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CN1192115C - 纯化B群β－溶血性链球菌毒素的方法 - Google Patents

纯化B群β－溶血性链球菌毒素的方法 Download PDF

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CN1192115C CNB971993696A CN97199369A CN1192115C CN 1192115 C CN1192115 C CN 1192115C CN B971993696 A CNB971993696 A CN B971993696A CN 97199369 A CN97199369 A CN 97199369A CN 1192115 C CN1192115 C CN 1192115C
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Abstract

一种用于从B群β-溶血性链球菌(GBS)中纯化多糖的方法，其包括将细菌发酵原液与疏水相互作用层析(HIC)树脂接触。附加的步骤可包括苯酚/盐水抽提以及离子交换层析。这种方法导致有很高纯度的产物。纯化的产物提供一种在研究和治疗用途中均非常有用的组合物。

Description

纯化B群β-溶血性链球菌毒素的方法
技术领域
本发明涉及用于一种多糖纯化的改进方法。
背景
CM101，一种GBS毒素，是一种从B群β-溶血性链球菌(GBS)分离的致病性分子。新生婴儿可以被GBS感染(一种被称之为GBS肺炎或“早发性疾病”的情形)，以及感染脓毒症、粒细胞减少症和呼吸窘迫，即肺动脉高压症与蛋白性肺水肿(Hellerqvist，C.G.等人，B群β-溶血性链球菌的研究I，一种细胞外毒素的分离及部分表征，儿科学研究(Pediatr.Res.)，15：892-898(1981))。
除了对接触GBS的新生儿的有害作用，尚不知道CM101对年长的人能引起毒性。实际上，对这种毒素的研究已经揭示了一个重要的治疗应用。见美国专利第5,010,062号以及Hellerqvist，C.G.等人，CM101在癌症患者的第I阶段试验的早期结果，美国癌症研究协会年会学报(Proceeding of the American Association of Cancer Research AnnualMeeting)(1995)，其中CM101被用于抑制肿瘤的血管形成。因此，对研究和治疗两个目的来说获得纯化的CM101是关键。
CM101是一种复杂的多糖毒素，分子量大约为300,000道尔顿，且包含N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡萄糖胺、葡萄糖、半乳糖以及甘露糖残基。Nmr(核磁共振)结果提示糖醇残基也可能存在。羧酸功能基团(可能为半乳糖醛酸)也被认为是此分子的一个组成部分。在对CM101的病理生理反应中，通过靶内皮上的交联受体重复的活性表位很可能起着重要的作用。(Hellerqvist，C.G.等人，CM101在癌症患者的第I阶段试验的早期结果。美国癌症研究协会年会学报(1995)；DeVore，R.F.，等人，抗新生血管生成药物CM101的第1阶段研究，临床癌症研究杂志(J.Clin.Can.Res.3：365-372(1997)))。
美国第5,010,062号专利提供了一种纯化GBS毒素的方法。但是这种方法劳动强度大，需要很多步骤并伴随着生物学活性水平连续的丢失。
当前，在本领域中已知纯化CM101提供的最终材料通过化学分析和生物学测定其纯度仅有40％。其余60％包括植物及酵母多糖和内源性细菌多糖。植物和酵母污染物绝大部分源自为了GBS细菌的最佳生长在商业培养基中使用的添加剂。内源性污染包括含有群及型特异性抗原的GBS多糖。(Paoletti，L.C.等人，通过四价GBS多糖-破伤风毒素偶联疫苗免疫母鼠对新生小鼠感染多重B群链球菌(GBS)血清型的保护，感染与免疫杂志(Infect.Immun.)62(8)：3236-43(1994)；Michon，F.，B群链球菌的多触角群特异性多糖，生物化学(Biochem.)27：5341-51(1988))。40％纯度水平的CM101代表了当前的临床等级。因此需要导致最终产物纯度全面增加的CM101纯化方法，优选地清除外源性植物和酵母多糖以及GBS抗原性多糖。
另外，在本领域中已知的纯化方案中包括环境不安全步骤，例如在苯酚：水抽提中大量苯酚的使用。苯酚是众所周知的腐蚀性材料。
因此，本发明的目的是提供一种纯化方法，其导致(i)一种高纯度的材料，(ii)使用最少的步骤，(iii)最小限度地使用腐蚀性或毒性材料如苯酚，以及(iv)增加产物产量。
发明概述
用在此描述的发明已经达到了的上述目的。特别是，一种为从GBS培养基中纯化CM101的包括疏水相互作用层析(HIC)树脂的纯化方案使产物的纯度高于95％。
