DE69229572T2

DE69229572T2 - Gliazellen-aktivierender Faktor und dessen Herstellung

Info

Publication number: DE69229572T2
Application number: DE69229572T
Authority: DE
Inventors: Tatsuya Kondo; Tsutomu Kurokawa; Ken-Ichi Naruo; Chisako Seko
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1991-02-14
Filing date: 1992-02-13
Publication date: 1999-11-11
Anticipated expiration: 2012-02-14
Also published as: EP0503297B1; DE69229572D1; CA2061148C; ATE182174T1; JP3385040B2; US5622928A; CA2061148A1; JPH05301893A; US5512460A; EP0503297A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Gliaaktivierungsfaktor, ein neues Polypeptid, das aus einer Gliomzellkulturlösung erhalten wird und gegenüber Gliazellen, Fibroblasten und dergleichen eine wachstumsfördernde Aktivität zeigt, eine für den Gliaaktivierungsfaktor kodierende DNA und eine rekombinante DNA zur Herstellung des Gliaaktivierungsfaktors.
Es sind verschiedene Wachstumsfaktoren aufgefunden, untersucht und verwendet worden [Cellular & Molecular Biology, herausgegegeben von The Japanese Tissue Culture Association, Asakura Shoten (1987)]. Derartige Zellwachstumsfaktoren schließen den Epidermiswachstumsfaktor (EGF), aus Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor(PDGF), den sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF) und basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) ein. Alle diese Faktoren sind auf der Grundlage der Wachstumsförderung von Fibroblastenzellen isoliert worden. Von diesen Faktoren ist jedoch auch gefunden worden, daß sie eine weitreichende Aktivität und schlechte Spezifität zeigen. Demgemäß sind kürzlich Anstrengungen unternommen worden, nach Wachstumsfaktoren zu suchen, die auf funktionell differenzierte Zellen spezifisch einwirken. Als Ergebnis sind Wachstumsfaktoren wie etwa der Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF) und Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) isoliert worden, wodurch auf diese Weise die Möglichkeit geschaffen wurde, daß diese Faktoren zum Behandeln von Krankheiten verwendet werden können, die in ihrem spezifischen Wirkungsspektrum angreifbar sind.
Von der Enzephalopathie des Alters, insbesondere Demenz, ist gefunden worden, daß sie aus bekannten Störungen wie etwa verletzungsbedingtem Hirnnervenzellentod und aus unbekannten Störungen folgt. Da Hirnnervenzellen unmittelbar nach der Geburt aufhören, sich zu vermehren, und ihre Zahl danach allmählich abnimmt, gibt es keinen natürlichen Mechanismus, durch den eine geschädigte Hirnnervenzelle in bedeutendem Maß repariert wird oder neue Hirnnervenzellen hinzugefügt werden. So bedarf die Wiederherstellung der Hirnnervenzellenaktivität künstlicher Stimuli.
Gliazellen, die entsprechend ihrer Form und Funktion entweder als Typ I- oder Typ II-Astrozyten oder Oligodendrozyten klassifiziert werden, umgeben die Hirnnervenzellen und unterstützen das Überleben. Die Aktivierung dieser Gliazellen führt zur Aktivierung und Erhalt der Hirnnervenzellen. Eine derartige Aktivierung und Erhalt ist ein wichtiges Maß für die Verbesserung eines enzephalopathologischen Zustandes. Trotz ausgedehnter Forschung über den Nachweis des durch Gliazellen freigesetzten neurotrophen Faktors ist noch kein bestimmter Faktor gefunden worden. Dementsprechend hat sich die Forschung auf die Aktivierung der Gliazellen und der auf diese Gliazellen einwirkenden Wachstumsfaktoren konzentriert.
Wie vorstehend beschrieben ist der Nachweis und die Isolierung von auf die Gliazellen einwirkenden Wachstumsfaktoren untersucht worden, um ihre Fähigkeit zum Aktivieren von Hirnnervenzellen auszunützen und von PDGF und FGF ist bekannt, daß sie auch gegen Gliazellen eine wachstumsfördernde Aktivität zeigen. Die Spezifität dieser Faktoren ist jedoch so schlecht, daß sie gegen andere Zelltypen eine starke wachstumsfördernde Aktivität zeigen. Demgemäß konnten sie nicht befriedigend als Wirkstoffe verwendet werden. Zusammengefaßt ist im Stand der Technik kein Faktor erfolgreich ermittelt worden, der Gliazellen stark und spezifisch aktiviert und somit ist kein Wirkstoff bereitgestellt worden, der Enzephalopathie zu behandeln vermag.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Im Laufe ihrer Forschung fanden die Erfinder einen wachstumsfördernden Faktor, der nicht nur Gliazellen aktiviert, sondern auch durch Gliazellen produziert wird. Eine Produktion dieses Faktors in großem Maßstab wird jedoch aus zwei Gründen behindert. Erstens macht die Unfähigkeit sich zu vermehren das Sammeln von Gliazellen aus Menschen in großem Maßstab unmöglich. Zweitens gibt es keine bekannte Technik, durch die einige Gliazellen erhalten und kultiviert werden können. Deshalb ist ein Ersatzsubstrat für die Gliazellen erforderlich.
Angesichts dieser Probleme begannen die Erfinder mit der Arbeit an Gliomzellen. Da Gliomzellinien die Eigenschaften normaler Gliazellen aufweisen, wurde von ihnen angenommen, daß sie ein gleichwertiges Ersatzsubstrat seien. Unter Verwenden der Gliomzellen konnten die Erfinder den vorstehend angeführten Gliaaktivierungsfaktor (hierin nachstehend "GAF") isolieren und reinigen.
Obschon die Verwendung von Gliomzellen zur Isolierung und Reinigung von GAF geeignet ist, ist es ihre Verwendung zur GAF- Produktion in großem Maßstab nicht. Die Erfinder fanden, daß die aus den humanen Gliomzellen erhaltene Menge GAF sehr gering ist. Deshalb ist zur Kultivierung großer Mengen Gliomzellen zum Erhalten von GAF in Mengen, die zur Verwendung als Wirkstoff oder Forschungsmaterial ausreichen, ein untragbarer Zeit- und Arbeitsaufwand erforderlich. Zum Erhöhen der GAF- Produktion untersuchten die Erfinder ein Verfahren, das das Klonieren eines für den GAF kodierenden Polynukleotids und das Anwenden des klonierten Polynukleotids bei einer kürzlich entwickelten Technik mit rekombinanter DNA unter Verwenden des Polynukleotids umfaßt.
In Fortführung dieses vorgeschlagenen Verfahrens wurde die Aminosäuresequenz der N-terminalen Seite von GAF analysiert synthetisiert. Unter Verwenden der vorstehend angeführten Sonde wurde ein Durchmustern auf cDNA-Bibliotheken ausgeführt, die aus mRNA aus der Human-Gliomzelle NMC-G1 oder aus der menschlichen Vorhaut stammenden Primärkulturzellen hergestellt wurden, und Human-GAF-cDNA wurde kloniert. Schließlich wurde Human-GAF durch Aufbauen eines diese cDNA enthaltenden Expressionsplasmids und Kultivieren mit diesem Plasmid transformierter Transformanten hergestellt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird
(1) ein Gliaaktivierungsfaktor, der ein durch die folgende Aminosäuresequenz dargestelltes Polypeptid:
oder Mutein oder Fragment davon enthält, wobei der Gliaaktivierungsfaktor, das Mutein und Fragment jeweils die folgenden Eigenschaften aufweisen:
(a) der Gliaaktivierungsfaktor, das Mutein oder Fragment zeigen jeweils keine immunologische Kreuzreaktion mit aus Blutplättchen stammendem Wachstumsfaktor (PDGF), saurem Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF) oder basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) und
(b) der Gliaaktivierungsfaktor, das Mutein oder Fragment zeigen jeweils eine wachstumsfördernde Aktivität auf Gliazellen, Fibroblasten und Ratten-Phänochromozytom-PC-12-Zellen;
(2) der Gliaaktivierungsfaktor gemäß vorstehend (1), wobei das Polypeptid durch die folgende Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 (n = 0), SEQ ID Nr. 3 (n = 1) dargestellt wird:
worin n 0 oder 1 ist, X&sub1;
oder ein Fragment davon darstellt und X&sub2; Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser oder ein Fragment davon darstellt;
(3) der Gliaaktivierungsfaktor gemäß vorstehend (1), wobei das Polypeptid durch- die folgende Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 4 (n - 0, X&sub3; = Ala Pro), SEQ ID Nr. 5 (n = 0, X&sub3; = Leu Gly ... Leu Leu), SEQ ID Nr. 6 (n = 1, X&sub3; = Ala Pro), SEQ ID Nr. 7 (n = 1, X&sub3; = Leu Gly... Leu Leu) dargestellt wird:
oder ein Fragment davon darstellt;
(4) der Gliaaktivierungsfaktor gemäß vorstehend (3), wobei das Polypeptid durch die folgende Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 8 (X&sub1;' - Met), SEQ ID Nr. 9 (X&sub1;' = Met Ala Pro)) dargestellt wird:
oder ein Fragment davon darstellt;
(5) eine DNA, die ein Polynukleotid enthält, das für einen in (1) bis (4) beschriebenen Gliaaktivierungsfaktor kloniert;
(6) die in (5) beschriebene DNA, bei der das Polynukleotid die folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 10) enthält:
(7) die in (5) beschriebene DNA, bei der das Polynukleotid durch die folgende Nukleotidseguenz (SEQ ID Nr. 11) dargestellt wird:
worin Y&sub1;
oder ein Fragment davon darstellt und Y&sub2;
oder ein Fragment davon darstellt,
oder eine Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 12) mit einem Startkodon an deren 5'-Terminus;
(8) die in (5) beschriebene DNA, bei der das Polynukleotid durch die folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 13) dargestellt wird:
oder ein Fragment davon, oder eine Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 14) mit einem Startkodon ATG an deren 5'-Terminus;
(9) die in (8) beschriebene DNA, bei der das Polynukleotid durch die folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 15) dargestellt wird:
worin Y'
oder ein Fragment davon darstellt.
(10) eine Transformante mit einem Vektor, der die in (5) beschriebene DNA enthält;
(11) ein Verfahren zum Herstellen des vorstehenden Gliaaktivierungsfaktors, das das Transformieren eines Wirts mit der in (5) beschriebenen DNA, Kultivieren der erhaltenen Transformante in einem Medium, Anreichern des Gliaaktivierungsfaktors in einem Kulturprodukt unter Bilden eines angereicherten Produktes und Sammeln des sich daraus ergebenden angereicherten Gliaaktivierungsfaktors umfaßt;
(12) eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines vorstehend in (1)-(3) beschriebenen Gliaaktivierungsfaktors und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger;
(13) Verwendung eines vorstehend in (1)-(3) beschriebenen Gliaaktivierungsfaktors zum Herstellen eines Arzneimittels zum Fördern einer Zunahme der Blutplättchenzahl;
(14) Verwendung eines vorstehend in (1)-(3) beschriebenen Gliaaktivierungsfaktors zum Herstellen eines Arzneimittels zur Behandlung oder Besserung der Alzheimer-Krankheit;
(15) Verwendung eines in einem der Ansprüche 1-3 beanspruchten Gliaaktivierungsfaktors zum Herstellen eines Arzneimittels zur Behandlung oder Besserung von Hirnläsionen, Hirnödem, seniler Demenz oder Diabetesneuropathie.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt Elutionsmuster von Protein und die Aktivität an einer Heparin-Sepharose®-CL-6B-Säule (Beispiel 1-(2), Schritt 1);
Fig. 2 zeigt Elutionsmuster von Protein und die Aktivität an einer Sephacryl®-S-200-HR-Säule (Beispiel 1-(2), Schritt 3);
Fig. 3 zeigt Elutionsmuster von Protein und die Aktivität an einer Heparin-Sepharose®-CL-6B-Säule (Beispiel 1-(2), Schritt 4);
Fig. 4 zeigt Elutionsmuster von Protein und Aktivität an HR- 894-Heparin-Hochieistungsflüssigkeit (Beispiel 1-(2), Schritt 5);
Fig. 5 zeigt Protein- und Aktivitätselutionsmuster durch Vydac C4-Hochleistungsflüssigkeit (Beispiel 1-(2), Schritt 6);
Fig. 6 ist ein SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresediagramm eines (aus NMC-G1 stammenden) gereinigten Gliaaktivierungsfaktors;
Fig. 7 ist eine graphische Darstellung, die die wachstumsfördernde Aktivität des gereinigten Gliaaktivierungsfaktors auf Gliazellen zeigt;
Fig. 8 ist eine graphische Darstellung, die die wachstumsfördernde Aktivität aus NMC-G1 stammendem, gereinigten Gliawachstumsaktivierungsfaktor auf die Gliazellen zeigt, die nach Reinigung mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie erneut bestimmt wird;
Fig. 9 ist eine graphische Darstellung, die Zunahmen der Gliazellenzahl durch den (aus NMC-G1 stammenden) Gliaaktivierungsfaktor zeigt;
Fig. 10 ist eine graphische Darstellung, die den zeitlichen Verlauf des Tritiumthymidineinbaus in die Gliazellen durch den (aus NMC-G1 stammenden) Gliaaktivierungsfaktor zeigt, wobei eine Gruppe bezeichnet, der GAF zugesetzt wurde, und -O- zeigt eine Kontrollgruppe an, an die kein GAF zugesetzt wurde;
Fig. 11 ist eine graphische Darstellung, die die wachstumsfördexnde Aktivität des (aus NMC-G1 stammenden) gereinigten Gliaaktivierungsfaktors auf Fibroblastenzellen des BALB/3T3- Maus-Klons A31 zeigt;
Fig. 12 ist eine graphische Darstellung, die die wachstumsfördernde Aktivität des (aus NMC-G1 stammenden) gereinigten Gliaaktivierungsfaktors auf Zellen des BALB/3T3-Maus-Klons A31 zeigt, die nach der Reinigung mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie erneut bestimmt wird;
Fig. 13 ist eine graphische Darstellung, die die wachstumsfördernde Aktivität des (aus NMC-G1 stammenden) gereinigten Gliaaktivierungsfaktors auf Gefäßendotheliumszellen der menschlichen Nabelschnur zeigt;
Fig. 14 ist eine graphische Darstellung, die die den Tritiumthymidineinbau fördernde Aktivität des (aus NMC-G1 stammenden) gereinigten Gliaaktivierungsfaktors auf PC-12-Zellen zeigt, die aus dem Ratten-Nebennierenmelanozytom stammen.
Fig. 15 ist eine graphische Darstellung, die die Wärme- und Säurestabilitäten von (aus NMC-G1 stammendem) Gliaaktivierungsfaktor zeigt;
Fig. 16 ist ein Diagramm, das die immunologische Kreuzreaktion des (aus NMC-1 stammenden) Gliaaktivierungsfaktors mit aFGF und bFGF zeigt;
Fig. 17 ist ein Diagramm, das mittels Biotinyl-Concanavalin A, Avidin und Biotinylperoxidase angefärbten (aus NMC-G1 stammenden) GAF zeigt;
Fig. 18 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer N- Glycanasebehandlung von (aus NMC-G1 stammendem) GAF zeigt;
Fig. 19 zeigt eine Nukleotidsequenzvon GAF-cDNA und eine daraus abgeleitete Aminosäuresequenz;
Fig. 20 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse zeigt, die durch Exprimieren von pGAF1 in COS-7-Zellen und Bestimmen der wachstumsfördernden Aktivität davon auf die Gliazellen erhalten wurden;
Fig. 21 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau von Plasmid pDGAF1 zeigt;
Fig. 22 ist eine graphische Darstellung, die die in einem Kulturüberstand Methotrexat-resistenter CHO-Zellen enthaltene GAF-Aktivität zeigt;
Fig. 23 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau von Plasmid pETGAF1 zeigt;
Fig. 24 ist ein Diagramm, das in einem Extrakt von MM294(DE3)/pLysS, pETGAF1 enthaltenen rhGAF zeigt, der durch das Western-Blotting-Verfahren angefärbt wurde;
Fig. 25 zeigt ein Proteinelutionsmuster an einer hydrophoben Säule (Beispiel 7-(3), Schritt 2);
Fig. 26 zeigt ein Proteinelutionsmuster bei der Heparin- Affinitätshochleistungsflüssigkeitschromatographie (Beispiel 8-(3), Schritt 3);
Fig. 27 zeigt ein SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresediagramm von gereinigtem rhGAF;
