JP3385040B2 - グリア活性化因子およびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はグリオーマ細胞培養液よ
り得られ、グリア細胞、線維芽細胞等に対して増殖促進
作用を示す、新規なポリペプチドであるグリア活性化因
子、該因子をコードするＤＮＡ、および該因子製造のた
めの組換えＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞成長因子は、多種のものが発見、研
究され、活用されてきている（細胞成長因子 part II、
日本組織培養学会編、1987、朝倉書店）。たとえば、上
皮細胞成長因子（ＥＧＦ，Epidermal Growth Facto
r）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ，Platelet-Derive
d Growth Factor）や酸性あるいは塩基性線維芽細胞増
殖因子（ａＦＧＦもしくはｂＦＧＦ， acidic or basic
Fibroblast Growth Factor）などである。これらは、
いずれも線維芽細胞株の増殖促進を指標として単離され
てきたものであり、その作用スペクトラムは広いが、特
異性に乏しい。近年、機能分化した細胞に特異的に作用
する増殖因子を探す努力が試みられつつあり、ケラチノ
サイト成長因子（ＫＧＦ Keratinocyte Growth Facto
r）、肝実質細胞成長因子（ＨＧＦ Hepatocyte Growth
Factor）等が単離され、その特異的な作用スペクトラム
から疾患への適用が期待されている。脳神経細胞は、生
後すぐに増殖を止め、以後、その数を減じて行く。近
年、老年での脳疾患、特に痴呆症が問題となってきてい
るが、これは、原因不明、あるいは損傷等による脳神経
細胞の死滅によることが判ってきた。このような脳神経
細胞の死滅を防ぎ止めるためには、これらの細胞を賦活
化することが必要である。グリア細胞は脳内で神経細胞
のまわりをとり囲んでおり、脳神経細胞の生存を支持し
ている。グリア細胞が放出しているであろう神経栄養因
子の探索は、きわめて広く行われてきたが、まだ決定的
な因子は見出されていない。グリア細胞は、その形態、
および働きから、Ｉ型アストロサイト、II型アストロサ
イト、オリゴデンドロサイト等に分類されている。これ
らのグリア細胞を賦活化することは、それ自身では分裂
増殖することのない脳神経細胞を賦活、維持することと
なり、脳疾患改善の重要な方策となってきている。この
ため、脳神経細胞のみならず、グリア細胞に作用する増
殖因子は渇望されてきた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】前記のように、グリア
細胞に作用する増殖因子は、脳神経細胞の賦活化を目ざ
して、探索されており、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ等が、グリア
細胞に対しても増殖促進作用を示すことが知られてい
る。しかし、これらの因子は、他の細胞種に対する増殖
促進作用も強く、思うようには医薬品として使用され得
てはいない。グリア細胞に、より特異的に作用している
因子を探し、これを医薬品として活用することは脳疾患
の改善の方策として期待されていたが、現在まで、この
ような因子は得られていない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】一般的に、多くの細胞は
自分自身の増殖を促す増殖促進因子を産生していること
が知られるようになってきた。そこで本発明者らは、グ
リア細胞が産生する、グリア細胞に対する増殖促進因子
について探索した。この結果、グリア細胞が該因子を産
生していることを見出したが、ヒト・グリア細胞をヒト
から採取することはできず、また、一般にそのままで維
持、培養できる細胞はない。そこで、グリア細胞として
の形質を残しているグリオーマ細胞株を用いて検討を重
ね、この因子（グリア活性化因子、GliaActivating Fac
tor，以下ＧＡＦと略称することがある。）を単離、精
製した。

【０００５】一方、ヒトグリオーマ細胞より得られたＧ
ＡＦは極めて微量であり、医薬品として、あるいは研究
材料として使用するため充分な量を得るには、大量のグ
リア細胞を培養するための時間と労力が必要とされる。
そこで本発明者等は、さらにＧＡＦをより簡便に得るた
めに、ＧＡＦをコードするポリヌクレオチドを同定し、
該ポリヌクレオチドを用いて近年発展してきた組み換え
ＤＮＡ技術を応用することにより、この問題を解決する
ことも考えた。すなわち、本発明者らは、ＧＡＦのＮ末
端側アミノ酸配列を解析し、この配列を基にオリゴヌク
レオチドプローブを合成した。ヒトグリオーマ細胞ＮＭ
Ｃ−Ｇ１，あるいはヒト包皮由来初代培養細胞のｍＲＮ
Ａより作製したｃＤＮＡライブラリーについて上記プロ
ーブを用いて検索し、ヒトＧＡＦ ｃＤＮＡをクローニ
ングした。さらに、該ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡを構
築し、該ＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養する
と、ヒトＧＡＦが生産されることを見出した。本発明者
らは、これらの知見に基づき、さらに研究した結果、本
発明を完成した。

【０００６】本発明は（１）グリオーマ細胞培養液より
得られ、かつグリア細胞増殖促進活性を有する蛋白質で
あるグリア活性化因子、（２）グリオーマ細胞がヒトグ
リオーマ細胞である上記（１）記載のグリア活性化因
子、 （３）アミノ酸配列： Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp で示されるポリペプチドを含むグリア活性化因子または
該因子作用を有するそのムテイン、 （４）アミノ酸配列： (Met)n-X₁-Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp -X₂ 〔ただしnは０または１を、X₁ は Ala Pro Leu Gly Glu
Val Gly Asn Tyr Phe Gly Val Gln Asp Ala Val Pro P
he Gly Asn Val Pro Val Leu Pro Val Asp Ser Pro Val
Leu Leu Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly G
ly Leu Pro Arg Gly Pro Ala Val Thr Asp またはその
断片を、X₂ は Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile
Leu Ser Gln Ser またはその断片を、それぞれ示す〕で
示されるポリペプチドからなる上記（３）記載のグリア
活性化因子、 （５）アミノ酸配列： (Met)n X₃ Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly Pro Ala Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 〔ただしnは０または１を、X₃ は Ala Pro もしくは Le
u Gly Glu Val Gly AsnTyr Phe Gly Val Gln Asp Ala V
al Pro Phe Gly Asn Val Pro Val Leu Pro ValAsp Ser
Pro Val Leu Leu またはその断片をそれぞれ示す〕で示
されるポリペプチドからなる上記（３）記載のグリア活
性化因子、 （６）アミノ酸配列： X₁' X₂' Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly Pro Ala Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 〔ただし、X₁' はMet または Met Ala Pro を、X₂' は
Leu Gly Glu Val GlyAsn Tyr Phe Gly Val Gln Asp Ala
Val Pro Phe Gly Asn Val Pro Val Leu ProVal Asp Se
r Pro Val Leu Leu またはその断片をそれぞれ示す〕で
示されるポリペプチドからなる上記（５）記載のグリア
活性化因子、（７）グリア活性化因子をコードするポリ
ヌクレオチドを含有するＤＮＡ、 （８）ポリヌクレオチドが塩基配列： TTG GATCATTTAA AGGGGATTCT CAGGCGGAGG CAGCTATACT GCAGGACTGG ATTTCACTTA GAAATCTTCC CCAATGGTAC TATCCAGGGA ACCAGGAAAG ACCACAGCCG ATTTGGCATT CTGGAATTTA TCAGTATAGC AGTGGGCCTG GTCAGCATTC GAGGCGTGGA CAGTGGACTC TACCTCGGGA TGAATGAGAA GGGGGAGCTG TATGGATCAG AAAAACTAAC CCAAGAGTGT GTATTCAGAG AACAGTTCGA AGAAAACTGG TATAATACGT ACTCGTCAAA CCTATATAAG CACGTGGACA CTGGAAGGCG ATACTATGTT GCATTAAATA AAGATGGGAC CCCGAGAGAA GGGACTAGGA CTAAACGGCA CCAGAAATTC ACACATTTTT TACCTAGACC AGTGGACCCC GAC で示されるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチ
ドである上記（７）記載のＤＮＡ、 （９）ポリヌクレオチドが塩基配列： Y₁-TTG GATCATTTAA AGGGGATTCT CAGGCGGAGG CAGCTATACT GCAGGACTGG ATTTCACTTA GAAATCTTCC CCAATGGTAC TATCCAGGGA ACCAGGAAAG ACCACAGCCG ATTTGGCATT CTGGAATTTA TCAGTATAGC AGTGGGCCTG GTCAGCATTC GAGGCGTGGA CAGTGGACTC TACCTCGGGA TGAATGAGAA GGGGGAGCTG TATGGATCAG AAAAACTAAC CCAAGAGTGT GTATTCAGAG AACAGTTCGA AGAAAACTGG TATAATACGT ACTCGTCAAA CCTATATAAG CACGTGGACA CTGGAAGGCG ATACTATGTT GCATTAAATA AAGATGGGAC CCCGAGAGAA GGGACTAGGA CTAAACGGCA CCAGAAATTC ACACATTTTT TACCTAGACC AGTGGACCCC GAC-Y₂ 〔ただし、Y₁は GCTCCCTTA GGTGAAGTTG GGAACTATTT CGG
TGTGCAG GATGCGGTAC CGTTTGGGAA TGTGCCCGTG TTGCCGGTG
G ACAGCCCGGT TTTGTTAAGT GACCACCTGG GTCAGTCCGA AGCA
GGGGGG CTCCCCAGGG GACCCGCAGT CACGGAC またはその断
片を、Y₂はAAAGTAC CTGAACTGTA TAAGGATATT CTAAGCCAAA
GT またはその断片を、それぞれ示す〕ないしその５’
末端に開始コドンATG を含有する塩基配列で示されるポ
リヌクレオチドである上記（７）記載のＤＮＡ、 （１０）ポリヌクレオチドが塩基配列： Y₃−AGT GACCACCTGG GTCAGTCCGA AGCAGGGGGG CTCCCCAGGG GACCCGCAGT CACGGACTTG GATCATTTAA AGGGGATTCT CAGGCGGAGG CAGCTATACT GCAGGACTGG ATTTCACTTA GAAATCTTCC CCAATGGTAC TATCCAGGGA ACCAGGAAAG ACCACAGCCG ATTTGGCATT CTGGAATTTA TCAGTATAGC AGTGGGCCTG GTCAGCATTC GAGGCGTGGA CAGTGGACTC TACCTCGGGA TGAATGAGAA GGGGGAGCTG TATGGATCAG AAAAACTAAC CCAAGAGTGT GTATTCAGAG AACAGTTCGA AGAAAACTGG TATAATACGT ACTCGTCAAA CCTATATAAG CACGTGGACA CTGGAAGGCG ATACTATGTT GCATTAAATA AAGATGGGAC CCCGAGAGAA GGGACTAGGA CTAAACGGCA CCAGAAATTC ACACATTTTT TACCTAGACC AGTGGACCCC GACAAAGTAC CTGAACTGTA TAAGGATATT CTAAGCCAAA GT 〔ただし、Y₃は GCTCCCTTA GGTGAAGTTG GGAACTATTT CGG
TGTGCAG GATGCGGTAC CGTTTGGGAA TGTGCCCGTG TTGCCGGTG
G ACAGCCCGGT TTTGTTA またはその断片を示す〕ないし
その５’末端に開始コドンATG を含有する塩基配列で示
されるポリヌクレオチドである上記（７）記載のＤＮ
Ａ、 （１１）ポリヌクレオチドが塩基配列： Y'−AGT GACCACCTGG GTCAGTCCGA AGCAGGGGGG CTCCCCAGGG GACCCGCAGT CACGGACTTG GATCATTTAA AGGGGATTCT CAGGCGGAGG CAGCTATACT GCAGGACTGG ATTTCACTTA GAAATCTTCC CCAATGGTAC TATCCAGGGA ACCAGGAAAG ACCACAGCCG ATTTGGCATT CTGGAATTTA TCAGTATAGC AGTGGGCCTG GTCAGCATTC GAGGCGTGGA CAGTGGACTC TACCTCGGGA TGAATGAGAA GGGGGAGCTG TATGGATCAG AAAAACTAAC CCAAGAGTGT GTATTCAGAG AACAGTTCGA AGAAAACTGG TATAATACGT ACTCGTCAAA CCTATATAAG CACGTGGACA CTGGAAGGCG ATACTATGTT GCATTAAATA AAGATGGGAC CCCGAGAGAA GGGACTAGGA CTAAACGGCA CCAGAAATTC ACACATTTTT TACCTAGACC AGTGGACCCC GACAAAGTAC CTGAACTGTA TAAGGATATT CTAAGCCAAA 〔ただし、Y'は AT GGCTCCCTTA GGTGAAGTTG GGAACTATTT
CGGTGTGCAG GATGCGGTACCGTTTGGGAA TGTGCCCGTG TTGCCG
GTGG ACAGCCCGGT TTTGTTA またはその断片を示す〕で
示されるポリヌクレオチドである上記（１０）記載のＤ
ＮＡ、（１２）上記（７）記載のＤＮＡを含有するベク
ターで形質転換された形質転換体、（１３）上記（１
２）記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にグリ
ア活性化因子を生成蓄積せしめ、これを採取することを
特徴とする該因子の製造法に関するものである。

【０００７】本発明のＧＡＦは第一にヒト由来グリオー
マ細胞株または上記（６）の形質転換体を培養して得ら
れた培養液上清からグリア細胞増殖活性を指標として単
離された蛋白質からなり、かつグリア細胞、線維芽細胞
に増殖促進活性を有するグリア活性化因子を要旨とす
る。更に本発明のＧＡＦは、次の特徴を有する： （ａ）ヘパリン親和性を有する（ヘパリンセファロース
カラムより０．４〜０．９Ｍ食塩濃度で溶出され
る。）。 （ｂ）分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
法で測定して、２５０００、２９０００、３００００の
三種の分子種がある。 （ｃ）活性の安定性：１００℃、５分の熱処理で活性を
失い、またｐＨ２、３０分処理で部分的に活性を失う。 （ｄ）抗原性：血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、酸性
線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増
殖因子（ｂＦＧＦ）との間に免疫学的交差性を示さな
い。 （ｅ）生物活性：グリア細胞、線維芽細胞、ラット副腎
髄質褐色細胞腫由来ＰＣ−１２細胞、に対して増殖促進
活性を示す。 本発明のＧＡＦは、分子量２５０００、２９０００、３
００００の三種の分子種があり、それぞれの分子種が一
つの蛋白質であり、いずれも同等の生物活性を有してい
ると認められる。

