DE68914582T2

DE68914582T2 - Endothelin-DNA und ihre Verwendung.

Info

Publication number: DE68914582T2
Application number: DE68914582T
Authority: DE
Inventors: Akihiro Inoue; Tomoh Masaki; Masashi Yanagisawa
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-10-25
Filing date: 1989-10-20
Publication date: 1994-08-25
Anticipated expiration: 2009-10-21
Also published as: EP0366016A3; EP0366016B1; EP0543425B1; DE68929134T2; DE68914582D1; EP0366016A2; CA2001303A1; US5231166A; US5811263A; US5294569A; CA2001303C; EP0543425A1; US5548061A; DE68929134D1; ATE188736T1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die ein DNA-Segment enthält, das für ein menschliches gefäßverengendes Peptid, nämlich Endothelin-2, kodiert, ein Vorstufen-Protein (oder ein Vorstufen-Polypeptid) und ein reifes Protein (oder ein reifes Polypeptid) von Endothelin-2 und ein Verfahren zum Herstellen des Vorstufen-Proteins und des reifen Proteins (Endothelin-2).
In dieser Beschreibung wird der Ausdruck "Vorstufen-Protein" vorzugsweise zum Beschreiben eines Proteins verwendet, welches eine Aminosäuresequenz eines reifen Peptids einschließt und einen Teil der oder die gesamte Aminosäuresequenz besitzt, die mit einem DNA-Segment des Peptids an dem N-Ende, dem C-Ende oder dessen beider Enden kodiert ist.
Es hat Berichte sowohl von Endothelium-abhängigen Vasokonstriktorreaktionen gegenüber verschiedenen mechanischen und chemischen Stimuli als auch Endothelium-abhängigen Vasodilatorreaktionen gegeben. Es ist zum Beispiel bekannt, daß eine Gefäßverengung durch mechanische Belastungen wie etwa eine Gefäßdehnung und einen erhöhten Gefäßinnendruck ausgelöst werden kann oder durch solche Mittel wie etwa Thrombin chemisch ausgelöst werden kann. Weiter kann eine Gefäßverengung durch Anoxiezustände ausgelöst werden. Eine durch Noradrenalin ausgelöste Gefäßverengung kann durch Verwendung von Neuropeptid Y verstärkt werden [K. Takemoto, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 5485 (1982); C. Minth et al., ibid. 81, 4577 (1984)]. Aus Endotheliumszellen stammende, die Koronargefäße verengende Faktoren (die jeweils Molekulargewichte von 8500 und 3000 besitzen) werden bei K. A. Hickey et al., Am. J. Phvsiol. 248, C550 (1985), und bei R. F. O'Brien, J. Cell Physiol. 132, 263 (1987) beschrieben. Ihre Strukturen sind jedoch unbekannt. Eine aus Endotheliumszellen stammende, peptidähnliche Substanz wird ferner bei M. N. Gillespie et al., J. Pharmac. Exp. Ther. 236, 339 (1985) beschrieben. Die Struktur dieser Substanz ist jedoch ebenfalls unbekannt.
Vasopressin ist als ein Peptid mit einer Vasokonstriktor-Aktivität bekannt und dessen Aminosäuresequenz wurde bestimmt. Es hat jedoch keine Berichte gegeben, daß Vasopressin aus Gefäßendotheliumszellen von Säugern oder Vögeln erhalten wurde. Obschon es einen Bericht gibt, daß ein Angiotensin mit Vasokonstriktoraktivität aus den Endotheliumszellen von Rinderaorten [I. Kifor und V. J. Dzav, Circ. Res., 60, 422 (1987)] erhalten wurde, ist das Angiotensin ein Peptid mit einem Molekulargewicht von nur etwa 1000.
Einige der Erfinder sind zuvor beim Isolieren von Schweine- Endothelin als einem Peptid mit einer ähnlichen Vasokonstriktoraktivität aus den Endotheliumszellen von Schweineaorten erfolgreich gewesen (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 206997/1989). Einige der Erfinder sind auch beim Isolieren von Human-Endothelin und dem Klonen von Schweine- Endothelin-cDNA und Human-Endothelin-cDNA erfolgreich gewesen (japanische Patentanmeldungen Nr. 275613/1987, 313155/1987, 148158/1988 und 274454/1988). Die reifen Polypeptide des Schweine-Endothelins und des Human-Endothelins besitzen dieselbe Aminosäuresequenz und werden als Endothelin-1 bezeichnet.
Weiter haben die Erfinder Patentanmeldungen hinsichtlich der Isolierung von Ratten-Endothelin und dem Klonieren seiner cDNA (japanische Patentanmeldungen Nr. 174935/1988 und 188083/1988) angemeldet und dieses Ratten-Endothelin wird als Endothelin-3 bezeichnet.
Weiter haben die Erfinder auch eine Patentanmeldung hinsichtlich der Isolierung von Maus-Endothelin und dem Klonieren seiner cDNA (japanische Patentanmeldung Nr. 223389/1988) angemeldet und dieses Maus-Endothelin wird als Endothelin-B bezeichnet.
Die Aminosäuresequenzen von Endothelin-I, Endothelin-B und Endothelin-3 werden in Fig. 3 im Vergleich miteinander dargestellt.
Endothelin ist ein allgemeiner Ausdruck für Peptide mit einem Molekulargewicht von 2500 ± 300 und mit 21 Aminosäureresten, einschließlich vier Cysteingruppen, die sich am 1., 3. 11. und 15. Rest vom N-Ende der Aminosäuresequenz befinden und die zwei Anordnungen von Disulfidbindungen bilden. Eine der Kombinationen der Disulfidbindungen können 1-15- und 3-11-Cysteingruppen sein und die andere kann 1-11 und 3-15 sein. Die erste liegt beim Bildungsverhältnis und bei der Aktivität höher als die letztere.
Diese vorstehend beschriebenen Endotheline sind verschieden benannt worden und in der vorliegenden Erfindung werden für die Endotheline neue, vereinheitlichte Namen angewendet. Diese sind verglichen mit den früheren Namen wie folgt:
Neue vereinheitlichte Namen Frühere Namen Endothelin-1 Endothelin A Human-Endothelin Schweine-Endothelin Endothelin α Endothelin-B Mas -Endothelin Endothelin B Endothelin β Endothelin-3 Endothelin C Endothelin Ratten-Endothelin
Wie vorstehend beschrieben sind homologe Endothelinpeptide in verschiedenen Tieren entdeckt worden. Aus derselben Tierart sind jedoch keine neuen, homologen Gene entdeckt worden. Es ist daher eine geläufige Tatsache, daß ein neues homologes Endothelin weiter untersucht wird und die Struktur und Aktivität des Endothelins untersucht wird, wodurch seine Brauchbarkeit untersucht wird und daß das neue Peptid durch Genrekombination kloniert wird, um den Weg für dessen Massenproduktion zu bereiten.