Fig. 28 ist ein Diagramm, das den durch das Western-Blotting- Verfahren angefärbten gereinigten rhGAF zeigt;
Fig. 29 ist eine graphische Darstellung, die die wachstumsfördernde Aktivität des gereinigten rhGAF auf die Gliazellen zeigt;
Fig. 30 ist eine graphische Darstellung, die die wachstumsfördernde Aktivität des gereinigten rhGAF auf Zellen des BALB/3T3-Maus-Klons A31 zeigt;
Fig. 31 ist eine graphische Darstellung, die die wachstumsfördernde Aktivität des gereinigten rhGAF auf Ratten- Gefäßglattmuskelzellen zeigt;
Fig. 32 ist eine graphische Darstellung, die die Aktivität des gereinigten rhGAF auf die Vermehrung von Gefäßendotheliumszellen der menschlichen Nabelschnur zeigt;
Fig. 33 ist eine graphische Darstellung, die die Aktivität des gereinigten rhGAF auf die Vermehrung von Mausknochenmarkzellen zeigt, und
Fig. 34 ist eine graphische Darstellung, die die Aktivität des gereinigten rhGAF auf die Vermehrung von Megakariozyten in den Mausknochenmarkzellen zeigt.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird GAF bereitgestellt, der ein Protein ist, das aus einem Kulturüberstand isoliert wurde, der durch Kultivieren der aus dem Menschen stammenden Gliomzellen oder der Transformanten mit GAF-kodierender DNA und mit einer wachstumsfördernden Aktivität auf Gliazellen und Fibroblasten erhalten wurde.
Aus Gliomzellen erhältlicher GAF weist weiter die folgenden Eigenschaften auf:
(a) Heparinaffinität (er wird aus einer Heparin-Sepharose®- Säule bei einer Kochsalzkonzentration von 0,4 bis 0,9 M eluiert).
(b) Molekulargewicht: dieser Faktor schließt drei Molekülarten mit durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gemessenen Molekulargewichten von 25 000, 29 000 und 30 000 ein.
(c) Aktivitätsstabilität: die Aktivität wird durch 5 Minuten Wärmebehandlung bei 100ºC verloren und durch 30 Minuten Behandlung bei pH 2 teilweise verloren.
(d) Antigenität: dieser Faktor zeigt keinerlei immunologische Kreuzreaktion mit aus Blutplättchen stammendem Wachstumsfaktor (PDGF), saurem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (aFGF) und basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF).
(e) Biologische Aktivität: dieser Faktor zeigt eine wachstumsfördernde Aktivität auf Gliazellen, Fibroblasten und Ratten- Phänochromozytom-PC-12-Zellen.
Aus Gliomzellen erhaltener GAF schließt drei Molekülarten mit Molekulargewichten von 25 000, 29 000 beziehungsweise 30 000 ein, wobei jede Art aus demselben Gen stammt. Es wurde gefunden, daß jede eine gleichwertige biologische Aktivität aufweist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird weiter ein Verfahren zum Herstellen des GAF bereitgestellt, das das Kultivieren der vorstehend beschriebenen, aus dem Menschen stammenden Gliomzellen oder Transformanten, Sammeln des GAF aus einem Kulturüberstand davon und Reinigen des gesammelten GAF umfaßt.
Der Zellkulturüberstand zum Erhalten von GAF kann durch die Kultur von Gliomzellen, zum Beispiel der Human-Gliomzelle NMC- G1 hergestellt werden. Jedes Kulturverfahren wie etwa stationäre Kultur, Rollflaschenkultur, Zellfabrik- oder Suspensionskultur kann zur Kultur von Gliomzellen verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die Rollflaschenkultur das bevorzugte Verfahren. Auf diese Weise wird ein Medium zur Kultur von Tierzellen wie etwa MEM- Medium [Science 122 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology 8 396 (1959)], RPMI1640-Medium [Journal of the American Medical Association 199 519 (1967)] und 199-Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine 73 1 (1950)] zur Kultivierung verwendet. Vorzugsweise wird DMEM-Medium verwendet. Diese Medien können mit bis zu 20%, vorzugsweise 5 bis 20% fetalem Kälberserum ergänzt sein. Der pH ist vorzugsweise 6 bis 8. Die Kultur wird 24 bis 100 Stunden bei 30 bis 40ºC, vorzugsweise bei 37ºC, nötigenfalls unter Austausch des Mediums durchgeführt.
Die Abtrennung und Reinigung von GAF-Protein aus dem vorstehend angeführten Kulturüberstand kann durch geeignete Kombinationen wohlbekannter Trenn- und Reinigungsverfahren durchgeführt werden. Diese bekannten Trenn- und Reinigungsverfahren schließen Verfahren, die einen Löslichkeitsunterschied ausnützen, wie etwa Aussalzen und Lösungsmittelfällung, Verfahren, die hauptsächlich einen Molekulargewichtsunterschied ausnützen, wie etwa Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Verfahren, die einen Unterschied bei der elektrischen Ladung ausnützen, wie etwa Ionenaustauschchromatographie und isoelektrisch fokussierende Elektrophorese, Verfahren, die einen Unterschied bei der spezifischen Affinität ausnützen, wie etwa Affinitätschromatographie, und Verfahren ein, die einen Hydrophobieunterschied ausnützen, wie etwa Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie.
Bevorzugte Trennverfahren für GAF-Protein nützen chromatographische Techniken, wobei die vorstehend angeführte Kulturlösung nach dem Entfernen ausgefallener Verunreinigungen durch Zentrifugieren der Heparin-Sepharosechromatographie unter Adsorbieren und Eluieren von GAF-Protein unterzogen wird, so daß das Protein wirksam konzentriert und gereinigt werden kann.
Die Gelfiltration mittels Sephacryl®S-200 ist zur Reinigung von GAF-Protein ebenfalls wirkungsvoll. In bevorzugten Ausführungsformen wird ein durch eine Heparin-Sepharose®-Säule konzentriertes, GAF-Protein enthaltendes Eluat durch die Anwendung einer Ultrafiltration weiter konzentriert und der Chroma tographie mittels einer Sephacryl®S-200-Säule unter Eluieren von GAF-Protein mit einer Pufferlösung unterzogen.
Die Säulenchromatographie mit einem sauren Harz wie etwa cm- Cellulose ist ebenfalls eine wirkungsvolle Trenn- und Reinigungstechnik. In bevorzugten Ausführungsformen wird eine mit demselben Puffer äquilibrierte Chromatographiesäule mit einer gegen einen schwach sauren Puffer dialysierten Probe beladen und durch Verwenden eines Salzes wie etwa NaCl kann eine lineare Gradientenelution bewerkstelligt werden.
Die Affinitätschromatographie über Heparin-Sepharose ist sehr wirkungsvoll. Zum Beispiel wird eine mit einem nahezu neutralen Puffer wie etwa Tris-Salzsäure oder Tris-Phosphorsäure äquilibrierte Heparin-Sepharose®-Säule mit einer GAF-Protein enthaltenden Lösung beladen und die Säule wird gründlich gewaschen. Anschließend wird durch Verwendung eines Salzes wie etwa NaCl eine lineare Gradientenelution bewerkstelligt, wodurch GAF-Protein eluiert werden kann.
Insbesondere sind Heparinsäulen zur Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (zum Beispiel Shodex AF pak HR-894, Showa Denko K. K., Japan) wirkungsvoll und können in einer zu der vorstehend angeführten Heparin-Sepharose®-Säule ähnlichen Weise verwendet werden.
GAF-Protein kann auch durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt werden, die bei der Reinigung vieler Proteine ausgezeichnete Ergebnisse ergibt. Die Säule wird zum Beispiel mit einer 0,1% Trifluoressigsäure enthaltenden Lösung beladen und die Elution kann durch einen Gradienten aus 0,1% Trifluoressigsäure zugesetztem Acetonitril durchgeführt werden.
GAF-Protein kann durch geeignete Kombinationen der vorstehend beschriebenen Verfahren als homogene Probe erhalten werden. Die Verwendung einer Spurenmenge Tensid bei dem Reinigungsverfahren oder Lagervorgang ist dazu geeignet, zu verhindern, daß eine Probe an einer Chromatographiesäule oder einem Gefäß adsorbiert wird. Bevorzugte Tenside schließen 3-[(3-Chloramidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS), NP-40 und Triton® X100 ein. Bei gewissen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist CHAPS bevorzugt.
GAF-Protein im Kulturüberstand und in den Lösungen des Reinigungsverfahrens kann auf wachstumsfördernde Aktivität auf der Grundlage der 3H-Thymidinaufnahme durch Primärkultur-Gliazellen, die aus dem Gehirn eines Rattenfötus (19 Tage nach der Befruchtung) isoliert wurden, oder durch BALB/c3T3-Zellen bestimmt werden.
Die sich daraus ergebende gereinigte Probe kann auch unter Bilden eines trockenen Pulvers dialysiert und lyophilisiert werden. Weiter wird auch geeigneterweise Serumalbumin zugesetzt, um beim Lagern der Probe behilflich zu sein.
Unter Verwenden der gereinigten Probe kann die Zuckerkettenstruktur von GAF-Protein untersucht werden. Zu diesem Zweck können Blotting-Versuche unter Verwenden von Lectin als Sonde oder Verdauungsversuche mit Zuckerketten abbauenden Enzymen benützt werden.
Nach dem Erhalten einer gereinigten Probe kann die Aminosäuresequenz der N-terminalen Seite direkt mit einem Aminosäuresequenzierer untersucht werden. Weiterhin werden nach dem Abbau der gereinigten Probe mit Proteinasen wie etwa Trypsin, Lysylende-Proteinase und V8-Protease die sich daraus ergebenden Peptidfragmente mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssig keitschromatographie getrennt und die Aminosäuresequenz für jede Sequenz kann unter Erhalten von Informationen über die Aminosäuresequenzen im inneren Teil des Proteins untersucht werden.
Die Verwendung eines automatischen Aminosäurensequenzierers (zum Beispiel Modell 470A, Applied Biosystems, USA) ist zur Bestimmung der Aminosäuresequenz besonders wirkungsvoll.
Die Nukleotidsequenz wird auf der Grundlage der sich daraus ergebenden Aminosäuresequenz abgeleitet und das Oligonukleotid, das zum Klonieren von cDNA, die für GAF-Protein kodiert, verwendet werden kann, wird synthetisiert.
Die auf diese Weise erhaltene cDNA wird in Organismen wie etwa Escherichia coli, Bacillus subtilis und Hefe exprimiert, in denen das GAF-Protein leichter erhalten werden kann. Tierkulturzellen werden ebenfalls als Expressionswirte verwendet und sind sehr geeignete Wirte, wenn Aktivitäts- oder Stabilitätserfordernisse vorschreiben, daß eine Zuckerstruktureinheit des GAF-Proteins verwendet werden soll.
Die Verwendung der vorstehend beschriebenen Gentechniken ermöglicht die leichte Massenproduktion von GAF-Proteinen.
Wenn GAF durch derartige Gentechniken erhalten wird, unterscheiden sich dessen Aminosäuresequenzen manchmal voneinander, wie etwa ein Fehlen oder ein Ersatz von (einer) Aminosäure(n), was auf einen Unterschied bei den Wirten aufgrund einer Mutation zurückzuführen ist. Derartige Proteine, die unterschiedliche Aminosäuresequenzen aufweisen, werden solange als im Umfang der vorliegenden Erfindung befindlich angesehen, wie sie eine GAF-Aktivität aufweisen.
Da weiterhin gefunden wurde, daß Molekülarten mit leicht unterschiedlichen N-terminalen Aminosäuresequenzen nichtsdestoweniger gemeinsam in einer GAF-Zubereitung vorhanden sind, die aus einem Kulturüberstand von Gliomzellen gereinigt wurde und ihre spezifischen Aktivitäten nahezu gleich sind, ist es möglich, einen Teil der Aminosäuresequenz von GAF wegzulassen, eine weitere Sequenz hinzuzufügen oder innerhalb der Sequenz ohne Verlust der biologischen Aktivität zu ersetzen. Somit stellt die vorliegende Erfindung auch Mutantenproteine bereit, die wärme- oder säurestabiler sind und durch diese Gentechniken leicht hergestellt werden können.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Expressionsvektor, der die DNA mit der für das GAF-Polypeptid kodierenden Nukleotidseguenz enthält, zum Beispiel durch das folgende Verfahren hergestellt werden:
(a) GAF wird aus einem Kulturüberstand isoliert und gereinigt und die Aminosäuresequenz auf der N-terminalen Seite wird analysiert,
(b) auf der Grundlage der sich daraus ergebenden Aminosäuresequenz wird eine dafür kodierende Oligonukleotidsonde synthetisiert,
(c) für den GAF kodierende RNA wird aus den Zellen extrahiert,
(d) einzelsträngige komplementäre DNA (cDNA) wird aus der mRNA synthetisiert, gefolgt von der Synthese von doppelsträngiger, komplementärer DNA,
(e) die komplementäre DNA wird in einen Phagenvektor oder ein Plasmid eingeführt,
(f) der auf diese Weise erhaltene rekombinante Phage oder das Plasmid werden unter Erzeugen einer Transformante in eine geeignete Wirtszelle eingeführt,
(g) nach der Kultivierung der auf diese Weise erhaltenen Transformante werden das die gewünschte DNA enthaltende Plasmid oder der Phage durch ein geeignetes Verfahren wie etwa Hybridisierung unter Verwenden der DNA-Sonde aus der Transformante isoliert,
(h) die gewünschte klonierte DNA wird aus der rekombinanten DNA ausgeschnitten und
(i) die klonierte DNA oder ein Teil davon werden stromabwärts von einem Promotor mit einem zur Expression geeigneten Vektor ligiert.
Die für den Human-GAF kodierende mRNA kann aus verschiedenen, GAF-produzierenden Zellen wie etwa menschlichen Gliomzellen und menschlichen Fibroblasten erhalten werden. Die menschlichen Gliomzellen schließen NMC-G1 ein und die menschlichen Fibroblasten schließen WI-38 (ATCC Nr. CCL-75) ein.
Die vorstehend angeführten NMG-G1-Zellen wurden am 31. Oktober 1990 beim Fermentationsinstitut, Osaka, Japan (IFO), unter der Zugangsnummmer IFO 50281 und am 21. Februar 1991 beim Fermentationsforschungsinstitut (FRI), Amt für industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für internationalen Handel und Industrie, 1-3, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi Ibaraki-Ken, Japan, unter der Zugangsnummer FERM BP-3294 hinterlegt. WI-38 wird im Catalogue of Cell Lines & Hybridomas, 5. Ausgabe, veröffentlicht von der American Type Culture Collection (1985), angeführt.
Verfahren zum Herstellen der RNA aus den GAF-produzierenden Zellen schließen das Guanidinthiocyanatverfahren [J. M. Chirgwin et al., Biochemistry 18 5294 (1979)] ein.
Unter Verwenden der auf diese Weise erhaltenen mRNA als Matrize wird cDNA synthetisiert und anschließend durch Verwenden von reverser Transkriptase, zum Beispiel gemäß dem Verfahren von H. Okayama et al. [Molecular and Cellular Biology 2 161 (1982) und ibid. 3 280 (1983)] in das Plasmid oder den Phagen eingeführt.
Die Plasmide, in die die cDNA eingeführt wird, schließen zum Beispiel pBR322 [Gene 2 95 (1977)], pBR325 [Gene 4 121 (1978)], pUC12 [Gene 19 259 (1982)], pUC13 [Gene 19 259 (1982)], pUC118 und pUC119, die jeweils aus E. coli stammen, und aus Bacillus subtilis [Biochemical and Biophysical Research Communication 112 678 (1983)] stammendes pUB110 ein. Jedes andere Plasmid kann jedoch verwendet werden, solange es in dem Wirt vermehrungsfähig und lebensfähig ist.
Verfahren zum Einführen der cDNA in das Plasmid schließen zum Beispiel das in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, S. 239, Cold Spring Laboratory (1982), beschriebene Verfahren ein. Verfahren zum Einführen der cDNA in den Phagenvektor schließen zum Beispiel das Verfahren von T. V. Hyunh et al. [DNA Cloning, A Practical Approach 1 49 (1985)] ein.
Die Plasmide, in die die vorstehend angeführte cDNA eingeführt wird, können durch Einführen der cDNA, die aus mRNA aus menschlichen normalen diploiden Zellen hergestellt wurde, in einen Vektor wie etwa pCD-Vektor erhalten werden [siehe Okayama et al., Molecular Cell Biology 3 280 (1983)].