【０００８】本発明において、さらにヒト由来グリオー
マ細胞株または上記（６）の形質転換体を培養し、その
培養上清よりグリア活性化因子を採取し、それを精製す
ることを特徴とするＧＡＦの製造法が提供される。本発
明によるＧＡＦを得るための該因子を含む細胞培養上清
は、グリオーマ細胞、例えばヒトグリオーマ細胞ＮＭＣ
−Ｇ１の培養により得られる。グリオーマ細胞の培養に
は静置培養、ローラボトル培養、セルファクトリーある
いは懸濁培養等のいかなる方法も用いられ得るが、好ま
しくはローラボトル培養が用いられる。培地としては動
物細胞用の培地、例えば、ＭＥＭ培地、〔サイエンス(S
cience)，122，501(1952)〕、ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロ
ジー(Virology)，8，396(1959)〕、ＲＰＭＩ１６４０培
地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・
アソシエーション(Journal of the American Medical A
ssociation)，199，519(1967)〕、１９９培地〔プロシ
ーディング・オブ・ザ・ソサィエティ・フォー・ザ・バ
イオロジカル・メディスン(Proceeding of the Society
for the Biological Medicine)，73，1(1950)〕などが
挙げられ、好ましくは、ＤＭＥＭ培地が用いられる。培
養にはこれにさらに約１０〜２０％の胎児牛血清を添加
しても良い。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養
温度は３０〜４０℃、好ましくは３７℃で約２４〜１０
０時間行い、必要に応じて培地交換を行う。

【０００９】上記培養液よりＧＡＦ蛋白を分離精製する
には、自体公知の分離精製法を適切に組み合わせて行う
ことが出来る。これらの公知の分離、精製法としては、
塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析
法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を
利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、等電点
電気泳動法などの荷電の差を利用する方法、アフィニテ
ィークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する
方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の
差を利用する方法などが挙げられる。さらに具体的に
は、上記培養液を遠心分離して夾雑沈澱物を除いた後、
ヘパリンセファロースクロマトグラフィーに付し、ＧＡ
Ｆ蛋白を吸着、溶出することにより、効率よく該蛋白の
濃縮、精製を行うことが出来る。

【００１０】セファクリルＳ−２００等を担体としたゲ
ルろ過もＧＡＦ蛋白の精製に有効である。例えば、ヘパ
リンセファロースカラムで濃縮されたＧＡＦ蛋白を含む
溶出液を、さらに限外ろ過法などを用いて濃縮してセフ
ァクリルＳ−２００カラムを用いるクロマトグラフィー
に付し、中性付近の緩衝液で溶出する。ＣＭセルロース
等の酸性樹脂のカラムクロマトグラフィーも有効であ
る。たとえば、弱酸性緩衝液で平衡化したカラムを用い
て、同じ緩衝液で透析した試料をクロマトグラフィーに
付し、ＮａＣｌ等の塩の直線濃度勾配溶出を行うことが
できる。また、ヘパリンセファロースを担体としたアフ
ィニティークロマトグラフィーは極めて有効である。例
えば、中性付近のトリス塩酸あるいはトリスリン酸など
の緩衝液で平衡化したヘパリンセファロースカラムを用
いて、ＧＡＦ蛋白を含む溶液をクロマトグラフィーに付
し、十分洗った後、ＮａＣｌなどの塩の直線濃度勾配溶
出を行うことによりＧＡＦ蛋白を精製することができ
る。特に高速液体クロマトグラフィー用に開発されたヘ
パリンカラム（例えばShodex ＡＦpak ＨＲ−８９４、
昭和電工製など）は有効であり、前記ヘパリンセファロ
ースと同様に利用することが出来る。逆相高速液体クロ
マトグラフィーは、多くの蛋白の精製に威力を発揮して
おり、ＧＡＦ蛋白もこの担体を用いて精製することがで
きる。例えば試料を０．１％トリフルオロ酢酸を含む溶
液としてカラムにかけ、０．１％トリフルオロ酢酸に加
えたアセトニトリルの濃度勾配によって溶出を行うこと
ができる。上記の操作を適宜、組み合わせることにより
ＧＡＦ蛋白を均一な標品として回収することができる。
また、精製過程、あるいは保存過程での微量のディター
ジェントの共存は、標品の担体、あるいは容器への非特
異的吸着を防ぐのに好適である。ディタージェントとし
てはＣＨＡＰＳ（３−〔（３-Cholamidopropyl)dimethy
lammonio〕-1-propanesulfonate）、ＮＰ−４０、Trito
n Ｘ１００などが挙げられるが、特にＣＨＡＰＳが好ま
しい。

【００１１】培養上清中および精製過程でのＧＡＦ蛋白
の活性は、例えばラット胎児（１９日令）脳より分離採
取した初代培養グリア細胞、あるいは公知のＢＡＬＢ／
ｃ３Ｔ３細胞に対する³Ｈ−チミジンのとりこみを指標
とした増殖促進効果などにより測定することができる。
得られた精製標品は透析、凍結乾燥を行い、乾燥粉末と
することもできる。さらに血清アルブミンなどを添加し
て保存することも好適である。得られた精製標品を用い
て、ＧＡＦ蛋白の糖鎖構造を調べることができる。この
目的のためにはレクチンを用いたブロッティングや糖鎖
分解酵素などが使用され得る。得られた精製標品は、そ
のままＮ末端側アミノ酸配列を調べることができる。ま
た、蛋白分解酵素、たとえば、トリプシン、リジルエン
ドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼ等で分解処理したの
ち、生じたペプチド断片を逆相高速液体クロマトグラフ
ィーを用いて分取し、それぞれについて、アミノ酸配列
を調べることが出来る。アミノ酸配列の決定には自動ア
ミノ酸配列分析計（例えばモデル４７０Ａ アプライド
バイオシステムズ、米国）が特に有効に使用される。

【００１２】得られたアミノ酸配列をもとに、対応する
核酸の塩基配列を求め、オリゴヌクレオチドを合成して
ＧＡＦ蛋白をコードしているｃＤＮＡのクローニングに
用いることが出来る。

【００１３】ｃＤＮＡを得られれば、このｃＤＮＡを微
生物、例えば大腸菌、枯草菌、イーストなどで発現させ
て、ＧＡＦ蛋白をより容易に得ることができる。また、
発現宿主としては動物培養細胞も用いられ、糖鎖構造が
必要な場合には、きわめて好適な宿主として用いられる
こととなる。この様に遺伝子工学的手法を用いることに
より、より容易にＧＡＦ蛋白の大量生産への道を開くこ
とができる。この様な遺伝子工学的手法によりＧＡＦを
得る場合、発現宿主の相違または突然変異等によるアミ
ノ酸の欠損、置換等によりここに示すアミノ酸配列が異
なることがあるが、このような蛋白であっても、ＧＡＦ
因子作用を有するものであれば、本発明のＧＡＦに含ま
れる。また、グリオーマ細胞の培養上清から精製された
ＧＡＦに、Ｎ末端側アミノ酸配列が欠失した分子種が存
在し、それらが同じ比活性を有していたことからもわか
る様に、ＧＡＦのアミノ酸配列の一部を欠失させる、あ
るいは他の配列を付加する、さらにはアミノ酸配列の一
部を置換しても同等の活性を保持させることは可能であ
る。遺伝子工学的手法を用いて、このような変異ＧＡＦ
蛋白をつくり、熱や酸に対する安定性を高めること等も
可能である。

【００１４】本発明のヒトグリア活性化因子（１）のポ
リペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有
する発現ベクターは、例えば（イ）ヒトグリア活性化因
子（１）を培養上清より単離精製し、Ｎ末端側アミノ酸
配列を分析する、（ロ）得られたアミノ酸配列を基に、
それをコードするオリゴヌクレオチドプローブを合成す
る、（ハ）ヒトグリア活性化因子をコードするＲＮＡを
細胞より抽出し、（ニ）該 ｍＲＮＡ から単鎖の相補
ＤＮＡ(cDNA)を、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、（ホ）
該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込み、
（ヘ）得られた組み換えファージまたはプラスミドで宿
主を形質転換し、（ト）得られた形質転換体を培養後、
形質転換体から適当な方法、例えばＤＮＡプローブを用
いたハイブリダイゼーション法により目的とするＤＮＡ
を含有するファージあるいはプラスミドを単離し、
（チ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化Ｄ
ＮＡを切り出し、（リ）該クローン化ＤＮＡまたはその
一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結す
る、ことにより製造することができる。

【００１５】ヒトＧＡＦをコードするｍＲＮＡは、種々
のグリア活性化因子産生細胞、例えばヒトグリオーマ細
胞、あるいはヒト線維芽細胞などから得る事ができる。
該ヒトグリオーマ細胞としてはＮＭＣ−Ｇ１、またヒト
線維芽細胞としてはＷＩ−３８（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−
７５）などが挙げられる。上記細胞ＮＭＣ−Ｇ１は平成
２年１０月３１日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に
受託番号ＩＦＯ ５０２８１として、また平成３年２月
２１日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３２９４として
それぞれ寄託されており、またＷＩ−３８はジ・アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（The Americ
an Type Culture Collection）発行のカタログ・オブ・
セル・ラインズ・アンド・ハイブリドーマズ 第５版（C
atalogue of Cell Lines & Hybriddomas， ５th editio
n），1985に掲載されている。

【００１６】ＧＡＦ産生細胞からＲＮＡを調製する方法
としては、グアニジンチオシアネート法〔(ジェー・エム
・チルグウィン(J.M..Chirgwin)ら、バイオケミストリー
（Biochemistry)，18，5294(1979)〕などが挙げられ
る。このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型とし、逆転
写酵素を用いて、例えば岡山(H.Okayama)らの方法〔モ
レキュラ−・アンド・セルラ−・バイオロジ−(Molecular
and Cellular Biology)2,161(1982)および同誌 3, 280
(1983)〕に従いcＤＮＡを合成し、得られた cＤＮＡを
プラスミドに組み込む。cＤＮＡを組み込むプラスミド
としては、たとえば大腸菌由来の pＢＲ322〔ジ−ン（g
ene),2,95(1977)〕,pＢＲ325〔ジーン,4,121(1978)〕,p
ＵＣ12〔ジーン,19,,259(1982)〕,pＵＣ13〔ジーン,19,
259(1982)〕、ｐＵＣ118，ｐＵＣ119，枯草菌由来の p
ＵＢ110〔バイオケミカル・バイオフィジカル・リサー
チ・コミュニケーョン(Biochemical and Biophysical R
esearch Communication),112,678(1983)〕などが挙げら
れるが、その他のものであっても、宿主内で複製増殖さ
れるものであれば、いずれをも用いることができる。

【００１７】プラスミドに組み込む方法としては、たと
えば、ティー・マニアティス（T.Maniatis)ら，モレキュ
ラー・クローニング(Molecular Cloning) コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harb
or La-boratory),第239頁（1982)に記載の方法などが挙
げられる。またファージベクターにｃＤＮＡを組み込む
方法としては、たとえばヒューン（Hyunh,T.V.）らの方
法〔ディー・エヌ・エークローニング ア プラクティカル
アプローチ（DNA Cloning, A Practical Approach)
１，49(1985)〕などが挙げられる。上記ｃＤＮＡが組み
込まれたプラスミドの例としては、ヒト正常２倍体細胞
ｍＲＮＡより合成したｃＤＮＡをベクター、たとえばｐ
ＣＤベクター〔Okayama ら、モレキュラー・セル・バイ
オロジー（Molecular Cell Biology），３，280(1983)
参照〕を宿主（たとえば、大腸菌ｘ１７７６）に組み込
んで作成してもよい。

【００１８】このようにして得られたプラスミドは、適
当な宿主たとえばエシェリキア（Escherichia）属菌，
バチルス（Bacillus）属菌などに導入する。上記エシェ
リキア属菌の例としては、エシェリキア・コリ(Escheri
chia coli)Ｋ12ＤＨ1〔プロシージング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A.)60,160(1968)〕,Ｍ103〔ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ,(Nucleic Acids Research),9,
309(1981)〕,ＪＡ221〔ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)〕,1
20,517(1978)〕，ＨＢ101〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー41,459(1969)〕,Ｃ600〔ジェネテ
ィックス(Genetics),39,440(1954)〕などが挙げられ
る。上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サ
チリス（Bacillus subtilis）ＭＩ114(ジーン，24,255
(1983),207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー(Journal of Biochemistry)95,87(1984)〕などが挙げ
られる。

【００１９】プラスミドで宿主を形質転換する方法とし
ては、たとえばティー・マニアティス（T．Maniatis）
ら，モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning),
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold
Spring Harbor Laboratory），第249頁（1982）に記載
のカルシウムクロライド法あるいはカルシウムクロライ
ド／ルビジウムクロライド法などが挙げられる。このよ
うにして得られた形質転換体中からＧＡＦのアミノ酸配
列を基に合成したオリゴヌクレオチドをプローブとし
て、自体公知の方法、たとえばコロニー・ハイブリダイ
ゼーション法〔ジーン(Gene) 10，63(1980)〕およびＤ
ＮＡ塩基配列決定法〔プロシージング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A.)74,560(1977)、ヌクレイック・アシッ
ズ・リサーチ,(Nucleic Acids Research),9,309(1981)〕
を用い求めるクローンを選出する。このようにして、ク
ローン化されたＧＡＦをコードする塩基配列を含有する
ＤＮＡを有するベクターを保持する微生物が得られる。

【００２０】上記クローン化されたＧＡＦをコードする
ｃＤＮＡを有するプラスミドは目的によりそのまま、ま
たは所望により制限酵素で消化して使用することが出来
る。クローン化されたｃＤＮＡから発現させたい領域を
切り出し、発現に適したビークル（ベクター）中のプロ
モーターの下流に連結して発現型ベクターを得ることが
できる。ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラス
ミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，
ｐＵＣ１３），枯草菌由来プラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４），酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５)，あるいはλファージ
などのバクテリオファージおよびレトロウィルス、ワク
シニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。

