DE69031710T2

DE69031710T2 - Verfahren zur herstellung eines proteins mittels eines durch mehrfachkopieintegrierung eines expressionsvektors transformierten pilzes

Info

Publication number: DE69031710T2
Application number: DE69031710T
Authority: DE
Inventors: Marco Luigi Frederico Nl-3123 Pn Schiedam Giuseppin; Maria Teresa Santos Marisol P-2825 Monte Da Caparica Lopes; Roelf Johannes Nl-1422 Rr Uithoorn Planta; Johannes Maria Antonius Nl-3155 Gc Maasland Verbakel; Cornelis Theodorus Nl-3142 Kb Maassluis Verrips
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1989-07-07
Filing date: 1990-07-09
Publication date: 1998-03-05
Anticipated expiration: 2010-07-10
Also published as: DE69033633T2; CA2063592A1; EP0778348A1; US6090574A; ES2109238T3; JP3273609B2; WO1991000920A3; ATE196505T1; CA2063592C; ATE160176T1; WO1991000920A2; IE902496A1; DK0481008T3; EP0481008A1; DK0778348T3; DE69031710D1; JPH05501949A; EP0481008B1; DE69033633D1; ES2150188T3

Description

In einem Hauptaspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines homologen oder heterologen Proteins durch eine Hefe, die durch Mehrfachkopien-Integration eines Expressionsvektors in das Genom der Hefe transformiert ist, wobei der Expressionsvektor sowohl ein "exprimierbares Gen", das das Protein codiert, als auch einen sogenannten "defizienten Selektionsmarker, der für das Wachstum der Hefe in einem spezifischen Medium notwendig ist," enthält.
Obgleich die meisten Versuche mit Hefen durchgeführt worden sind, ist ersichtlich, daß die Erfindung auch auf Schimmelpilze anwendbar ist. Daher wird in der vorliegenden Beschreibung zusätzlich zu entweder Hefe oder Schimmelpilz der Begriff "Fungus" oder seine Pluralform "Fungi" verwendet, der sowohl Hefen als auch Schimmelpilze abdeckt.
In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck "exprimierbares Gen" ein Strukturgen, welches ein - für den Wirtsorganismus entweder homologes oder heterologes - Protein codiert, in Verbindung mit den DNA-Sequenzen für ordnungsgemäße Transkription und Translation des Strukturgens und wahlweise mit Sekretionssignal-DNA-Sequenzen, wobei diese DNA- Sequenzen im Wirtseukaryonten funktionsfähig sein sollen.
In der vorliegenden Beschreibung wird der Ausdruck "defizienter Selektionsmarker, der für das Wachstum der Hefe oder des Schimmelpilzes in einem spezifischen Medium notwendig ist," für ein Markergen verwendet, welches einen Promoter und ein ein Polypeptid oder Protein codierendes Strukturgen enthält, wobei das Polypeptid oder Protein
- entweder für die Herstellung eines Bestandteils, z.B. von Aminosäuren, Vitaminen und Nukleotiden, notwendig ist, wobei dieser Bestandteil für das Wachstum der Hefe oder des Schimmelpilzes essentiell ist; in der vorliegenden Beschreibung wird ein derartiger Bestandteil auch "essen= tieller Nährstoff" genannt,
- oder für den Schutz der Zelle gegen im Medium vorliegende toxische Verbindungen, z.B. Antibiotika oder Cu²&spplus;-Ionen, notwendig ist,
mit der Maßgabe, daß der defiziente Selektionsmarker
- entweder zur sub-optimalen de novo-Synthese des Polypeptids oder Proteins führt, die wiederum zu einer suboptimalen Produktion des essentiellen Bestandteils bzw. zu einem sub-optimalen Schutz gegen die toxische Verbindung führt,
- oder zur de nove-Synthese einer Modifikation des Polypeptids oder Proteins mit einer sub-optimalen Effizienz bei der Produktion des essentiellen Bestandteils bzw. zu suboptimalem Schutz gegen die toxische Verbindung führt.
Somit wird das Wort "defizient" verwendet, um sowohl die suboptimale Synthese des Polypeptids oder Proteins als auch die Produktion eines Polypeptids oder Proteins mit sub-optimaler Effizienz bei den Aktionen für die Zelle, wie vorstehend erwähnt, zu bezeichnen.
Beispiele derartiger Markergene sind u.a. auxotrophe Marker, wie die LEU2-, die TRP1- und die URA3-Gene, Antibiotikaresistenzgene, wie das G418-Resistenzgen und das Chloramphenicol- Resistenzgen, und das das Enzym Katalase codierende Gen, das die Zelle gegen H&sub2;O&sub2; schützen kann.

HINTERGRUND DES ASPEKTS DER MEHRFACHKOPIEN-INTEGRATION DER ERFINDUNG

Ein Beispiel eines sogenannten "defizienten Selektionsmark ers, der für das Wachstum der Hefe notwendig ist," ist das von Kingsman c.s. (Literaturstelle 1) beschriebene LEU2d-Gen, der die Entwicklung eines in mehreren Kopien integrierenden Vektors beschrieb, der unter Verwendung des transponierbaren Ty-Elements Tyl-15 (Literaturstelle 2) über das Genom verstreut wurde. Das Element wurde so gestaltet, daß es zwei selektierbare Marker, TRP1 (Literaturstelle 3) und LEU2 aus pMA3a, und die PGK-Expressionssignale aus pMA91 (Literaturstelle 4) mit einer IFN-α&sub2;-codierende Sequenz (Literaturstelle 5) enthielt. Es wurde eine einfache Kopie des gestalteten Ty in das Genom unter Verwendung eines linearen Fragments integriert, um die Rekombination entlang der Enden des Elements zu stimulieren und dabei ein endogenes Element zu ersetzen. Die Transformanten wurden nach dem TRP1-Marker selektiert. Bei Selektion nach IEU2 wurden nur wenige Transformanten erhalten, da durch eine einfache Kopie dieses Gens unzureichend Enzym produziert wurde. Der Transformant wurde anschließend in abnehmenden Konzentrationen an Leucin gezüchtet, um - vermutlich durch Verteilung des Ty-Elements über das Genom durch Genkonversion und -transposition (Literaturstelle 6) - nach einem Zuwachs in der Kopienzahl des LEU2- Gens zu selektieren. Es wurde ein Stamm konstruiert, der 8x10&sup5; Moleküle IFN pro Zelle produzierte; dies ist ein Zwischenwert zwischen Ausbeuten aus Einfachkopie-ARS/CEN- Vektoren (10&sup5; Moleküle/Zelle) und aus Mehrfachkopien-Vektoren wie pMA91 (6x10&sup6; Moleküle/Zelle).
Für ein praktisches stabiles Produktionssystem mit einer transformierten Hefe weist die Verwendung von Ty-Elementen bestimmte Nachteile auf.
- Zum Beispiel sind Ty-Elemente homolog zu retroviralen Sequenzen, die mehr oder weniger bedenkliche Materialien zur Herstellung eines für Erzeugnisse zum menschlichen Verzehr geeigneten Proteins oder bei dessen Zubereitung sind. Daher ist es vorzuziehen, Lösungen zu finden, bei denen diese mehr oder weniger bedenklichen Materialien nicht verwendet werden.
- Ein anderer Nachteil besteht in ihrer Eigenschaft, transponierbare Elemente zu sein. Dies hat zur Folge, daß ein beachtliches Risiko existiert, daß der erhaltene Stamm genetisch nicht stabil ist, weil die in das Chromosom der Hefe integrierten transponierbaren Ty-Elemente transponieren und an anderen Stellen des Genoms integrieren können, was negative Auswirkungen für das Herstellungsverfahren hat und zu Problemen bei der Erlangung der Herstellungserlaubnis von zuständigen Firmen und den Ordnungsbehörden führen kann.
- Angesichts ihrer retroviralen Eigenschaften können Ty- Elemente zu virusartigen Partikeln führen. Dies ist für praktische Herstellungsverfahren sehr unerwünscht, weil eine Instabilität genetisch modifizierter Organismen vermieden werden sollte.
- Ty-Elemente kommen nur in der Hefe Saccharoinyces cerevisiae vor. Daher ist es zweifelhaft, ob sie für andere Hefen oder sogar Schimmelpilze verwendet werden können. Es ist unbekannt, ob in anderen Organismen vorkommende transponierbare Elemente auf ähnliche Weise verwendet werden können. Doch selbst wenn sie können, weisen sie die gleichen oben beschriebenen Nachteile auf.
- Die durch Ty-Integration erhaltene Kopienzahl liegt bei et wa 20 bis 30 mit einem einzelnen Maximum von etwa 40 Kopien pro Zelle. Eine höhere Zahl von 100 bis 300 Kopien pro Zelle wäre für kommerzielle Herstellungssysteme in hohem Maße wünschenswert, da höhere Kopienzahlen im allgemeinen zu höheren Expressionsniveaus führen.
Daher besteht ein Bedürfnis nach anderen Systemen, durch welche Mehrfachkopien-Integration heterologer Gene in Fungi, wie Hefe und Schimmelpilze, erreicht werden kann.