本发明的一个方面是从GBS细菌中纯化多糖毒素的一种方法，此方法包括一种HIC树脂的使用。本发明也包括一种用此处公开的方法从GBS细菌中产生基本上纯的多糖毒素的方法，以及一种包括基本上纯的毒素和药学上可接受载体的药物组合物。这种药物组合物可以用于治疗具有病症的患者。例如，肿瘤患者可以用本发明的组合物治疗。
附图简述
图1显示本发明的CM101纯化方案。
图2显示已知的CM101纯化方案。
图3a-3c是定量水解标准曲线，显示了PAD检测器对5μg(图3a)、20μg(图3b)和50μg(图3c)葡聚糖(葡萄糖多聚体)与6-脱氧葡萄糖的作为恒定内部标准的剂量反应。
图4显示了标准的糖样品的分离。
图5a-b是在丁基-Sepharose HIC柱上一种培养基浓缩物的洗脱分布图。图5a是在UV 206吸光度处测量的。图5b是在UV 280吸光度处测量的。
图6a是HIC纯化的含有CM101(16分钟峰)水洗脱级分的HPLC分布图，通过Millenium 2000 Diodo-Ray检测器(Waters，Millford，MA)在UV203吸光度处监控。
图6b是与图6a相应的Diodo-Ray频谱，阐明了含有CM101峰(16分钟)的260吸收(RNA和DNA)和280吸收(含有酪氨酸蛋白)的最小存在。
图7a是在203nm监控的洗脱分布图，显示了经苯酚/盐水抽提和DEAE层析后图6a中HIC水洗脱峰的纯度。
图7b是Diodo-Ray频谱，阐明了图7a中含有CM101峰的纯度，通过窄的对称峰及在260nm(RNA/DNA)和280nm(蛋白质)处的无吸收得到证明。
图8是通过从HIC柱获得级分的ANA-1测定的IL-6活性分布图，更特别的，从经过100ml丁基Sepharose的10K5P6浓缩物获得级分的IL-6活性分布图。(FT＝流出液；1M＝1M磷酸盐级分；0.25M＝0.25M磷酸盐级分；H2O＝水级分；EtOH＝乙醇级分)。
图9阐明了通过本发明的方法纯化的CM101的糖分析。
图10是经过HIC层析的当前临床等级CM101的HPLC分布图。
图11阐明通过HIC和HPLC进一步纯化的当前临床等级CM101样品的糖分析。
图12a是使用pH8.4 10mM磷酸盐缓冲液通过已知的方法纯化的CM101之HPLC分布图。
图12b是用本发明的方法纯化CM101的HPLC分布图，使用了与图12a HPLC分布图同样的洗脱条件。
实施方案详述
这里使用的GBS毒素被定义为从自然界或裂解的GBS细菌中分离或来自裂解和/或高压灭菌的GBS细菌的任何级分或组分，它具有通过绵羊中呼吸窘迫测定的诱导证明了的生物学活性(Hellerqvist，C.G.等人，B群β-溶血性链球菌的研究I，一种细胞外毒素的分离及部分特征，儿科学研究(Pediatr.Res.)，12：892-898(1981))或补体的活化作用，并且通过肿瘤组织标本的过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)测定证明结合到新生血管上。(Hellerqvist，C.G.等人，GBS毒素的抗肿瘤作用：来自B群β-溶血性链球菌的一种多糖外毒素，癌症研究临床肿瘤学杂志(J.Canc Res.Clin.Oncon.)，120：63-70(1993)；以及Hellerqvist，C.G.等人，CM01对癌症患者的第I阶段试验的早期结果。美国癌症研究协会年会学报(1995))。
基本上纯的GBS毒素意味着其中GBS毒素的纯度高于40％(例如，当前浓度至少大约40％重量比)，优选地纯度至少大约60％，更优选纯度至少大约90％，最优选纯度至少大约95％的制剂。
在本发明的方法中使用的GBS初始材料来源，可以通过培养最近已经感染或有能力感染新生婴儿的B群β-溶血性链球菌菌株获得。这种菌株的分离株可以从被感染的婴儿的血液中得到。
高产量的CM101通常需要用复杂的THB培养基发酵，它含有用于优化GBS生长及CM101产生的多糖和蛋白质形式的大分子材料。在发酵过程中，细菌产自不同于CM101的蛋白质、核酸和多糖的营养素。估计在发酵肉汤中，CM101的浓度少于重量的0.1％。
本发明的纯化方法应用了疏水相互作用层析(HIC)，其比已知的方法更有效地消除了大量内源的和外源的污染蛋白质、核酸及多糖，并且导致最终产物中含有10-50％纯的CM101。这表示在GBS初始材料接触HIC树脂的一个步骤中，比初始材料纯化了100-500倍。
使用HIC树脂来纯化多糖是令人惊讶和新奇的，因为HIC柱是设计用来纯化疏水性蛋白质的，并不认为对没有蛋白质和脂类的多糖有用处。多糖因为其众多的羟基通常表现为亲水特性。在生产者推荐的条件下通过本领域熟练的实践者使用，将初始材料用于HIC柱，籍此，柱上保留蛋白质，并允许多糖通过层析柱。