【００２１】該ｃＤＮＡはその５’末端に翻訳開始コド
ンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端には翻訳終止コ
ドンとしてのＴＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを有していて
もよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、
適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもで
きる。さらに該ＤＮＡを発現させるにはその上流にプロ
モーターを接続する。本発明で用いられるプロモーター
としては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切な
プロモーターであればいかなるものでもよい。形質転換
する際の宿主がエシェリキア属菌である場合は、Ｔ7プ
ロモーター，ｔｒｐプロモーター，ｌａｃプロモータ
ー，ｒｅｃＡプロモーター，λＰＬプロモーター，ｌｐ
ｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合
は、ＳＰＯ１プロモーター，ＳＰＯ２プロモーター，ｐ
ｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、Ｐ
ＨＯ５プロモーター，ＰＧＫプロモーター，ＧＡＰプロ
モーター，ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。とりわ
け宿主がエシェリキア属菌でプロモーターがＴ7プロモ
ーターまたはｔｒｐプロモーターであることが好まし
い。宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプ
ロモーター、レトロウィルスのプロモーターなどが挙げ
られ、とりわけＳＶ４０由来のプロモーターが好まし
い。

【００２２】このようにして構築されたＧＡＦをコード
するｃＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体
を製造する。宿主としては、たとえばエシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。
上記エシェリヒア属菌、バチルス属菌の具体例として
は、前記したものと同様のものが挙げられる。上記酵母
としては、たとえばサッカロマイセス セレビシエ(Sacc
aromyces cerevisiae)ＡＨ２２Ｒ~，ＮＡ８７−１１
Ａ，ＤＫＤ−５Ｄなどが挙げられる。動物細胞として
は、たとえばサル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細胞，ヒトＦＬ細
胞などが挙げられる。

【００２３】上記エシェリキア属菌を形質転換するに
は、たとえばプロシージング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA),69,2110(1972)やジーン,17,107(1982)などに記載の
方法に従って行なわれる。バチルス属菌を形質転換する
には、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジ
ェネティックス(Molecular & General Genetics）,168,
111(1979)などに記載の方法に従って行なわれる。酵母
を形質転換するには、たとえばプロシージング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA),75,1929(1978)に記載の方法に従
って行なわれる。動物細胞を形質転換するには、たとえ
ばヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２，４５６（１
９７３）に記載の方法に従って行なわれる。

【００２４】このようにして、ＧＡＦをコードするｃＤ
ＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換
体が得られる。その一例としては、たとえば後述の実施
例５で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＤＨ
−１／pGAF1が挙げられ、該微生物は、平成３年８月２
８日に財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ
１５２１７として寄託されており、また通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に平成３年９
月２日から受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３５４７としてそ
れぞれ寄託されている。また実施例８で得られたEscher
ichia coli MM294(DE3)／pLysS，pETGAF1は、平成３年
１２月３日に財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号
ＩＦＯ １５２４８として寄託されており、また通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に平成
３年１２月２４日から受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３６８
９としてそれぞれ寄託されている。

【００２５】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナト
リウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵
母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。
培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリヒア属菌を
培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミ
ノ酸を含むＭ９培地〔ミラー(Miller),ジャーナル・オブ
・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティック
ス(Journal of Experiments in Molecular Genetics),4
31−433,Cold Spring Harbor Laboratory, New York 19
72〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率
よく働かせるために、たとえば３β−インドリル アク
リル酸のような薬剤を加えることができる。

【００２６】宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通
常約１５〜４３℃で約３〜24時間行い、必要により、通
気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の
場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行な
い、必要により通気や攪拌を加えることもできる。宿主
が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、
たとえばバークホールダー(Burkholder)最小培地〔Bost
ian, K. L. ら、「プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)
77,4505(1980)〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８
に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃
で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加
える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、
培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含
むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science)122,501(195
2)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー(Viro-logy),8,396
(1959)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ・
ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The
Jounal of the American Medical Association) 199,51
9(1967)〕,１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサ
イエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Pro-ceeding of the Society for the Biological Me
dicine)73, 1 (1950)〕などが挙げられる。ｐＨは約６
〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃
で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加
える。

【００２７】上記培養物からＧＡＦを分離精製するに
は、例えば下記の方法により行うことができる。ＧＡＦ
を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養
後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを緩衝
液あるいは塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含む液
に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解
によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離に
よりＧＡＦを得る方法などが適宜用い得る。

【００２８】抽出液よりのＧＡＦの精製は通常の精製方
法が用いられ得る。例えば硫安による分画、イオン交換
クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、ゲルろ過など、いずれを
用いてもよい。また精製過程での蛋白分解酵素阻害剤の
共存は、分解を受けていない蛋白を得るのに好適であ
る。また精製過程での緩和な表面活性剤の共存は、収量
を高めるのに好都合である。例えばＣＨＡＰＳなどは好
ましい。天然型ＧＡＦの精製に用いたヘパリンカラムは
極めて有効に使用される。これらを組み合わせることに
より、均一なＧＡＦ蛋白を得ることができる。ここに製
造されるＧＡＦはグリア細胞に対する増殖促進活性を有
するので、脳の損傷等の治癒促進剤として用いることが
出来る。また脳神経細胞損傷による疾患、脳浮腫、アル
ツハイマー病、老人性痴呆、さらには糖尿病性網膜症な
どへの応用もできる。他の細胞への作用に比べて、グリ
ア細胞に対する作用が強いので、グリア細胞を特異的に
賦活することが期待できる。また、線維芽細胞に対する
増殖促進作用を有することから、火傷、創傷、術後組織
潰瘍、消化器潰瘍の治癒促進剤として用いることができ
る。また、ＧＡＦは巨核芽球に作用して、この細胞を増
殖分化させ、血小板増加を促すことが見出された。他の
造血系あるいは免疫担当の細胞の増殖も促進するものと
考えられる。特に脳内では免疫担当細胞としてミクログ
リアが存在しており、この細胞の賦活にも関与している
ものと考えられる。この点からも脳損傷の治療改善に用
いることができよう。ＧＡＦはヒトさい帯由来血管内皮
細胞にはほとんど作用しなかったが、血管平滑筋細胞に
は増殖促進作用を有している。

【００２９】さらに他の増殖因子、ａＦＧＦ、ｂＦＧ
Ｆ、ＩＧＦなどと同様に骨形成を促進する作用も期待さ
れ、骨折や骨粗鬆症への適用も考えられる。ＧＡＦ ｃ
ＤＮＡはｂＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＰＤＧＦなどと同様に
線維芽細胞を形質転換することができる。この性質か
ら、ＧＡＦの上昇が細胞内での転写グリオーマの悪性化
の一因となっていることも考えられる。従って、脳腫瘍
ではＧＡＦの産生が促進されていると考えられるので、
ＧＡＦおよびその抗体さらにはＧＡＦ ｃＤＮＡは腫瘍
の診断にも有用となろう。またグリア細胞の培養研究に
は、有効な因子として活用され得る。

【００３０】本発明のＧＡＦを医薬として用いるには、
そのまま粉末として、または他の薬理学的に許容されう
る担体、賦形剤、希釈剤とともに医薬組成物（例えば、
注射剤、錠剤、カプセル剤、液剤、軟膏など）として、
温血哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラット、ハムスタ
ー、ウサギ、犬、ネコ）に対して非経口的または経口的
に安全に投与することができる。注射剤の製剤化はたと
えば生理食塩水またはブドウ糖やその他の補助薬を含む
水溶液を用い、常法に従って行なわれる。錠剤、カプセ
ル剤等の医薬組成物も常法に従って調製しうる。さら
に、医薬組成物としての注射剤、液剤、錠剤、カプセル
剤等を製造する際には、無菌条件下で行なう。本発明の
ＧＡＦを上記した医薬として用いる場合には、たとえば
上記した温血動物に、投与ルート、症状などを考慮し
て、１回約０．５ｎｇないし５０μg／kg、１日量約１
ｎｇないし100μg／kgの中から適当量を選んで投与され
る。また、本発明のＧＡＦを細胞培養を促進させるため
の試薬として用いる場合、培地１リットルあたり約０．
０１〜１０μgさらに好ましくは約０．１〜１０μgとな
るように培地に加えることが好ましい。

【００３１】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Commision on Biochemical Nomenclature による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ−体を示すも
のとする。

【００３２】ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＧｌｙまたはＧ ：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：システイン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニールアラニン ＴｙｒまたはＹ ：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン

【００３３】

【実施例】以下の実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 参考例１ グリア細胞に対する増殖促進活性の測定 ラット胎児脳より調製したグリア初代培養細胞を非働化
したウシ胎児血清を１０％含むＤＭＥＭ培地に３×１０
⁴個／mlとなるように浮遊させた。その細胞浮遊液１０
０μlを９６穴の平底マイクロプレート（Ａ／Ｎ Nunc社
製、Roskilde、デンマーク）の各ウエルに入れ２〜３日
間の培養後、各ウエルより７５μlの培地を廃棄し、各
ウエルに血清を含まないＤＭＥＭ培地１７５μｌを添加
した。さらに２〜３日間培養した後、各ウエルより２０
μlの培地を廃棄した。その後非働化したウシ胎児血清
を１．２５％含むＤＭＥＭ培地で適当に希釈したテスト
サンプルの２０μlを各ウエルに添加後、一晩培養し
た。翌朝、各ウエルに１μCiのトリチウムチミジン(５C
i／mmol、１mCi／ml、ＲＣＣ Amersham）を添加後、さ
らに５〜７時間培養した。培養後、各ウエルの培地を廃
棄後、各ウエルに１００μlの０．５％トリプシンと
０．０１％ＥＤＴＡを含むＰＢＳを添加し、数分の間室
温にて放置した。顕微鏡でグリア細胞が浮遊しているこ
とを確認した後、浮遊細胞をタイターテックセルハーベ
スター（Flow Laboratries社製、Virginia，Ｕ.Ｓ.
Ａ.）を用いてガラスファイバーフィルター（大日本製
薬株式会社製）上に集め水で洗浄後、細胞に取り込まれ
たトリチウムチミジンのカウントを液体シンチレーショ
ンカウンターにて測定した。

【００３４】実施例１ グリオーマ細胞ＮＭＣ−Ｇ１の培養上清の採取 ヒトグリオーマ細胞ＮＭＣ−Ｇ１を、１０％ウシ胎児血
清を含むＤＭＥＭ培地中でコーニングローラーボトルを
用い回転させながら３７℃で培養した（０．２回／
分）。コーニングローラーボトル表面上にＮＭＣ−Ｇ１
細胞がコンフルエントの状態になった後、培地を０．５
％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に変更した。３〜４
日おきに細胞培養上清を採取し、培地を新しい０．５％
ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に変更した。採取した
細胞培養上清を遠心し（ベックマン社製、モデルＪ−６
Ｂ、４０００回転／分、１５分間）、遠心上清を得、精
製の出発材料とした。

【００３５】ＧＡＦの精製 ステップ１：ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグ
ラフィー に記した方法で得たＮＭＣ−Ｇ１細胞の培養上清１８
リットルに５Ｍ ＮａＣｌ水溶液を１／５０容量（３６
０ml）、１０％ＮａＮ₃を１／1000容量（１８ml)添加し
た。このように調製したＮＭＣ−Ｇ１細胞培養上清を、
あらかじめ０．２Ｍ ＮａＣｌを含む２０mMトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．６）で平衡化したヘパリンセファロー
ス（登録商標）ＣＬ−６Ｂカラム（ベッド容積は８０m
l、Pharmacia ＬＫＢ Biotechnology社製、Uppsala，S
weden）にペリスタリックポンプを用いて通す（流速１
５０ml／時間、４℃）。レジンを４５０mlの０．２Ｍ
ＮａＣｌを含む２０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）
で洗浄した後（流速１５０ml／時間、４℃）、吸着した
たんぱく質を４００mlの２Ｍ ＮａＣｌを含む２０mMト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で溶出した（６０ml／時
間、８ml／フラクション、４℃）（図１）。溶出した各
フラクションについてグリア細胞に対する増殖促進活性
を参考例１に記載の方法で測定し、活性を示した画分
（フラクション１１からフラクション２３）を集めた。

【００３６】ステップ２：濃縮 合計３２リットルの培養上清についてステップ１のヘパ
リンアフィニティーカラムクロマトグラフィー（ステッ
プ１）を行ない活性画分をプールした（１９２ml）。こ
の溶液をDiaflow ＹＭ−１０メンブレン（分画分子量：
１０,０００、Amicon Corp社製、Massachusetts，Ｕ.
Ｓ.Ａ.）で窒素ガス加圧下約３５mlにまで濃縮した（４
℃）。

【００３７】 ステップ３：ゲルろ過カラムクロマトグラフィー ステップ２で濃縮した溶液約３５mlをセファクリルＳ−
２００ＨＲ（ベッド容積は１７８７ml、内径５cm×長さ
９１cm、Pharmacia ＬＫＢ Biotechnology）にのせ、
０．５Ｍ ＮａＣｌと０．１％ＣＨＡＰＳを含む２０mM
トリス塩酸緩衝液で溶出・分画した（８５ml／時間、１
０ml／フラクション、４℃）（図２）。各分画について
グリア細胞に対する増殖促進活性を参考例１に記載の方
法で測定し、活性を示した画分（フラクション１０５か
らフラクション１１７）をプールした。さらに５５リッ
トルのＮＭＣ−Ｇ１培養上清について、ステップ１、
２、３の各ステップを２回に分けて行なった。

【００３８】ステップ４：ヘパリンアフィニティーカラ
ムクロマトグラフィー ３回のゲルろ過カラムクロマトグラフィーでの活性画分
をプールした（３９０ml）。プールした溶液に９９mlの
１００％グリセリン、２．６１mlの１０％ＣＨＡＰＳ水
溶液、５．２２mlの１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
６）と１５４mlの水を添加した（合計６５１ml）。これ
をあらかじめ０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ＣＨＡＰＳ
と１５％グリセリンを含む２０mMトリス塩酸緩衝液(ｐ
Ｈ７．６）で平衡化したヘパリンセファロース（登録商
標）ＣＬ−６Ｂカラム（ベッド容積は５．８ml）に通し
た（２５ml／時間、４℃）。カラムを８０mlの０．３Ｍ
ＮａＣｌ、０．１％ＣＨＡＰＳと１５％グリセリンを
含む２０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で洗浄した
後（２５ml／時間、４℃）、吸着したたんぱく質をＮａ
Ｃｌの濃度を直線的に上昇させることにより溶出し、分
画した。塩濃度勾配は０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．１％Ｃ
ＨＡＰＳと１５％グリセリンを含む２０mMトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．６）５０mlに、１．２Ｍ ＮａＣｌ、
０．１％ＣＨＡＰＳと１５％グリセリンを含む２０mMト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）５０mlを加えていくこと
により作製した（２５ml／時間、２ml／フラクション、
４℃）（図３）。

