DE69306273T2

DE69306273T2 - Mitogen für die glatte Muskulatur und dessen kodierende DNS

Info

Publication number: DE69306273T2
Application number: DE69306273T
Authority: DE
Inventors: Moses Judah Folkmann; Koichi Igarashi; Yuen Shing
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd; Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd; Childrens Medical Center Corp
Priority date: 1992-02-10
Filing date: 1993-02-06
Publication date: 1997-04-03
Anticipated expiration: 2013-02-07
Also published as: JPH0687894A; EP0555785B1; CA2089111C; ES2099304T3; DE69306273D1; DK0555785T3; JP3621431B2; ATE145939T1; CA2089111A1; EP0555785A1

Description

Die vorliegende Erfindung ist auf einen rekombinanten, nicht-glykosylierten menschlichen Wachstumsfaktor, der das Wachstum von Glattmuskelzellen stimuliert, und auf Verwendungen desselben gerichtet.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Obschon die Glattmuskelzellvermehrung ausgedehnt untersucht worden ist (siehe z.B. Schwartz et al., Circulation Research, Bd. 58, Nr. 4, Seite 427, deren Offenbarung hierin durch Verweis inbegriffen ist), sind die Signale, welche die Glattmuskelzellvermehrung steuern größtenteils unbekannt geblieben. Von der Glattmuskelzellvermehrung ist bekannt, daß sie bei Krankheiten wie etwa Arteriosklerose (Atherosklerose und Bluthochdruck) eine zentrale Rolle spielt. Das Fehlen der Glattmuskelzellvermehrung bei Kleinkindern spielt auch bei Gefäßmißbildungen eine Rolle. Dieses Versagen der Glattmuskelzellvermehrung führt zu nicht behandelbaren Gefäßläsionen, die oft zum Tod führen.
Obschon jetzt allgemein anerkannt wird, daß die Glattmuskelzellvermehrung während der Bildung atherosklerotischer Läsionen auftritt, ist die Rolle dieser Vermehrungsantwort in der Gesamtgeschichte der Plaque überhaupt nicht offensichtlich. Einige Forscher haben behauptet, daß die während der Entwicklung von Arterien auftretende Vermehrung das Anfangsereignis atherosklerotischer Läsionen ist, das einer Lipidanreicherung oder Endotheliumsverletzung vorangeht.
Die Haupthypothese, welche die Glattmuskelzellvermehrung in der Gefäßwand erklärt, ist die Hypothese einer Antwort auf eine Verletzung. Kurz gesagt ist die Hypothese die, daß sich Glattmuskelzellen in der Wand normalerweise im Ruhezustand befinden. Wenn das Endothelium verletzt wird, setzen Blutplättchen einen Faktor oder Faktoren frei, welche die Bewegung von Glattmuskelzellen in die und die Vermehrung innerhalb der Arterienintima stimulieren (Ross, Arteriosclerosis 1:293-311, 1981). Ross zeigte auch, daß die kultivierten Glattmuskelzellen einen aus Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF) zur Vermehrung benötigen (Ross und Glomset, N. Engl. J. Med. 295; 369-377 und 420-425, 1976). Der offensichtliche Schluß ist, daß eine Plättchenfreisetzung für die Glattmuskelvermehrungsantwort auf eine Denudation unter Aufblähen notwendig ist.
Die Beobachtung von Ross führte zur darauffolgenden Reinigung des PDGF, der Ermittlung seines Rezeptors und kürzlich dem Nachweis des Onkogens c-sis als dem Gen für eine der beiden PDGF-Peptidketten.
Das zweite bekannte Erfordernis für den Ablauf des Zellcyclus ist die Verfügbarkeit von Somatomedin C, das auch als insulinähnlicher Wachstumsfaktor (IGF-1) bekannt ist. IGF-1 selbst kann durch Glattmuskelzellen synthetisiert werden und Antikörper gegen IGF-1 hemmen den Ablauf des Zellcyclus. Diese Daten legen nahe, daß PDGF die Produktion seines eigenen Progressionsfaktors stimulieren kann. Diese Beobachtung ist von beträchtlicher Bedeutung gegenüber der interessanten Möglichkeit, daß die Glattmuskelvermehrung durch der Gefäßwand innewohnende Faktoren gesteuert werden kann.
Abgesehen von PDGF sind auch andere für Glattmuskelzellen mitogene Substanzen untersucht worden. Außerdem enthalten Blutplättchen auch ein Protein, das dem Epidermiswachstumsfaktor (EGF) ähnelt (Oka und Orth, J. Clin. Invest. 72:249-259, 1983) und Assoian et al., 1984) und einen β-Tumorwachstumsfaktor genannten Faktor, der das Zellwachstum in Suspension unterstützen kann (Tucker et al., Science 226: 705-777, 1984). Der relative Beitrag eines jeden davon zur Stimulation der Vermehrung ist größtenteils unbekannt.
Ein weiterer Wachstumsfaktor (BTC-CG) mit der Aminosäuren-Teilsequenz
ist aus der. EP-A-0 482 623 (zitiert unter Art. 54 (3) EPÜ) bekannt.
Zusätzlich erwähnt das Journal of Cell Biology Bd. 111, Nr. 5/2, S. 227A (1990), daß der Wachstumsfaktor (BTC-GF) aus dem konditionierten Medium von Pankreas-Betatumorzellen gereinigt wird, welche anfänglich aus transgenen Mäusen (RIP1-Tag2) stammen, in denen praktisch jede Betazelle das Onkogen SV40 Groß-T exprimierte.
Die Stimuli, welche die Glattmuskelvermehrung bei Bluthochdruck steuern, bleiben ebenfalls größtenteils unbekannt. PDGF kann eine wichtige Rolle bei Änderungen der Mikrogefäße bei malignem Bluthochdruck spielen, ist aber wahrscheinlich nicht an großen Gefäßen beteiligt oder an Gefäßen, die von milderen und chronischeren Formen hohen Blutdrucks betroffen sind.
Obschon es viel Forschung über die Rolle glatter Muskeln bei der Pathologie verschiedener Erkrankungen gegeben hat und mehrere Mechanismen und die Rolle von Wachstumsfaktoren wie etwa PDGF erforscht worden sind, besteht weiter ein Bedarf nach Informationen über Mitogene, welche die Glattmuskelzellvermehrung stimulieren. Der Nachweis derartiger Mitogene gestattet es, sich verschiedene Behandlungsstrategien auszudenken, wie etwa Strategien des konkurrierenden Bindens unter Einsetzen von Antikörpern gegenüber dem Glattmuskelmitogen oder konkurrierende Proteine, die an die Rezeptoren für derartige Mitogene binden. Glattmuskelmitogene können auch bei der Behandlung von Zuständen wie etwa einer Gefäßmißbildung oder als Wachstumsfaktor bei der Wund-/Ulkusheilung verwendet werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf
(1) einen rekombinanten menschlichen Wachstumsfaktor (nachstehend "BTC-GF") mit den folgenden Eigenschaften:
a) das Protein hat ein Molekulargewicht von etwa 32 000 bei der SDS-PAGE;
b) das Protein ist stabil, wenn es 10 mM Dithiothreit ausgesetzt wird;
c) das Protein stimuliert die Vermehrung von Glattmuskelzellen;
d) das Protein hat eine Aminosäurensequenz, welche die Aminosäuren Nr. 1 bis Nr. 147 von Figur 10 oder die Aminosäuren Nr. 1 bis 80 von Figur 10 umfaßt;
(2) eine isolierte DNA, die für das BTC-GF-Protein von (1) vorstehend kodiert;
(3) einen rekombinanten Vektor, der die DNA von (2) vorstehend umfaßt;
(4) eine Transformante, die den Vektor von (3) vorstehend umfaßt, und
(5) ein Verfahren zum Herstellen des BTC-GF-Proteins von (1) vorstehend, welches das Kultivieren der Transformante von (4) vorstehend umfaßt.
Maus-BTC-GF wurde anfänglich aus dem konditionierten Medium von Pankreas-Tumorzellen erhalten, die anfänglich aus transgenen Mäusen (RIP1-Tag 2) stammten, bei denen praktisch alle Betazellen das Onkogen SV40 Groß-T exprimierten. Eine Probe der Pankreas-Tumorzellen (nachstehend "BTC-3-Zellen"), aus denen BTC-GF ursprünglich nachgewiesen, isoliert und gereinigt wurde, ist am 26. Oktober 1990 unter der ATCC-Zugangsnummer CRL 10585 bei der American Type Culture Collection unter dem Budapester Vertrag hinterlegt worden. BTC- GF kann auch aus einer Sublinie von Pankreastumorzellen (nachstehend "BTC-JC10-Zellen") gereinigt werden, von welchen eine Probe am 24. September 1991 unter der ATCC-Zugangsnummer CRL 10875 bei der American Type Culture Collection unter dem Budapester Vertrag hinterlegt worden ist.
BTC-GF ist ein Mitogen für Glattmuskelzellen, 3T3-Fibroblasten und Retinapigment-Epitheliumszellen aber nicht für Endotheliumszellen. BTC-GF wird durch Kochen, durch 10 mM Dithiothreit oder durch Aussetzen gegenüber 1M Essigsäure nicht inaktiviert. Die biologische Aktivität von BTC-GF liegt als einzelne Proteinbande mit einem Molekulargewicht von etwa 32000 bei der SDS-PAGE vor. Die N-terminale Aminosäurenteilsequenz von BTC-GF (SEQ ID Nr. 1), die durch Vergleichen der N-terminalen Aminosäurensequenz von sowohl aus BTC-3- als auch BTC-JC10-Zellen gereinigtem BTC-GF und durch Ableitung aus der Nukleotidsequenz von BTC-GF-cDNA bestimmt wurde, ist:
(siehe Figur 7 und 9).
Eine Computerrecherche in der übersetzten GENBANK und der NBRF- Proteindatenbank zeigte keine ähnlichen Proteine.
BTC-GF kann sowohl bei der Behandlung von Erkrankungen wie etwa einer Gefäßmißbildung als auch bei der Behandlung von Wunden/Ulzera und dergleichen verwendet werden. BTC-GF kann auch zum Herstellen konkurrierender Mittel wie etwa Antikörpern oder falschen Peptiden verwendet werden. Da BTC-GF aus den insulinproduzierenden Inselzellen stammt, können derartige konkurrierende Mittel bei der Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, die sich aus der Glattmuskelzellvermehrung ergeben, wie etwa Atherosklerose und Diabetes- Retinopathie, die sowohl bei Diabetes als auch Bluthochdruck beobachtet werden. Er kann auch als diagnostischer Test verwendet werden, bei dem zum Beispiel ein Antikörper gegenüber dem Wachstumsfaktor diesen Faktor in dem Blut von Diabetikern nachweisen kann, bei denen das Anfärben oder Regenerieren von Betazellen mit Inseln den Faktor freisetzt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 veranschaulicht die 3T3-Zellwachstumsfaktoraktivität von Maus-BTC-GF, nachdem konzentriertes, serumfreies, mit Betatumorzellen konditioniertes Medium durch eine Biorex 70-Kationenaustauschsäule geleitet wurde.
Figur 2 veranschaulicht die 3T3-Zellwachstumsfaktoraktivität vereinigter aktiver Fraktionen von Figur 1, als sie durch eine Phenyl- Sepharose -Säule geleitet wurden.
Figur 3 veranschaulicht die 3T3-Zellwachstumsfaktoraktivität vereinigter aktiver Fraktionen aus der Phenyl-Sepharose -Säule, als sie durch eine FPLC-Heparin-Affinitätssäule geleitet wurden.
Figur 4 veranschaulicht die 3T3-Zellwachstumsfaktoraktivität vereinigter aktiver Fraktionen aus der Heparin-Affinitätssäule, als sie durch eine HPLC C4-Umkehrphasensäule geleitet wurden.
Figur 5 ist eine Silberanfärbung von Maus-BTC-GF auf einem Gel aus den vereinigten aktiven Fraktionen, die durch Wiederholen der HPLC C4-Umkehrphasensäulenreinigung erhalten wurden.