令人惊奇的发现是CM101具有疏水特性，允许使用本纯化方案以达到高水平的纯度。特别令人惊讶的是，CM101比其所分离自的上清液中存在的大多数蛋白质和多糖具有显著的更为疏水的特性。大于98％的这些蛋白质和多糖污染物通过HIC柱。虽然HIC树脂通常用于HIC柱，但这一步骤可以选择性地以另外的方式通过树脂和初始材料接触来进行。例如，GBS原始材料和树脂可以在分批方法中一起放进容器中，并且随后通过如离心的方法将含有毒素部分从树脂中分离出来。
附加的纯化步骤可包括以相对于先前方法较小体积(大约减小1000倍)的苯酚/盐水抽提和离子交换柱。这些附加的纯化步骤对纯度超过95％的最终产物有益。
HIC是一种基于蛋白质的疏水特性用于分离蛋白质，例如膜蛋白的方法。HIC树脂被定义为含有疏水相互作用基团的树脂，这些基团通常共价吸附于支持物上以便能自由地与接触树脂的物质相互作用。疏水基团的实例包括烷基、烷氧基和芳基基团。依照本发明将使用的优选HIC树脂具有与含有两个或更多碳的脂族基团，优选地含有2到12个碳的烷基基团以及更优选地正常或分支的丁基基团联结的支持物。含高达20个碳的苯基或烷氧基基团也是优选的疏水相互作用基团。疏水相互作用基团优选地由Sepharose(Pharmacia)、丙烯酰胺(Toso Haas，Montgomeryville.PA)或硅胶支持。依照使用HIC柱的标准方法，含有目标蛋白质的初始材料在高达2M的盐溶液中用于层析柱，然后通过降低展开缓冲液的离子强度来减少疏水相互作用使结合的蛋白质被洗脱并分离。pH值和/或温度的改变也可用来改变疏水相互作用。
从B群链球菌纯化CM101需要获得GBS的细菌培养物。细菌接种物在通过补充2g/l或更多的葡萄糖及Na2HPO4而改进的Todd Hewitt肉汤(THB)中培养至对数生长后期。然后如图1所示，高压灭菌培养物。CM101存在于GBS的发酵培养物的上清液中，在高压灭菌后其浓度达2-15mg/l。培养基中包含约15g/l的其它细菌和培养基组分。因而CM101构成上清液中组分的大约0.01-0.1％。在高压灭菌后，将培养基过滤。虽然50,000道尔顿(50KD)或较小截断值的过滤器可以使用，但滤出液优选地通过10,000道尔顿(10KD)截断值的过滤器浓缩。
然后依照本发明纯化CM101，如图1所示，通过将上清浓缩液或重构的乙醇沉淀(其在0.75-2M的磷酸钾或另外的盐如磷酸钠、硫酸钠或硫酸钾、氯化物或醋酸盐中配制)上样于优选地用同样摩尔浓度的同样盐溶液平衡过的HIC柱。此方法中优选的是培养基浓缩液或10KD-50kD没有乙醇沉淀和重构的初始材料，因为培养基浓缩液初始材料提供了比重构的乙醇沉淀更高的CM101产量。
含有CM101的初始材料应用于HIC柱，并用0.75-2M的磷酸盐水溶液洗涤。在0.75-2M洗涤后，用0.5-1M然后是2M的盐溶液优选地用磷酸盐将层析柱进一步展开。在优选实施方案中，CM101用水从层析柱上洗脱为一个含有10-50％CM101的单峰。另外，将CM101从HIC柱洗脱的水可用水中含10％乙醇、pH6.8的10mM磷酸盐溶液(缓冲液A)代替，然后使用水中含20％乙醇的溶液。在缓冲液A和20％乙醇两个级分中回收CM101活性。一般，缓冲液A不足以从HIC柱上清除所有CM101，所以缓冲液A洗涤后附加20％的乙醇洗涤。然而，在放大时，乙醇构成环境危害并且后来的水峰或缓冲液A及20％乙醇峰级分的苯酚/盐水抽提产生大约相等纯度的CM101。HIC方法清除了98％以上的残存在10k浓缩液或重构乙醇沉淀中的蛋白质和培养基多糖。
从HIC柱得到的浓缩的CM101可以通过苯酚和盐水溶液，优选0.05M盐水抽提进一步纯化。这种附加的步骤提供了CM101级分大约95％的纯度。
从HIC柱上洗脱的水或结合的缓冲液A及20％乙醇级分或者对水透析并冷冻干燥并在0.05M盐溶液中重构，或者在浓缩后对盐水透析。典型地，苯酚被加到材料中并且将溶液快速加热到70-80℃。当形成单一相时，溶液冷却到4℃。所得苯酚/盐水抽提的盐水相含有CM101，然后应用于阳离子交换柱上，例如DEAE。
对于DEAE柱方法，DEAE柱在水中平衡，然后用0.1M盐水、0.05MNaOAc，pH7.4洗柱并用梯度达0.34M NaCl的步骤展开。CM101的洗脱通过ANA-1测定和定量。如同HIC树脂步骤一样，一种离子交换树脂可以通过使用除层析柱外的仪器与含有毒素的材料接触。然后含有CM101的级分对水透析并冷冻干燥。在苯酚/盐水抽提和离子交换层析步骤后，CM101纯度达到95％以上。
层析柱洗脱液或从树脂接触步骤产生的材料之生物学活性通过ANA-1和/或斑点印迹试验测定。然后用绵羊试验证实生物学活性。表1描述了几种从不同批的初始材料获得的并应用到HIC柱上的AP和10k材料数次分离物。变性蛋白质和培养基多糖及其它物质的去除是相似的。
虽然优选的纯化顺序是执行HIC步骤，随后是苯酚/盐水抽提，然后是离子交换步骤，但是纯化也可以另外的顺序进行。