【００３９】ステップ５：ヘパリンアフィニティー高速
液体カラムクロマトグラフィー ステップ４でのグリア細胞に対して増殖促進作用を示す
活性画分（フラクションＮｏ．２３−３０）をプールし
た１６mlに、３２mlの０．１％ＣＨＡＰＳと１５％グリ
セリンを含む２０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）を
添加した。この４８mlの溶液のうち４６mlを、ＨＲ−８
９４カラム（径８mm×長さ５０mm、昭和電工、日本)を
装置した高速液体クロマトグラフィー（Varian model
５０４０ system,Varian Associates社製、Californi
a，Ｕ.Ｓ.Ａ.）にかけた。レジンに吸着したたんぱく質
は、ＮａＣｌの濃度を直線的に上昇させることにより、
流速１ml／分で溶出し、分画（１ml／フラクション）し
た。用いた緩衝液はＡが０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１％
ＣＨＡＰＳと１５％グリセリンを含む２０mMトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．６）で、Ｂが２Ｍ ＮａＣｌ、０．１
％ＣＨＡＰＳと１５％グリセリンを含む２０mMトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．６）である。溶出のプログラムは次
に記すとおリで行なった。すなわち０分（１００％Ａ）
−１０分（９０％Ａ＋１０％Ｂ）−１５分（９０％Ａ＋
１０％Ｂ）−５０分（６５％Ａ＋３５％Ｂ）−６０分
（１００％Ｂ）−６４分（１００％Ｂ）−６５分（１０
０％Ａ）として行なった（図４）。カラム温度は室温で
あった。

【００４０】 ステップ６：逆相高速液体カラムクロマトグラフィー ステップ５で得られた活性画分（フラクションＮｏ．３
２−３８）をプールした７mlに、１．７５mlの０．５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を添加した。この８．７５
mlの溶液のうちの８mlを、Vydac Ｃ４カラム（径０．４
６cm×長２５cm、Vydac, California，Ｕ.Ｓ.Ａ.）を装
置した高速液体クロマトグラフィー（Varian model ５
０４０ System）にかけた。吸着したたんぱく質はアセ
トニトリルの濃度を直線的に上昇させることにより流速
０．８ml／分で溶出・分画（０．８ml／フラクション）
した。用いた溶媒はＡが０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）−９９．９％水、Ｂが０．１％ＴＦＡ−９０％ア
セトニトリルとした。溶出のプログラムは次に記すとお
りで行なった。すなわち０分（１００％Ａ）−１５分
（６５％Ａ＋３５％Ｂ）−１１０分（５０％Ａ＋５０％
Ｂ）−１１２分（１００％Ｂ）−１１７分（１００％
Ｂ）−１２０分（１００％Ａ）として行なった（図
５）。カラム温度は室温であった。分取後、スピードバ
ックコンセントレーター（モデルＡ２９０、サーバント
社製、米国）でアセトニトリルを除去した後、蒸留水を
添加してすべての画分を０．５ｍｌの液量に調製した。
活性画分（フラクション ５５、５９、６０、６１、６
２）を２−メルカプトエタノール存在下ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動し、銀染色した結果を図６に
示す。各画分は各々２５ｋＤａ（フラクション ５
５）、２９ｋＤａ（フラクション ５９、６０）、３０
ｋＤａ（フラクション ６１、６２）の単一なバンドを
与えた。

【００４１】 精製の要約 ＮＭＣ−Ｇ１培養上清３３リットルを用いての精製の要
約を表１に記す。

【００４２】

【表１】

【００４３】生物活性の測定は、参考例１に記載した方
法で行なった。生物活性の単位はトリチウムチミジンの
５０％取り込み値を示すサンプルの希釈率の逆数とし
た。なお、トリチウムチミジンの１００％取り込み値
は、１０％ウシ胎児血清により誘導される値とした。蛋
白質量は２８０ｎｍにおける吸光度１．０が１ｍｇ／ｍ
ｌの蛋白濃度であるとして換算した。＊印の蛋白質量は
銀染色による標準蛋白の染色強度を基に決定した。

【００４４】 実施例２ ＧＡＦの各種培養細胞に対する作用（１） グリア細胞に対する増殖促進活性 実施例１−に記載した方法で得られた精製本因子は、
グリア細胞に対し増殖促進活性を有している（図７）。
図中横軸はＧＡＦ濃度を示す。なおグリア細胞に対する
増殖促進活性の測定方法については、参考例１に記載し
た方法に従って行なった。精製の最終ステップである逆
相高速液体カラムクロマトグラフィーおよびアセトニト
リルを除去する操作をした直後の精製標品について、再
度グリア細胞に対する増殖促進活性を測定した。その結
果を図８に示す。図中横軸はＧＡＦ濃度を示す。図７と
図８の結果において、５０％トリチウムチミジン取り込
み値を与えるＧＡＦ濃度に差が生じたのは、以下の理由
によると考えられる。すなわち、図７は精製後−８０℃
で保存後の標品を用いた時の結果であり、低蛋白濃度溶
液の凍結融解操作によりＧＡＦ蛋白が変性失活または容
器へ吸着したものと推測される。

【００４５】（２）グリア細胞増殖促進活性 ＧＡＦを添加した後のグリア細胞数の変化を調べた。以
下に記載した方法に従って行った。非働化したウシ胎児
血清を１０％含むＤＭＥＭ培地に３×１０⁴個／ｍｌと
なるように浮遊させ、その５００μｌを２４穴の培養プ
レート（Linbro社製、米国）の各ウエルに入れ、３日間
培養した。その後各ウエルより４４０μｌの培地を廃棄
し、新たに３４０μｌのＤＭＥＭを添加した。次に実施
例１−ステップ４に記載したヘパリンアフィニティー
カラムクロマトグラフィーで得られたＧＡＦ活性画分
を、非働化したウシ胎児血清を１．２５％含むＤＭＥＭ
培地で５０倍に希釈した溶液を５０μｌ、またヘパリン
を同じ溶液で５００μｇ／ｍｌとなるように溶解した溶
液５０μｌを添加したウエル、どちらか片方のみを添加
したウエル、また対照群として両方を添加しないウエル
を作った。全てのウエルは、非働化したウシ胎児血清を
１．２５％含むＤＭＥＭ培地で最終容積が５００μｌと
なるようにした後、さらに２日間培養した。培養後、各
ウエルを３ｍｌのＤＭＥＭで２度洗浄し、０．５ｍｌの
０．２％トリプシンと０．０１％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ
を添加し細胞を浮遊させ、各ウエルの細胞数をコールタ
ー細胞数計測機（コールター社、ＺＭ型）を用いて算定
した。結果を図９に示す。グリア細胞数はＧＡＦを添加
することにより無添加群に比べ１．６倍に増加した。し
かしヘパリンを添加したことによる効果はなかった。

【００４６】（３）グリア細胞増殖促進活性の経時変化 ＧＡＦのグリア細胞増殖促進活性の経時変化を、以下に
記すこと以外は参考例１に記載した方法に従って調べ
た。すなわち、実施例１−のステップ５に記載したヘ
パリンアフィニティー高速液体カラムクロマトグラフィ
ーで得られたＧＡＦ活性画分を、非働化したウシ胎児血
清を１．２５％含むＤＭＥＭ培地で８００倍に希釈した
サンプル２０μｌをウエルに添加後、４．８，１３，１
６，１９，２２，２５，２８，３１および４０時間後
に、各ウエルにそれぞれ１μＣｉのトリチウムチミジン
を添加した。３時間後にハーベストし、細胞に取り込ま
れたトリチウムチミジンのカウントを液体シンチレーシ
ョンカウンターにて測定した。結果を図１０に示すが、
ＧＡＦ添加後１６から１９時間後にトリチウムチミジン
の取り込みがピークになった。

【００４７】（４） 線維芽細胞に対する増殖促進活性 実施例１−に記載した方法で得られた精製本因子は、
線維芽細胞マウスＢＡＬＢ／３Ｔ３ｃｌｏｎｅＡ３１細
胞に対し増殖促進活性を有していた（図１１）。図中横
軸はＧＡＦ濃度を示す。なお線維芽細胞Ａ３１に対する
増殖促進活性の測定については、以下に記載する方法で
行なった。マウスＢＡＬＢ／３Ｔ３ｃｌｏｎｅＡ３１細
胞を５％仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地でヌンク９６穴マ
イクロタイタープレート（平底）に１穴あたり２×１０
³個を７５μlの培地にて播種して、培養し、翌日、各ウ
エルより５０μlの培地を廃棄し、各ウェルに血清を含
まないＤＭＥＭ培地を１７５μl添加した。３〜４日間
培養したのち各ウェルより２０μlの培地を廃棄した。
その後、非働化したウシ胎児血清を１．２５％含むＤＭ
ＥＭ培地で適当に希釈したテストサンプルの２０μlを
各ウェルに添加後一晩培養した。翌朝、各ウェルに１μ
Ｃｉのトリチウムチミジン（５Ci／mmol、１mCi／ml
ＲＣＣ Amersham）を添加後、さらに５〜７時間培養し
た。培養後各ウェルを約１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、１０
０μlの５％ＳＤＳ水溶液を添加し、３７℃で一晩放置
した。各ウェルの細胞抽出液をチューブに集め、細胞に
取り込まれた³Ｈ-Tdr量をシンチレーションカウンター
にて測定した。さらに、精製の最終ステップである逆相
高速液体カラムクロマトグラフィーおよびアセトニトリ
ルを除去する操作をした直後の精製標品について、５Ci
／mmol、１mCi／mlのトリチウムチミジン溶液を用いて
再度線維芽細胞Ａ３１に対する増殖促進活性を測定し
た。その結果を図１２に示す。図中横軸はＧＡＦ濃度を
示す。図１１と図１２の結果において、５０％トリチウ
ムチミジン取り込み値を与えるＧＡＦ濃度に差が生じた
のは、以下の理由によると考えられる。すなわち、図１
１は精製後−８０℃で保存後の標品を用いた時の結果で
あり、低蛋白濃度溶液の凍結融解操作によりＧＡＦ蛋白
が変性失活または容器へ吸着したものと推測される。

【００４８】 （５）ヒトさい帯血管内皮細胞に対する作用 実施例１−に記載した方法で得られた精製本因子は、
ヒトさい帯血管内皮細胞に対し増殖促進活性を有してい
なかった（図１３）。図中横軸はＧＡＦまたはｂＦＧＦ
のたん白濃度を示す。なおヒトさい帯血管内皮細胞に対
する増殖促進活性は以下に記載する方法に従って行なっ
た。本検定に用いられた細胞は、ヒトさい帯より単離さ
れた静脈血管内皮細胞（以下ＨＵＶＥ細胞）である。ま
た、細胞増殖度の測定には以下に述べるＭＴＴアッセイ
法を用いた。ＭＴＴアッセイの手法は多田らの方法〔ジ
ャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド(J. Immuno
l. Methods)，93，157（1986）〕に若干の変更を加え
た。即ち、継代維持されているＨＵＶＥ細胞を0.002％
ＥＤＴＡ（ドータイト社345−01882）を含む0.125％ト
リプシン酵素溶液（ベーリンガーマンハイム社）を用い
て単一細胞に解離し、得られた細胞を牛胎児血清（ウイ
タカーバイオプロダクト社）を２．５％含む、ＧＩＴ培
地（日本製薬398−00515）からなるＨＵＶＥ細胞培地に
懸濁した。この細胞懸濁液に含まれる細胞数をコールタ
ー細胞数計測機（コールター社 ＺＭ型）を用いて算出
し、以下の培養に供した。２×１０³個のＨＵＶＥ細胞
を含む１００ｕｌのＨＵＶＥ細胞懸濁液を、９６穴培養
皿（ヌンク社 Ｆ９６）に加え、３７℃で培養した（日
立炭酸ガス−窒素ガス制御培養機ＣＨ−１６型、Ｃ
Ｏ₂：５％、Ｏ₂：７％）。培養翌日に、各々のサンプル
をＨＵＶＥ細胞培地に加えた。さらにヘパリン（シグマ
社）を終濃度５．０ｕｇ／ｍｌないし２０μｇ／ｍｌに
なるように添加したものである。各サンプルを加えたの
ち、さらに培養を３日間行ない、培養皿より培地を除
き、１．０ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ試薬（ドータイト社 34
101823）を含むＨＵＶＥ培地を１００μｌ加え、３７℃
で４時間保温した。その後、１０％ＳＤＳ水溶液（和光
純薬 191-07145 ）を１００ｕｌ加え、４時間保温を続
けた。反応終了の後、反応液を含む９６穴培養皿を振盪
し、反応液の波長５９０ｎｍにおける吸収を、マイクロ
タイタープレート吸光度測定機（タイターテック MCC 3
41 ）を用いて測定した。

【００４９】（６）ラット副腎褐色細胞腫由来ＰＣ−１
２細胞株に対する作用 実施例１−に記載した方法で得られた精製本因子は、
ラット副腎褐色細胞腫由来ＰＣ−１２細胞株に対し増殖
促進活性を有していた（図１４）。図中横軸はＧＡＦ濃
度を示す。なおＰＣ−１２に対する増殖促進活性の測定
は以下に記載する方法で行なった。ＧＡＦを非働化した
ウマ血清を１％含むＲＰＭＩ−１６４０培地で適当に希
釈し、その５０μlを９６穴マイクロプレートに入れ
た。次にＰＣ−１２細胞を非働化したウマ血清を１％含
むＲＰＭＩ−１６４０培地に１０⁶個／ｍｌになるよう
に浮遊させ、その細胞浮遊液５０μｌを９６穴の平底マ
イクロプレート（Ａ／Ｎ Ｎｕｎｃ社製、Roskilde、デ
ンマーク）の各ウェルに入れ、さらに２日間培養した。
培養後、各ウェルに０．５μＣｉのトリチウムチミジン
（５Ci／mmol、１mCi／ml ＲＣＣ Amersham）を添加
後、さらに５時間培養した。培養後細胞をＴｉｔｅｒｔ
ｅｋセルハーベスターを用いてガラスファイバーフィル
ター上に集め水で洗浄後、細胞に取り込まれた³Ｈ−チ
ミジンのカウントを液体シンチレーションカウンターに
て測定した。

