DE3850690T2

DE3850690T2 - Basic fibroblast growth factor mutein, DNS und deren Verwendung.

Info

Publication number: DE3850690T2
Application number: DE3850690T
Authority: DE
Inventors: Koichi Sakyo-Ku Kyoto 606 Igarashi; Tsutomu Kawanishi Hyogo 666-01 Krokawa; Reiko Nagaokakyo Kyoto 560 Sasada; Masaharu Toyonaka Osaka 560 Senoo
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1987-02-24
Filing date: 1988-02-20
Publication date: 1995-01-05
Anticipated expiration: 2008-02-21
Also published as: FI96316C; IE64299B1; ES2056842T3; IL85473A; NO880719D0; NO880719L; FI880845A; JPH02193A; KR880010130A; NO180305B; JP2526965B2; EP0281822A3; IE880482L; ATE108829T1; CS407691A3; FI880845A0; DE3850690D1; EP0281822B1; FI96316B; NO180305C

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Muteine von basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (nachstehend auch kurz als bFGF bezeichnet), eine rekombinante DNA mit einer Basensequenz, die für ein bFGF-Mutein kodiert, und seine Verwendung.
Als eine basisches Polypeptidhormon mit einem Molekulargewicht von etwa 17000, das hauptsächlich durch die Hypophyse ausgeschieden wird, wurde bFGF zuerst als ein Faktor abgetrennt, der eine starke wachstumsfördernde Wirkung auf Fibroblasten wie etwa BALB/c3T3 ausübt [D. Gospodarowicz; Nature, 249, 123 (1974)]. Danach wurde jedoch bewiesen, daß er eine wachstumsfördernde Wirkung auf fast alle Zellen ausübt, die von einem Mesoblast stammen [D. Gospodarowicz et al., National Cancer Institute Monograph, 48, 109 (1978)]. Insbesondere legt die angiogene Wirkung von bFGF, zusammen mit seiner das Zellwachstum fördernden Wirkung, eine Möglichkeit zu dessen Anwendung als ein therapeutischer Wirkstoff für Traumata und als vorbeugender und therapeutischer Wirkstoff für Thrombosen, Arteriosklerose usw. nahe.
Rinder-bFGF wurde zuerst in den Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Bd. 82, s. 6507 (1985) beschrieben. In Science, 233, 545 (1986) wurden die Aminosäurebestandteile von Rinder-bFGF offenbart, welche aus dem Klon abgeleitet wurden, der durch Klonieren einer cDNA des Human-bFGF hergestellt wurde.
Was Human-bFGF betrifft, wird in Biochemical and Biophysical Research Communications, Bd. 135, S. 541 (1986) berichtet, daß Human-bFGF aus menschlichem Gehirn extrahiert wurde.
In European Molecular Biology Organization (EMBO) Journal, Bd. 5, S. 2523 (1986) und der internationalen PCT-Veröffentlichung Nr. WO/01728 wird gezeigt, daß die Aminosäurebestandteile von Human-bFGF auf der Grundlage des Klons, der durch Klonieren einer cDNA von Human-bFGF mittels Rinder-bFGF als Sonde hergestellt wurde, im einzelnen hergeleitet wurden.
Außerdem wird in FEBS Letters, 213, 189 (1987) die Herstellung von Human-bFGF durch Kultivierung einer Transformanten beschrieben, die durch Klonieren einer cDNA von Human-bFGF erhalten wurde.
Beim Vergleichen von Human-bFGF und Rinder-bFGF besitzt der aus dem Menschen Thr als 112-Position, während der aus dem Rind Ser besitzt; der aus dem Menschen besitzt Ser als 128-Position, während der aus dem Rind Pro besitzt. (In diesem Fall wird das N-terminale Pro als erste Aminosäure festgelegt.)
Die Erfinder vermuteten, daß durch Verändern der Aminosäurensequenz bFGF in der Stabilität, in der Produktivität in einer Zelle und der zellvermehrenden Aktivität je Molekül verbessert würde und außerdem seine unentdeckten Bioaktivitäten verstärkt würden.
Außerdem enthalten biologisch aktive, durch DNA-Rekombinationstechniken mikrobiologisch hergestellte Proteine Cysteinreste, die für ihre Aktivitäten nicht wesentlich sind, welche aber unerwünschte intermolekulare oder intramolekulare Verknüpfungen bilden können.
Im Verlauf einer Herstellung von bFGF durch eine rekombinante DNA-Technik wurden heterogene Konformationen in Escherichiacoli-Extrakt gefunden, der eine hohe bFGF-Konzentration enthielt. Von diesen Konformationen wird angenommen, daß sie aufgrund einer zufälligen intra- oder intermolekularen Disulfidverbrückung erzeugt wurden und der Grund von Schwierigkeiten bei der bFGF-Reinigung und einer Ausbeuteverringerung sind.
Indem sie diese Tatsache zur Kenntnis nahmen, beabsichtigten die Erfinder, mikrobiologisch hergestellte, bioaktive Proteine, wie etwa rekombinante bFGF derart zu verändern, daß, während ihre Aktivitäten nicht gegenteilig beeinflußt werden, ihre Fähigkeiten zum Bilden derartiger intermolekularer Brücken und intramolekularer Verknüpfungen, die zur Bildung ungewünschter tertiärer Strukturen (z. B. Konformationen, welche die Proteinaktivität erniedrigen) führen, verringert oder beseitigt werden.
Die Erfinder bauten veränderte bFGF-Muteine durch DNA-Rekombination und ortsgerichtete Mutagenese auf und führten Untersuchungen zum Verbessern ihrer Stabilität, Erhöhen ihrer intrazellulären Produktivitäten und Aktivitäten durch und beschreiben Änderungen bei ihren Bioaktivitäten. Als Ergebnis fanden die Erfinder ein Mutein, das diese Zwecke erfüllt. Die Erfinder unternahmen weitere Untersuchungen, die sich auf diesen Befund gründen und vervollständigten die vorliegende Erfindung.
Die vorliegende Erfindung umfaßt:
(1) ein Mutein eines basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF), das ein Ersatztyp-Mutein oder eine Kombination eines Ersatztyp-Muteins und eines Auslassungstyp-Muteins ist, wobei
ein Ersatztyp-Mutein ein Mutein ist, in welchem wenigsten einer der vier Cysteinreste in der Sequenz der den Naturtyp bFGF bildenden Aminosäuren durch eine andere Aminosäure als Cystein ersetzt ist und
ein Auslassungstyp-Mutein ein Mutein ist, in welchem dem Aminoende der den bFGF darstellenden Aminosäurensequenz eine bis 41 Aminosäuren fehlen und/oder dem Carboxylende, der den bFGF darstellenden Aminosäurensequenz eine bis 61 Aminosäuren fehlen,
(2) eine rekombinante DNA mit einer Basensequenz, die für das vorgenannte Mutein (1) kodiert
(3) eine Transformante, die einen Vektor beherbergt, der eine rekombinante DNA mit der Basensequenz, die für das vorgenannte Mutein (1) kodiert enthält, und
(4) ein Verfahren zum Herstellen des vorgenannten Muteins (1), das das Kultivieren einer Transformante, die einen Vektor beherbergt, der eine rekombinante DNA mit der Basensequenz, die für das Mutein kodiert, in einem Kulturmedium unter Erzeugen und Anreichern in der Kulturbrühe umfaßt.
Als bFGF kann jeder bFGF aufgeführt werden, solange er aus einem warmblütigen Säuger stammt.
Als typische Beispiele desselben können Human-, Rinder- und Maus-bFGF angeführt werden.
Insbesondere sind Polypeptide, welche die wie folgt dargestellte Aminosäurensequenz einschließen, bevorzugt:
Genauer ist ein durch die Formel
dargestelltes Polypeptid, in dem X Thr oder Ser darstellt, wenn X Thr ist, Y Ser darstellt und wenn X Ser, Y Pro darstellt, bevorzugt.
Genauer ist ein Polypeptid, das die Aminosäurensequenz
enthält, bevorzugt.
Das Mutein der vorliegenden Erfindung besitzt im wesentlichen die Aminosäurensequenz des ursprünglichen Peptids oder Proteins. Als derartige Abänderungen kann ein Hinzufügen von Aminosäuren, ein Weglassen von Aminosäurebestandteilen und ein Ersatz von Aminosäurebestandteilen durch andere Aminosäuren angeführt werden.
Ein derartiges Hinzufügen einer Aminosäure schließt das Hinzufügen wenigstens einer Aminosäure ein.
Ein derartiges Weglassen eines Aminosäurebestandteils schließt das Weglassen wenigstens eines bFGF-Aminosäurebestandteils ein.
Ein derartiger Ersatz eines Aminosäurebestandteils durch andere Aminosäuren schließt den Ersatz wenigstens eines bFGF-Aminosäurebestandteils durch eine andere Aminosäure ein.
Die wenigstens eine Aminosäure in dem Mutein, dem wenigstens eine Aminosäure zu bFGF hinzugefügt wurde, schließt Methionin aus, das aus den zur Peptidexpression und dem für das Signalpeptid verwendeten Startkodon stammt.
Die Zahl der hinzugefügten Aminosäuren ist wenigstens 1, sie kann aber jede sein, solange die bFGF-Eigenschaften nicht verloren werden. Bevorzugte Aminosäuren sollten einige oder alle Aminosäurensequenzen von Proteinen einschließen, die eine Homologie mit bFGF besitzen und die Aktivitäten aufweisen, welche denen von bFGF ähnlich sind.
Als Beispiele derartiger hinzugefügter Aminosäuren können ein Teil oder alle Aminosäuresequenzen von Proteinen wie etwa die sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (aFGF), Interleukin 1-α (IL1-α), Interleukin 1-β IL1-β) und ein Protein angeführt werden, das durch int-2 in Onkogenen kodiert wird.
Derartige aFGF schließen diejenigen, welche aus Menschen stammen und diejenigen, welche aus Rindern stammen, ein. Derartige IL1-α und IL1-β schließen diejenigen ein, welche aus Menschen stammen.
Aminosäurensequenzen derartiger Rinder aFGF schließen:
Aminosäurensequenzen von Human-Il1-α schließen:
ein.
Aminosäurensequenzen von Human-Il1-α schließen:
Aminosäurensequenzen, die an int-2 kodiert werden, schließen:
ein.
Was die Zahl der ausgelassenen bFGF-Aminosäurebestandteile in dem vorliegenden Mutein betrifft, dem wenigstens 1 bFGF-Aminosäurebestandteil fehlt, kann es irgendeine sein, solange irgendeine Eigenschaft von bFGF nicht verloren wird.
Als Beispiele derartiger ausgelassener Aminosäurebestandteile können
das Auslassen von Aminosäuren aus dem Aminoende oder Carboxylende,
die 10 Reste in dem Aminoende von Human-bFGF:
Met-Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser
die 14 Reste in dem Aminoende von Human-bFGF:
Met-Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Phe-Pro
die 41 Reste in dem Aminoende von Human-bFGF:
1 2 3 4 41
Met-Pro-Ala-Leu- . . . -Val
oder die 61 Reste in dem Carboxylende von Human-bFGF:
87 88 146 147
Lys-Cys- . . . -Lys-Ser
angeführt werden.
Die Zahl der wenigstens 1 bFGF-Aminosäurebestandteile vor dem Ersatz in einem Mutein, das wenigstens 1 bFGF-Aminosäurebestandteil enthält, der durch andere Aminosäuren ersetzt ist, kann jede sein, solange irgendeine Eigenschaft von bFGF nicht verloren wird.
Als Beispiele von Aminosäurebestandteilen vor dem Ersatz können Cystein und andere Aminosäuren als Cystein angeführt werden. Cystein ist bevorzugt. Als anderer Aminosäurebestandteil als Cystein vor dem Ersatz können Asparaginsäure, Arginin, Glycin, Serin, Valin und so weiter angeführt werden.
Wenn der Aminosäurebestandteil vor dem Ersatz Cystein ist, sind als substituierte Aminosäuren zum Beispiel neutrale Aminosäuren bevorzugt. Als spezifische Beispiele derartiger neutraler Aminosäuren können Glycin, Valin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Tyrosin, Phenylalanin, Histidin, Tryptophan, Serin, Threonin und Methionin angeführt werden. Insbesondere sind Serin und Threonin bevorzugt.
Wenn der Aminosäurebestandteil vor dem Ersatz irgendein anderer als Cystein ist, werden als andere substituierte Aminosäuren Aminosäuren ausgewählt, die in einer Eigenschaft wie etwa Hydrophilie, Hydrophobie oder elektrischer Ladung von der Aminosäure vor der Substitution verschieden sind.
Wenn der Aminosäurebestandteil vor dem Ersatz Asparaginsäure ist, schließen substituierte Aminosäuren Asparagin, Threonin, Valin, Phenylalanin und Arginin ein, Asparagin und Arginin sind bevorzugt.
Wenn der Aminosäurebestandteil vor dem Ersatz Arginin ist, schließen substituierte Aminosäuren Glutamin, Threonin, Leucin, Phenylalanin und Asparaginsäure ein, Glutamin ist bevorzugt.
Wenn der Aminosäurebestandteil vor dem Ersatz Glycin ist, schließen substituierte Aminosäuren Threonin, Leucin, Phenylalanin, Serin, Glutaminsäure und Arginin ein, Threonin ist bevorzugt.
Wenn der Aminosäurebestandteil vor dem Ersatz Serin ist, schließen substituierte Aminosäuren Methionin, Alanin, Leucin, Cystein, Glutamin, Arginin und Asparaginsäure ein, Methionin ist bevorzugt.
Wenn der Aminosäurebestandteil vor dem Ersatz Valin ist, schließen substituierte Aminosäuren Serin, Leucin, Prolin, Glycin, Lysin und Asparaginsäure ein, Serin ist bevorzugt.
Als Aminosäurebestandteil vor dem Ersatz sind Asparaginsäure, Arginin, Glycin, Serin und Valin bevorzugt.
Als Aminosäurebestandteil sind Asparagin, Glutamin, Arginin, Threonin, Methionin, Serin und Leucin bevorzugt.
Als bevorzugte Ausführungsform bei der Substitution in dem Mutein ist die Substitution von Serin für Cystein (d. h., Cystein wird durch Serin ersetzt) am bevorzugtesten.
Bei dem Ersatz können nicht weniger als 2 Ersetzungen auftreten, und zwei oder drei Ersetzungen sind bevorzugt.
Das Mutein der vorliegenden Erfindung kann eine Kombination von 2 oder 3 der vorgenannten Hinzufügungen, Auslassungen und Ersetzungen sein.
Außer der herkömmlichen DNA-Rekombinationstechnik wird eine ortsgerichtete Mutagenese zum Erzeugen des Muteins der vorliegenden Erfindung eingesetzt. Die Technik ist gut bekannt und wird in Genetic Engineering, Lather, R. F. und Lecog, J. P., Academic Press, S. 31 bis 50 (1983) beschrieben. Die auf ein Oligonucleotid gerichtete Mutagenese wird in Genetic Engineering: Principles and Methods, Smith, M. und Gillam, S., Plenum Press, Bd. 3, S. 1 bis 32 (1981) beschrieben.
Die Herstellung des Strukturgens, welches das Mutein der vorliegenden Erfindung kodiert, wird zum Beispiel durch
(a) Hybridisieren einer einzelsträngigen DNA, die 1 Strang des Strukturgens von bFGF umfaßt, mit einem mutagenen Oligonucleotidstarter,
(b) Verlängern des Starters mittels DNA-Polymerase unter Bilden eines Mutationsheteroduplex und
(c) Vermehren dieses Mutationsheteroduplex durchgeführt.
Die Größe des Nucleotidstarters hängt von Bedingungen ab, die für eine stabile Hybridisierung des Starters an den Genbereich, in den die Mutation eingeführt werden soll, und von Einschränkungen bei den gegenwärtig verfügbaren Verfahren der Oligonucleotidsynthese ab. Die Faktoren, die beim Planen des Oligonucleotids zu berücksichtigen sind, welches zur Verwendung bei der Mutagenese vorgesehen ist, die durch das Oligonucleotid gesteuert wird (z. B. die Gesamtgröße des Nucleotids und die Größe des sich nicht überlappenden Teils an der Mutationsstelle) werden von Smith, M., Gillam, S. in der vorgenannten Literatur beschrieben. Im allgemeinen wird die Gesamtlänge des Oligonucleotids auf eine solche Länge eingestellt, daß die stabile und einmalige Hybridisierung an der Mutationsstelle optimiert wird und die Verlängerungen zwischen der Mutationsstelle und den 5'- und 3'-Enden mit ausreichenden Größen bereitgestellt werden, um eine Mutationsveränderung aufgrund der Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase zu verhindern.
Die zur Mutagenese gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Oligonucleotide enthalten normalerweise etwa 12 bis 24 Basen, vorzugsweise 14 bis 20 Basen, und bevorzugter 14 bis 18 Basen. Diese enthalten normalerweise wenigstens etwa 3 Base 3'-Enden der zu verändernden Kodone.
Zum Zweck des Erhaltens zum Beispiel eines Muteins mit einer hinzugefügten Aminosäure wird ein mutagenes bFGF-Gen durch Synthetisieren des Gens, das die hinzuzufügende Aminosäurensequenz kodiert, und sein Inserieren oder Hinzufügen direkt oder nach Fragmentierung durch Verdauung mit einem Restriktionsenzym in eine geeignete Stelle in dem bFGF-Gen mittels DNA-Ligase hergestellt. Wenn in dem bFGF-Gen keine geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstelle vorhanden ist, können Restriktionsenzym- Erkennungsstellen durch die vorgenannte ortsgerichtete Mutagenese hergestellt werden.
Zum Zweck des Erhaltens zum Beispiel eines Muteins, dem bFGF- Aminosäurebestandteile fehlen, wird ein mutagenes bFGF-Gen auf 3 verschiedenen Wegen hergestellt. In einem der 3 Fälle wird das Aminoende von bFGF entfernt, in einem weiteren Fall wird eine zentrale Region von bFGF entfernt und im verbleibenden Fall wird das Carboxylende entfernt.
Im Fall des Auslassens des Aminoendes wird ein Kodon des Gens, das das Carboxylende der auszulassenden Aminosäurensequenz kodiert, zu dem Met-kodierenden Kodon ATG durch ortsgerichtete Mutagenese verändert und das Kodon besitzt eine geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstelle, die an der Seite dessen 5'- Endes erzeugt wurde, um seine Ligation an den Promotor zu erleichtern.
In dem Fall des Auslassens einer zentralen Region der Aminosäurensequenz wird eine einzelne Restriktionsenzym-Erkennungsstelle durch ortsgerichtete Mutagenese in jeder der Seiten des 5'-Endes und 3'-Endes des Gens hergestellt, welches die auszulassende Sequenz kodiert, und das betreffende Gen wird aus dem Gen durch enzymatische Verdauung abgespalten, und dies wird von der erneuten Ligation der verbleibenden 2 Genf ragmente gefolgt, um das gewünschte Gen, das bFGF kodiert, dem die angegebenen Aminosäuren fehlen, aufzubauen. Es ist selbstverständlich notwendig, aufgrund der Verdauung mit den Restriktionsenzymen den Leserahmen nicht zu verschieben.
Im Fall des Auslassens einer Aminosäurensequenz in der Seite des Carboxylendes wird ein Kodon des Gens, das die Aminosäuren am Aminoende der auszulassenden Sequenz kodiert, durch ortsgerichtete Mutagenese in ein Stopkodon verändert.
Zum Zweck des Erhaltens eines Muteins, bei dem der Aminosäurebestandteil Cystein ausgetauscht ist, wird ein mutagenes bFGF- Gen durch Entfernen zum Beispiel des Cys-Expressionskodons oder Induzieren einer ortsgerichteten Mutagenese in dem Cys-Expressionskodon TGC oder TGT mittels eines synthetischen Nucleotidstarters induziert, der auf diese Weise das Kodon verändert, so daß es eine unterschiedliche Aminosäure kodiert, hergestellt. Ein Starter wird mit einer Sinnkette des FGF-Gens zum Beispiel unter Ändern von Cystein (Position 26) von Human-bFGF in Serin hybridisiert. Als geeigneter Nucleotidstarter kann zum Beispiel 5'-CGTTCTTGCTGTAGAGCCGCT-3' angeführt werden, in welchem das unterstrichene Triplet das veränderte Kodon darstellt.
Als geeigneter Starter beim Ändern von Cystein (Position 70) in Serin kann 5'-AACGATTAGCGCTCACTC-3' angeführt werden, in welchem das unterstrichene Triplet das geänderte Kodon darstellt.
Als geeigneter Starter zum Ändern von Cystein (Position 88) in Serin kann 5'-GTAACAGACTTAGAAGCTAGT-3' angeführt werden, in welchem das unterstrichene Triplet das geänderte Kodon darstellt.
Als geeigneter Starter zum Ändern von Cystein (Position 93) in Serin kann 5'-TCGAAGAAGAAAGACTCATCC-3' angeführt werden, in welchem das unterstrichene Triplet das geänderte Kodon darstellt.
Im Fall von Cys (Position 26) ändert sich Cystein über die T - A-Transposition der ersten Base in Serin; im Fall von Cys (Position 70) ändert sich Cystein über die T → A-Transposition der ersten Base und T → C-Transposition der zweiten Base in Serin; und im Fall von Cys (Position 88, Position 93) ändert sich Cystein über die G → C-Transposition der zweiten Base in Serin.
Es sollte angemerkt werden, daß beim Herstellen des bFGF-Muteinproteins durch ortsgerichtete Mutagenese, 2 oder mehr Veränderungen in der DNA-Sequenz induziert werden können, das heißt, die DNA-Kodons, die den Aminosäuren entsprechen, sind degeneriert.
Zum Zweck des Erhaltens eines Muteins, bei dem ein anderer Aminosäurebestandteil als Cystein durch eine andere Aminosäure ersetzt worden war, wird ein mutagenes bFGF-Gen durch Ändern eines Kodons mittels eines Oligonucleotidstarters auf dieselbe Weise wie bei Cystein hergestellt.
Der Aufbau des Oligonucleotidstarters schwankt selbstverständlich damit, welche Aminosäure geändert werden soll.
Der Starter wird zu einem einzelsträngigen Phagen hybridisiert, der sich aus dem Klonieren eines Einzelstrangs des bFGF-Gens wie etwa M13 ergibt [Yanish-Perror, C. Vieira und J. Messing, Gene, 33, 103-119 (1985); Messing, J., Methods in Enzymology, 101, 20-78 (1983)] fd [R. Herrman et al., Molecular and General Genetics, 177, 231 (1980)] oder Φ·174 [M. Smith und S. Gillam, Genetic Engineering, Plenum Press, Bd. 3, S. 1-32 (1981)]. Es wird angemerkt, daß der Phage entweder die Sinnkette oder Antisinnkette des Gens zu tragen vermag. Wenn der Phage eine Antisinnkette trägt, kann der Starter außer den Unterschieden zu dem entsprechenden Kodon, das ein Triplet bestimmt, das eine weitere Aminosäure kodiert hat, Unterschiede besitzen, die auf eine Kodondegenerierung aus der Sinnkettenregion zurückzuführen ist, welche das Kodon enthält, in welches die Mutation induziert werden soll. Ähnlich kann der Starter, wenn der Phage eine Sinnkette trägt, sowohl nicht zu der Sinnkettenregion komplementär sein, die das Kodon enthält, in welches die Mutation induziert werden soll, als auch entsprechende Unterschiede zu dem Triplet, das sich mit dem auszulassenden Kodon paart. Die zur Hybridisierung verwendeten Bedingungen werden von M. Smith und S. Gillam in der vorgenannten Literatur beschrieben. Die Temperatur liegt normalerweise zwischen etwa 0ºC und 70ºC, üblicher zwischen etwa 10ºC und 50 ºC. Nach der Hybridisierung wird der Starter auf der Phagen-DNA durch Reaktion mit Escherichia-coii- DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, reverser Transkriptase oder einer anderen geeigneten DNA-Polymerase verlängert. Die sich daraus ergebende dsDNA wird in eine geschlossene ringförmige dsDNA durch Behandlung mit DNA-Ligase wie etwa T4-DNA-Ligase überführt. Die einzelsträngige Regionen enthaltenden DNA-Moleküle können durch Behandlung mit S1-Endonuklease zersetzt werden.
Die sich daraus ergebende Mutationsheteroduplex wird zum Transformieren eines infizierbaren Wirtsorganismus oder Zelle verwendet. Bei der Vermehrung des Heteroduplex durch den Wirt werden aus beiden Ketten Vorläufer hergestellt. Auf die Vermehrung folgend wird das Mutantengen aus einem Vorläufer der Mutantenkette isoliert und in einen geeigneten Vektor inseriert, welcher anschließend zum Transformieren eines geeigneten Wirtsorganismus oder Zelle verwendet wird.
Die Phagen-DNA, die das Mutationsgen trägt, wird anschließend isoliert und in ein Plasmid eingebaut.
Als Beispiele von Plasmiden, in welche die DNA eingebaut wird, können Plasmide angeführt werden, die von Escherichia coli wie etwa pBR322 [Gene, 2, 95 (1977)], pBR325 [Gene, 4, 121 (1978)], pUC12 [Gene, 19, 259 (1982)] und pUC13 [Gene, 19, 259 (1982)] stammen, und Plasmide, die von Bacillus subtilis wie etwa pUB110 [Biochemical and Biophysical Research Communication, 112, 678 (1983)] stammen, aber jedes andere Plasmid kann ebenfalls verwendet werden, solange es in dem Wirt vermehrt und festgehalten wird.
Als Verfahren zum Einbauen in ein Plasmid kann zum Beispiel das in Molecular Cloning, T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, S. 239 (1982) usw., beschriebene Verfahren angeführt werden.
Das klonierte Gen wird stromabwärts von einem Promotor in einem geeigneten Vehikel (Vektor) zur Expression unter Erhalten eines Expressionsvektors ligiert.
Die Vektoren schließen die vorgenannten Plasmide, die von Escherichia coli stammen (z. B. pBR322, pBR325, pUc12 und pUc13), Plasmide, die von Bacillus subtilis stammen (z. B. pUB110, pTP5 und pc194), Plasmide, die von Hefe stammen (z. B. pSH19 und pSH15), Bakteriophagen wie etwa λ-Phage und tierische Viren wie etwa Retroviren und Impfviren ein.
Das Gen kann ATG als Translationsstartkodon an seinem 5'-Ende besitzen und kann auch TAA, TGA oder TAG als Translationsendkodon an seinem 3'-Ende besitzen. Zum Zweck der Expression des Gens wird ein Promotor stromaufwärts davon ligiert. Jeder Promotor kann für die vorliegende Erfindung verwendet werden, solange er dem zur Genexpression verwendeten Wirt in geeigneter Weise entspricht.
Wenn der Wirt für die Transformation ein Bakterium der Gattung Escherichia ist, sind ein trp-Promotor, lac-Promotor, rec A- Promotor, λPL-Promotor, Ipp-Promotor usw. geeignet; wenn der Wirt ein Bakterium der Gattung Bacillus ist, sind ein SP01- Promotor, SP02-Promotor, penP-Promotor usw. geeignet; wenn der Wirt eine Hefe ist, sind ein PH05-Promotor, PGK-Promotor, GAP- Promotor, ADH-Promotor usw. geeignet. Insbesondere ist es bevorzugt, daß der Wirt ein Bakterium der Gattung Escherichia ist und der Promotor ein trp-Promotor oder λPL-Promotor ist.
Wenn der Wirt eine tierische Zelle ist, schließen geeignete Promotoren Promotoren, die von SV40 stammen und Retrovirenpromotoren ein; insbesondere sind von SV40 stammende Promotoren bevorzugt.
Unter Verwendung des auf diese Weise aufgebauten Vektors, der eine rekombinante DNA mit einer Mutein-kodierenden Basensequenz enthält, wird eine Transformante hergestellt.
Als Wirte können zum Beispiel Bakterien der Gattung Escherichia, Bakterien der Gattung Bacillus, Hefen, tierische Zellen usw. angeführt werden.
Als Beispiele der Bakterien der Gattung Escherichia können Escherichia coli K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] und MM294 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 4174 (1976)] angeführt werden.
Als Beispiele der Bakterien der Gattung Bacillus kann Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)] und 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] angeführt werden.
Als Beispiele der Hefen kann Saccharoinyces cerevisiae AH22R&supmin;, NA87-11A und DKD-5D angeführt werden.
Als Beispiele tierischer Zellen können Affenzellen COS-7, Vero, Eierstockzellen des chinesischen Hamsters CHO, Mäuse-L-Zellen und menschliche FL-Zellen angeführt werden.
Die Transformation der vorgenannten Bakterien der Gattung Escherichia wird zum Beispiel gemäß den in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982) usw. beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Transformation von Bakterien der Gattung Bacillus wird gemäß zum Beispiel den in Molecular and General Genetics, 168, 111 (1979) usw. beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Transformation von Hefen wird zum Beispiel gemäß dem in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Transformation tierischer Zellen wird zum Beispiel gemäß dem in Virology, 52, 456 (1973) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Eine Transformante, die einen Vektor beherbergt, welcher eine rekombinante DNA mit einer Mutein-kodierenden Basensequenz besitzt, wird auf diese Weise erhalten.
Die Transformante wird in einem Medium kultiviert, um ihr zu erlauben, Mutein zu produzieren.
Beim Kultivieren einer Transformanten, deren Wirt ein Bakterium der Gattung Escherichia oder Bacillus ist, ist ein flüssiges Medium zur Kultivierung geeignet, in dem Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Mineralien und andere für das Wachstum der Transformanten wesentliche Substanzen enthalten sind. Als Kohlenstoffquellen können zum Beispiel Glucose, Dextrin, lösliche Stärke, Sucrose usw. angeführt werden, als Stickstoffquellen können zum Beispiel anorganische oder organische Substanzen, wie etwa Ammoniumsalze, Nitrate, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Sojabohnenkuchen und Kartoffelextrakt angeführt werden, als Mineralien können zum Beispiel Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und Magnesiumchlorid angeführt werden. Hefeextrakte, Vitamine, Wachstumsbeschleuniger usw. können ebenfalls zugesetzt werden.
Es ist erwünscht, daß der pH des Mediums etwa 6 bis 8 beträgt.
Als Beispiel eines geeigneten Mediums für die Kultivierung von Bakterien der Gattung Escherichia kann das M9-Medium angeführt werden, das Glucose und Casaminosäure enthält [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)]. Chemikalien wie etwa 3β- Indolylacrylsäure können hinzugesetzt werden, wenn es notwendig ist, die Wirksamkeit des Promotors zu erhöhen.
Wenn der Wirt ein Bakterium der Gattung Escherichia ist, wird die Kultivierung normalerweise bei etwa 15 bis 43ºC während etwa 3 bis 24 Stunden durchgeführt und nötigenfalls werden Belüftung und/oder Rühren hinzugesetzt.
Wenn der Wirt ein Bakterium der Gattung Bacillus ist, wird die Kultivierung normalerweise bei etwa 30 bis 40ºC während etwa 6 bis 24 Stunden durchgeführt und nötigenfalls werden Belüftung und/oder Rühren hinzugesetzt.
Als Medium für die Kultivierung von Transformanten, deren Wirt eine Hefe ist, kann zum Beispiel Burkholders Minimalmedium angeführt werden [Bostian, K. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)]. Es ist bevorzugt, daß der pH des Mediums auf etwa 5 bis 8 eingestellt ist. Die Kultivierung wird normalerweise bei etwa 20 bis 35ºC während etwa 24 bis 72 Stunden durchgeführt und nötigenfalls werden Belüftung und/oder Rühren hinzugesetzt.
Als Medium für die Kultivierung von Transformanten, deren Wirt eine tierische Zelle ist, können zum Beispiel MEM-Medien, die etwa 5 bis 20% fetales Rinderserum enthalten [Science, 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI1640-Medium [Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)] und 199-Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] angeführt werden. Es ist bevorzugt, daß der pH etwa 6 bis 8 beträgt. Die Kultivierung wird normalerweise bei etwa 30 bis 40ºC während etwa 15 bis 60 Stunden durchgeführt und nötigenfalls werden Belüftung und/oder Rühren hinzugesetzt.
Die Trennung und Reinigung des Muteins aus der vorgenannten Kultur kann zum Beispiel durch die folgenden Verfahren durchgeführt werden.
Beim Extrahieren des Muteins aus kultivierten Bakterien, Pilz- oder tierischen Zellen kann geeignet zum Beispiel das Verfahren eingesetzt werden, bei welchem Bakterien, Pilz- oder tierische Zellen nach der Kultivierung durch ein bekanntes Verfahren gesammelt und in einer Pufferlösung suspendiert werden, die ein Proteindenaturierungsmittel wie etwa Guanidinhydrochlorid enthält, um das gewünschte Protein aus den Zellen zu eluieren, und das Verfahren, bei welchem Bakterien, Pilz- oder tierische Zellen nach der Zerstörung durch eine French-Presse, Ultraschall, Lysozymbehandlung und/oder Gefrieren-Auftauen der Zentrifugation unter Erhalten des Muteins unterzogen werden. Insbesondere wird das Verfahren mittels einer Kombination aus Lysozymbehandlung und Ultraschall bevorzugt.
Die Reinigung des Muteins aus dem auf diese Weise erhaltenen Überstand kann durch wohlbekannte Verfahren der Trennung und Reinigung in geeigneter Kombination durchgeführt werden. Als Beispiele derartiger wohlbekannter Verfahren der Trennung und Reinigung können Verfahren angeführt werden, die auf der Löslichkeit beruhen, wie etwa Aussalzen und Lösungsmittelfällung, Verfahren, die hauptsächlich auf dem Unterschied im Molekulargewicht beruhen, wie etwa Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Verfahren, die auf dem Unterschied in der elektrischen Ladung beruhen, wie etwa Ionenaustauschchromatographie, Verfahren, die auf einer spezifischen Affinität beruhen, wie etwa Affinitätschromatographie, Verfahren, die auf dem Unterschied in der Hydrophobie beruhen, wie etwa Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, und Verfahren, die auf dem Unterschied im isoelektrischen Punkt beruhen, wie etwa isoelektrische Elektrophorese.
Genauer können durch Unterziehen des vorgenannten Überstands der Ionenaustauschchromatographie mittels DEAE-Cellulose usw. als Träger Verunreinigungen wie etwa Nukleinsäuren und saures Protein entfernt werden. Zum Beispiel ist es wirkungsvoll, den Überstand durch eine DEAE-Cellulosesäule hindurchgehen zu lassen, die mit einer nahezu neutralen Pufferlösung wie etwa Tris äquilibriert wurde, und die nicht auf der Säule adsorbierte Fraktion zu sammeln. Durch weiteres Unterziehen der gesammelten Fraktion der Ionenaustauschchromatographie unter Verwenden von CM-Cellulose oder dergleichen als Träger ist es möglich, das Mutein an dem Träger zu adsorbieren und das Mutein mit einer Salzlösung zu eluieren. Diese Eluate können nach der Dialyse lyophilisiert werden.
Die Affinitätschromatographie mittels Heparin-Sepharose kann geeigneterweise zum Reinigen von bFGF-Mutein in Extrakten angewandt werden. Auf diese Weise kann zum Beispiel das bFGF-Muteinprotein durch Aufbringen des vorstehenden Eluats auf eine Heparin-Sepharose-Säule, die mit einem fast neutralen Puffer (z. B. Tris oder Phosphatpuffer) äquilibriert wurde, gründliches Waschen der Säule und Ausführen einer Elution durch einen linearen Gradienten, der mit NaCl oder dergleichen aufgebaut wurde, gereinigt werden.
Heparinsäulen (z. B. Shodex AF-pak HR-894, von Showa Denko, Japan, erhältlich), die für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie entwickelt wurden, sind besonders wirkungsvoll.
In diesem Fall kann das bFGF-Mutein als homogenes Produkt auf dieselbe Weise wie im Fall der vorstehend angeführten Heparin- Sepharose-Säule gewonnen werden und zwar durch Aufbringen der Probe auf eine Heparinsäule mit einem etwa neutralen Puffer, gründliches Waschen der Säule und Ausführen der Elution an einem linearen Gradienten, der zum Beispiel mit NaCl aufgebaut wurde.
Das auf diese Weise erhaltene Produkt kann durch Dialyse und Lyophilisierung in die Form eines trockenen Pulvers gebracht werden. Es ist erwünscht, das Produkt mit einem zugesetzten Träger (z. B. Serumalbumin) zu konservieren, da die Adsorption des Produkts an der Gefäßwand dadurch verhindert werden kann.
Weiter ist es bevorzugt, eine geringe Menge eines Reduktionsmittels im Verlauf der Reinigung oder Konservierung zuzusetzen, um eine Oxidation des Produkts zu verhindern.
Als Beispiele des Reduktionsmittels werden β-Mercaptoethanol, Dithiothreit, Glutathion und so weiter angeführt.
Auf diesem Weg kann im wesentlichen reines bFGF-Muteinprotein erhalten werden. Das im wesentlichen reine bFGF-Muteinprotein gemäß dieser Erfindung schließt Produkte ein, deren bFGF-Muteinproteingehalt nicht weniger als 95% (Gew./Gew.) und bevorzugter Produkte, deren bFGF-Muteingehalt nicht weniger als 98% (Gew./-Gew.) beträgt.
Das auf diese Weise erhaltene Mutein besitzt eine das Fibroblastenwachstum fördernde Aktivität, eine das Wachstum kapillarer Endotheliumszellen stimulierende Aktivität und eine angiogene Aktivität, besitzt eine hohe Stabilität und ist von geringer Toxizität. Es kann daher als ein Heilungsbeschleuniger für Verbrennungen, Wunden, postoperative Gewebe usw. oder als therapeutischer Wirkstoff, der auf seiner angiogenen Wirkung bei Thrombose, Arteriosklerose usw. beruht, verwendet werden. Er kann auch als Reagenz zur Beschleunigung der Zellkultivierung verwendet werden.
Insbesondere ist ein Mutein, in welchem wenigstens ein Cysteinbestandteil durch Serin ersetzt ist, bevorzugt, da das Mutein bemerkenswert stabil ist.
Wenn das Mutein gemäß der vorliegenden Erfindung als Pharmazeutikum verwendet wird, kann es parenteral oder oral sicher an warmblütige Tiere (z. B. Menschen, Mäuse, Ratten, Hamster, Kaninchen, Hunde und Katzen) direkt in Pulverform oder nach Zubereiten als pharmazeutische Zusammensetzung (z. B. Injektion, Tabletten, Kapseln, Lösungen und Salben) mit anderen pharmazeutisch erlaubten Trägern, Arzneimittelhilfsstoffen oder Verdünnungsmitteln verabreicht werden.
Die Herstellung einer Injektion wird gemäß einem Routineverfahren unter Verwenden zum Beispiel einer physiologischen Kochsalzlösung oder einer wäßrigen, glukosehaltigen Lösung und anderen Hilfsmitteln durchgeführt. Pharmazeutische Zusammensetzungen, wie etwa Tabletten und Kapseln können auch gemäß Routineverfahren hergestellt werden.
Das Mutein gemäß der vorliegenden Erfindung wird, wenn es als eines der vorgenannten Pharmazeutika verwendet wird, zum Beispiel den vorgenannten warmblütigen Tieren in einer geeigneten Menge verabreicht, die im Bereich von etwa 1 ng/kg bis 100 kg/kg am Tag unter Kenntnisnahme des Verabreichungswegs, der Symptome usw. verabreicht.
Wenn das Mutein ,gemäß der vorliegenden Erfindung als Reagenz zum Beschleunigen der Zellkultivierung verwendet wird, wird es dem Medium vorzugsweise so zugesetzt, daß es darin in einer Menge von etwa 0,01 bis 10 ug je 1 Liter Medium, bevorzugter etwa 0,1 bis 10 ug je 1 Liter Medium, enthalten ist.
Die Abkürzungen für in der vorliegenden Beschreibung und den Zeichnungen verwendeten Basen, Aminosäuren usw. gründen sich auf die von der IUPAC-IUB-Kommission für Biochemische Nomenklatur angegeben oder diejenigen, welche gebräuchlicherweise auf entsprechenden Gebieten verwendet werden, und Beispiele davon werden nachstehend angeführt. Wenn die Möglichkeit der Anwesenheit eines optischen Isomeren in Aminosäuren besteht, ist das Isomer ein L-Körper, solange nicht anders angegeben.
DNA : Deoxyribonukleinsäure
cDNA : komplementäre Deoxyribonukleinsäure
A : Adenin
T : Thymin
G : Guanin
C : Cytosin
RNA : Ribonukleinsäure
dATP : Deoxyadenosintriphosphat
dTTP : Deoxythymidintriphosphat
dGTP : Deoxyguanosintriphosphat
dCTP : Deoxycytidintriphosphat
ATP : Adenosintriphosphat
Tdr : Thymidin
EDTA : Ethylendiamintetraessigsäure
SDS : Natriumdodecylsulfat
Gly : Glycin
Ala : Alanin
Val : Valin
Leu : Leucin
Ile : Isoleucin
Ser : Serin
Thr : Threonin
Cys : Cystein
Met : Methionin
Glu : Glutaminsäure
Asp : Asparaginsäure
Lys : Lysin
Arg : Arginin
His : Histidin
Phe : Phenylalanin
Tyr : Tyrosin
Trp : Tryptophan
Pro : Prolin
Asn : Asparagin
Gln : Glutamin
In der vorliegenden Beschreibung und den Zeichnungen wird beim Numerieren der Aminosäurebestandteile des Human-bFGF das Met, das vom Translationsstartkodon stammt, als erste Aminosäure festgelegt, solange nicht anders angegeben.
Die folgenden Transformanten, die in den Referenzbeispielen oder nachstehend angeführten Beispielen hergestellt wurden, wurden beim Fermentationsinstitut, Osaka (IFO), Japan, und dem Fermentationsforschungsinstitut, Amt für Industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für Internationalen Handel und Industrie (FRI), Japan, unter den in Tabelle 1 dargestellten Zugangsnummern an den Hinterlegungsdaten hinterlegt (die Hinterlegungsdaten sind in Klammern angegeben). Was die Hinterlegungsnummer des FRI betrifft, bezeichnet die FERM BP-Nummer die Hinterlegungsnummer unter dem Budapester Vertrag und im Fall, daß sowohl die FERM P-Nummer und die FERM BP-Nummer beschrieben werden, zeigt dies, daß die Hinterlegung unter der FERM P-Nummer in eine Hinterlegung unter dem Budapester Vertrag überführt worden ist und die Transformanten unter der FERM BP-Nummer beim FRI aufbewahrt worden sind. Tabelle 1 Transformanten IFO FRI E. coli Referenzbeispiel Beispiel Transformanten IFO FRI E. coli Beispiel
Die folgenden Hybridome, die in dem nachstehend angeführten Beispiel 35(3)(d) hergestellt wurden, wurden seit dem 17. August 1987 unter den nachstehend angegebenen Zugangsnummern beim IFO hinterlegt.
Maus HbF 52 Zelle: IFO 50143
Maus HbF 78 Zelle: IFO 50144