ZUSAMMENFASSUNG DES ASPEKTS DER MEHRFACHKOPIEN-INTEGRATION DER ERFINDUNG

Es ist nun gefunden worden, daß eine stabile Mehrfachkopien Integration in S. cerevisiae durch Verwendung eines Expressionsvektors erreicht werden kann, der sowohl ein exprimierbares heterologes Gen als auch einen "defizienten Selektionsmarker, der für das Wachstum der Hefe notwendig ist," laut vorstehender Definition; und zusätzlich eine ribosomale DNA- Sequenz enthält, wovon die ribosomale DNA-Sequenz die stabile Mehrfachkopien-Integration des Expressionsvektors in den ribosomalen DNA-Locus des Hefegenoms erlaubt. Überraschenderweise erschien es mit einem derartigen System möglich zu sein, Mehrfachkopien-Integration von über 200 Kopien pro Zelle zu erreichen, die sowohl in Batch- als auch kontinuierlichen Kulturen über mehr als 70 Generationen stabil waren.
Es ist überraschenderweise gefunden worden, daß nicht nur das bekannte LEU2d-System, sondern auch andere "defiziente Marker", insbesondere ein TRP1D- oder URA3D-Gen, verwendet werden können. Es ist weiter gefunden worden, daß dieses Verfahren auch auf andere Hefen, insbesondere der Gattungen Hansenula und Kluyveromyces, übertragen werden kann. Daher scheint das Prinzip der Verwendung eines Expressionsvektors, der einen "defizienten Marker" in Verbindung mit einer ribosomalen DNA-Sequenz enthält, um, wie vorstehend offenbart, eine Mehrfachkopien-Integration in eine Hefe zu erreichen, eine allgemeinere Anwendung zu haben, z.B. für weitere Hefen, wie Pichia oder Schimmelpilze, die z.B. zu den Gattungen Aspergill US, Rhizopus oder Trichoderina gehören, insbesondere, wenn die Mehrfachkopien-Integrationsvektoren ribosomale DNA enthalten, die aus dem Wirtsorganismus stammen. Daher ist dieses Prinzip für Fungi im allgemeinen anwendbar.
Der Aspekt der Mehrfachkopien-Integration der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins, z.B. einer Lipase, durch einen Eukaryonten bereit, der durch Mehrfachkopien-Integration eines Expressionsvektors in das Genom des Eukaryonten transformiert worden ist, wobei der Expressionsvektor sowohl ein das heterologe Protein codierendes exprimierbares Gen als auch einen sogenannten "defizienten Selektionsmarker, der für das Wachstum des Eukaryonten notwendig ist," enthält, in welchem Verfahren der Expressionsvektor ribosomale DNA-Sequenzen enthält, die die Mehrfachkopien-Integration des Expressionsvektors in den ribosomalen DNA-Locus des Eukaryontengenoms ermöglicht.
Es ist weiter gefunden worden, daß ein vorstehend beschriebener Expressionsvektor in hoher Kopienzahl stabil aufrechterhalten werden kann, wenn ein erfindungsgemäß transformierter Fungus auf einem sogenannten "kompletten" oder nichtselektiven Medium gezüchtet wird, welches alle für das Wachstum des Fungus notwendigen Bestandteile enthält. Normalerweise würde man erwarten, daß die de nove-Synthese aufgrund des Vorliegens des essentiellen Bestandteus im Medium nicht erforderlich ist, was zur Abnahme des Anteils der Mehrfachkopien-integrierten Hefezellen an der Gesamthefepopulation und daher zu einer verminderten Produktion des gewünschten Polypeptids oder Proteins führen würde. Überraschenderweise wird die Mehrfachkopien-Integration trotz einer Situation, in der de novo-Synthese nicht erforderlich ist, stabil aufrechüerhalten, und das Polypeptid oder Protein wurde in relativ hohen Mengen produziert.
Obgleich die Erfindung nicht durch irgendeine Erklärung beschränkt ist, wird angenommen, daß die beobachteten Effekte auf der folgenden Theorie beruhen. Aus unbekannten Gründen scheint es, daß in einem derartigen System die Aufnahme des essentiellen Bestandteils beschr.nkt ist. Daher ist die de novo-Synthese immer noch notwendig, wenn der Fungus bei einer Wachstumsgeschwindigkeit oberhalb eines bestimmten Minimalwertes gezüchtet wird. Dies führt zu einem Selektionsvorteil für diejenigen Zellen, die eine hohe Kopienzahl des "defizienten Markers" aufweisen. Möglicherweise wird die aktive Aufnahme des essentiellen Bestandteils, z.B. von Leucin, vom Vorliegen anderer Komponenten im Medium, z.B. Peptiden und Valin, negativ beeinflußt.
Daher kann das Verfahren im allgemeinen als Verfahren beschrieben werden, bei dem der transformierte Fungus in einem Medium gezüchtet wird, das den essentiellen Bestandteil in einer Konzentration unterhalb eines bestimmten Schwellenwertes enthält, wodurch die Aufnahme des Bestandteils geschwindigkeitsbestimmend wird, so daß die de novo-Synthese des Bestandteils für eine Wachstumsgeschwindigkeit oberhalb eines bestimmten Minimalwertes erforderlich ist.
Ein Plasmid, das geeignet ist zur Verwendung in einem Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins durch einen Fungus, welcher durch Mehrfachkopien-Integration eines Expressionsvektors in die ribosomale DNA des Fungus transformiert ist, wurde vor der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Lopes et al. haben ihre Ergebnisse bezüglich eines Hefe- Vektors, welchen sie pMIRY2 genannt haben und der zur Expression heterologer Proteine in großen Mengen geeignet ist, 1988 und 1989 veröffentlicht. Auf einem 1988 veröffentlichen Poster wurde der Vektor zum ersten Mal beschrieben. Der vorletzte Satz der Zusainmenfassung auf dem Poster lautete
"pMIRY2-Derivate, die das PGK- oder Thaumatingen enthalten, erschienen wesentlich weniger stabil als das ursprüngliche Plasmid."
Die in 1988 auf dem Poster gezeigten Ergebnisse wurden vollständig in Gene, 79 (Nr. 2; 15. Juli 1989) 199-206 veröffentlicht. Der Satz über die Instabilität des pMIRY2-Plasmids, das ein insertiertes Gen enthält und auf dem Poster von 1988 erwähnt wurde, wurde jedoch in der Veröffentlichung von 1989 in "Gene" weder wiederholt noch widerlegt.
Andere wichtige Passagen in diesem "Gene"-Artikel sind
"Der beste Kandidat scheint die ribosomale DNA zu sein, die etwa 140 Kopien einer 9,1 kb-Einheit umfaßt, die hintereinander auf dem Chromosom XII wiederholt sind (Petes, 1979).
...........
Experimente, bei welchen dieses System verwendet wurde, um entweder homologe oder heterologe Gene in Hefezellen einzuführen, zeigen Expressionsmengen, die mit solchen, die kürzlich unter Verwendung des YEP-Vektors erreicht wurden, vergleichbar sind.
(siehe Seite 200, rechte Spalte)"
"..., wir schließen daraus, daß Mehrfachkopien des Plasmids in den rDNA-Locus hintereinander angeordnet und an einer sehr begrenzten Anzahl von Mutationsorten integriert wurden.
(siehe Seite 202, rechte Spalte)"
Dieser pMIRY2-Vektor war die Basis für Plasmide, die bei der Entwicklung der vorliegenden Erfindung verwendet wurden. Das auf dem Poster von 1988 erwähnte Stabilitätsproblem wurde durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung durch Entwickeln eines Verfahrens, wie es in Anspruch 1 und den abhängigen Ansprüchen beschrieben ist, gelöst.
Ein Beispiel eines kompletten Mediums ist ein industriell eingesetztes Wachstumsmedium, wie Molassen, Molke, Hefeextrakt und Kombinationen hiervon.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die fermentative Herstellung einer der verschiedenen Formen der vorstehend beschriebenen Enzyme oder verwandter Wirte. Eine derartige Fermentation kann entweder eine normale Batch- Fermentation, eine semi-kontinuierliche Fermentation oder eine kontinuierliche Fermentation sein. Die Auswahl, welches Verfahren eingesetzt werden muß, hängt vom Wirtstamm und dem bevorzugten Downstream-Verfahren ab. Gemäß dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, daß das Enzym vom Mikroorganismus in die Fermentationsbrühe sekretiert wird, worauf das Enzym aus der Brühe gewonnen werden kann, indem die Zellen zuerst entweder durch Filtration oder Zentrifugation entfernt werden.
In besonderen Ausführungsformen betrifft dieser Aspekt der Erfindung die Herstellung modifizierter Enzyme oder modifizierte Enzyme, insbesondere modifizierte Lipasen. Daher stellt dieser nachstehend beschriebene Aspekt u.a. Verfahren zur Herstellung einer Lipase, z.B. von Lipasen von der Gattung Pseudomonas, z.B. Lipase aus P. glumae (alias P. gladioli), bereit und stellt außerdem genetisch modifizierte Formen derartiger Lipasen bereit.