图2显示了用一种已知的方法纯化CM101的一个实施例。值得注意的是使用了70％乙醇沉淀的步骤，随后用苯酚/水抽提。在该已知纯化方法的早期阶段需要大量的乙醇及苯酚，表现了在环境上不安全的操作。图2描绘的方法也需要离子交换柱、凝胶过滤柱和晶状体凝集素柱。
先前的方法包括众多的步骤，其中包括对环境危险的步骤。另一方面，本发明的方法效率高，提供了较高纯度，产量达2到25倍，并且最小限度使用环境不安全材料。
与以前使用的方法相比，环境上有危害的苯酚-水抽提步骤减少了1000倍。而且，通过凝胶过滤方法取消了附加的纯化步骤。先前方法中的晶状体凝集素层析步骤也被去掉。HIC柱、苯酚/盐水抽提以及离子交换柱步骤的最终产物已有大约95％的纯度，所以其它的处理是不必要的。
因此，本发明的纯化方法中所用的疏水性基团的树脂中的疏水性基团是2-12个碳的烷基或苯基基团，优选丁基，更优选正丁基。另外，本发明的纯化方法还可包括用一种水酚混合物抽提毒素以形成包含毒素的水相。
通过本发明的方法纯化的CM101可以用于研究或治疗目的。当CM101与一种药学可接受的载体结合时，它是特别有用的，例如在盐溶液中重构并对患者静脉内施用。施用纯化的CM101的其它剂型也可使用。本发明的药物组合物包含与一种药学可接受载体结合的本发明基本上纯的GBS毒素。通常，这种载体将易于与毒素混合形成能通过静脉(IV)途径施用的组合物。因此，此载体优选为水，其可包含另外的药学可接受的赋形剂以保证适于静脉施用。所得组合物是无菌的并有适宜的渗透性。通常适宜的静脉注射制剂是依照任何本领域技术人员熟知的标准技术制备的。例如Salvatore J.Turco著的Remington’s药物科学第18版，Mach出版公司(Remington’s Pharmaceutical Sciences，MachPublishing Co.)(1990)，第85章题为“静脉内混合物”，在此引入作为参考，提供了用于如本发明的制备药学可接受的IV组合物标准技术。
另外，发现对CM101有积极应答的病况的患者可以用本发明的药物组合物治疗。例如，患有肿瘤的患者可以通过在这里讲的药物组合物静脉用药方便地给予治疗。美国专利第5,010,062号讨论了人类某些肿瘤的治疗，在此引入作为参考。
定量及定性分析
HPLC分析
获自经HIC层析后的样品的CM101之纯度及数量是通过高压液相层析(HPLC)凝胶过滤分析确定的。凝胶过滤柱一般用10％乙腈水溶液平衡，并且生物学活性的CM101洗脱为含有其的均匀窄峰。另外可以在pH8.4的10mM磷酸盐缓冲液中展开，产生一个内含更多CM101的峰。pH8.4的醋酸铵(NH4OAc)缓冲液可以用作10mM磷酸盐缓冲液的另一种替代。
使用30、50和100μg纯的CM101标准于100μl展开缓冲液中注入Hydragel 1000柱(Waters，Millford，MA)，典型的检测反应(UV203吸收值)分别其是26×106、48×106和97×106面积单位，其对未知样品的数量产生一个剂量反应曲线。
CM101的分子量也可通过凝胶过滤层析测定。非变性缓冲液，如前面描述的乙腈、磷酸盐或醋酸铵可用来上样于层析柱。CM101的洗脱物与不同分子量的标准右旋糖苷多糖标记物的洗脱物类似。在这些条件下，CM101的分子量大约为300,000道尔顿。
氨基酸分析
定量和定性的自动化氨基酸分析可以用标准商业化可得的仪器，例如来自Waters，Millford.MA的PicoTag进行。
ANA-1分析
为了监测不同发酵和纯化步骤的生物学活性，在体外试验中可应用一种经转化的鼠巨噬细胞系。这种试验测定了鼠巨噬细胞ANA-1应答与CM101接触产生的IL-6。
特别是，在体外CM101通过IL-6的产生诱导raf/myc转化的鼠骨髓巨噬细胞系ANA-1的应答。其它的巨噬细胞样细胞系以及新鲜的外周血白细胞也可使用。
为进行ANA-1试验，样品首先稀释到合适的范围(根据预期的CM101活性)，并在1∶4稀释度测定4到8个浓度。通过使用在PBS中重构的临床等级的CM101产生一种CM101标准曲线。在PBS中配制4000ng/ml溶液，其在加了细胞之后达到2000ng/ml的最终浓度，以及六个连续的1∶2稀释度。例如可以使用2×106/ml浓度的细胞。通过在ANA-1细胞中加入200U/ml的鼠IFN-γ增加这个试验的敏感度。最终培养物是100U/ml IFN-γ。
带有培养物的微量滴定板应放于37℃含5％CO2气体的潮湿孵箱中过夜(16-18小时)，然后进行ELISA IL-6检测(R.D.系统，Minneapolis，MN)。特别是，培养物上清液被转移到IL-6测定板上，并把此板保持在4℃直到IL-6检测完成。
斑点印迹测定
在溶液中或生物学液体中定量测定CM101的另一种快速方法是在聚偏氟乙烯(PVDF)膜上以系列稀释度印迹样品。通过使用针对CM101的鼠单克隆抗体或荧光标记的针对CM101的鼠单克隆抗体，继之以荧光标记的抗鼠IgG，测定CM101的数量。直接针对CM101抗原的抗体7A3可用于此目的。在不同级分中CM101的数量是通过与系列稀释的CM101的标准曲线比较确定的。