KURZBESCHREIBUNG

Die Erfinder haben mit Betracht darauf, daß für weitere Untersuchungen und medizinische Behandlungen wichtige Beiträge geliefert werden, verschiedentlich untersucht, ob ein neues homologes Gen mit der vorstehend beschriebenen Vasokonstriktoraktivität gewonnen und weiter durch Genrekombination hergestellt werden kann. Als Ergebnis ist die folgende Information erhalten worden und man ist auf diese Weise zu der vorliegenden Erfindung gelangt.
Die Erfinder sind beim Klonieren von DNA, die für Endothelin mit einer Aminosäuresequenz kodiert, welche von derjenigen des vorstehenden Endothelin-1 [Human-Endothelin (Endothelin A)] verschieden ist, aus einer Human-Genom-DNA-Bank durch Verwenden des synthetisierten, für einen Teil des Human-Endothelins, welches in den früher angemeldeten Patentanmeldungen beschrieben wurde, kodierenden DNA-Segments als Sonde erfolgreich gewesen.
Die Erfinder sind auch beim Wegbereiten der Massenherstellung des neuen Endothelins durch Genrekombination erfolgreich gewesen. Die Erfinder haben dieses Human-Endothelin mit der neuen Aminosäuresequenz "Endothelin-2" genannt (zuerst "Human-Endothelin A-II").
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird (1) eine DNA-Sequenz, die ein für Endothelin-2 kodierendes DNA-Segment enthält, (2) ein Vorstufen-Protein und ein reifes Endothelin-2-Peptid, (3) eine Transformante, die eine DNA-Sequenz trägt, welche ein für Endothelin-2 kodierendes DNA-Segment enthält und (4) ein Verfahren zum Herstellen reifen Endothelin-2 bereitgestellt, welches das Kultivieren der in (3) beschriebenen Transformante, das Erzeugen und Anreichern eines Proteins in einem Kulturmedium und das Sammeln des auf diese Weise erhaltenen Proteins umfaßt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt vereinfachte Restriktionsenzymkarten einer DNA- Sequenz, die eine Endothelin-2-Vorstufe oder ein reifes Peptid-DNA-Segment enthalten.
Fig. 2 zeigt eine Nukleotidsequenz der Endothelin-2-Vorstufe oder eines reifen Peptid-DNA-Segments, Nukleotidsequenzen von Endothelin-1 und Ratten-Endothelin-3 als Vergleichsbeispiele und ihre daraus vermuteten Aminosäuresequenzen und
Fig. 3 zeigt eine Aminosäuresequenz des reifen Human-Endothelin- 2-Peptids mit der in Fig. 2 gezeigten vermuteten Nukleotidsequenz und Aminosäuresequenzen von Endothelin-1, Endothelin B und Endothelin-3.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die Endothelin-2-Vorstufe der vorliegenden Erfindung umfaßt die folgende Aminosäuresequenz [Formel (2)].
Reifes Endothelin-2 der vorliegenden Erfindung, das dem vom Menschen stammenden reifen Endothelin (Endothelin-1) entspricht und aus 21 Aminosäureresten besteht, besitzt eine Aminosäuresequenz, die durch die folgende Formel (2') dargestellt wird, welche der Nr. 12 bis 32 der Formel (2) entspricht:
Die Zahlen der Aminosäurereste in der vorstehenden Formel werden in der Reihenfolge, die hinsichtlich der Aminosäuresequenz reifen Endothelins-2 mit dem ersten Cys beginnt, angegeben und sind von den an eine Endothelin-2-Vorstufe in der Formel (2) vergebenen Zahlen verschieden.
Endothelin-2 ist von Endothelin-1 in der vorstehenden Formel in den unterstrichenen Aminosäureresten verschieden und besitzt die
6 7 6 7
Aminosäurereste Trp-Leu anstelle von Leu-Met in Endothelin-1.
Eine DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung, die für Endothelin-2 kodiert, enthält eine Nukleotidsequenz, die durch die folgende Formel (1) oder einen Teil davon dargestellt wird: Endothelin 2
Diese DNA-Sequenz ist von der in Fig. 2 dargestellten von bekanntem Endothelin-1, Endothelin B und Endothelin-3 sehr verschieden.
Die dem reifen Protein entsprechende DNA-Sequenz [entsprechend den Nr. 34 bis 96 in Formel (1)] ist ebenfalls von den bekannten Endothelin-DNA-Sequenzen verschieden und daher sind die DNA- Sequenzen der vorliegenden Erfindung neu.
Als DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung, die für das reife Endothelin-2-Peptid (Endothelin-2) kodieren, kann jede DNA- Sequenz verwendet werden, so lange wie die DNA-Sequenz eine Nukleotidsequenz enthält, die für die Aminosäuresequenz [Nr. 12 bis 32 in Formel (2)] des reifen Endothelin-2-Peptids kodiert.
Zum Beispiel wird vorzugsweise eine DNA-Sequenz verwendet, welche die durch Formel (1) dargestellte Nukleotidsequenz oder einen Teil derselben enthält.
Die durch Formel (1) dargestellte Nukleotidsequenz ist die in der vorliegenden Erfindung erhaltene Endothelin-2-DNA-Sequenz. Die in Formel (2') dargestellte Endothelin-2-Aminosäuresequenz entspricht der durch die Nr. 34 bis 96 in Formel (1) dargestellten Nukleotidsequenz.