【００５０】（７） 活性の安定性 ヘパリンセファロース（登録商標）ＣＬ−６Ｂの２Ｍ
ＮａＣｌ溶出画分（実施例１ステップ１）を、１００
℃で５分熱処理すると活性は完全になくなった。また室
温でｐＨ２、３０分処理すると部分的に活性を失った
（図１５）。図中横軸はＧＡＦの希釈倍数を示してい
る。 （８） 抗原性：酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）
塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）とグリア活性化
因子間の免疫学的交差性 実施例１−に記載の方法により精製した標品につい
て、抗ａＦＧＦウサギポリクローナル抗血清と抗ｂＦＧ
ＦウサギＩｇＧを用いてウエスタンブロッティングを行
なった（図１６）。図１６から判るように本因子はａＦ
ＧＦとｂＦＧＦそれぞれとの間に免疫学的交差性を示さ
なかった。

【００５１】実施例３ ＮＭＣ−Ｇ１細胞が産生するＧＡＦ蛋白成分の性質 実施例１で得られた２５ｋＤａ ＧＡＦ ３０ｕｇ、２９
ｋＤａ ＧＡＦ ３０ｕｇおよび３０ｋＤａ ＧＡＦ ６０
ｕｇをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した
後、ＰｒｏＢｌｏｔｔメンブレン（Applied Biosystem
社製、カリフォルニア、米国）上に乾式ブロッティング
装置（ＡＴＴＯ社製、東京）を用いて蛋白をトランスフ
ァーした。メンブレンを２％ＰＶＰ−３６０溶液（２％
ポリビニルピロリゾン−３６０）（シグマ社製、米国）
を含むリン酸緩衝液−食塩（８ｇＮａＣｌ，０．２ｇ
ＫＣｌ，１．１５ｇ Ｎａ₂ＨＰＯ₄，０．２ｇ ＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄を１リットルの水に溶かしｐＨ７．４としたもの）
に４５分間振とうしつつ浸した後、メンブレンをビオチ
ニル化コンカナバリンＡ（Vector Lab 社製、米国）を
１０μｇ／ｍｌの濃度で含む２％ＰＶＰ−３６０溶液に
移し、１時間振とうした。その後メンブレンをＴＮＴ緩
衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌと０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００を含む２５ｍＭトリス塩緩衝液（ｐＨ７．５））
で洗浄した（１０分間、３回）。さらに、メンブレンを
アビディンとビオチニル化西洋ワサビペルオキシダーゼ
複合物（Standard Vectastain(登録商標）ＡＢＣキッ
ト、VectorLab 社製）を含むリン酸緩衝液−食塩溶液に
４５分間振とうしつつ浸した後、ＴＮＴ緩衝液で洗浄し
た（１０分間、３回）。１２ｍｇ ４−クロロ−１−ナ
フトールと４ｍｌメタノールを混ぜたものに２０ｍｌ
ＴＮ緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭトリス
塩緩衝液（ｐＨ７．５））と１３．２μｌ過酸化水素水
を混ぜたものを加え、それにメンブレンを浸し、発色さ
せた。図１７にその結果を示す。Ｎ−グリカナーゼを用
いる酵素的脱グリコシル化は、Ｇｅｎｚｙｍｅ社（ボス
トン、米国）のプロトコールに従って実施した。ＧＡＦ
をＮ−グリカナーゼ処理した後、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行い、ゲルを銀染色した結果を図
１８に示す。２５ｋＤａ、２９ｋＤａおよび３０ｋＤａ
のＧＡＦは部分的ではあるが、各々その分子量が３から
４ｋＤａだけ減少した。以上、二つの実験より、２５ｋ
Ｄａ、２９ｋＤａおよび３０ｋＤａ ＧＡＦにＮ−グリ
コシド型糖鎖が付加していることが確認された。

【００５２】実施例４ Ｎ末端アミノ酸配列の分析 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（還元条件
下）で単一な３種類のＧＡＦ（２５ｋＤａ、２９ｋＤａ
および３０ｋＤａ）を、ポリビニリデンダイフルオライ
ドタイプのメンブレンであるＢｒｏＢｌｏｔｔ（登録商
標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、カ
ルフォルニア、米国）に吸着させ、プロテインシークェ
ンサー（モデル４７３Ａシステム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、アミノ酸配列の解
析を行なった。用いた蛋白量は、２５ｋＤａ ＧＡＦが
６０pmol、２９ｋＤａ ＧＡＦが５pmol、３０ｋＤａ Ｇ
ＡＦが５５pmolであった。得られた配列の結果を以下に
記す。 1 5 10 15 16 25ｋＤａ Ala-Asp-Z₁-Leu-Gly-Gln-Ser-Glu-Ala-Gly-Gly-Leu-Pro-X-Gly-Pro- 20 21 Ala-Val-Thr-Asp-Leu- （配列番号：３） 1 5 6 7 10 13 29ｋＤａ X-Gln-Asp-Ala-Val-Pro-Phe-Gly-Asn-Val-Pro-(Ser)-Leu- （配列番 号：４） 1 5 10 15 16 30ｋＤａ Z₂-Gly-Glu-Val-Gly-Asn-Tyr-Phe-Gly-Val-Gln-Asp-Ala-Val-Pro-Phe 20 23 -Gly-Asn-Val-(Pro)-X-Leu-Leu- （配列番号：５） Ｚ₁＝ＨｉｓまたはＰｒｏを示す。 Ｚ₂＝ＬｅｕまたはＡｌａを示す。 Ｘ：未同定のアミノ酸 （ ）：確定できなかったが推定されたアミノ酸 最初のステップのアミノ酸（Ｎ末端アミノ酸）および１
０番目を超えるアミノ酸については確実性に乏しい。

【００５３】実施例５ ＧＡＦ ｃＤＮＡのクローニングとその塩基配列の解析 実施例３で得られた３０ｋＤａＧＡＦのアミノ酸配列を
もとに、この配列に対応し、かつ制限酵素の認識配列を
付加した下記のオリゴヌクレオチドプライマー２本（ｐ
ｒｉｍｅｒ １，２）を合成した。 1 5 10 30ｋＤａ GAF Z₂ Gly Glu Val Gly Asn Tyr Phe Gly Val- primer 1: 5′-AAGGATCCGTIGGIAAYTAYTTYGG-3′（配列番号：６） 11 15 20 23 Gln Asp Ala Val Pro Phe Gly Asn Val(Pro) X Leu Leu Primer2: 5′-AAGAATTCACRTTICCRAAIGGIAC-3′（配列番号：７） Z₂=Leu または Ala を示す。 I: Inosine Y＝T/C，R＝A/G このプライマーを用いてヒトゲノム由来ＤＮＡをテンペ
レートとしてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｌａｉ
ｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ，Ｂと
Ｆｕｌｏｏｒａ，Ｆ．Ａ．メソッズ イン エンザイモ
ロジィ（Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ）１５５巻、３
３５頁、１９８７）を行った。（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録
商標）ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇ
ｅｎｔＫ’ｔ（シータス社、米国）ゲノムＤＮＡ １μ
ｇに対して、プライマー１，２をそれぞれ５６０ng加
え、１００μｌの反応液中Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商
標）（シータス社、米国）２．５ユニットを添加して９
４℃１分、５０℃２分、７２℃３分のＤＮＡ合成サイク
ルを２５回くり返した。この反応物について、アクリル
アミドゲル電気泳動を行い予期される長さ（６３bp）の
断片を回収し、その塩基配列を解析したところ、下記の
配列が得られた。 ５′−ＧＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＧＡＡＣＴＡＴＴＴＣＧ
ＧＧＧＴＧＣＡＧＧＡＴＧＣＧＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＧ
ＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＴＣ−３′（配列番号：８） この配列をもとにして再度、下記のプローブ２本（ｐｒ
ｏｂｅ １，２）を化学合成した。 ｐｒｏｂｅ１ ５′−ＴＧＧＧＧＡＡＣＴＡＴＴＴＣＧ
ＧＧＧＴＧＣＡＧＧＡＴＧＣＧＧ−３′（配列番号：
９） ｐｒｏｂｅ２ ５′−ＡＣＧＴＴＧＣＣＧＡＡＧＧＧＧ
ＡＣＣＧＣＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣ−３′（配列番号：１
０） 一方ヒト包皮由来初代培養細胞ｍＲＮＡより合成したｃ
ＤＮＡをｐＣＤベクター〔Ｏｋａｙａｍａら、モレキュ
ラー・セル・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ），３，２８０（１９８３）参
照〕に組み込んで作成した大腸菌ｘ１７７６を宿主とし
たｃＤＮＡライブラリーをＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔ
ｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ
Ｈｕｍａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ，Ｕ．Ｓ．Ａの岡山博士より分与を受けた。このｃ
ＤＮＡライブラリーよりアルカリ法（Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍ．Ｈ．Ｃ．＆ Ｄｏｌｙ．Ｊ．ヌクレイック・アシッ
ズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ），１，１５１３（１９７９）〕でプラスミドＤ
ＮＡを抽出し、このＤＮＡを大腸菌ＤＨ１に感染させ、
約２×１０⁵ 個のｃｌｏｎｅよりなる大腸菌ＤＨ１を宿
主としたｃＤＮＡライブラリーを作成した。

【００５４】上記大腸菌ＤＨ１を用いたｃＤＮＡライブ
ラリーをニトロセルロースフィルター（ミリポア社、Ｈ
ＡＴＦフィルター）上に約１×１０⁵ ｃｌｏｎｅ／フィ
ルターとなるように１０枚まき、このフィルターをマス
ターフィルターとしている各２枚ずつを１組としたレプ
リカフィルター計２０枚を作成した。このレプリカフィ
ルター上の大腸菌を０．５Ｎ ＮａＯＨ溶液で溶かし、
露出変性したプラスミドＤＮＡをフィルター上に固定し
た〔Ｃｒｕｎｓｔｅｉｎ．Ｍ．＆ Ｈｏｇｎｅｓｓ，
Ｄ．Ｓ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｌ．Ｕ
ＳＡ ７２，８９６１（１９７５）〕。

【００５５】前記化学合成したｐｒｏｂｅ１，２につい
てＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとγ−³²Ｐ ＡＴＰと
により、５′末端に³²Ｐを導入し、これらをプローブと
して別々にＤＮＡを固定したレプリカフィルターに会合
させた。会合反応は、１０μＣｉのプローブを含む５×
ＳＳＰＥ〔１８０mM ＮａＣｌ、１０mM ＮａＨ₂Ｐ
Ｏ₄、１mM ＥＤＴＡ（pH７．４）〕、５×Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ′ｓ，０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ml変性サケ
精子ＤＮＡ溶液１０ml中で、５５℃１６時間行い、反応
後フィルターを５×ＳＳＣ〔０．１５Ｍ ＮａＣｌ、
０．０１５Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ〕０．１
％ＳＤＳ溶液で室温で３回さらに６０℃３０分ずつ２回
洗浄した〔Ｔ．ｍａｎｉａｔｉｓら、“Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｌｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐ．３０９（１９８
２）〕。

【００５６】洗浄したフィルターよりラジオオートグラ
ムをとり、二種類のプローブの両方に対して反応する菌
株を一組２枚のレプリカフィルターのラジオオートグラ
ムを重ね合わせることにより探した。この方法により１
×１０⁶クローンより二種類のプローブに対して反応す
る２株を得た。これら２株よりプラスミドＤＮＡをアル
カリ法（前出）によって抽出精製した。プラスミドＤＮ
Ａ中のｃＤＮＡ部分を制限酵素ＢａｍＨＩにより切り出
し、アガロースゲル電気泳動で分画すると、２株由来の
ｃＤＮＡはいずれも約１．５５Kbの同鎖長を示した。従
って、この２株は同じものであると考えられた。この２
株の一方の菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＤＨ−１／ｐＧＡＦ１）に含まれるプラスミド中のｃＤ
ＮＡ部分の塩基配列をジデオキシヌクレオチド合成鎖停
止法（Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇら、ヌクレイック・アシッズ
・リサーチ，９，３０９（１９８１））によって決定し
た。その塩基配列（配列番号：２）および塩基配列から
推定されるアミノ酸配列（配列番号：１）を図１９に示
した。ｐＧＡＦ１に含まれるｃＤＮＡ部分は１４９３bp
であり、５′側非翻訳領域、全アミノ酸コード領域、
３′側非翻訳領域及びｐｏｌｙＡ鎖を含んでいた。コー
ドされていたアミノ酸配列は２０８アミノ酸であり、こ
の配列中にＮ末端配列分析（実施例４）により明らかに
された３０ｋＤａ、２９ｋＤａ、２５ｋＤａの部分アミ
ノ酸配列はすべて含まれていた。一部（２５ｋＤａの１
位のＡｌａ、２９ｋＤａの１２位のＳｅｒ、３０ｋＤａ
の２３位のＬｅｕ）、蛋白のアミノ酸分析（実施例４）
で得られた配列と相異するアミノ酸配列がコードされて
いるが、相異点はいずれもアミノ酸配列分析で不確実な
結果を与えやすいＮ末端、あるいは１０残基を超えて同
定された部分であり、ｃＤＮＡより推定された配列の方
が正しいものと考えられる。