绵羊肺动脉压力试验
通过肺动脉压力增加和肺血管的渗透性增加证明，毒素通过增加肺动脉高压影响绵羊肺部。
在磷酸缓冲盐液(PBS)中的CM101样品可以通过灌注施用于羔羊，以15分钟的间隔记录肺动脉压的变化。这些压力的变化与CM101的活性相关。(Hellerqvist，C.G.等人。B群β-溶血性链球菌的研究I，一种细胞外毒素的分离及部分特征，儿科学研究(Pediatr.Res.)，12：892-898(1981))。
糖分析
100μg量的样品在比例为5∶70∶25的三氟乙酸(TFA)、醋酸(HOAc)和水的混合物中100℃水解2小时。蒸发溶液，样品在TFA和水以2∶8比例的混合物中100℃进一步水解24小时。这种方法完全地水解样品中的所有糖苷键。最初存在于氨基糖上的N-乙酰基基团也被清除。
然后使用PAD(脉冲电流探测器)探测器在Dionex糖分析系统上分析样品。结果示于图4。
样品的纯度通过糖的定量和定性分析确定。原理在图3a-3c和图4中得到阐明。通过HPLC定量的多糖样品用内部标准6-脱氧-D-葡萄糖的水解和分析得到补充。此部分描述的方法在测定的范围内有线性剂量反应，并且通过与标准比较未知的保留时间完成定性分析。
本发明的毒素CM101的特征在于当通过10％乙腈缓冲液，流速为0.3ml/分钟的HPLC分析时，在从时间零点起于16分钟处在203nm吸光度测量到毒素洗脱于一个窄的对称峰。
本发明的毒素CM101的特征在于通过以pH8.4 10mM磷酸盐缓冲液的HPLC分析，在从时间零点起于24分钟处在203nm吸光度测量到毒素洗脱于一个窄的对称峰。
本发明的毒素CM101的特征在于通过一种增加绵羊肺动脉压力的试验测量，其具有比未与疏水相互作用层析树脂接触的B群β-溶血链球菌毒素强2到3倍的比活性。
本发明还涉及包含毒素CM101的组合物，其中当通过10％乙腈缓冲液，流速0.3ml/分钟的HPLC分析时，在从时间零点起于16分钟处在203nm吸光度测量到毒素洗脱于一个窄的对称峰。
本发明还涉及包含毒素CM101的组合的，其中当通过pH8.4，10mM磷酸盐缓冲液的HPLC分析时，在从时间零点起于24分钟处在203nm吸光度测量到毒素洗脱于一个窄的对称峰。
实施例
实施例1：放大的CM101纯化方案
B群链球菌血清型III型分离工作原种与3,000加仑发酵罐一同使用。细菌培养物的25ml种子用于65升有效容积(lwv)的80升容器，然后其用于接种750lwv的容器，并依次接种入最终7500lwv(3,000加仑)的发酵罐。另外，65lwv可以直接用于接种7500lwv发酵罐。
在对数生长后期通过高压灭菌终止培养。然后通过10,000×g连续离心，继之以0.45微米盒式过滤器过滤(Millipore公司，Bedford，MA)除去细菌。
然后使用10kD到50kD截断值的盒式过滤器(Millipore)将所得培养物上清液浓缩15倍到500升。然后通过透析，将浓缩的材料制成2M的盐溶液，优选地用pH7.4的磷酸盐(加样缓冲液)。
然后通过使用BioPilot系统(Pharmacia)的60升正丁基-Sepharose层析柱将浓缩的上清液进行疏水相互作用层析(Pharmacia，Uppsaia，瑞典)。对于培养基浓缩物中CM101生物学活性，无活性流出的正丁基Sepharose树脂的容量大约是80升培养基对1升树脂。在浓缩的上清液加到层析柱之后，用加样缓冲液洗涤柱，然后用0.5-1M继之是0.25M pH7.4磷酸盐缓冲液洗涤。用水洗脱含有CM101的级分于大约120升或两倍柱体积的水中，并在10kD到50kD范围的截断值盒中浓缩到2升。通过BioPiot中预先设定的程序控制层析柱洗脱，并通过在206和280nm的UV吸收、电导率和pH值监控洗脱。
含有CM101的2升级分对pH7.0的0.05M的盐水透析，然后加热到75-80℃并加0.2-2升的苯酚。然后把混合物加热到80℃并在此温度保持5分钟。继之，将混合物冷却到4℃。由这一步骤产生的水相在加到用水平衡的DEAE Sephacel FF层析柱(Pharmacia，Uppsala，瑞典)之前，优选地用0.2倍体积的氯仿抽提2次。层析柱用100mM的盐水，pH7.4的0.05M NaOAc洗涤，然后把生物学活性物质CM101用NaCl梯度从DEAE柱洗脱。用IL-6检测和HPLC分析检测生物学活性。通过HPLC和糖分析以及IL-6及绵羊试验测定生物学活性确定本方法纯化的CM101的质量。
本放大的纯化方案所提供的优点避免了以前方法中使用的乙醇沉淀中大体积的早期苯酚-水抽提方法。
结果