SPEZIELLE AUSFÜHRUNGSFORMEN DES MEHRFACHKOPIEN-ASPEKTS DER ERFINDUNG

Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines homologen oder heterologen Proteins durch einen Eukaryonten bereit, der durch Mehrfachkopien-Integration eines Expressionsvektors in das Genom eines Wirtseukaryonten transformiert ist, wobei der Expressionsvektor sowohl ein vorstehend definiertes, das homologe oder heterologe Protein codierendes "exprimierbares Gen" als auch einen vorstehend definierten sogenannten "defizienten Selektionsmarker, der für das Wachstum der Hefe oder des Schimmelpilzes in einem spezifischen Medium notwendig ist" enthält, in dem der Expressionsvektor ribosomale DNA-Sequenzen enthält, die die Mehrfachkopien-Integration des Expressionsvektors in den ribosomalen DNA-Locus des Eukaryontengenoms ermöglichen. Vorzugsweise ist der defiziente Selektionsmarker ein LEU2d-Gen, ein TRP1d-Gen oder ein URA3d-Gen. Der Eukaryont kann ein Fungus, wie eine Hefe, vorzugsweise eine der Gattungen Saccharomyces, Kluyveromyces oder Hansenula, oder ein Schimmelpilz, vorzugsweise einer der Gattungen Aspergillus, Rhizopus und Trichoderma, sein. In einem bevorzugten Verfahren wird der transformierte Eukaryont in einem Medium gezüchtet, das einen für das Wachstum des Eukaryonten essentiellen Bestandteil in einer Konzentration enthält, wodurch die Aufnahme des Bestandteils geschwindigkeitsbestimmend ist, so daß die de novo-Synthese des Bestandteils für eine Wachstumsgeschwindigkeit oberhalb eines bestimmten Minimalwertes erforderlich ist, wobei dieser Wert vom Wirtsorganismus und den Verfahrensbedingungen abhängt. Vorzugsweise ist dieses Medium ein sogenanntes "komplettes" oder nicht-selektives Medium, das alle für das Wachstum des Eukaryonten notwendigen Bestandteile enthält, z.B. ein industriell eingesetztes Wachstumsmedium, wie Molassen, Molke, Hefeextrakt und Gemische hiervon.
Um eine ausreichende Produktion eines ausgewählten Proteins im erfindungsgemäßen Verfahren zu erhalten, ist es bevorzugt, daß der transformierte Eukaryont das oder die für die Expression des Proteins erforderlichen Gene in multimerer Form auf einem seiner Chromosomen auf oder in unmittelbarer Verbindung mit einem Locus enthält, der für eine ribosomale RNA codiert, während auf dem gleichen Locus auch multimere Kopien eines defizienten Gens vorliegen, das ein für den biochemischen Synthesepfad des "essentiellen Nährstoffs" erforderliches Protein codiert. Beispiele derartiger exprimierbarer Gene sind diejenigen, die ein Enzym, vorzugsweise ein hydrolytisches Enzym, insbesondere eine Lipase, oder eine genetisch modifizierte Form eines derartigen Enzyms codieren. Besonders bevorzugte Lipasen, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden können, sind Lipasen, die mit gegen eine Lipase aus Chromobacter viscosum var lipolyticum NRRL B-3673 gezüchteten Antiseren oder mit gegen Lipase aus Alcaligenes PL-679, ATCC 31371 oder FERM-P 3783 gezüchteten Antiseren oder mit gegen eine Lipase aus Pseudoinonas fluorescens IAM 1057 gezüchteten Antiseren eine Kreuzreaktion zeigen, und modifizierte Formen einer derartigen eine Kreuzreaktionen zeigenden Lipase.
Eine besonders bevorzugte Lipase wird von einem Gen codiert, das die in Figur 2 angegebene Nukleotidsequenz oder eine beliebige Nukleotidsequenz aufweist, die dieselbe Aminosäuresequenz wie die durch diese Nukleotidsequenz spezifizierte codiert oder modifizierte Formen dieser Aminosäuresequenz codiert, die zu einer Lipase mit einer besseren Gesamttauglichkeit in Detergenziensystemen als die ursprüngliche Lipase führen. Der in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte transformierte Eukaryont ist vorzugsweise ein Eukaryont, der für die Synthese eines vorstehend definierten "essentiellen Nährstoffs" defizient ist, wobei der defiziente Selektionsmarker zur Komplementierung der Synthese des "essentiellen Nährstoffs" beitragen kann. Die Defizienz des Elternstamms kann durch Ersatz eines Gens, welches ein im Biosynthesepfad der Herstellung des essentiellen Nährstoffs wirksames Enzym codiert, erreicht werden. Es ist besonders vorteilhaft, wenn das Enzym, für das der Elternstamm defizient ist, eine Reaktion in einem Teil des Biosynthesepfads katalysiert, der bis zur Bildung des essentiellen Nährstoffs nicht verzweigt ist. Beispiele essentieller Nährstoffe sind Aminosäuren, Nukleotide oder Vitamine, insbesondere eine der Aminosäuren Leucin, Tryptophan oder Uracil.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein vorstehend beschriebenes Verfahren, bei dem der Expressionsvektor zusätzlich zu den normalerweise auf einem Vektor vorliegenden Sequenzen enthält:
(i) eine doppelsträngige (ds)-ribosomale DNA oder einen Teil hiervon, z.B. eine ds-DNA-Sequenz, die eine ribosomale RNA codiert, und
(ii) eine DNA-Sequenz, die in der 5'T3'-Richtung in folgender Reihenfolge enthält:
(ii) (a) einen starken, im Wirtsorganismus funktionsfähigen Promoter,
(ii) (b) wahlweise eine Signalsequenz, die die Sekretion des Proteins aus dem Wirtseukaryont erleichtert,
(ii) (c) ein das Protein codierendes Strukturgen,
(ii) (d) einen effizienten, im Wirtseukaryonten funktionsfähigen Terminator.
Die ribosomale DNA kann ribosomale DNA sein, die in Schimmelpilzen vorkommt, insbesondere Schimmelpilzen der Gattungen Aspergillus, Rhizopus und Trichoderma, oder diejenige, die in Hefen vorkommt, insbesondere Hefen der Gattungen Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula und Pichia.
Versuche haben gezeigt, daß die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn der Vektor etwa die gleiche Länge wie eine ribosomale DNA-Einheit des Wirtsorganismus aufweist. Z.B. wurden Vektoren von etwa 14 kb oder 5 kb nicht stabil aufrechterhalten, wenn die ribosomale Einheit auf der chromosomalen DNA etwa 9 kb beträgt, Vektoren von etwa 0 bis 10 kb wurden jedoch stabil aufrechterhalten.
Der das exprimierbare Gen kontrollierende Promoter ist vorzugsweise
(i) der Gal7-Promoter, der GAPDH-Promoter oder der PGK- Promoter, falls der Wirt zur Gattung Saccharomyces gehört,
(ii) der Inulinase-Promoter, der PGK-Promoter oder der LAC4- Promoter, falls der Wirt zur Gattung Kluyveromyces gehört,
(iii) der DHAS-Promoter oder MOX-Promoter, falls der Wirt zur Gattung Hansenula gehört,
(iv) der Glucoamylase-Promoter, Glucoseoxidase-Promoter oder der GAPDH-Promoter, falls der Wirt zu einem Schimmelpilz der Gattung Aspergillus gehört, oder
(v) der Cellulase-Promoter oder der GAPDH-Promoter, falls der Wirt zu Schimmelpilzen der Gattungen Rhizopus und Trichoderma gehört.
Wenn das Strukturgen eine Oxidase codiert, gehört die Wirtszelle vorzugsweise zu den Gattungen Hansenula oder Pichia oder Aspergillus.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Verfahren, bei dem das exprimierbare Strukturgen die leichte oder schwere Kette eines Immunoglobulins oder vorzugsweise beide Gene, oder einen Teil der leichten oder schweren Kette eines Immunoglobulins, vorzugsweise den Teil, der codiert, was normalerweise das FAB-Fragment genannt wird, oder den Teil hiervon, der die variablen Regionen codiert, codiert. In Beziehung zu dieser Ausführungsform steht die Verwendung eines Gens oder von Genen, die gentechnisch modifiziert sind, was zu modifizierten Immunoglobulinen oder Immunoglobulinen mit katalytischer Aktivität (Abzyme) führt.
Ein bevorzugter Expressionsvektor enthält zusätzlich ein ein Enzym codierendes defizientes Gen, das disruptiert oder aus dem Chromosom der Wirtszelle deletiert worden ist, insbesondere eines, welches ein im Biosynthesepfad der Herstellung eines essentiellen Nährstoffs, wie einer Aminosäure, wie Leucin, Tryptophan oder Uracil, eines Nukleotids oder eines Vitamins, wirksames Enzym codiert.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann als normale Batch- Fermentation, als semi-kontinuierliche Fermentation oder als kontinuierliche Fermentation durchgeführt werden. Es ist bevorzugt, daß das Medium den essentiellen Nährstoff in einer solchen Konzentration enthält, daß mindestens 20, jedoch vorzugsweise mindestens 50, Kopien des defizienten Gens im Chromosom aufrechterhalten werden, wobei das defiziente Gen ein Enzym codiert, das an der Biosynthese des essentiellen Nährstoffs beteiligt ist. Gute Ausbeuten des Proteins, das vom transformierten Eukaryonten hergestellt werden soll, können erhalten werden, wenn die Wachstumsgeschwindigkeit des Wirtes zwischen 20 und 100%, vorzugsweise zwischen 80 und 100%, der maximalen Wachstumsgeschwindigkeit eines ähnlichen Wirtes unter den gleichen Fermentationsbedingungen liegt, der für den essentiellen Nährstoff nicht defizient ist.

HINTERGRUND DES LIPASE-ASPEKTS DER ERFINDUNG

Lipasen und Proteasen sind beide als Inhaltsstoffe von Detergenzien- und Reinigungsmittelzusammensetzungen bekannt. Proteasen werden weithin eingesetzt.
Beispiele bekannter Lipase-haltiger Detergenzienzusammensetzungen werden von den EP-A-0 205 200 und EP-A-0 206 390 (Unilever) bereitgestellt, die eine Klasse von Lipasen betreffen, die auf der Basis ihrer immunologischen Beziehung und ihrer überlegenen Reinigungseffekte beim Waschen von Textilien definiert sind. Die bevorzugte Klasse von Lipasen enthält Lipasen aus u.a. P. fluorescens, P. gladioli und Chromobacter-Arten.
Die EP-A-0 214 761 (NOVO) und EP-A-0 258 060 (NOVO) geben jeweils eine detaillierte Beschreibung von Lipasen aus bestimmten Mikroorganismen und auch bestimmter Verwendungen von Detergenzienadditiven und Detergenzienzusammensetzungen für die beschriebenen Enzyme. Die EP-A-0 214 761 gibt eine detaillierte Beschreibung von Lipasen, die aus Organismen der Arten P. cepacia stammen, und bestimmte Verwendungen hierfür. Die EP-A-0 258 060 gibt eine detaillierte Beschreibung von Lipasen, die aus Organismen der Gattung Thermomyces (früherer Namc Humicola) stammen, und bestimmte Verwendungen hierfür.
Eine Schwierigkeit bei der gleichzeitigen Einverleibung von sowohl Lipasen als auch Proteasen in Detergenzienzusammensetzungen besteht darin, daß die Protease zum Angriff der Lipase neigt.
Zum Überwinden dieses Nachteils sind Maßnahmen vorgeschlagen worden.
Ein derartiger Versuch wird von der EP-A-0 271 154 (Unilever) verkörpert, in der gezeigt wird, daß sich bestimmte ausgewählte Proteasen mit isoelektrischen Punkten unter 10 vorteilhaft mit Lipasen kombinieren lassen.
Ein anderer Versuch ist in der WO 89/04361 (NOVO) beschrieben, die Detergenzienzusammensetzungen betrifft, die eine Lipase aus Pseudomonas-Arten und eine Protease aus Fusarium oder Proteasen des Subtilisin-Typs enthalten, die in ihrer Aminsäuresequenz an der Position 166, 169 oder 222 auf bestimmte Weisen mutiert worden sind. Es wurde berichtet, daß mit den speziellen beschriebenen Proteasen eine Verminderung des Ausmaßes des Angriffs auf die Lipase festzustellen war.