【００５７】実施例６ ＧＡＦをコードする遺伝子の動
物細胞における発現： （１）ＧＡＦのＣＯＳ−７細胞での発現 サルＣＯＳ−７細胞を１０％ＮＵ−Ｓｅｒｕｍ（Ｃｏｌ
ａｂｏｒａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ社）を含むＩＭＤ
Ｍ培地でファルコン径６０mmプラスチックディッシュに
１枚当り６×１０⁵個播種した。翌日無血清のＩＭＤＭ
培地で洗浄後、公知の方法〔Ｂ．Ｓｅｅｄら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ５２：３３
６５（１９８７）〕に従い、プラスミドｐＧＡＦ１のＤ
ＮＡ２μｇ及び１０μｇと４００μｇ／mlのＤＥＡＥ−
ｄｅｘｔｒａｎとを含む反応溶液を調製し細胞に添加し
た。３７℃で４時間インキュベーションした後に２分間
ＤＭＳＯ処理を行った。その後１０％ＮＵ−Ｓｅｒｕｍ
を含む培地（３ml／ディッシュ）で培養を続け、７０〜
７２時間後に産生されたＧＡＦを含む培地を集めた。さ
らにディッシュあたり１．５mlのリン酸緩衝生理食液水
中に細胞を回収した。ｐＧＡＦ１をトランスフェクトし
たＣＯＳ７細胞の培養上清中にグリア細胞増殖促進活性
が検出された。ＧＡＦ ｃＤＮＡが含まれていないベク
ターだけのプラスミドｐＣＤＸをトランスフェクトした
ＣＯＳ−７細胞、またトランスフェクトしない細胞の培
養上清中には活性は検出されなかった（図２０）。凍結
融解を２度および超音波処理をして得られた細胞抽出液
中にはコントロールと比べて有意な活性がなかった。こ
の結果からｐＧＡＦ１のｃＤＮＡがＧＡＦをコードして
いることが確認されるとともに、ＣＯＳ細胞でｃＤＮＡ
を発現させると産物は培養液中へ分泌されることが明ら
かとなった。

【００５８】（２）ＧＡＦのＣＨＯ細胞での発現 （ａ）発現用プラスミドｐＤＧＡＦ１の構築 前記実施例５で得られたＧＡＦの全構造を含むプラスミ
ドｐＧＡＦ１を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、１．５５
ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。一方、動物細胞用ベクタ
ーｐＴＢ３９９〔セル・ストラクチャー・アンド・ファ
ンクション（Cell Struct. Funct. 12：205 (1987)〕を
制限酵素ＢａｍＨＩで切断しＩＬ−２ｃＤＮＡ領域を除
去した後、前記のＧＡＦ ｃＤＮＡ １．５５ｋｂ断片
を挿入して、Abelson マウス白血病ウイルス（ＭｕＬ
Ｖ）ＬＴＲの支配下に動物細胞でＧＡＦ ｃＤＮＡを発
現させ得る発現用プラスミドｐＲＧＢ１２を構築した。
さらに、これを制限酵素ＳａｌＩ−ＨｉｎｄIIIで切断
して発現ユニット部分（プロモーター遺伝子−ポリ
（Ａ）シグナル）をハムスタージヒドロ葉酸還元酵素
（ＤＨＦＲ）発現用プラスミドｐＴＢ３４８〔セル・ス
トラクチャー・アンド・ファンクション（Cell Struct.
Funct. 12：205 (1987)〕のＳＶ４０プロモーター上流
にあるＳａｌＩ−ＨｉｎｄIII部位に挿入して、プラス
ミドｐＤＧＡＦ１を構築した。プラスミドｐＤＧＡＦ１
の構築図を図２１に示す。

【００５９】（ｂ）ＣＨＯ細胞における発現 ＣＨＯ ｄｈｆｒ~細胞を１０％牛胎児血清を含むＨａｍ
Ｆ12培地で直径６ｃｍの組織培養用ディッシュに播種
し、翌日、同培地で培地交換した。２時間後にリン酸カ
ルシウム法（Graham ら、ヴィロロジー(Virolozy) 52，
456 (1973))によりプラスミドｐＤＧＡＦ１ ＤＮＡ１０
μｇをトランスフェクトした。２日間、増殖培地で培養
した後、細胞を３５μｇ／ｍｌプロリンと１０％透析Ｆ
ＣＳを含むＤＭＥＭ培地で９６穴マイクロプレート（Ｎ
ｕｎｃ社）にまき直し、３〜４日毎の培地交換を行い、
いくつかのｄｈｆｒ+ 形質転換体を選択した。これらを
３５μｇ／ｍｌプロリンと５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培
地で２４穴マイクロプレート（Linbro，Flow社）に移
し、各クローンを培養した。以後、用いた培地は３５μ
ｇ／ｍｌプロリンと５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地であ
る。これらのクローンのうちＧＡＦたん白を産生してい
る１６クローンを６ｃｍの組織培養用ディッシュに移
し、メトトレキセート（ＭＴＸ）濃度を３段階（０．
１，１，１０μＭ）に上げながら、１０μＭ ＭＴＸ耐
性株を取得しＧＡＦ遺伝子の増幅をはかる。各クローン
の培養上清中に含まれるＧＡＦ活性を図２２に示す。図
中、横軸は添加した培養上清の希釈率を示している。Ｇ
ＡＦ活性の高いクローンを選択し、糖鎖の付加した天然
型ＧＡＦ産生細胞として確立し、ＧＡＦの採取等に用い
る。

【００６０】実施例７ ＧＡＦ遺伝子導入によるマウス
ＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３細胞の形質転換 （１）ＧＡＦ発現用プラスミドｐＲＧＢ１２の構築 実施例６に記載したプラスミドｐＲＧＢ１２をＧＡＦ発
現用プラスミドとした。コントロールのプラスミドとし
ては、ＧＡＦ ｃＤＮＡインサートのないプラスミドｐ
ＴＢ１０５５を用いた。 （２）ＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３細胞の形質転換 マウスＢＡＬＢ／３Ｔ３ｃｌｏｎｅＡ３１（サブクロー
ンＡ３１−１−１（Kakunaga ら、サイエンス（Scienc
e) 209，505（1980））、Dr. K. Kakunaga より分与を
受けた）を１０％牛血清を含むＤＭＥＭ培地で直径６ｃ
ｍの組織培養用ディッシュに１×１０⁵個播種し、翌
日、同培地で培地交換した。３時間後にリン酸カルシウ
ム法（Graham ら、ヴィロロジー(Virolozy) 52，456 (1
973))によりプラスミドｐＲＧＢ１２あるいはｐＴＢ１
０５５を１，２，５および１０μｇ、それぞれトランス
フェクトした。３７℃で４時間インキュベートした後、
１５％グリセロールを含むＰＢＳ溶液で３分間刺激し
た。５％牛血清を含むＤＭＥＭ培地で３〜４日毎に半量
ずつ培地交換を行いながら４週間培養を続けた。培養終
了後、培地を捨て、氷冷メタノールを加え１５分間細胞
を固定した。水洗後、ギムザ溶液で２０分間染色した。
ディッシュを水洗、風乾後、染色されたフォーカスを数
えた。その結果を表２に示す。ＧＡＦ遺伝子には、はっ
きりとした形質転換性があることがわかった。

【００６１】 表２ ＧＡＦ遺伝子導入によるＡ３１細胞のフォーカス形成 プラスミド トランスフェクトしたＤＮＡ量（μｇ） ０ １ ２ ５ １０ ｐＴＢ１０５５ ０＊ Ｎ．Ｔ． ０ Ｎ．Ｔ． ０ｐＲＧＢ１２ ０ ３ ２８ ２５ ３３ ＊：ディッシュ当りのフォーカス数 Ｎ．Ｔ．：未検討 実施例８ （１）ＧＡＦの大腸菌での発現 （ａ）ＧＡＦ発現用プラスミドｐＥＴＧＡＦ１の構築 前記実施例５で得られたＧＡＦの全構造遺伝子を含むプ
ラスミドｐＧＡＦ１を制限酵素ＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩで
切断し、１．２５ｋｂのｃＤＮＡ断片を単離した。一
方、Ｔ７プロモーターを含むプラスミドｐＥＴ３−ｃを
制限酵素ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩで切断し、４．６ｋｂの
ＤＮＡを単離し、そこに前記のＧＡＦ ｃＤＮＡ １．２
５ｋｂ断片と、精製ＧＡＦタンパクＮ末端のＬｅｕの前
にＭｅｔが来る様に合成したＤＮＡ断片（ＮｄｅＩ−Ｋ
ｐｎＩ）（〔配列番号１１〕および〔配列番号１２〕）
を挿入して、Ｔ７プロモーターの支配下に、ＧＡＦ ｃ
ＤＮＡを発現させ得る発現用プラスミドｐＥＴＧＡＦ１
を構築した。プラスミドｐＥＴＧＡＦ１の構築図を図２
３に示す。このプラスミドを用いて大腸菌ＭＭ２９４
（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを形質転換することにより、Ｇ
ＡＦを発現する形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２９４（Ｄ
Ｅ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＥＴＧＡＦ１を得た。得られた
ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＥＴＧＡＦ１を
ＬＢ培地で培養し、イソプロピル−β−Ｄ(−)−チオガ
ラクトシド（和光純薬（株）、日本）で発現を誘導した
後、培養液２００μｌ相当の菌体全抽出蛋白質をＧＡＦ
蛋白のＮ末端部分を認識するウサギ抗ＧＡＦポリクロー
ナル抗血清（×５００倍希釈）を用いウエスタンブロッ
ティング法により調べると、特異的なバンドが確認され
た（図２４）。ＧＡＦ ｃＤＮＡの含まれないプラスミ
ドｐＥＴ３−ｃによる形質転換体ＭＭ２９４（ＤＥ３）
／ｐＬｙｓＳ，ｐＥＴ３−ｃではこのバンドは産生され
ない。

【００６２】（２）大腸菌で産生させたヒトＧＡＦ（ｒ
ｈＧＡＦ）の抽出Ｅ ．ｃｏｌｉＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＥ
ＴＧＡＦ１を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１０
μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢメディウ
ム中にて３７℃で振とう培養した。培養液のＫｌｅｔｔ
値が１２０に達した時点でイソプロピル−β−Ｄ（−）
−チオガラクトシドを最終濃度０．４ｍＭになるように
添加し、さらに３７℃にて３．５時間振とう培養した。
１リットルの培養液より、遠心（６，０００回転／分、
１０分間）により集めた菌体を、氷上にて、８０ｍｌの
２ｍＭ （ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニル フ
ルオライド ハイドロフルオライド（和光純薬（株）、
日本）、１００μｇ／ｍｌの卵白リゾチーム（生化学工
業株式会社、東京）、および０．１Ｍ食塩を含む２０ｍ
Ｍトリス塩緩衝液で懸濁させ４℃にて１時間置いた後、
３７℃で３分間インキュベートした。その懸濁液を、氷
で冷却して超音波処理（BRANSON 社製、SONIFIER（登録
商標）、米国、CELL DISRUPTOR 200 出力８にて２分
間）した。大腸菌抽出物を17,000回転／分、４０分間の
遠心により得た。

【００６３】（３）大腸菌が産生するヒトＧＡＦ（ｒｈ
ＧＡＦ）の精製 ステップ１：硫安沈殿 １リットルの培養液より得られた８０ｍｌの大腸菌抽出
物に２７ｍｌの飽和硫酸アンモニウム水溶液を添加混合
後、４℃にて１昼夜放置した。その後１７０００回転／
分，４０分間の遠心にて上清を得た。 ステップ２：疎水カラムクロマトグラフィー ステップ１で得られた１００ｍｌの遠心上清を、あらか
じめ２５％飽和硫酸を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．６）で平衡化した Butyl-Toyopearl 650 M
(ベッド容積５０ｍｌ、内径２．５ｃｍ×長さ１０ｃ
ｍ、東ソー株式会社製、東京）に通した（８０ｍｌ／時
間、４℃）。１２．５％飽和硫酸と２ｍＭ ａＰＭＳＦ
を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で充分
坦体を洗浄後、１５％グリセリン、０．１％ＣＨＡＰＳ
および２ｍＭ ａＰＭＳＦを含む２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．６）でｒｈＧＡＦ蛋白を含む画分を得た
（８０ｍｌ／時間、１０ｍｌ／フラクション、４℃）
（図２５）。 ステップ３：ヘパリンアフィニティー高速液体カラムク
ロマトグラフィー ステップ２でのｒｈＧＡＦ蛋白を含む画分（フラクショ
ン４４から４７）をプールした（４０ｍｌ）。この４０
ｍｌの溶液のうち３６ｍｌを、ＨＲ−８９４（内径８ｍ
ｍ×長さ５０ｍｍ、昭和電工、日本）を装置した高速液
体クロマトグラフィー（Gilson Medical Electronics社
製、フランス)にかけた。レジンに吸着したたんぱく質
は、Ｎａｃｌの濃度を直線的に上昇させることにより、
流速２ｍｌ／分で溶出し分画（２ｍｌ／フラクション）
した。用いた緩衝液はＡが０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．１
％ＣＨＡＰＳと１５％グリセリンを含む１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で、Ｂが２Ｍ ＮａＣｌ、
０．１％ＣＨＡＰＳと１５％グリセリンを含む１０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）である。溶出のプログ
ラムは次に記すとおりで行った。すなわち０分（１００
％Ａ）−７０分（７５％Ａ＋２５％Ｂ）−７５分（１０
０％Ｂ）−８０分（１００％Ｂ）−８５分（１００％
Ａ）として行った（図２６）。カラム温度は室温であっ
た。

【００６４】蛋白の溶出画分の１μｌを２−メルカプト
エタノール存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳
動し（ゲル濃度１２．５％）、銀染色した結果を図２７
に示す。食塩濃度を上昇させることにより溶出されてき
た画分は、２７ｋＤａの単一なバンドを与えた。またこ
の２７ｋＤａたん白はＮ末部分と結合するウサギ抗ＧＡ
Ｆポリクローナル抗血清で認識された。（図２８）。フ
ラクション２７から４２をプールした。