Figur 6 veranschaulicht die mitogene Aktivität von Maus-BTC-GF an Rinderglattmuskelzellen.
Figur 7 veranschaulicht die N-terminale Aminosäurensequenz von aus BTC-3- beziehungsweise BTC-JC10-Zellen gereinigtem BTC-GF.
Figur 8 veranschaulicht die interne Aminosäurensequenz von Maus- BTC-GF aus den Aminosäuren 33-80 von Figur 9.
Figur 9 veranschaulicht die Basensequenz von Maus-BTC-GF-cDNA und der abgeleiteten Aminosäurensequenz von Maus BTC-GF.
Figur 10 veranschaulicht die Basensequenz und abgeleitete Aminosäurensequenz von in Beispiel 1 erhaltener Human-BTC-GF-cDNA oder den Aminosäuren Nr. 1 bis 80 von Figur 10.
Figur 11 zeigt das Aufbauschema von Plasmid pTB 1515.
Figur 12 zeigt das Aufbauschema von Plasmid pTB 1507.
Figur 13 zeigt das Aufbauschema von Plasmid pTB 1516.
Figur 14 zeigt die in Beispiel 8 erhaltenen Ergebnisse der S-Sepharose -Säulenchromatographie.
Figur 15 zeigt die in Beispiel 8 erhaltenen Ergebnisse der Gelfiltration.
Figur 16 zeigt die in Beispiel 8 erhaltenen Ergebnisse der Heparin-HPLC.
Figur 17 zeigt die in Beispiel 8 erhaltene Umkehrphasen-HPLC.
Figur 18 zeigt die in Beispiel 8 erhaltenen Ergebnisse der SDS- PAGE/Silberanfärbung.
Figur 19 zeigt die in Beispiel 9 erhaltenen Ergebnisse der S-Sepharose -Säulenchromatographie und der die DNA-Synthese auslösenden Aktivität.
Figur 20 zeigt die in Beispiel 9 erhaltenen Ergebnisse der Gelfiltration.
Figur 21 zeigt die in Beispiel 9 erhaltenen Ergebnisse der Heparin- HPLC-Säulenchromatographie.
Figur 22 zeigt die in Beispiel 9 erhaltenen Ergebnisse der Umkehrphasen-HPLC.
Figur 23 zeigt die in Beispiel 9 erhaltenen Ergebnisse der SDS- PAGE/Silberanfärbung.
Figur 24 zeigt die in Beispiel 10 erhaltenen Ergebnisse der S- Sepharose -Säulenchromatographie.
Figur 25 zeigt die in Beispiel 10 erhaltenen Ergebnisse der Umkehrphasen-HPLC-Säulenchromatographie.
Figur 26 zeigt die in Beispiel 10 erhaltenen Ergebnisse der SDS- PAGE/Silberanfärbung.
Figur 27 zeigt die in Beispiel 10 erhaltenen Ergebnisse der Umkehrphasen-HPLC-Säulenchromatographie.
Figur 28 zeigt die Aminosäurensequenzen entsprechend den in Beispiel 10 erhaltenen Ergebnissen.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter, nichtglykosylierter menschlicher Wachstumsfaktor BTC-GF bereitgestellt, welcher die Glattmuskelzellvermehrung fördert, und ein Verfahren zu seinem Herstellen.
Natürlicher BTC-GF wurde aus dem konditionierten Medium von BTC-3- Pankreastumorzellen (ATCC Nr. CRL 10585) nachgewiesen und isoliert, welche anfänglich aus transgenen Mäusen (RIP1-Tag 2) stammten, bei denen praktisch alle Betazellen das Onkogen SV40 T exprimierten. BTC-GF ist auch aus BTC-JC10-Zellen (ATCC Nr. CRL 10875) gereinigt worden.
Der produzierte native BTC-GF hat ein Molekulargewicht von etwa 32000 bei der SDS-PAGE und ist hitzestabil, wenn er dem Kochen unterzogen wird. BTC-GF ist auch in Anwesenheit von 10 mM Dithiothreit stabil und wenn er einer 1 M Essigsäurekonzentration ausgesetzt wird.
Obschon eine Anzahl von Verfahren beim Reinigen des nativen BTC-GF eingesetzt werden kann, werden die bevorzugten Verfahren nachstehend ausgeführt.
Zuerst werden die Betatumorzellen in Rollflaschen in DMEM mit 5% Kälberserum vier Tage kultiviert. Das Medium wird anschließend durch serumfreies Medium ersetzt und vor der Ernte 48-72 Stunden kultiviert.
Als nächstes wird serumfreies, konditioniertes Betazellentumormedium konzentriert und durch eine Anzahl Säulen geleitet, wie etwa eine Biorex 70-Säule, eine Phenyl-Sepharosesäule und eine FPLC- Heparin-Affinitätssäule und eine HPLC-Umkehrphasensäule.
Die N-terminale Aminosäurensequenz von BTC-GF, die durch Vergleichen von mit einem ABI 470A-Proteinsequenzer bestimmtem BTC-GF aus BTC-3- und BTC-JC10-Zellen und durch Ableiten aus der Nukleotidsequenz der für BTC-GF (Figur 9) kodierenden cDNA erhalten wurde, ist wie folgt:
Die interne Aminosäurensequenz (siehe Fig. 9, Aminosäuren 44-66) von BTC-GF ist wie folgt:
Maus-BTC-GF kann durch Klonieren des Maus-BTC-GF-Gens aus Mauszellen, Aufbauen einer rekombinanten DNA, die das Maus-BTC-GF-Gen enthält, und Kultivieren der Transformante, die aus der Transformation mit der DNA folgt, hergestellt werden.
Im allgemeinen haben die Proteine von Tieren, die mit dem Menschen nah verwandt sind, eine äußerst hohe Homologie bei der Aminosäurensequenz mit den entsprechenden menschlichen Proteinen. Tatsächlich stammen Abschnitte verschiedener Aminosäuren oft aus einer Einpunktmutation des Kodons. Es ist daher vernünftig zu erwarten, daß die DNA-Sequenz des vorerwähnten Maus-BTC-GF-Gens der DNA-Sequenz des menschlichen BTC-GF-Gens ähnelt. Die Erfinder fanden, daß Human-BTC-GF durch Klonieren des Human-BTC-GF-Gens aus menschlichen Zellen mittels eines Teils des Maus-BTC-GF-Gens als DNA-Sonde, Aufbauen einer das BTC-GF-Gen enthaltenden rekombinanten DNA und Kultivieren der Transformante, die sich aus der Transformation mit der DNA ergibt, hergestellt werden kann.
Die Erfinder haben weitere Untersuchungen angestellt und haben die vorliegende Erfindung vervollständigt, welche sich auf:
(1) einen rekombinanten, nicht glykosylierten Human-BTC-GF,
(2) für Human-BTC-GF kodierende isolierte DNA,
(3) einen rekombinanten Vektor, der die isolierte DNA aus (2) besitzt,
(4) eine Transformante, welche den Vektor aus (3) beherbergt, und
(5) ein Verfahren zum Herstellen des BTC-GF-Proteins aus (1), welches das Kultivieren der Transformante aus (4) in einem Kulturmedium umfaßt, bezieht.
Als rekombinanter, nicht-glykosylierter Human-BTC-GF wird ein Protein mit einer Aminosäurensequenz veranschaulicht, welche die Aminosäure Nr. 1 bis 80 oder die Aminosäure Nr. 1 bis Nr. 147 von Figur 10 umfaßt.
So wird gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sowohl für BTC-GF kodierende, isolierte DNA als auch ein Verfahren zur Herstellung von BTC-GF durch Gentechniken bereitgestellt.
Genauer wird ein Expressionsvektor bereitgestellt, der eine DNA mit einer Basensequenz enthält, die für das Polypeptid von Human-BTC-GF kodiert, welcher zum Beispiel hergestellt werden kann durch:
(a) Isolieren einer für Human-BTC-GF kodierenden RNA,
(b) Synthetisieren einer einzelsträngigen komplementären DNA (cDNA), die auf der RNA beruht, und anschließend Synthetisieren der entsprechenden doppelsträngigen DNA und nötigenfalls Durchführen einer Mutagenese,
(c) Inserieren der komplementären DNA in ein Plasmid oder einen Phagenvektor,
(d) Transformieren eines Wirts mit dem sich daraus ergebenden rekombinanten Plasmid,
(e) Kultivieren der erhaltenen Transformante oder Bilden des Phagenplaque und Isolieren des Plasmids oder der Phagen-DNA, welche die gewünschte DNA enthält, aus der Transformanten oder dem Phagen durch ein geeignetes Verfahren, zum Beispiel durch das Koloniehybridisierungsverfahren oder Plaquehybridisierungsverfahren mittels einer DNA-Sonde,
(f) Ausschneiden der klonierten, gewünschten DNA aus dem Plasmid oder Phagen und
(g) Inserieren der klonierten DNA in einen Träger an einer Stelle stromabwärts von einem Promotor.
Für Säuger-BTC-GF kodierende RNA können aus einer Vielfalt vorstehend angeführter Human-BTC-GF produzierender Zellen oder Pankreastumorzellen erhalten werden.
Ein Verfahren zur RNA-Herstellung aus Human-BTC-GF produzierenden Zellen ist das Guanidinthiocyanatverfahren [J. M. Chirgwin et al.: Biochemistry, 18, 5294 (1979].
Unter Verwenden der auf diese Weise erhaltenen RNA als Matrize zusammen mit reverser Transkriptase kann zum Beispiel durch das Verfahren von H. Okayama et al. [Molecular and Cellular Biology, 2, 161 (1982)] eine cDNA synthetisiert werden. Die erhaltene cDNA wird in ein Plasmid oder einen Phagenvektor inseriert.
Außer den vorstehenden Techniken kann die ortsgerichtete Mutagenese eingesetzt werden. Die ortsgerichtete Mutagenese ist wohlbekannt und sie wird in Genetic Engineering, Lather, R. F. und Lecoq, J. P., Academic Press, S. 31 bis 50 (1983) beschrieben. Die auf Oligonukleotide gerichtete Mutagenese wird in Genetic Engineering; Principles and Methods, Smith, M. und Gillam, S., Plenum Press, Bd. 3, S. 1 bis 32 (1981) beschrieben.
Die Herstellung des Strukturgens, welches den vorliegenden Human BTC-GF kodiert, kann zum Beispiel durch:
(a) Hybridisieren einer einzelsträngigen DNA, die 1 Strang des Strukturgens umfaßt, mit einem mutagenen Oligonukleotidprimer,
(b) Verlängern des Primers mittels DNA-Polymerase unter Bilden eines Mutationsheteroduplex und
(c) Replizieren dieses Mutationsheteroduplex durchgeführt werden.
Die Größe des Oligonukleotidprimers hängt yon Bedingungen ab, die für eine stabile Hybridisierung des Primers mit der Genregion, in welche die Mutation eingeführt werden soll, und von Einschränkungen bei den gegenwärtig verfügbaren Oligonukleotidsyntheseverfahren ab. Die beim Planen des Oligonukleotids, das zur Verwendung bei der durch das Oligonukleotid gerichteten Mutagenese vorgesehen ist, in Betracht zu ziehenden Faktoren (z.B. die Gesamtgröße des Nukleotids und die Größe des nicht übereinstimmenden Abschnitts an der Mutationsstelle) werden durch Smith, M. und Gillam, S. in der vorgenannten Literatur beschrieben. Im allgemeinen wird die Gesamtlänge des Oligonukleotids auf eine solche Länge eingestellt, daß die stabile und einzige Hybridisierung an der Mutationsstelle optimiert wird und die Verlängerungen zwischen der Mutationsstelle und den 5'- und 3'-Termini werden mit ausreichender Größe versehen, um ein Mutationseditieren aufgrund der Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase zu verhindern.
Die zur Mutagenese verwendeten Oligonukleotide enthalten normalerweise etwa 12 bis 24 Basen, vorzugsweise 14 bis 20 Basen und bevorzugter 14 bis 18 Basen. Diese enthalten wenigstens etwa 3 Basen des 3'-Terminals des zu ändernden Kodons.
Zum Zweck des Erhaltens zum Beispiel eines Human-BTC-GF mit einer hinzugefügten Aminosäure wird ein mutagenes Human-BTC-GF-Gen durch Synthetisieren des Gens, das für die hinzuzufügende Aminosäurensequenz kodiert und direkt oder nach der Fragmentierung durch Verdauung mit einem Restriktionsenzym, sein Inserieren in oder Hinzufügen einer geeigneten Stelle in dem Human-BTC-GF mittels DNA-Ligase hergestellt. Wenn in dem BTC-GF-Gen keine geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstelle vorliegt, können Restriktionsenzym-Erkennungsstellen durch die vorgenannte ortsgerichtete Mutagenese hergestellt werden.