Kurze Erläuterung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Basensequenz, die Human-bFGF kodiert und die daraus abgeleitete Aminosäurensequenz.
Fig. 2 zeigt die als Starter verwendeten synthetischen Oligomeren, um Cys-kodierende Kodons in Ser-kodierende Kodons umzuwandeln.
Fig. 3 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein CS1 kodiert, welches durch das in Beispiel 2 erhaltene Plasmid pTB739 getragen wird und die dadurch kodierte Aminosäurensequenz des Human-bFGF-Muteins CS1. Die mutierten Basen sind unterstrichen und die die überführte Aminosäure enthaltende Region ist von einem Quadrat umgeben.
Fig. 4 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein CS2 kodiert, welches durch das in Beispiel 3 erhaltene Plasmid pTB742 getragen wird und die dadurch kodierte Aminosäurensequenz des Human-bFGF-Muteins CS2. Die mutierten Basen sind unterstrichen und die die überführte Aminosäure enthaltende Region ist von einem Quadrat umgeben.
Fig. 5 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein CS3 kodiert, welches durch das in Beispiel 4 erhaltene Plasmid pTB743 getragen wird und die dadurch kodierte Aminosäurensequenz des Human-bFGF-Muteins CS3. Die mutierten Basen sind unterstrichen und die die überführte Aminosäure enthaltende Region ist von einem Quadrat umgeben.
Fig. 6 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein CS4 kodiert, welches durch das in Beispiel 5 erhaltene Plasmid pTB744 getragen wird und die dadurch kodierte Aminosäurensequenz des Human-bFGF-Muteins CS4. Die mutierten Basen sind unterstrichen und die die überführte Aminosäure enthaltende Region ist von einem Quadrat umgeben.
Fig. 7 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB739 in Beispiel 2 (1).
Fig. 8 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB742 in Beispiel 3 (1).
Fig. 9 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB743 in Beispiel 4 (1).
Fig. 10 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB744 in Beispiel 5 (1).
Fig. 11 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein CS23 kodiert, das durch das in Beispiel 7 erhaltene Plasmid pTB762 getragen wird, und die Aminosäurensequenz des Human-bFGF-Muteins CS23, das dadurch kodiert wird. Die mutierten Basen sind unterstrichen und die eine der überführten Aminosäuren enthaltenden Regionen sind von Quadraten umgeben.
Fig. 12 zeigt die Aufbaukarte des Plasmids pTB762 in Beispiel 7 (1).
Fig. 13 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein CS123 kodiert, das durch das in Beispiel 9 erhaltene Plasmid pTB764 getragen wird, und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Human-bFGF-Muteins CS123. Die mutierten Basen sind unterstrichen und die irgendwelche der überführten Aminosäuren enthaltenden Regionen sind von Quadraten umgeben.
Fig. 14 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB764 in Beispiel 9 (1).
Fig. 15 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein CS1234 kodiert, das durch das in Beispiel 11 erhaltene Plasmid pTB765 getragen wird, und die dadurch kodierte Aminosäurensequenz des Human-bFGF-Muteins CS1234. Die mutierten Basen sind unterstrichen und die irgendwelche der überführten Aminosäuren enthaltenden Regionen sind von Quadraten umgeben.
Fig. 16 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB765 in Beispiel 11 (1).
Fig. 17 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein CS12 kodiert, das durch das in Beispiel 15 erhaltene Plasmid pTB776 getragen wird, und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Human-bFGF-Muteins CS12. Die mutierten Basen sind unterstrichen und die eine der überführten Aminosäuren enthaltenden Regionen sind von Quadraten umgeben.
Fig. 18 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB776 in Beispiel 15 (1).
Fig. 19 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein CS24 kodiert, das durch das in Beispiel 16 erhaltene Plasmid pTB778 getragen wird, und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Human-bFGF-Muteins CS24. Die mutierten Basen sind unterstrichen und die eine der überführten Aminosäuren enthaltenden Regionen sind von Quadraten umgeben.
Fig. 20 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB778 in Beispiel 16 (1).
Fig. 21 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein CS13 kodiert, das durch das in Beispiel 17 erhaltene Plasmid pTB779 getragen wird, und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Human-bFGF-Muteins CS13. Die mutierten Basen sind unterstrichen und die eine der überführten Aminosäuren enthaltenden Regionen sind von Quadraten umgeben.
Fig. 22 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB779 in Beispiel 17 (1).
Fig. 23 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein CS14 kodiert, das durch das in Beispiel 18 erhaltene Plasmid pTB763 getragen wird, und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Human-bFGF-Muteins CS14. Die mutierten Basen sind unterstrichen und die eine der überführten Aminosäuren enthaltenden Regionen sind von Quadraten umgeben.
Fig. 24 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB763 in Beispiel 18 (1).
Fig. 25 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein CS34 kodiert, das durch das in Beispiel 19 erhaltene Plasmid pTB777 getragen wird, und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Human-bFGF-Muteins CS34. Die mutierten Basen sind unterstrichen und die eine der überführten Aminosäuren enthaltenden Regionen sind von Quadraten umgeben.
Fig. 26 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB777 in Beispiel 19 (1).
Fig. 27 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein CS234 kodiert, das durch das in Beispiel 20 erhaltene Plasmid pTB782 getragen wird, und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Human-bFGF-Muteins CS234. Die mutierten Basen sind unterstrichen und die eine der überführten Aminosäuren enthaltenden Regionen sind von Quadraten umgeben.
Fig. 28 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB782 in Beispiel 16 (1).
Fig. 29 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein CS124 kodiert, das durch das in Beispiel 21 erhaltene Plasmid pTB780 getragen wird, und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Human-bFGF-Muteins CS124. Die mutierten Basen sind unterstrichen und die eine der überführten Aminosäuren enthaltenden Regionen sind von Quadraten umgeben.
Fig. 30 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB780 in Beispiel 21 (1).
Fig. 31 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein CS134 kodiert, das durch das in Beispiel 22 erhaltene Plasmid pTB781 getragen wird, und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Human-bFGF-Muteins CS134. Die mutierten Basen sind unterstrichen und die eine der überführten Aminosäuren enthaltenden Regionen sind von Quadraten umgeben.
Fig. 32 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB781 in Beispiel 22 (1).
Die Fig. 33 bis 35 zeigen die Elutionsmuster der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie der in Beispiel 24 erhaltenen Muteine.
Fig. 36 zeigt die Elutionsmuster der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie der in Beispiel 25 erhaltenen Muteinoxide.
Fig. 37 zeigt die Elutionsmuster der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie der in Beispiel 26 erhaltenen Muteinreduktionsprodukte.
Fig. 38 zeigt die als Starter zum Herstellen Mutein-kodierender DNA verwendeten synthetischen Oligomeren.
Fig. 39 zeigt die Basensequenz des Phagen M13-PN10, der in Beispiel 27 erhalten wurde, und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Muteins TM910, wobei das Mutein TM910 in Beispiel 32 erhalten wurde.
Fig. 40 zeigt die Basensequenz des in Beispiel 27 erhaltenen Phagen M13-PN14 und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Muteins N14, wobei das Mutein N14 in Beispiel 34 erhalten wurde.
Fig. 41 zeigt die Basensequenz des in Beispiel 27 erhaltenen Phagen M13-PC86 und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Muteins C86, wobei das Mutein C86 in Beispiel 35 erhalten wurde.
Fig. 42 zeigt die Basensequenz des in Beispiel 27 erhaltenen Phagen M13-PDN42 und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Muteins DN42, wobei das Mutein DN42 in Beispiel 36 erhalten wurde.
Fig. 43 zeigt die Basensequenz des in Beispiel 27 erhaltenen Phagen M13-PRQ45 und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Muteins RQ45, wobei das Mutein RQ45 in Beispiel 37 erhalten wurde.
Fig. 44 zeigt die Basensequenz des in Beispiel 28 erhaltenen Phagen M13-PNR42 und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Muteins NR42, wobei das Mutein NR42 in Beispiel 38 erhalten wurde.
Fig. 45 zeigt die Stabilität der in Beispiel 29 erhaltenen Human-bFGF-Muteine CS2, CS3 und CS23.
Fig. 46 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB854 in Beispiel 32.
Fig. 47 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB852 in Beispiel 33.
Fig. 48 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein N10 kodiert, das durch das in Beispiel 33 erhaltene Plasmid pTB852 getragen wird, und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Muteins N10, wobei das Mutein N10 in Beispiel 33 erhalten wurde. Die mutierten Basen sind unterstrichen.
Fig. 49 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB795 in Beispiel 34.
Fig. 50 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB796 in Beispiel 35.
Fig. 51 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB797 in Beispiel 36.
Fig. 52 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB799 in Beispiel 37.
Fig. 53 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB798 in Beispiel 38.
Fig. 54 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein FINT kodiert, das durch das in Beispiel 39 erhaltene Plasmid pTB853 getragen wird, und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Muteins FINT, wobei das Mutein FINT in Beispiel 39 erhalten wurde. Die mutierten Basen sind unterstrichen.
Fig. 55 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB853 in Beispiel 39.
Fig. 56 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB855 in Beispiel 40.
Fig. 57 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein N41 kodiert, das von dem in Beispiel 40 erhaltenen Plasmid pTB855 getragen wird, und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Human-bFGF-Muteins N41, wobei das Mutein N41 in Beispiel 40 erhalten wurde. Die mutierten Basen sind unterstrichen.
Fig. 58 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB856 in Beispiel 41.
Fig. 59 zeigt die Basensequenz, die das Human-bFGF-Mutein C129 kodiert, das durch das in Beispiel 41 erhaltene Plasmid pTB856 getragen wird, und die Aminosäurensequenz des dadurch kodierten Muteins C129, wobei das Mutein C129 in Beispiel 41 erhalten wurde. Die mutierten Basen sind unterstrichen.
Fig. 60 zeigt das Aufbauschema des Plasmids pTB831 in Beispiel 42.