Das Plasmid, in das cDNA eingeführt worden ist, wird in geeignete Wirtszellen wie etwa Escherichia und Bacillus angehörenden Zellen eingeführt.
Beispiele der vorstehend beschriebenen, Escherichia angehörenden Zellen schließen E. coli K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 60 160 (1968)], M103 [Nucleic Acids Research 9 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology 120 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology 41 459 (1969)] und C600 [Genetics 39 440 (1954)] ein.
Beispiele der vorstehend beschriebenen, Bacillus angehörenden Zellen schließen Bacillus subtilis MI114 [Gene 24 255 (1983)] und 207-21 [Journal of Biochemistry 95 87 (1984)] ein.
Verfahren zum Transformieren des Wirtes mit dem Plasmid schließen zum Beispiel das in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, S. 249, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982), beschriebene Calciumchloridverfahren und Calciumchlorid/Rubidiumchloridverfahren ein.
Gewünschte Klone werden aus den auf diese Weise erhaltenen Transformanten durch an sich in der Technik bekannte Verfahren wie etwa das Koloniehybridisierungsverfahren [Gene 10 63 (1980)] und die DNA-Nukleotidsequenzbestimmungsverfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74 560 (1977), Nucleic Acids Research 9 309 (1981)] selektiert.
Auf diese Weise wird ein klonierter Mikroorganismus erhalten, der den Vektor mit der DNA enthält, die die für GAF kodierende Nukleotidsequenz enthält.
Das Plasmid mit der für den vorstehend angeführten GAF kodierenden cDNA kann wie es ist oder abhängig vom vorgesehenen Zweck gewünschtenfalls nach Verdauung mit einem Restriktionsenzym verwendet werden.
Die zum Exprimieren vorgesehene Region wird aus der klonierten cDNA ausgeschnitten und stromabwärts von einem Promotor in einen zur Expression geeigneten Träger (Vektor) ligiert, wodurch der Expressionsvektor erhalten werden kann.
Die Vektoren schließen die vorstehenden, aus E. coli stammenden Plasmide wie etwa pBR322, pBR325, pUC12 und pUC13, aus Bacillus subtilis stammende Plasmide wie etwa pUB110, pTP5 und pC194, aus Hefe stammende Plasmide wie etwa pSH19 und pSH1S, Bakteriophagen wie etwa den λ-Phagen und tierische Viren wie etwa Retroviren und Vakziniaviren ein.
Die cDNA kann an deren 5'-Terminus ATG als Translationsstartkodon und TAA, TGA oder TAG als Translationsabbruchkodon an deren 3'-Terminus enthalten. Diese Kodons können mittels eines geeigneten synthetischen DNA-Adaptors hinzugefügt werden. Weiter wird zum Exprimieren der DNA stromabwärts davon ein Promotor ligiert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann jeder Promotor verwendet werden, solange er zur Expression in der für die Genexpression ausgewählten Wirtszelle geeignet ist.
Wenn die zur Transformation verwendete Wirtszelle Escherichia ist, ist es bevorzugt, daß ein T7-Promotor, ein trp-Promotor, ein lac-Promotor, ein recA-Promotor, ein λPL-Promotor oder ein lpp-Promotor verwendet wird. Wenn die Wirtszelle Bacillus ist, ist es bevorzugt, daß ein SPO1-Promotor, ein SPO2-Promotor oder ein penP-Promotor verwendet wird. Wenn die Wirtszelle Hefe ist, ist es bevorzugt, daß ein PHO5-Promotor, ein PGK- Promotor, ein GAP-Promotor oder ein ADH-Promotor verwendet wird. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfin dung ist die Wirtszelle Escherichia und ist der Promotor der T7-Promotor oder der trp-Promotor.
Wenn die Wirtszelle eine Tierzelle ist, kann ein aus SV40 stammender Promotor oder ein Retrovirus-Promotor verwendet werden. Der aus SV-40 stammende Promotor ist bevorzugt.
Durch Verwenden eines die für auf diese Weise aufgebauten GAF kodierende DNA enthaltenden Vektors wird die Transformante hergestellt.
Beispiele der Wirtszellen schließen Escherichia, Bacillus, Hefe und Tierzellen ein.
Beispiele der vorstehend angeführten Escherichia und Bacillus schließen den vorstehend beschriebenen ähnliche Stämme ein. Beispiele der vorstehend angeführten Hefe schließen Saccharomyces cerevisiae AH22R, NA87-11A und DKD-5D ein.
Spezielle Beispiele der vorgenannten Tierzellen schließen COS- 7-Affenzellen, Vero, Zellen des chinesischen Hamsters (CHO) Maus-L-Zellen und menschliche FL-Zellen ein.
Die Transformierung der vorstehend beschriebenen Escherichia wird zum Beispiel gemäß dem in Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69 2110 (1972), Gene 17 107 (1982) beschriebenen Verfahren ausgeführt.
Die Transformierung von Bacillus wird zum Beispiel gemäß dem in Molecular & General Genetics 168 111 (1979) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Transformierung der Tierzellen wird z. B. gemäß dem in Virology, 52, 456 (1973) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Transformierung von Hefe wird zum Beispiel gemäß dem in Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75 1929 (1978) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Auf diese Weise wird die Transformante erhalten, die mit dem Expressionsvektor transformiert ist, der die für GAF kodierende cDNA enthält.
Beispiele davon schließen im nachstehend beschriebenen Beispiel 5 erhaltene E. coli K12 DH1/pGAF1 ein. Dieser Organismus wurde am 28. August 1991 beim IFO unter der Zugangsnummer IFO 15217 und am 2. September 1991 beim FRT unter der Zugangsnummer FERM BP-3547 hinterlegt.
Weiter wurde in Beispiel 8 erhaltene E. coli MM294(DE3)/pLysS, pETGAF1 am 3. Dezember 1991 beim IFO unter der Zugangsnummer IFO 15248 und am 24. Dezember 1991 beim FRI unter der Zugangsnummer FERM BP-3689 hinterlegt. Wenn Bakterientransformanten kultiviert werden, wird typischerweise ein flüssiges Medium zur Kultur verwendet. Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und andere für das Wachstum der Transformanten notwendige Nährstoffe sind darin enthalten. Beispiele der Kohlenstoffquellen schließen Glucose, Dextrin, lösliche Stärke und Sucrose ein. Beispiele der Stickstoffquellen schließen anorganische oder organische Materialien wie etwa Ammoniumsalze, Nitrate, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakte, Sojabohnenmehl und Kartoffelextraktlösung ein. Die anorganischen Verbindungen schließen zum Beispiel Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und Magnesiumchlorid ein. Weiter können Hefe, Vitamine und wachstumsfördernde Faktoren hinzugesetzt werden.
Der pH des Mediums ist vorzugsweise 5 bis 8.
Wenn die Escherichia-Transformanten kultiviert werden, wird zum Kultivieren der Transformanten vorzugsweise Glucose und Casaminosäuren enthaltendes M9-Medium [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)] verwendet. Um den Promotor wirkungsvoller arbeiten zu lassen, können nötigenfalls zum Beispiel Wirkstoffe wie etwa 3β-Indolylacrylsäure hinzugesetzt werden.
Die Escherichia-Transformanten werden üblicherweise 3 bis 24 Stunden bei 15 bis 43ºC nötigenfalls unter Belüften oder Rühren kultiviert.
Die Bacillus-Transformanten werden üblicherweise 6 bis 24 Stunden bei 30 bis 40ºC nötigenfalls unter Belüften oder Rühren kultiviert.
Wenn Hefetransformanten kultiviert werden, ist das bevorzugte Medium Burkholder-Minimalmedium [K. L. Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 77 4505 (1980)]. Der pH des Mediums wird vorzugsweise auf 5 bis 8 eingestellt. Die Kultivierung wird üblicherweise 25 bis 72 Stunden bei 20 bis 35ºC nötigenfalls unter Belüften oder Rühren durchgeführt.
Wenn Tierzellen-Transformanten kultiviert werden, schließen Beispiele von Medien, die verwendet werden können, 0 bis 20% fetales Kälberserum enthaltendes MEM-Medium [Science 122 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology 8 396 (1959)], RPMI1640-Medium [Journal of the American Medical Association 199 519 (1967)] und 199-Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine 73 1 (1950)] ein. Der pH ist vorzugsweise 6 bis 8. Die Zellkultur wird üblicherweise 15 bis 60 Stunden bei 30 bis 40ºC nötigenfalls unter Belüften oder Rühren durchgeführt.
Die Isolierung und Reinigung des GAF aus den vorstehend angeführten Kulturprodukten wird gemäß dem folgenden Verfahren durchgeführt.
Zuerst werden die Zellen nach der Kultivierung durch in der Technik bekannte Verfahren gesammelt. Anschließend werden die gesammelten Zellen in einer Pufferlösung oder einer Lösung, die ein Proteindenaturierungsmittel wie etwa Guanidinhydrochlorid enthält, suspendiert und durch Ultraschallbehandlung, Lysozymbehandlung und/oder Gefrier-Auftaubehandlung aufgebrochen, wodurch GAF freigesetzt wird, gefolgt vom Zentrifugieren unter Erhalten von GAF.
GAF kann aus den Extrakten durch in der Technik bekannte Verfahren gereinigt werden. Zum Beispiel können Verfahren wie etwa Fraktionierung mittels Ammoniumsulfat, Ionenaustauschchromatographie, Hydrophobiechromatographie, Affinitätschromatographie und Gelfiltration verwendet werden. Von der zur Reinigung von natürlich vorkommendem GAF verwendeten Säule ist gefunden worden, daß sie den GAF der vorliegenden Erfindung sehr wirkungsvoll reinigt. Das homogene GAF-Protein kann durch Kombinationen davon erhalten werden. Weiter kann dem Reinigungsverfahren ein Proteasehemmer zugesetzt werden, wenn das Protein ohne Zersetzung erhalten werden soll. Außerdem kann dem Reinigungsverfahren zum Erhöhen der Proteinausbeute ein mildes Tensid zugesetzt werden. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist CHAPS bevorzugt.
Wie vorstehend erläutert weist gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellter GAF gegenüber Gliazellen eine wachstumsfördernde Aktivität auf, so daß er als Therapiebeschleuniger bei Hirnläsionen verwendet werden kann. GAF kann auch bei der Therapie von Erkrankungen verwendet werden, die auf eine Hirnnervenzellenläsion, Hirnödem, Alzheimer-Krankheit, senile Demenz und weiter Diabetesneuropathien zurückzuführen sind. Da GAF gegenüber Gliazellen eine stärkere Aktivität als gegenüber anderen Zellen zeigt, wird von ihm erwartet, daß er Gliazellen spezifisch aktiviert. Weiterhin kann GAF wegen der wachstumsfördernden Aktivität auf die Fibroblasten als Therapiebeschleuniger bei Verbrennungen, Wunden, postoperativen Gewebsulzera und Magen-Darm-Ulzera verwendet werden.
Es ist ferner gefunden worden, daß GAF auf Megakaryozyten unter Vermehren und Differenzieren dieser Zellen und unter Fördern einer Zunahme der Blutplättchenzahl wirkt. Von GAF wird auch angenommen, daß er die Vermehrung anderer blutbildender und immunkompetenter Zellen fördert. Insbesondere wird von GAF angenommen, daß er bei der Aktivierung von Mikrogliazellen, die im Gehirn als immunkompetente Zellen vorliegen, eine Rolle spielt. Unter diesem Gesichtspunkt kann GAF zur Behandlung und Besserung von Hirnläsionen verwendet werden.
GAF wirkt kaum auf Gefäßendotheliumszellen der menschlichen Nabelschnur, zeigt aber gegenüber Gefäßglattmuskelzellen eine wachstumsfördernde Aktivität. Dementsprechend ist GAF bei der Behandlung geschädigter Gefäßglattmuskelzellen brauchbar.
Wie bei anderen wachstumsfördernden Faktoren wie etwa aFGF, bFGF und IGF wird auch von GAF erwartet, daß er eine osteogenesefördernde Aktivität aufweist und es wird ferner die Anwendung von GAF bei einem Bruch und Osteoporose erwartet.
Wie bei der cDNA von bFGF, TGF-α und PDGF kann die cDNA von GAF Fibroblasten transformieren. Wegen dieses Transformierungsvermögens wird eine Zunahme der GAF-Expression als eine Ursache von Malignität bei Gliomzellen angesehen. Es ist daher verständlich, daß die Produktion von GAF in Fällen, bei denen sich ein Hirntumor zeigt, erhöht ist. Deshalb ist das Verfolgen des GAF-Spiegels unter Verwenden von Antikörpern davon und GAF-cDNA ein brauchbares Diagnoseverfahren für Hirntumor. Wei terhin kann GAF-Antikörper als Antihirntumormittel verwendet werden. Weiter kann GAF zu Untersuchungen der Kultur von Gliazellen als wirkungsvoller Wachstumsfaktor benützt werden.
Wenn GAF der vorliegenden Erfindung als Wirkstoff verwendet wird, kann er sicher parenteral oder oral an Säuger (wie etwa Menschen, Mäuse, Ratten, Hamster, Kaninchen, Hunde und Katzen) in Pulverform wie er ist oder in einer pharmazeutischen Zusammensetzung (wie etwa Injektionen, Tabletten, Kapseln, Lösungen und Salben) mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Arzneimittelhilfsstoffen und Verdünnungsmitteln verabfolgt werden. Die Injektionen des GAF der vorliegenden Erfindung werden durch ein herkömmliches Verfahren unter Verwenden von zum Beispiel physiologischer Kochsalzlösung oder Glucose oder andere Hilfsmittel enthaltenden wäßrigen Lösungen hergestellt. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen wie etwa Tabletten und Kapseln können auch gemäß herkömmlichen Verfahren hergestellt werden. Die Injektionen, Lösungen, Tabletten und Kapseln als pharmazeutische Zusammensetzungen werden unter aseptischen Bedingungen hergestellt.
Wenn der GAF der vorliegenden Erfindung wie vorstehend beschrieben als Wirkstoff verwendet wird, wird er zum Beispiel den vorstehend angeführten Tieren in geeigneten Dosen von 0,5 ng bis 50 ug/kg einmal und 1 ng bis 100 ug/kg täglich verabfolgt, wobei die Verabreichungswege und Symptome in Betracht gezogen werden.
Wenn der GAF der vorliegenden Erfindung weiter als Reagenz zum Fördern einer Zellkultur verwendet wird, wird er einem Medium vorzugsweise in einer Menge von 0,01 bis 10 ug je Liter Medium und bevorzugter in einer Menge von 0, 1 bis 10 ug je Liter Medium zugesetzt.
Wenn Nukleotide, Aminosäuren und so weiter in der Beschreibung und den Zeichnungen durch Abkürzungen bezeichnet werden, werden die von der IUPAC-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur angenommenen oder gemeinhin in der Technik verwendeten Abkürzungen eingesetzt. Zum Beispiel werden die folgenden Abkürzungen verwendet. Wenn die Aminosäuren als optische Isomere vorliegen können, versteht es sich, daß solange nichts anderes angegeben ist, die L-Formen dargestellt werden.
DNA: Desoxyribonukleinsäure
cDNA: komplementäre Desoxyribonukleinsäure
A: Adenin
T: Thymin
G: Guanin
C: Cytosin
RNA: Ribonukleinsäure
mRNA: Boten-Ribonukleinsäure
dATP: Desoxyadenintriphosphat
dTTP: Desoxythymidintriphosphat
dGTP: Desoxyguanosintriphosphat
dCTP: Desoxycytidintriphosphat
ATP: Adenosintriphosphat
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
SDS: Natriumdodecylsulfat
Gly oder G: Glycin
Ala oder A: Alanin
Val oder V: Valin
Leu oder L: Leucin
Ile oder I: Isoleucin
Ser oder S. Serin
Thr oder T: Threonin
Cys oder C: Cystein
Met oder M: Methionin
Glu oder E: Glutaminsäure
Asp oder D: Asparaginsäure
Lys oder K: Lysin
Arg oder R: Arginin
His oder H: Histidin
Phe oder F: Phenylalanin
Tyr oder Y: Tyrosin
Trp oder W: Tryptophan
Pro oder P: Prolin
Asn oder N: Asparagin
Gln oder Q: Glutamin