【００６５】（４）精製の要約 １リットルのＥ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐ
ＬｙｓＳ，ｐＥＴＧＡＦ１培養液から出発したｒｈＧＡ
Ｆの精製の要約を表３に記す。 表３ サンプル 全たん白量 全活性 比活性 活性 精製 回収率 倍数 （mg） （U） （U／mg） （％） 大腸菌抽出物 672 4.16×10⁷ 6.19×10⁴ 100 1 25%飽和硫安上清 210 4.35×10⁷ 2.07×10⁵ 105 3.3 Butyl-Toyopearl 37.6 4.10×10⁶ 1.09×10⁵ 10 1.8ヘパリンHPLC 4.5 3.31×10⁶ 7.35×10⁵ 8.0 12 生物活性は、参考例１に記載した方法で行った。生物活
性の単位はトリチウムチミジンの５０％取り込み値を示
すサンプルの希釈率の逆数とした。なお、トリチウムチ
ミジンの１００％取り込み値は、１０％ウシ胎児血清に
より誘導される値とした。蛋白質量はＭｉｃｒｏＢＣＡ
キット（ＰＩＥＲＣＥ社製、米国）により、ウシ血清ア
ルブミンを対照にして算定した。

【００６６】 実施例９ 因子の各種培養細胞に対する作用（２） （１）グリア細胞に対する増殖促進活性 実施例８−（３）に記載した方法で得られたｒｈＧＡＦ
は、グリア細胞に対し増殖促進活性を有している（図２
９）。図中横軸はＧＡＦ濃度を示す。なおグリア細胞に
対する増殖促進活性の測定方法については、参考例１に
記載した方法に従って行った。 （２）線維芽細胞に対する増殖促進活性 実施例８−（３）に記載した方法で得られたｒｈＧＡＦ
は、線維芽細胞マウスＢＡＬＢ／３Ｔ３ｃｌｏｎｅＡ３
１細胞に対し増殖促進活性を有していた（図３０）。図
中横軸はＧＡＦ濃度を示す。なお線維芽細胞Ａ３１に対
する増殖促進活性の測定については、実施例２−（４）
で記載した方法に従って行った。 （３）ラット血管平滑筋細胞に対する増殖促進活性 実施例８−（３）に記載した方法で得られたｒｈＧＡＦ
は、ラット血管平滑筋細胞に対し増殖促進活性を有して
いた（図３１）。図中横軸はＧＡＦ濃度を示す。なおラ
ット血管平滑筋細胞に対する増殖促進活性の測定につい
ては、以下に記載する方法で行った。ラット初代培養血
管平滑筋細胞を１０％仔牛血清を含むイーグルＭＥＭ培
地でヌンク９６穴マイクロタイタープレート（平底）に
１穴あたり３×１０³個を１００μｌの培地にて播種し
て培養し、翌日、各ウェルより８０μｌの培地を廃棄し
各ウェルに血清を含まないイーグルＭＥＭ培地を１８０
μｌ添加した。２日間培養したのち各ウェルより２０μ
ｌの培地を廃棄した。その後、０．１％ウシ血清アルブ
ミンを含むＤＭＥＭ培地で適当に希釈したテストサンプ
ルの２０μｌを各ウェルに添加後一晩培養した。翌朝、
各ウェルに１μＣｉのトリチウムチミジン（５Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌ、１ｍＣｉ／ｍｌ ＲＣＣ Ａｍｅｒｓｈａｍ）
を添加後、さらに５時間培養した。培養後、各ウェルの
培地を廃棄後、各ウェルに１００μｌの０．５トリプシ
ンと０．０１％ＥＤＴＡを含むＰＢＳを添加し、数分の
間室温にて放置した。顕微鏡で細胞が浮遊していること
を確認した後、浮遊細胞をタイターテックセルハーベス
ター（Flow laboratones社製、Virginia，USA)を用いて
ガラスファイバーフィルター(大日本製薬株式会社製)上
に集め水で洗浄後、細胞に取り込まれたトリチウムチミ
ジンのカウントを液体シンチレーションカウンターにて
測定した。

【００６７】 （４） ヒトさい帯血管内皮細胞に対する作用 実施例８−（３）に記載した方法で得られたｒｈＧＡＦ
は、ヒトさい帯血管内皮細胞に対して増殖促進活性を有
していなかった（図３２）。図中横軸はＧＡＦまたはｂ
ＦＧＦのたん白濃度を示す。なおヒトさい帯血管内皮細
胞に対する増殖促進活性の測定については、実施例２−
（５）に記載した方法に従って行った。

【００６８】 （５）ｒｈＧＡＦの巨核球系コロニー刺激因子活性 ＢＡＬＢ／ｃメスマウス骨髄細胞は、２０％ウシ胎児血
清（ＦＣＳ）含有イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤ
Ｍ）に２×１０⁷個／ｍｌとなるように懸濁し、ＦＣＳ
をコートしたプラスチック培養皿中で３７℃、１時間イ
ンキュベーションして付着性細胞を除去した。得られた
非付着性骨髄細胞は、ＩＭＤＭで３回洗浄した後実験に
供した。細胞を１％NeutridomaSP(boehringer mannheim
社)含有ＩＭＤＭに懸濁し、ヒトリコンビナントＧＡＦ
（ｒｈＧＡＦ）とともに１×１０⁵個ずつ９６穴平底プ
レートに播種した。ｒｈＧＡＦは０．６Ｍ ＮａＣｌ，
１５％グリセリン，０．１％ＣＨＡＰＳ，１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に１２５μｇ／ｍｌ溶解
したものをＩＭＤＭで希釈して使用し、ＧＡＦを含まな
い緩衝液も同様に希釈して実験系に添加した。また、ポ
ジティブコントロールとしてマウスリコンビナントＩＬ
−３（ｍｒＩＬ−３）（Genzyme社）を用いた。これ
を、３７℃、５％ＣＯ₂を含む空気の存在下で４日間培
養した。その後、５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ（SIGMA社)含有
ＰＢＳ溶液を２０μｌ添加し、３７℃で５時間培養し
た。１０％ＳＤＳ，０．０１Ｎ ＨＣｌ溶液を１００μ
ｌ添加し、３７℃でさらに１晩インキュベートした後、
５９０ｎｍの吸光度を測定し、骨髄細胞の増殖を調べ、
図３３に示した。一方、同様に調製した細胞を３７℃、
５％ＣＯ₂を含む空気の存在下で７日間培養した。５％
グルタルアルデヒド含有ＰＢＳ溶液を５０μｌ添加して
２０００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞を固定した。０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で一度洗浄後、アセチ
ルコリンエステラーゼ染色（続生化学実験講座 ８ 血液
上巻，１４９頁参照）にて巨核球を染色し、ウェルあた
りの巨核球数を倒立顕微鏡下で数え、図３４に示した。
これらの結果から、ｒｈＧＡＦにはマウス骨髄細胞を増
殖させる活性があること、さらに骨髄細胞中の巨核芽球
に作用してこの細胞を増殖分化させる活性があることが
明らかとなった。

【００６９】

【００７０】

【配列表】

配列番号(SEQ ID NO)： 1 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)： 208 配列の型(SEQUENCE TYPE)：アミノ酸（amino acid） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：タンパク質（protein） ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｎｏ 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：Homo sapiens ハプロタイプ(HAPLO TYPE)：2n 組織の種類(TISSUE TYPE)：skin 細胞の種類(CELL TYPE)：fibroblast 直接起源(IMMIDIATE SOURCE)： ライブラリー名(LIBRARY)：Human foreskin cDNA libra
ry クローン名(CLONE)：pGAF1 配列: Met Ala Pro Leu Gly Glu Val Gly Asn Tyr Phe Gly Val Gln Asp Ala 5 10 15 Val Pro Phe Gly Asn Val Pro Val Leu Pro Val Asp Ser Pro Val Leu 20 25 30 Leu Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly 35 40 45 Pro Ala Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg 50 55 60 Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly 65 70 75 80 Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu 85 90 95 Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser 100 105 110 Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu 115 120 125 Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp 130 135 140 Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg 145 150 155 160 Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr 165 170 175 Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val 180 185 190 Asp Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 195 200 205。

【００７１】配列番号(SEQ ID NO)： 2 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)： 1493 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：二本鎖（double） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)： Ｎｏ アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｎｏ 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：Homo sapiens ハプロタイプ(HAPLO TYPE)：2n 組織の種類(TISSUE TYPE)：skin 細胞の種類(CELL TYPE)：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ 直接起源（ＩＭＭＩＤＩＡＴＥ ＳＯＵＲＣＥ）： ライブラリー名(LIBRARY)：Human foreskin cDNA libra
ry クローン名(CLONE)：pGAF1 配列: TGAAACAGCA GATTACTTTT ATTTATGCAT TTAATGGATT GAAGAAAAGA ACCTTTTTTT 60 TTCTCTCTCT CTCTGCAACT GCAGTAAGGG AGGGGAGTTG GATATACCTC GCCTAATATC 120 TCCTGGGTTG ACACCATCAT TATTGTTTAT TCTTGTGCTC CAAAAGCCGA GTCCTCTGAT 180 GGCTCCCTTA GGTGAAGTTG GGAACTATTT CGGTGTGCAG GATGCGGTAC CGTTTGGGAA 240 TGTGCCCGTG TTGCCGGTGG ACAGCCCGGT TTTGTTAAGT GACCACCTGG GTCAGTCCGA 300 AGCAGGGGGG CTCCCCAGGG GACCCGCAGT CACGGACTTG GATCATTTAA AGGGGATTCT 360 CAGGCGGAGG CAGCTATACT GCAGGACTGG ATTTCACTTA GAAATCTTCC CCAATGGTAC 420 TATCCAGGGA ACCAGGAAAG ACCACAGCCG ATTTGGCATT CTGGAATTTA TCAGTATAGC 480 AGTGGGCCTG GTCAGCATTC GAGGCGTGGA CAGTGGACTC TACCTCGGGA TGAATGAGAA 540 GGGGGAGCTG TATGGATCAG AAAAACTAAC CCAAGAGTGT GTATTCAGAG AACAGTTCGA 600 AGAAAACTGG TATAATACGT ACTCGTCAAA CCTATATAAG CACGTGGACA CTGGAAGGCG 660 ATACTATGTT GCATTAAATA AAGATGGGAC CCCGAGAGAA GGGACTAGGA CTAAACGGCA 720 CCAGAAATTC ACACATTTTT TACCTAGACC AGTGGACCCC GACAAAGTAC CTGAACTGTA 780 TAAGGATATT CTAAGCCAAA GTTGACAAAG ACAATTTCTT CACTTGAGCC CTTAAAAAAG 840 TAACCACTAT AAAGGTTTCA CGCGGTGGGT TCTTATTGAT TCGCTGTGTC ATCACATCAG 900 CTCCACTGTT GCCAAACTTT GTCGCATGCA TAATGTATGA TGGAGGCTTG GATGGGAATA 960 TGCTGATTTT GTTCTGCACT TAAAGGCTTC TCCTCCTGGA GGGCTGCCTA GGGCCACTTG 1020 CTTGATTTAT CATGAGAGAA GAGGAGAGAG AGAGAGACTG AGCGCTAGGA GTGTGTGTAT 1080 GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT ATGTGTGTAG CGGGAGATGT GGGCGGAGCG 1140 AGAGCAAAAG GACTGCGGCC TGATGCATGC TGGAAAAAGA CACGCTTTTC ATTTCTGATC 1200 AGTTGTACTT CATCCTATAT CAGCACAGCT GCCATACTTC GACTTATCAG GATTCTGGCT 1260 GGTGGCCTGC GCGAGGGTGC AGTCTTACTT AAAAGACTTT CAGTTAATTC TCACTGGTAT 1320 CATCGCAGTG AACTTAAAGC AAAGACCTCT TAGTAAAAAA TAAAAAAAAA TAAAAAATAA 1380 AAATAAAAAA AGTTAAATTT ATTTATAGAA ATTCCAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1440 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 1493。

【００７２】配列番号(SEQ ID NO)：3 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：21 配列の型(SEQUENCE TYPE)：アミノ酸（amino acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：タンパク質（protein） ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｎｏ アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｎｏ フラグメント型(FRAGMENT TYPE)：N-terminal fragment 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：Homo sapiens ハプロタイプ(HAPLO TYPE)：2n 組織の種類(TISSUE TYPE)：brain 細胞の種類(CELL TYPE)：glioma セルライン(CELL LINE)：NMC-G1 配列の特徴(FEATURE) 特徴を決定した方法(IDENTIFICATION METHOD)：Ｅ 3 Xaa= His または Pro 14 Xaa= undetermined 配列: Ala Asp Xaa Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Xaa Gly Pro 5 10 15 Ala Val Thr Asp Leu 20。

【００７３】配列番号(SEQ ID NO)：4 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：13 配列の型(SEQUENCE TYPE)：アミノ酸（amino acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：タンパク質（protein） ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｎｏ アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｎｏ フラグメント型(FRAGMENT TYPE)：N-terminal fragment 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：Homo sapiens ハプロタイプ(HAPLO TYPE)：2n 組織の種類(TISSUE TYPE)：brain 細胞の種類(CELL TYPE)：glioma セルライン(CELL LINE)：NMC-G1 配列の特徴(FEATURE) 1 Xaa = undetermined 12 (Ser) = predicted 特徴を決定した方法(IDENTIFICATION METHOD):E 配列: Xaa Gln Asp Ala Val Pro Phe Gly Asn Val Pro (Ser) Leu 5 10。

【００７４】配列番号(SEQ ID NO)：5 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：23 配列の型(SEQUENCE TYPE)：アミノ酸（amino acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：タンパク質（protein） ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｎｏ フラグメント型(FRAGMENT TYPE)：N-terminal fragment 起源（ＯＲＩＧＩＮＡＬ ＳＯＵＲＣＥ） 生物名（ＯＲＧＡＮＩＳＭ）：Homo sapiens ハプロタイプ(HAPLO TYPE)：2n 組織の種類(TISSUE TYPE)：brain 細胞の種類(CELL TYPE)：glioma セルライン(CELL LINE)：NMC-G1 配列の特徴(FEATURE) 1 Xaa= Leu または Ala 20 (Pro) = predicted 21 Xaa = undetermined 特徴を決定した方法(IDENTIFICATION METHOD)：Ｅ 配列: Xaa Gly Glu Val Gly Asn Tyr Phe Gly Val Gln Asp Ala Val Pro Phe 5 10 15 Gly Asn Val (Pro) Xaa Leu Leu 20。