Zum Zweck des Erhaltens zum Beispiel eines Human-BTC-GF, dem Aminosäurebestandteile fehlen, wird ein mutagenes Human-BTC-GF-Gen hergestellt, in welchem das Carboxylterminal entfernt ist.
Im Fall der Auslassung einer Aminosäurensequenz auf der Seite des Carboxylterminus wird ein Kodon des Gens, welches für aminoterminale Aminosäuren der auszulassenden Sequenz kodiert, durch Ortsgerichtete Mutagenese in ein Stopkodon verändert.
Das Plasmid, in welches die cDNA inseriert werden soll, ist zum Beispiel ein Plasmid, das aus Escherichia coli stammt, wie etwa pBR322 [Gene, 2, 95 (1977)], pBR325 [Gene, 4, 121 (1978)], pUC12 [Gene, 19, 259 (1982)] oder pUC13 [Gene, 19, 259 (1982)], oder ein aus Bacillus subtilis stammendes, wie etwa pUB110 [Biochemical and Biophysical Research Communications, 112, 678 (1983)]. Irgendwelche anderen Plasmide, die vermehrt und mit dem eingesetzten Wirt erhalten werden können, können ebenfalls verwendet werden.
Der Phagenvektor, in den die cDNA inseriert werden soll, ist zum Beispiel λ9t10 oder λgt11.
Ein zum Inserieren in ein Plasmid bevorzugtes Verfahren ist das durch T. Maniatis et al. in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 239 (1982), beschriebene Verfahren.
Das auf diese Weise erhaltene Plasmid wird in einen geeigneten Wirt, zum Beispiel in einen der Gattung Escherichia oder Bacillus angehörenden Bakterienstamm eingeführt.
Beispiele des vorstehenden Stamms der Gattung Escherichia sind Escherichia coli K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968- )], M103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)] und C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], MM294 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 4174 (1976)].
Beispiele des vorstehenden Stamms der Gattung Bacillus sind Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)] und 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)].
Ein bevorzugtes Verfahren zum Ausführen der Transformierung ist das durch T. Maniatis et al. in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 249 (1982), beschriebene Calciumchlorid- oder Calciumchlorid/Rubidiumchloridverfahren.
Aus den auf diese Weise erhaltenen Transformanten können die gewünschten Klone zum Beispiel durch das Koloniehybridisierungsverfahren [Gene, 10, 63 (1980)] und dem DNA-Basensequenzbestimmungsverfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560 (1977); Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)] selektiert werden.
Auf diese Weise wird ein Mikroorganismus, der einen Vektor mit einer klonierten DNA, die für den BTC-GF kodiert, oder einen Phagen mit einer klonierten DNA trägt, die für einen BTC-GF kodiert, erhalten.
Das Plasmid wird aus dem Mikroorganismus isoliert.
Für eine derartige Plasmidisolierung kann zum Beispiel das Alkaliextraktionsverfahren [H. C. Birnboim et al.: Nucleic Acids Research, 1, 1513 (1979)] verwendet werden.
Das vorgenannte Plasmid oder der Phagenvektor mit der klonierten, für BTC-GF kodierenden DNA wird so verwendet, wie es/er ist oder wird gewünschtenfalls einer Restriktionsenzymbehandlung zum Ausschneiden der DNA unterzogen.
Expressionsvektoren können durch Inserieren der klonierten cDNA in einen zur Exprimierung der cDNA geeigneten Träger (Vektor) an einer Stelle stromabwärts von einem Promotor erhalten werden.
Der Vektor schließt sowohl die vorgenannten, von Escherichia coli stammenden Plasmide (z.B. pBR322, pBR325, pUC13) und von Bacillus subtilis stammenden Plasmide (z.B. PUB110, pTP5, pC194) als auch aus Hefe stammende Plasmide (Z.B. pSH19,pSH15), Bakteriophagen wie etwa den λ-Phagen und tierische Viren wie etwa Retroviren und Vacciniaviren ein.
Die cDNA kann ATG als Translationsstartkodon an ihrem 5'-Ende haben. Sie kann auch TAA, TGA oder TAG als Translationsabbruchskodon am 3'-Ende haben. Zum Ausführen der cDNA-Exprimierung wird ein Promotor an eine Stelle stromaufwärts der cDNA gebunden. Der bei der Ausführung der Erfindung zu verwendende Promotor kann jeder Promotor sein, falls er geeignet ist und an den Wirt angepaßt ist, der zur Exprimierung der cDNA eingesetzt wird.
Wenn der zu transformierende Wirt ein der Gattung Escherichia angehörender Stamm ist, werden der T7-Phage-Promotor, der trp- Promotor, lac-Promotor, rec-A-Promotor, λpL-Promotor und lpp-Promotor bevorzugt. Wenn der Wirt ein Stamm der Gattung Bacillus ist, werden zum Beispiel der SP01-Promotor, SP02-Promotor und penP- Promotor bevorzugt. Wenn der Wirt ein Hefestamm ist, werden der PH05-Promotor, PGK-Promotor, GAP-Promotor und ADH-Promotor bevorzugt. Insbesondere ist es bevorzugt, daß der Wirt ein Stamm der Gattung Escherichia ist und daß der Promotor der trp-Promotor oder λpL-Promotor ist.
Wenn der Wirt eine Tierzellinie ist, sind von SV40 stammende Promotoren und Retrovirus-Promotoren verwendbar. Insbesondere sind von SV40 stammende Promotoren bevorzugt.
Mittels des auf diese Weise erhaltenen Vektors kann eine Transformante durch ihr Einführen in eine Wirtszelle hergestellt werden.
Beispiele des Wirts schließen der Gattung Escherichia angehörende Stämme, der Gattung Bacillus angehörende Stämme, Hefen und Tierzellen ein. Repräsentative Beispiele der Stämme der Gattung Escherichia und Bacillus sind die hierin vorstehend angeführten.
Als Hefen können Saccharomyces cerevisiae AH22R&supmin;, NA87-11A und DKD-5D verwendet werden.
Als Tierzellen bevorzugte Zellinien schließen Affen-COS-7- [Gluzman, Y, Cell 23, 157 (1991)] und Verozellen, CHO-Zellen des Chinesischen Hamsters, Maus-L-Zellen und Human-FL-Zellen ein.
Die Transformation der vorstehenden Stämme der Gattung Escherichia kann zum Beispiel durch das in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972) oder zum Beispiel in Gene, 17, 107 (1982), beschriebene Verfahren ausgeführt werden.
Die Transformation eines Stamms der Gattung Bacillus wird zum Beispiel durch das in Molecular and General Genetics, 168, 111 (1979) beschriebene Verfahren ausgeführt.
Die Transformation von Hefen wird zum Beispiel durch das in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1979), beschriebene Verfahren durchgeführt.
Die Transformation von Tierzellen wird zum Beispiel unter anderem durch das in Virology, 52, 456 (1973), beschriebene Verfahren ausgeführt.
Auf diese Weise werden Transformanten erhalten, die mit Vektoren transformiert sind, welche die für Human-BTC-GF kodierende DNA enthalten.
Die Transformante wird in einem Medium kultiviert, um sie Human- BTC-GF produzieren zu lassen.
Das beim Kultivieren einer Transformante, die mit einem Stamm der Gattung Escherichia oder Bacillus als Wirt erhalten wurde, zu verwendende Medium ist im allgemeinen ein flüssiges, das Substanzen enthält, die für das Wachstum der Transformante erforderlich sind, zum Beispiel Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Nährstoffe. Glukose, Dextrin, lösliche Stärke und Sucrose können zum Beispiel als Kohlenstoffquellen dienen. Ammoniumsalze, Nitratsalze, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Sojabohnenkuchen und Kartoffelextrakt können als Stickstoffquellen dienen. Als organische Nährstoffe können Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und Magnesiumchlorid angeführt werden. Hefeextrakte, Vitamine und Wachstumsförderer können weiter hinzugefügt werden.
Das Medium sollte vorzugsweise einen pH zwischen 6 bis 8 haben. Glukose und Casaminosäuren enthaltendes M9-Medium (Miller: Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972) ist ein zur Verwendung beim Kultivieren von Mikroorganismen der Gattung Escherichia bevorzugtes Medium. Zur wirkungsvollen Ausübung der Promotorfunktion kann im Fall eines trp-Promotors nötigenfalls ein Mittel wie etwa 3-β-Indolylacrylsäure zugesetzt werden.
Wenn der Wirt ein Mikroorganismus der Gattung Escherichia ist, wird die Kultivierung im allgemeinen 3 bis 24 Stunden bei 15 bis 43ºC ausgeführt. Nötigenfalls kann eine Belüftung und/oder Rühren durchgeführt werden.
Wenn der Wirt ein Mikroorganismus der Gattung Bacillus ist, wird die Kultivierung im allgemeinen 6 bis 24 Stunden bei 30 bis 40ºC ausgeführt. Nötigenfalls kann eine Belüftung und/oder Rühren durch geführt werden.
Wenn der Wirt eine Hefetransformante ist, kann zum Beispiel Burkholders Minimalmedium als Medium verwendet werden. Der pH des Mediums sollte vorzugsweise auf 5 bis 8 eingestellt werden. Die Kultivierung wird im allgemeinen 24 bis 72 Stunden bei 20 bis 35ºC, nötigenfalls unter Belüftung und/oder Rühren durchgeführt.
Das für die Kultivierung einer Tierzellentransformante bevorzugte Medium schließt MEM-Medium [Science, 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640-Medium [Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)] oder 199-Medium [Proceedings of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] ein, welchen weiter 5 bis 20% fetales Kälberserum zugesetzt wird. Das Medium sollte vorzugsweise einen pH von 6 bis 8 haben. Die Kultivierung wird im allgemeinen 15 bis 60 Stunden bei 30 bis 40ºC, nötigenfalls unter Belüftung und/oder Rühren durchgeführt.
Rekombinanter BTC-GF kann in gereinigter Form aus dem vorstehenden Kultivierungsprodukt zum Beispiel durch die folgenden Verfahren isoliert werden:
Zum Extrahieren des BTC-GF aus kultivierten Zellen werden die Zellen nach der Kultivierung gesammelt und anschließend durch ein geeignetes Verfahren wie etwa das Verfahren, welches das Suspendieren der Zellen in einer Pufferlösung umfaßt, die ein Proteindenaturierungsmittel wie etwa Guanidinhydrochlorid enthält, um dadurch die extrazelluläre Lösung des gewünschten Proteins zu bewirken, oder durch das Verfahren, welches das Aufbrechen der Zellen durch eine French-Presse, Beschallung, Lysozymbehandlung und/oder Frost- Tau-Wechsel umfaßt, gefolgt vom Zentrifugieren zur Isolierung des BTC-GF-Proteins, verarbeitet werden. Die Behandlung mit der French- Presse oder die kombinierte Anwendung einer Lysozymbehandlung und Beschallung sind besonders bevorzugt.