In der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel ein Expressionsvektor mit der DNA-Sequenz, welche die für das reife Endothelin- 2 kodierende Nukleotidsequenz enthält, durch das folgende Verfahren hergestellt werden:
(a) Boten-RNA (mRNA) wird aus den Endothelin-2 erzeugenden Zellen isoliert.
(b) Einzelsträngige, komplementäre DNA (cDNA) wird aus mRNA synthetisiert, gefolgt von der Synthese doppelsträngiger DNA.
(c) Die komplementäre DNA wird in einen Klonierungsvektor wie etwa einen Phagen oder ein Plasmid eingeführt.
(d) Wirtszellen werden mit dem auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Phagen oder Plasmid transformiert.
(e) Nach der Kultivierung der auf diese Weise erhaltenen Transformanten werden die gewünschte DNA enthaltende Plasmide oder Phagen aus den Transformanten durch ein geeignetes Verfahren, wie etwa eine Hybridisierung mit einer für einen Teil des Endothelins-2 kodierenden DNA-Sonde oder ein einen anti-Endothelin- 2-Antikörper verwendender Immuntest, isoliert.
(f) Die gewünschte klonierte DNA-Sequenz wird aus der rekombinanten DNA herausgeschnitten.
(g) Die klonierte DNA-Sequenz oder ein Teil derselben wird stromabwärts von einem Promotor im Expressionsvektor ligiert.
Die für Endothelin-2 kodierende mRNA kann aus verschiedenen Endothelin erzeugenden Zellen, wie Endotheliumszellen aus menschlichen Aorten oder menschlichen Plazenten, erhalten werden.
Verfahren zum Herstellen der mRNA aus den Endothelin-2 erzeugenden Zellen schließen das Guanidin-Thiocyanat-Verfahren [J. M. Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979)] und dergleichen ein.
Unter Verwenden der auf diese Weise erhaltenen mRNA als Schablone wird die cDNA durch Verwendung reverser Transkriptase zum Beispiel gemäß dem Verfahren von H. Okayama et al. [Molecular and Cellular Biology 2, 161 (1979); ibid. 3, 280 (1983)] synthetisiert. Die auf diese Weise erhaltene cDNA wird in das Plasmid eingeführt.
Die Plasmide, in welche die cDNA eingeführt werden kann, schließen zum Beispiel pBR322 [Gene 2, 95 (1977)], pBR325 [Gene 4, 121 (1978)], pUC12 [Gene 19, 259 (1982)] und pUC13 [Gene 19, 259 (1982)], von denen jedes aus Escherichia coli stammt, und von Bacilius subtilis stammendes pUB110 [Biochemical and Biophysical Research Communication 112 678 (1983)] ein. Es kann jedoch jedes andere Plasmid verwendet werden, solange es replizierbar und in der Wirtszelle wachstumsfähig ist. Beispiele der Phagenvektoren, in welche die cDNA eingeführt werden kann, schließen gt11 ein [R. Young und R. Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 1194 (1983)]. Es kann jedoch jeder andere Phagenvektor verwendet werden, solange er in der Wirtszelle wachstumsfähig ist.
Verfahren zum Einführen der cDNA in das Plasmid schließen zum Beispiel das bei T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 239 (1982), beschriebene Verfahren ein. Verfahren zum Einführen der cDNA in den Phagenvektor schließen zum Beispiel das Verfahren von T. V. Hyunh et al. [DNA CLONING' A Practical Approach 1, 49 (1985)] ein.
Das auf diese Weise erhaltene Plasmid wird in eine geeignete Wirtszelle wie etwa Escherichia und Baciilus eingeführt.
Beispiele vorstehend beschriebener Escherichia schließen Eicherichia coli K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 60, 160 (1968)], M103 [Nucleic Acids Research 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Bioloav 41, 459 (1969)] und C600 [Genetics 39, 440 (1954)] ein.
Beispiele vorstehend beschriebenen Bacillus schließen Bacillus subtilis MI114 [Gene 24, 255 (1983)] und 207-21 [Journal of Biochemistry 95, 87 (1984)] ein.
Verfahren zum Transformieren der Wirtszelle mit dem Plasmid schließen zum Beispiel das bei T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 249 (1982), beschriebene Calciumchlorid-Verfahren oder das Calciumchlorid/Rubidiumchlorid-Verfahren ein.
Wenn ein Phagenvektor verwendet wird, kann der Phagenvektor zum Beispiel in vermehrte Escherichia coli mittels des in vitro- Packverfahrens übertragen werden.
Endothelin-2-cDNA enthaltende Human-cDNA-Banken können durch zahlreiche, in der Technik wohlbekannte Techniken einschließlich ihres Erwerbens am Markt erhalten werden, obschon sie durch die vorstehend beschriebenen Verfahren erhältlich sind. Zum Beispiel ist eine cDNA-Bank aus menschlichen Plazenten von Clontech Laboratories, Inc., U.S.A., erhältlich.
Verfahren zum Klonieren einer Endothelin-2-DNA aus der Human- DNA-Bank schließen zum Beispiel das Plaquehybridisierungsverfahren unter Verwenden von Oligonukleotiden ein, die auf der Grundlage des Phagenvektors Charon 4A und der Aminosäuresequenz von Endothelin-2 als Sonde chemisch synthetisiert wurden [T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)]. Die auf diese Weise klonierte Endothelin-2-DNA wird zum Erhalten der Endothelin-2-DNA nötigenfalls zum Beispiel in pBR322, pUC12, pUC13, pUC19, pUC118 und pUC119 unterkloniert.