Referenzbeispiel 1

(Aufbau des Plasmids, welches das Human-bFGF-kodierende Gen enthält)

(1) Isolierung des cDNA-enthaltenden Plasmids

Eine cDNA, deren Wirt Escherichia coli·1776 ist, und die durch Einbauen einer primären Kulturzellen-mRNA, die aus menschlicher Vorhaut stammte, in einen pCD-Vektor hergestellt wurde [siehe Okayama et al., Molecular Cell Biology, 3, 280 (1983)], wurde von Dr. Okayama am National Institute of Child Health and Human Development, Bethesda, USA, zur Verfügung gestellt. Aus dieser DNA wurde eine Plasmid-DNA durch das Alkaliverfahren [Birnboim, H. C. und Doly, J., Nucleic Acids Research, 1, 1513 (1979)] extrahiert, und diese DNA wurde mit Escherichia coli DH1 infiziert, um etwa 2·10&sup6; Klone einer cDNA-Bank zu erzeugen, deren Wirt Escherichia coli DH1 ist.
Diese cDNA-Bank mittels Escherichia coli DH1 wurde auf 10 Nitrocellulosefilter (Millipore Inc., USA, HATF-Filter) in einer Menge von etwa 5·10&sup4; Klone/Filter gestrichen, wonach mittels der vorstehenden 10 Filter als Originalfilter insgesamt 20 Filterkopien in Paaren hergestellt wurden. Die Escherichia coli- Zellen auf den Filterkopien wurden mit einer 0,5N NaOH-Lösung lysiert und die freigesetzte, denaturierte Plasmid-DNA wurde auf den Filtern immobilisiert [Grunstein, M. und Hogness, D. S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961 (1975)].
Getrennt davon wurden auf der Grundlage der Aminosäuren Nr. 13 bis 20 (Pro-Pro-Gly-His-Phe-Lys-Asp-Pro) und Aminosäuren Nr. 89 bis 96 (Thr-Asp-Glu-Cys-Phe-Phe-Phe-Glu) auf der Aminosäurensequenz des von F. Esch et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6507 (1985)] berichteten basischen Rinderfibroblasten-Wachstumsfaktors die diesen Aminosäurensequenzen entsprechenden Basensequenzen chemisch synthetisiert. (Für einige Kodons wurde der dritte Buchstabe willkürlich festgelegt. 5'GG A/G TC T/C TT A/G AA A/G TGGCCAGGAGG und 5'TC A/G AA A/G AA A/G AA A/G CA T/C TCGTCGGT. Die unterstrichenen Buchstaben stellen die festgelegten Basen dar.) Für jedes dieser Oligonucleotide wurde die Reaktion 1 Stunde bei 37ºC in 50 ul einer Reaktionsflüssigkeit mittels T4-Polynukleotidkinase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) [Oligonucleotid 0,1 ug, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Mercaptoethanol, 50 uCi γ-³²P ATP (> 5000 Ci/mMol), 3 Einheiten T4-Polynukleotidkinase] durchgeführt, um das 5'-Ende der Oligonucleotide mit ³²P zu markieren.
Unter Verwendung der 2 in dem vorstehenden Verfahren markierten Oligonucleotide als Sonden wurden diese unabhängig mit einem Replicafilter verbunden, an welches die DNA immobilisiert worden war. Die Verbindungsreaktion wurde 16 Stunden bei 35ºC in einer Lösung von 5·SSPE [180 mM NaCl, 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 1 mM EDTA (pH 7,4)], 5·Denhardts-Lösung, 0,1% SDS und 100 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA durchgeführt, die 10 uCi der Sonde enthielt. Nach der Reaktion wurde das Filter mit einer 0,1%igen SDS-Lösung von 5·SSC [0,15M NaCl, 0,015M Natriumcitrat] 3 Mal 30 Minuten bei Raumtemperatur und anschließend 2 Mal 30 Minuten bei 45ºC gewaschen [T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 309 (1982)].
Radioautogramme wurden von den gewaschenen Filtern aufgenommen und Stämme, die auf beide Sonden ansprechen, wurden durch Überlappen der 2 Radioautogramme aus jedem Paar Replicafilter gesucht. Durch dieses Verfahren wurde 1 Stamm, der auf beide Sonden ansprach [Escherichia coli K12 DH1/pTB627 (IFO 14494, FERM BP-1280)], aus 5·10&sup5; Klonen erhalten.
(2) Aus dem in (1) vorstehend erhaltenen Stamm [Escherichia coli K12 DHI/pTB627 (IFO 14494, FERM BP-1280)] wurde eine Plasmid-DNA (pTB627) durch das Alkaliverfahren [Nucleic Acids Research, 1, 1513 (1979)] extrahiert und gereinigt.

Referenzbeispiel 2

(Expression eines Gens, das Human-bFGF kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB669 zur Expression von Human-bFGF

Das in Referenzbeispiel 1 (2) vorstehend erhaltene, eine HumanbFGF-cDNA enthaltende Plasmid pTB627 wurde mittels der Restriktionsenzyme Aval und Ball gespalten, um ein DNA-Fragment mit 0,44 kb zu erhalten, das die für Human-bFGF kodierende Region enthielt. An die BalI-Spaltungsstelle (stumpfes Ende) dieses DNA-Fragments wurde mittels T4-DNA-Ligase der BglII Linker pCA- GATCTG ligiert und ein AvaI-BglII DNA-Fragment mit 0,44 kb wurde abgetrennt. Mit diesem AvaI-BglII DNA-Fragment mit 0,44 kb wurde T4-DNA-Ligase umgesetzt, um die BglII-Spaltungsstellen zu ligieren, und dies wurde von der Reaktion mit DNA-Polymerase (Klenow- Fragment) in Anwesenheit von dXTP zum Abstumpfen der Aval-Spaltungsstelle gefolgt. An dieses DNA-Fragment wurden nach der Phosphorylierung mittels T4-DNA-Ligase die synthetischen Oligonucleotide 5 'AATTCTATGCCAGCATTGC3' und 5' GCAATGCTGGCATAG3' ligiert, und dies wurde von der Spaltung mittels EcoRI-BglII gefolgt, um ein DNA-Fragment mit etwa 0,46 kb herzustellen. Getrennt wurde die DNA des Plasmids ptrp781 [Kurokawa, T. et al., Nucleic Acids Research, 11, 3077-3085 (1983)], die einen trp-Promotor besitzt, mittels PstI gespalten und durch eine T4- DNA-Polymerasereaktion abgestumpft. Nach der Ligation des BglII Linkers pCAGATCTG an das stumpfe Ende durch eine T4-DNA-Ligasereaktion wurde eine Spaltung mittels EcoR I-BglII durchgeführt, um ein DNA-Fragment mit etwa 3,2 kb abzutrennen, das den trp- Promotor, das Tetracyclinresistenzgen und eine Plasmidreplikationsstartstelle enthielt. Das vorgenannte EcoR I-BglII DNA- Fragment mit 0,46 kb, das die Human-bFGF-kodierende Genregion enthielt, und dieses DNA-Fragment mit 3,2 kb wurden durch eine T4-DNA-Ligasereaktion zusammen ligiert, um das Plasmid pTB669 zur Human-bFGF-Expression aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB669 wurde Escherichia coli DH1 transformiert, wodurch Escherichia coli DH1/pTB669, welches das Plasmid pTB669 beherbergt, erhalten wurde.
Außerdem wurde Escherichia coli K12 MM294 oder C600 mittels pTB669 auf dieselbe Weise wie vorstehend transformiert, wodurch Escherichia coli K12 MM294/pTB669 (IFO 14532, FERM BP-1281) bzw. E. coli C600/pTB669 erhalten wurden.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakten

Jede der vorgenannten Transformanten wurde in einem M9-Medium kultiviert, das 1% Glucose, 0,4% Casaminosäure und 8 ug/ml Tetracyclin enthielt, und, wenn der Klett-Wert etwa 200 wurde, wurde 3-β-Indolylacrylsäure in einer Konzentration von 25 ug/ml zugesetzt, und dies wurde von 4 weiteren Stunden Kultivierung gefolgt. Nach der Kultivierung wurden die Bakterienzellen gesammelt und in einer 10%igen Sucroselösung suspendiert, die eine 1/20 Menge 20 mM Tris-HCl (pH 7,6) enthielt. Dieser Suspension wurde Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) auf 1 mM, EDTA auf 10 mM, NaCl auf 0,1 M, Spermidinhydrochlorid auf 10 mM und Lysozym auf 100 ug/ml zugesetzt (jede Zahl zeigt die Endkonzentration) und das Gemisch wurde 45 Minuten bei 0ºC belassen, wonach es 30 Sekunden Ultrabeschallung ausgesetzt wurde. Diese Lösung wurde bei 18000 Upm 30 Minuten zentrifugiert (Sorval-Zentrifuge, SS34- Rotor), um einen Überstand zu ergeben, der als Bakterienzellextrakt verwendet wurde.

(3) Human-bFGF-Aktivität der Bakterienzellextrakte

Die Human-bFGF-Aktivitäten werden durch die Gewichte der Standardprobe gereinigten Rinderhirn-FGF (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) in Mengen angezeigt, die denjenigen von Bakterienzellextrakten in der Aktivität der wachstumsfördernden Wirkung auf BALB/c3T3-Zellen äquivalent sind.
Maus-BALB/c3T3-Zellen wurden in einer Menge von 2·10³ Zellen je Näpfchen in ein DMEM-Medium eingeimpft, das 5% Kälberserum auf einer Nunc-96-Näpfchen-Mikrotiterplatte (flacher Boden) enthielt, wobei jedes Näpfchen 0,2 ml des Mediums enthielt, und wurden kultiviert. Am nächsten Tag wurde das Medium durch ein DMEM-Medium ersetzt, das 0,5% Kälberserum enthielt. Nach 3 Tagen Kultivierung wurden 10 ul eines Bakterienzellextrakts, der zuvor in 5fachen Schritten mit einem DME-Medium seriell verdünnt wurde, das 0,5% BSA enthielt, jedem Näpfchen zugesetzt und kultiviert. 20 Stunden später wurden jedem Näpfchen 2 ul ³H-Tdr (5 Ci/mMol, 0,5 mCi/ml RCC Amersham, UK) zugesetzt. 6 Stunden später wurden die Zellen durch Behandlung mit einer phosphatgepufferten Lösung (PBS), die 0,2% Trypsin-0,02% EDTA enthielt, abgezogen und die Zellen wurden auf ein Glasfilter mittels eines Titertech-Zellenernters geerntet, wonach die Menge des in die Zellen aufgenommenen ³H-Tdr mittels eines Szintillationszählers bestimmt wurde. Mittels desselben Verfahrens wurden Bestimmungen der Aktivitäten von Rinderhirn-FGF-Proben (hergestellt von Takara Shuzo) mit bekanntem Gewicht ausgeführt. Aus der auf diese Weise erhaltenen Arbeitskurve wurden Berechnungen der Mengen Human-bFGF in den Bakterienzellextraktproben angestellt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 dargestellt.
Zur Kontrolle wurde die Human-bFGF-Produktivität der durch Transformation von Escherichia coli DH1 mittels des Plasmids ptrp781 erhaltenen Transformanten E. coli DHI/ptrp781 bestimmt. Tabelle 2, Human-bFGF-Produktivitäten
Transformante Human-bFGF-Produktivität (je Liter Kulturmedium)
E. coli DHI/pTB669
E. coli MM294/pTB669
E. coli C600/pTB669
E. coli DH1/ptrp781

Beispiel 1

(Herstellung rekombinanter DNA, die eine Mutein-kodierende Basensequenz enthalten)

(1) Klonieren des M13-Vektors des Human-bFGF-Gens

Das in Referenzbeispiel 2 erhaltene Plasmid pTB669 wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI verdaut. Die DNA in replikativer Form (RF) des Phagenvektors M13mp8 [J. Messing, Methods in Enzymology, 101, 20-78 (1983)] wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI verdaut und wurde mit dem aus dem verdauten pTB669 stammenden Human-bFGF-DNA-Fragment gemischt. Das Gemisch wurde anschließend mittels T4-DNA-Ligase zusammenligiert. Die ligierte DNA wurde in eine infizierbare Zelle des Stamms Escherichia coli JM105 transformiert, die sich daraus ergebende Transformante wurde auf eine Platte mittels Xgal als Indikator geimpft [J. Messing et al., Nucleic Acids Research, 9, 309-321 (1981)], die den rekombinanten Phagen enthaltende Plaque (weiße Plaque) wurde aufgenommen, die Basensequenz der rekombinierten Region wurde durch das Dideoxynukleotidsynthese- Kettenabschlußverfahren [J. Messing et al., Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)] bestimmt, wodurch bestätigt wurde, daß Human-bFGF-DNA ordnungsgemäß inseriert worden war.
Aus diesem M13-PO-Klon wurde eine einzelsträngige Phagen-DNA gereinigt, die anschließend als Vorlage für eine ortsgerichtete Mutagenese mittels eines synthetischen Oligonucleotids verwendet wurde.

(2) Ortsspezifische Mutagenese

In Anwesenheit von 0,1 mM Adenosintriphosphat (ATP), 50 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan-hydrochlorid (Tris-HCl, pH 8,0), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit (DTT) und 9 Einheiten T4-Kinase in einer Gesamtmenge von 50 ul wurden 40 Picomol des synthetischen Oligonucleotids:
5'> CGT TCT TGC TGT AGA GCC GCT< 3'
[Starter zum Austauschen von Cys 26 gegen Ser (die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym RsaI verschwindet) (siehe Fig. 2)] mit T4-Kinase 1 Stunde bei 37ºC behandelt. Dieser Kinase-behandelte Starter (12 Picomol) wurde 5 Minuten auf 67ºC und 25 Minuten auf 42ºC in 50 ul eines Gemischs erhitzt, das 50 mM NaCl, 1,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM β-Mercaptoethanol enthielt, wodurch der Starter an 5 ug der einzelsträngigen (ss) M13-PO-DNA hybridisiert wurde. Das rückgebildete Gemisch wurde anschließend auf Eis gekühlt und es wurde 50 ul eines Reaktionsgemisches zugesetzt, das 0,5 mM Deoxynukleotidtriphosphat (dNTP), 80 mM Tris-HCl (pH 7,4), 8 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 9 Einheiten DNA-Polymerase-1-Klenow-Fragment, 0,5 mM ATP und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase enthielt, zugesetzt und die Reaktion wurde 3 Stunden bei 37ºC und 2 Stunden bei 25 ºC durchgeführt, wonach die Reaktion durch Hinzufügen von 2 ul 0,2 mM EDTA abgebrochen wurde. Das Reaktionsprodukt wurde zum Transformieren infizierbarer JM105-Zellen verwendet. Die auf diese Weise erhaltenen Transformantenzellen wurden über Nacht wachsen gelassen, wonach eine ssDNA aus dem Überstand des Kulturmediums isoliert wurde. Mittels dieser ssDNA als Vorlage für den zweiten Zyklus der Starterverlängerung wurde gelgereinigte DNA vom RF-Typ in infizierbare JM105-Zellen transformiert. Die sich daraus ergebenden Transformantenzellen wurden über eine Agarplatte gestrichen und wurden über Nacht unter Erhalten von Phagenplaques kultiviert.