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele genauer beschrieben.

Bezugsbeispiel 1

Bestimmung der wachstumsfördernden Aktivität gegenüber Gliazellen

Eine aus fetalem Rattenhirn hergestellte Primärkultur von Gliazellen wurde in mit 10% inaktiviertem Kälberserum zu 3 · 10&sup4; Zellen/ml ergänztem DMEM-Medium suspendiert. 100 ul der sich daraus ergebenden Zellsuspension wurden in jedes Näpfchen einer Flachboden-Mikrotiterplatte mit 96 Näpfchen (A/N Nung, Roskilde, Dänemark) gegossen und 2 bis 3 Tage kultiviert. Anschließend wurden aus jedem Näpfchen 75 ul Medium verworfen und jedem Näpfchen wurden 175 ul serumfreies DMEM-Medium zugesetzt. Nach 2 bis 3 Tagen weiterem Kultivieren wurden von jedem Näpfchen 20 ul Medium verworfen. Anschließend wurden jedem Näpfchen 20 ul einer mit DMEM-Medium, das mit 1,25% inaktiviertem fetalem Kälberserum ergänzt war, entsprechend verdünnten Testprobe zugesetzt, gefolgt vom Kultivieren über Nacht. Am nächsten Morgen wurde jedem Näpfchen 1 uCi Tritiumthymidin (5 Ci/mMol, 1 mCi/ml, RCC Amersham) zugesetzt und das Kultivieren wurde 5 bis 7 Stunden weiter fortgesetzt. Nach dem Kultivieren wurde das Medium aus jedem Näpfchen verworfen und jedem Näpfchen wurden 100 ul 0,5% Trypsin und 0,01% EDTA enthal tendes PBS zugesetzt, gefolgt von mehreren Minuten Stehen bei Raumtemperatur. Nachdem die Ablösung der Gliazellen unter dem Mikroskop bestätigt worden war, wurden die abgelösten Zellen auf einem Glasfaserfilter (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Japan) mittels eines Titertek Cell Harvesters (Flow Laboratories, Virginia, USA) gesammelt und mit Wasser gewaschen. Anschließend wurde die in die Zellen aufgenommene Tritiumthymidinmenge durch einen Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen.

Beispiel 1

(1) Sammeln des Kulturüberstandes von NMC-G1-Gliomzellen

Human-NMC-G1-Gliomzellen wurden in mit 10% fetalem Kälberserum ergänztem DMEM-Medium bei 37ºC mittels einer Kunststoffrollflasche (Corning Iwaki Glass, Japan) unter Drehen (0,2 Upm) kultiviert. Nachdem die NMC-G1-Zellen auf der Oberfläche der Rollflasche konfluent geworden waren, wurde das Medium gegen mit 0,5% fetalem Kälberserum ergänztes DMEM-Medium ausgetauscht. Der Zellkulturüberstand wurde alle 3 bis 4 Tage gesammelt und das Medium wurde durch frisches, mit 0,5% fetalem Kälberserum ergänztes DMEM-Medium ausgetauscht. Der gesammelte Zellkulturüberstand wurde anschließend dem Zentrifugieren (Modell J-6B, Beckman, 4000 Upm, 15 Minuten) unter Erhalten eines zentrifugierten Überstandes unterzogen, der als Ausgangsmaterial verwendet wurde.

(2) Reinigung von GAF

Schritt 1: Heparin-Affinitätssäulenchromatographie

1/50 Volumen (360 ml) einer 5 M NaCl-Lösung und 1/1000 Volumen (18 ml) 10% NaN&sub3; wurden einem Volumen von 18 Liter durch das in (1) beschriebene Verfahren erhaltenem NMC-G1-Zellüberstand zugesetzt. Der auf diese. Weise hergestellte NMC-G1-Zellkulturüberstand wurde mittels einer peristaltischen Pumpe bei 4ºC mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 150 ml/Stunde durch eine Heparin-Sepharose®-CL-6B-Säule (Bettvolumen: 80 ml, Phar macia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden) geleitet, die zuvor mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), der 0,2 M NaCl enthielt, voräquilibriert worden war. Das Harz wurde mit 450 ml 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), der 0,2 M NaCl enthielt, mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 150 ml/Stunde bei 4ºC gewaschen und anschließend wurde das adsorbierte Protein mit 400 ml 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 715), der 2 M NaCl enthielt, eluiert (60 ml/Stunde, 8 ml/Fraktion, 4ºC) (Fig. 1). Die wachstumsfördernde Aktivität jeder eluierten GAF-Fraktion auf Gliazellen wurde durch das in Bezugsbeispiel 1 beschriebene Verfahren bestimmt und Fraktionen mit einer Aktivität (Fraktionen 11 bis 23) wurden zur weiteren Verwendung gesammelt.

Schritt 2: Einengen

Insgesamt wurden 32 Liter Kulturüberstand der Heparin- Affinitätschromatographie von Schritt 1 unterzogen und aktive Fraktionen wurden zusammengefaßt (192 ml). Diese Lösung wurde durch Verwenden einer Diaflow YM-10-Membran (Grenzmolekulargewicht: 10000, Amicon Corp., Massachusetts, USA) in einer Stickstoffatmosphäre unter Druck auf etwa 35 ml eingeengt.

Schritt 3: Gelfiltrationschromatographie

Etwa 35 ml der in Schritt 2 eingeengten Lösung wurden auf eine Sephacryl® S-200HR-Säule (Bettvolumen: 1787 ml, 5 cm Innendurchmesser · 91 cm Länge, Pharmacia LKB Biotechnology) gegeben und mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, der mit 0,5 M NaCl und 0,1% CHAPS ergänzt war, eluiert und fraktioniert (85 ml/Stunde, 10 ml/Fraktion, 4ºC) (Fig. 2). Bei jeder Fraktion wurde die wachstumsfördernde Aktivität gegenüber Gliazellen durch das in Bezugsbeispiel 1 beschriebene Verfahren bestimmt und Aktivität zeigende Fraktionen (Fraktion 105 bis 117) wurden zusammengefaßt. Zum Gewinnen einer größeren Menge GAF-Protein wurden weitere 55 Liter NMC-G1-Kulturüberstand in zwei Teile geteilt und Schritt 1 bis 3 wurde jeweils bei jedem Teil ausgeführt und die vereinigte Probe wurde zu den folgenden Reinigungsschritten verwendet.

Schritt 4: Heparin-Affinitätssäulenchromatographie

Die in Schritt 3 durch drei Gelfiltrationschromatographievorgänge erhaltenen aktiven Fraktionen wurden zusammengefaßt (390 ml). Der auf diese Weise zusammengefaßten Lösung wurden 99 ml 100%iges Glycerin, 2,61 ml 10% CHAPS, 5,22 ml 1 M Tris-HCl- Puffer (pH 7,6) und 154 ml Wasser (651 ml insgesamt) zugesetzt. Mit dieser Lösung wurde eine Heparin-Sepharose® CL-6B- Säule (Bettvolumen: 5,8 ml), die mit 0,3 M NaCl, 0,1% CHAPS und 15% Glycerin enthaltendem 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) voräquilibriert worden war, bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 25 ml/Stunde und 4ºC beladen. Die Säule wurde mit 80 ml 0,3 M NaCl, 0,1% CHAPS und 15% Glycerin enthaltendem 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) mit einer Fließgeschwindigkeit von 25 ml/h und 4ºC gewaschen und anschließend wurde das adsorbierte Protein durch lineares Erhöhen der NaCl-Konzentration eluiert und fraktioniert. Der Salzkonzentrationsgradient wurde durch allmähliches Zusetzen von 50 ml 1,2 M NaCl, 0,1% CHAPS und 15% Glycerin enthaltendem 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) zu 50 ml 0,3 M NaCl, 0,1% CHAPS und 15% Glycerin enthaltendem 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) (25 ml/Stunde, 2 ml/Fraktion, 4ºC) erzeugt, so daß die Salzkonzentration im Verlauf der Elution allmählich von 0,3 M auf 1,2 M anstieg (Fig. 3).

Schritt 5: Heparin-Affinitätshochleistungsflüssigkeitschromatographie

Die in Schritt 4 erhaltenen aktiven Fraktionen mit einer wachstumsfördernden Aktivität gegenüber Gliazellen (Fraktion 23 bis 30) wurden zusammengefaßt und 32 ml 0,1% CHAPS und 15% Glycerin enthaltender 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) wurden 16 ml der zusammengefaßten Lösung zugesetzt. Von den 48 ml dieser Lösung wurden 46 ml der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Varian Modell 5040 System, Varian Associates, Kaliforni en, USA) unterzogen, die mit einer HR-894-Säule (8 mm Durchmesser x 50 mm Länge, Showa Denko K. K., Japan) ausgestattet war. Das am Harz adsorbierte Protein wurde bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/Minute durch lineares Erhöhen der NaCl-Konzentration eluiert und fraktioniert (1 ml/Fraktion). Der verwendete Puffer A war 0,2 M NaCl, 0,1% CHAPS und 15% Glycerin enthaltender 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) und Puffer B war 2 M NaCl, 0,1% CHAPS und 15% Glycerin enthaltender 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6).
Das Elutionsprogramm war wie folgt:
0 Minuten (100% A) - 10 Minuten (90% A + 10% B) - 15 Minuten (90% A + 10% B) - 50 Minuten (65% A + 35% B) -60 Minuten (100% B) - 64 Minuten (100% B) - 65 Minuten (100% A). Der durch dieses Programm erzeugte Konzentrationsgradient wird in Fig. 4 dargestellt.
Die Säulentemperatur war Raumtemperatur.

Schritt 6: Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitssäulenchromatographie

Die in Schritt S erhaltenen aktiven Fraktionen (Fraktion 32 bis 38) wurden zusammengefaßt und 1,75 ml 0,5 M Phosphatpuffer (pH 6,0) wurden 7 ml der zusammengefaßten Lösung zugesetzt. Von 8,75 ml dieser Lösung wurde auf 8 ml die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Varian Modell 5040 System) angewandt, die mit einer Vydac C4-Säule (0,46 cm Innendurchmesser x 25 cm Länge, Vydac, Kalifornien, USA) ausgestattet war. Das adsorbierte Protein wurde mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,8 ml/Minute durch lineares Erhöhen der Acetonitrilkonzentration unter Fraktionieren eluiert (0,8 ml/Fraktion). Das verwendete Lösungsmittel A war 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) - 99,9% Wasser und Lösungsmittel B war 0,1% TFA. - 90% Acetonitril. Das Elutionsprogramm war wie folgt:
0 Minuten (100% A) - 15 Minuten (65% A + 35% B) - 110 Minuten (50% A + 50% B) - 112 Minuten (100% B) - 117 Minuten (100% B) - 120 Minuten (100% A). Der durch dieses Programm erzeugte Konzentrationsgradient wird in Fig. 5 dargestellt.
Die Säulentemperatur war Raumtemperatur.
Nach der Fraktionierung wurde Acetonitril durch einen Speedback-Konzentrator (Modell A290, Servant, USA) abgedampft. Anschließend wurde destilliertes Wasser hinzugesetzt, um alle Fraktionen auf ein Volumen von 0,5 ml einzustellen.
Die aktiven Fraktionen (Fraktion 55, 59, 60, 61 und 62) wurden der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von 2- Mercaptoethanol unterzogen, gefolgt vom Anfärben mit Silber. Die Ergebnisse davon werden in Fig. 6 dargestellt. Jede Fraktion ergibt eine einzelne Bande bei 25 kDa (Fraktion 55), 29 kDa (Fraktion 59 und 60) oder 30 kDa (Fraktion 61 und 62). Diese drei Banden entsprechen GAF-Proteinen mit Molekulargewichten von 25000, 29000 beziehungsweise 30000.

(3) Zusammenfassung der Reinigung

Die Zusammenfassung der Reinigung von 33 Liter NMC-G1- Kulturüberstand wird in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
Die biologische Aktivität wurde durch das in Bezugsbeispiel 1 beschriebene Verfahren bestimmt. Die Gesamtaktivität (U) wird als Kehrwert des. Verdünnungsverhältnisses der Probe mit einem Wert der Tritiumthymidinaufnahme von 50% ausgedrückt, wobei ein Wert der Tritiumthymidinaufnahme von 100% als die Tritiumthymidinaufnahme in einem Medium aus 10% fetalem Kälberserum definiert ist. Die Proteingesamtmenge in mg wurde mittels einer standardisierten Absorption von 1,0 bei 280 nm für eine Lösung mit einer Proteinkonzentration von 1 mg/ml berechnet. Wo die Proteingesamtmenge durch einen "*" dargestellt wird, wurde diese Menge auf der Grundlage der Anfärbungsdichte der durch Silber angefärbten Bande auf dem Polyacrylamidgel verglichen mit der von Standardprotein bestimmt.