Zur Reinigung des BTC-GF aus dem in der vorstehenden Weise erhaltenen Überstand, können geeignete Kombinationen bekannter Isolierungs- und Reinigungsverfahren verwendet werden. Bevorzugte Isolierungs- und Reinigungsverfahren schließen Verfahren ein, die Löslichkeitsunterschiede ausnützen, wie etwa das Aussalzverfahren und Lösungsmittelrückfällungsverfahren, die Verfahren, die Molekulargewichtsunterschiede im Hauptstrang ausnützen, wie etwa das Dialyseverfahren, Ultrafiltrationsverfahren, Gelfiltrationsverfahren und SDS-Polyacrylamid-Gelektrophoreseverfahren, die Ladungsunterschiede ausnützenden Verfahren, wie etwa das Ionenaustauschchromatographieverfahren, spezielle Affinitäten ausnützende Verfahren, wie etwa das Affinitätschromatographieverfahren, Hydrophobieunterschiede ausnützende Verfahren wie etwa die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Unterschiede im isolektrischen Punkt ausnützende Verfahren wie etwa Isoelektrofokussieren.
Genauer können Nukleinsäuren und saure Proteine als Verunreinigungen aus dem vorgenannten Überstand durch Unterziehen des Überstands der Ionenaustauschchromatographie mittels DEAE-Cellulose entfernt werden. Es ist zum Beispiel wirkungsvoll, den Überstand auf eine DEAE-Cellulosesäule aufzugeben, die mit einem nahezu neutralen Puffer (z.B. Tris-Puffer) äquilibriert wurde, und die abfließende Fraktion zu sammeln. Wenn die abfließende Fraktion einer Ionenaustauschchromatographie mittels CM-Cellulose unterzogen wird, wird der BCT-GF, der ein basisches Protein ist, auf dem Träger absorbiert und kann mit einer Salzlösung eluiert werden. Die Säulenchromatographie an saurem CM-Celluloseharz kann bei dem Bakterienextrakt direkt zum Reinigen des BTC-GF verwendet werden.
Es ist zum Beispiel wirkungsvoll, den Überstand auf eine CM-Cellulosesäule aufzugeben, die mit einem leicht sauren Puffer (wie etwa Phosphatpuffer) äquilibriert wurde. Nach Waschen der Säule mit demselben Puffer kann BTC-GF durch Eluieren der Säule mit dem zusätzliche Salze (wie etwa NaCl) enthaltenden Puffer isoliert werden. Das Eluat kann nach der Dialyse lyophilisiert werden.
Die Affinitätschromatographie mittels Heparin-Sepharose kann zum Reinigen von BTC-GF in Escherichia coli-Extrakten angewandt werden. So kann zum Beispiel das BTC-GF-Protein durch Aufgeben des vorstehenden Eluats auf eine Heparin-Sepharose-Säule, die mit einem nahezu neutralen Puffer (z.B. Tris- oder Phosphatpuffer) äquilibriert wurde, gründliches Waschen der Säule und Ausführen einer Elution durch einen aus NaCl aufgebauten linearen Gradienten gereinigt werden.
Heparin-Säulen (z.B. von Showa Denko, Japan, erhältliches Shodex AF-pak HR-894), die für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie entwickelt wurden, sind besonders wirkungsvoll.
In diesem Fall kann BTC-GF als homogenes Produkt in derselben Weise wie im Fall der vorgenannten Heparin-Sepharose -Säule, nämlich durch Aufgeben der Probe auf eine Heparin-Säule mit einem etwa neutralen Puffer, gründliches Waschen der Säule und Ausführen einer Elution durch einen aus NaCl aufgebauten linearen Gradienten isoliert werden.
Das auf diese Weise erhaltene Produkt kann durch Dialyse und Lyophilisierung in die Form eines trockenen Pulvers gebracht werden. Das Konservieren des Produkts mit einem zugesetzten Träger (z.B. Serumalbumin) ist erwünscht, da die Adsorption des Produkts an der Gefäßwand dadurch vermieden werden kann.
Weiterhin ist es bevorzugt, eine geringe Menge eines Reduktionsmittels im Lauf der Reinigung oder Konservierung zuzusetzen, um die Oxidation des Produkts zu verhindern.
Reduktionsmittel, die verwendet werden können, schließen β-Mercaptoethanol, Dithiothreit und Glutathion ein.
Auf diese Weise kann im wesentlichen reiner BTC-GF erhalten werden. Der im wesentlichen reine BTC-GF gemäß dieser Erfindung schließt Produkte ein, deren BTC-GF-Gehalt nicht kleiner als 95% (Gew./Gew.) ist und bevorzugter Produkte, deren BTC-GF-Gehalt nicht kleiner als 98% (Gew./Gew.) ist.
Zu seiner pharmazeutischen Verwendung kann der BTC-GF gemäß der vorliegenden Erfindung sicher an warmblütige Tiere (z.B. Mensch, Maus, Ratte, Hamster, Kaninchen, Hund, Katze) parenteral oder oral entweder als solcher in Pulverform oder in Form pharmazeutischer Zusammensetzungen (z.B. Injektion, Tablette, Kapsel, Lösung, Salbe) verabreicht werden, welche zusammen mit pharmakologisch annehmbaren Trägern, Arzneimittelgrundlagen und/oder Verdünnungsmitteln hergestellt wurden.
Injizierbare Zubereitungen können durch ein herkömmliches Verfahren mittels zum Beispiel physiologischer Kochsalzlösung oder einer wäßrigen, Glukose und/oder einen anderen Hilfsstoff oder Hilfsstoffe enthaltenden Lösung hergestellt werden. Tabletten, Kapseln und andere pharmazeutische Zusammensetzungen können ebenfalls durch ein herkömmliches Verfahren hergestellt werden.
Der vorliegende rekombinante, nicht-glykosylierte Human-BTC-GF hat dieselbe biologische Aktivität wie diejenige von nativem BTC-GF.
Gereinigter BTC-GF gemäß der vorliegenden Erfindung kann bei der Behandlung pathologischer Zustände wie etwa einer Gefäßmißbildung durch intravaskuläre Infusion oder zur Behandlung von Atherosklerose durch Verabreichung eines konkurrierenden Hemmers verwendet werden.
Gereinigter BTC-GF kann auch bei der Behandlung von Wunden und Ulzera verwendet werden.
Wenn BTC-GF der vorliegenden Erfindung sowohl bei der Behandlung von Erkrankungen, die Gefäßmißbildungen sind, als auch bei der Be handlung von Wunden/Ulzera verwendet wird, ist die dem warmblütigen Tier zu verabreichende Menge BTC-GF klein und eine geeignete Menge wird aus 1 ng bis 1 mg/kg, bevorzugter 10 ng bis 100 µg/kg täglich entsprechend dem Verabreichungsweg und den Symptomen ausgewählt.
Gereinigter BTC-GF der vorliegenden Erfindung kann auch zum Herstellen verschiedener konkurrierender Mittel verwendet werden, die bei der Behandlung sowohl von Atherosklerose und Diabetes-Retinopathie als auch Bluthochdruck verwendet werden können. Konkurrierende Mittel wie etwa Antikörper oder falsche Proteine können hergestellt werden, die um BTC-GF konkurrieren und/oder ihn beim Stimulieren der Glattmuskelzellvermehrung blockieren.
BTC-GF kann auch zum Erzeugen von Antikörpern gegen ihn selbst verwendet werden. Der erzeugte Antikörper kann in Abhängigkeit von der besonderen Anwendung, für die er ausgelegt ist, polyklonal oder monoklonal sein. Derartige Antikörper können durch dem Fachmann wohlbekannte Techniken hergestellt werden. Zum Beispiel kann dessen Protein- oder Antigenabschnitt mit Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) konjugiert werden und zum Züchten eines Antikörpers in einem Tier wie etwa einem Kaninchen verwendet werden. Typischerweise wird das Peptid-KLH-Konjugat zum Erzeugen von Antikörpern mehrere Male über einen Zeitraum von etwa zwei Monaten injiziert. Der Antikörper wird änschließend durch Standardtechniken aus dem Serum gesammelt. Wahlweise können monoklonale Antikörper mittels Standardfusionstechniken zum Bilden von Hybridomzellen in Zellen hergestellt werden, die Antikörper gegen das Protein produzieren. [Kohler, G., et al., Nature 256:495 (1975), was durch Verweis hierin inbegriffen ist]. Typischerweise umfaßt dies das Fusionieren einer Antikörper-produzierenden Zelle mit einer immortalisierten Zellinie, wie etwa eine Myelomzelle, unter Produzieren der Hybridzelle. Wahlweise können monoklonale Antikörper aus Zellen durch das Verfahren von Huse et al., Science 246:1275 (1989), hergestellt werden.
Üblicherweise wird glykosyliertes Protein wegen der Heterogenität der Glykosylierung jedes Moleküls als heterogene Form erzeugt. Im Gegensatz dazu wird nicht-glykosyliertes Protein homogen erzeugt, was zeigt, daß die Reinigung nicht-glykosylierter Proteine leichter als diejenige glykosylierter Moleküle ist. Außerdem können die meisten nicht-glykosylierten Proteine durch prokaryontische Expressionssysteme hergestellt werden. Das bedeutet, daß die Produktivität nicht-glykosylierter Proteine höher ist, als diejenige glykosylierter Proteine.
In der Beschreibung, den Ansprüchen und Zeichnungen sind die für Basen, Aminosäuren und so weiter verwendeten Abkürzungen die von der IUPAC-IUB-Kommission für Biochemische Nomenklatur empfohlenen oder die gebräuchlicherweise in der Technik verwendeten. Beispiele werden nachstehend angegeben. Aminosäuren, bei denen eine optische Isomerie möglich ist, befinden sich, solange nicht anders angegeben, in der L-Form.
DNA: Desoxyribonukleinsäure
cDNA: komplementäre Desoxyribonukleinsäure
A: Adenin
T: Thymin
G: Guanin
C: Cytosin
I: Inosin
RNA: Ribonukleinsäure
dATP: Desoxyadenosintriphosphat
dTTP: Desoxythymidintriphosphat
dGTP: Desoxyguanosintriphosphat
dCTP: Desoxycytidintriphosphat
ATP: Adenosintriphosphat
Tdr: Thymidin
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
SDS: Natriumdodecylsulfat
Gly: Glycin
Ala: Alanin
Val: Valin
Leu: Leucin
Ile: Isoleucin
Ser: Serin
Thr: Threonin
Cys: Cystein
Met: Methionin
Glu: Glutaminsäure
Asp: Asparaginsäure
Lys: Lysin
Arg: Arginin
His: Histidin
Phe: Phenylalanin
Tyr: Tyrosin
Trp: Tryptophan
Pro: Prolin
Asn: Asparagin
Gln: Glutamin
Die Erfindung wird unter Bezug auf die folgenden Beispiele, die beim Verständnis der vorliegenden Erfindung behilflich sind, weiter veranschaulicht.
In den Beispielen und in Tabelle 1 erörterte Wachstumsfaktoraktivitäten wurden durch Messen des Einbaus von [Methyl-³H]Thymidin in die DNA von Maus-Balb/c-3T3-Ruhezellen wie früher beschrieben (Shing Y., Davidson S. und Klagsbrun M., Methods in Enzymology, 146B, 42-48, 1987) bestimmt. Tabelle 1. Reinigung von BTC-GF
Werte beruhen auf dem Verarbeiten von 10 Liter konditioniertem Medium
Die biologische Aktivität wurde durch DNA-Synthese in Maus-3T3-Zellen gemessen
Eine Einheit Wachstumsfaktoraktivität ist als die Menge Wachstumsfaktor definiert, die zum Simulieren des zu Hälfte maximalen [Methyl-³H]Thymidineinbaus in DNA benötigt wird
Die Proteinmasse wurde durch Anwenden von λ&sub2;&sub8;&sub0; = 1,0 für 1 mg/ml Lösung abgeshätzt
* Die Proteinmasse wurde abgeschätzt durch die Intensität der Silberfärbung verglichen mit derjenigen des Proteinstandards und Aminosäurenanalyse