(3) Ortsgerichtete Mutagenese

Das Verfahren des vorstehenden Abschnitts (2) wurde wiederholt, aber der verwendete synthetische Oligonucleotidstarter war: 5'> AAC GAT TAG CGC TCA CTC C< 3', der das Cystein-70-kodierende Kodon so verändert, daß das Kodon Serin kodiert. (Eine Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms HaeII wurde erzeugt.) (Siehe Fig. 2.)

(4) Ortsgerichtete Mutagenese

Das Verfahren des vorstehenden Abschnitts (2) wurde wiederholt, aber der verwendete synthetische Oligonucleotidstarter war: 5'> GTA ACA GAC TTA GAA GCT AGT < 3', der das Cystein-88-kodierende Kodon SO ändert, daß das Kodon Serin kodiert. (Eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym AluI wurde erzeugt.) (Siehe Fig. 2.)

(5) Ortsgerichtete Mutagenes

Das Verfahren des vorstehenden Abschnitts (2) wurde wiederholt, außer daß der verwendete synthetische Oligonucleotidstarter 5'> TCG AAG AAG AAA GAC TCA TCC< 3' war, der das Cystein-93-kodierende Kodon SO ändert, daß das Kodon Serin kodiert. (Eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym Hinf I wurde erzeugt.) (Siehe Fig. 2.)

(6) Screening und Identifizierung mutagen gemachter Plaques

Platten, die mutierte M13-PO-Plaques [vorstehender Abschnitt (1)] enthielten und 2 Platten, die unmutierte M13-PO-Phagenplaques enthielten wurden auf 4ºC gekühlt und die Plaques von jeder Platte wurden auf 2 Nitrocellulose-Rundfilter überführt, indem ein trockener Filter 5 Minuten auf die Agarplatte im Fall des ersten Filters und 15 Minuten im Fall des zweiten Filters gelegt wurde. Die Filter wurden anschließend 5 Minuten auf dicke Filterpapiere gelegt, die in 0,2N NaOH, 1,5M NaCl und 0,2% Triton X-100® eingetaucht waren, wonach sie neutralisiert wurden, indem sie 5 weitere Minuten auf Filterpapiere gelegt wurden, die in 0,5M Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5 und 1,5M NaCl eingetaucht waren. Die Filter wurden zweimal auf Filter gewaschen, die in 2·SSC (Standard-Natriumcitrat) in derselben Weise eingetaucht waren und wurden trocknen gelassen, gefolgt vom Trocknen bei 80ºC während 2 Stunden in einem Vakuumofen. Die sich überlappenden Filter wurden 4 Stunden der Vorhybridisierung bei 55ºC mit 10 ml/Filter einer DNA-Hybridisierungspufferlösung (5·SSC) mit einem pH-Wert von 7,0 unterzogen, die 4·Denhardts-Lösung (Polyvinylpyrrolidon, Ficoll® und Rinderserumalbumin, 1·= 0,02%), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Natriumphosphat-gepufferte Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 und 100 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthielt. Die Hybridisierung wurde 24 Stunden bei 42ºC mit 10&sup5; cpm/ml eines Oligonucleotidstarters durchgeführt. Die Filter wurden jeweils in einer Pufferlösung zum Waschen, die 0,1% SDS und eine verringerte Menge SSC enthielt, 30 Minuten bei 50ºC gewaschen. Die Filter wurden anschließend zuerst mit einer Pufferlösung gewaschen, die 2·SSC enthielt. Die Kontrollfilter, die unmutierte M13-PO- Plaques enthielten, wurden mittels eines Geigerzählers auf Radioaktivität untersucht. Während die SSC-Konzentration schrittweise verringert wurde, wurden die Kontrollfilter gewaschen, bis auf den Filtern keine nachweisbare Radioaktivität zurückblieb. Der Mindestwert der verwendeten SSC-Konzentrationen betrug 0,1·SSC. Man ließ die Filter an der Luft trocknen und durch 2 bis 3 Tage Belichten bei -70ºC wurden Autoradiographien aufgenommen. Das Screening wurde an 10000 mutierten M13-PO- Plaques und 100 unmutierten Kontrollplaques mittels einer Kinase-behandelten Oligonucleotidsonde durchgeführt. Keine der Kontrollplaques hybridisierten zu der Sonde, während 3 bis 10 der mutierten M13-PO-Plaques zu der Sonde hybridisierten.
Eine der mutierten M13-PO-Plaques wurde entnommen und wurde in ein JM105-Kulturmedium eingeimpft. Aus dem Überstand wurde eine ssDNA hergestellt und aus den Bakterienzellpellets wurde eine doppelsträngige (ds) DNA hergestellt. Analysen wurden von den Basensequenzen mittels geeigneter Oligonucleotidstarter und ssDNA angefertigt.
Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das TGC(Cys-26)-Kodon in ein TCT-(Ser)-Kodon, das TGT(Cys-70)-Kodon in ein AGC(Ser)-Kodon, das TGT(Cys-88)-Kodon in ein TCT(Ser)-Kodon und das TGT(Cys-93)- Kodon in ein TCT(Ser)-Kodon geändert worden war.
Von den mutierten M13-PO-Phagen wurde der Phage, in dem das Kodon Cys-26 ein Ser-kodierendes Kodon geworden war, M13-P1; der Phage, in dem das Kodon Cys-70 ein Ser-kodierendes Kodon geworden war, Ml3-P2; der Phage, in dem das Kodon Cys-88, M13-P3; und der Phage, in dem das Kodon Cys-93 ein Ser-kodierendes Kodon geworden war, M13-P4 genannt.

Beispiel 2

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB739 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die vorstehend in Beispiel 1 erhaltene replikative Form (RF) M13-P1 wurde mittels der Restriktionsenzyme EcoRI und PstI gespalten, um ein DNA-Fragment mit etwa 0,5 kb zu erhalten, das die Human-bFGF-Mutein-kodierende Region enthielt.
Getrennt wurde die Plasmid-ptrp781-DNA [Kurokawa, T. et al., Nucleic Acids Research, 11, 3077-3085 (1983)], die einen trp- Promoter enthält, mittels EcoRI-PstI gespalten, um ein DNA-Fragment mit etwa 3,2 kb abzutrennen, das einen trp-Promotor, ein Tetracyclin-resistentes Gen und eine Plasmidreplikationsstartstelle enthielt. Das vorgenannte EcoRI-PstI DNA-Fragment mit 0,5 kb, das die Human-bFGF-Mutein-kodierende Region enthielt, und dieses DNA-Fragment mit 3,2 kb wurden durch eine T4-DNA-Ligasereaktion zusammenligiert, um das Plasmid pTB739 zur Human-bFGF- Mutein-Expression (Fig. 7) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB739 wurde Escherichia coli DHI transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli DHI/pTB739 (IFO14575, FERM BP-1641) erhalten wurde, der das Plasmid pTB739 beherbergt, welches das in Fig. 3 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

Die vorgenannte Transformante wurde in einem M9-Medium kultiviert, das 1% Glucose, 0,4% Casaminosäure und 8 ug/ml Tetracyclin enthielt, und als der Klettwert etwa 200 wurde, wurde 3β- Indolylacrylsäure auf eine Konzentration von 25 ug/ml zugesetzt, und dies wurde von 4 weiteren Stunden Kultivierung gefolgt. Nach der Kultivierung wurden die Bakterienzellen gesammelt und in einer 10%igen Sucroselösung, die 1/20 Menge 20 mM Tris-HCl (pH 7,6) enthielt, suspendiert. Dieser Suspension wurde Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) auf 1 mM, EDTA auf 10 mM, NaCl auf 0,1 M, Spermidinhydrochlorid auf 10 mM und Lysozym auf 100 ug/ml (jede Zahl zeigt die Endkonzentration) zugesetzt, und das Gemisch wurde 45 Minuten bei 0ºC belassen, wonach es 30 Sekunden der Ultrabeschallung ausgesetzt wurde. Diese Lösung wurde bei 18000 upm (Sorval®-Zentrifuge, SS34-Rotor) 30 Minuten unter Ergeben eines Überstands zentrifugiert, der anschließend als Bakterienzellextrakt verwendet wurde.

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Maus-BALB/c3T3-Zellen wurden in einer Menge von 2·10³ Zellen je Näpfchen in ein DMEM-Medium, das 5% Kälberserum enthielt, auf eine Nunc-96-Näpfchen-Mikrotiterplatte (flacher Boden) eingeimpft, wobei jedes Näpfchen 0,2 ml Medium enthielt, und wurde kultiviert. Am nächsten Tag wurde das Medium durch ein DMEM-Medium ersetzt, das 0,5% Kälberserum enthielt. Nach 3 Tagen Kultivierung wurden jedem Näpfchen 10 ul Bakterienzellextrakt, der zuvor in 5fachen Stufen mit einem DME-Medium, das 0,5% BSA enthielt, seriell verdünnt wurde, zugesetzt und wurde kultiviert. 20 Stunden später wurden jedem Näpfchen 2 ul ³H-Tdr (5 Ci/mMol, 0,5 mCi/ml RCC Amersham) zugesetzt. 6 Stunden später wurden die Zellen durch Behandlung mit einer Phosphat-gepufferten Lösung (PBS), die 0,2% Trypsin-0,02% EDTA enthielt, abgezogen und die Zellen wurden auf einem Glasfilter mittels eines Titertech-Zellernters geerntet, wonach die in die Zellen aufgenommene Menge ³H- Tdr mittels eines Szintillationszählers bestimmt wurde.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt aus E. coli DHI/pTB739 FGF-Aktivität auf.
Das Mutein CS1, in dem Cys in der 26-Position von Human-bFGF durch Ser ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 3

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plamids pTB742 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die vorstehend in Beispiel 1 erhaltene replikative Form (RF) M13-P2 wurde mittels der Restriktionsenzyme EcoRI und PstI gespalten, um ein DNA-Fragment mit etwa 0,5 kb zu erhalten, das eine Region enthielt, die ein Human-bFGF-Mutein kodiert.
Getrennt wurde eine Plasmid-ptrp781-DNA, die einen trp-Promotor enthielt, mittels EcoRI-PstI gespalten, um ein DNA-Fragment mit etwa 3,2 kb abzutrennen, das einen trp-Promotor, ein Tetracyclin-resistentes Gen und eine Plasmidreplikationsstartstelle enthielt. Dieses DNA-Fragment mit 3,2 kb und das vorgenannte EcoRI-PstI-DNA-Fragment mit 0,5 kb, das eine Human-bFGF-Muteinkodierende Genregion enthielt, wurden durch eine T4-DNA-Ligasereaktion zusammenligiert, um das Plasmid pTB742 zur Expression eines Human-bFGF-Muteins (Fig. 8) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB742 wurde Escherichia coli DH1 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli DH1/pTB742 (IFO 14584, FERM BP-1642) erhalten wurde, der das Plasmid pTB742 beherbergt, das das in Fig. 4 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

Die vorgenannte Transformante wurde durch das in Beispiel 2 (2) beschriebene Verfahren unter Ergeben eines Überstands kultiviert, der abschließend als Bakterienzellextrakt verwendet wurde.

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität wurde an dem vorstehend in (2) erhaltenen Bakterienzellextrakt durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren ausgeführt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt von E. coli DH1/pTB742 FGF-Aktivität auf.
Das Mutein CS2, in dem Cys in der 70-Position von Human-bFGF durch Ser ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 4

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB743 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die vorstehend in Beispiel 1 erhaltene replikative Form (RF) M13-P3 wurde mittels der Restriktionsenzyme EcoRI und PstI gespalten, um ein DNA-Fragment mit etwa 0,5 kb zu erhalten, das eine Region enthielt, die ein Human-bFGF-Mutein kodiert.
Getrennt wurde eine Plasmid-ptrp781-DNA, die einen trp-Promotor enthielt, mittels EcoRI-PstI gespalten, um ein DNA-Fragment mit etwa 3,2 kb abzutrennen, das einen trp-Promotor, ein Tetracyclin-resistentes Gen und eine Plasmidreplikationsstartstelle enthielt. Dieses DNA-Fragment mit 3,2 kb und das vorgenannte EcoRI-PstI DNA-Fragment mit 0,5 kb, das eine Genregion enthielt, die Human-bFGF-Mutein kodiert, wurden durch eine T4-DNA-Ligasereaktion zusammenligiert, um das Plasmid pTB743 zur Expression von Human-bFGF-Mutein (Fig. 9) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB743 wurde Escherichia coli DH1 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli DHI/pTB743 (IFO 14585, FERM BP-1643) erhalten wurde, der das Plasmid pTB743 beherbergt, welches das in Fig. 5 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

Die vorgenannte Transformante wurde auf die in Beispiel 2 (2) beschriebene Weise unter Ergeben eines Überstands kultiviert, der anschließend als Bakterienzellextrakt verwendet wurde.

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des vorstehend in (2) erhaltenen Zellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren angestellt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt von E. coli DH1/pTB743 FGF-Aktivität auf.
Das Mutein CS3, in dem Cys in der 88-Position von Human-bFGF durch Ser ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 5

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB744 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die vorstehend in (1) erhaltene replikative Form (RF) M13-P4 wurde mittels der Restriktionsenzyme EcoRI und PstI gespalten, um ein DNA-Fragment mit etwa 0,5 kb zu erhalten, das eine Region enthielt, die ein Human-bFGF-Mutein kodiert.
Getrennt wurde eine Plasmid-ptrp781-DNA, die einen trp-Promotor enthielt, mittels EcoRI-PstI gespalten, um ein DNA-Fragment mit etwa 3,2 kb abzutrennen, das einen trp-Promotor, ein Tetracyclin-resistentes Gen und eine Plasmidreplikationsstartstelle enthielt. Dieses DNA-Fragment mit 3,2 kb und das vorgenannte EcoRI-PstI-DNA-Fragment mit 0,5 kb, das eine Human-bFGF-Muteinkodierende Genregion enthielt, wurden durch eine T4-DNA-Ligasereaktion zusammenligiert, um das Plasmid pTB744 zur Expression eines Human-bFGF-Muteins (Fig. 10) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB744 wurde Escherichia coli DH1 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli DH1/pTB744 (IFO 14586, FERM BP-1644) erhalten wurde, der das Plasmid pTB744 beherbergt, welches das in Fig. 6 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

Die vorgenannte Transformante wurde durch das in Beispiel 2 (2) beschriebene Verfahren unter Ergeben eines Überstands kultiviert, der anschließend als Bakterienzellextrakt verwendet wurde.

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des vorstehend in (2) erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren angestellt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt aus E. coli DH1/pTB744 FGF-Aktivität auf.
Das Mutein CS4, in dem Cys in der 93-Position in Human-bFGF durch Ser ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 6

(Screening und Identifizierung mutagen gemachter Plaques)

Platten, die in Beispiel 1 erhaltene mutierte M13-P2-Phagenplaques enthielten, und 2 Platten, die in Beispiel 1 erhaltene unmutierte M13-P2-Phagenplaques enthielten, wurden auf 4ºC gekühlt, und die Plaque von jeder Platte wurden auf 2 Nitrocellulose-Rundfilter überführt, indem ein trockenes Filter im Fall des ersten Filters 5 Minuten und im Fall des zweiten Filters 15 Minuten auf die Agarplatte gelegt wurden. Die Filter wurden anschließend 5 Minuten auf dicke Filterpapiere gelegt, die in 0,2N NaOH, 1,5M NaCl und 0,2% Triton X-100® eintauchten, wonach sie neutralisiert wurden, indem sie 5 weitere Minuten auf Filterpapiere gelegt wurden, die in 0,5M Tris-HCl (pH 7,5) und 1,5M NaCl eintauchten. Die Filter wurden zweimal auf Filtern, die in 2·SSC (Standard-Natriumcitrat) eintauchten, auf dieselbe Weise gewaschen und wurden trocknen gelassen, und dies wurde von 2 Stunden Trocknen in einem Vakuumofen bei 80ºC gefolgt. Die sich überlappenden Filter wurden 4 Stunden der Vorhybridisierung bei 55ºC mit 10 ml/Filter einer DNA-Hybridisierungspufferlösung (5·SSC) mit einem pH-Wert von 7,0 unterzogen, die 4·Denhardts Lösung (Polyvinylpyrrolidon, Ficoll® und Rinderserumalbumin, 1·= 0,02%), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Natriumphosphat-gepufferte Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 und 100 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthielt. Die Hybridisierung wurde 24 Stunden bei 42ºC mit 10&sup5; cpm/ml eines Oligonucleotidstarters durchgeführt. Die Filter wurden jeweils in einer Pufferlösung zum Waschen, die 0,1% SDS und eine verringerte Menge SSC enthielt, 30 Minuten bei 50ºC gewaschen. Die Filter wurden anschließend zuerst mit einer 2·SSC enthaltenden Pufferlösung gewaschen. Die Kontrollfilter, die unmutierte M13-P2-Plaques enthielten, wurden mittels eines Geigerzählers auf Radioaktivität untersucht. Während die SSC-Konzentration schrittweise verringert wurde, wurden die Kontrollfilter gewaschen, bis keine nachweisbare Radioaktivität auf den Filtern verblieb. Der Mindestwert der verwendeten SSC-Konzentrationen betrug 0,1·SSC. Man ließ die Filter an der Luft trocknen und Radioautographien wurden durch 2 bis 3 Tage Belichten bei -70 ºC aufgenommen. Das Screening wurde von 10000 mutierten M13-P2-Plaques und 100 unmutierten Kontrollplaques mittels einer Kinase-behandelten Oligonucleotidsonde durchgeführt. Keine der Kontrollplaques hybridisierte zu der Sonde, während 3 bis 10 der mutierten M13- P2-Plaques zu der Sonde hybridisierten.
Eine der mutierten M13-P2-Plaques wurde entnommen und wurde in ein JM105-Kulturmedium eingeimpft. Aus dem sich daraus ergebenden Überstand wurde eine ssDNA hergestellt und aus den Bakterienzellpellets wurde eine doppelsträngige (ds)DNA hergestellt. Analysen der Basensequenzen wurden mittels geeigneter Oligonucleotidstarter und ssDNA durchgeführt.
Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das TGC(Cys-26)-Kodon in ein TCT(Ser) -Kodon, das TGT(Cys-88 )-Kodon in ein TCT(Ser) -Kodon beziehungsweise das TGT(Cys-93)-Kodon in ein TCT(Ser)-Kodon geändert worden waren.
Von den mutierten Ml3-P2-Phagen wurde der Phage, in dem die Kodons Cys-26 und -70 Ser-kodierende Kodons geworden waren, M13-P12; der Phage, in dem die Kodons Cys-70 und -88 Ser-kodierende Kodons geworden waren, M13-P23; und der Phage, in dem die Kodons Cys-70 und -93 Ser-kodierende Kodons geworden waren, M13-P24 genannt.

Beispiel 7

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB762 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die vorstehend in Beispiel 6 erhaltene replikative Form (RF) M13-P23 wurde auf die in Beispiel 2 (1) beschriebene Weise behandelt, um das Plasmid pTB762 zur Human-bFGF-Mutein-Expression (Fig. 12) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB762 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB762 (IFO 14613, FERM BP-1645) erhalten wurde, der das Plasmid pTB762 beherbergt, das das in Fig. 11 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des vorstehend in (2) erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren angestellt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt aus E. coli MM294/pTB762 FGF-Aktivität auf.
Das Mutein CS23, in dem Cys in der 70-Position und in der 88- Position durch Ser ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 8

(Screening und Identifizierung mutagen gemachter Plaques)

Platten, die in Beispiel 7 erhaltene mutierte M13-P23-Phagenplaques enthielten, und 2 Platten, die in Beispiel 7 erhaltene unmutierte M13-P23-Phagenplaques enthielten, wurden auf 4ºC gekühlt und die Plaque von jeder Platte wurden auf 2 Nitrocellulose-Rundfilter überführt, indem ein trockenes Filter im Fall des ersten Filters 5 Minuten und im Fall des zweiten Filters 15 Minuten auf die Agarplatte gelegt wurden. Die Filter wurden anschließend 5 Minuten auf dicke Filterpapiere gelegt, die in 0,2N NaOH, 1,5M NaCl und 0,2% Triton X-100® eintauchten, wonach sie neutralisiert wurden, indem sie 5 weitere Minuten auf Filterpapiere gelegt wurden, die in 0,5M Tris-HCl (pH 7,5) und 1,5M NaCl eintauchten. Die Filter wurden zweimal auf Filtern, die in 2·SSC (Standard-Natriumcitrat) eintauchten, auf dieselbe Weise gewaschen und wurden trocknen gelassen, und dies wurde von 2 Stunden Trocknen in einem Vakuumofen bei 80ºC gefolgt. Die sich überlappenden Filter wurden 4 Stunden der Vorhybridisierung bei 55ºC mit 10 ml/Filter einer DNA-Hybridisierungspufferlösung (5·SSC) mit einem pH-Wert von 7,0 unterzogen, die 4·Denhardts Lösung (Polyvinylpyrrolidon, Ficoll® und Rinderserumalbumin, 1·= 0,02%), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Natriumphosphat-gepufferte Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 und 100 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthielt. Die Hybridisierung wurde 24 Stunden bei 42ºC mit 10&sup5; cpm/ml eines Oligonucleotidstarters durchgeführt. Jedes Filter wurde in einer Pufferlösung zum Waschen, die 0,1% SDS und eine verringerte Menge SSC enthielt, 30 Minuten bei 50ºC gewaschen. Die Filter wurden anschließend zuerst mit einer Pufferlösung gewaschen, die 2·SSC enthielt. Die Kontrollfilter, die unmutierte M13-P23-Plaques enthielten, wurden mittels eines Geigerzählers auf Radioaktivität untersucht. Während die SSC-Konzentration schrittweise erniedrigt wurde, wurden die Kontrollfilter, die unmutierte M13-P23-Plaques enthielten, gewaschen, bis keine nachweisbare Radioaktivität auf den Filtern zurückblieb. Der Mindestwert der verwendeten SSC-Konzentrationen betrug 0,1·SSC. Man ließ die Filter an der Luft trocknen und Autoradiographien wurde durch 2 bis 3 Tage Belichten bei -70ºC aufgenommen. Das Screening wurde von 10000 mutierten M13-P23-Plaques und 100 unmutierten Kontrollplaques mittels einer Kinase-behandelten Oligonucleotidsonde durchgeführt. Keine der Kontrollplaques hybridisierten zu der Sonde, während 3 bis 10 der mutierten M13-P23-Plaques zu der Sonde hybridisierten.
Eine der mutierten M13-P23-Plaques wurde entnommen und wurde in JM105-Kulturmedium eingeimpft. Aus dem sich daraus ergebenden Überstand wurde eine ssDNA hergestellt und aus den Bakterienzellpellets eine doppelsträngige (ds)DNA hergestellt. Analysen der Basensequenzen wurden mittels geeigneter Oligonucleotidstarter und ssDNA durchgeführt.
Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das TGC(Cys-26)-Rodon in ein TCT(Ser)-Kodon beziehungsweise das TGT(Cys-93)-Kodon in ein TCT(Ser)-Kodon geändert worden war.
Von den mutierten M13-P23-Phagen wurde der Phage, in dem die Kodons Cys-26, -70 und -88 Ser-kodierende Kodons geworden waren, M13-P123; und der Phage, in dem die Kodons Cys-70, -88 und -93 Ser-kodierende Kodons geworden waren, M13-P234 genannt.