Beispiel 2

Aktivität von GAF gegenüber verschiedenen Kulturzellen (1) (1) Wachstumsfördernde Aktivität von GAF auf Gliazellen

Der durch das in Beispiel 1, Schritt 1-6, erhaltene gereinigte GAF zeigt wie in Fig. 7 dargestellt wird eine wachstumsfördernde Aktivität auf Gliazellen. In Fig. 7 zeigen die Werte auf der Abszisse die GAF-Konzentration an, wobei die mit dem Wert "6" bezeichnete Konzentration 50 · 4¹&supmin;&sup6; ng/ml ist. Die wachstumsfördernde Aktivität auf Gliazellen wurde gemäß dem in Bezugsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt.
Zum Vermeiden einer durch die Lagerung verursachten Inaktivierung wurde die wachstumsfördernde Aktivität gegenüber Gliazellen unter Verwenden der gereinigten Probe unmittelbar nach den Arbeitsschritten der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitssäulenchromatographie und des Entfernens von Acetonitril, dem Endschritt des Reinigungsverfahrens bestimmt. Die Ergebnisse davon werden in Fig. 8 dargestellt. In dieser Figur zeigen die Werte auf der Abszisse die GAF-Konzentration an.
Die in Fig. 7 und 8 dargestellten Ergebnisse zeigen geringfügig verschiedene Werte für die GAF-Konzentration, die eine 50%ige Tritiumthymidinaufnahme ergeben. Von diesem Unterschied wird angenommen, daß er auf eine teilweise Inaktivierung einer Probe zurückzuführen ist. Fig. 7 zeigt nämlich die Ergebnisse, die erhalten werden, wenn die nach der Reinigung bei -80ºC aufbewahrte Probe verwendet wurde. Es wird deshalb angenommen, daß das GAF-Protein in dieser Probe durch den Gefrier-Auftau- Vorgang der niederkonzentrierten Proteinlösung unter Zersetzen inaktiviert wurde oder durch das Gefäß adsorbiert wurde.

(2) Wachstumsfördernde Aktivität auf Gliazellen

Nach dem GAF-Zusatz wurde das Gliazellenwachstum gemäß dem folgenden Verfahren untersucht.
Die Gliazellen wurden in DMEM-Medium, das mit 10% inaktiviertem fetalem Kälberserum ergänzt war, zu 3 · 10&sup4; Zellen/ml suspendiert und 500 ul davon wurden in jedes Näpfchen einer 24- Näpfchen-Kulturplatte (Linbro, USA) gegossen. Die Zellkultur wurde 3 Tage ausgeführt. Anschließend wurden 440 ul Medium aus jedem Näpfchen verworfen und jedem Näpfchen wurden 340 ul frisches DMEM-Medium zugesetzt. Anschließend wurden die folgenden Näpfchen vorbereitet: Näpfchen, denen 50 ul einer 50-fach verdünnten GAF-aktiven Fraktion, die durch die in Beispiel 1-(2), Schritt 4, beschriebene Heparin-Affinitätssäulenchromatographie erhalten wurde, in mit 1,25% inaktiviertem fetalem Kälberserum ergänztem DMEM-Medium zugesetzt waren; Näpfchen, denen 50 ul einer Lösung von 500 ug/ml Heparin in demselben Medium zugesetzt waren; Näpfchen, denen beides zugesetzt war, und Näpfchen als Kontrollgruppe, denen nichts zugesetzt war.
Alle vorstehend angeführten Näpfchen wurden mit DMEM-Medium, das mit 1,25% inaktiviertem fetalem Kälberserum ergänzt war, unter Ergeben eines Endvolumens von 500 ul eingestellt, gefolgt von weiteren 2 Tagen Kultivieren. Nach dem Kultivieren wurde jedes Näpfchen zweimal mit 3 ml DMEM-Medium gewaschen und anschließend wurden 0,5 ml 0,2% Trypsin und 0,01% EDTA enthaltendes PBS-zum Ablösen der Zellen hinzugesetzt. Die Zellenzahl jedes Näpfchens wurde mittels eines Coulter Cell Counters (Typ ZM, Coulter) gezählt. Die Ergebnisse werden in Fig. 9 dargestellt. Die Zahl der Gliazellen wurde durch Zusatz von GAF verglichen mit den kein GAF enthaltenden Gruppen 1,6 mal erhöht. Es scheint jedoch, daß der Zusatz von Heparin zu den Näpfchen das Gliazellenwachstum nicht beeinflußt.

(3) Zeitlicher Verlauf der das Gliazellenwachstum fördernden Aktivität

Der zeitliche Verlauf der das Gliazellenwachstum fördernden Aktivität wurde gemäß dem in Bezugsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren mit folgender Ausnahme untersucht. Durch die in Beispiel 1-(2), Schritt S, beschriebene Heparin-Affinitätshochleistungsflüssigkeitssäulenchromatographie erhaltenen GAFaktive Fraktionen wurden 880-fach mit DMEM-Medium verdünnt, das mit 1,25% inaktiviertem fetalem Kälberserum ergänzt war, und 20 ul der sich daraus ergebenden Probe wurden jedem Näpfchen zugesetzt. Anschließend wurde jedem Näpfchen nach 4, 8, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31 beziehungsweise 40 Stunden 1 uCi Tritiumthymidin zugesetzt. Die Zellen wurden nach 3 Stunden geerntet und die in die Zellen aufgenommene Tritiumthymidinmenge wurde mit einem Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen. Dasselbe Verfahren wurde für ein Kontrollnäpfchen wiederholt. Die Ergebnisse werden in Fig. 10 dargestellt. Die Tritiumthymidinaufnahme erreichte 16 bis 19 Stunden nach dem GAF- Zusatz einen Höchstwert.

(4) Wachstumsfördernde Aktivität gegenüber Fibroblasten

Wie in Fig. 11 dargestellt übt der durch das in Beispiel 1, Schritt 1-6, beschriebene Verfahren erhaltene gereinigte GAF auf Fibroblastenzellen des BALB/3T3-Mausklons A31 eine wachstumsfördernde Aktivität aus. In der Figur bezeichnen die Werte auf der Abszisse die GAF-Konzentration. Die wachstumsfördernde Aktivität von GAF auf A31-Zellen wurde gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt.
2 · 10³ Zellen des BALB/3T3-Mausklons A31 wurden zusammen mit 75 ul mit 5% Kälberserum ergänztem DMEM-Medium jedem Näpfchen einer Nung-96-Näpfchen-Mikrotiterplatte (Flachboden) zugesetzt und kultiviert. Am nächsten Tag wurden aus jedem Näpfchen 50 ul Medium verworfen und 175 ul serumfreies DMEM-Medium wurden jedem Näpfchen zugesetzt. Nach 3 bis 4 Tagen Kultivierung wurden aus jedem Näpfchen 20 ul Medium verworfen. Anschließend wurden jedem Näpfchen 20 ul der entsprechend mit DMEM-Medium, das mit 1,25% inaktiviertem fetalem Kälberserum ergänzt war, verdünnten Testprobe zugesetzt, gefolgt vom Kultivieren über Nacht. Am nächsten Morgen wurde jedem Näpfchen 1 uCi Tritiumthymidin (5 Ci/mMol, 1 mCi/ml, RCC Amersham) zugesetzt, gefolgt von weiteren 5 bis 7 Stunden Kultivieren. Nach der Kultur wurde jedes Näpfchen mit 1 ml PBS gewaschen und anschließend wurden 100 ul 5%ige SDS-Lösung hinzugesetzt, gefolgt vom Stehen über Nacht bei 37ºC. Ein Zellextrakt jedes Näpfchens wurde in einem Röhrchen gesammelt und die in die Zellen aufgenommene Tritiumthymidinmenge wurde mit einem Szintillationszähler gemessen.
Um eine Inaktivierung durch das Lagern zu vermeiden, wurde die wachstumsfördernde Aktivität des GAF auf A31-Zellen unter Verwenden der gereinigten Probe unmittelbar nach den Arbeitsschritten der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitssäulenchromatographie und dem Entfernen von Acetonitril, dem Endschritt des Reinigungsverfahrens bestimmt. Die Ergebnisse davon werden in Fig. 12 dargestellt. In der Figur bezeichnen die Werte auf der Abszisse die GAF-Konzentration.
Die in Fig. 11 und 12 dargestellten Ergebnisse zeigen geringfügig verschiedene Werte für die GAF-Konzentration, die eine 50%ige Tritiumthymidinaufnahme ergeben. Von diesem Unterschied wird angenommen, daß er auf eine teilweise Inaktivierung einer der Proben zurückzuführen ist. Fig. 11 zeigt die Ergebnisse, die erhalten werden, wenn die nach der Reinigung bei -80ºC aufbewahrte Probe verwendet wurde. Es wird deshalb angenommen, daß das GAF-Protein in dieser Probe durch den Gefrier-Auftau- Vorgang der niederkonzentrierten Proteinlösung unter Zersetzen inaktiviert wurde oder durch das Gefäß adsorbiert wurde.

(5) Aktivität gegenüber Gefäßendotheliumszellen der menschlichen Nabelschnur

Die wachstumsfördernde Aktivität von GAF auf Gefäßendotheliumszellen der menschlichen Nabelschnur wurde durch ihr Vergleichen mit der von bFGF bestimmt. Dieser Vergleich zeigte, daß der durch das in Beispiel 1, Schritt 1-6, erhaltene gereinigte GAF wie in Fig. 13 dargestellt keine wachstumsfördernde Aktivität auf Gefäßendotheliumszellen der menschlichen Nabelschnur zeigte. In der Figur bezeichnen die Werte auf der Abszisse die Proteinkonzentration von GAF oder bFGF.
Die wachstumsfördernde Aktivität auf Gefäßendotheliumszellen der menschlichen Nabelschnur wurde gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt. Aus menschlichen Nabelschnüren isolierte menschliche venöse Gefäßendotheliumszellen (hierin nachstehend als HUVE-Zellen bezeichnet) wurden zu diesem Test verwendet. Weiter wurde der wohlbekannte MTT-Test zur Messung des Zellvermehrungsgrades verwendet. Dieses Testverfahren wurde jedoch gemäß Tada et al. [J. Immunol. Methods 93 157 (1986)] abgeändert. Und zwar wurden die während der Passage aufrechterhaltenen HUVE-Zellen durch die Verwendung einer 0,125%igen Trypsinlösung (Boehringer Mannheim), die 0,002% EDTA (345-01882, Dotite) enthielt, in einzelne Zellen aufgespalten und die sich daraus ergebenden Zellen wurden in einem Medium suspendiert, das mit 2,5% fetalem Kälberserum (Whittakar Bioproduct) ergänztes GIT-Medium (398-00515, Nippon Seiyaku) umfaßte. Die in dieser Suspension enthaltene Zellzahl wurde mittels eines Coulter Cell Counters (Typ ZM, Coulter) gezählt und die Suspension wurde dar folgenden Zellkultur unterzogen: 100 ul 2 · 10³ HUVE-Zellen enthaltende Suspension wurden jedem Näpfchen einer 96-Näpfchen-Kulturschale (F96, Nung) zugesetzt, gefolgt vom Kultivieren bei 37ºC (Hitachi CO&sub2;-N&sub2;-Kontrollinkubator, Typ CH-16, CO&sub2; : 5%, O&sub2; : 7%). Am Tag nach dem Kultivieren wurden der HUVE-Zellkultur Testproben (Fig. 13) zugesetzt. Heparin (Sigma, USA) wurde weiter zum Erzeugen einer Endkonzentration von 5,0 ug/ml bis 20 ug/ml zugesetzt. Nach Zugabe der Probe wurde das Kultivieren weitere 3 Tage fortgesetzt. Das Medium wurde aus dem Kulturnäpfchen entfernt und 100 ul mit 1,0 mg/ml MTT-Reagenz (34101823, Dotite) ergänztes HUVE-Medium wurden dem Näpfchen zugesetzt, gefolgt von 4 Stunden Halten bei 37ºC.
Anschließend wurden 100 ul 10%ige SDS-Lösung (Wako Pure Chemical Industries) hinzugesetzt und 4 Stunden bei einer konstanten Temperatur von 37ºC gehalten. Nach Beenden der Reaktion wurde die die Reaktionslösung enthaltende 96-Näpfchen- Kulturschale geschüttelt und ihre Absorption bei 590 nm wurde durch Verwendung eines Mikrotiterplatten-Absorptionsmeßinstruments (MCC 341, Titertek) gemessen.

(6) Aktivität gegenüber Ratten-Pheochromozytom-PC-12-Zellen

Wie in Fig. 14 dargestellt wies der durch das in Beispiel 1, Schritt 1-6, beschriebene Verfahren erhaltene gereinigte GAF gegenüber Ratten-Pheochromozyten-PC12-Zellen eine wachstumsfördernde Aktivität auf. In der Figur bezeichnen die Werte auf der Abszisse die GAF-Konzentration.
Die wachstumsfördernde Aktivität gegenüber PC-12-Zellen wurde gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt. GAF wurde mit RPMI- 1640-Medium, das mit 1% inaktiviertem Pferdeserum ergänzt war, entsprechend verdünnt und 50 ul der sich daraus ergebenden Lösung wurden in jedes Näpfchen einer 96-Näpfchen-Mikrotiterplatte gegossen. Als nächstes wurden PC-12-Zellen in RPMI- 1640-Medium, das mit 1% inaktiviertem Pferdeserum verdünnt war, unter Ergeben von 10&sup6; Zellen/ml suspendiert und 50 ul der Zellsuspension wurden in jedes Näpfchen einer 96-Näpfchen- Flachboden-Mikrotiterplatte (A/N Nung, Roskilde, Dänemark) gegossen, gefolgt von 2 Tagen weiterem Kultivieren. Nach dem Kultivieren wurden jedem Näpfchen 5 uCi Tritiumthymidin (5 Ci/mMol, 1 mCi/ml, RCC Amersham) zugesetzt, gefolgt von 5 Stunden weiterem Kultivieren. Nach dem Kultivieren wurden die Zellen auf einem Glasfaserfilter mittels eines Titertek Cell Harvesters gesammelt und mit Wasser gewaschen. Anschließend wurde die in die Zellen aufgenommene Menge Tritiumthymidin durch einen Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen.

(7) Stabilität der Aktivität

Als die aus einer Heparin-Sepharose-CL-6B-Säule (eingetragenes Warenzeichen) eluierten 2 M NaCl-Fraktionen 5 Minuten (Beispiel 1-(2), Schritt 1) bei 100ºC wärmebehandelt wurden, ging die Aktivität vollständig verloren. Wenn sie weiter bei pH 2 30 Minuten bei Raumtemperatur behandelt wurden, ging die Aktivität teilweise verloren. Diese Phänomene werden in Fig. 15 dargestellt. In der Figur bezeichnen die Werte auf der Abszisse die Verdünnung von GAF. Kontrolle bedeutet unbehandelten GAF. Eine gestrichelte Linie bezeichnet den Tritiumthymidineinbauwert ohne GAF.

(8) Antigenität: immunologische Kreuzreaktion von GAF mit aFGF und bFGF

Eine gemäß dem in Beispiel 1, Schritt 1-6, beschriebenen Verfahren gereinigte Probe wurde dem Western Blotting unter Verwenden von polyklonalem Kaninchen-anti-aFGF-Antiserum und Kaninchen-anti-bFGF-IgG unterzogen. Wie aus Fig. 16 zu ersehen ist reagierte der GAF weder mit aFGF noch bFGF über Kreuz.