Referenzbeispiel 1

Primärkulturen von BTC-3-Pankreas-Betatumorzellen (ATCC-Zugangsnr. CRL 10585) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagles-Medium (DMEM) hergestellt, das 10% Kälberserum enthielt. Diese Kulturen wurden in Zellkolben mit 162 cm² (Costar Cat #3150) plattiert und in einem befeuchteten CO&sub2;-Inkubator mit 37º0 inkubiert. Die Zellen wurden als Quelle zum Beimpfen von Rollflaschen mit 900 cm² Wachstumsfläche (Costar Cat #3901) verwendet, die 125 ml DMEM mit 5% Kälberserum enthielten. Die Flaschen wurden mit 95% Luft/5% CO&sub2; begast und auf einer Schüttelapparatur zur Zellproduktion (Bellco) bei 0,5 Upm in einem Inkubator mit 37ºC rotiert. Nach 4 Tagen wurde das Medium in jeder Flasche durch serumfreies Medium ersetzt. Das Medium wurde nach 48-72 Stunden Inkubation geerntet und durch frisches Medium ersetzt. Sechs Liter konditioniertes Medium wurden wöchentlich als Ausgangsmaterialien für die Reinigung der Wachstumsfaktoren geerntet.

Referenzbeispiel 2

Verfahren zur Reinigung von Maus-BTC-GF aus BTC-3-Zellen

Schritt 1. Konzentrieren

Zehn Liter konditioniertes, serumfreies Betatumorzellenmedium wurde bei 4 ºC mit einem Amicon-Hohlfaserkonzentrator mittels eines Filters mit einem Grenzmolekulargewicht von 10000 auf 500 ml eingeengt. Das konzentrierte Medium wurde nachfolgend durch kontinuierliche Dialyse gegen 50 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7, äquilibriert.

Schritt 2. Biorex 70-Chromatographie

Das konzentrierte Medium wurde auf eine Biorex-Säule (200 ml Bettvolumen) aufgetragen, die mit 10 mM Tris, pH 7, bei 4ºC äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit 400 ml desselben Puffers gespült und die biologische Aktivität wurde anschließend mit einem NaCl- Gradienten von 400 ml 0 M bis 400 ml 0,6 M bei einer Fließgeschwindigkeit von 60 ml/Stunde (Fig. 1) eluiert.

Schritt 3. Phenyl-Sepharose -Chromatographie

Die aktiven Fraktionen aus der Biorex-Säule wurden zusammengefaßt, 5 Minuten gekocht und durch Zentrifugieren (10000 x g, 20 Minuten) geklärt. Die klare Überstandslösung wurde auf 1,5 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; gebracht und auf eine Phenyl-Sepharose -Säule (25 ml Bettvolumen) aufgetragen, welche mit 1,5 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7, bei 4 ºC äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 100 ml Äquilibrierungspuffer gespült und die biologische Aktivität wurde nachfolgend mit einem (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Gradienten von 170 ml 1,5 M bis 170 ml 0 M in 10 mM Phosphatpuffer bei pH 7 bei einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/Stunde eluiert (Fig. 2).

Schritt 4. FPLC-Heparin-Affinitätschromatographie

Die aktiven Fraktionen aus der Phenyl-Sepharose-Säule wurden zusammengefaßt, dialysiert und auf eine TSK-GEL-Heparin SPW-Glassäule (7,5 cm x 8 mm Innendurchmesser) aufgetragen, die mit 10 mM Tris, pH 7, bei Raumtemperatur äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 10 ml desselben Puffers gespült und die biologische Aktivität wurde mit einem NaCl-Gradienten von 0 bis 0,3 M, gefolgt von einem weiteren NaCl-Gradienten von 0,3 bis 0,6 M bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min/Fraktion (Fig. 3) eluiert.

Schritt 5. HPLC-C4-Umkehrrhasenchromatographie

Die aktiven Fraktionen aus der Heparin-Säule wurden zusammengefaßt ünd direkt in eine HPLC-C4-Umkehrphasensäule eingespritzt, die mit 10% Acetonitril in 0,1% TFA bei Raumtemperatur äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 20 ml derselben Lösung gespült und die biologische Aktivität wurde mit einem Acetonitrilgradienten von 10 bis 35% bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min eluiert und Fraktionen von 1,5 ml wurden gesammelt (Fig. 4). Dieser Schritt wurde zum Erhalten eines mit Silber angefärbten Proteins aus einer einzigen Bande bei der SDS-PAGE einmal wiederholt (Fig. 5).
Eine Zusammenfassung des Reinigungsergebnisses wird in Tabelle 1 dargestellt.

Referenzbeispiel 3

Mitogene Aktivität von Maus-BTC-GF an Glattmuskelzellen

Der gereinigte BTC-GF von Referenzbeispiel 2 stimulierte die Vermehrung von Rinder-Aortaglattmuskelzellen (SMC) (Fig. 6). Die mitogene Aktivität von Maus BTC-GF wurde an SMC getestet, die in 1% Kälberserum enthaltendem DMEM kultiviert wurden. Vier Tage nachdem die Testproben den Kulturen zugefügt worden waren, wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und die Zellzahl in jedem Näpfchen der 24-Näpfchen-Platten wurde mit einem Coulter-Zähler gezählt.
Das durch die vorstehend beispielhaft angeführte Reinigungsvorschrift hergestellte Protein hat die folgenden Eigenschaften: Maus BTC-GF ist ein Polypeptid mit der N-terminalen Aminosäurensequenz:
Es hat ein durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmtes Molekulargewicht von 32000. Seine mitogene Aktivität wird durch Aussetzen gegenüber hoher Temperatur (100º0, 5 Minuten), Sulfhydryl-Reduktionsmittel (10 mM Dithiothreit) oder sauren Bedingungen (pH 2,2) nicht inaktiviert.

Referenzbeispiel 4

BTC-JC10 wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gehalten, das mit 10% Kälberserum ergänzt war. Zur Erzeugung eines konditionierten Mediums wurden 10&sup4; Zellen/ml BTC-JC10-Zellen in einem 8-Liter-Drehkolben (Belco Glass) in einer DMEM/F12-Medium- Suspension (1:1) gezüchtet, das mit 2 mM Glutamin, 100 E/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin, 0,5% Insulin, Transferin und Selen (ITS, Sigma) und 0,1% Polyethylenglykol 400 ergänzt war. Das konditionierte Medium wurde gesammelt, als die Zelldichte 2 x 10 10&sup5; Zellen/ml erreichte.
Maus-BTC-GF wurde aus konditioniertem BTC-JC10-Medium durch Verfahren gereinigt, die denjenigen für die Reinigung von Maus-BTC-GF aus BTC-3-Zellen ähnlich waren. Die N-terminale Aminosäurenteilsequenz von Maus-BTC-GF, der aus BTC-JC10-Zellen gereinigt wurde, wird in SEQ ID Nr. 1 dargestellt.
Wie aus Figur 7 zu ersehen ist, scheint die N-terminale Aminosäurensequenz von Maus-BTC-GF aus BTC-3-Zellen und BTC-JC10 identisch zu sein, was zeigt, daß die beiden Proteine aus beiden Zelltypen dieselben sind.

Referenzbeispiel 5

(Klonieren der Maus-BTC-GF-cDNA)

Maus-BTC-GF ist ein Polypeptid mit der internen Aminosäurensequenz:
Auf der Grundlage der in Referenzbeispiel 3 und 4 (Fig. 7 und 8) bestimmten Aminosäurenteilsequenzen von Maus-BTC-GF wurden 4 Oligonukleotide chemisch synthetisiert, die 4 Aminosäurensequenzen entsprachen, welche die N-terminalen Aminosäuren Nr. 7-12 (Thr-Pro- Glu-Thr-Asn-Gly), Nr. 17-23 (Ala-Pro-Gly-Glu-Glu-Arg-Thr) und die internen Aminosäuren Nr. 1-6 von Figur 8 (His-Tyr-Cys-Ile-His-Gly), Nr. 12-17 von Figur 8 (Val-Asp-Glu-Gln-Thr-Pro) umfaßten. Bei den folgenden Primern wurde I (Inosin) an bestimmten dritten Positionen an entarteten Kodons verwendet. Somit waren die Basensequenzen
Primer 1: 5' ACI CCI GA A/G ACN AA T/C GG 3'
Primer 2: 5' GCI CCI GGI GA A/G GA A/G C/A GN AC 3'
Primer 3: 5' CC A/G TG T/G/A AT A/G CA A/G TA A/G TG 3' und (Antisense)
Primer 4: 5' GG NGT T/C TG T/C TC A/G T CNAC 3' (Antisense) und
(N stellt A, T, G oder C dar).
Poly(A)-RNA wurde aus BTC-JC10-Zellen mittels eines RNA-Extraktionskits (Pharmacia) und mRNA-Reinigungskits (Pharmacia) hergestellt. cDNA wurde mit der Poly(A)-RNA und einem zufallsverteilten Hexanukleotidprimer (cDNA-Synthesesystem plus, Amersham) mittels dieser cDNA als Matrizen und 2 Oligonukleotiden (Primer 1 und 4) als Primer synthetisiert. Die erste PCR (Polymerasekettenreaktion) wurde (30 Kreisläufe 1 min bei 94ºC, 2 min bei 45ºC und 2 min bei 72ºC) durchgeführt. Die 2. PCR wurde unter Verwenden der Produkte der ersten PCR und Primer 2 und 3 durchgeführt (30 Kreisläufe 1 min bei 94ºC, 2 min bei 45ºC und 2 min bei 72ºC).
Die Produkte (durch die 2. PCR verstärkte DNA) wurden durch 1,5% Agarosegelelektrophorese fraktioniert und die DNA mit einer Größe von etwa 0,1 kb wurde aus dem Gel eluiert. Diese DNA wurde durch ein Zufallsprimingverfahren mit 32p markiert.
Die vorstehend angeführten BTC-JC10-cDNA wurden mit λgt10-Vektor ligiert, der mit EcoRI verdaut war, und dephosphoryliert (Stratagene) und die Phagenvektoren wurden unter Herstellen einer cDNA-Bank verpackt (GIGAPACK II GOLD, Stratagene). Diese cDNA-Bank (etwa 5 x 10&sup6; Klone) wurde mit Escherichia coli NM514 (Yk&supmin;Mk&supmin;) plattiert und die aufgetretenen Plaque wurden auf 6 Filter (Hyband N, Amersham) in einer Menge von etwa 3 x 10&sup5; Klone je Filter überführt und mit 0,5N NaOH lysiert und freigesetzte und denaturierte Phagen-DNA wurde auf den Filtern immobilisiert.
Die markierte DNA wurde als Sonde mit den Filtern hybridisiert. Die Hybridisierungsreaktionen wurden in 10 ml einer Lösung von 100 µg/ml denaturierter Lachsspermien-DNA, die 10 µCi Sonde in 5 x SSPE [180 mM NaCl, 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 1 mM EDTA (pH 7,4)] und 5 x Denhardt's enthielt, mit 0,1% SDS 16 Stunden bei 65ºC ausgeführt. Nach der Reaktion wurde der Filter mit 0,1% SDS-Lösung in 0,2 x SSC jeweils zweimal 30 min bei 65ºC gewaschen.
Von den gewaschenen Filtern wurden Radioautogramme aufgenommen und durch übereinanderlegen der Radioautogramme auf den Platten wurde ein positiver Plaque gesucht. Auf diese Weise wurden aus 2 x 10&sup6; Plaques 7 positive Phagenklone erhalten. Anschließend wurde mittels der DNA aus diesen positiven Klonen und Primer 2 und 3 eine PCR versucht und eine erwartete DNA-Größe (0,1 kb) wurde mit nur 2 Klonen verstärkt. Von einem (λgt10-BTC-3) wurde gezeigt, daß er an der EcoRI-Stelle 1,2 kb cDNA besaß. Diese cDNA wurde in die EcoRI- Stelle von Plasmid pUC119 (Plasmid pTB1489) inseriert. Das Plasmid pTB 1489 wurde in Escherichia coli DHTαF' (Bethesda Research Laboratory, USA) unter Erhalten einer Transformante Escherichia coli DH5αF'/pTB 1489 (IFO 15256) eingeführt. Diese Transformante ist sowohl beim Fermentationsinstitut, Osaka (IFO), Japan, unter der Hinterlegungsnummer IFO 15256 als auch bei der American Type Culture Collection am 10. Februar 1992 unter der ATCC-Zugangsnr. 68911 hinterlegt worden.
Die Basensequenz der cDNA, und zwar die 1,2 kb des EcoRI-DNA-Fragments, wurde durch das Didesoxynukleotidsynthese-Kettenabbruchverfahren [J. Messing et al.: Nucleic Acids Research 9: 309 (1981)] bestimmt. Auf der Grundlage der Sequenzierungsergebnisse konnte die gesamte Aminosäurensequenz von Maus-BTC-GF bestimmt werden.
Die Basensequenz der cDNA und die aus der Basensequenz vorhergesagte Aminosäurensequenz werden in Fig. 9 dargestellt. In Fig. 9 steht die Abkürzung "End" für das Terminatorkodon und der N-terminale Aminosäurerest (Aminosäure Nr. 1 Asp) von Maus-BTC-GF wurde aus demjenigen von Fig. 7 abgeschätzt.
Die 30 Aminosäurereste stromaufwärts des N-terminalen Aminosäurerestes stellen vermutlich ein Signalpeptid dar. Der Pfeil zeigt die Stelle des Übergangs vom Signalpeptid zum reifen Maus-BTC-GF an.