【００７５】配列番号(SEQ ID NO)：6 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：25 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（other nuclei
c acid） 合成DNA(synthetic DNA) ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｙｅｓ アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｎｏ 配列の特徴(FEATURE) 11,14 I = inosine 配列: AAGGATCCGT IGGIAAYTAY TTYGG 25。

【００７６】配列番号(SEQ ID NO)：7 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：25 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（other nuclei
c acid） 合成DNA(synthetic DNA) ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｙｅｓ アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｙｅｓ 配列の特徴(FEATURE) 14,20,23 I = inosine 配列: AAGAATTCAC RTTICCRAAI GGIAC 25。

【００７７】配列番号(SEQ ID NO)：8 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：59 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：二本鎖（double） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（other nuclei
c acid） (PCR product from genomic DNA) ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｎｏ アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｎｏ 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：Homo sapiens 配列: GGATCCGTGG GGAACTATTT CGGGGTGCAG GATGCGGTCC CCTTCGGCAA CGTGAATTC 59。

【００７８】配列番号(SEQ ID NO)：9 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：30 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（other nuclei
c acid） 合成DNA(synthetic DNA) ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｙｅｓ アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｎｏ 配列: TGGGGAACTA TTTCGGGGTG CAGGATGCGG 30。

【００７９】配列番号(SEQ ID NO)：10 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：30 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（other nuclei
c acid） 合成DNA(synthetic DNA) ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｙｅｓ アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｙｅｓ 配列: ACGTTGCCGA AGGGGACCGC ATCCTGCACC 30。

【００８０】配列番号(SEQ ID NO)：11 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：47 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（other nuclei
c acid） 合成DNA(synthetic DNA) ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：No アンチセンス(ANTI-SENCE)：No 配列: TATGTTAGGT GAAGTTGGGA ACTATTTCGG TGTGCAGGAT GCGGTAC 47。

【００８１】配列番号(SEQ ID NO)：12 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：41 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（other nuclei
c acid） 合成DNA(synthetic DNA) ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：No アンチセンス(ANTI-SENCE)：Yes 配列: CGCATCCTGC ACACCGAAAT AGTTCCCAAC TTCACCTAAC A 41。

【図面の簡単な説明】

【図１】へパリンセファロース（登録商標）ＣＬ−６Ｂ
カラムクロマトグラフィー（実施例１ステップ１）で
のたん白と活性の溶出パターンを示す図である。

【図２】セファクリルＳ−２００ＨＲカラムクロマトグ
ラフィー（実施例１ステップ３）でのたん白と活性の
溶出パターンを示す図である。

【図３】へパリンセファロース（登録商標）ＣＬ−６Ｂ
カラムクロマトグラフィー（実施例１ステップ４）で
のたん白と活性の溶出パターンを示す図である。

【図４】ＨＲ−８９４ヘパリンアフィニティー高速液体
カラムクロマトグロフィー（実施例１ステップ５）で
のたん白と活性の溶出パターンを示す図である。

【図５】Vydac Ｃ４高速液体カラムクロマトグロフィー
（実施例１ステップ６）でのたん白と活性の溶出パタ
ーンを示す図である。

【図６】精製グリア活性化因子（ＮＭＣ−Ｇ１由来）の
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。

【図７】精製グリア活性化因子のグリア細胞に対する増
殖促進活性を示すグラフである。

【図８】ＮＭＣ−Ｇ１由来精製グリア活性化因子のグリ
ア細胞に対する増殖促進活性を示すグラフである。

【図９】グリア活性化因子（ＮＭＣ−Ｇ１由来）による
グリア細胞数の増加を示す図である。

【図１０】グリア活性化因子（ＮＭＣ−Ｇ１由来）によ
るグリア細胞へのトリチウムチミジン取り込み促進の経
時変化を示す図である。●はＧＡＦ添加群を○はＧＡＦ
無添加のコントロール群を示す。

【図１１】精製グリア活性化因子（ＮＭＣ−Ｇ１由来）
の線維芽細胞マウスＢＡＬＢ／３Ｔ３ｃｌｏｎｅＡ３１
細胞に対する増殖促進活性を示すグラフである。

【図１２】ＮＭＣ−Ｇ１由来精製グリア活性化因子の線
維芽細胞マウスＢＡＬＢ／３Ｔ３ｃｌｏｎｅＡ３１細胞
に対する増殖促進活性を示すグラフである。

【図１３】精製グリア活性化因子（ＮＭＣ−Ｇ１由来）
のヒトさい帯血管内皮細胞に対する増殖促進活性を示す
図である。

【図１４】精製グリア活性化因子（ＮＭＣ−Ｇ１由来）
のラット副腎褐色細胞腫由来ＰＣ−１２細胞株に対する
トリチウム取り込み促進活性を示す図である。

【図１５】グリア活性化因子（ＮＭＣ−Ｇ１由来）活性
の熱・酸安定性を示すグラフである。

【図１６】ａＦＧＦ、ｂＦＧＦとグリア活性化因子（Ｎ
ＭＣ−Ｇ１由来）間の免疫学的交差性を示す図である。

【図１７】ＧＡＦ（ＮＭＣ−Ｇ１由来）のビオチニル化
コンカナバリンＡおよびアビディンとビオチニル化ペル
オキシダーゼを用いた染色の図である。

【図１８】ＧＡＦ（ＮＭＣ−Ｇ１由来）のＮ−グリカナ
ーゼ処理の結果である。

【図１９】ＧＡＦ ｃＤＮＡの塩基配列とそれにより規
定されるアミノ酸配列を示す図である。

【図２０】ｐＧＡＦ１をＣＯＳ−７細胞で発現させ、グ
リア細胞に対する増殖促進活性を測定した結果である。

【図２１】プラスミドｐＤＧＡＦ１の構築を示す図であ
る。

【図２２】メトトレキセート耐性ＣＨＯ細胞培養上清中
に含まれるＧＡＦ活性を示す図である。

【図２３】プラスミドｐＥＴＧＡＦ１の構築を示す図で
ある。

【図２４】ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＥＴ
ＧＡＦ１の抽出物中に含まれるｒｈＧＡＦをウエスタン
ブロッティング法により染色した図である。

【図２５】疎水カラムクロマトグラフィー（実施例７
（３）ステップ２）でのたん白の溶出パターンを示す図
である。

【図２６】ヘパリンアフィニティー高速液体カラムクロ
マトグラフィー（実施例８−（３）ステップ３）でのた
ん白の溶出パターンを示す図である。

【図２７】精製ｒｈＧＡＦのＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動図である。

【図２８】精製ｒｈＧＡＦをウエスタンブロッティング
法により染色した図である。

【図２９】精製ｒｈＧＡＦのグリア細胞に対する増殖促
進活性を示す図である。

【図３０】精製ｒｈＧＡＦの線維芽細胞株ＢＡＬＢ／３
Ｔ３ｃｌｏｎｅＡ３１細胞に対する増殖促進活性を示す
図である。

【図３１】精製ｒｈＧＡＦのラット血管平滑筋細胞に対
する増殖促進活性を示す図である。

【図３２】精製ｒｈＧＡＦのヒトさい帯血管内皮細胞増
殖に対する作用を示す図である。

【図３３】精製ｒｈＧＡＦのマウス骨髄細胞増殖に対す
る作用を示す図である。

【図３４】精製ｒｈＧＡＦのマウス骨髄細胞中巨核芽球
に対する作用を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ１２Ｒ 1:19 Ａ６１Ｐ 25/00 １７１ 1:91 43/00 １７１ Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 前置審査 (56)参考文献 Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．，1982年，Ｖｏｌ．397，ｐ．25− 33 Ｎａｔｕｒｅ，1990年，Ｖｏｌ．348, Ｎｏ．6298，ｐ．257−260 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 5/28 C12P 21/00 - 21/08 C07K 14/00 - 14/825 A61K 38/00 - 38/58 A61P 1/00 - 43/00

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次のアミノ酸配列： Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp で示されるポリペプチドを含有するグリア活性化因子。
2. 【請求項２】次のアミノ酸配列： (Met)n-X1-Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp -X2 〔ただしnは０または１を、X1 は Ala Pro Leu Gly Glu
   Val Gly Asn Tyr PheGly Val Gln Asp Ala Val Pro Ph
   e Gly Asn Val Pro Val Leu Pro Val Asp SerPro Val L
   eu Leu Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly
   Leu Pro ArgGly Pro Ala Val Thr Asp またはその断片
   を、X2 は Lys Val Pro Glu Leu TyrLys Asp Ile Leu S
   er Gln Ser またはその断片を、それぞれ示す〕で示さ
   れるポリペプチドからなる請求項１記載のグリア活性化
   因子。
3. 【請求項３】次のアミノ酸配列： (Met)n X3 Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly Pro Ala Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 〔ただしnは０または１を、X3 は Ala Pro もしくは Le
   u Gly Glu Val Gly AsnTyr Phe Gly Val Gln Asp Ala V
   al Pro Phe Gly Asn Val Pro Val Leu Pro ValAsp Ser
   Pro Val Leu Leu またはその断片を、それぞれ示す〕で
   示されるポリペプチドからなる請求項１記載のグリア活
   性化因子。
4. 【請求項４】請求項１ないし３のいずれかのグリア活性
   化因子をコードするポリヌクレオチドを含有するＤＮ
   Ａ。
5. 【請求項５】ポリヌクレオチドが次の塩基配列： TTG GATCATTTAA AGGGGATTCT CAGGCGGAGG CAGCTATACT GCAGGACTGG ATTTCACTTA GAAATCTTCC CCAATGGTAC TATCCAGGGA ACCAGGAAAG ACCACAGCCG ATTTGGCATT CTGGAATTTA TCAGTATAGC AGTGGGCCTG GTCAGCATTC GAGGCGTGGA CAGTGGACTC TACCTCGGGA TGAATGAGAA GGGGGAGCTG TATGGATCAG AAAAACTAAC CCAAGAGTGT GTATTCAGAG AACAGTTCGA AGAAAACTGG TATAATACGT ACTCGTCAAA CCTATATAAG CACGTGGACA CTGGAAGGCG ATACTATGTT GCATTAAATA AAGATGGGAC CCCGAGAGAA GGGACTAGGA CTAAACGGCA CCAGAAATTC ACACATTTTT TACCTAGACC AGTGGACCCC GAC で示されるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチ
   ドである請求項４記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】ポリヌクレオチドが次の塩基配列： Y1-TTG GATCATTTAA AGGGGATTCT CAGGCGGAGG CAGCTATACT GCAGGACTGG ATTTCACTTA GAAATCTTCC CCAATGGTAC TATCCAGGGA ACCAGGAAAG ACCACAGCCG ATTTGGCATT CTGGAATTTA TCAGTATAGC AGTGGGCCTG GTCAGCATTC GAGGCGTGGA CAGTGGACTC TACCTCGGGA TGAATGAGAA GGGGGAGCTG TATGGATCAG AAAAACTAAC CCAAGAGTGT GTATTCAGAG AACAGTTCGA AGAAAACTGG TATAATACGT ACTCGTCAAA CCTATATAAG CACGTGGACA CTGGAAGGCG ATACTATGTT GCATTAAATA AAGATGGGAC CCCGAGAGAA GGGACTAGGA CTAAACGGCA CCAGAAATTC ACACATTTTT TACCTAGACC AGTGGACCCC GAC-Y2 〔ただし、Y1は GCTCCCTTA GGTGAAGTTG GGAACTATTT CGG
   TGTGCAG GATGCGGTAC CGTTTGGGAA TGTGCCCGTG TTGCCGGTG
   G ACAGCCCGGT TTTGTTAAGT GACCACCTGG GTCAGTCCGA AGCA
   GGGGGG CTCCCCAGGG GACCCGCAGT CACGGAC またはその断
   片を、Y2はAAAGTAC CTGAACTGTA TAAGGATATT CTAAGCCAAA
   GT またはその断片を、それぞれ示す〕ないしその５’
   末端に開始コドンATG を含有する塩基配列で示されるポ
   リヌクレオチドである請求項４記載のＤＮＡ。
7. 【請求項７】ポリヌクレオチドが次の塩基配列： Y3−AGT GACCACCTGG GTCAGTCCGA AGCAGGGGGG CTCCCCAGGG GACCCGCAGT CACGGACTTG GATCATTTAA AGGGGATTCT CAGGCGGAGG CAGCTATACT GCAGGACTGG ATTTCACTTA GAAATCTTCC CCAATGGTAC TATCCAGGGA ACCAGGAAAG ACCACAGCCG ATTTGGCATT CTGGAATTTA TCAGTATAGC AGTGGGCCTG GTCAGCATTC GAGGCGTGGA CAGTGGACTC TACCTCGGGA TGAATGAGAA GGGGGAGCTG TATGGATCAG AAAAACTAAC CCAAGAGTGT GTATTCAGAG AACAGTTCGA AGAAAACTGG TATAATACGT ACTCGTCAAA CCTATATAAG CACGTGGACA CTGGAAGGCG ATACTATGTT GCATTAAATA AAGATGGGAC CCCGAGAGAA GGGACTAGGA CTAAACGGCA CCAGAAATTC ACACATTTTT TACCTAGACC AGTGGACCCC GACAAAGTAC CTGAACTGTA TAAGGATATT CTAAGCCAAA GT 〔ただし、Y3は GCTCCCTTA GGTGAAGTTG GGAACTATTT CGG
   TGTGCAG GATGCGGTAC CGTTTGGGAA TGTGCCCGTG TTGCCGGTG
   G ACAGCCCGGT TTTGTTA またはその断片を示す〕ないし
   その５’末端に開始コドンATG を含有する塩基配列で示
   されるポリヌクレオチドである請求項４記載のＤＮＡ。
8. 【請求項８】請求項４記載のＤＮＡを含有するベクター
   で形質転換された形質転換体。
9. 【請求項９】請求項４記載のＤＮＡで宿主を形質転換
   し、得られた形質転換体を培地に培養し、培養物中にグ
   リア活性化因子を生成蓄積せしめ、これを採取すること
   を特徴とする該因子の製造法。
10. 【請求項１０】治療的に有効な量の請求項１ないし３の
    いずれかのグリア活性化因子と製剤学的に許容し得る担
    体を含有する脳神経細胞損傷疾患用治療剤または創傷用
    治療剤。