Beispiel 9

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB764 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die vorstehend in Beispiel 8 erhaltene replikative Form (RF) M13-P123 wurde auf die in Beispiel 2 (1) beschriebene Weise behandelt, um das Plasmid pTB764 zur Human-bFGF-Mutein-Expression (Fig. 14) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB764 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB764 (IFO 14614, FERM BP-1646) erhalten wurde, der das Plasmid pTB764 beherbergt, welches das in Fig. 13 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des in (2) vorstehend erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren durchgeführt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt aus E. coli MM294/pTB794 FGF-Aktivität auf.
Das Mutein C5123, in dem Cys an der 26-, 70- und 88-Position in Human-bFGF durch Ser ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 10

(Screening und Identifizierung mutagen gemachter Plaques)

Platten, die in Beispiel 8 erhaltene mutierte M13-P123-Phagenplaques enthielten, und 2 Platten, die in Beispiel 8 erhaltene unmutierte M13-P123-Phagenplaques enthielten, wurden auf 4ºC gekühlt und die Plaque von jeder Platte wurden auf 2 Nitrocellulose-Rundfilter überführt, indem ein trockenes Filter im Fall des ersten Filters 5 Minuten und im Fall des zweiten Filters 15 Minuten auf die Agarplatte gelegt wurden. Die Filter wurden anschließend 5 Minuten auf dicke Filterpapiere gelegt, die in 0,2N NaOH, 1,5M NaCl und 0,2% Triton X-100® eintauchten, wonach sie neutralisiert wurden, indem sie 5 weitere Minuten auf Filterpapiere gelegt wurden, die in 0,5M Tris-HCl (pH 7,5) und 1,5M NaCl ein;tauchten. Die Filter wurden zweimal auf Filtern, die in 2·SSC (Standard-Natriumcitrat) eintauchten, auf dieselbe Weise gewaschen und wurden trocknen gelassen und dies wurde von 2 Stunden Trocknen in einem Vakuumofen bei 80ºC gefolgt. Die sich überlappenden Filter wurden 4 Stunden der Vorhybridisierung bei 55ºC mit 10 ml/Filter einer DNA-Hybridisierungspufferlösung (5·SSC) mit einem pH-Wert von 7,0 unterzogen, die 4·Denhardts Lösung (Polyvinylpyrrolidon, Ficoll® und Rinderserumalbumin, 1·= 0,02%), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Natriumphosphat-gepufferte Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 und 100 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthielt. Die Hybridisierung wurde 24 Stunden bei 42ºC mit 10&sup5; cpm/ml eines Oligonucleotidstarters durchgeführt. Die Filter wurden jeweils in einer Pufferlösung zum Waschen, die 0,1% SDS und eine verringerte Menge SSC enthielt, 30 Minuten bei 50ºC gewaschen. Die Filter wurden anschließend zuerst mit einer Pufferlösung gewaschen, die 2·SSC enthielt. Die Kontrollfilter, die unmutierte M13-P123-Plaques enthielten, wurden mittels eines Geigerzählers auf Radioaktivität untersucht. Während die SSC-Konzentration schrittweise verringert wurde, wurden die Kontrollfilter, die unmutierte M13- P123-Plaques enthielten, gewaschen, bis keine nachweisbare Radioaktivität auf den Filtern zurückblieb. Der Mindestwert der verwendeten SSC-Konzentrationen betrug 0,1·SSC. Man ließ die Filter an der Luft trocknen und Autoradiographien wurden durch 2 bis 3 Tage Belichten bei -70ºC aufgenommen. Das Screening wurde von 10000 mutierten M13-P123-Plaques und 100 unmutierten Kontrollplaques mittels einer Kinase-behandelten Oligonucleotidsonde durchgeführt. Keine der Kontrollplaques hybridisierten zu der Sonde, während 3 bis 10 der mutierten M13-P123-Plaques zu der Sonde hybridisierten.
Eine der mutierten M13-P123-Plaques wurde entnommen und wurde in ein JM105-Kulturmedium eingeimpft. Aus dem sich daraus ergebenden Überstand wurde eine ssDNA hergestellt, und aus den Bakterienzellpellets wurde eine doppelsträngige (ds)DNA hergestellt. Analysen der Basensequenzen wurden mittels eines geeigneten Oligonucleotidstarters und einer ssDNA durchgeführt.
Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das TGT(Cys-93)-Kodon in ein TCT(Ser)-Kodon geändert worden war.
Von den mutierten M13-P123-Phagen wurde der Phage, in dem die Kodons Cys-26, -70, -88 und -93 Ser-kodierende Kodons geworden waren, M13-P1234 genannt.

Beispiel 11

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB765 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die in Beispiel 10 vorstehend erhaltene replikative Form (RF) M13-P1234 wurde auf die in Beispiel 2 (1) beschriebene Weise behandelt, um das Plasmid PTB765 zur Expression eines HumanbFGF-Muteins (Fig. 16) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB765 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB765 (IFO 14615, FERM BP-1647) erhalten wurde, der das Plasmid pTB765 beherbergt, welches das in Fig. 15 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des vorstehend in (2) erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde auf die in Beispiel 2 (3) beschriebene Weise durchgeführt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt aus E. coli MM294/pTB765 FGF-Aktivität auf.
Das Mutein CS1234, in dem Cys in der 26-, 70-, 88- und 93-Position in Human-bFGF durch Ser ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 12

(Screening und Identifizierung mutagen gemachter Plaques)

Platten, die durch das Verfahren von Beispiel 1 mittels eines synthetischen Oligomers [Fig. 2 (3) oder (4)] mutierte M13-P1- Phagen enthielten, und 2 Platten, die in Beispiel 1 erhaltene unmutierte M13-P1-Phagenplaques enthielten, wurden auf 4ºC gekühlt und die Plaque von jeder Platte wurden auf 2 Nitrocellulose-Rundfilter überführt, indem ein trockenes Filter im Fall des ersten Filters 5 Minuten und im Fall des zweiten Filters 15 Minuten auf die Agarplatte gelegt wurden. Die Filter wurden anschließend 5 Minuten auf dicke Filterpapiere gelegt, die in 0,2N NaOH, 1,5M NaCl und 0,2% Triton X-100® eintauchten, wonach sie neutralisiert wurden, indem sie 5 weitere Minuten auf Filterpapiere gelegt wurden, die in 0,5M Tris-HCl (pH 7,5) und 1,5M NaCl eintauchten. Die Filter wurden zweimal auf Filtern, die in 2·SSC (Standard-Natriumcitrat) eintauchten, auf dieselbe Weise gewaschen und trocknen gelassen, und dies wurde von 2 Stunden Trocknen in einem Vakuumofen bei 80ºC gefolgt. Die sich überlappenden Filter wurden 4 Stunden der Vorhybridisierung bei 55ºC mit 10 ml/Filter einer DNA-Hybridisierungspufferlösung (5·SSC) mit einem pH-Wert von 7,0 unterzogen, die 4·Denhardts Lösung (Polyvinylpyrrolidon, Ficoll® und Rinderserumalbumin, 1·=0,02%), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Natriumphosphatgepufferte Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 und 100 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthielt. Die Hybridisierung wurde 24 Stunden bei 42ºC mit 10&sup5; cpm/ml eines Oligonucleotidstarters durchgeführt. Die Filter wurden jeweils in einer Pufferlösung zum Waschen, die 0,1% SDS und eine verringerte Menge SSC enthielt, 30 Minuten bei 50ºC gewaschen. Die Filter wurden anschließend zuerst mit einer Pufferlösung gewaschen, die 2·SSC enthielt. Die Kontrollfilter, die unmutierte M13-P1-Plaques enthielten, wurden mittels eines Geigerzählers auf Radioaktivität untersucht. Während die SSC-Konzentration schrittweise verringert wurde, wurden die Kontrollfilter, die unmutierte M13- P1-Plaques enthielten, gewaschen, bis keine nachweisbare Radioaktivität auf den Filtern zurückblieb. Der Mindestwert der verwendeten SSC-Konzentrationen betrug 0,1·SSC. Man ließ die Filter an der Luft trocknen und Autoradiographien wurden durch 2 bis 3 Tage Belichten bei -70ºC aufgenommen. Das Screening wurde von 10000 mutierten M13-P1-Plaques und 100 unmutierten Kontrollplaques mittels einer Oligonucleotidsonde durchgeführt, die in Anwesenheit von γ-³²P-ATP mit Kinase behandelt wurde.
Keine der Kontrollplaques hybridisierten zu der Sonde, während 3 bis 10 der mutierten M13-P23-Plaques zu der Sonde hybridisierten.
Eine der mutierten M13-P1-Plaques wurde entnommen und in ein JM105-Kulturmedium eingeimpft. Aus dem sich daraus ergebenden Überstand wurde eine ssDNA hergestellt und aus den Bakterienzellpellets wurde eine doppelsträngige (ds)DNA hergestellt. Von den Basensequenzen wurden mittels geeigneter Oligonucleotidstarter und ssDNA Analysen angefertigt.
Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das TGT(Cys-88)-Kodon in ein TCT(Ser)-Kodon, beziehungsweise das TGT(Cys-93)-Kodon in ein TCT(Ser)-Kodon geändert worden war.
Von den mutierten M13-P1-Phagen wurde der Phage, in dem die Kodons Cys-26 und -88 Ser-kodierende Kodons geworden waren, M13- P13, und der Phage, in dem die Kodons Cys-26 und -93 Ser-kodierende Kodons geworden waren, M13-P14 genannt.

Beispiel 13

(Screening und Identifizierung mutagen gemachter Plaques)

Platten, die M13-P14-Phagenplaques enthielten, die durch das Verfahren von Beispiel 1 mittels eines synthetischen Oligomers [Fig. 2 (2) oder (3)] mutiert waren, und 2 Platten, die unmutierte M13-P14-Phagenplaques enthielten, wurden auf 4ºC gekühlt und die Plaques von jeder Platte wurden auf 2 Nitrocellulose-- Rundfilter überführt, indem ein trockenes Filter im Fall des ersten Filters 5 Minuten und im Fall des zweiten Filters 15 Minuten auf die Agarplatte gelegt wurde. Die Filter wurden anschließend 5 Minuten auf dicke Filterpapiere gelegt, die in 0,2N NaOH, 1,5M NaCl und 0,2% Triton X-100® eintauchten, wonach sie neutralisiert wurden, indem sie 5 Minuten auf Filterpapiere gelegt wurden, die in 0,5M Tris-HCl (pH 7,5) und 1,5M NaCl eintauchten. Die Filter wurden zweimal auf dieselbe Weise auf Filtern gewaschen, die in 2·SSC (Standard-Natriumcitrat) eintauchten und wurden trocknen gelassen und dies wurde von 2 Stunden Trocknen bei 80ºC in einem Vakuumofen gefolgt. Die sich überlappenden Filter wurden 4 Stunden einer Vorhybridisierung bei 55ºC mit 10 ml/Filter einer DNA-Hybridisierungspufferlösung (5·SSC) mit einem pH-Wert von 7,0 unterzogen, die 4·Denhardts Lösung (Polyvinylpyrrolidon, Ficoll® und Rinderserumalbumin, 1·= 0,02%), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Natriumphosphat-gepufferte Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 und 100 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthielt. Die Hybridisierung wurde 24 Stunden bei 42ºC mit 10&sup5; cpm/ml eines Oligonucleotidstarters durchgeführt. Jedes Filter wurde in einer Pufferlösung zum Waschen, die 0,1% SDS und eine verminderte Menge SSC enthielt, 30 Minuten bei 50ºC gewaschen. Die Filter wurden anschließend zuerst mit einer Pufferlösung gewaschen, die 2·SSC enthielt. Die Kontrollfilter, die unmutierte M13-P14-Plaques enthielten, wurden mittels eines Geigerzählers auf Radioaktivität untersucht. Während die SSC-Konzentration schrittweise verringert wurde, wurden die Kontrollfilter, die unmutierte M13- P14-Plaques enthielten, gewaschen, bis keine nachweisbare Radioaktivität auf den Filtern zurückblieb. Der Mindestwert der verwendeten SSC-Konzentrationen betrug 0,1·SSC. Man ließ die Filter an der Luft trocknen und Autoradiographien wurden durch 2 bis 3 Tage Belichten bei -70ºC aufgenommen. Das Screening wurde vom 10000 mutierten M13-P14-Plaques und 100 unmutierten Kontrollplaques mittels einer Oligonucleotidsonde, die mit Kinase in Anwesenheit von γ-³²P-ATP behandelt wurde, durchgeführt. Keine der Kontrollplaques hybridisierten zu der Sonde, während 3 bis 10 der mutierten M13-P14-Plaques zu der Sonde hybridisierten.
Eine der mutierten M13-P14-Plaques wurde entnommen und in ein JM105-Kulturmedium eingeimpft. Aus dem sich daraus ergebenden Überstand wurde eine ssDNA hergestellt und aus den Bakterienzellpellets wurde eine doppelsträngige (ds)DNA hergestellt. Analysen wurden von den Basensequenzen mittels geeigneter Oligonucleotidstarter und ssDNA angefertigt.
Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das TGT(Cys-70)-Kodon in ein TCT(Ser)-Kodon, beziehungsweise das TGT(Cys-93)-Kodon in ein TCT(Ser)-Kodon geändert wurde.
Von den mutierten M13-P14-Phagen wurde der Phage, in dem die Kodons Cys-26, -70 und -93 Ser-kodierende Kodons geworden waren, M13-P124, und der Phage, in dem die Kodons Cys-26, -88 und -93 Ser-kodierende Kodons geworden waren, M13-P134 genannt.

Beispiel 14

(Screening und Identifizierung mutagen gemachter Plaques)

Platten, die M13-P3-Phagenplaques enthielten, die durch das Verfahren von Beispiel 1 mittels eines synthetischen Oligomers [Fig. 2(4)] mutiert waren, und 2 Platten, die unmutierte M13- P3-Phagenplaques enthielten, die in Beispiel 1 erhalten wurden, wurden auf 4ºC gekühlt und die Plaques von jeder Platte wurden auf 2 Nitrocellulose-Rundfilter überführt, indem ein trockener Filter im Fall des ersten Filters 5 Minuten und im Fall des zweiten Filters 15 Minuten auf die Agarplatte gelegt wurde. Die Filter wurden anschließend 5 Minuten auf dicke Filterpapiere gelegt, die in 0,2N NaOH, 1,5M NaCl und 0,2% Triton X-100® eintauchten, wonach sie neutralisiert wurden, indem sie weitere 5 Minuten auf Filterpapieren gehalten wurden, die in 0,5M Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5 und 1,5M NaCl eintauchten. Die Filter wurden zweimal auf Filtern, die in 2·SSC (Standard-Natriumcitrat) eintauchten, auf dieselbe Weise gewaschen und wurden trocknen gelassen, und dies wurde von 2 Stunden Trocknen bei 80ºC in einem Vakuumofen gefolgt. Die sich überlappenden Filter wurden 4 Stunden bei 55ºC der Vorhybridisierung mit 10 ml/Filter einer DNA-Hybridisierungspufferlösung (5·SSC) mit einem pH- Wert von 7,0 unterzogen, die 4·Denhardts Lösung (Polyvinylpyrrolidon, Ficoll® und Rinderserumalbumin, 1·= 0,02%), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Natriumphosphat-gepufferte Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 und 100 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthielt. Die Hybridisierung wurde 24 Stunden bei 42ºC mit 10&sup5; cpm/ml eines Oligonucleotidstarters durchgeführt. Die Filter wurden jeweils in einer Pufferlösung zum Waschen, die 0,1% SDS und eine verringerte Menge SSC enthielt, 30 Minuten bei 50ºC gewaschen. Die Filter wurden anschließend zuerst mit einer Pufferlösung gewaschen, die 2·SSC enthielt. Die Kontrollfilter, die unmutierte M13-P3-Plaques enthielten, wurden mittels eines Geigerzählers auf Radioaktivität untersucht. Während die SSC-Konzentration schrittweise verringert wurde, wurden die Kontrollfilter, die unmutierte M13-P3-Plaques enthielten, gewaschen, bis keine nachweisbare Radioaktivität auf den Filtern zurückblieb. Der Mindestwert der verwendeten SSC- Konzentrationen betrug 0,1·SSC. Man ließ die Filter an der Luft trocknen und Autoradiographien wurden durch 2 bis 3 Tage Belichten bei -70ºC aufgenommen. Das Screening wurde von 10000 mutierten M13-P3-Plaques und 100 unmutierten Kontrollplaques mittels eines Oligonucleotidstarters durchgeführt, der mit Kinase in Anwesenheit von γ-³²P-ATP behandelt wurde. Keine der Kontrollplaques hybridisierten zu der Sonde, während 3 bis 10 der mutierten M13-P3-Plaques zu der Sonde hybridisierten.
Eine der mutierten M13-P3-Plaques wurde entnommen und wurde in ein JM105-Kulturmedium eingeimpft. Aus dem sich daraus ergebenden Überstand wurde eine ssDNA hergestellt, und aus den Bakterienzelipellets wurde eine doppelsträngige (ds)DNA hergestellt. Analysen der Basensequenzen wurden mittels eines geeigneten Oligonucleotidstarters und ssDNA ausgeführt.
Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das TGT(Cys-93)-Kodon in ein TCT(Ser)-Kodon geändert wurde.
Von den mutierten M13-P3-Phagen wurde der Phage, in dem die Kodons Cys-88 und -93 Ser-kodierende Kodons geworden waren, M13- P34 genannt.

Beispiel 15

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB776 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die in Beispiel 6 vorstehend erhaltene replikative Form (RF) M13-P12 wurde auf die in Beispiel 2 (1) beschriebene Weise behandelt, um das Plasmid pTB776 zur Human-bFGF-Mutein-Expression (Fig. 18) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB776 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB776 erhalten wurde, der das Plasmid pTB776 beherbergt, welches das in Fig. 17 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des in (2) vorstehend erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren durchgeführt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt aus E. coli MM294/pTB776 eine FGF-Aktivität auf.
Das Mutein CS12, in dem Cys in den 26- und 70-Positionen von Human-bFGF durch Ser ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 16

(Expression des Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB778 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die in Beispiel 6 vorstehend erhaltene replikative Form (RF) M13-P24 wurde auf die in Beispiel 2 (1) beschriebene Weise behandelt, um das Plasmid pTB778 zur Human-bFGF-Mutein-Expression (Fig. 20) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB778 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB778 erhalten wurde, der das Plasmid pTB778 enthält, welches das in Fig. 19 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des in (2) vorstehend erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren durchgeführt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt aus E. coli MM294/pTB778 FGF-Aktivität auf.
Das Mutein CS24, in dem Cys in den 70- und 93-Positionen von Human-bFGF durch Ser ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 17

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB779 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die in Beispiel 12 vorstehend erhaltene replikative Form (RF) M13-P13 wurde auf die in Beispiel 2 (1) beschriebene Weise behandelt, um das Plasmid pTB779 zur Human-bFGF-Mutein-Expression (Fig. 22) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB779 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB779 erhalten wurde, der das Plasmid pTB779 beherbergt, welches das in Fig. 21 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des in (2) vorstehend erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren durchgeführt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt von E. coli MM294/pTB779 FGF-Aktivität auf.
Das Mutein CS13, in dem Cys in der 26- und 88-Position von Human-bFGF durch Ser ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 18

(Expression des Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB763 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die in Beispiel 12 vorstehend erhaltene replikative Form (RF) M13-P14 wurde auf die in Beispiel 2 (1) beschriebene Weise behandelt, um das Plasmid pTB763 zur Human-bFGF-Mutein-Expression (Fig. 24) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB763 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB763 erhalten wurde, der das Plasmid pTB763 beherbergt, welches das in Fig. 23 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des in (2) vorstehend erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren durchgeführt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt von E. coli MM294/pTB763 FGF-Aktivität auf.
Das Mutein CS14, in dem Cys in der 26- und 93-Position von Human-bFGF durch Ser ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 19

(Expression des Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB777 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die in Beispiel 14 vorstehend erhaltene replikative Form (RF) M13-P34 wurde auf die in Beispiel 2 (1) beschriebene Weise behandelt, um das Plasmid pTB777 zur Human-bFGF-Mutein-Expression (Fig. 26) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB777 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB777 erhalten wurde, der das Plasmid pTB777 beherbergt, welches das in Fig. 25 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des in (2) vorstehend erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren durchgeführt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt von E. coli MM294/pTB777 FGF-Aktivität auf.
Das Mutein CS34, in dem Cys in der 88- und 93-Position von Human-bFGF durch Ser ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 20

(Expression des Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB782 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die in Beispiel 8 vorstehend erhaltene replikative Form (RF) M13-P234 wurde auf die in Beispiel 2 (1) beschriebene Weise behandelt, um das Plasmid pTB782 zur Human-bFGF-Mutein-Expression (Fig. 28) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB782 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB782 erhalten wurde, der das Plasmid pTB782 beherbergt, welches das in Fig. 27 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des in (2) vorstehend erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren durchgeführt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt von E. coli MM294/pTB782 FGF-Aktivität auf.
Das Mutein CS234, in dem Cys an der 70-, 88- und 93-Position von Human-bFGF durch Ser ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 21

(Expression des Gens, welches Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB780 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die in Beispiel 13 vorstehend erhaltene replikative Form (RF) M13-P124 wurde auf die in Beispiel 2 (1) beschriebene Weise behandelt, um das Plasmid pTB780 zur Human-bFGF-Mutein-Expression (Fig. 30) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB780 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB780 erhalten wurde, der das Plasmid pTB780 beherbergt, welches das in Fig. 29 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des in (2) vorstehend erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren durchgeführt.
Als Ergebnis zeigte der Bakterienzellextrakt von E. coli MM294/pTB780 FGF-Aktivität.
Das Mutein CS124, in dem Cys in der 26-, 70- und 93-Position von Human-bFGF durch Ser ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 22

(Expression des Gens, das Human-bFGF kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB781 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die in Beispiel 13 vorstehend erhaltene replikative Form (RF) M13-P134 wurde auf die in Beispiel 2 (1) beschriebene Weise behandelt, um das Plasmid pTB781 zur Human-bFGF-Mutein-Expression (Fig. 31) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB781 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB781 erhalten wurde, der das Plasmid pTB781 beherbergt, welches das in Fig. 32 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des in (2) vorstehend erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren durchgeführt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt aus E. coli MM294/pTB781 FGF-Aktivität auf.
Das Mutein CS134, in dem Cys in der 26-, 88- und 93-Position von Human-bFGF durch Ser ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 23

(Muteinproduktivitäten)

Bestimmungen der FGF-Aktivitäten von Bakterienzellextrakten, die entsprechende Muteine enthielten, wurden gemäß dem Verfahren von Referenzbeispiel 2 (2) durchgeführt, wodurch die Muteinproduktivitäten entsprechender Transformanten berechnet wurden. Die auf diese Weise erhaltenen Werte werden in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Plasmid Mutein Produktivität (mg-ptFGF/1 Kultur)

Beispiel 24

(Reinigung von hbFGF-Mutein)

Transformanten, die entsprechende Muteine produzierten, wurden durch das in Referenzbeispiel 2 beschriebene Verfahren kultiviert, wodurch Bakterienzellextrakte hergestellt wurden. 25 ml jedes Extrakts (aus 500 ml Kulturmedium hergestellt) wurden durch eine Säule (Φ2·10 cm) aus DEAE-Cellulose (DE52, Wattman®, Inc., Großbritannien) hindurchgeführt, die mit einer Lösung äquilibriert war, die 20 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,4 und 0,2M NaCl enthielt, wodurch die Nukleinsäurebestandteile in dem Extrakt entfernt wurden. Das aus der Säule Ausfließende und die Waschungen, die sich aus dem Waschen der Säule mit einer Lösung ergaben, die 20 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,4 und 0,2M NaCl enthielt, wurden vereinigt und gesammelt (DEAE ausfließende Fraktion, 60 ml).
Diese Fraktion wurde der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mittels eines Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (Gilson, Inc., Frankreich) unterzogen, der mit einer Shodex AF- pak HR-894®-Heparinsäule (8 mm ID·5 cm, hergestellt von Showa Denko, Japan) beladen war. Nach dem Waschen der Säule mit einer 20 mM Tris-HCl-Lösung mit einem pH-Wert von 7,4 und anschließend mit einer Lösung, die 20 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,4 und 0,5M NaCl enthielt, wurde eine lineare Gradientenelution mit dem NaCl-Gradienten von 0,5M bis 2M (60 ml Volumen, 1,0 ml/Min. Fließgeschwindigkeit) in einem Puffer durchgeführt, der 20 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,4 enthielt.
Die Elutionsmuster entsprechender Muteine werden in den Fig. 33 bis 35 dargestellt. In diesen Figuren stellen die Ordinaten Absorptionen für OD280 und NaCl-Konzentrationen in dem Gradienten dar. Die Abszissen stellen die Zeit dar, wobei die Gradientenelution zum Zeitpunkt 0 begonnen wurde. Peakfraktionen wurden gesammelt und ihre FGF-Aktivitäten wurden untersucht. Deren spezifische Aktivitäten nach der Reinigung sind in Tabelle 4 dargestellt.