Referenzbeispiel 6

(Aufbau eines Maus-BTC-GF-cDNA-Expressionsplasmids für Säugerzellen)

Ein EcoRI-Fragment mit 1,2 kb, das die BTC-GF-cDNA enthielt, wurde aus dem in Referenzbeispiel 5 erhaltenen Plasmid pTB1489 isoliert. Das Expressionsplasmid pTB701 [J. Biol. Chem. 263, 6927 (1988)] wurde mit EcoRI gespalten und anschließend mit Kalbsdarmphosphatase behandelt. Das sich daraus ergebende Plasmid wurde mit dem vorstehenden, BTC-GF-cDNA enthaltenden 1,2 kb-EcoRI-Fragment ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformierung von E. coli DH1 (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 505, 1982) verwendet. Aus den sich daraus ergebenden Ampicillin-resistenten Transformanten wurde ein Plasmid isoliert und dieses Plasmid wurde pTB1491 genannt.

Referenzbeispiel 7

(Exprimierung von BTC-GF-cDNA in Säugerzellen)

Affenzellen COS7 wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Flow Labs.), das 10% fetales Kälberserum enthielt, plattiert (3 x 10&sup5; Zellen/Schale) und kultiviert. Zehn Mikrogramm Expressionsplasmid pTB1491 (Referenzbeispiel 6) und pTB1495 (mit demselben Aufbau wie pTB1491, ausgenommen die umgekehrte Orientierung von BTC-GF-cDNA) wurden mittels des Calciumphosphatverfahrens [Graham et al., Virology 52, 456 (1973)] in COS7-Zellen eingeführt. Am nächsten Tag wurde das Kulturmedium gegen DMEM ausgetauscht, das 0,5% fetales Kälberserum enthielt, gefolgt von 2 Tagen Kultivierung. Das konditionierte Medium wurde gesammelt und auf die Stimulierung der DNA-Synthese durch den beschriebenen [Mol. Cell. Biol. 8, 588 (1998)] ³H-Thymidineinbau in ruhende BALB/c-3T3-A31-714- Klone, [Int. J. Cancer 12, 463 (1973)], untersucht. Die Ergebnisse werden nachstehend in Tabelle 2 dargestellt.

Beispiel 1

(Klonieren von Human-BTC-GF-cDNA)

Poly(A)-RNA wurde aus der menschlichen Brustadenokarzinomzellinie MCF7 (ATCC HTB22, ATCC-Katalog der Zellinien und Hybridome, sechste Ausgabe, 1988) mittels eines RNA-Extraktionskits (Pharmacia) und mRNA-Reinigungskits (Pharmacia) hergestellt. cDNA wurden mit Poly(A)-RNA und einem zufallsverteilten Hexanukleotidprimer (cDNA- Synthesesystem plus, Amersham) synthetisiert. Diese cDNA wurden in die BstXI-Stelle des Plasmids pME18S (Medical Immunology 20, 27 (1990)) unter Verwenden des BstXI-Adaptors und transformiertem Escherichia coli DH5αF' unter Herstellen einer cDNA-Bank integriert.
Diese cDNA-Bank wurde auf 10 Nitrocellulosefilter (Millipores HATF- Filter) in einer Menge von etwa 5 x 10&sup4; Klone je Filter plattiert. Mittels der Filter als Originalfilter wurden den ursprünglichen Filtern entsprechende Filterdoppel hergestellt. Die Escherichia coli-Zellen auf diesen Filterdoppeln wurden mit 0,5N NaOH lysiert und freigesetzte und denaturierte Plasmid-DNA wurden auf den Filtern immobilisiert (Grunstein, M & Hogness, D. S.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, f12 3961 (1975)).
Das in Referenzbeispiel 5 erhaltene Plasmid pTB1489 wurde mit EcoRI und NhaI verdaut und ein DNA-Fragment von 0,73 kb, das für einen Maus-BTC-GF kodierte, wurde isoliert. Dieses DNA-Fragment wurde mit ³²P durch das Nicktranslationsverfahren (Rigby, P. W. J. et al.: Journal of Molecular Biology, 113, 237 (1977)) markiert.
Die auf diese Weise markierte DNA wurde als Sonde mit den Filterdoppeln hybridisiert. Die Hybridisierungsreaktion wurde in 10 ml einer Lösung von 100 µl/ml denaturierter Lachsspermien-DNA, die 10 µCi Sonde in 5 x SSPE (180 mM NaCl, 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 1 mM EDTA (pH 7,4)) und 5 X Denhardts enthielt, mit 0,1% SDS 16 Stunden bei 60ºC ausgeführt. Nach der Reaktion wurden die Filter mit 0,1% SDS-Lösung in 2 X SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat) jeweils zweimal 30 Minuten bei Raumtemperatur und anschließend zweimal 30 Minuten bei 60ºC gewaschen (T. Maniatis et al.: "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 309 (1982)).
Von den gewaschenen Filtern wurden Radioautogramme aufgenommen. Durch Übereinanderlegen der Radioautogramme der Filterdoppel wurde nach einer Bakterienkolonie gesucht. Auf diese Weise wurde unter 5 x 10&sup5; Kolonien ein Stamm, Escherichia coli K12 DHL/pTB1499, erhalten, der mit der Sonde reagieren konnte.
Die Plasmid-DNA, pTB1499, wurde aus dem vorstehend erhaltenen Stamm durch das Alkaliextraktionsverfahren (Birnboim, H. C. & Doly, J.,: Nucleic Acids Res. 1 : 1513 (1979)) extrahiert und gereinigt. Der cDNA-Abschnitt der Plasmid-DNA wurde mittels des Restriktionsenzyms BstXI (Takara Shuzo) ausgeschnitten und durch Agarosegelelektrophorese fraktioniert.
Anschließend wurde die Basensequenz des vorstehend angeführten cDNA-Abschnitts durch das Didesoxynukleotidsynthese-Kettenabbruchsverfahren (J. Messing et al.: Nucleic Acids Res., 9 309 (1981)) bestimmt.
Auf der Grundlage der Sequenzierung konnte die gesamte Aminosäurensequenz von Human-BTC-GF bestimmt werden.
Die Basensequenz der cDNA und die aus dieser Basensequenz vorhergesagte Aminosäurensequenz werden in Fig. 10 dargestellt. Der Pfeil zeigt die Stelle des Übergangs vom Signalpeptid zum reifen Human-BTC-GF.
Das Plasmid pTB1499 wurde unter Erhalten einer Transformante Escherichia coli DHSA/pTB1499 in Escherichia coli DH5α (Bethesda Research Laboratory, USA) eingeführt. Diese Transformante ist am 14. Januar 1992 unter der Hinterlegungsnummer IFO 15257 beim IFO als auch am 10. Februar 1992 unter der ATCC-Zugangsnr. 68910 bei der American Type Culture Collection hinterlegt worden.

Beispiel 2

(Aufbau des Human-BTC-GF-cDNA-Expressionsplasmids für Säugerzellen)

Ein die Human-BTC-GF-cDNA enthaltendes SmaI-DraI-Fragment mit 0,7 kb wurde aus dem Plasmid pTB1499 (Beispiel 1) isoliert. Der BglII- Linker (5'CAGATCTG 3') wurde mittels T4-DNA-Ligase mit den stumpfen Enden dieses Fragments ligiert. Nach dem Verdauen mit BglII wurde das Human-BTC-GF-cDNA enthaltende Fragment mit 0,7 kb durch Ligieren mit T4-DNA-Ligase in die BglII-Stelle eines Expressionsplasmids pTB1308 inseriert, das aus pTB399 [Cell Struct. Funct. 12, 205 (1987)] durch Entfernen der IL-2-cDNA-Region (Figur 11) hergestellt wurde. Das sich daraus ergebende Plasmid (pTB1515) wurde anschließend mit SalI und HindIII gespalten. Das einen MuLV-LTR und eine Human-BTC-GF-cDNA enthaltende Fragment mit 2,4 kb wurde isoliert und zwischen SalI-HindIII-Stellen von pTB348 [Cell Struct. Funct. 12, 205 (1987)] mit dem SV40-Frühregionpromotor und Hamster-DHFR- cDNA eingeführt. Das sich daraus ergebende Plasmid wurde pTB1507 (Figur 12) genannt.