Die Nukleotidsequenz der auf diese Weise erhaltenen DNA-Sequenz wird zum Beispiel durch das Maxam-Gilbert-Verfahren [A. M. Maxam und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 560 (1977)] oder das Didesoxyverfahren [J. Messing et al., Nucleic Acids Research 9, 309 (1981)] bestimmt und die Existenz der Endothelin-2-DNA wird im Vergleich mit der bekannten Aminosäuresequenz bestätigt.
Wie vorstehend beschrieben wird die für Endothelin-2 kodierende DNA-Sequenz [Endothelin-2-DNA, durch Formel (1) dargestellt] erhalten.
Fig. 1 zeigt die Restriktionsenzym-Fragmentkarte der DNA-Sequenz, welche das im nachstehend beschriebenen Beispiel 2 erhaltene, für Endothelin-2 kodierende DNA-Segment enthält. Figur 2 zeigt die durch das Didesoxyverfahren bestimmte Nukleotidsequenz der DNA-Sequenz und Fig. 3 zeigt die aus der Nukleotidsequenz ermittelten Aminosäuresequenzen.
Die wie vorstehend beschrieben klonierte, für Endothelin-2 kodierende DNA-Sequenz kann in Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung so wie sie ist oder gewünschtenfalls nach Verdauung mit einem Restriktionsenzym verwendet werden.
Ein zum Exprimieren beabsichtigter Bereich wird aus der klonierten DNA herausgeschnitten und stromabwärts vom Promotor in einem zur Exprimierung geeigneten Träger (Vektor) ligiert, wodurch der Expressionsvektor erhalten werden kann.
Die DNA-Sequenz besitzt ATG als Translationsstartcodon an deren 5'-Ende und kann TAA, TGA oder TAG als Translationsabbruchscodon am 3'-Ende besitzen. Das Translationsstartcodon und das Translationsabbruchscodon kann durch Verwendung eines geeigneten synthetischen DNA-Adaptors hinzugefügt werden. Ein Promotor wird weiter zum Zweck des Exprimierens der DNA-Sequenz stromaufwärts davon ligiert.
Beispiele der Vektoren schließen die vorstehenden, aus Escherichia coli stammenden Plasmide, wie etwa pBR322, pBR325, pUC12 und pUC13, die aus Bacillus subtilis stammenden Plasmide, wie etwa pUB110, pTP5 und pC194, aus Hefe stammende Plasmide, wie etwa pSH19 und pSH15, ein Bakteriophage wie etwa ein -Phage und tierische Viren, wie etwa Retroviren und Vakzinviren, ein.
Als in der vorliegenden Erfindung verwendeter Promotor ist jeder Promotor geeignet, solange der Promotor zur Expression in der für die Genexpression ausgewählten Wirtszelle geeignet ist.
Wenn die zur Transformation verwendete Wirtszelle Escherichia ist, ist es bevorzugt, daß ein trp-Promotor, ein lac-Promotor, ein recA-Promotor, ein PL-Promotor, ein lpp-Promotor usw. verwendet werden. Wenn die Wirtszelle Bacillus ist, ist es bevorzugt, daß ein PHO5-Promotor, ein PGK-Promotor, ein GAP- Promotor, ein ADH-Promotor usw. verwendet werden. Insbesondere ist es bevorzugt, daß die Wirtszelle Escherichia ist und der Promotor der trp-Promotor oder der PL-Promotor ist.
Wenn die Wirtszelle eine tierische Zelle ist, sind ein von SV-40 stammender Promotor, ein Retrovirus-Promotor, ein Metallothionin-Promotor, ein Hitzeschock-Promoter usw. jeweils verwendbar.
Ein Verstärker, eine gewisse, für die Aktivität des Promotors in einer Zelle wichtige DNA-Sequenz wird auch wirkungsvoll zur Expression verwendet.
Durch Verwenden eines auf diese Weise aufgebauten Vektors, der die DNA-Sequenz enthält, die für das reife Endothelin-2-Peptid (Endothelin-2) kodiert, werden Transformanten hergestellt.
Die Wirtszellen schließen zum Beispiel Escherichia, Bacillus, Hefe und tierische Zellen ein.
Als Beispiele der vorstehenden Escherichia und Bacillus können den vorstehend beschriebenen Stämmen ähnliche angeführt werden.
Beispiele der vorstehenden Hefe schließen saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R&supmin;, NA87-11A und DKD-5D ein.
Beispiele der tierischen Zellen schließen Affenzellen COS-7, Vero-, Zellen des chinesischen Hamsters (CHO), Mäuse-L-Zellen und Human-FL-Zellen ein.
Die Transformation des vorstehenden Escherichia wird zum Beispiel durch das in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69 2110 (1972) oder Gene 17, 107 (1982), beschriebene Verfahren durchgeführt.
Die Transformation des vorstehenden Bacillus wird zum Beispiel gemäß dem in Molecular & General Genetics 168, 111 (1979) beschriebenen Verfahren ausgeführt.
Die Transformation der Hefe wird zum Beispiel gemäß dem in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 1929 (1978), beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Transformation der tierischen Zellen wird zum Beispiel gemäß dem in Virology 52, 456 (1973), beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Auf diese Weise werden Transformanten erhalten, die mit einem Expressionsvektor transformiert sind, der die für das reife Endothelin-2-Peptid (Endothelin-2) kodierende DNA-Sequenz enthält.