RTabelle 4

Mutein Spezifische Aktivität (mg-ptFGF/mg Protein)
CS1 0,4
CS2 0,9
CS3 1,0
CS4 1,0
CS12 0,5
CS13 0,5
CS14 0,3
CS23 1,1
CS24 0,8
CS34 0,5
CS123 0,4
CS124 0,1
CS134 0,5
CS234 0,9
CS1234 0,1
rhbFGF 1,0
In Tabelle 4 werden die spezifischen Aktivitäten auf der Grundlage der FGF-Aktivität von aus Rinderhirn stammendem FGF (Reinheit nicht weniger als 95%), das von Takara Shuzo Co., Ltd., hergestellt wurde, dargestellt.
Bei allen Muteinen wurde der dem Peak I von bFGF entsprechende Peak bei einer Elutionszeit zwischen 15 und 25 Minuten eluiert. Diese kann auch als eine einzelne Bande an der Position von Molekulargewicht etwa 17000 bei der 17,25% SDS Polyacrylamidgelelektrophorese nachgewiesen werden.

Beispiel 25

(Oxidation von FGF-Muteinen)

Jedes Mutein, das von einer Heparin-HPLC-Säule eluiert wurde, und bFGF wurden getrennt zweimal 3 Stunden bei 4ºC gegen eine 1000fache Volumenmenge destilliertes Wasser dialysiert, und dieses wurde von der Lyophilisierung gefolgt. 200 ug (Proteingrundlage) jeder trockenen Standardprobe wurden in 200 ul einer Oxidationsreaktionsflüssigkeit [50 mM Tris-HCl (pH 8,5)/0,2M NaCl/1 mg/ml BSA/20 mM H&sub2;O&sub2;] gelöst und die Oxidation wurde 30 Minuten bei 37ºC durchgeführt.
Die Lösung wurde anschließend durch eine Heparin-HPLC-Säule hindurchgeleitet und das Muster, das bei der Elution mit dem Salzgradienten zwischen 0,6 M und 2M erschien, wurde untersucht. Die erhaltenen Elutionsmuster werden in Fig. 36 dargestellt. Bei bFGF waren die Peaks im allgemeinen niedrig, während bei CS2, CS3 und CS23 der dem Peak I entsprechende Peak hoch war; diese Peakerhöhung war besonders bei CS3 und CS23 zu bemerken.
Dies legt nahe, daß CS3 und CS23 gegen Oxidation stabil sind. Außerdem eluierte das Protein in allen Fällen CS2, CS3 und CS23, als Peak, der FGF-Aktivität aufwies.

Beispiel 26

(Reduktion von FGF-Muteinen)

200 ug (Proteingrundlage) jeder auf dieselbe Weise wie in Beispiel 25 erhaltenen, lyophilisierten Standardprobe wurden in 200 ul einer Reduktionsreaktionsflüssigkeit [50 mM Tris-HCl (pH 8,5)/0,2M NaCl/1 mg/ml BSA/20 mM Dithiothreit (DTT)] gelöst und die Reduktion wurde 30 Minuten bei 37ºC durchgeführt.
Die Lösung wurde anschließend durch eine Heparin-HPLC-Säule hindurchgeführt und das Muster, das bei der Elution mit dem Salzgradienten zwischen 0,6 M und 2M erschien, wurde untersucht. Die erhaltenen Elutionsmuster werden in Fig. 37 dargestellt. Bei bFGF und CS2 war der Peak I entsprechende Peak zu bemerken und es wurde nahegelegt, daß die anderen Peaks (Peaks II bis IV) der Oxidation zuzuschreiben sind. Es wurde ferner nahegelegt, daß bei CS3 und CS23 der Peak durch Oxidation nicht beeinflußt wird. Das heißt, dies unterstützt die in Beispiel 25 erwähnte Stabilität. Von bFGF und den als diese Peaks eluierten Muteinen wurde gefunden, daß sie FGF-Aktivität besitzen.

Beispiel 27

(Herstellung rekombinanter DNA mit einer Mutein-kodierenden Basensequenz)

(1) Klonieren von M13-Vektor für ein Human-bFGF-Gen

Das in Referenzbeispiel 2 erhaltene Plasmid pTB669 wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI verdaut. Die DNA in replikativer Form (RF) des Phagenvektors M13mp8 [J. Messing, Methods in Enzymology, 101, 20-78 (1983)] wurde mit einem aus pTB669 stammenden Human-bFGF-DNA-Fragment gemischt, das zuvor mit EcoRI und BamHI verdaut wurde. Das Gemisch wurde anschließend der Ligation mittels T4-DNA-Ligase unterzogen. Die sich daraus ergebende ligierte DNA wurde in infizierbare Zellen des Stamms Escherichia coli JM105 transformiert. Die Transformantenzellen wurden über eine Platte ausgestrichen, deren Indikatorarten Xgal waren [J. Messing et al., Nucleic Acids Research, 9, 309-321 (1981)]; die den rekombinanten Phagen enthaltende Plaque (weiße Plaque) wurde ausgewählt. Die Basensequenz der rekombinierten Region wurde durch das Dideoxynukleotidsynthese-Kettenabbruchsverfahren [J. Messing et al., Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)] bestimmt, wodurch bestätigt wurde, daß die Human-bFGF- DNA ordnungsgemäß inseriert wurde.
Aus diesem M13-PO-Klon wurde eine einzelsträngige Phagen-DNA gereinigt, die als Vorlage für eine ortsgerichtete Mutagenese mittels eines synthetischen Oligonucleotids verwendet wurde.

(2) Ortsspezifische Mutagenese

In Anwesenheit von 0,1 mM Adenosintriphosphat (ATP), 50 mM Hydroxymethylaminomethan-hydrochlorid (Tris-HCl) mit einem pH- Wert von 8,0, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiotreit (DTT) und 9 Einheiten T4-Kinase in einer Gesamtmenge von 50 ul wurden 40 Picomol des synthetischen Oligonucleotids:
5 ' -CGGGCATGAATTCGCCGCT-3'
[Starter zum Herstellen einer Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym EcoRI in der Basensequenz und nachfolgend Ändern von Pro-14 in Met (siehe Fig. 38 (2)] 1 Stunde mit T4-Kinase bei 37ºC behandelt. Dieser Kinase-behandelte Starter (12 Picomol) wurde 5 Minuten bei 67ºC und 25 Minuten bei 42ºC in 50 ul eines Gemischs erhitzt, das 50 mM NaCl, 1,0 mM Tris-HCl mit einem pH- Wert von 8,0, 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM J3-Mercaptoethanol enthielt, wodurch es zu 5 ug der einzelsträngigen (ss)M13-PO-DNA hybridisiert wurde. Das wiederhergestellte Gemisch wurde anschließend auf Eis gekühlt und wurde 50 ul eines Reaktionsgemischs zugesetzt, das 0,5 mM Deoxynukleotidtriphosphat (dNTP), 80 mM Tris- HCl mit einem pH-Wert von 7,4, 8 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 9 Einheiten DNA-Polymerease-I-Klenow-Fragment, 0,5 mM ATP und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase enthielt, und die Reaktion wurde 3 Stunden bei 37ºC und 2 Stunden bei 25ºC durchgeführt, wonach die Reaktion durch Hinzufügen von 2 ul 0,2 mM EDTA angehalten wurde. Das Reaktionsprodukt wurde zum Transformieren infizierbarer JM105-Zellen verwendet. Man ließ die Transformantenzellen über Nacht wachsen, wonach eine ssDNA aus dem Überstand des Kulturmediums isoliert wurde. Mittels dieser ssDNA als Vorlage für den zweiten Zyklus der Starterverlängerung wurde gelgereinigte DNA vom RF-Typ in infizierbare JM105-Zellen transformiert. Die sich daraus ergebenden Transformantenzellen wurden über eine Agarplatte ausgestrichen und zum Erhalten von Phagenplaques über Nacht kultiviert.

(3) Ortsgerichtete Mutagenese

Das Verfahren des vorstehenden Absatzes (2) wurde wiederholt, aber der verwendete synthetische Oligonucleotidstarter war: 5'CGCCCATGGTGCCATCCTC-3', das in der Basensequenz eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym NcoI erzeugt und gleichzeitig Gly-9 in Thr und Ser-10 in Met verändert. [Siehe Fig. 38 (1).]

(4) Ortsgerichtete Mutagenese

Das Verfahren des vorstehenden Absatzes (2) wurde wiederholt, aber der verwendete synthetische Oligonucleotidstarter war: 5'- TAACACCTTAAGAAGCCAG-3', der in der Basensequenz eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym Af1II erzeugt und gleichzeitig das Lys-87-kodierende Kodon in ein Endkodon ändert. [Siehe-Fig. 38 (3).]

(5) Ortsgerichtete Mutagenese

Das Verfahren des vorstehenden Absatzes (2) wurde wiederholt, aber der verwendete synthetische Oligonucleotidstarter war: 5'CCGGACTCCGTTAACTCGG-3', der in der Basensequenz eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym HpaI erzeugt und gleichzeitig Asp-42 in Asn verändert. [Siehe Fig. 38 (4).]

(6) Ortsgerichtete Mutagenese

Das Verfahren des vorstehenden Absatzes (2) wurde wiederholt, aber der verwendete synthetische Oligonucleotidstarter war: 5'- CTTCTCCTGGACTCCGTCAAC-3', der die Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym HpaII in der Basensequenz löscht und gleichzeitig Arg-45 in Gln ändert. [Siehe Fig. 38 (5).]

(7) Screening und Identifizierung von Plaques, die mutagen waren

Platten, die mutierte M13-PO-Plaques enthielten [vorstehender Abschnitt (1)], und 2 Platten, die unmutierte M13-PO-Phagenplaques erhielten, wurden auf 4ºC gekühlt und die Plaques von jeder Platte wurden auf 2 Nitrocellulose-Rundfilter überführt, indem ein trockener Filter im Falle des ersten Filters 5 Minuten und im Falle des zweiten Filters 15 Minuten auf die Agarplatte gelegt wurde. Die Filter wurden anschließend 5 Minuten auf dicke Filterpapiere gelegt, die in 0,2N NaOH, 1,5M NaCl und 0,2% Triton X-100® eintauchten, wonach sie neutralisiert wurden, indem sie 5 weitere Minuten auf Filterpapiere gelegt wurden, die in 0,5M Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5 und 1,5M NaCl eintauchten. Die Filter wurden zweimal auf Filtern, die in 2·SSC (Standard-Natriumcitrat) eintauchten, auf dieselbe Weise gewaschen und wurden trocknen gelassen, und dies wurde von 2 Stunden Trocknen bei 80ºC in einem Vakuumofen gefolgt. Die sich überlappenden Filter wurden 4 Stunden der Vorhybridisierung bei 55ºC mit 10 ml/Filter einer DNA-Hybridisierungspufferlösung (5·SSC) mit einem pH-Wert von 7,0 unterzogen, die 4·Denhardts Lösung (Polyvinylpyrrolidon, Ficoll® und Rinderserumalbumin, 1·=0,02%), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Natriumphosphatgepufferte Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 und 100 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthielt. Die Hybridisierung wurde 24 Stunden bei 42ºC mit 10&sup5; cpm/ml eines Oligonucleotidstarters durchgeführt. Jeder Filter wurde 30 Minuten bei 50ºC in einer Pufferlösung zum Waschen, die 0,1% SDS und eine verringerte Menge SSC enthielt, gewaschen. Die Filter wurden anschließend zuerst mit einer Pufferlösung gewaschen, die 2·SSC enthielt. Die Kontrollfilter, die unmutierte M13-PO-Plaques enthielten, wurden mittels eines Geigerzählers auf Radioaktivität untersucht. Während die SSC-Konzentration schrittweise verringert wurde, wurden die Kontrollfilter, die unmutierte M13-PO-Plaques enthielten, gewaschen, bis keine nachweisbare Radioaktivität auf den Filtern verblieb. Der Mindestwert der verwendeten SSC-Konzentrationen betrug 0,1·SSC. Man ließ die Filter an der Luft trocknen und Autoradiographien wurden durch 2 bis 3 Tage Belichten bei -70ºC aufgenommen. Das Screening wurde von 10000 mutierten M13-PO-Plaques und 100 unmutierten Kontrollplaques mittels einer Oligonucleotidsonde durchgeführt, die mit ³²P-γ-ATP behandelt war. Keine der Kontrollplaques hybridisierte zu der Sonde, während 3 bis 10 der mutierten M13-PO-Plaques zu der Sonde mutierten.
Eine der mutierten M13-PO-Plaques wurde entnommen und wurde in JM105-Kulturmedium eingeimpft. Aus dem sich daraus ergebenden Überstand wurde eine ssDNA hergestellt, und aus den Bakterienzellpellets wurde eine doppelsträngige (ds)DNA hergestellt. Analysen wurden von den Basensequenzen mittels geeigneter Oligonucleotidstarter und ssDNA angefertigt.
Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das GGC(Gly-9)-Kodon in ein ACC(Thr)-Kodon geändert wurde und das AGC(Ser-10)-Kodon in ein ATG(Met)-Kodon geändert worden war, das CCG(Pro-14)-Kodon in ein ATG(Met)-Kodon, das AAA(Lys-87)-Kodon in ein TAA(End-)-Kodon, das GAC(Asp-42)-Kodon in ein AAC(Asn-42)-Kodon, beziehungsweise das CGG(Arg-45)-Kodon in ein CAG(Gln-45)-Kodon geändert worden war.
Von den mutierten M13-PO-Phagen wurde der Phage, in dem ein Gly- 9-Kodon ein Thr-kodierendes Kodon und das Ser-10-Kodon ein Metkodierendes Kodon geworden war, M13-PN10 [seine Basensequenz und die dadurch kodierte Aminosäurensequenz werden in Fig. 39 dargestellt]; der Phage, in dem das Pro-14-Kodon ein Met-kodierendes Kodon geworden war, M13-PN14 [seine Basensequenz und die dadurch kodierte Aminosäurensequenz werden in Fig. 40 dargestellt]; der Phage, in dem das Lys-87-Kodon ein Endkodon geworden war, M13-PC86 [seine Basensequenz und die dadurch kodierte Aminosäurensequenz werden in Fig. 41 dargestellt]; der Phage, in dem das Asp-42-Kodon ein Asn-kodierendes Kodon geworden war, M13-PDN42 [seine Basensequenz und die dadurch kodierte Aminosäurensequenz werden in Fig. 42 dargestellt]; und der Phage, in dem das Arg-45-Kodon ein Gln-kodierendes Kodon geworden war, M13-PRQ45 genannt [seine Basensequenz und die dadurch kodierte Aminosäurensequenz werden in Fig. 43 dargestellt].

Beispiel 28

(Herstellung rekombinanter DNA mit Mutein-kodierender Basensequenz)

(1) Ortsgerichtete Mutagenese

In Anwesenheit von 0,1 mM Adenosintriphosphat (ATP, 50 mM Hydroxymethylaminomethan-hydrochlorid (Tris-HCl) mit einem pH-Wert von 8,0, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit (DTT) und 9 Einheiten T4- Kinase in einer Gesamtmenge von 50 ul wurden 40 Picomol des synthetischen Oligonucleotids:
5'-CGGACTCCTCTAACTCGGC-3'
[Starter zum Löschen der Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym HpaI in der Basensequenz und anschließend Ändern von Asn- 42 in Arg (siehe Fig. 38 (6)] mit T4-Kinase 1 Stunde bei 37ºC behandelt. Dieser Kinase-behandelte Starter wurde 5 Minuten auf 67&sup0;G und 25 Minuten auf 42ºC in 50 ul eines Gemischs erhitzt, das 50 mM NaCl, 1,0 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 8,0, 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM β-Mercaptoethanol enthielt, wodurch es zu 5 ug der einzelsträngigen (ss)M3-PDN 42-DNA hybridisiert wurde. Das wiederhergestellte Gemisch wurde anschließend auf Eis gekühlt und wurde 50 ul eines Reaktionsgemischs zugesetzt, das 0,5 mM Deoxynukleotidtriphosphat (dNTP), 80 mM Tris-HCl mit einem pH- Wert von 7,4, 8 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 9 Einheiten DNA-Polymerase-I-Klenow-Fragment, 0,5 mM ATP und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase enthielt, und die Reaktion wurde 3 Stunden bei 37ºC und 2 Stunden bei 25ºC durchgeführt, wonach die Reaktion durch Zusetzen von 2 ul EDTA angehalten wurde. Das Reaktionsprodukt wurde zum Transformieren infizierbarer JM105-Zellen verwendet. Die Transformantenzellen wurden über Nacht wachsen gelassen, wonach eine ssDNA aus dem Überstand des Kulturmediums isoliert wurde. Mittels dieser ssDNA als Vorlage für den zweiten Zyklus der Starterverlängerung wurde gelgereinigte DNA vom RF-Typ in infizierbare JM105-Zellen transformiert. Die sich daraus ergebenden Transformantenzellen wurden über eine Agarplatte ausgestrichen und zum Erhalten von Phagenplaques über Nacht kultiviert.

(2) Screening und Identifizierung mutagen gemachter Plaques

Platten, die M13-PDN42-Phagenplaques enthielten, die durch das Verfahren von Beispiel 26 mittels eines synthetischen Oligomers [Fig. 38 (6)] mutiert wurden, und 2 Platten, die unmutierte, in Beispiel 26 erhaltene M13-PDN42-Phagenplaques enthielten, wurden auf 4ºC gekühlt, und die Plaques von jeder Platte wurden auf 2 Nitrocellulose-Rundfilter überführt, indem ein trockener Filter im Fall des ersten Filters 5 Minuten und im Fall des zweiten Filters 15 Minuten auf die Agarplatte gelegt wurde. Die Filter wurden anschließend 5 Minuten auf dicke Filterpapiere gelegt, die in 0,2N NaOH, 1,5M NaCl und 0,2% Triton X-100® eintauchten, wonach sie neutralisiert wurden, indem sie 5 weitere Minuten auf Filterpapiere gelegt wurden, die in 0,5M Tris-HCl mit einem pH- Wert von 7,5 und 1,5M NaCl eintauchten. Die Filter wurden zweimal auf Filter, die in 2·SSC (Standard-Natriumcitrat) eintauchten, auf dieselbe Weise gewaschen und wurden trocknen gelassen, und dies wurde von 2 Stunden Trocknen in einem Vakuumofen bei 80ºC gefolgt. Die sich überlappenden Filter wurden 4 Stunden der Vorhybridisierung bei 55ºC mit 10 ml/Filter einer DNA-Hybridisierungspufferlösung (5·SSC) mit einem pH-Wert von 7,0 unterzogen, die 4·Denhardts Lösung (Polyvinylpyrrolidon, Ficoll® und Rinderserumalbumin, 1·= 0,02%), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Natriumphosphat-gepufferte Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 und 100 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthielt. Die Hybridisierung wurde 24 Stunden bei 42ºC mit 10&sup5; cpm/ml eines Oligonucleotidstarters durchgeführt. Jeder Filter wurde in einer Pufferlösung, die 0,1% SDS und eine verringerte Menge SSC enthielt, 30 Minuten bei 50ºC gewaschen. Die Filter wurden anschließend zuerst mit einer 2·SSC enthaltenden Pufferlösung gewaschen. Die Kontrollfilter, die unmutierte M13- PDN42-Plaques enthielten, wurden mittels eines Geigerzählers auf Radioaktivität untersucht. Während die SSC-Konzentration schrittweise verringert wurde, wurden die Kontrollfilter, die unmutierte M13-PDN42-Plaques enthielten, gewaschen, bis keine nachweisbare Radioaktivität auf den Filtern zurückblieb. Der Mindestwert der verwendeten SSC-Konzentrationen betrug 0,1 x SSC. Man ließ die Filter an der Luft trocknen und Autoradiographien wurden durch 2 bis 3 Tage Belichten bei -70ºC aufgenommen. Das Screening wurde von 10000 mutierten M13-PDN42-Plaques und 100 unmutierten Kontrollplaques mittels einer Oligonucleotidsonde durchgeführt, die in Anwesenheit von ³²P-γ-ATP mit Kinase behandelt war. Keine der Kontrollplaques hybridisierte zu der Sonde, während 3 bis 10 der mutierten M13-PDN42-Plaques zu der Sonde hybridisierten.
Eine der mutierten M13-PDN42-Plaques wurde entnommen und wurde in ein JM105-Kulturmedium eingeimpft. Aus dem sich daraus ergebenden Überstand wurde eine ssDNA hergestellt, und aus den Bakterienzellpellets wurde eine doppelsträngige (ds)DNA hergestellt. Analysen wurden von der Basensequenz mittels eines geeigneten Oligonucleotidstarters und ssDNA angefertigt.
Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das AAC(Asn-42)-Kodon in ein AGA(Arg)-Kodon geändert worden war.
Von den mutierten M13-PDN42-Phagen wurde der Phage, in dem das Asn-42-Kodon ein Arg-kodierendes Kodon geworden war, M13-PNR42 genannt. Seine Basensequenz und die dadurch kodierte Aminosäurensequenz werden in Fig. 44 dargestellt.