DER LIPASE-ASPEKT DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt in einem Aspekt durch rekombinante DNA- Techniken hergestellte Lipasen bereit, die mindestens eine Mutation in ihrer Aminosäuresequenz tragen, welche eine verbesserte Stabilität gegen Proteaseangriff verleiht.
Z.B. stellt die Erfindung Lipasen bereit, die eine immunologische Kreuzreaktivität gegen Antiseren zeigen, die gegen Lipase aus Chromobacter viscosum var. Lipolyticum NRRL B-3673 oder gegen Lipase aus Pseudomonas fluorescens IAM 1057 gezüchtet sind und von einem künstlich modifizierten Mikroorganismus produziert werden, der ein durch rekombinante DNA- Techniken hergestelltes Gen enthält, das mindestens eine die Aminosäuresequenz der Lipase beeinflussende Mutation trägt, um hierdurch der Lipase eine verbesserte Stabilität gegen Proteaseangriff zu verleihen.
Die künstlich modifizierten Mikroorganismen sind u.a. Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, P. putida und P. glumae, in denen das ursprüngliche Gen für die Lipase deletiert worden ist, Bacillus subtilis und verschiedene Varietäten der Gattung Aspergillus, Rhizopus und Trichoderma, Saccharomyces cerevisiae und verwandte Arten, Hansenula polymorpha, Pichia und verwandte Arten, Kluyveromyces marxianus und verwandte Arten. Da diese Wirtszellen einen breiten Bereich verschiedener Mikroorganismen widerspiegeln, können andere, in den Beispielen nicht im Detail beschriebene Mikroorganismen gleichfalls als Wirtszellen verwendet werden.
Die modifizierte Lipase kann sowohl Aktivitäts- als auch Stabilitätsvorteile bringen, wenn sie als Teil einer Detergenzien- oder Reinigungsmittelzusammensetzung verwendet wird.
Bei einer derartigen Lipase kann die Mutation z.B. ausgewählt sein aus
(a) einer Einführung (z.B. durch Insertion oder Subsitution) eines oder mehrerer Prolinreste an einem Ort, der sonst gegen proteolytischen Angriff empfindlich ist;
(b) einer Erhöhung der nettopositiven Ladung des Lipasemoleküls (z.B. durch Insertion positiv geladener Aminosäurereste oder durch Substitution neutraler oder negativ geladener Aminosäurereste);
(c) einer Einführung (z.B. durch Insertion oder Substitution) einer Kombination von Aminosäureresten der Lipase, die einer Glycosylierung in der ausgewählten Wirtszelle zugänglich sind, wodurch die Stabilität der glycosylierten Lipase gegen proteolytischen Angriff verbessert wird.
Durch die Erfindung wird auch ein Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Mikroorganismus bereitgestellt, der durch rekombinante DNA-Techniken zur Herstellung eines Enzyms in der Lage ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das das Enzym codierende Gen, das in den Mikroorganismus eingeführt wird, an seinem 5'-Ende an eine (modifizierte) Präsequenz fusioniert ist.
In besonderen Ausführungsformen der Erfindung wird das Gen bakteriellen Ursprungs mit einer künstlichen Präsequenz in eukaryontische Organismen eingeführt.
Demzufolge stellt die Erfindung in bestimmten Aspekten künstlich modifizierte Mikroorganismen bereit, die ein ein Enzym codierendes Gen enthalten und zur Herstellung dieses Enzyms, das ursprünglich aus einem der vorstehend erwähnten Organismen stammt, oder eines durch Anwendung rekombinanter DNA- Techniken modifizierten Form eines derartigen Enzyms in der Lage sind, und Fermentationsverfahren zur Enzymherstellung auf der Basis derartiger künstlich modifizierter Mikroorganismen. Die Fermentationsverfahren selbst können, abgesehen von der speziellen Natur der Mikroorganismen, auf bekannten Fermentationstechniken und üblicherweise eingesetzten Fermentations- und Downstream-Verarbeitungsanlagen beruhen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird gefunden, daß modifizierte (mutierte) Lipasen aus Pseudomonas oder eine andere der bevorzugten Klasse von Lipasen mit (einer) Aminosäuresequenzmodifikation(en), die zur Erhöhung der Stabilität des Enzyms gegen Proteaseverdau ausgewählt (ist) sind, in Detergenzien- und Reinigungsmittelzusammensetzungen, insbesondere zum Beispiel in Verbindung mit Proteasen, z.B. Proteasen des Subtilisin-Typs, von Wert sind.
Ein geeignetes und gegenwärtig bevorzugtes Beispiel einer derartigen Mutation wird von einer mutierten Lipase aus Pseudomonas glumae mit einer His-154-Pro-Mutation verkörpert, die vermutlich eine gegen Proteaseverdau empfindliche Stelle in einer der Schleifen der Tertiärstruktur der Lipase durch eine weniger empfindliche Stelle ersetzt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird gefunden, daß modifizierte (mutierte) Lipasen aus Pseudomonas oder eine andere der bevorzugten Klasse von Lipasen mit (einer) Aminosäuresequenzmodifikation(en), die zur Erhöhung der nettopositiven Ladung der Lipase und deren pI ausgewählt (ist) sind, in Detergenzien- und Reinigungsmittelzusammensetzungen, insbesondere z.B. in Verbindung mit Proteasen, z.B. Proteasen des Subtilisin-Typs, von Wert sind.
Geeignete Mutationen sind u.a. z.B. die Deletion negativ geladener Reste (z.B. Aspartat oder Glutamat) oder deren Substitution durch neutrale Reste (z.B. Serin, Glycin und Prolin) oder durch Substitution neutraler oder negativer Reste durch positiv geladene Aminosäurereste (z.B. Arginin oder Lysin) oder die Insertion positiv geladener Reste.
Geeignete Beispiele derartiger Mutationen, die die nettopositive Ladung und den pl erhöhen, sind u.a. D157R, D55A und I110K. Geeignete Beispiele für die Einführung (z.B. durch Insertion oder Substitution) einer Kombination von Aminosäureresten, die einer Glycosylierung im ausgewählten Wirt zugänglich sind und hierdurch deren Stabilität gegen proteolytischen Angriff verbessern, sind durch die Mutation D157T und Insertion von G zwischen N155 und T156 gegeben.
Um Über-Glycosylierung zu vermeiden oder Glycosylierung an weniger gewünschten Positionen zu entfernen, können die potentiellen Glycosylierungsstellen der ursprünglichen Lipase entfernt werden.
Innerhalb der bevorzugten Klasse von Lipasen ist die von Pseudomonas gluinae (früher und üblichererweise Pseudomonas gladioli genannt) produzierte Lipase eine bevorzugte Grundlage für die Verfahren und Erzeugnisse der vorliegenden Erfindung. Weder die Aminosäuresequenz noch die Nukleotidsequenz des Gens, welches die bevorzugte Lipase codiert, waren bislang bekannt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben das Gen, welches die bevorzugte Lipase dieses Bakteriums codiert, isoliert, was nachstehend näher erläutert wird.
Die Erfindung stellt auch durch Einführung dieses Gens in Klonierungsvektoren genetisch gewonnenes Material und deren Verwendung zur Transformierung neuer Wirtszellen und zur Expression des Lipasegens in diesen neuen Wirtszellen bereit.
Verwendbare heterologe neue Wirtszellen sind u.a. z.B. Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, P. putida. Auch P. gluinae, in dem das ursprüngliche Lipasegen deletiert worden ist, ist ein geeigneter Wirt. Die bevorzugten Wirtssysteme für eine Herstellung im großen Maßstab sind Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae und verwandte Arten, Kluyveromyces marxianus und verwandte Arten, Hansenula polymorpha, Pichia und verwandte Arten und Mitglieder der Gattungen Aspergillus, Rhizopus und Trichoderma. Geeignete Wirte für eine Herstellung in großem Maßstab sind auch Gram(-)-Bakterien, insbesondere bezüglich der effizienten Sekretion von (mutierten) Lipasen ausgewählte und/oder modifizierte. Da diese Wirtszellen einen breiten Bereich verschiedener Mikroorganismen widerspiegeln, können andere, in den Beispielen nicht im Detail beschriebene Mikroorganismen gleichfalls als Wirtszellen verwendet werden.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft Vektoren, die in der Lage sind, die Expression einer ein Gen codierenden Nukleotidsequenz, die ein vorstehend beschriebenes Enzym codiert, in einem der bevorzugten Wirte zu steuern und die vorzugsweise umfassen:
(a) eine das reife Enzym oder ein Prä-Enzym codierende ds- DNA unmittelbar stromabwärts zu einem (für den gewählten Wirt bevorzugten) Sekretionssignal; in Fällen, in denen der Teil des Gens, der translatiert werden sollte, nicht mit dem Codon ATG beginnt sollte davor ein ATG gesetzt werden. Der translatierte Teil des Gens sollte immer mit einem geeigneten Stop-Codon enden;
(b) ein (für den ausgewählten Wirtsorganismus geeignetes) Expressions-Regulon, das bezüglich des Plus-Strangs der ds-DNA von (a) stromaufwärts angeordnet ist;
(c) eine (für den ausgewählten Wirtsorganismus geeignete) Terminator-Sequenz, die bezüglich des Plus-Strangs der ds-DNA von (b) stromabwärts angeordnet ist;
(d) Nukleotidsequenzen, die die Integration, vorzugsweise Mehrfachkopien-Integration, der ds-DNA von (a-c) in das Genom des ausgewählten Wirtes erleichtern, welcher Wirt für einen essentiellen Nährstoff defizient ist. Die Nukleotidsequenz, die die Mehrfachkopien-Integration erleichtert, ist doppelsträngige ribosomale DNA oder zumindest ein Teil dieser Sequenz. Darüber hinaus muß eine das defiziente Gen enthaltende ds-DNA-Sequenz auf dem Integrationsvektor vorliegen, die das in der Wirtszelle fehlende Enzym codiert, und
(e) wahlweise eine Proteine codierende ds-DNA-Sequenz, die bei der temporären Inaktivierung oder Entfaltung und/oder Reifung und/oder Sekretion einer der Vorläuferformen des Enzyms im ausgewählten Wirt beteiligt sind.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1: Isolierung und Charakterisierung des die (Prä-)Lipase codierenden Gens aus P. glumae.
Beispiel 2: Konstruktion der Lipase-negativen P. glumae Stämme PG2 und PG3.
Beispiel 3: Konstruktion eines synthetischen, P. glumae(Prä-)Lipase codierenden Gens.
Beispiel 4: Einführung des synthetischen Lipasegens (Wildtyp) in den Lipase-negativen P. glumae PG3.
Beispiel 5: Herstellung mutierter Lipasegene und ihre Einführung in PG3.
Beispiel 6: Expression der synthetischen Lipasegene in Saccharomyces cerevisiae unter Verwendung autonom replizierender Plasmide.
Beispiel 7: Expression synthetischer Lipasegene in Saccharomyces cerevisiae unter Verwendung von Mehrfachkopien-Integration.
Beispiel 8: Herstellung von Guar-α-galactosidase in Saccharomyces cerevisiae unter Verwendung von Mehrfachkopien- Integration.
Beispiel 9: Mehrfachkopien-Integration in Saccharomyces cerevisiae unter Verwendung anderer defizienter Selektionsmarker.
Beispiel 10: Stabilität des Mehrfachkopien-Integranten in kontinuierlichen Kulturen.
Beispiel 11: Die Stabilität des Mehrfachkopien-Integranten SU50B beeinflussende Parameter.
Beispiel 12: Expression der synthetischen Lipasegene in Hansenula polymorpha.
Beispiel 13: Herstellung von Guar-x-galactosidase in Hansenula polymorpha unter Verwendung von Mehrfachkopien-Integration.
Beispiel 14: Mehrfachkopien-Integration in Kluyveromyces.
Die Beispiele 1 bis 6 und 12 betreffen die Isolierung, Klonierung und Expression von Lipasegenen in den Hefen Saccharomyces cerevisiae und Hansenula polymorpha unter Verwendung von Plasmidvektoren.
Das Beispiel 7 betrifft die Expression eines Lipasegens in der Hefe Saccharomyces cerevisiae nach Mehrfachkopien-Integration eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors.
Die Beispiele 9 bis 11 betreffen andere Aspekte der Mehrfachkopien-Integration.
Die Beispiele 8 und 13 betreffen die Expression von Guar-α- galactosidase in den Hefen Saccharomyces cerevisiae und Hansenula polymorpha.
Das Beispiel 14 zeigt, daß die Mehrfachkopien-Integration in einer Kluyveromyces-Hefe erreicht werden kann.