Beispiel 3

(Aufbau des Human-BTC-GF-cDNA-Expressionsplasmids von E. coli)

Ein für reifen Human-BTC-GF (1-147 Aminosäurereste) kodierendes EcoRI-BAMHI-Fragment mit 0,6 kb wurde aus dem Plasmid PTB15 (Beispiel 2) isoliert. Nach dem Ligieren synthetischer Adaptoren mit dem ATG-Translationsstartkodon (a: 5'TATGGATGGG 3', b: 5'AATTC- CCATCCA 3') an die EcoRI-Stelle des vorstehenden Fragments mit 0,6 kb wurde das sich daraus ergebende NdeI-BamHI-Fragment mit 0,6 kb in das Plasmid pET-3c, welches den t/-Promotor [Gen 56, 125 (1987)] trägt, unter Aufbauen des Plasmids pTB1505 inseriert.
Zum Erhalten eines DNA-Fragments, das für 80 Aminosäurereste von Human-BTC-GF [Reste 1 (Asp) - 80 (Tyr) von Figur 10] kodierte, wurde eine PCR unter Verwenden des Plasmids pTB1505 als Matrize und 2 Oligonukleotiden (1: 5'ATACATATGGATGGGAATTCCA 3'; 2: 5'CCGGATCCT- AGTAAAACAAGTCAACTCT 3') als Primer durchgeführt. Die Produkte wurden mit NdeI und BamHI verdaut, durch 2,0 % Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und das erwartete DNA-Fragment mit 0,25 kb wurde isoliert. Dieses NdeI-BamHI-Fragment mit 0,25 kb wurde stromabwärts des T7-Promotors von pET-3c durch Ligieren mit T4-DNA-Ligase unter Ergeben von Plasmid pTB1516 (Figur 13) inseriert.

Beispiel 4

(Exprimierung von Human-BTC-GF-cDNA in Säugerzellen)

Affenzellen COS7 wurden plattiert (3 x 10&sup5; Zellen/Schale) und in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Flow Labs) kultiviert, welches 10% fetales Kälberserum enthielt. Zehn Mikrogramm des Expressionsplasmids pTB1499 (Beispiel 1) beziehungsweise pTB1507 (Beispiel 2) wurden in COS7-Zellen mittels des Calciumchloridverfahrens [Virology 52 456 (1973)] eingeführt. Am nächsten Tag wurde das Kulturmedium gegen DMEM ausgetauscht, das 0,5% fetales Kälberserum enthielt, gefolgt von 2 Tagen Kultivierung. Das konditionierte Medium wurde gesammelt und auf die Stimulierung der DNA-Synthese durch ³H-Thymidineinbau in den ruhenden BALB/c-3T3-A31-714-Klon 4 [Int. J. Cancer 12, 463 (1973)] wie beschrieben [Mol. Cell. Biol. 8, 588 (1988)] untersucht. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3

Beispiel 5

(Exprimierung von Human-BTC-GF-cDNA in E. coli)

Escherichia coli MM294 wurde mit Lambdaphagen DE3 (Studier, vorstehend) lysogeniert, in welchem das RNA-Polymerasegen des T7- Phagen rekombiniert worden war. Danach wurde das Plasmid pLysS unter Ergeben von E. coli MM294(DE3)/pLysS in E. coli MM294(DE3) eingeführt. In diesen Stamm wurde das Plasmid pTB1516 eingeführt, wodurch E. coli MM294(DE3)/pLysS, pTB1516 erhalten wurde. Die Transformante wurde bei 37ºC in 20 ml L-Brühe kultiviert, die 100 µg/ml Ampicillin und 10 µg/ml Chloramphenicol enthielt. Als der Klettwert etwa 180 war, wurde dem Medium Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) auf 0,4 mM Endkonzentration zugesetzt und die Kultivierung wurde 4 Stunden fortgesetzt. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und in 0,5 ml Puffer suspendiert, der 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 10% Sucrose und 0,25 mM PMSF enthielt, und anschließend wurde der Suspension Eiweißlysozym in einer Konzentration von 0,5 mg/ml zugesetzt. Nach einer Stunde Aufbewahren in einem Eisbad wurde das Gemisch 5 Minuten bei 37ºC inkubiert und unter Ergeben eines Überstandes dem Zentrifugieren unterzogen (SORVALL, 15000 Upm, 30 Minuten bei 4ºC).
Der Bakterienextrakt wurde wie in Beispiel 4 beschrieben auf die Stimulierung der DNA-Synthese durch ³H-Thymidineinbau in ruhende BALB/c-3T3-Zellen untersucht. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4
Die Transformante Escherichia coli MM294(DE3)/pLysS, PTB1516 ist am 16. April 1992 unter der Hinterlegungsnummer IFO 15282 beim IFO als auch am 21. April 1992 unter der Zugangsnummer FERM BP-3836 beim Fermentationsforschungsinstitut, Amt für industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für internationalen Handel und Industrie, Japan (FRL), hinterlegt worden.

Beispiel 6

(Aufbau eines hBTC produzierenden CHO-Zellenstammes)

Das Expressionsplasmid pTB1507 (Beispiel 2) wurde durch das Calciumphosphatverfahren in CHO-dhfr&supmin;-Zellen [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)] eingeführt. Nach zwei Tagen wurde das Medium gegen ein Selektionsmedium (DMEM, das 10% dialysiertes fetales Kälberserum und 35 µg/ml Prolin enthielt) ausgetauscht und die Kultivierung wurde unter Erhalten von DHFR&spplus;-Zellen fortgesetzt. Diese CHO-DHFR&spplus;-Zellen wurden durch das Grenzverdünnungsverfahren kloniert und es wurden 60 Klone nachgewiesen. Zellen jedes Klons wurden in einer 24-Näpfchen-Platte zum Erreichen von 80% Konfluenz gezüchtet und das Medium wurde gegen 0,5 ml DMEM/Ham's F12 (1:1) ausgetauscht, welches 0,5% Kälberserum und 0,1 µg/ml Insulin enthielt. Nach 2 Tagen Kultivierung wurde das konditionierte Medium gesammelt und wie in Beispiel 3 beschrieben auf die mitogene Aktivität von HBTC untersucht. Das konditionierte Medium aus 31 Klonen von 60 zeigte eine mitogene Aktivität gegen Maus-3T3-Zellen. Die mitogene Aktivität war 0,1 bis 5,0 ng/ml, wobei die Aktivität durch Bestimmen des Faktors, der zum Ergeben von 50% der maximalen Stimulierung erforderlich ist, und Angeben als Gewicht des Standards Maus-EGF berechnet wurde.

Beispiel 7

(Aufbau eines HBTC produzierenden A9-Zellenstammes)

Maus-A9-Zellen (ATCC CCL 1.4) wurden mit Expressionsplasmiden, pTB1515 (Beispiel 2), das hbTC-cDNA enthielten, und p4aA8 [Jolly, D. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 477 (1983)], welches das Human-HPRT-Gen enthielt, simultan durch das Calciumphosphatverfahren transfiziert. Die Zellen wurden in DMEM-Medium, das mit 10% fetalem Kälberserum ergänzt war, 2 Tage gezüchtet und anschließend zur Selektion in HAT-Medium [Littlefield, J. W., Science 145, 709 (1964)] kultiviert. HPRT&spplus;-Zellen wuchsen in HAT-Medium und Klone wurden durch das Grenzverdünnungsverfahren isoliert. Die Zellen (10&sup5; je Näpfchen einer 24-Näpfchen-Platte) jedes Klons wurden plattiert und 2 Tage in einem Wachstumsmedium kultiviert und anschließend 2 Tage in 0,5 ml DMEM kultiviert, das 0,5% fetales Kälberserum enthielt. Der Wert für das in das Kulturmedium von 10&sup6; Zellen ausgeschiedene hBTC wurde durch die mitogene Aktivität gegenüber Maus-3T3-Zellen wie in Referenzbeispiel 7 beschrieben untersucht. Die Ergebnisse mehrerer Klone werden nachstehend in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5
Der Klon A9/1515-14 ist am 28. Dezember 1992 unter der Hinterlegungsnummer IFO 50389 beim IFO als auch am 13. Januar 1993 unter der Zugangsnr. FERM BP-4159 beim FRL hinterlegt worden.

Beispiel 8

(Reinigung von Human-BTC-GF, das durch eine transformierte COS7- Zelle produziert wurde)

Einem Liter Kulturüberstand von COS7-Zellen, in die das Plasmid pTB1507 eingeführt worden war, wurden 100 ml 1M Kaliumphosphat (pH 6,0), 2 ml 0,5 M EDTA, 10 ml 5% CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat) und 2 ml 0,25 M PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) zugesetzt und die Lösung wurde auf eine S-Sepharose -Säule (1,6 x 10 cm Durchmesser, Pharmacia) mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min aufgegeben. Nach dem Waschen der Säule mit 100 ml Puffer (0,1 M Kaliumphosphat (pH 6,0), 1 mM EDTA, 0,05% CHAPS, 0,5 mM PMSF) wurde zum Eluieren des Proteins eine Gradientenkonzentration von 0 M bis 0,21 M NaCl von 0 bis 10 Minuten, 0,21 M NaCl von 10 bis 40 Minuten und nach 40 Minuten ein 0,7 M NaCl enthaltender Puffer auf die Säule aufgegeben. Nach Messen der DNA- Synthese-induzierenden Aktivität für BALB/c3T3-Zellen der entsprechenden 2-ml-Fraktion (jeweils eine Minute) wurden die Fraktionen Nr. 51-69 zusammengefaßt (Fig. 14).
Die zusammengefaßte Fraktion der S-Sepharose -Säule wurde durch Ultrafiltration (Centriprep-10, Amicon) eingeengt und das Konzen trat wurde auf eine Gelfiltrationssäule (Superdex 75pg, Durchmesser 1,6 x 60 cm, Pharmacia) aufgegeben, welche bereits durch einen Puffer, der 20 mM Tris (pH 7,4) - 1 mM EDTA-0,05% CHAPS enthielt, mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,2 ml/min äquilibriert worden war. Die biologischen Aktivitäten wurden in jeder 1,2-ml-Fraktion (1 Minute) 15 Minuten nach dem Start gemessen und die Fraktionen 40-50 wurden zusammengefaßt (Fig. 15).
Die aus der Gelfiltration zusammengefaßte Fraktion wurde auf eine Heparin-HPLC-Säule (Durchmesser 0,85 x 5 cm; Shodex HR-894, Showa- denko) aufgegeben. Nach Waschen mit 20 mM Tris (pH 7,4) - 1 mM EDTA-0,05% CHAPS wurde eine Gradientenelution durch Einsetzen von 0 M bis 1 M NaCl bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min-60 Minuten durchgeführt und in Abständen von einer Minute wurden Fraktionen abgenommen. Die biologisch aktiven Fraktionen Nr. 24-28 wurden zusammengefaßt (Fig. 16).
Den aus der Heparin-HPLC-Säule zusammengefaßten Fraktionen wurde Triflueressigsäure (TFA) auf eine Endkonzentration von 0,1% zugesetzt und das Gemisch wurde auf eine C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule (Durchmesser 0,46 x 15 cm, Asahipak OPP-50, Asashi Chemical) aufgegeben. Nach Waschen der Säule mit 0,1% TFA wurde eine Gradientenelution mit 0% bis 63% (Vol./Vol.) Acetonitril mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min 70 Minuten durchgeführt und die eluierte Lösung wurde in Fraktionen von jeweils einer Minute aufgeteilt (Fig. 17). Die biologische Aktivität wurde bei dem in Fig. 17 schwarz gezeichneten Peak bestätigt.
Die SDS-PAGE und das Anfärben mit Silber von 20 µl bei der Umkehrphasenfraktionierung ergab eine einzige Bande, welche einem Molekulargewicht von 26-30 kD (Fig. 18) entsprach.
Auf diese Weise wurde durch COS7-Zellen hergestellter gereinigter Human-BTC-GF erhalten.

