じ＜　ＫＢｒ法による赤外線吸収
スペクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ストレプトコッカス属菌の培養濾液もしくはその
限外濾過濃縮液に有機溶剤を添加して得られる沈澱物又
はこの沈澱物から分離されたＳＰＦ−ＰＣＯ−２０もし
くはＳＰＦ−ＰＣＯ−３０、と、ピシバニールとを併用
して効果的に抗腫瘍活性を高めてなる抗腫瘍剤。
（２）ストレプトコッカス属菌の培養濾液もしくはその
限外濾過濃縮液に有機溶剤を添加して得られる沈澱物で
抗腫瘍活性を有するＳＰＦ−ＰＣＯ。