BEISPIEL 1: ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES (PRÄ-)LIPASE CODIERENDEN GENS AUS P. GLUMAE

Isolierung von chromosomaler DNA von P. glumae

Zellen einer 15 ml-Übernachtkultur in LB-Medium wurden durch Zentrifugation (Sorvall HB4-Rotor, 10000 U/min; 10 min) gesammelt. Das Zellpellet wurde bei -20ºC über Nacht aufbewahrt.
Nach dem Auftauen wurden die Zellen in 10 ml SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Na-Citrat) resuspendiert, das 2 mg/ml Lysozym enthielt. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37ºC wurden 0,5 ml 10% SDS zugesetzt, worauf eine 10-minütige Inkubation bei 70ºC folgte. Nach dem Abkühlen auf 45ºC wurde 1 ml Proteinase K (2 mg/ml Tris-HCl pH 7,0, 30 Minuten bei 45ºC vorinkubiert) zugegeben, und das Gemisch wurde weitere 30 Minuten bei 45ºC inkubiert. Als nächstes wurden 3,2 ml 5 M NaClO&sub4; zugesetzt, worauf zwei Extraktionen mit 15 ml CHCl&sub3;/iso-C&sub5;H&sub1;&sub1;OH (24:1) folgten, wobei auf jede ein Zentrifugationsschritt (Sorvall H54, 5000 U/min/10 min) folgte. Die DNA wurde aus dem Überstand durch Zusatz von 10 ml Ethanol präzipitiert. Nach Waschen in 75%igem Ethanol wurde das DNA-Pellet in 2 ml H&sub2;O resuspendiert.

Herstellung einer Genbank

Eine DNA-Präparation von P. glumae wurde teilweise mit dem Restriktionsenzym Sau3A verdaut, wie von Maniatis (7) beschrieben. Der Cosmidvektor c2RB (8) wurde mit SmaI und BamHI vollständig verdaut; beide Enzyme besitzen auf dem Cosmid eine Erkennungsstelle. Überschüssige Vektorfragmente wurde unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM Dithiotreitol (DTT), 10 mM MgCl&sub2; und 0,5 mM rATP) mit DNA-Fragmenten aus P. glumae ligiert. Die derart erhaltene rekombinante DNA wurde wie von Hohn (9) beschrieben in Phagenpartikel verpackt. Die auf diese Weise erhaltenen vollständigen Phagenpartikel wurden zur Transformierung von E. coli 1046 (met, gal, lac, hsdR, phx, supE, hsdM, recA) durch Transfektion verwendet.
5 ml 0,4% Maltose enthaltendes frisches LB-Medium, wurden mit 0,5 ml einer Übernachtkultur von E. coli 1046 angeimpft und 6 Stunden bei 37 ºC unter kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Vor der Infektion mit den Phagenpartikeln wurden MgCl&sub2; und CaCl&sub2; auf eine Endkonzentration von 10 mM zugegeben. In einem typischen Versuch wurden 50 µl Phagenpartikel mit 50 µl Zellen vermischt, und das Gemisch wurde 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert; 100 µl LB-Medium wurden zugegeben, und die Inkubation wurde 30 Minuten lang bei 37ºC fortgesetzt. Die Zellen wurden direkt auf LB-Agarplatten, die 75 µg/ml Ampicillin (Brocacef) enthielten, plattiert. Nach Wachstum über Nacht bei 37ºC wurden etwa 300 Kolonien erhalten.

Oligonukleotidsynthese

Als Sonden für das Lipase-codierende DNA-Fragment verwendeten wir Oligonukleotide auf der Basis der Sequenzen der 24 N- terminalen Aminosäuren (s. nachstehend), die durch Edman- Abbau unter Verwendung eines Applied Biosystems-Gasphasen Proteinsequenzanalysators bestimmt wurden.
Auf der Grundlage der ermittelten Aminosäuresequenz wurden alle möglichen Nukleotidsequenzen, die die Aminosäuresequenz codieren, abgeleitet. Desoxyoligonukleodtide, die alle oder einen Teil der möglichen Nukleotidsequenzen enthielten (sog. Mischsonden), wurden auf einem DNA-Synthesizer (Applied Biosystems 380 A) unter Einsatz der Phosphoamidit-Technik (10) synthetisiert. Die Oligonukleotide wurden auf 16%igen oder 20%igen Polyacrylamidgelen gereinigt (7).

Radioaktiv markierte Oligonukleotidsonden

Üblicherweise wurden 0,1 bis 0,3 µg des gereinigten Oligonukleotids durch 30-minütige Inkubation bei 37ºC in 50 mM Tris- HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 µM EDTA, 10 mM DTT, 70 uci gamma-³²P-ATP (3000 Ci/mM Amersham) und 10 Einheiten T4 Polynukleotidkinase (Amersham) in einem Endvolumen von 15 µl markiert. Die Reaktion wurde mit 10 µl 0,5 M EDTA pH 8,0 beendet und durch eine Sephadex G25-Säule von 2,5 ml (Einwegspritze) geleitet, die mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0 und 1 mM EDTA) äquilibriert war. Fraktionen von 250 µl wurden gesammelt, von denen die ersten beiden radioaktiven Fraktionen, üblicherweise die Fraktionen 4 und 5, vereinigt und für die Hybridisierung verwendet wurden.

Screening der Genbank

Aus verschiedenen wie vorstehend beschrieben durchgeführten Verpackungs- und Transfektionsversuchen wurde eine Gesamtmenge von ca. 1000 einzelner Kolonien erhalten. Diese Kolonien wurde auf ELISA-Platten (Greiner, F-Form) transferiert, die 150 µl LB-Medium (100 µg Ampicillin/ml)/Vertiefung enthielten. Nach Wachstum über Nacht bei 37ºC wurden unter Verwendung eines selbst hergestellten, aus 60 so angeordneten Nadeln, daß sie in die Mikrotiter-Vertiefungen passen, bestehenden Stempels Duplikate hergestellt. Zu den Vertiefungen der Masterplatten wurden 50 µl 50% Glycerol zugegeben, und nach vorsichtigem Mischen mit Hilfe des Stempels wurden diese Platten bei -*0ºC aufbewahrt.
Die Duplikate wurden für den Transfer der Genbank auf Nitrocellulosefilter (Millipore, Typ HATF, 0,45 µm, 14 cm) verwendet. Hierzu wurden die Cellulosefilter vorher angefeuchtet, indem man sie auf LB-Agarplatten mit 100 µg/ml Ampicillin legte. Nach dem Transfer der Bakterien mittels des Stempels wurden bei 37ºC über Nacht Kolonien gezüchtet.
Die Kolonien auf dem Filter wurden lysiert, indem man sie 15 Minuten lang auf einen Stapel Whattman 3 MM-Papier legte, der mit 0,5 M NaOH und 1,5 M NaCl gesättigt war. Nach Entfernung überschüssiger Flüssigkeit durch Auflegen der Filter auf trockenes Papier wurden sie neutralisiert, indem man sie 2 bis 3 Minuten lang auf einen Stapel von 3 MM-Papier legte, der mit 1 M Tris-HCl pH 7,0, 1,5 mM NaCl gesättigt war. Abschließend wurden die Filter 30 Sekunden lang in 10 x SSC (1,5 M NaCl, 0,15 M Na-Citrat) getaucht, luftgetrocknet und bei 80ºC zwei Stunden lang unter Vakuum gebacken. Vor der (Vor)Hybridisierung wurden die Filter ausgiebig bei 65ºC 16 bis 24 Stunden lang unter mehrfachem Pufferwechsel in 3 x SSC, 0,1% SDS gewaschen. Das Waschen wurde unterbrochen, sobald die Kolonien nicht mehr sichtbar waren.
Die Vorhybridisierung der Filter wurde. in 5 x SSC, 5 x Denhardts (10 x Denhardts - 0,2% Ficoll, 0,2% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% Rinderserumalbumin), 0,1% SDS, 50 mM Natriumphosphat pH 7,5, 1% Glycin, 100 µg/ml Kalbsthymus-DNA (geschert und wärmedenaturiert), 500 µg/ml tRNA und 50% entionisiertem Formamid 2 Stunden lang bei 37ºC durchgeführt.
Die Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten Mischsonde (5. vorstehend, vis02, 32 Nukleotide) wurde 16 Stunden lang bei 39ºC in 5 x SSC, 1 x Denhardts, 0,1% SDS, 20 mm Natriumphosphat pH 7,5, 100 µg/ml Kalbsthymus-DNA, 500 µg/ml TRNA und 50% entionisiertem Formamid durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Filter gewaschen: 3 x 15 Minuten mit 6 x SSC bei Raumtemperatur, 1 x 15 Minuten 2 x SSC, 0,1% SDS und anschließend bei Raumtemperatur, in Abhängigkeit von den Eigenschaften der Oligonukleotidsonde. Bei vis02 wurde das Waschen 15 Minuten bei 37ºC in vorgewärmten 0,1 SSC, 0,1% SDS ausgedehnt.
Beim wie vorstehend beschriebenen Screening der Genbank wurden verschiedene Cosmid-Klone isoliert. Der Klon 5G3 (im folgenden pUR6000 genannt) wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt.