图5a-b显示了在2M K2HPO4，pH7.2的丁基Sepharose HIC柱上，培养基浓缩物的洗脱分布图。不同的峰是在洗脱梯度中随时间逐渐变化的结果。图5a表现了在UV206吸光度测量的分布图，其测定了全部有机材料峰级分的量，并显示CM101在最后的窄峰(大约383分钟)。图5b表现了在UV280吸光度处测定的分布图，其测定了不同级分中蛋白质的量。
通过进行HIC柱步骤，CM101被结合到层析柱上，而高达99.7％的蛋白质和高达98.5％的中性及带电荷的多糖通过层析柱，如表1所示。
表1  通过HIC层析纯化的CM101活性
通过积分UV280和206分布图定量
最终洗脱可能的蛋白质UV280              总有机物UV206
                         回收％             回收％
AP6P6           水       0.85                2.67
AP2P9           水       1.08                0.19
10K5P6          水       0.82                1.05
10K5P6          水       0.46                2.43
AP1P9           缓冲液A  0.39                1.90
10K5P6          缓冲液A  0.50                1.51
AP6P6           缓冲液A  0.19                1.35
在表1中，以乙醇沉淀(AP)、AP1、AP2和AP6以及10K浓缩的不同发酵批次应用于HIC层析并用水或缓冲液A洗脱。两种方法对外源性或内源性蛋白质(UV280)和多糖及普通有机物(LV206)产生大约相同效率的清除。
图6a-b表现了包含CM101的HIC纯化的水洗脱级分在UV203吸光度监测的HPLC分布图和Diodo-Ray频谱。这些图形说明了含有CM101峰的260吸收(RNA和DNA)及280吸收(蛋白质)的最小存在。
在HIC级分进一步经过苯酚/盐水抽提和离子交换步骤后，HIC水洗脱峰的纯度进一步提高，如图7a-b所示。注意到从时间零点始于约16分钟处的窄的对称峰以及在260(RNA/DNA)和280(蛋白质)处无吸收。对图6a-b和7a-b所显示的洗脱分布图，HPLC是用10％乙腈水溶液进行的，流速大约是0.3ml/分钟。
这些洗脱分布图及生物学活性与当乙醇沉淀用作上样到HIC柱的初始材料时获得的那些是相似的。
来自10k初始材料的HIC级分在ANA-1细胞中诱导IL-6合成的能力在图8中得到阐明。如ANA-1试验测得，HIC层析能回收培养基上清中大约总生物学活性的50％。为了确认ANA-1试验的结果，对CM101抗原存在时显示免疫反应性的相同材料进行了斑点印迹试验。
HIC层析后从10k浓缩液得到的不同级分也在用于测定生物学活性的绵羊模型中检测。CM101活性的量是基于使用当前临床CM101(1活性单位对应7.5μg/kg)的剂量反应曲线确定的。结果显示在表2中，其中比较了乙醇沉淀(AP)和培养基浓缩液(10k)的HIC级分。
表2：基于在绵羊模型中生物学活性定量的获自AP和10K材料的HIC层析的CM101的数量
                   乙醇沉淀(AP)      培养基浓缩液
级分(10k)        CM101活性μg/l    CM101活性μg/l
预加样                466            没有提供
1M磷酸盐              118               209
0.25M磷酸盐           28                2970
水                    225               7520
通过本发明的方法纯化的CM101生物学活性也在绵羊中用肺动脉压试验进行了测定，然后与用旧方法纯化的CM101活性进行比较，例如在美国专利第5,010,062号中所讲。依照本发明纯化的材料，比用不与HIC树脂接触的旧方法纯化的材料显示强2到3倍的比活性。
用本发明的方法生产的产物也在上文证明，与上文显示的7520μg/l值相比，已知的方法每升发酵体积提供约300μg的CM101。
在图7a-b阐明的通过本发明的方法获得的纯化CM101也进行了糖分析。糖的产生显示在图9中。
定量地，通过本发明的方法获得的CM101是纯度高于95％的碳水化合物，并含有少于5％的蛋白质，它是通过上面介绍的定性及定量以及自动氨基酸分析(PicoTag，Waters，Millford，MA)确定的。
实施例2：当前临床等级与新组合物的比较
通过本发明的方法获得的CM101比当前临床等级CM101更好。特别的，图10与图7a的HPLC洗脱分布图相比较，说明依据本发明生产的样品纯度较高。图7a显示了一个窄的对称主要峰而不是数个峰。