Beispiel 29

(Stabilitäten der Muteine CS2, CS3 und CS23)

Untersuchungen der Stabilitäten von Human-bFGF, das durch Heparin-HPLC gereinigt war, und den Muteinen CS2, CS3 und CS23 (den in Beispiel 24 erhaltenen) unter sauren Bedingungen wurden wie folgt durchgeführt: die Muteine und Human-bFGF wurden in Lösung in 50 mM Na-Acetat (pH 4,0), das auf 1 ug/ml Konzentration eingestellt war, getrennt bei 37ºC inkubiert. Die Inkubationszeit schwankte zwischen 0 und 1 Stunde in Intervallen von 10 Minuten, und die Aktivitäten für die entsprechenden Inkubationszeiten wurden mittels des Maus-BALB/c3T3-Zellsystems (vorstehend angeführt) bestimmt. Die Aktivitäten für entsprechende Inkubationszeiten wurden in Prozentverhältnissen berechnet, die auf den Aktivitäten nicht-inkubierter Standardproben, die als 100% angenommen werden, beruhen und wurden zum Erhalten der in Fig. 45 dargestellten Grafiken aufgetragen. In Fig. 45 zeigen beziehungsweise die Ergebnisse von Human-bFGF, dem Mutein CS2, dem Mutein CS3 und dem Mutein CS23 an. Human-bFGF inaktivierte sich selbst innerhalb 10 Minuten fast vollständig, während die Muteine über längere Zeiträume in der abnehmenden Reihenfolge CS2, CS3 und CS23 aktiv blieben. Das Mutein CS23 erhielt selbst 20 Minuten später etwa 50% Aktivität. Als Ergebnis erwies es sich, daß diese Muteine eine größere Stabilität als die von Human-bFGF besitzen.

Beispiel 30

(Das Wachstum menschlicher vaskulärer Nabelschnurendotheliumszellen fördernde Aktivitäten der Muteine)

Bestimmungen der das Wachstum vaskulärer Endotheliumszellen fördernden Aktivitäten von Human-bFGF, das durch Heparin-HPLC gereinigt war, und der Muteine CS2, CS3 und CS23 (die in Beispiel 24 erhaltenen) wurden durchgeführt. Das für die Bestimmungen verwendete Verfahren ist wie folgt: menschliche vaskuläre Endotheliumszellen wurden aus einer menschlichen Nabelschnurvene durch Perfusion mittels einer Trypsinlösung erhalten und wurden durch Subkultur mittels eines flüssigen Mediums, das durch Hinzufügen von 2,5% fetalem Rinderserum und 2,0 ng/ml Human-bFGF zu GIT-Medium (hergestellt von Daigo Eiyo Kagaku K.K., Japan) hergestellt wurde, aufrechterhalten. In eine 96-Näpfchen-Kulti vierungsplatte (Nunc, 1-67008) wurden 100 ul einer Suspension von 2·10³ menschlichen vaskulären Endotheliumszellen eingeimpft, und dies wurde von der Kultivierung in einer Kammer mit konstanter Temperatur, die mit Kohlendioxid gefüllt war, gefolgt. Am nächsten Tag wurde FGF in einer solchen Menge, daß die Endkonzentration 2 ng/ml betrug, und 100 ul eines Proben in verschiedenen Konzentrationen enthaltenden Mediums zugesetzt. Nach 3 Tagen Kultivierung wurde das die Probe enthaltende Medium abgedampft und 100 ul einer 1 mg/1 ml MTT-Lösung (hergestellt durch Auflösen von 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H- tetrazoliumbromid im Medium) wurden zugesetzt, und dies wurde von 4 Stunden Inkubation gefolgt. 100 ul einer 10%igen SDS- Lösung (wäßrige Lösung von Natriumdodecylsulfat) wurden anschließend zugesetzt und die Inkubation wurde 5 bis 6 Stunden durchgeführt, um die Zellen und das MTT-Pigment in Lösung zu dringen, wonach der OD&sub5;&sub9;&sub0;-Wert mittels eines Spektrophotometers bestimmt wurde. Die Berechnungen der Zellvermehrungsraten für entsprechende Probenkonzentrationen in Prozentverhältnissen, die auf der maximalen Vermehrungsrate beruhen, die mit 8,0 ng/ml Human-bFGF, das als 100% angenommen wurde, erhalten wurden, werden durchgeführt, und Bestimmungen der spezifischen Aktivitäten wurden durch Vergleichen der Konzentrationen, die sich bei 50% Vermehrungsrate ergaben, mit der Konzentration einer Standard-FGF-Probe durchgeführt. Die auf diese Weise erhaltenen spezifischen Aktivitäten werden in Tabelle 5 dargestellt.

Tabelle 5

FGF Spezifische Aktivität
CS2 1,6
CS3 3,0
CS23 2,5
Human-bFGF 1,0
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde erkannt, daß die Muteine in der spezifischen Aktivität höher als Human-bFGF sind.

Beispiel 31

(Angioneogenesewirksamkeiten von Muteinen, bestimmt durch das CAM-Verfahren)

Untersuchungen der angioneogenetischen Wirksamkeit in vivo von Human-bFGF, der durch Heparin-HPLC gereinigt wurde, und der Muteine CS2, CS3 und CS23 (die in Beispiel 24 erhaltenen) wurden durchgeführt. Das Verfahren erfolgte durch den CAM(chorio-allantoische Membran)-Test. Eine leicht veränderte Technik des Auerbachschen Verfahrens [Developmental Biology, 41, 391 (1974)] wurde als CAM-Test verwendet. Nach 3 Tagen Inkubation bei 37ºC in einem Inkubator wurden die Schalen befruchteter Hühnereier entfernt und wurden eine weitere Woche mittels eines Napco- Kohlendioxidinkubators 6300 (CO&sub2;: 0%, H&sub2;O: gesättigt) bei 37ºC inkubiert. Eine wäßrige Lösung jedes Proteins wurde über Polypropylenscheiben mit einem Durchmesser von 6 mm so getüpfelt, daß jedes Protein in Mengen von 6,25, 12,5, 25,0 und 50,0 ng vorlag. Nach dem Lufttrocknen in einem sauberen Abzug wurden die Scheiben 3 weitere Tage bei 37ºC inkubiert, während sie auf einer chorio-allantoischen Membran aus Hühnern standen, und Beobachtungen der Angiogenesezustände wurden mittels eines stereoskopischen Mikroskops durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle 6 dargestellt. NB: Insgesamt wurden für jede Probe 18 Eier verwendet, und die Zahlen in der Tabelle stellen die Zahlen der Eier, in denen eine Angiogenese bemerkt wurde, als Prozentverhältnis dar. Tabelle 6 FGF Angiogenesewirksamkeit Human-bFGF Träger
Aus Tabelle 6 ist offensichtlich, daß die bFGF-Muteine Angiogenesewirksamkeiten besitzen, die denen des Kontroll-Human-bFGF nahezu gleichwertig sind.

Beispiel 32

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB854 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die in Beispiel 27 vorstehend erhaltene replikative Form (RF) M13-PN10 wurde auf die in Beispiel 2 (1) beschriebene Weise behandelt, um das Plasmid pTB854 für das Human-bFGF-Mutein (Fig. 46) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB854 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB854 erhalten wurde, der das Plasmid pTB854 beherbergt, welches das in Fig. 39 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des in (2) vorstehend erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren durchgeführt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt aus E. coli MM294/pTB854 FGF-Aktivität auf.
Das Mutein TM910, in dem Gly an der 9-Position und Ser an der 10-Position von Human-bFGF durch Thr beziehungsweise Met ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 33

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB852 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die DNA des Plasmids pTB854, das in dem vorstehenden Beispiel 32 erhalten wurde, wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NcoI so gespalten, um das DNA-Fragment zu entfernen, das die 10 Aminosäurereste des N-Endes von Human-bFGF kodiert. Der einzelsträngige Teil des verbleibenden DNA-Fragments wurde durch Verwendung von Escherichia coli-DNA-Polymerase I in Anwesenheit von dATP, dCTP, dGTP, dTTP an dem stumpfen Ende befestigt und durch Einsetzen einer T4-DNA-Ligationsreaktion unter Aufbauen des Plasmids pTB852 für das Human-bFGF-Mutein (Fig. 47) ligiert.
Mittels dieses Plasmids 852 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB852, der das Plasmid pTB852 beherbergt, welches das in Fig. 48 dargestellte, Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des in (2) vorstehend erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren durchgeführt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt aus E. coli MM294/pTB852 FGF-Aktivität auf. Das Mutein N10, in dem die Aminosäurensequenz von Pro an der 2-Position bis Ser an der 10- Position von Human-bFGF entfernt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 34

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB795 für die Human-bFGF-Mutein-Expression

Die in Beispiel 27 vorstehend erhaltene replikative Form (RF) M13-PN14 wurde auf die in Beispiel 2 (1) beschriebene Weise unter Aufbauen des Plasmids pTB795 für das Human-bFGF-Mutein (Fig. 49) behandelt.
Mittels dieses Plasmids pTB795 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB795 (IFO 14700, FERM BP-1660) erhalten wurde, der das Plasmid pTB795 enthält, welches das in Fig. 40 dargestellte, Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des in (2) vorstehend erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren durchgeführt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt aus E. coli MM294/pTB795 FGF-Aktivität auf. Das Mutein N14, in dem die Aminosäurensequenz von Pro in der 2-Position bis Pro in der 14- Position von Human-bFGF entfernt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 35

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB796 für die Human-bFGF-Mutein-Expression

Die in Beispiel 27 vorstehend erhaltene replikative Form (RF) M13-PC86 wurde auf die in Beispiel 2 (1) beschriebene Weise unter Aufbauen des Plasmids pTB796 für das Human-bFGF-Mutein (Fig. 50) behandelt.
Mittels dieses Plasmids pTB796 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB796 (IFO 14701, FERM BP-1661) erhalten wurde, der das Plasmid pTB796 enthält, welches das in Fig. 41 dargestellte, Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Der vorstehend in (2) erhaltene Zellextrakt wurde einem Enzymimmuntest (EIA), Sandwichverfahren, mittels monoklonaler Antikörper, wie nachstehend in (a) bis (j) gezeigt, unterzogen.
Als Ergebnis wird bestätigt, daß bFGF-Mutein C86 im Zellextrakt vorhanden ist. Das Mutein C86, in dem die Aminosäurensequenz von Lys an der &sup8;&sup7;-Position bis Ser an der ¹&sup4;&sup7;-Position entfernt worden ist, wurde auf diese Weise erhalten.
Der EIA mittels eines monoklonalen Antikörpers wurde durch das folgende Verfahren ausgeführt:

(a) Immunisierung

³ALB/c-Mäusen (männlich, 4 Wochen alt) wurde das Antigen HumanbFGF (wie in Referenzbeispiel 2 erhalten) in Lösung in 0,4 ml Freundschem kompletten Adjuvans (Difco Laboratories, USA) intraperitoneal injiziert. Drei Wochen später wurden 10 ug des Antigens hbFGF in Lösung in 0,4 ml Freundschem unvollständigem Adjuvans intraperitoneal verabreicht. Weitere drei Wochen später wurde dieselbe zusätzliche Immunisierung durchgeführt, und zwei Wochen später wurden 10 ug Human-bFGF in Lösung in physiologischer Kochsalzlösung intraperitoneal eingeimpft.

(b) Zellfusion

Aus den in (a) erwähnten immunisierten Mäusen wurde die Milz 4 Tage nach der letzten Antigenverabfolgung herausgeschnitten, um dadurch Zellen zu erhalten, die zur Zellfusion verwendet werden. Diese Zellen wurden in einem Medium suspendiert, das durch Zusammenmischen von Isokov-Medium und Ham F-12-Medium im Verhältnis von 1 : 1 hergestellt wurde (nachstehend als 1H-Medium bezeichnet).
Die Maus-Myelomzelle P3-X63-Ag 8UI wurde in RPMI 1640-Medium, das 10% fetales Rinderserum enthielt, unter einer Atmosphäre aus 5% Kohlendioxid und 95% Luft subkultiviert.
Die Zellfusion wurde gemäß dem von Köhler und Milstein [Köhler, G. und Milstein, C.: Nature, 256, 495 (1975)] eingeführten Verfahren ausgeführt. 2,9·10&sup7; Zellen der vorstehenden Myelomzelllinie und 1,5·10&sup8; durch das vorgenannte Verfahren erhaltene immunisierte Lymphozyten wurden zusammengemischt und zentrifugiert und 45% Polyethylenglykol 6000 (nachstehend als PEG 6000 bezeichnet) in Lösung in 0,3 ml 1H-Medium wurde tropfenweise zugesetzt. Die PEG 6000-Lösung wurde auf 37ºC vorerhitzt und wurde allmählich zugesetzt. Fünf Minuten später wurde das auf 37ºC vorerhitzte 1H-Medium in einer Geschwindigkeit von 0,5 ml je Minute zugesetzt, um auf 10 ml aufzufüllen. Die Lösung wurde anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur bei 600 Upm zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Diese Zellfällung wurde in 200 ml 1H-Medium suspendiert, das 20% Kälberserum enthielt, und diese Suspension wurde in eine 24-Näpfchen-Mikroplatte (Linbro) in einer Menge von 2 ml je Näpfchen überführt. Einen Pag später wurde 1H-Medium (das 20% Kälberserum enthielt), welches mit HAT (1·10&supmin;&sup4;M Hypoxanthin, 4·10&supmin;&sup7;M Aminopterin, 1,6·10&supmin;&sup5;M Thymidin) (nachstehend als HAT-Medium bezeichnet) ergänzt war, der Mikroplatte in einer Menge von 1 ml je Näpfchen zugesetzt, und weitere drei Tage später wurde die Hälfte der Mediumsmenge durch HAT-Medium ersetzt. Die auf diese Weise gezüchteten Zellen sind Hybridzellen.

(c) Suche nach Antikörper-produzierenden Zellen

Zuvor wurde der Überstand der Hybridzellkultur in einer Menge von 100 ul je Näpfchen einer 96-Näpfchen-Mikrotiterplatte zugesetzt, die aus Polystyrol bestand, an welcher Human-bFGF immobilisiert worden war, und die Inkubation wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Inkubationsüberstand wurde entfernt und nach dem Waschen wurde mit Meerrettichperoxidase (HRP) -markierter Anti-Maus-IgG-Ziege-Antikörper (Miles Laboratories) als sekundärer Antikörper zugesetzt und die Inkubation wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Der sekundäre Antikörper wurde entfernt und nach gründlichem Waschen der Näpfchen wurde eine Farbreaktion in Anwesenheit zugesetzten Reaktionssubstrats (EIA-Verfahren) durchgeführt. Durch dieses Verfahren wurde in 3 Näpfchen eine starke Wirksamkeit beobachtet.

(d) Klonieren von Hybridzellen

Zellen in jeder dieser drei Zellen wurden zu 0,5 Zellen je Näpfchen in eine 96-Näpfchen-Mikrotiterplatte eingeimpft, in die 10&sup4; Zellen/Näpfchen Mausthymozyten als vegetative Zellen eingeimpft worden waren, und das Klonieren wurde durchgeführt. Als Ergebnis wurden drei Klone, und zwar das Maushybridom HbF52 (IFO 50143) und das Maushybridom HbF78 (IFO 50144), erhalten.

(e) Aszitesbildung von Hybridzellen

Jeweils 2·10&sup6; Zellen des Maushybridoms HbF52 oder des Maushybridoms HbF78 wurde Mäusen eingeimpft, denen zuvor Mineralöl intraperitoneal verabreicht worden war. Zehn Tage später wurde aus jeder Maus Aszites in einer Menge von 2 ml gesammelt, wodurch der monoklonale Antikörper MoAb52, beziehungsweise der monoklonale Antikörper MoAb78 erhalten wurde.
(f) Der auf diese Weise erhaltene monoklonale Antikörper MoAb78 wurde der Reinigung von der Aszitesflüssigkeit gemäß dem Verfahren von Stachelin et al., The Journal of Biological Chemistry, 256, 9750 (1981), unterzogen. Auf diese Weise erhaltener Antikörper wurde auf mehr als 2 mg/ml konzentriert und der Dialyse in 0,2M Phosphatpuffer (pH 7,0) unterzogen. Auf diese Weise erhaltenen 1,4 ml MoAb78-Lösung (Konzentration 2,8 mg/ml) wurden 50 ul in N,N'-Dimethylformamid gelöstes S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid (Aldrich Co., USA) so zugesetzt, daß die Konzentration 11,5 mg/ml betrug. Die Luft in dem Reaktionsgefäß wird durch Stickstoffgas ersetzt. Das Gefäß wurde verschlossen und so dem Rühren unterzogen, daß die Reaktion zum Einführen von SH-Gruppen bewirkt wird. Das unumgesetzte S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid wurde durch 10 Minuten Behandlung mit 130 ul 0,2M Tris·HCl (pH 7,0), 13 ul 0,2M EDTA und 130 ul 2M Hydroxyamin (pH 7,0) desaktiviert. Der MoAb78 wurde durch Gelfiltration mittels einer Säule, die mit Sephadex G-25® (Durchmesser 1 cm·80 cm, Farmacia, Schweden) gepackt war, gewonnen (Fließgeschwindigkeit: 20 ml/Stunde).
(g) 10 mg Meerrettichperoxidase (HRP, Boehringer Mannheim, Qualität I, West-Deutschland) wurden in 1,4 ml = 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8) gelöst. Auf der anderen Seite wurden 14 mg N-Hydroxysuccinimidester von N-(4-Carboxycyclohexylmethyl)maleimid in 335 ul DMF gelöst, und 100 ul der auf diese Weise erhaltenen Lösung wurden der vorgenannten HRP-Lösung zugesetzt. Die Luft in dem Reaktionsgefäß wurde durch Stickstoffgas ersetzt und das Gefäß wurde verschlossen. Nach 1 Stunde Reaktion bei Raumtemperatur wurden Proteine des Teils des monoklonalen MoAb78, die in den SH-Gruppen eingeführt wurden, durch Gelfiltration mittels einer mit Sephadex G-25 wie vorstehend in (f) gepackten Säule gewonnen.
(h) 6 ml des vorstehend in (f) erhaltenen Teils des monoklonalen Antikörpers MoAb78, in den eine SH-Gruppe eingeführt wurde, und 2 ml des vorstehend in (g) erhaltenen Teils von HRP, in den eine Maleimidgruppe eingeführt wurde, wurden gemischt und das Gemisch wurde mittels eines Collodionbeutels (Sartorius, West-Deutschland) unter vermindertem Druck 20 Stunden bei 4ºC auf 1 ml eingeengt. Nach der Reaktion wurde das unumgesetzte HRP, in das eine SH-Gruppe eingeführt wurde, unter Verwendung einer Ultrogel AcA44-Säule (LKB Co., Durchmesser 1 cm·80 cm, Schweden) entfernt (Fließgeschwindigkeit: 10 ml/Stunde). In den Eluaten besaß die 2,4 HRP/Antikörper-enthaltende Fraktion die höchste HRP-Zahl je Antikörpermolekül. Das auf diese Weise Erhaltene wurde in dem EIA unter dem folgenden Punkt (i) eingesetzt.
(i) Der vorstehend in (e) erhaltene monoklonale Antikörper MoAb52 wurde auf die vorstehend in (f) beschriebene Weise gereinigt. Der monoklonale Antikörper MoAb52 wurde mit PBS so verdünnt, daß er 10 ug/ml oder 20 ug/ml betrug, und das Verdünnungsmittel wurde so auf eine Immunoplatte (Nunc, Dänemark) gegossen, daß es 100 ul/Näpfchen betrug. Man ließ die Platte über Nacht bei 4ºC stehen, um den monoklonalen Antikörper MoAb52 an der Platte zu adsorbieren. Nach Entfernen des Antikörpers, der nicht adsorbiert ist, wurde die Platte dreimal gewaschen, 0,01% Merthiolat enthaltendes PBS und 1% Rinderserumalbumin (BSA) wurden der Platte zu 200 ul/Näpfchen zugesetzt und die Platte wurde über Nacht bei 4ºC stehenlassen.
(j) Der vorstehend in (2) erhaltene Zellextrakt, der bFGF-Mutein C86 enthielt, wurde mit 0,1% BSA enthaltendem PBS verdünnt. Von der vorstehend in (i) erhaltenen Platte wurde die BSA-Lösung entfernt, die Platte wurde viermal mit PBS gewaschen, und das verdünnte bFGF-Mutein C86 wurde der Platte zu 100 ul/Näpfchen zugesetzt, so daß es über Nacht bei 4ºC adsorbiert wurde. Das unumgesetzte Mutein C86 wurde entfernt und die Platte wurde viermal mit PBS gewaschen. Der monoklonale Antikörper, der mit vorstehend in (h) erhaltenem HRP konjugiert war, wurde mit 0,1% BSA enthaltendem PBS auf 1/300 verdünnt und das Verdünnungsmittel wurde der Platte so zugesetzt, daß 100 ul/Näpfchen vorlagen. Die Reaktion wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Entfernen des Antikörpers wurde die Platte 6 Mal mit PBS gewaschen, ein Substrat für Oxidase (Bio. Rad Co. USA) wurde der Platte so zugesetzt, daß 100 ul/Näpfchen vorlagen. Die mengenmäßige Bestimmung wurde durch Absorptionsmessungen bei 415 nm bewerkstelligt und es wurde bestätigt, daß eine geringe Menge Mutein C86 erzeugt wurde.