Beispiel 3

Eigenschaft von durch NMC-G1-Zellen produziertem GAF-Protein

30 ug in Beispiel 1 erhaltener 25 kDa GAF, 30 ug 29 kDa GAF und 60 ug 30 kDa GAF wurden der SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterzogen und anschließend durch Verwenden einer Blottingapparatur des trockenen Typs (ATTO, Tokio, Japan) auf eine Proßlott-Membran (Applied Biosystems, Kalifornien, USA) überführt. Die Membran wurde unter Schütteln 45 Minuten in eine Phosphatpuffer-NaCl-Lösung (8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,15 g/l Na&sub2;HPO&sub4;, 0,2 g/l KH&sub2;PO&sub4;, pH 7,4), die mit 2%iger PVP-360-Lösung (2% Polyvinylpyrrolizon-360, Sigma, USA) ergänzt war, eingetaucht und anschließend in eine Biotinylconcanavalin A (Vector Lab, USA) in einer Konzentration von 10 ug/ml enthaltende 2%ige PVP-360-Lösung überführt, gefolgt von 1 Stunde Schütteln. Anschließend wurde die Membran drei (3) Mal mit TNT-Puffer [25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 0,5 M NaCl und 0,1% Triton X-100 enthielt], 10 Minuten gewaschen. Weiter wurde die Membran 45 Minuten in Phosphatpuffer-NaCl- Lösung, die einen Komplex aus Avidin und biotinylierter Meerrettichperoxidase [Standard Vactostain (eingetragenes Warenzeichnen) ABC-Kit, Vector Lab] enthielt, eingetaucht und mit TNT-Puffer gewaschen (10 Minuten, 3 Mal).
Ein Gemisch aus 20 ml TN-Puffer [25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 0,5 M NaCl enthielt] und 13,2 ul wäßrigem Wasserstoffperoxid wurde einer Lösung von 12 mg 4-Chlor-1-naphthol in 4 ml Methanol zugesetzt und die Membran wurde zur Farbentwicklung darin eingetaucht. Die Ergebnisse davon werden in Fig. 17 dargestellt. Fig. 17 ist ein Diagramm, das unter Verwenden von Biotinylconcanavalin A, Avidin und Biotinylperoxidase angefärbten GAF zeigt.
Drei Molekülarten GAF wurden alle angefärbt und dies zeigt an, daß diese Moleküle über ihre Kohlenhydratketten an Concanavalin A binden können.
Die enzymatische Entglycosylierung mittels N-Glycanase wurde gemäß der Vorschrift von Genzyme (Boston, USA) durchgeführt. Nach der N-Glycanasebehandlung von GAF wurde eine SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese ausgeführt und das Gel wurde mit Silber angefärbt. Die Ergebnisse davon werden in Fig. 18 dargestellt. Die Bande von 25 kDa-, 29 kDa- und 30 kDa-GAF war nach der Behandlung jeweils um 3 bis 4 kDa verringert, obschon es schien, daß die Entglycosylierung nur teilweise vollständig war. Dies zeigte, daß der GAF Zuckerketten vom N- glykosylierten Typ mit 3 bis 4 kDa besaß.
Aus den beiden vorstehenden Versuchen wurde bestätigt, daß an die Glykosylierungsstelle des 25 kDa-, 29 kDa- und 30 kDa-GAF jeweils eine N-verknüpfte Zuckerkette vom Kohlenhydratglykosidtyp gebunden war.

Beispiel 4

Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz

Drei Arten GAF (25 kDa, 29 kDa und 30 kDa) wurden in Proßlott (eingetragenes Warenzeichen) (Applied Biosystems, Kalifornien, USA), einer Membran vom Polyvinylidendifluoridtyp adsorbiert und ihre Aminosäuresequenz wurde mittels eines Proteinsequenzierers (Modell 473A-System, Applied Biosystems) analysiert. Etwa 60 pMol 25 kDa-GAF, etwa 5 pMol 29 kDa-GAF und etwa 55 pMol 30 kDa-GAF wurden auf diese Weise analysiert. Die sich daraus ergebenden Sequenzen werden nachstehend dargestellt:
Z&sub1; = His oder Pro
Z&sub2; = Leu oder Ala
X = nicht identifizierte Aminosäure
( ): unbestimmte, aber abgeleitete Aminosäure

Beispiel 5

Klonieren von GAF-cDNA und Analyse deren Nukleotidsequenz

Auf der Grundlage der in Beispiel 4 erhaltenen Aminosäuresequenz von 30 kDa-GAF wurden die folgenden beiden Oligonukleotidprimer (Primer 1 und 2) synthetisiert, die dieser Sequenz entsprechen und denen eine Erkennungssequenz eines Restriktionsenzyms hinzugefügt werden war.
Z&sub2; = Leu oder Ala, I = Inosin, Y = T/C, R = A/G
Unter Verwenden dieser Primer wurde die Polymerasekettenreaktion (PCR) [K. B. Mullis und F. A. Fuloora, Methods in Enzymology 155 335 (1987)] durch Verwenden aus dem Humangenom stammender DNA als Matrize (GeneAmp (eingetragenes Warenzeichen) DNA Amplification Reagent Kit (Ceatas, USA)) ausgeführt. Jeder Primer 1 und 2 wurde in einer Menge von 560 ng je ug Genom-DNA zugesetzt und 2,5 Einheiten Ampli Taq (eingetragenes Warenzeichen) (Ceatas, USA) wurden 100 ul Reaktionslösung zugesetzt. Anschließend wurde ein DNA-Synthesedurchlauf 1 Minute bei 94ºC, 2 Minuten bei 50ºC und 3 Minuten bei 72º 25 Mal wiederholt. Dieses Reaktionsprodukt wurde der Acrylamid- Gelelektrophorese unterzogen und Fragmente mit einer gewünschten Länge von etwa 63 bp wurden isoliert. Als Ergebnis der Nukleotidsequenzanalyse davon wurde die folgende Sequenz erhalten:
Auf der Grundlage dieser Sequenz wurden die folgenden beiden Sonden (Sonde 1 und Sonde 2) chemisch synthetisiert.
Sonde &sub1; 5'TGGGGAACTATTTCGGGGTGCAGGATGCGG-3"(SEQ ID Nr. 22
Sonde &sub2; 5'-ACGTTGCCGAAGGGGACCGCATCCTGCACC-3"(SEQ ID Nr. 23
Getrennt wurde mittels E. coli x1776 als Wirt durch Einführen einer cDNA, die aus Primärkulturzellen aus mRNA, die aus menschlicher Vorhaut stammte, synthetisiert worden war, in den PD-Vektor [siehe Okayama et al., Molecular Cell Biology 3 280 (1983)], der von Dr. Okayama, National Institute of Child Health and Human Development, Bethesda, USA, zur Verfügung gestellt wurde, eine cDNA-Bibliothek hergestellt. Plasmid-DNA wurde aus dieser cDNA-Bibliothek durch das Alkaliverfahren [H. C. Birnboim und J. Doly, Nucleic Acids Research 1 1513 (1979)] extrahiert und E. coli DH1 wurde mit dieser DNA unter Herstellen einer cDNA-Bibliothek infiziert, die etwa 2 · 10&sup5; Klone von E. coli-DH1 als Wirtszellen enthielt.
Zehn Nitrocellulosefiltet (HATF-Filter, Millipore) wurden mit der vorstehend angeführten cDNA-Bibliothek unter Verwenden von E. coli-DH1 zu etwa 1 · 10&sup5; Klone/Filter plattiert. Zehn aus 2 Filtern bestehende Filterdoppelpaare wurden aus den vorstehenden 10 Stammfiltern hergestellt. Zur Denaturierung durch Lysieren von E. coli auf den Filterdoppeln mit 0,5 N NaOH-Lösung freigesetzte Plasmid-DNA wurde auf den Filtern fixiert [M. Crunstein und D. 5. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 72 8961 (1975)].
³²P wurde durch Verwenden von T4-Polynukleotidkinase und [γ- ³²P] -ATP in den 5' -Terminus von Sonde 1 und 2 eingeführt. Jede Sonde wurde mit jedem Filterdoppel, auf dem die DNA fixiert war, hybridisiert. Die Hybridisierungsreaktion wurde in 10 ml einer Lösung von 5 X SSPE (180 mM NaCl, 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 1 mM EDTA, pH 7,4), die mit 10 uCi Sonde, 5 X Denhardts, 0,1% SDS und 100 ug/ml denaturierter Lachssperma-DNA ergänzt war, 16 Stunden bei 55ºC durchgeführt. Nach Abschluß der Reaktion wurden die Filter 3 Mal mit einer Lösung von 5 X SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat) und 0,1% SDS bei Raumtemperatur und weitere zwei Mal 30 Minuten bei 60ºC gewaschen [T. Maniatis et al., Molecular Cloning, S. 309, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)].
Von den gewaschenen Filtern wurden Radioautogramme aufgenommen und die Radioautogramme der Filterdoppel wurden in Sätzen von zwei Filtern übereinandergelegt, um nach Zellen zu suchen, die gegenüber beiden Sondenarten reaktionsfähig waren. Durch dieses Verfahren wurden aus 1 · 10&sup6; Klonen 2 Klone erhalten, die gegenüber den beiden Sondenarten reaktionsfähig waren.
Die Plasmid-DNA der beiden Klone wurde extrahiert und durch das Alkaliverfahren gereinigt (vorstehend beschrieben). Als die cDNA-Anteile der Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI ausgeschnitten und durch Agarosegelelektrophorese fraktioniert wurden, zeigten beide aus den zwei Klonen stammenden cDNA dieselbe Kettenlänge von etwa 1,55 kb. Diese beiden Stämme wurden als miteinander identisch erachtet.
Die Nukleotidsequenz des cDNA-Teils des in einem (E. coli K12 DH1/pGAF1) dieser beiden Stämme enthaltenen Plasmids wurde durch das Didesoxynukleotidsynthesekettenabbruchverfahren [J. Messing et al., Nucleic Acid Research 9 309 (1981)] bestimmt. Die auf diese Weise bestimmte Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 24) und die aus dieser Nukleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 25) sind in Fig. 19 dargestellt. Der in der bestimmten Sequenz (E. coli K12 DH1/pGAF1, "pGAF1") enthaltene cDNA-Teil wies eine Kettenlänge von 1493b auf und enthielt eine 5'-terminale, nichttranslatierte Region, eine alle Aminosäuren kodierende Region, eine 3'-terminale, nichttranslatierte Region und eine Poly-A-Kette. Die kodierte Aminosäuresequenz wies 208 Aminosäuren auf und enthielt alle partiellen Aminosäuresequenzen mit 30 kDa, 29 kDA und 25 kDa, die von der in Beispiel 4 erörterten N-terminalen Sequenzanalyse offenbart worden waren. Die kodierte Aminosäuresequenz war zum Teil von den in Beispiel 4 erhaltenen Sequenzen verschieden (in der 1-Stellung von 25 kDa, Ala; der 12-Stellung von 29 kDa, Ser, und der 23-Stellung von 30 kDa, Leu). Diese Unterschiede wurden jedoch beim N-Terminus und Teilen beobachtet, von denen festgestellt wurde, daß sie 10 Reste überschritten, wovon alle bei der Aminosäureanalyse leicht unsichere Ergeb nisse ergaben. Daher wurde die aus der cDNA abgeleitete Sequenz als zutreffend angesehen.

Beispiel 6

Expression von für GAF kodierenden Genen in Säugerzellen

(1) Expression von GAF in COS-7-Zellen

Affen-Cos-7-Zellen in mit 10% NU-Serum ergänztem IMDM-Medium (Collaborative Research) wurden in Falcon-Plastikschalen mit einem Durchmesser von 60 mm zu 6 · 10&sup5; Zellen/Schale plattiert. Am nächsten Tag wurden nach dem Waschen mit serumfreiem IMDM- Medium 2 ug und 10 ug Plasmid-pGAF-1-DNA und 400 ug/ml DEAE- Dextran enthaltende Reaktionslösungen gemäß dem in der Technik bekannten Verfahren [B. Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 52 3365 (1987)] hergestellt und die eine oder die andere der vorstehenden Lösungen wurde jeder Schale zugesetzt. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37ºC wurde eine DMSO-Behandlung durchgeführt. Anschließend wurde die Zellkultivierung in einem 10% Nu-Serum enthaltenden Medium (3 ml/Schale) fortgesetzt und das Medium wurde nach 70 bis 72 Stunden gesammelt. Die Zellen wurden durch einen Gummischaber aus den Schalen gewonnen und in 1,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung suspendiert.
Eine das Gliazellwachstum fördernde Aktivität wurde in einem Kulturüberstand der mit pGAF1 transfizierten COS-7-Zellen nachgewiesen. Wie in Fig. 20 dargestellt wurde die Aktivität weder in Kulturüberständen der COS-7-Zellen, die mit dem Plasmid pCDX ohne GAF-cDNA transfiziert worden waren, noch der COS-7-Zellen nachgewiesen, die nicht transfiziert worden waren. Ferner zeigten gemäß Fig. 20 Extrakte aus pGAF1transfizierten Zellen, die durch zwei Gefrier-Auftau- Kreisläufe und Beschallung erhalten worden waren, verglichen mit denen aus der Kontrolltransfektanten keine bedeutende Aktivität. Aus diesen Ergebnissen wurde bestätigt, daß die cDNA von pGAF1 richtig für GAF-Protein kodiert worden war und es zeigte sich, daß wenn die cDNA mit den COS-Zellen exprimiert worden war, das Produkt in die Kulturlösung ausgeschieden wurde.

(2) Expression von GAF in CHO-Zellen

(a) Aufbau des Expressionsplasmids pDGAF1

In Beispiel 5 erhaltenes Plasmid pGAF1 wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und ein GAF-cDNA-Fragment mit 1,55 kb wurde isoliert. Ähnlich wurde der Vektor pTB399 für Säugerzellen [Cell Struct. Funct. 12 205 (1987)] mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und die IL-2-cDNA-Region wurde entfernt, gefolgt von der Inserierung des vorstehend angeführten Fragments der GAF-cDNA mit 1,55 kb unter Aufbauen des Expressionsplasmids pRGB12, das GAF-cDNA unter der Kontrolle des Abelson-Mausleukämievirus (MuLV) LTR in Säugerzellen exprimieren kann. Dieses Plasmid wurde weiter mit dem Restriktionsenzym Sall-HindIII gespalten und ein Expressionseinheitabschnitt (Promotorgen-poly(A)-Signal) wurde in die stromaufwärts des SV40-Promotors gelegene Sall-HindIl-Stelle des Hamster- Dihydrofolatreduktase-Expressionsplasmids pTB348 (DHFR) [Cell Struct. Funct. 12 205 (1987)] unter Aufbauen des Plasmids pDGAF1 inseriert. Fig. 21 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau von Plasmid pDGAF1 zeigt.