Sequenzierung des Lipasegens

Die aus dem Verdau von pUR6000 mit BamHI hervorgehenden DNA- Fragmente wurden in das Plasmid pEMBL9 (11), das ebenfalls mit BamHI gespalten worden war, ligiert, und die erhaltene rekombinante DNA wurde zur Transformierung von E. coli JM101 (12) nach dem CaCl&sub2;-Verfahren verwendet und auf LB- Agarplatten, ergänzt mit X-gal und IPTG (7), plattiert.
68 weiße Kolonien wurden auf Mikrotiterplatten transferiert und demselben Screening-Verfahren, wie für die Cosmid-Bank beschrieben, unterworfen. Verschiedene positive Klone konnten isoliert werden. Ein aus diesen Kolonien isoliertes repräsentatives Plasmid ist in Figur 1 abgebildet und wird als pUR6002 bezeichnet. Nach Verdau dieses Plasmids mit EcoRI wurden auf dem Gel zwei Fragmente mit einer Länge von 4,1 kb bzw. 2,1 kb gefunden. Ein anderes Plasmid, pUR6001, enthielt das BamHI-Fragment in der entgegengesetzten Orientierung. Nach Verdau mit EcoRI lieferte dieses Plasmid Fragmente mit einer Länge von 6,1 kb bzw. 70 bp.
Im wesentlichen auf die gleiche Weise wurde pUR6006 konstruiert. In diesem Fall wurde pUR6000 mit EcoRI verdaut, worauf die Fragmente in die EcoRI-Stelle des Plasmids pLAFRI (13) ligiert wurden. Nach dem Screening der Transformanten wurde ein positiver Klon ausgewählt, der ein EcoRI-Fragment von -6 kb enthielt und als pUR6006 bezeichnet wurde (Figur 1). Die gereinigte DNA von pUR6001 und pUR6002 wurde für die Bestimmung der Nukleotidsequenz nach dem Sanger-Didesoxykettenterminationsverfahren (14) mit den von Biggin et al. (15) beschrieben Modifikationen unter Verwendung von Alpha-³&sup5;S-dATP (2000 Ci/mM) und Klenow-Enzym (Amersham), ddNTPs (Pharmacia- PL Biochemicals) und dNTPs (Boehringer) verwendet. Wir verwendeten auch den Sequenase-Kit (United States Biochemical Corporation) unter Ersatz des dGTP gegen 7-Deaza-dGTP. Die Produkte der Sequenzierungsreaktion wurden auf denaturierendem Polyacrylamidgel mit einem Puffergradienten getrennt, wie von Biggin et al. (15) beschrieben.
Die vollständige Nukleotidsequenz (1074 bp) der P. glumae- Lipase (im folgenden auch : glumae-Lipase) Gens ist in Figur 2 angegeben.
Die Nukleotidsequenz enthält ein offenes Leseraster, das 358 Aminosäuren codiert, worauf ein Stoppcodon folgt.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist unterhalb der Nukleotidsequenz in Figur 2 in der IUPAC-Einbuchstabennotation gezeigt.
Die NH&sub2;-terminale Aminosäuresequenz des Lipaseenzyms, wie aus der P. glumae-Kulturbrühe gereinigt, ist als AlaAspThrTyrAla- AlatThrArgTyrProValIleLeuvValHisGlylLeuAlaGlytThrAspLys (= ADTY- AATRYPVILVHGLAGTDK) identifiziert worden. Diese Aminosäuresequenz wird durch die Nukleotide 118-183 (Figur 2) codiert. Aus diesen Befunden kann zunächst geschlossen werden, daß das reife Lipaseenzym aus 319 Aminosäureresten besteht und ein berechnetes Molekulargewicht von 33092 Dalton aufweist. Zweitens wird das Enzym als Vorläufer mit einer N-terminalen Verlängerung von 39 Aminosäurresten (in Figur 2 als -39 bis -1 gezählt) synthetisiert.
Aus der wissenschaftlichen Literatur ist bekannt, daß die meisten exkretierten Proteine intrazellulär als Vorläuferenzyme produziert werden (16). Meistens weisen diese Enzyme eine N-terminale Verlängerung, das sog. Leitpeptid oder die Signalsequenz, auf. Dieses Peptid ist an der anfänglichen Interaktion mit der Bakterienmembran beteiligt.
Allgemeine Merkmale der Signalsequenz, wie sie in gramnegativen Bakterien gefunden werden, sind:
1. eine (im Durchschnitt) 2 positiv geladene Aminosäurereste enthaltende aminoterminale Region;
2. eine hydrophobe Sequenz von 12 bis 15 Resten;
3. eine mit Serin, Alanin oder Glycin endende Spaltstellenregion;
4. die Gesamtlänge beträgt etwa 23 Aminosäuren.
Überraschenderweise umfaßt die Lipasesignalsequenz 39 Aminosäuren, was ziemlich lang ist. Darüber hinaus enthält sie vier positiv geladene Aminosäurereste am N-Terminus. Für gram-negative Bakterien scheint dies ein außergewöhnlicher Typ einer Signalsequenz zu sein.

Isolierung von verwandte Lipasen codierenden Genen aus anderen Organismen

Wie bereits erwähnt, gehört die P. glumae-Lipase zu einer Gruppe immunologisch verwandter Lipasen. Daher kann man erwarten, daß diese Enzyme Abschnitte hochkonservierter Aminosäuresequenzen enhalten, obgleich sie von verschiedenen Organismen produziert werden. Infolgedessen muß ein gewisser Grad an Homologie in der DNA-Sequenz existieren. Mit dem P. glumae-Lipasegen zu unserer Verfügung ist es einfach, verwandte Lipasegene aus anderen Organismen zu isolieren. Dies kann im wesentlichen auf die gleiche Weise wie vorstehend beschrieben geschehen. Von dem interessierenden Organismus wird eine Genbank (z.B. in einem Cosmid oder Lambdaphagen) hergestellt. Diese Genqmbank kann unter Verwendung (von Teilen) des.-2,2 kb BamHI-Fragments (vorstehend beschrieben) als Sonde gescreent werden. Ein positives Signal ergebende Kolonien können isoliert und detaillierter charakterisiert werden.

BEISPIEL 2: KONSTRUKTION DER LIPASE-NEGATIVEN P. GLUMAESTAMME PG2 UND PG3

Die Konstruktion von PG2, aus dem das Lipasegen deletiert worden ist, und PG3, in dem das Lipasegen durch ein Tetracyclinresistenzgen (Tc-res) ersetzt worden ist, umfaßt drei Hauptschritte.

A - Konstruktion von pUR6106 und pUR6107 (in E. coli), ausgehend von pUR6001 (s. Beispiel 1):

pUR6001 enthält ein BamHI-Fragment aus dem P. glumae Chromosom von -2,2 kb. Das auf diesem Fragment angeordnete Lipasegen (1074 bp) weist eine 5'- und eine 3'-flankierende Sequenz von -480 bzw. -660 bp auf. Die aufeinanderfolgenden Konstruktionsschritte waren:
a. teilweiser Verdau von pUR6001 (isoliert aus E. coli KA816 dam-3, dcm-6, thr, leu, thi, LacY, galK2, galT22, ara-14, tonA31, tsx-78, supE44) (auch GM418 (17) genannt) mit ClaI, um linearisierte Plasmide zu erhalten,
b. Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation (7) der DNA, anschließend Verdau mit PstI,
c. Isolierung eines 4,5 kb Plasmid-DNA-Fragments (mit ClaI- und PstI-klebrigen Enden) und eines PstI- Fragments von -670 bp aus einem Agarosegel nach Gelelektrophorese und anschließender Elektroelution in Dialysesäcken (7),
d. das erhaltene Plasmid-DNA-Fragment mit einem klebrigen ClaI- und PstI-Ende wurde mit einem synthetischen Linker-Fragment (nachstehend gezeigt) mit einem klebrigen CalI- und PstI-Ende ligiert.
ClaI OGATGAGATCTTGATCACTGCA PstI TACTCTAGAACTAGTG
Dieses synthetische Fragment enthält eine Erkennungsstelle für die Restriktionsenzyme BclI und BglII. Nach Transformierung des Ligationsgemisches in E. coli SA101 (d.h. JM101 mit recA, hdsR), Selektion auf LB-Ap (100 µg Ampicillin/ml)-Agarplatten und Screening der Plasmide aus den erhaltenen Transformanten durch Restriktionsenzymanalyse wurde für den nächsten Konstruktionsschritt ein korrektes Plasmid ausgewählt. Nach Verdau dieses korrekten Plasmids mit BamHI und HindIII wurde ein Vektorfragment von -4 kb und ein Insert-Fragment von -500 kb gefunden.
e. Das wie in d. beschrieben erhaltene Plasmid-Konstrukt wurde mit PstI verdaut und zusammen mit dem -670 bp PstI-Fragment, isoliert wie in c. beschrieben, ligiert.
f. Transformierung des Ligationsgemisches in E coli SA101, Selektion auf LB-Ap (100 µg Ampicillin/ml)- Agarplatten und Screening der Plasmide aus den erhaltenen Transformanten. Da das PstI-Fragment zwei verschiedene Orientierungen aufweisen kann, mußte dieses mittels Restriktionsenzymanalyse analysiert werden. In dem uns interessierenden Konstrukt sollte die Orientierung derart sein, daß der Verdau mit BamHI zu einem Vektorfragment von -4 kb und einem Insert-Fragnent von -1,2 kb führt. Ein Vertreter der korrekten Plasmide ist in Figur 3 abgebildet und wurde pUR6102 genannt.
g. pUR6102 wurde vollständig mit BglII verdaut.
h. pBR322 (18) wurde vollständig mit AvaI und EcoRI verdaut, worauf die DNA-Fragmente durch Agarosegelelektrophorese getrennt wurden. Ein Fragment von -1435 Basenpaaren, das das Tetracylinresistenzgen enthielt, wurde durch Elektroelution aus dem Gel isoliert.
i. Nach dem Auffüllen der klebrigen Enden (in einem Puffer, der 7 mm Tris-HCl pH 7,5, 0,1 mm EDTA, 5 mM β- Mercaptoethanol, 7 mm MgCl&sub2;, 0,05 mm dNTPs und 0,1 φ/l Klenow-Polymerase enthielt) des das Tc-res-Gen enthaltenden DNA-Fragments und des linearisierten pUR6102 wurden diese ligiert.
j. Transformierung von E. coli SA101 mit dem Ligationsgemisch, Selektion auf LB-Tc (25 µg Tetracyclin/ml)- Agarplatten und Screening der Plasmide aus den erhaltenen Transformanten durch Restriktionsenzymanalyse. Der Konstruktionsweg von pUR6102 und pUR6103 ist in Figur 3 abgebildet.
k. pUR6102 wurde mit BamHI verdaut, und pUR6103 wurde teilweise mit BamHI verdaut; die erhaltenen Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese getrennt, und die gewünschten Fragmente (-1145 bp bzw. -2550 bp) wurden aus dem Gel durch Elektroelution isoliert.
l. PRZ102 (19) wurde vollständig mit BamHI verdaut und an die in Schritt k. erhaltenen BamHI-Fragmente ligiert.
m. Transformierung der Ligationsgemische in E. coli S17-1 (20), Selektion auf LB-km, Tc (jeweils 25 µ/ml) und Screening der Plasmide aus den erhaltenen Transformanten durch Restriktionsenzymanalyse. Die erhaltenen Plasmide wurden pUR6106 bzw. pUR6107 genannt (Figur 4).