Wenn bakterielle Transformanten kultiviert werden, ist ein flüssiges Medium besonders als zur Kultur verwendetes Medium geeignet. Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und anderes, zum Wachstum der Transformanten Notwendiges sind darin enthalten. Beispiele der Kohlenstoffquellen schließen Glucose, Dextrin, lösliche Stärke und Sucrose ein.
Beispiele der Stickstoffquellen schließen anorganische oder organische Materialien, wie etwa Ammoniumsalze, Nitrate, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakte, Sojabohnenmehl und Kartoffelextraktlösung ein. Die anorganischen Verbindungen schließen zum Beispiel Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und Magnesiumchlorid ein. Hefeextrakt, Vitamine, wachstumsfördernde Faktoren und so fort können weiter dazugesetzt werden.
Der pH des Mediums ist vorzugsweise 5 bis 8.
Als zur Kultivierung von Escherichia verwendetes Medium ist zum Beispiel Glucose und Casaminosäuren enthaltendes M9-Medium bevorzugt (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972). Um den Promotor wirkungsvoll wirken zu lassen, kann nötigenfalls ein Wirkstoff wie etwa 3-Indolylacrylsäure dazugesetzt werden.
Wenn die Wirtszelle Escherichia ist, wird die Kultivierung üblicherweise 3 bis 24 Stunden bei 15 bis 43ºC nötigenfalls unter Belüftung oder Rühren durchgeführt.
Wenn Hefetransformanten kultiviert werden, wird zum Beispiel Burkholder-Minimalmedium [K. L. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4505 (1980)] als Medium verwendet. Der pH des Mediums wird vorzugsweise auf 5 bis 8 eingestellt. Die Kultivierung wird üblicherweise 24 bis 72 Stunden bei 20 bis 35ºC nötigenfalls unter Belüftung oder Rühren durchgeführt.
Wenn Transformanten tierischer Zellen kultiviert werden, schließen Beispiele des Mediums 5 bis 20% fetales Kälberserum enthaltendes MEM-Medium [Science 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology 8, 396 (1959)], RPMI1640-Medium (Journal of the American Medical Association 199, 519 (1967)] und 199-Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine 73, 1 (1950)] ein.
Der pH beträgt vorzugsweise 6 bis 8. Die Kultivierung wird üblicherweise 15 bis 60 Stunden bei 30 bis 40ºC nötigenfalls unter Belüftung oder Rühren durchgeführt.
Das reife Endothelin-2-Peptid (Endothelin-2) kann aus der vorstehend beschriebenen Kultur durch zum Beispiel das folgende Verfahren isoliert und gereinigt werden.
Wenn das reife Endothelin-2-Peptid aus den kultivierten Zellen extrahiert werden soll, werden die Zellen nach der Kultivierung durch in der Technik bekannte Verfahren gesammelt. Anschließend werden die gesammelten Zellen in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert und durch Ultraschallbehandlung, Lysozym und/oder Gefrieren-Auftauen aufgebrochen. Danach wird durch Zentrifugation oder Filtration eine rohe Extraktlösung von reifem Endothelin-2-Peptid erhalten. Die Pufferlösung kann ein Proteindenaturierungsmittel, wie etwa Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid oder ein oberflächenaktives Mittel wie etwa Triton X-100 enthalten.
Wenn das Endothelin-2-Vorstufen-Protein oder das reife Peptid in der Kulturlösung sekretiert werden, wird nach Abschluß der Kultivierung durch in der Technik bekannte Verfahren ein Überstand von den Zellen abgetrennt und anschließend gesammelt.
Die Trennung und Reinigung des in dem auf diese Weise erhaltenen Kulturüberstands oder der extrahierten Lösung enthaltenen Endothelin-2-Vorstufen-Proteins oder des reifen Peptids kann durch eine geeignete Kombination bekannter Trenn- und Reinigungsverfahren ausgeführt werden. Die bekannten Trenn- und Reinigungsverfahren schließen Methoden ein, welche die Löslichkeit ausnützen, wie etwa Salzfällung und Lösungsmittelfällung, Verfahren, welche hauptsächlich einen Unterschied im Molekulargewicht ausnützen, wie etwa Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Verfahren, welche einen Unterschied in der elektrischen Ladung ausnützen, wie etwa Ionenaustausch-Säulenchromatographie, Verfahren, welche eine spezifische Affinität ausnützen, wie etwa Affinitätschromatographie, Verfahren, welche einen Unterschied in der Hydrophobie ausnützen, wie etwa Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, und Verfahren, welche einen Unterschied im isoelektrischen Punkt ausnützen, wie etwa isoelektrofokussierende Elektrophorese.