为了进一步证明使用HIC柱的优点并提供纯化已知为CM101的毒素的证据，当前临床等级的CM101被加到HIC柱并进行HPLC纯化以及糖分析。示于图11中的结果可以与图9比较。糖分析显示了最终产物在数量和质量上相似，证明了HIC层析方法去除糖，并不涉及生物学活性的CM101。结果在表3中也同样得到证实。
表3：CM101的碳水化合物组分(以整体的碳水化合物比率表示)
用本方法纯化的CM101 当前临床等级CM101 进一步纯化的当前临床等级CM101
糖
鼠李糖 0 3 0
甘露糖 1 3 1
半乳糖 3 24 3
葡萄糖 1 7 1
葡糖胺* 1 13 1
半乳糖胺* 1 5 1
*在天然的多糖中分别以“N-乙酰基-葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺”表示。
上面所示的糖残基表提供了大概的摩尔比例。依照本方法纯化的CM101实际的残基范围是(第一栏)(0.2-1甘露糖)∶(2.5-3.5半乳糖)∶(0.5-1葡萄糖)∶(1N-乙酰基葡糖胺)∶(0.5-1N-乙酰基半乳糖胺)。上述数目用N-乙酰基葡糖胺的数目标准化，因此N-乙酰基葡糖胺被设成1。
为了进一步的比较，图12a-b显示了用旧方法(图12a)以及依照本发明的方法(图12b)生产的CM101的HPLC分布图。凝胶过滤柱(Ultrage 100，Waters，Milford，MA)在pH8.4的10mM磷酸盐缓冲液中展开。如图12b所见，依照本发明的方法纯化的CM101洗脱在一个大约超过约5分钟的范围相对窄的峰里。以0.3ml/分钟流速从时间零点起洗脱时间大约是24分钟。与此相比，通过旧的方法纯化材料洗脱在一个大约超过12分钟的宽峰里。
实施例3：通过SDS-PAGE/Western印迹分析CM101
使用4-20％的梯度胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。CM101的样品在2％SDS、0.5M Tris-HCL、5％甘油、0.05％溴酚兰和5％β-巯基乙醇组成的，pH0.8的缓冲液中55℃孵育10分钟，加到4％的积层胶并用4-20％的SDS分离胶电泳。凝胶以200伏电压电泳90分钟。
凝胶在Western印迹缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸和20％甲醇)中展开并以100伏电压印迹2小时。凝胶在室温下于含5％脱脂奶粉的PBS中封闭1小时，用结合缓冲液(磷酸盐缓冲液，2％胎牛血清和0.5％吐温-20去垢剂(BBT))清洗两次，然后与10μg/ml的7A3(针对CM101的单克隆抗体)孵育1小时。
凝胶用BBT清洗4次10分钟，然后与碱性磷酸酶结合的抗鼠抗体孵育45分钟，用BBT清洗4次，用Pierce Single-Step AP显影剂显影50分钟。
在这些条件下分析时，SDS-PAGE/Western印迹分析提示CM101中含有一种或多种26,000道尔顿的成分。
因而，本发明的方法提供了一个改进的纯化方法，其把危险步骤的困难降到最小并提供极好的纯度。另外，通过在这里讲的方法生产的产物比当前用到的CM101更好。
在本说明书中提及的所有的出版物及专利申请在此引入作为相同范围的参考，好象每一单独的出版物和专利申请被明确和个别地指出在此引入作为参考。
本发明现已经完全描述，在不偏离这些附加权利要求的精神或范围的情况下能够对它做很多改变和修饰，这对本领域的普通技术人员都是显而易见的。

Claims (35)

1.一种从B群β-溶血链球菌细菌中纯化多糖毒素的方法，此方法包括：
(a)将一种含有该毒素的水混合物与一种疏水相互作用层析树脂接触，且
(b)从疏水相互作用层析树脂中分离毒素，
其中该毒素是CM101，含有甘露糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰基葡糖胺以及N-乙酰基半乳糖胺的糖残基，其摩尔比为(0.2-1甘露糖)∶(2.5-3.5半乳糖)∶(0.5-1葡萄糖)∶(1 N-乙酰基葡糖胺)∶(0.5-1N-乙酰基半乳糖胺)，并且分离毒素的步骤产生的毒素纯度至少为60％。
2.权利要求1的方法，其中自疏水相互作用层析树脂分离毒素的步骤产生的毒素纯度相对于水混合物中的毒素纯度增加了100-500倍。
3.权利要求1的方法，其中疏水相互作用层析树脂还包括一种含选自烷基、烷氧基和芳基基团的疏水性基团的树脂。
4.权利要求3的方法，其中疏水性基团是含范围在2到12个碳的烷基基团。
5.权利要求4的方法，其中疏水性基团是丁基基团。
6.权利要求5的方法，其中疏水性基团是正丁基基团。
7.权利要求3的方法，其中疏水性基团是苯基基团。
8.权利要求1的方法，其还包括用一种水酚混合物抽提毒素以形成包含毒素的水相。
9.权利要求1的方法，其还包括：
(a)用离子交换树脂接触毒素，且
(b)从该离子交换树脂中分离毒素。
10.权利要求9的方法，其中自离子交换树脂分离毒素的步骤产生的毒素纯度至少是90％。