(b) Expression in CHO-Zellen

CHO-dhfr-Zellen wurden in einer Schale mit 6 cm Durchmesser mit 10% fetalem Kälberserum ergänztem HamF12-Medium plattiert. Am nächsten Tag wurde das Medium durch dasselbe, frische Medium ersetzt. Nach 2 Stunden wurden 10 ug Plasmid pDGAF1-DNA durch das Calciumphosphatverfahren [Graham et al., Virology 52 456 (T973)] transfiziert. Nachdem die Zellen 2 Tage in einem Wachstumsmedium kultiviert worden waren, wurden sie erneut in einer 96-Näpfchen-Mikrotiterplatte (Nung) mit DMEM-Medium plattiert, das mit 35 ug/ml Prolin und 10% Dialyse-FCS ergänzt war. Alle 3 bis 4 Tage wurde ein Wechsel des Mediums durchgeführt und es wurden einige dhfr&spplus;-Transformanten selektiert.
Diese Transformanten wurden in DMEM-Medium, das mit 35 ug/ml Prolin und 5% Dialyse-FCS ergänzt war, zum Kultivieren jedes Klons auf eine 24-Näpfchen-Mikrotiterplatte (Linbro, Flow) überführt. Danach wurde mit 35 ug/ml Prolin und 5% Dialyse-FCS ergänztes DMEM-Medium zur Kultur verwendet. 16 dieser Klone, die GAF-Protein produzierten, wurden auf eine Schale mit 6 cm Durchmesser überführt und mit in drei Schritten (0,1, 1 und 10 uM) zunehmender Methotrexatkonzentration (MTX) und Erhalten gegen 10 uM MTX resistenter Klone kultiviert, die ein verstärktes DHFR- und GAF-Gen aufweisen können. Die GAF-Aktivität im Kulturüberstand jedes Klons wird in Fig. 22 dargestellt. Die Abszissenwerte in der Figur bezeichnen die Verdünnungsrate des zugesetzten Überstandes. Klone mit hoher GAF-Aktivität wurden selektiert und zu GAF vom natürlichen Typ produzierenden Zellen, an die Zuckerketten gebunden waren, verwendet.

Beispiel 7

Transformation von BALB/3T3-Mauszellen durch Einführen von GAF-Genen

(1) Aufbau des GAF-Expressionsplasmids pRGB12

Das in Beispiel 6 beschriebene Plasmid pRGB12 wurde als GAF- Expressionsplasmid verwendet. Das Plasmid pTB1055, in das keine GAF-cDNA inseriert worden war, wurde als Kontrollplasmid verwendet.

(2) Transformation von BALB/c-3T3-Zellen

Etwa 10&sup5; Zellen des BALB/3T3-Mausklons A31 [Subklon A31-1-1 (Kakunaga et al., Science 209 505 (1980)), von Dr. Kakunaga zur Verfügung gestellt] wurden in DMEM-Medium, das mit 10% Rinderserum ergänzt war, auf einer 6 cm-Schale plattiert. Am nächsten Tag wurde das Medium durch ein neues Volumen desselben Mediums ersetzt. Nach 3 Stunden wurden 1, 2, 5 oder 10 ug Plasmid pRGB12 oder pTB1055 durch das Calciumphosphatverfahren [Graham et al., Virology 52 456 (1973)] transfiziert. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37ºC wurde mit einer PBS-Lösung, die mit 15% Glycerin ergänzt war, eine Stimulation der Transfizierung durchgeführt. Die Zellkultivierung wurde 4 Wochen fortgesetzt, wobei die Hälfte des Mediums alle 3 bis 4 Tage durch 5% Kälberserum enthaltendes DMEM-Medium ersetzt wurde. Nach dem Beenden der Kultur wurde das Medium verworfen und zum Fixieren der Zellen wurde 15 Minuten eiskaltes Methanol hinzugefügt. Nach Waschen mit Wasser wurden die Zellen 20 Minuten mit Giemsalösung angefärbt. Die Schalen wurden mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet, gefolgt vom Zählen der angefärbten Herde. Die Ergebnisse daraus sind in Tabelle 2 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigten eindeutig, daß die GAF-Gene eine Transformierungseigenschaft aufwiesen. Tabelle 2 Herdbildung von A31-Zellen durch Einführen von GAF-Genen

Beispiel 8

(1) Expression von GAF in E. coli

(a) Aufbau des GAF-Expressionsplasmids pETGAF1

Plasmid pGAF1, das alle Strukturgene des in Beispiel 5 erhaltenen GAF enthielt, wurde mit dem Restriktionsenzym KpnI-BamHI gespalten und ein DNA-Fragment mit 1,25 kb wurde isoliert. Ähnlich wurde das einen T7-Promotor enthaltende Plasmid pET3-c mit dem Restriktionsenzym NdeI-BamHI gespalten und eine DNA mit 4,6 kb wurde isoliert, gefolgt von der Inserierung des vorgenannten Fragments mit 1,25 kb der GAF-cDNA und synthetisierten DNA-Fragmente (NdeI-KpnI) [(SEQ ID Nr.: 26) und SEQ ID Nr. 27)], die Met unmittelbar vor Leu, dem N-Terminus des ge reinigten GAF-Proteins mit 30 kDa kodieren. Auf diese Weise wurde das Expressionsplasmid pETGAF1 aufgebaut, das die GAFcDNA unter der Kontrolle des T7-Promotors exprimieren kann. Fig. 23 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau von Plasmid pETGAF1 zeigt. Unter Verwenden dieses Plasmids wurde E. coli MM294(DE3)/pLysS unter Produzieren des GAF- Expressionsplasmids E. coli MM294(DE3)/pLysS, pETGAF1 transformiert.
Auf diese Weise erhaltenes MM294(DE3)/pLysS, pETGAF1 wurde in LB-Medium kultiviert und die GAF-Expression wurde durch Isopropyl-β-D(-)-thiogalactosid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) ausgelöst. Anschließend wurden die aus den Zellen extrahierten Proteine, die 200 ul Kulturlösung entsprachen, durch das Western-Blotting-Verfahren unter Verwenden von polyklonalem Kaninchen-anti-GAF-Antiserum (500-fache Verdünnung) untersucht, das den N-terminalen Abschnitt des GAF-Proteins erkennt. Als Ergebnis wurde wie in Fig. 24 dargestellt eine spezifische Bande gefunden. Die Transformante MM294(DE3)/pLysS, pET3-c, die mit dem Plasmid pET3-c ohne GAF- cDNA transformiert worden war, erzeugte die Bande nicht.

(2) Extraktion von in E. coli produziertem Human-GAF (rhGAF)

E. coli MM294(DE3)/pLysS, pETGAF1 wurde unter Schütteln bei 37ºC in mit 50 ug/ml Ampicillin und 10 ug/ml Chloramphenicol ergänztem LB-Medium kultiviert. Als der Klettwert der Kulturlösung 120 erreichte, wurde Isopropyl-β-D(-)-thiogalactosid auf eine Endkonzentration von 0,4 mM zugesetzt und die Kultur wurde 3,5 Stunden unter Schütteln bei 37ºC weiter kultiviert. Die aus 1 Liter Kulturlösung durch Zentrifugieren (10 Minuten bei 6000 Upm) gesammelten Zellen wurden in 80 ml 20 mM Tris-HCl- Puffer, der mit 2 mM (p-Amidinophenyl)-methansulfonylfluoridhydrofluorid (Wako Pure Chemical Industries, Japan), 100 ug/ml Eiweißlysozym (Seikagaku Kogyo K. K., Tokio, Japan) und 0,1 M NaCl ergänzt war, auf Eis suspendiert und man ließ die sich daraus ergebende Suspension 1 Stunde bei 4ºC stehen, gefolgt von 3 Minuten Inkubation bei 37ºC. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wurde mit Eis gekühlt und der Ultraschallbehandlung [Sonifier Cell Disruptor of 800 (eingetragenes Warenzeichen), Branson, USA, 2 Minuten bei Leistungsstufe 8] unterzogen. Durch 40 Minuten Zentrifugieren bei 17000 Upm wurde ein E. coli-Extrakt erhalten.

(3) Reinigung von in E coli produziertem Human-GAF (rhGAF)

Schritt 1: Ammoniumsulfatfällung

80 ml des aus 1 Liter vorstehender Lösung erhaltenen E. coli- Extraktes wurden 27 ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung zugesetzt, gefolgt vom Mischen. Anschließend ließ man das Gemisch über Nacht bei 4ºC stehen. Darauf wurde das Gemisch unter Erhalten eines Überstandes 40 Minuten bei 17000 Upm zentrifugiert.

Schritt 2: Hydrophobe Säulenchromatographie

100 ml des in Schritt 1 erhaltenen zentrifugierten Überstandes ließ man bei 4ºC mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 80 ml/Stunde durch eine Butyl-Toyopearl-Säule 650M (Bettvolumen: 50 ml, 2,5 cm Innendurchmesser · 10 cm Länge, Tosoh Corp. Tokio, Japan) laufen, die mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), der mit 25% gesättigter Ammoniumsulfatlösung ergänzt war, äquilibriert worden war. Das Harz wurde mit 20 mM Tris-HCl- Puffer (pH 7,6), der mit 12,5% gesättigter Ammoniumsulfatlösung und 2 mM aPMSF ergänzt war, gründlich gewaschen und anschließend wurden durch Elution mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), der mit 15% Glycerin, 0,1% CHAPS und 2 mM aPMSF ergänzt war, rhGAF-Protein enthaltende Fraktionen (durch Western- Blotting-Technik bestimmt, Daten nicht angegeben) erhalten (E2, 80 ml/Stunde, 10 ml/Fraktion, 4ºC), deren Ergebnisse in Fig. 25 dargestellt werden.

Schritt 3: Heparin-Affinitäts-Hochleistungsflüssigkeitsäulen- Chromatographie

Die in Schritt 2 erhaltenen rhGAF-Protein enthaltenden Fraktionen (Fraktion 44 bis 47) wurden zusammengefaßt (40 ml). Von 40 ml dieser Lösung wurde auf 36 ml die Hochleistungsflüssigkeitssäulenchromatographie (Gilson Medical Electronics, Frankreich) angewandt, die mit einer HR-894-Säule (8 mm Durchmesser x 50 mm Länge, Showa Denko K. K., Japan) ausgestattet war. Das durch das Harz adsorbierte Protein wurde mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 2 ml/Minute durch lineares Erhöhen der NaCl-Konzentration eluiert und fraktioniert (2 ml/Fraktion). Der verwendete Puffer A war 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), der 0,4 M NaCl, 0,1% CHAPS und 15% Glycerin enthielt, und Puffer B war 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), der 2 M NaCl, 0,1% CHAPS und 15% Glycerin enthielt. Das Elutionsprogramm war wie folgt:
0 Minuten (100% A) - 70 Minuten (75% A 25% B) - 75 Minuten (100% B) - 80 Minuten (100% B) - 85 Minuten (100% A). Die Ergebnisse dieser Elution werden in Fig. 26 dargestellt. Die Säulentemperatur war Raumtemperatur.
Ein Mikroliter jeder eluierten Fraktion 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 und 44 wurde der SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (Gelkonzentration: 12,5%) in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol, gefolgt vom Anfärben mit Silber unterzogen. Die Ergebnisse davon werden in Fig. 27 dargestellt. Durch Erhöhen der NaCl-Konzentration eluierte Fraktionen ergeben eine einzige Bande bei 27 kDa. Dieses 27 kDa-Protein wurde ferner durch polyklonales Kaninchen-anti-GAF-Antiserum erkannt, das wie in Fig. 28 dargestellt an den N-terminalen Teil von GAF bindet. Fraktion 27 bis 42 wurden zusammengefaßt.

(4) Zusammenfassung der Reinigung

Die Zusammenfassung der Reinigung von rhGAF, der aus 1 Liter Kultur von E. coli MM294(DE3)/pLysS, pETGAF1 erhalten wurde, wird in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3
Die biologische Aktivität wurde durch das in Bezugsbeispiel 1 beschriebene Verfahren bestimmt. Die Gesamtaktivität (U) wird als Kehrwert des Verdünnungsverhältnisses der Probe mit 50% Tritiumthymidinaufnahme ausgedrückt, wobei ein Wert von 100% Tritiumthymidinaufnahme als die Tritiumthymidinaufnahme in einem Medium aus 10% fetalem Kälberserum definiert ist. Die Proteinmenge wurde durch einen MicroBCA-Kit (Pierce, USA) unter Verwenden von Rinderserumalbumin als Standard definiert.

Beispiel 9

Aktivität von GAF gegenüber verschiedenen Kulturzellen (2)

(1) Wachstumsfördernde Aktivität gegenüber Gliazellen

Wie in Fig. 29 angegeben weist der durch das in Beispiel 8- (3) beschriebene Verfahren erhaltene rhGAF gegenüber Gliazellen eine wachstumsfördernde Aktivität auf. In der Figur bezeichnen die Werte auf der Abszisse die GAF-Konzentration. Eine das GAF-Wachstum fördernde Aktivität auf Gliazellen wurde gemäß dem in Bezugsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt.

(2) Wachstumsfördernde Aktivität auf Fibroblasten

Wie in Fig. 30 angegeben, weist der durch das in Beispiel 8- (3) beschriebene Verfahren erhaltene rhGAF gegenüber Fibroblastenzellen des BALB/3T3Maus-Klons A31 eine wachstumsfördernde Aktivität auf. In der Figur bezeichnen die Werte auf der Abszisse die GAF-Konzentration. Die das GAF-Wachstum fördernde Aktivität auf A31-Zellen wurde gemäß dem in Beispiel 2-(4) beschriebenen Verfahren bestimmt.

(3) Wachstumsfördernde Aktivität auf Ratten-Gefäßalattmuskelzellen

Wie in Fig. 31 angegeben weist der durch das in Beispiel 8- (3) angegebene Verfahren erhaltene rhGAF gegenüber Ratten- Gefäßglattmuskelzellen eine wachstumsfördernde Aktivität auf (Fig. 31). In der Figur bezeichnen die Werte auf der Abszisse die GAF-Konzentration.
Eine das GAF-Wachstum fördernde Aktivität auf die Ratten- Gefäßglattmuskelzellen wurde gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt. Ratten-Gefäßglattmuskelzellen in Primärkultur wurden in jedes Näpfchen einer Nung-96-Näpfchen-Mikrotiterplatte (Flachboden) in einer Menge von 3 · 10³/Näpfchen in 100 ul Eagles MEM-Medium, das mit 10% Kälberserum ergänzt war, plattiert und kultiviert. Am nächsten Tag wurden aus jedem Näpfchen 80 ul des Mediums verworfen und jedem Näpfchen wurden 180 ul serumfreies Eagles MEM-Medium zugesetzt. Nach 2 Tagen Kultivieren wurden aus jedem Näpfchen 20 ul Medium verworfen. Anschließend wurden jedem Näpfchen 20 ul mit DMEM-Medium, das mit 0,1% Rinderserumalbumin ergänzt war, entsprechend verdünnte Testprobe zugesetzt, gefolgt vom Kultivieren über Nacht. Am nächsten Morgen wurde jedem Näpfchen 1 uCi Tritiumthymidin (5 Ci/mMol, 1 mCi/ml, RCC Amersham) zugesetzt, gefolgt von 5 Stunden weiterem Kultivieren. Nach dem Kultivieren wurde das Medium aus jedem Näpfchen verworfen und jedem Näpfchen wurden 100 ul 0,5% Trypsin und 0,01% EDTA enthaltendes PBS zugesetzt, gefolgt von mehreren Minuten Stehen bei Raumtemperatur. Nachdem das Ablösen der Zellen unter einem Mikroskop bestätigt worden war, wurden die abgelösten Zellen auf einem Glasfaserfilter (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Japan) mittels eines Titertek Cell Harvesters (Flow Laboratories, Virginia, USA) gesammelt und mit Wasser gewaschen. Anschließend wurde die in die Zellen aufgenommene Tritiumthymidinmenge durch einen Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen.