Beispiel 9

(Reinigung von durch A9-Zellen produziertem BTC-GF)

3,5 Liter Kulturüberstand von A9/1515-14-Zellen wurden 180 ml 1 M Kaliumphosphat (pH 6,0), 7 ml 0,5 M EDTA, 36 ml 5% CHAPS und 7 ml 0,25 M PMSF zugesetzt. Das Gemisch wurde auf eine S-Sepharose-Säule (Durchmesser 2,6 x 40 cm, Pharmacia) aufgegeben.
Nach Waschen der Säule mit einem Puffer (0,1 M Kaliumphosphat (pH 6,0), 1 mM EDTA und 0,05% CHAPS, 0,5 mM PMSF) wurde zum Eluieren des Proteins ein das Vorstehende und 0,7 M NaCl enthaltender Puffer mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min aufgegeben.
Fraktionen von jeweils 5 ml wurden auf die DNA-Synthese induzierende Aktivität (biologische Aktivität) bei BALB/c3T3-Zellen getestet und die erhaltenen Fraktionen Nr. 23-32 wurden als BTC-I und die Fraktionen Nr. 40-49 wurden als BTC-II (Fig. 19) zusammengefaßt.
Nach dem Fraktionieren von BTC-I mit 25% und anschließend 80%- gesättigtem Ammoniumsulfat wurde das sich daraus Ergebende durch Ultrafiltration (Centriprep-10, Amicon) konzentriert und das Konzentrat wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,2 ml/min auf eine Gelfiltrationssäule (Superdex 75 pg, Durchmesser 1,6 x 60 cm, Pharmacia) aufgegeben, welche zuvor mit 20 mM Tris (pH 7,4), 1 mM EDTA und 0,05% CHAPS äquilibriert worden war. 15 Minuten nach Beginn der Gelfiltration wurden Portionen von jeweils 1,2 ml gesammelt und die Fraktionen Nr. 35-41 mit hoher biologischer Aktivität wurden zusammengefaßt (Fig. 20A).
Nach dem Einengen des BTC-II durch Ultrafiltration (YM2; Amicon) wurde das Konzentrat mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,2 ml/min auf eine Gelfiltrationssäule (Superdex 75 pg, Durchmesser 1,6 x 60 cm, Pharmacia) aufgegeben, welche zuvor mit 20 mM Tris (pH 7,4), 1 mM EDTA und 0,05% CHAPS äquilibriert worden war. 15 Minuten nach Beginn der Gelfiltration wurden Portionen von jeweils 1,2 ml gesammelt und die Fraktionen Nr. 66-74 mit hoher biologischer Aktivität wurden zusammengefaßt (Fig. 20B).
Die aus der Gelfiltrationssäule gesammelte BTC-I-Fraktion wurde auf eine Heparin-HPLC-Säule (AF pak HR894, Durchmesser 0,8 x 5 cm, Showa-denko) aufgegeben. Nach Waschen der Säule mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 0,05% CHAPS wurde mit 0-0,9 M NaCl 30 Minuten eine Gradientenelution mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min durchgeführt und Fraktionen von jeweils 1 ml abgenommen. Die biologisch aktiven Fraktionen Nr. 9-13 wurden zusammengefaßt (Fig. 21A).
Die aus der Gelfiltrationssäule gesammelte BTC-II-Fraktion wurde auf eine Heparin-HPLC-Säule (AF pak HR894, Durchmesser 0,8 x 5 cm, Showa-denko) aufgegeben. Nach Waschen der Säule mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 0,05% CHAPS wurde mit 0-0,9 M NaCl 30 Minuten eine Gradientenelution mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min durchgeführt und Fraktionen von jeweils 1 ml abgenommen. Die biologisch aktiven Fraktionen Nr. 16-19 wurden zusammengefaßt (Fig. 21B).
Der aus dem Eluat der Heparinsäule gesammelten BTC-I-Fraktion wurde TFA auf eine Endkonzentration von 0,1% zugesetzt und anschließend wurde das Gemisch auf eine C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule (Asahipak ODP50, Durchmesser 0,46 x 15 cm, Asahi Chemical) aufgegeben. Auf das auf diese Weise erhaltene Eluat wurde 70 Minuten eine Gradientenelution mit Acetonitril (0 - 63%) in Anwesenheit von 0,1% TFA angewandt und das Eluat wurde in Fraktionen von jeweils 0,5 ml (1 Minute) gesammelt (Fig. 22A). Die biologische Aktivität wurde bei dem Elutionspeak bestätigt. Durch SDS-PAGE/Anfärben mit Silber wurde eine einzige Bande unter der Position mit dem Molekulargewicht von 14 K nachgewiesen (Fig. 23A). Das Verfahren ergab 150 µg BTC-I.
Der aus dem Eluat der Heparinsäule gesammelten BTC-II-Fraktion wurde TFA auf eine Endkonzentration von 0,1% zugesetzt und anschließend wurde das Gemisch auf eine C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule (Asahipak ODP50, Durchmesser 0,46 x 15 cm, Asahi Chemical) aufgegeben. Auf das auf diese Weise erhaltene Eluat wurde 70 Minuten eine Graduentenelution mit Acetonitril (0 - 63%) in Anwesenheit von 0,1% TFA angewandt und es wurden jeweils 0,5 ml Eluat (1 Minute) gesammelt (Fig. 22B). Die biologische Aktivität wurde bei dem Elutionspeak bestätigt. Durch SDS-PAGE/Anfärben mit Silber wurde eine einzige Bande an einer Position mit dem Molekulargewicht von 26-30 K nachgewiesen (Fig. 23B). Das Verfahren ergab 75 µg BTC-II.

Beispiel 10

(Reinigung von BTC-GF, der durch eine E. coli-Transformante produziert wurde)

Die Transformante E. coli MM294 (DE3)/pLysS, pTB1516 wurde eine Nacht kultiviert und die Kultur wurde in LB-Medium überführt und das Medium wurde 2 Stunden bei 37ºC kultiviert. IPTG wurde dem System auf eine Endkonzentration von 0,1 mM zugesetzt und die Kultivierung wurde 3 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und bei -20ºC aufbewahrt.
Die in einer Menge von 5 Liter aufbewahrten Zellen wurden aufgetaut und in 300 ml Puffer suspendiert, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM EDTA, 0,2 M NaCl, 10% Sucrose und 1 mM APMSE (4-Amidinophenyl)methylsulfonylfluorid) enthielt. In der Suspension wurden 40 mg Eiweißlysozym gelöst und die Lösung wurde 2 Stunden bei 4ºC inkubiert und der Ultraschallbehandlung und anschließend 1 Stunde Zentrifugieren bei 20000 x g unter Ergeben eines Überstandes unterzogen. Den Überstand ließ man durch 200 ml eines Q-Sepharose -Betts fließen und dem sich daraus Ergebenden wurde TCA auf eine Endkonzentration von 4% zugesetzt und man ließ 10 Minuten bei 4ºC ruhig stehen. Ein durch 20 Minuten Zentrifugieren mit 20000 x g gesammelter Niederschlag wurde in einem Puffer suspendiert, der 100 ml 20 mM Tris (pH 7,4), 1 mM EDTA und 1 mM APMSF enthielt, und dem sich daraus Ergebenden wurde 5N NaOH zum Einstellen des pH auf 6 zugesetzt, während in einem Mörser homogenisiert wurde. Dieses Homogenisat wurde 1 Stunde dem Zentrifugieren bei 100000 x g unterzogen und der sich daraus ergebende Überstand wurde auf eine S-Sepharose -Säule (Durchmesser 1,6 x 10 cm; Pharmacia) aufgegeben. Nach Waschen der Säule mit einem Puffer, der 0,1 M Kaliumphosphat (pH 6), 1 mM EDTA und 1 mM APMSF enthielt, wurde eine Gradientenelution 200 Minuten mit 400 ml 0 M bis 1 M NaCl durchgeführt. Es wurden jeweils 5 ml Eluat gesammelt. Die hochaktiven Fraktionen Nr. 20 bis 27 wurden als E. coli-BTC II (Fig. 24) zusammengefaßt.
Den zusammengefaßten Fraktionen wurde TFA auf eine Endkonzentration von 0,1% zugesetzt und anschließend wurde das Gemisch auf eine C18- Umkehrphasen-HPLC-Säule (Asahipak ODP-50, Durchmesser 1,0 x 25 cm, Asahi Chemical) aufgegeben. Nach Waschen der Säule mit 0,1% TFA wurde auf das auf diese Weise erhaltene Eluat 170 Minuten eine Gradientenelution mit 340 ml Acetonitril (0 - 63%) angewandt und es wurden jeweils 4 ml Eluat gesammelt. Die biologische Aktivität wurde bei den Elutionspeaks bestätigt (Fig. 25). Durch SDS-PAGE/- Anfärben mit Silber wurde eine Bande bei der Position mit dem Molekulargewicht von 18 K nachgewiesen (Fig. 26, Bahn II). Das Verfahren ergab 630 µg E. coli BTC-I.
Der aus dem 5-Sepharoseeluat gesammelten BTC-II-Fraktion wurde TFA auf eine Endkonzentration von 0,1% zugesetzt und anschließend wurde das Gemisch auf eine C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule (Asahipak ODP-50, Durchmesser 4,6 x 15 cm, Asahi Chemical) aufgegeben. Nach Waschen der Säule mit 0,1% TFA wurde auf das auf diese Weise erhaltene Eluat 70 Minuten einer Gradientenelution mit 35 ml Acetonitril (0 - 63%) angewandt und es wurden jeweils 0,5 ml Eluat gesammelt. Die biologische Aktivität wurde bei den Elutionspeaks bestätigt (Fig. 27). Durch SDS-PAGE/Anfärben mit Silber wurde eine Bande unter der Position mit dem Molekulargewicht von 14,3 K (Lysozym) nachgewiesen (Fig. 26, Bahn II). Das Verfahren ergab 990 µg E. coli BTC-II.
Die N-terminale Aminosäurensequenz von E. coli-BTC-I und BTC-II wurde bis zu 20 Aminosäuren bestimmt. Die Sequenz von BTC-I war mit derjenigen von Human-BTC-GF außer dem aus dem Startkodon stammenden Met identisch, wogegen BTC-II ein Molekül ist, dem 30 Aminosäuren ausgehend von Asp zu Lys fehlen (siehe Fig. 28).

Claims

1. Rekombinantes Human-BTC-GF-Protein mit den folgenden Eigenschaften:

a) das Protein hat ein Molekulargewicht von etwa 32 000 bei der SDS-PAGE;

b) das Protein ist stabil, wenn es 10 mM Dithiothreit ausgesetzt wird;

c) das Protein stimuliert die Vermehrung von Glattmuskelzellen;

d) das Protein hat eine Aminosäurensequenz, welche die Aminosäuren Nr. 1 bis Nr. 147 von Figur 10 oder die Aminosäuren Nr. 1 bis 80 von Figur 10 umfaßt.

2. Isolierte DNA, die für das Protein von Anspruch 1 kodiert.

3. Isolierte DNA von Anspruch 2, wobei die isolierte DNA die DNA-Sequenz von Nukleotid Nr. 388 bis Nukleotid Nr. 828 oder Nukleotid Nr. 388 bis Nukleotid Nr. 627 von Figur 10 umfaßt.

4. Rekombinanter Vektor, welcher die isolierte DNA von Anspruch 2 oder 3 besitzt.

5. Transformante, welche den Vektor von Anspruch 4 beherbergt.

6. Verfahren zum Herstellen des Proteins von Anspruch 1, welches das Kultivieren der Transformante von Anspruch 5 in einem Kulturmedium umfaßt.