Die Aktivität des auf diese Weise gebildeten Endothelin-2-Vorstufen-Proteins oder des reifen Peptids kann durch einen Enzymimmuntest mittels eines spezifischen Antikörpers gemessen werden. Falls die Produkte eine gefäßverengende Aktivität besitzen, kann diese Aktivität ebenfalls als Index gemessen werden.
Die mit der DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung transfizierten oder transformierten Zellen, wie etwa tierische Zellen oder Escherichia coli, gestatten es, große Mengen des reifen Endothelin-2-Peptids herzustellen. So kann die Herstellung dieses Peptids vorteilhaft erreicht werden.
Das hier hergestellte reife Endothelin-2-Peptid kann nicht nur als therapeutische Blutdruckmittel oder örtliche Vasokonstriktoren verwendet werden, sondern liefert auch einen Anhaltspunkt für die Analyse des Mechanismus der gefäßverengenden Reaktionen in vivo und für die Ermittlung von Antagonisten gegenüber den gefäßverengenden Faktoren einschließlich der anderen Endothelinpeptide. Endothelin-2 besitzt eine bis zu zweimal so hohe gefäßverengende Aktivität wie die früher isolierten Endothelinpepti de. Diese Peptide besitzen solche Wirkungen wie das Verhindern verschiedener Arten Blutungen, zum Beispiel Magen- oder Speiseröhrenblutung, als Vasokonstriktoren und können ferner zum Heilen verschiedener Schocksymptome nützlich sein. Die Peptide können oral, örtlich, intravenös oder parenteral, vorzugsweise örtlich oder intravenös verabreicht werden. Die Dosis beträgt 0,001 ug bis 100 ug/kg, vorzugsweise 0,01 ug bis 10 ug/kg. Die Dosis ist vorzugsweise vom Gewicht abhängig und wird vorzugsweise in Form einer Lösung in 1 bis 10 ml Kochsalzlösung verwendet.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung kann zusammen mit zusätzlichen Bestandteilen in die Form verschiedener Zubereitungen, wie etwa Emulsionen, wasserhaltige Gemische, Tabletten, Lösungen, Pulver, Granulate, Kapseln und Pillen gebracht werden. Beispiele der zusätzlichen Bestandteile schließen pharmazeutisch annehmbare Vehikel, Zerfallshilfsmittel, Gleitmittel, Bindemittel, Dispergiermittel, Weichmacher, Füllstoffe und Träger ein. Was die zusätzlichen Bestandteile anbelangt schließen Beispiele der Träger Lactose, Glucose und Weißzucker, diejenigen der Zerfallshilfsmittel schließen Stärke, Natriumalginat, Agarpulver und Calciumcarboxymethylcellulose, diejenigen der Gleitmittel schließen Magnesiumstearat, Talk und flüssiges Paraffin ein, diejenigen der Bindemittel schließen Sirup, Gelatinelösung, Ethanol und Polyvinylalkohol, diejenigen der Dispergiermittel schließen Methylcellulose, Ethylcellulose und Schellack und diejenigen der Weichmacher schließen Glycerin und Stärke ein.
Wenn Nukleotide, Aminosäuren und so weiter durch die Abkürzungen in dieser Beschreibung und Zeichnungen bezeichnet werden, werden die von der IUPAC-IUB Kommission für biochemische Nomenklatur angenommenen oder die in der Technik gebräuchlicherweise verwendeten Abkürzungen verwendet. Es werden zum Beispiel die folgenden Abkürzungen verwendet. Wenn Aminosäuren in der Lage sind, als optische Isomere vorzuliegen, werden, solange nicht anders angegeben, die L-Formen dargestellt.
DNA : Deoxyribonukleinsäure
cDNA : komplementäre Deoxyribonukleinsäure
A : Adenin
T : Thymin
G : Guanin
C : Cytosin
RNA : Ribonukleinsäure
mRNA : Boten-Ribonukleinsäure
dATP : Desoxyadenosintriphosphat
dTTP : Desoxythymidintriphosphat
dGTP : Desoxyguanosintriphosphat
dCTP : Desoxycytidintriphosphat
ATP : Adenosintriphosphat
EDTA : Ethylendiamintetraessigsäure
SDS : Natriumdodecylsulfat
Gly oder G: Glycin
Ala oder A: Alanin
Val oder V: Valin
Leu oder L: Leucin
Ile oder I: Isoleucin
Ser oder S: Serin
Thr oder T: Threonin
Cys oder C: Cystein
Met oder M: Methionin
Glu oder E: Glutaminsäure
Asp oder D: Asparaginsäure
Lys oder K: Lysin
Arg oder R: Arginin
His oder H: Histidin
Phe oder F: Phenylalanin
Tyr oder Y: Tyrosin
Trp oder W: Tryptophan
Pro oder P: Prolin
Asn oder N: Asparagin
Gln oder Q: Glutamin
Was das reife Endothelin-2-Peptid der vorliegenden Erfindung betrifft, so kann ein Teil der Aminosäuresequenz modifiziert sein, und zwar kann eine Addition, Eliminierung oder Substitution mit anderen Aminosäuren vorliegen, solange wie die gefäßverengende Eigenschaft nicht verloren ist.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend mit dem folgenden Referenzbeispiel und den Beispielen im einzelnen beschrieben. Es versteht sich, daß das Referenzbeispiel und die Beispiele nicht dazu bestimmt sind, den Umfang der Erfindung zu begrenzen.
Die in Beispiel 2 erhaltene Transformante Escherichia coli XL- 1/pghET20SG1 ist beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (FRI), unter der Zugangsnummer FERM BP-2118 am 24. Oktober 1988 hinterlegt worden.