(4) Aktivität gegenüber Gefäßendotheliumszellen der menschlichen Nabelschnur

Der durch das in Beispiel 8-(3) beschriebene Verfahren erhaltene rhGAF weist wie in Fig. 32, die die rhGAF- und bFGF- Aktivität vergleicht, angegeben keine wachstumsfördernde Aktivität gegenüber Gefäßendotheliumszellen der menschlichen Nabelschnur auf. In der Figur bezeichnen die Werte auf der Abszisse die Proteinkonzentration von rhGAF oder bFGF. Die wachstumsfördernde Aktivität auf Gefäßendotheliumszellen der menschlichen Nabelschnur wurde gemäß dem in Beispiel 2-(5) beschriebenen Verfahren bestimmt.

(5) Megakaryozytenkoloniestimulierungsfaktoraktivität von rhGAF

Knochenmarkzellen der weiblichen BALB/c-Maus wurden in Iscovemodifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM), das mit 20% fetalem Kälberserum (FCS) unter Ergeben von 2 · 10&sup7; Zellen/ml ergänzt war, suspendiert und in einer mit fetalem Kälberserum überzogenen Kunststoffkulturschale unter Entfernen anhaftender Zellen 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Nach 3 Mal Waschen mit IMDM wurden die sich daraus ergebenden, nicht-haftenden Knochenmarkzellen für den Versuch verwendet. Die Zellen wurden in mit 1% Neutridoma SP (Boehringer Mannheim) ergänztem IMDM suspendiert und jedes Näpfchen einer 96-Näpfchen-Flachbodenplatte wurde zusammen mit humanem rekombinantem GAF (rhGAF) mit 1 · 10&sup5; Zellen beimpft. Eine Lösung von 125 ug/ml rhGAF in 0,6 M NaCl, 15% Glycerin, 0,1% CHAPS, 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) wurde mit IMDM verdünnt und ein GAF-freier Puffer wurde ähnlich verdünnt und diese wurden jeweils dem Versuchssystem zugesetzt. Weiter wurde rekombinantes Maus-IL-3 (mr-IL3) (Genzyme) als positive Kontrolle verwendet. Die Zellkultivierung wurde in Gegenwart von 5% CO&sub2; enthaltender Luft 4 Tage bei 37ºC ausgeführt. Anschließend wurden 20 u1 mit 5 mg/ml MTT (Sigma) ergänzte PBS- Lösung zugesetzt, gefolgt von 5 Stunden Kultivieren bei 37ºC. Es wurden 100 ul 10% SDS, 0,01 N HCl-Lösung hinzugesetzt und die sich daraus ergebende Lösung wurde über Nacht bei 37ºC weiter inkubiert. Anschließend wurde die Absorption bei 590 nm gemessen und die Vermehrung der Knochenmarkzellen wurde untersucht. Die Ergebnisse davon werden in Fig. 33 dargestellt.
Ähnlich wurden auf ähnliche Weise hergestellte Zellen in Gegenwart von 5% CO&sub2; enthaltender Luft 7 Tage bei 37ºC kultiviert. 50 ul mit 5% Glutaraldehyd ergänzte PBS-Lösung wurden hinzugesetzt, gefolgt von 5 Minuten Zentrifugieren bei 2000 Upm unter Fixieren der Zellen. Nach einmal Waschen mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0) wurden die Megakaryozyten durch Acetylcholinesterasefärbung angefärbt (siehe Biochemical Experimental Course, Second Series, 8, Bloods, erster Band, Seite 149) und die Zahl der Megakaryozyten je Näpfchen wurde unter einem Umkehrmikroskop gezählt. Die Ergebnisse davon werden in Fig. 34 dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigten, daß der rhGAF eine das Wachstum von Mausknochenmarkzellen unterstützende Aktivität aufwies und weiter gegenüber Megakaryozyten eine Aktivität des Einwirkens auf ihr Wachstum und Reifen in den Knochenmarkszellen aufwies.

SEQUENZLISTEN

SEQ ID Nr. 1

SEQUENZLÄNGE: 142 Aminosäuren
SEQUENZTYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Protein SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 1:

SEQ ID Nr. 2

SEQUENZLÄNGE: 207 Aminosäuren
SEQUENZTYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Protein SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 2:

SEQ ID Nr. 3

SEQUENZLÄNGE: 208 Aminosäuren
SEQUENZTYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Protein SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 3:

SEQ ID Nr. 4

SEQUENZLÄNGE: 177 Aminosäuren
SEQUENZTYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Protein SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 4:

SEQ ID Nr. 5

SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
SEQUENZLÄNGE: 205 Aminosäuren
SEQUENZTYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Protein SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 5:

SEQ ID Nr. 6

SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
SEQUENZLÄNGE: 178 Aminosäuren
SEQUENZTYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Protein SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 6:

SEQ ID Nr. 7

SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
SEQUENZLÄNGE: 206 Aminosäuren
SEQUENZTYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Protein SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 7:

SEQ ID Nr. 8

SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
SEQUENZLÄNGE: 206 Aminosäuren
SEQUENZTYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Protein SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 8:

SEQ ID Nr. 9

SEQUENZLÄNGE: 208 Aminosäuren
SEQUENZTYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Protein SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 9:

SEQ ID Nr. 10

SEQUENZLÄNGE: 426 Basenpaare
SEQUENZTYP: Nukleinsäure
STRÄNGIGKEIT: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
HYPOTHETISCH: NEIN
ANTI-SENSE: NEIN SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 10:

SEQ ID Nr. 11

SEQUENZLÄNGE: 621 Basenpaare
SEQUENZTYP: Nukleinsäure
STRÄNGIGKEIT: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
HYPOTHETTSCH: NEIN
ANTI-SENSE: NEIN SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 11:

SEQ ID Nr. 12

SEQUENZLÄNGE: 624 Basenpaare
SEQUENZTYP: Nukleinsäure
STRÄNGIGKEIT: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
HYPOTHETISCH: NEIN
ANTI-SENSE: NEIN SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 12:

SEQ ID Nr. 13

SEQUENZLÄNGE: 621 Basenpaare
SEQUENZTYP: Nukleinsäure
STRÄNGIGKEIT: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
HYPOTHETISCH: NEIN
ANTI-SENSE: NEIN SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 13:

SEQ ID Nr. 14

SEQUENZLÄNGE: 621 Basenpaare
SEQUENZTYP: Nukleinsäure
STRÄNGIGKEIT: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: CDNA bis mRNA
HYPOTHETISCH: NEIN
ANTI-SENSE: NEIN SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 14:

SEQ ID Nr. 15

SEQUENZLÄNGE: 624 Basenpaare
SEQUENZTYP: Nukleinsäure
STRÄNGIGKEIT: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 15:

SEQ ID Nr. 16

SEQUENZLÄNGE: 21 Aminosäuren
SEQUENZTYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Protein
HYPOTHETISCH: NEIN
ANTI-SENSE: NEIN
FRAGMENTTYP: N-terminal
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(B) HAPLOTYP: 2n
(C) GEWEBETYP: Gehirn
(D) ZELLTYP: Gliom
(E) ZELLINIE: NMC-G1
(V) MERKMAL
(A) ORT
3 Xaa = His oder Pro
14 Xaa = unbestimmt
(B) NACHWEISVERFAHREN: E SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 16:

SEQ ID Nr. 17

SEQUENZLÄNGE: 13 Aminosäuren
SEQUENZTYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Protein
HYPOTHETISCH: NEIN
ANTI-SENSE: NEIN
FRAGMENTTYP: N-terminal
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(B) HAPLOTYP: 2n
(C) GEWEBETYP: Gehirn
(D) ZELLTYP: Gliom
(E) ZELLINIE: NMC-G1
MERKMAL
(A) ORT
1 Xaa = unbestimmt
12 (Ser) = vorhergesagt
(B) NACHWEISVERFAHREN: E SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 17:

SEQ ID Nr. 18

SEQUENZLÄNGE: 23 Aminosäuren
SEQUENZTYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Protein
HYPOTHETISCH: NEIN
ANTI-SENSE: NEIN
FRAGMENTTYP: N-terminal
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(B) HAPLOTYP: 2n
(C) GEWEBETYP: Gehirn
(D) ZELLTYP: Gliom
(E) ZELLINIE: NMC-G1
MERKMAL
(A) ORT
1 Xaa = Leu oder Ala
20 (Pro) = vorhergesagt
21 Xaa = unbestimmt
(B) NACHWEISVERFAHREN: E SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 18:

SEQ ID Nr. 19

SEQUENZLÄNGE: 25 Basenpaare
SEQUENZTYP: Nukleinsäure
STRANGIGKEIT: einzel
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: andere Nukleinsäure, synthetische DNA
HYPOTHETISCH: JA
ANTI-SENSE: NEIN
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
MERKMAL
(A) 11, 14 I = Inosin SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 19:

SEQ ID Nr. 20

SEQUENZLÄNGE: 25 Basenpaare
SEQUENZTYP: Nukleinsäure
STRÄNGIGKEIT: einzel
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: andere Nukleinsäure, synthetische DNA
HYPOTHETISCH: JA
ANTI-SENSE: JA
MERKMAL
(A) 14, 20, 23 I = Inosin SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 20:

SEQ ID Nr. 21

SEQUENZLÄNGE: 59 Basenpaare
SEQUENZTYP: Nukleinsäure
STRÄNGIGKEIT: doppel
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: andere Nukleinsäure, PCR-Produkt aus Genom-DNA
HYPOTHETISCH: NEIN
ANTI-SENSE: NEIN
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 21:

SEQ ID Nr. 22

SEQUENZLÄNGE: 30 Basenpaare
SEQUENZTYP: Nukleinsäure
STRÄNGIGKEIT: einzel
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: andere Nukleinsäure, synthetische DNA
HYPOTHETISCH: JA
ANTI-SENSE: NEIN SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 22:

SEQ ID Nr. 23

SEQUENZLÄNGE: 30 Basenpaare
SEQUENZTYP: Nukleinsäure
STRÄNGIGKEIT: einzel
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: andere Nukleinsäure, synthetische DNA
HYPOTHETISCH: JA
ANTI-SENSE: JA SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 23:

SEQ ID Nr. 24

SEQUENZLÄNGE: 1493 Basenpaare
SEQUENZTYP: Nukleinsäure
STRÄNGIGKEIT: doppel
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
HYPOTHETISCH: NEIN
ANTI-SENSE: NEIN
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(B) HAPLOTYP: 2n
(C) GEWEBETYP: Haut
(D) ZELLTYP: Fibroblast
(V) UNMITTELBARE HERKUNFT
(A) BIBLIOTHEK: cDNA-Bibliothek menschlicher Vorhaut
(B) KLON: pGAF1 SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 24:

SEQ ID Nr. 25

SEQUENZLÄNGE: 208 Aminosäuren
SEQUENZTYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Protein
HYPOTHETISCH: NEIN
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(B) HAPLOTYP: 2n
(C) GEWEBETYP: Haut
(D) ZELLTYP: Fibroblast
(V) UNMITTELBARE HERKUNFT
(A) BIBLIOTHEK: cDNA-Bibliothek menschlicher Vorhaut
(B) KLON: pGAF1 SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 25:

SEQ ID Nr. 26

SEQUENZLÄNGE: 47 Basenpaare
SEQUENZTYP: Nukleinsäure
STRÄNGIGKEIT: einzel
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: andere Nukleinsäure, synthetische DNA
HYPOTHETISCH: NEIN
ANTI-SENSE: NEIN SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 26:

SEQ ID Nr. 27

SEQUENZLÄNGE: 41 Basenpaare
SEQUENZTYP: Nukleinsäure
STRÄNGIGKEIT: einzel
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: andere Nukleinsäure, synthetische DNA
HYPOTHETISCH: NEIN
ANTI-SENSE: JA SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 27:

Claims

1. Gliaaktivierungsfaktor, der ein durch die folgende Aminosäuresequenz dargestelltes Polypeptid:

oder Mutein oder Fragment davon enthält, wobei der Gliaaktivierungsfaktor, das Mutein und Fragment jeweils die folgenden Eigenschaften aufweisen:

(a) der Gliaaktivierungsfaktor, das Mutein oder Fragment zeigen jeweils keine immunologische Kreuzreaktion mit aus Blutplättchen stammendem Wachstumsfaktor (PDGF), saurem Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF) oder basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) und

(b) der Gliaaktivierungsfaktor, das Mutein oder Fragment zeigen jeweils eine wachstumsfördernde Aktivität auf Gliazellen, Fibroblasten und Ratten-Phänochromozytom-PC-12-Zellen.

2. Gliaaktivierungsfaktor gemäß Anspruch 1, wobei das Polypeptid durch die folgende Aminosäuresequenz dargestellt wird:

worin n 0 oder 1 ist, X&sub1;

oder ein Fragment davon darstellt und X&sub2;

oder ein Fragment davon darstellt.

3. Gliaaktivierungsfaktor gemäß Anspruch 1, wobei das Polypeptid durch die folgende Aminosäuresequenz dargestellt wird:

oder ein Fragment davon darstellt.

4. DNA enthaltend ein Polynukleotid, das für einen Gliaaktivierungsfaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.

5. DNA gemäß Anspruch 4, wobei das Polynukleotid durch die folgende Nukleotidsequenz dargestellt wird:

6. DNA gemäß Anspruch 4, wobei das Polynukleotid durch die folgende Nukleotidsequenz dargestellt wird:

worin Y&sub1;

oder ein Fragment davon darstellt und Y&sub2;

oder ein Fragment davon darstellt, oder eine Nukleotidsequenz mit einem Startkodon an deren 5'- Terminus.

7. DNA gemäß Anspruch 4, wobei das Polynukleotid durch die folgende Nukleotidsequenz dargestellt wird:

oder ein Fragment davon darstellt, oder eine Nukleotidsequenz mit einem Startkodon ATG an deren 5'-Terminus.

8. Transformante mit einem Vektor, der die in Anspruch 4 beanspruchte DNA enthält.

9. Verfahren zum Herstellen eines in Anspruch 1 beanspruchten Gliaaktivierungsfaktors, das das

Transformieren eines Wirts mit der in Anspruch 4 beanspruchten DNA,

Kultivieren der erhaltenen Transformante in einem Medium, Anreichern des Gliaaktivierungsfaktors in einer Kulturbrühe und

Sammeln des sich daraus ergebenden Gliaaktivierungsfaktors umfaßt.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines in einem der Ansprüche 1-3 beanspruchten Gliaaktivierungsfaktors und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung wie in Anspruch 10 beansprucht, wobei die Zusammensetzung zum Fördern einer Zunahme der Blutplättchenzahl geeignet ist.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung wie in Anspruch 10 beansprucht, wobei die Zusammensetzung zur Behandlung oder Besserung von Hirnläsionen geeignet ist.

13. Verwendung eines in einem der Ansprüche 1-3 beanspruchten Gliaaktivierungsfaktors zum Herstellen eines Arzneimittels zum Fördern einer Zunahme der Blutplättchenzahl.

14. Verwendung eines in einem der Ansprüche 1-3 beanspruchten Gliaaktivierungsfaktors zum Herstellen eines Arzneimittels zur Behandlung oder Besserung der Alzheimer-Krankheit.

15. Verwendung eines in einem der Ansprüche 1-3 beanspruchten Gliaaktivierungsfaktors zum Herstellen eines Arzneimittels zur Behandlung oder Besserung von Hirnläsionen, Hirnödem, seniler Demenz oder Diabetesneuropathie.