11.权利要求10的方法，其中自离子交换树脂分离毒素的步骤产生的毒素纯度至少是95％。
12.权利要求1的方法，其还包括在疏水相互作用层析树脂分离毒素的步骤后：
(a)用一种水酚混合物抽提毒素以形成包含毒素的水相，
(b)用离子交换树脂接触毒素，且
(c)从该离子交换树脂中分离毒素。
13.一种用权利要求1的方法纯化的来自B群β-溶血链球菌细菌中的多糖毒素，其中毒素包含甘露糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰基葡糖胺以及N-乙酰基半乳糖胺的糖残基，其摩尔比为(0.2-1甘露糖)∶(2.5-3.5半乳糖)∶(0.5-1葡萄糖)∶(1N-乙酰基葡糖胺)∶(0.5-1N-乙酰基半乳糖胺)。
14.权利要求13的毒素，其中该毒素是CM101。
15.权利要求14的毒素，其中该毒素纯度至少为60％。
16.权利要求15的毒素，其中该毒素纯度至少为90％。
17.权利要求16的毒素，其中该毒素纯度至少为95％。
18.权利要求13的毒素，其中甘露糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰基葡糖胺以及N-乙酰基半乳糖胺的糖残基以(1甘露糖)∶(3半乳糖)∶(1葡萄糖)∶(1N-乙酰基葡糖胺)∶(1N-乙酰基半乳糖胺)的摩尔比存在。
19.权利要求14的毒素，其在非变性条件下通过凝胶过滤层析测量的分子量为300,000道尔顿。
20.权利要求14的毒素，其特征在于当通过10％乙腈缓冲液，流速为0.3ml/分钟的HPLC分析时，在从时间零点起于16分钟处在203nm吸光度测量到毒素洗脱于一个窄的对称峰。
21.权利要求14的毒素，其特征在于通过以pH8.4 10mM磷酸盐缓冲液的HPLC分析，在从时间零点起于24分钟处在203nm吸光度测量到毒素洗脱于一个窄的对称峰。
22.权利要求14的毒素，通过一种增加绵羊肺动脉压力的试验测量，其具有比未与疏水相互作用层析树脂接触的B群β-溶血链球菌毒素强2到3倍的比活性。
23.一种从B群β-溶血链球菌细菌中纯化多糖毒素的方法，其包括：
(1)将GBS细菌毒素原料上样于疏水相互作用层析柱，
(2)洗脱疏水相互作用层析柱以获得包含毒素的疏水相互作用层析洗脱物，
(3)用苯酚和水溶液的混合物抽提疏水相互作用层析洗脱物以形成包含毒素的水相，
(4)将该水相上样于离子交换柱，并
(5)洗脱离子交换柱以获得离子交换洗脱物，其中离子交换洗脱物包含毒素。
其中该毒素是CM101，含有甘露糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰基葡糖胺以及N-乙酰基半乳糖胺的糖残基，其摩尔比为(0.2-1甘露糖)∶(2.5-3.5半乳糖)∶(0.5-1葡萄糖)∶(1 N-乙酰基葡糖胺)∶(0.5-1N-乙酰基半乳糖胺)，并且毒素纯度至少是60％。
24.权利要求23的方法，其中毒素纯度至少是95％。
25.一种组合物，其由权利要求1所述方法纯化的来自B群β-溶血链球菌细菌的多糖毒素组成，其中还包含甘露糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰基葡糖胺以及N-乙酰基半乳糖胺的糖残基，其摩尔比为(0.2-1甘露糖)∶(2.5-3.5半乳糖)∶(0.5-1葡萄糖)∶(1N-乙酰基葡糖胺)∶(0.5-1N-乙酰基半乳糖胺)。
26.权利要求25的组合物，其中毒素是CM101。
27.权利要求26的组合物，其中该毒素纯度至少是60％。
28.权利要求27的组合物，其中该毒素纯度至少是90％。
29.权利要求28的组合物，其中该毒素纯度至少是95％。
30.权利要求25的组合物，其中甘露糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰基葡糖胺以及N-乙酰基半乳糖胺的糖残基以(1甘露糖)∶(3半乳糖)∶(1葡萄糖)∶(1N-乙酰基葡糖胺)∶(1N-乙酰基半乳糖胺)的摩尔比存在。
31.权利要求26的组合物，其中该毒素在非变性条件下通过凝胶过滤层析测量其分子量为300,000道尔顿。
32.权利要求26的组合物，其中当通过10％乙腈缓冲液，流速0.3ml/分钟的HPLC分析时，在从时间零点起于16分钟处在203nm吸光度测量到毒素洗脱于一个窄的对称峰。
33.权利要求26的组合物，其中当通过pH8.4，10mM磷酸盐缓冲液的HPLC分析时，在从时间零点起于24分钟处在203nm吸光度测量到毒素洗脱于一个窄的对称峰。
34.一种药物组合物，其包含权利要求1所述方法纯化的来自B群β-溶血链球菌细菌的多糖毒素和一种药学可接受的载体。
35.权利要求34的药物组合物，其中该组合物纯度至少为60％。
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