Referenzbeispiel

(1) Bestimmung der gefäßverengenden Aktivität bei glatter Muskulatur

Spiralförmige Proben von rechter Schweinekoronararterie (0,5 x 20 mm) mit durch Reiben mit einem kleinen Bausch entfernter Innenschicht werden in 3 ml Krebs-Ringer-Lösung suspendiert, die bei 37ºC gehalten wird und mit einem 5% Kohlendioxid und 95 Vol.-% Sauerstoff enthaltenden Gasgemisch gesättigt ist. Nach Einstellen der Grundspannung auf 2 g wird die isometrische Spannung mit Spannungsmeßwandlern gemessen.

(2) Bestimmung der kardiotonen Wirkung

Anstelle der spiralförmige Proben von rechter Schweinekoronararterie, die in dem unter dem vorstehenden Punkt (1) beschriebenen Test verwendet wurden, werden suspendierte Proben von rechtem Meerschweinchenatrium verwendet und die Spannung und der Herzschlag je Minute wurde gemäß demselben, in (1) beschriebenen Verfahren gemessen.

Beispiel 1

Herstellung einer auf einen Teil von Endothelin-1 [Schweine- Endothelin (Human-Endothelin I)] kodierenden DNA-Sonde
Die aus der Aminosäuresequenz, die sich aus dem 7. bis 16. Rest von Endothelin-1, Met-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile, zusammensetzt, erwartete Boten-RNA-Sequenz wurde zum chemischen Synthetisieren einer DNA-Sonde mit der folgenden Sequenz verwendet.
Das 5'-Ende dieser DNA-Sonde wurde mit [ -³²P]ATP durch Verwenden von T4-Polynukleotid-Kinase phosphoryliert. Die phosphorylierte DNA-Sonde wurde zum Überprüfen einer Genom-DNA-Bank verwendet.

Beispiel 2

Isolierung von Endothelin-2-Vorstufe-Genom-DNA und Bestimmung deren Nukleotidsequenz
Escherichia coli Le392 wurde mit der vorstehenden Human-Genom-DNA-Bank (Clontech Laboratories, Inc.) infiziert und plattiert, wodurch man Phagenplaques auftreten ließ. Gemäß dem Bericht von W. Benton und R. Davis [Science 196, 180-182 (1977)] wurde ein Teil der Plaque-DNA auf ein Nylonfilter überführt und mit der mit ³²P markierten DNA-Sonde in Beispiel 1 hybridisiert. Die Hybridisierung wurde in Anwesenheit von 20% Formamid bei 42ºC durchgeführt und anschließend wurde das Filter in 0,2 x SSC, 0,1% SDS bei 20ºC gewaschen. Hybridisierungspositive Klone wurden isoliert. Anschließend wurde eine reife Koderegion von ghET20, einem dieser Klone, mit SacI ausgeschnitten und in das Plasmid pUC118 subkloniert. Durch Transformieren von Escherichia coli XL-1 mit dem sich daraus ergebenden Plasmid wurde die Transformante Escherichia coli XL-1/pghETT20SG1 erhalten. In Fig. 1 wird die vereinfachte Restriktionsenzymkarte eines in diesem Plasmid enthaltenen Human-Genom-DNA-Fragments dargestellt. In der Abbildung stellt der dicke Strich ( ) eine reife Endothelin-2-Kode-Region dar.
Diese reife Peptid-Koderegion und die Nukleotidsequenz in deren Nähe wurden durch das Verfahren von Sanger [Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467 (1977)] bestimmt. Die Nukleotidsequenz und die daraus vermutete Aminosäuresequenz werden in Fig. 2 dargestellt. Die von ( ) umgebene Region stellt den reifen der Aminosäuresequenz von reifem Endothelin-2-Peptid.