B - Deletion des Lipasegens vom P. glumae-Chromosom

a. Einführung von pUR6106 in P. glumae mittels biparentaler Konjugation mit E. coli S17-1(pUR6106) (dies ist die Schreibweise für das Plasmid pUR6106 enthaltende E. coli S17-1).
Eine P. glumae-Kolonie wurde von einer MME-Platte (0,2 g/l MGSO&sub4;-7H&sub2;O, 2 g/l Citrat-H&sub2;O, 10 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 3,5 g/l NaNH&sub4;HPO&sub4; 4H&sub2;O, 0,5% Glucose und 1,5% Agar) in 20 ml Luriabrühe-Kulturmedium (LB) transferiert und über Nacht bei 30ºC herangezogen. E. coli S17-1(pUR6106) wurden über Nacht in 3 ml LB-Medium, 25 µg/ml Km, bei 37ºC herangezogen.
Am nächsten Tag wurde die P. glumae-Kultur 1:1 verdünnt und 4 bis 5 Stunden bei 30ºC herangezogen, bis die 0D660 2,0 bis 2,5 betrug. E. coli S17-1(pUR6106) wurde 1:50 verdünnt und 4 bis 5 Stunden bei 37ºC herangezogen, bis die 0D660 1,5 bis 2,0 betrug.
Für die Konjugation wurden 50 OD-Einheiten (1 Einheit = 1 ml mit OD = 1) (20-25 ml) P. glumae-Zellen und 2,5 OD- Einheiten (1,2-1,6 ml) E. coli S17-1(pUR6106) gemischt und 10 Minuten bei 5000 U/min (H54-Rotor) zentrifugiert. Das Zellpellet wurde auf 3 LB-Platten verteilt und über Nacht bei 30ºC inkubiert. Anschließend wurde das Zellmaterial von der Platte entfernt, in 3 ml 0,9% NaCl-Lösung resuspendiert und durch Zentrifugierung (10 min, RT, H84-Rotor, 4 kU/min) pelletiert. Das Zellpellet wurde in 1,0 ml 0,9% NaCl-Lösung resuspendiert und auf drei Platten MME, 0,5% Glucose, 1,5% Agar, 50 µg/ml Kanamycin (Km) verteilt und bei 30ºC herangezogen. Da pUR6106 in P. glumae nicht repliziert, können Km-resistente Transkonjuganten nur durch Integration erhalten werden. In diesen Stämmen ist das Plasmid pUR6106 durch ein Einzelrekombinationsereignis an der 5'- oder 3'-flankierenden Region in das bakterielle Chromosom integriert worden. Aufgrund der Tatsache, daß diese Stämme noch ein funktionsfähige Lipasegen enthalten, ist ihr Phänotyp Lipase-positiv.
b. Zwei derartige Stämme (PG-RZ21 und PG-RZ25) wurden für weitere Versuche ausgewählt. Um das Plasmid und das funktionsfähige Lipasegen aus der chromosomalen DNA zu deletieren, sollte ein zweites Rekombinationsereignis stattfinden. Dies kann erreicht werden, indem man die Stämme mehrere Tage lang auf LB-Medium ohne Km (ohne Selektionsdruck) heranzieht, die Zellen auf BYPO- Platten (10 g/l Trypticasepepton, 3 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Fleischextrakt, 5 g/l NaCl, 7 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 50 ml/l Olivenölemulsion und 1,5% Agar) in einer Dichte ausplattiert, die getrennte Kolonien sicherstellt, und nach Lipase-negativen Kolonien absucht. Beim Ausplattieren dieser Lipase-negativen Kolonien auf selektiven Platten (MME-KM 50 µg/ml) sollten diese nicht wachsen. Ein auf diese Weise erhaltener Stamm konnte PG-2 genannt werden.

C - Ersatz des Lipasegens des P. glumae-Chromosoms durch das Tc-res-Gen

a. Die Einführung von pUR6107 in P. glumae über Konjugation mit E. coli S17-1(pUR6107), wie in B, Selektion von Transkonjuganten beschrieben, wurde bei 30ºC auf 50 µg/ml Tc enthaltendem MME-Medium durchgeführt.
b. Auf diese Weise erhaltene Transkonjuganten wurden auf 50 µg/ml Tc enthaltende BYPO-Platten und 100 µg/ml Km enthaltende MME-Platten dupliziert. Verschiedene Transkonjuganten zeigten eine Km-Sensitivität (kein Wachstum auf MME Km-100-Platten) und Lipase-negativen Phänotyp (keine Klärungszone auf BYPO-Platten). Aufgrund eines doppelten Cross-overs (an der 5'- und an der 3'- flankierenden Region) wurde das Lipasegen durch das Tc- Resistenzgen ersetzt. Ein repräsentativer Stamm wurde für die weitere Untersuchung ausgewählt und PG-3 genannt.

BEISPIEL 3: KONSTRUKTION EINES SYNTHETISCHEN, P. GLUMAE(PRA-)LIPASE CODIERENDEN GENS

Auf der Basis der Nukleotidsequenz des P. glumae-(Prä-)Lipasegens wurde ein neues Gen konstruiert, das verschiedene stumme Mutationen enthielt. Durch diese Mutationen wurde die Aminosäuresequenz des Enzyms nicht verändert. Es war jedoch möglich, den GC-Gehalt zu erniedrigen, was das Enzym-Design erleichtert und es uns ermöglichte, das synthetische Gen in einer Vielzahl von heterologen Wirtssystemen zu verwenden. Ein anderer Punkt zur Erleichterung des Enzym-Designs war die Möglichkeit, Restriktionsenzymerkennungsstellen an zweckmäßigen Positionen im Gen einzuführen.
Die Sequenz des neuen Gens ist in Figur 5(A) angegeben.
Das neue Gen wurde in Restriktionsfragmente von etwa 200 Nukleotiden, sog. Kassetten, unterteilt. Ein Beispiel einer derartigen Kassette ist in Figur 6 dargestellt.
Jede Kassette wurde am 5'- und 3;-Ende verlängert, um eine EcoRI- bzw. HindIII-Stelle zu erzeugen.
Die codierenden Stränge dieser Kassetten wurden in Oligonukleotide (Oligos) mit einer durchschnittlichen Länge von 33 Basen unterteilt. Das gleiche wurde für die nicht codierenden Stränge in solcher Weise getan, daß die Oligos zu etwa 50% mit denjenigen der codierenden Stränge überlappten.
Die Oligos wurden wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert.
Vor dem Zusammenfügen der Fragmente mußten die 5'-Enden der synthetischen Oligos phosphoryliert werden, um die Ligation zu erleichtern. Die Phosphorylierung wurde wie folgt durchgeführt:
Äquimolare Mengen (50 pmol) der Oligos wurden vereint und in 40 µl Reaktionspuffer mit 8 Einheiten Polynukleotidkinase 30 bis 45 Minuten lang bei 37ºC kinasiert. Die Reaktion wurde durch 5-minütiges Erwärmen auf 70ºC und Ethanol-Präzipitation abgebrochen.
Die Reassoziation wurde durchgeführt, indem man das Pellet in 30 µl eines Puffers auflöste, der enthielt: 7 mM/l Tris-HCl pH 7,5, 10 mM/l 2-Mercaptoethanol; es wurden 5 mM/l ATP zugesetzt.
Anschließend wurde das Gemisch 5 Minuten lang in ein Wasserbad mit 65ºC gestellt, worauf man über eine Dauer von einer Stunde auf 30ºC abkühlte. Man setzte MgCl&sub2; auf eine Endkonzentration von 10 mM/l zu. T4-DNA-Ligase (2,5 Einheiten) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei 37ºC oder über Nacht bei 16ºC abgestellt. Danach wurde das Reaktionsgemisch 10 Minuten lang auf 70ºC erwärmt. Nach Ethanol- Präzipitation wurde das Pellet in Verdaupuffer aufgelöst und mit EcoRI und HindIII geschnitten.
Das Gemisch wurde auf einem 2%igen Agarosegel getrennt, und das Fragment mit einer der korrekt zusammengefügten Kassette entsprechenden Länge wurde durch Elektroelution isoliert.
Die Fragmente wurden wie in Beispiel 1 beschrieben in pEMBL9 (verdaut mit EcoRI/HindIII) ligiert, und sie wurden durch Sequenzanalyse auf ihre Richtigkeit überprüft. In nachfolgenden Klonierungsschritten wurden die verschiedenen Kassetten in der richtigen Reihenfolge zusammengesetzt, was zu pUR6030 führte. Hierbei handelt es sich um ein pEMB19-Derivat, das das vollständige synthetische Lipasegen enthält.
Um zur Durchführung der in Beispiel 4 beschriebenen Konstruktionen in der Lage zu sein, wurde eine zweite Version des synthetischen Gens hergestellt, indem man das Fragment 5 ersetzte. Auf diese Weise wurde das Konstrukt pUR6600 hergestellt, das die 3'-PstI-Stelle an Position 1069 anstelle der Position 1091 aufweist (s. Figur 5B).