Beispiel 36

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB797 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die vorstehend in Beispiel 27 erhaltene replikative Form (RF) M13-PDN42 wurde auf die in Beispiel 2 (1) beschriebene Weise behandelt, um das Plasmid pTB797 für das Human-bFGF-Mutein (Fig. 51) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB797 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB797 (IFO 14702, FERM BP-1662) erhalten wurde, der das Plasmid pTB797 beherbergt, welches das in Fig. 42 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

Die vorgenannte Transformante wurde durch das in Beispiel 2 (2) beschriebene Verfahren unter Ergeben eines Überstands kultiviert, welcher anschließend als Bakterienzellextrakt verwendet wurde.

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des vorstehend in (2) erhaltenen Zellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren durchgeführt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt aus E. coli MM294/pTB797 FGF-Aktivität auf. Das Mutein DN42, in dem Asp in der 42-Position des Human-bFGF durch Asn ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 3

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB799 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die vorstehend in Beispiel 27 erhaltene replikative Form (RF) M13-PRQ45 wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 (1) behandelt, um das Plasmid pTB799 für das Human-bFGF-Mutein (Fig. 52) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB799 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB799 erhalten wurde, der das Plasmid pTB799 beherbergt, welches das in Fig. 43 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des vorstehend in (2) erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren durchgeführt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt aus E. coli MM294/pTB799 FGF-Aktivität auf. Das Mutein RQ45, in dem Arg in der 45-Position des Human-bFGF durch Gln ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 38

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB798 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die vorstehend in Beispiel 28 beschriebene replikative Form (RF) M13-PNR42 wurde auf die in Beispiel 2 (1) beschriebene Weise behandelt, um das Plasmid pTB798 für das Human-bFGF-Mutein (Fig. 53) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB798 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB798 erhalten wurde, der das Plasmid pTB798 beherbergt, welches das in Fig. 44 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des vorstehend in (2) erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren durchgeführt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt aus E. coli MM294/pTB798 FGF-Aktivität auf. Das Mutein NR42, in dem Asp an der 42-Position des Human-bFGF durch Arg ersetzt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 39

(Herstellung rekombinanter DNA mit einer Mutein-kodierenden Basensequenz)

(1) Ortsspezifische Mutagenese

In Anwesenheit von 0,1 mM Adenosintriphosphat (ATP), 50 mM Hydroxymethylaminomethan-hydrochlorid (Tris-HCl) mit einem pH- Wert von 8,0, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiotreit (DTT) und 9 Einheiten T4-Kinase in einer Gesamtmenge von 50 ul wurden 40 Picomol des synthetischen Oligonucleotids: 5'-TCTTCTCCAGGGATCCGTT-3' [Starter zum Hinzufügen der Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym BamHI in der Basensequenz und darauffolgendes Ändern von Val-44 in Ser und Arg 45 in Leu [siehe Fig. 38 (7)] 1 Stunde bei 37ºC mit T4-Kinase behandelt. Dieser Kinase-behandelte Starter wurde in 50 ul eines Gemischs, das 50 mM NaCl, 1,0 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 8,0, 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM β- Mercaptoethanol enthielt, 5 Minuten auf 67ºC und 25 Minuten auf 42ºC erhitzt, wodurch er zu 5 ug der einzelsträngigen (ss)M3-PDN 42-DNA hybridisiert wurde. Das wiederhergestellte Gemisch wurde anschließend auf Eis gekühlt und wurde 50 ul eines Reaktionsgemisches zugesetzt, das 0,5 mM Deoxynukleotidtriphosphat (dNTP), 80 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,4, 8 mM MgCl&sub2;, 100 nM NaCl, 9 Einheiten DNA-Polymerase-I-Klenow-Fragment, 0,5 mM ATP und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase enthielt, und die Reaktion wurde 3 Stunden bei 37ºC und 2 Stunden bei 25ºC durchgeführt, wonach die Reaktion durch Hinzufügen von 2 ul EDTA angehalten wurde. Das Reaktionsprodukt wurde zum Transformieren infizierbarer JM105-Zellen verwendet. Man ließ die Transformantenzellen über Nacht wachsen, wonach eine ssDNA aus dem Überstand des Kulturmediums isoliert wurde. Mittels dieser ssDNA als Vorlage für den zweiten Zyklus der Starterverlängerung wurde gelgereinigte DNA vom RF-Typ in infizierbare JM105-Zellen transformiert. Die sich daraus ergebenden Transformantenzellen wurden über eine Agarplatte ausgestrichen und über Nacht zum Erhalten von Phagenplaques kultiviert.

(2) Screening und Identifizierung mutagen gemachter Plaques

Platten, die M13-PDN42-Phagenplaques enthielten, die durch das Verfahren von Beispiel 27 mittels des synthetischen Oligomers (Oligonucleotid) [Fig. 38 (7)] mutiert waren, und 2 Platten, die unmutierte M13-PDN42-Phagenplaques enthielten, die in Beispiel 26 erhalten wurden, wurden auf 4ºC gekühlt und die Plaques von jeder Platte wurden auf 2 Nitrocellulose-Rundfilter überführt, indem ein trockenes Filter 5 Minuten im Fall des ersten Filters und 15 Minuten im Fall des zweiten Filters auf die Agarplatte gelegt wurden. Die Filter wurden anschließend 5 Minuten auf dicke Filterpapiere gelegt, die in 0,2N NaOH, 1,5M NaCl und 0,2% Triton X-100® eintauchten, wonach sie neutralisiert wurden, indem sie 5 weitere Minuten auf Filterpapiere gelegt wurden, die in 0,5M Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5 und 1,5M NaCl eintauchten. Die Filter wurden zweimal auf Filtern, die in 2·SSC (Standard-Natriumcitrat) eintauchten, auf dieselbe Weise gewaschen und trocknen gelassen, und dies wurde von 2 Stunden Trocknen in einem Vakuumofen bei 80ºC gefolgt. Die sich überlappenden Filter wurden 4 Stunden der Vorhybridisierung bei 55ºC mit 10 ml/Filter einer DNA-Hybridisierungspufferlösung (5·SSC) mit einem pH-Wert von 7,0 unterzogen, die 4·Denhardts Lösung (Polyvinylpyrrolidon, Ficoll® und Rinderserumalbumin, 1·=0,02%), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Natriumphosphat-gepufferte Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 und 100 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthielt. Die Hybridisierung wurde 24 Stunden bei 42ºC mit 10&sup5; cpm/ml eines Oligonucleotidstarters durchgeführt. Jeder Filter wurde in einer Pufferlösung, die 0,1% SDS und eine verringerte Menge SSC enthielt, 30 Minuten bei 50ºC gewaschen. Die Filter wurden anschließend mit einer Pufferlösung, die 2·SSC enthielt gewaschen. Die Kontrollfilter, die unmutierte M13-PDN42-Plaques enthielten, wurden mittels eines Geigerzählers auf Radioaktivität untersucht. Während des schrittweisen Verringern der SSC-Konzentration wurden die Kontrollfilter, die unmutierte M13-PDN42-Plaques enthielten, gewaschen, bis keine nachweisbare Radioaktivität auf den Filtern zurückblieb. Der Mindestwert der verwendeten SSC-Konzentrationen betrug 0,1·SSC. Man ließ die Filter an der Luft trocknen und Autoradiographien wurden durch 2 bis 3 Tage Belichten bei -70ºC aufgenommen. Das Screening wurde von 10000 mutierten M13-PDN42- Plaques und 100 unmutierten Kontrollplaques mittels einer Oligonucleotidsonde durchgeführt, die in Anwesenheit von ³²P-γ-ATP mit Kinase behandelt war. Keine der Kontrollplaques hybridisierte zu der Sonde, während 3 bis 10 der mutierten M13-PDN42-Plaques zu der Sonde hybridisierten.
Eine der mutierten M13-PDN42-Plaques wurde entnommen und in ein JM105-Kulturmedium eingeimpft. Aus dem sich daraus ergebenden Überstand wurde eine ssDNA hergestellt, und aus den Bakterienzellpellets wurde eine doppelsträngige (ds)DNA hergestellt. Analysen wurden von der Basensequenz mittels eines geeigneten Oligonucleotidstarters und ssDNA angefertigt.
Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das GTC(Val-44)-Kodon und CGG(Arg-45)-Kodon in das TCC(Ser)-Kodon beziehungsweise das CTG(Leu)-Kodon geändert wurden.
Von den mutierten M13-PDN42-Phagen wurde der Phage, in dem das Val-44-Kodon und Arg-45-Kodon ein Ser-kodierendes Kodon beziehungsweise Leu-kodierendes Kodon geworden waren, M13-PINT genannt. Seine Basensequenz und die dadurch kodierte Aminosäurensequenz werden in Fig. 54 dargestellt.

(3) Aufbau des Plasmids pTB853 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die vorstehend in (2) erhaltene replikative Form (RF) M13-PINT wurde auf die in Beispiel 2 (1) beschriebene Weise behandelt, um das Plasmid pTB853 für das Human-bFGF-Mutein (Fig. 55) aufzubauen.
Mittels dieses Plasmids pTB853 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB853 erhalten wurde, der das Plasmid pTB853 enthält, welches das in Fig. 54 dargestellte Mutein-kodierende Gen enthält.

(4) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(5) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des vorstehend in (4) erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren angestellt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt aus E. coli MM294/pTB853 FGF-Aktivität auf. Das Mutein FINT, in dem Asp in der 42-Position, Val in der 44-Position und Arg in der 45-Position von Human-bFGF durch Asn, Ser beziehungsweise Leu ersetzt worden waren, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 40

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB855 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die DNA des Plasmids pTB669, das in dem vorgenannten Referenzbeispiel 2 erhalten wurde, wurde mit dem Restriktionsenzym HincII gespalten, und es wurde mit dem EcoRI-Linker p(5'CAT- GAATTCATG3') in einer T4-DNA-Ligasereaktion ligiert. Die auf diese Weise erhaltene DNA wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und PstI weiter gespalten, um ein DNA-Fragment mit etwa 0,35 kb zu erhalten. Dieses DNA-Fragment wurde mit dem in Beispiel 2 (1) erhaltenen DNA-Fragment mit etwa 3,2 kb ligiert. Das Fragment, das durch Spalten des Plasmids ptrp781 mit EcoRI-PstI erhalten wurde, um das Plasmid pTB855 zur Human-bFGF-Mutein- Expression zu erhalten, wurde aufgebaut (Fig. 56).
Mittels dieses Plasmids 855 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB855 erhalten wurde, der das Plasmid pTB855 mit dem in Fig. 57 dargestellten Mutein-kodierenden Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

(3) Human-bFGF-Aktivität des Bakterienzellextrakts

Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität des vorstehend in (2) erhaltenen Bakterienzellextrakts wurde durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren durchgeführt.
Als Ergebnis wies der Bakterienzellextrakt aus E. coli MM294/pTB855 FGF-Aktivität auf. Das Mutein N41, in dem die Aminosäurensequenz von Pro in der 2-Position bis Val in der 41- Position von Human-bFGF entfernt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 41

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in Escherichia coli)

(1) Aufbau des Plasmids pTB856 zur Human-bFGF-Mutein-Expression

Die DNA des Plasmids pTB669, die in dem vorgenannten Referenzbeispiel 2 erhalten wurde, wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI teilweise gespalten, um die BamHI-Erkennungsstelle in dem bFGF- Gen zu erhalten. Die Stelle wurde weiter mit Escherichia coli- DNA-Polymerase I in Anwesenheit von dATP, dCTP, dGTP, dTTP unter Ergeben eines stumpfen Endes weiter gespalten. Diese DNA wird mit dem Nhel-Linker p(5'CTAGCTAGCTAG3') in einer T4-DNA-Ligasereaktion ligiert. Nach dem Behandeln mit dem Restriktionsenzym Nhel und Ligieren der gespaltenen Stelle in einer T4-DNA-Ligasereaktion wurde das Plasmid pTB856 zur Human-bFGF-Mutein-Expression aufgebaut (Fig. 58).
Mittels dieses Plasmids pTB856 wurde Escherichia coli MM294 transformiert, wodurch der Stamm Escherichia coli MM294/pTB856 erhalten wurde, der das Plasmid pTB856 mit dem in Fig. 59 dargestellten Mutein-kodierenden Gen enthält.

(2) Herstellung von Bakterienzellextrakt

Die vorgenannte Transformante wurde durch das Verfahren wie in Beispiel 2 (2) unter Ergeben eines Überstands kultiviert, der anschließend als Bakterienzellextrakt verwendet wurde.
(3) Der vorstehend in (2) erhaltene Zellextrakt wurde einem Enzymimmuntest (EIA), Sandwichverfahren, auf die in Beispiel 35 (3) beschriebene Weise unterzogen. Als Ergebnis wird bestätigt, daß bFGF-Mutein im Zellextrakt vorhanden ist. Das Mutein C129, in dem die Aminosäurensequenz von Lys an der 130-Position bis Ser an der 147-Position entfernt worden war, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 4

(Expression eines Gens, das Human-bFGF-Mutein kodiert, in einer tierischen Zelle)

(1) Aufbau der Plasmide pTB831, pTB833 und pTB835 zur HumanbFGF-Expression

Das Plasmid pTB762, das vorstehend in Beispiel 7 erhalten wurde, wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI-BamHI unter Erhalten eines DNA-Fragments mit 0,38 kb gespalten, das eine kodierende Region enthält, die Human-bFGF-Mutein CS23 kodiert, worin Cys in der 70-Position und in der 88-Position durch Ser ersetzt worden war.
Auf der anderen Seite wurde das Plasmid pTB504 [Beispiel 1 (ii) des japanischen offengelegten Patentes Nr. 62-175182, das der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 225 701 entspricht] mit dem Restriktionsenzym Clal-EcoRI gespalten, um ein DNA-Fragment mit 1,7 kb zu erhalten, das eine Mausleukämievirus(MuLV)LTR- Region, einen frühen SV40-Promotor, eine Spleißverbindung und eine Human-Interleukin-2(IL-2)-Leadersequenz enthält.
Weiter wurde das Plasmid pTB627, das in Referenzbeispiel 1 erhalten wurde, mit dem Restriktionsenzym ClaI-EcoRI gespalten, um ein DNA-Fragment mit 2 kb zu ergeben, und das Plasmid pTB389 wurde mit dem Restriktionsenzym Clal-EcoRI gespalten, um ein DNA-Fragment mit 2,6 kb zu ergeben. Das auf diese Weise erhaltene DNA-Fragment mit 2 kb und das DNA-Fragment mit 2,6 kb wurden ligiert, um das Plasmid pTB675 zu ergeben, das Human-bFGF kodiert. Das vorstehende Plasmid pTB389 wurde durch Überführen jeder Pstl-Spaltungsstelle an der Region des 5'-Endes und der BamHI-Spaltungsstelle an der Region des 3'-Endes der Interleukin-2-Genregion des Plasmids pTB106 (offenbart in dem offengelegten japanischen Patent Nr. 61-63282, das der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 172 619 entspricht) in EcoRI unter Entfernen der Interleukin-2-Genregion erhalten. Anschließend wurde das Plasmid pTB675 mit den Restriktionsenzymen ClaI-BamHI unter Ergeben eines DNA-Fragments mit 3,4 kb gespalten, das eine Kodierungsregion für Aminosäuren am C-Ende von Human-bFGF, eine nicht-kodierende Region, ein Ampicillin-resistentes Gen, das aus dem Plasmid pBR322 stammt, und einen Replikationsstartpunkt in Escherichia coli enthält.
Die vorstehenden drei DNA-Fragmente (d. h. das DNA-Fragment mit 0,38 kb, das DNA-Fragment mit 1,7 kb und das DNA-Fragment mit 3,4 kb) wurden durch Verwendung von T4-DNA-Ligase unter Ergeben des Plasmids pTB831 (Fig. 60) ligiert.
Auf ähnliche Weise wurde das in Beispiel 18 erhaltene Plasmid pTB763, welches das Human-bFGF-Mutein CS14 kodiert (in dem Cys an der 26- und 93-Position von Human-bFGF durch Ser ersetzt worden war) oder das in Beispiel 11 erhaltene Plasmid pTB765, das das Human-bFGF-Mutein CS1234 kodiert (in dem Cys an der 26-, 70-, 88- und 93-Position von Human-bFGF durch Ser ersetzt worden war) anstelle des Plasmids pTB762 in dem vorstehenden Verfahren verwendet, wodurch das Plasmid pTB833 beziehungsweise das Plasmid pTB835 aufgebaut wurden.

(2) Expression in tierischen Zellen

Affen-COS-Zellen wurden in Gewebekulturschalen mit 6 cm Durchmesser mit DMEM-Medium eingeimpft, das 10% fetales Kälberserum enthielt, und nach 24 Stunden wurde das Kulturmedium durch frisches ersetzt. Nach 4 Stunden wurden 10 ug DNA der Plasmide pTB831, pTB833 oder pTB835 in die COS-Zellen gemäß dem Calciumphosphatverfahren [Graham et al., Virology, 52, 456 (1972)] transfiziert. Am nächsten Tag wurde das Kulturmedium durch DMEM- Medium ersetzt, das 1% fetales Kälberserum enthielt. Nach 48 Stunden Kultivierung wurde die Kulturbrühe einschließlich Zellen gesammelt und die Zellen wurden isoliert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und anschließend in PBS suspendiert. Die Suspension wurde durch Ultraschallbehandlung über eine kurze Zeit behandelt und anschließend 15 Minuten der Zentrifugation bei 15000 upm unter Ergeben eines Überstands unterzogen.
Eine Bestimmung der Human-bFGF-Aktivität wurde an der Kulturbrühe der COS-Zellen, die mit dem Plasmid infiziert waren und an dem Extrakt aus den Zellen durch das in Beispiel 2 (3) beschriebene Verfahren angestellt. Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7 Plasmid Mutein FGF-Aktivität ng/Scheibe Kulturbrühe Extrakt aus Zellen

Claims

1. Mutein des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF), das ein Ersatztyp-Mutein oder eine Kombination eines Ersatztyp- Muteins und eines Auslassungstyp-Muteins ist, wobei

ein Ersatztyp-Mutein ein Mutein ist, in welchem wenigstens einer der vier Cysteinreste in der Sequenz der den Naturtyp-bFGF bildenden Aminosäuren durch eine andere Aminosäure als Cystein ersetzt ist, und

ein Auslassungstyp-Mutein ein Mutein ist, in welchem dem Aminoende der Sequenz der den Naturtyp-bFGF bildenden Aminosäuren eine bis 41 Aminosäuren fehlen und/oder dem Carboxyende der Sequenz der den Naturtyp-bFGF bildenden Aminosäuren eine bis 61 Aminosäuren fehlen.

2. Mutein wie in Anspruch 1 beansprucht, in welchem der Naturtyp-bGFG in seinem Molekül die Aminosäuresequenz:

Phe-Phe-Leu-Arg-Ile-His-Pro-Asp-Gly-Arg-Val-Asp-Gly-Val- Arg-Glu-Lys -Ser-Asp-Pro

enthält.

3. Mutein wie in Anspruch 1 und 2 beansprucht, in welchem die neu eingeführte Aminosäure eine neutrale Aminosäure ist.

4. Mutein wie in Anspruch 3 beansprucht, in welchem die neutrale Aminosäure aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Glycin, Valin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Tyrosin, Phenylalanin, Histidin, Tryptophan, Serin, Threonin und Methionin besteht.

5. Mutein wie in Anspruch 4 beansprucht, in welchem die natürliche Aminosäure Serin oder Threonin ist.

6. Mutein wie in Anspruch 5 beansprucht, in welchem die neutrale Aminosäure Serin ist.

7. Mutein wie in Anspruch 6 beansprucht, in welchem der Cysteinrest in Position 70 des Human-bFGF durch Serin ersetzt ist.

8. Mutein wie in Anspruch 6 beansprucht, in welchem der Cysteinrest in Position 88 des Human-bFGF durch Serin ersetzt ist.

9. Mutein wie in Anspruch 6 beansprucht, in welchem die Cysteinreste in Position 70 und in Position 88 des Human-bFGF durch Serin ersetzt sind.

10. Mutein wie in Anspruch 1 beansprucht, in welchem dem Aminoende der den bFGF bildenden Aminosäuren wenigstens eine Aminosäure fehlt.

11. Mutein wie in Anspruch 1 beansprucht, in welchem dem Carboxylende der den bFGF bildenden Aminosäuren wenigstens eine Aminosäure fehlt.

12. Rekombinante DNA mit einer Basensequenz, die für das in einem der Ansprüche 1-11 beanspruchte Mutein aus dem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) kodiert.

13. Rekombinante DNA wie in Anspruch 12 beansprucht, in welcher die neu eingeführte Aminosäure eine neutrale Aminosäure ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Glycin, Valin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Tyrosin, Phenylalanin, Histidin, Tryptophan, Serin, Threonin und Methionin besteht.

14. Rekombinante DNA wie in Anspruch 13 beansprucht, in welcher die neu eingeführte Aminosäure Serin ist.

15. Rekombinante DNA wie in Anspruch 12 beansprucht, in welcher dem Aminoende oder dem Carboxylende der den bFGF bildenden Aminosäuren wenigstens eine Aminosäure fehlt.

16. Transformante, die einen Vektor beherbergt, der eine rekombinante DNA mit einer Basensequenz enthält, welche für das in einem der Ansprüche 1-11 definierte Mutein des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) kodiert.

17. Transformante wie in Anspruch 16 beansprucht, in welcher die neu eingeführte Aminosäure eine neutrale Aminosäure ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Glycin, Valin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Tyrosin, Phenylalanin, Histidin, Tryptophan, Serin, Threonin und Methionin besteht.

18. Transformante wie in Anspruch 17 beansprucht, in welcher die neu eingeführte Aminosäure Serin ist.

19. Transformante wie in Anspruch 16 beansprucht, in welcher dem Aminoende oder dem Carboxylende der den bFGF bildenden Aminosäuren wenigstens eine Aminosäure fehlt.

20. Verfahren zum Herstellen eines Muteins des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF), welches das Kultivieren einer Transformanten, die einen Vektor beherbergt, der eine rekombinante DNA mit einer Basensequenz enthält, welche für das in einem der Ansprüche 1-11 definierte Mutein des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) kodiert, in einem Kulturmedium unter Erzeugen und Anreichern des Muteins in der Kulturbrühe umfaßt.

21. Verfahren wie in Anspruch 20 beansprucht, wobei die neu eingeführte Aminosäure eine neutrale Aminosäure ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Glycin, Valin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Tyrosin, Phenylalanin, Histidin, Tryptophan, Serin, Threonin und Methionin besteht.

22. Verfahren wie in Anspruch 21 beansprucht, wobei die neu eingeführte Aminosäure Serin ist.

23. Verfahren wie in Anspruch 20 beansprucht, wobei dem Aminoende oder dem Carboxylende der den Naturtyp-bFGF bildenden Aminosäuren wenigstens eine Aminosäure fehlt.