Beispiel 3

(1) Synthese von Endothelin-2

Human-Endothelin A-II wurde durch ein herkömmliches Verfahren unter Verwenden von 0,7 g (0,5 mMol) des im Handel erhältlichen Boc-Trp(CHO)-PAM-Harzes (Applied Biosystems) und einem Peptid- Synthetisierungsgerät (Applied Biosystems, Modell 430A) synthetisiert.
Ein Kondensationsverfahren wurde wie folgt ausgeführt:
Eine Boc-Gruppe auf dem Harz wurde mit 50% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid unter Bilden einer freien Aminoendgruppe behandelt, an welche die folgenden Aminosäuren in Anwesenheit von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) gemäß der Aminosäuresequenz von Endothelin-2 vom C-Ende aus der Reihe nach kondensiert wurden:
Boc-Ile, Boc-Asp(OBzl), Boc-Leu, Boc-His(Tos), Boc-Cys(Acm), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Phe, Boc-Glu(OBzl), Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Trp(CHO) und Boc-Ser(Bzl).
Man ließ 890 mg von 2,53 g des auf diese Weise erhaltenen, geschützten Endothelin-2-Harzes mit 1 ml Anisol und 1 ml 1,2- Ethandithiol quellen und behandelte anschließend 60 Minuten mit 10 ml Fluorwasserstoff bei 0ºC, gefolgt vom Entfernen überschüssigen Fluorwasserstoffs unter vermindertem Druck. Nach Waschen mit 5 ml Diethylether wurde der Rückstand mit Trifluoressigsäure extrahiert und das Harz wurde abfiltriert. Nach Entfernen von Trifluoressigsäure durch Destillation unter vermindertem Druck wurde der Extrakt in 50%iger wäßriger Essigsäure gelöst und auf eine Dextrangelsäule (Sephadex G-50, 2 x 90 cm) aufgebracht. Mit dem vorstehenden Lösungsmittel eluierte Peakfraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 180 mg weißes Pulver erhalten wurden. In 4 ml 50%iger wäßriger Essigsäure wurden 31 mg des Pulvers gelöst und 19 mg Quecksilber(II)-trifluoracetat wurden dazugesetzt, gefolgt von 16 Stunden Rühren bei Raumtemperatur. Das sich daraus ergebende Gemisch wurde durch Zusatz von 100 ml n-Butanol, 50 ml Methanol und 50 ml Wasser verdünnt und Schwefelwasserstoffgas wurde durchgeblasen. Anschließend wurde zur Einstellung auf pH 8 5%iges NH&sub4;OH zugesetzt und danach wurde das Gemisch 6 Stunden der Luftoxidation unterzogen. Essigsäure wurde weiter dazugesetzt, um pH 3 zu ergeben, gefolgt von der Lyophilisierung. Das lyophilisierte Gemisch wurde auf eine Sephadex G- 50-Säule (2 x 90 cm), die mit 50%iger Essigsäure gefüllt war, aufgebracht und die Peakfraktionen wurden gesammelt. Die gesammelten Fraktionen wurden mittels HPLC [Säule: YMC (YMC Co. Ltd.), Lösungsmittel: eluiert durch einen linearen Gradienten von 0,1%iger wäßriger Trifluoressigsäure und Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt] unter Erhalten von 1,0 mg des gewünschten Produkts weiter fraktioniert.
Das synthetisierte Endothelin-2 wurde durch HPLC bei 41,4 Minuten eluiert, im Gegensatz zu 40,2 Minuten für Endothelin-1.

Säulenbedingungen

Wakosil 5C18 (Wako Chem. Ind. Ltd., Japan) (4,6 x 250 mm)
Elutionsmittel: A (0,1% wäßrige Trifluoressigsäure)
B (0,1% Trifluoressigsäure enthaltendes Acetonitril)
Lineare Konzentrationsgradientenelution von A bis B (50 Minuten)
Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/Minute
Aminosäure-Analysenwerte: Analysenwerte (die Anzahl im synthetisierten Produkt)
Asx 1,92 (2) Ser 2,31 (3) Glx 1,04 (1)
Cys 1,30 (1) Val 1,16 (1) Ile 1,35 (1)
Leu 1,85 (2) Tyr 0,89 (1) Phe 1,01 (1)
His 1,10 (1) Lys 1,03 (1) Trp (*) (2)
* aufgrund saurer Zersetzung wurden keine Daten erhalten
Die Kombination der Disulfidbindungen in dem reifen Endothelin-2 waren 1-15- und 3-11-Cysteingruppen.

(2) Bestimmung

Die Aktivität des unter dem vorstehenden Punkt (1) erhaltenen Endothelins-2 wurde durch das Verfahren des Referenzbeispiels erhalten.
Die durch die Bestimmung (1) mittels einer Schweinekoronararterie gemessene ED&sub5;&sub0; (mittlere wirksame Dosis: bei 50% der getesteten Tiere wirksame Dosis) war 8 x 10&supmin;¹&sup0; bis 10 x 10&supmin;¹&sup0; Mol/l.

(3) Zubereitung zur Injektion

12 ug in (1) erhaltenes Endothelin-2 wurden in einer Kochsalzlösung gelöst und anschließend durch ein Millipore-Filter filtriert, gefolgt von der Lyophilisierung. Eine Zubereitung zur intravenösen Injektion wurde durch Lösen des lyophilisierten Produkts in einer Kochsalzlösung auf ein Gesamtvolumen von 5 ml zum Gebrauch hergestellt.

Claims

1. Reifes Endothelin-2-Protein mit der Aminosäure-Sequenz

2. Protein, das eine Vorstufe von Endothelin-2 ist und eine Aminosäure-Sequenz der folgenden Formel (2) hat:

3. Für Endothelin-2 codierende DNA-Sequenz, mit der DNA-Sequenz

4. Für ein Endothelin-2-Vorstufen-Protein codierende DNA- Sequenz mit einer durch die folgende Formel (1) oder einen Teil derselben dargestellten Nucleotid-Sequenz:

5. Transformante, die durch eine DNA-Sequenz transformiert wird, die ein für das Protein nach Anspruch 1 codierendes DNA-Segment umfaßt.

6. Verfahren zur Herstellung eines reifen Endothelin-2-Proteins, umfassend (a) das Kultivieren der Transformante nach Anspruch 5, (b) das Anreichern des reifen Endothelin-2 in einem Kulturmedium und (c) das Sammeln desselben.