BEISPIEL 4: EINFÜHRUNG DES SYNTHETISCHEN LIPASEGENS VOM WILDTYP IN DEN LIPASE-NEGATIVEN P. GLUMAE PG3

Um zu testen, ob das synthetische Lipasegen in P. glumae funktionsfähig ist, wurde das Gen in den Stamm PG3 eingeführt.
Um die Fermentationsverfahren zu vereinfachen, entschied man sich, dieses Gen stabil in das PG3-Chromosom zu integrieren und es nicht auf einem Plasmid einzuführen.
Aus diesem Grunde mußte das synthetische Lipasegen mit der 5'- und der 3'-Kantensequenz des ursprünglichen P. glumae- Lipasegens versehen werden. Dies wurde auffolgende Weise erreicht (s. Figur 7):
a. Aus pUR6002 (aus E. coli KA816) wurde auf gleiche Weise wie in Beispiel 2 beschrieben ein Vektor mit ClaI und PstI-klebrigen Enden hergestellt.
b. pUR6600 (aus E.coli KA816) wurde mit ClaI vollständig und mit PstI teilweise verdaut. Nach Auftrennung der Fragmente durch Agarosegelelektrophorese wurde ein Fragment von -1050 bp isoliert.
c. Das derart erhaltene Fragment wurde in den von pUR6002 abgeleiteten Vektor ligiert und zur Transformierung von E. coli SA101 verwendet. Auf diese Weise wurde das Konstrukt pUR6603 erhalten.
d. pUR6603 wurde vollständig mit BamHI verdaut. Nach Auftrennung der Fragmente durch Agarosegelelektrophorese wurde ein Fragment von -2,2 kb isoliert. Dieses Fragment enthält das synthetische Lipasegen mit den 5'- und 3'-flankierenden Regionen des Wildtyp-P. gladioli-Lipasegens.
e. pRZ102 wurde ebenfalls vollständig mit BamHI verdaut.
f. Das in d. erhaltene 2,2 kb-Fragment wurde wie in Beispiel 2 beschrieben in pRZ102 ligiert.
g. Das erhaltene Konstrukt, pUR6131, wurde in E. coli S17- 1 transferiert.
Die Integration dieses Konstrukts in das Chromosom von PG3 wurde auf die gleiche Weise erreicht, wie für pUR6106 im Beispiel 2, Abschnitt B-a., beschrieben.
Aus den erhaltenen Km-resistenten Transkonjuganten wurden mehrere auf BYPO-Platten transferiert. Sie schienen alle den Lipase-positiven Phänotyp aufzuweisen, da um die Kolonien Klärungszonen auftraten. Ein typischer Vertreter wurde PGL26 genannt.
Offensichtlich kann die gleiche Route befolgt werden, um das Konstrukt pUR6131 in einen Lipase-negativen P. glumae PG2- Stamm (s. Beispiel 28-b.) zu integrieren.
Aus den Beispielen 2 und 4 könnte man schließen, daß der P. glumae-Stamm PG1 (und Derivate hiervon, z.B. PG2 und PG3, oder über klassische Mutagenese erhaltene Derivate von PG1 mit verbesserter Lipase-Produktion) durch Deletion oder Einfügung (homologer oder heterologer) DNA-Fragmente in das bakterielle Chromosom leicht manipuliert werden kann. Unter Anwendung dieser Techniken ist es möglich, einen Stamm zu konstruieren, der hinsichtlich der Produktion von Lipase optimiert ist. In dieser Hinsicht könnte man daran denken:
- den ursprünglichen Lipase-Promoter durch einen stärkeren (induzierbaren) Promoter zu ersetzen,
- mehr als eine Kopie des Lipasegens (die möglicherweise verschiedene Lipasemutanten codieren) einzufügen,
- den ursprünglichen Promoter zu ersetzen oder mehrere Kopien von Genen einzufügen, die Funktionen codieren, die bei der Produktion und Exkretion des Lipaseenzyms beteiligt sind (z.B. Chaperon-Proteine, "Helferproteine", die beim Export des Lipaseenzyms beteiligt sind),
- das die extrazelluläre Protease codierende Gen zu deletieren (eine TnS-Mutante von PG1 (PGT89), die keine Klärungszone oder Magermilchplatten produziert, ist hinterlegt worden),
- die Rhamnolipidproduktion zu manipulieren.

BEISPIEL 5: HERSTELLUNG VON MUTIERTEN LIPASEGENEN UND IHRE EINFÜHRUNG IN PG3

Zur Verbesserung der Lipase ist es notwenig, über die Möglichkeit zu verfügen, definierte Veränderungen in die Aminosäuresequenz des Proteins einzuführen.
Ein bevorzugtes Verfahren hierzu bedient sich des Ersatzes eines Genfragments des die Wildtyp-Lipase codierenden synthetischen Gens oder des Wildtyp-P. glumae-Lipasegens durch ein entsprechendes chemisch synthetisiertes Fragment, das die gewünschte Mutation enthält.
Im Fall des synthetischen Wildtyp-Lipasegens kann eine Kassette (oder ein Fragment hiervon) durch eine entsprechende Kassette (oder ein Fragment hiervon) ersetzt werden, die die gewünschte Mutation enthält.
Die Kassette, welche das Codon (die Codons) für die interessierende(n) Aminosäure(n) umfaßt, wurde erneut zusammengefügt (wie in Beispiel 3 beschrieben). Diesmal wurden jedoch die Oligos des codierenden und des nicht-codierenden DNA-Strangs, die das interessierende Codon (die interessierenden Codons) umfaßten, durch Oligomere mit der gewünschten Mutation ersetzt. Die neuen Oligos wurden wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert. Die derart erhaltene mutierte Kassette oder ein Fragment hiervon wurde an der entsprechenden Position in das synthetische Wildtyp-Lipasegen von Konstrukten, wie pUR6030 oder pUR6603, eingeführt. Zur Einführung eines synthetischen mutierten Lipasegens in PG2 oder PG3 mußte die in Beispiel 4 beschriebene Route, beginnend mit Schritt d., befolgt werden.
Ein typisches Beispiel der Herstellung eines mutierten Gens ist nachstehend beschrieben. In diesem Fall ist His an der Position 154 des Wildtyp-Lipasegens durch Pro ersetzt worden. Hierzu wurden zwei neue Oligomere synthetisiert. Das die Aminosäure 154 der reifen Lipase codierende Codon ist nach CCT verändert. Diese Oligomere wurden zur Zusammenfügung des Fragments 3(H154P) verwendet, wie in Beispiel 3 beschrieben. Nach dem Klonieren des Fragments in pEMBL9 wurden die DNA- Sequenzen wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Das derart erhaltene Konstrukt wurde pUR6071 genannt.
Das Plasmid pUR6071 wurde vollständig mit EspI und SalI verdaut. Nach Auftrennung der erhaltenen DNA-Fragmente durch Gelelektrophorese (wie in Beispiel 2 beschrieben) wurde ein Fragment von -90 bp aus dem Agarosegel isoliert. pUR6002 wurde teilweise mit FspI und teilweise mit SalI verdaut. Nach Gelelektrophorese wurde ein Vektor von -6000 Nukleotiden aus dem Agarosegel in Beispiel 2 isoliert. Das isolierte -90 bp- Fragment wurde in den pUR6002-Vektor ligiert, wobei pUR6077A erhalten wurde. Das BamHI-Fragment (-2200 bp) von pUR6077A wurde wie in den Beispielen 3 und 4 beschrieben in pRZ102 ligiert. Auf diese Weise wurde pUR6127 erhalten. Die Einführung dieses Konstrukts in das Chromosom von PG3 wurde wie in Beispiel 4 beschrieben erreicht. Ein erhaltener Lipase produzierender P. glumae-Transkonjugant wurde PGL24 genannt.
Die von diesem Stamm produzierte modifizierte Ligase erwies sich in einem tatsächlichen Detergenziensystem als erheblich stabiler als die zugrundeliegende Lipase (Figur 8). Auf im wesentichen die gleiche Weise sind verschiedene andere mutierte Lipasegene hergestellt worden. In einigen Fällen führte dies zu einer veränderten Nettoladung des codierten Proteins (Z.B. D157R (+2), D55A (+1), I110K (+1), R61P (-1), T109D (-1), ROD (-2)). In anderen Fällen sind Aminosäuren eingeführt oder deletiert worden (z.B. PGL40, in dem 1525- 154H durch AlaLeuSerGlyHisPro = ALSGHP ersetzt worden ist). Darüber hinaus sind potentielle Glycosylierungsstellen entfernt (z.B. N48S und/oder N238S) und/oder eingefügt worden (z.B. D157T und Einfügung von G zwischen N155 und T156).

BEISPIEL 6: EXPRESSION DER SYNTHETISCHEN LIPASEGENE IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE UNTER VERWENDUNG AUTONOM REPLIZIERENDER PLASMIDE

Zur Veranschaulichung der Produktion von P. glumae-Lipase durch eukaryontische Mikroorganismen wurden zur Expression von P. glumae-Lipase in der Hefe S. cerevisiae geeignete Vektoren unter Verwendung des GAL7-Promoters (21) konstruiert. Die P. glumae-Lipase wird von der Hefe S. cerevisiae unter Verwendung zweier verschiedener Expressionssysteme produziert. Ein Expressionssystem beruht auf autonom replizierenden Plasmiden mit der Lipaseexpressionskassette und ein Expressionssystem beruht auf Mehrfachkopien-Integration der Lipaseexpressionskassette in das Wirtsgenom.
Das Plasmid pUR2730 (21) wurde als Basis für die Lipaseexpressionsplasmide verwendet. Das Plasmid pUR2730 besteht aus dem GAL7-Promoter, der S. cerevisiae-Invertase-Signalsequenz, dem α-Galactosidasegen (der α-Galactosidaseexpressionskassette), 2 µm-Sequenzen für die Replikation in S. cerevisiae, dem LEU2d-Gen zur Selektion in S. cerevisiae und P8R322-Sequenzen zur Replikation und Selektion in E. coli.
Das Plasmid pUR6030 wurde als Quelle für das Lipasegen verwendet.
Die folgenden S. cerevisiae-Expressionsplasmide wurden konstruiert, welche codieren:
1. reife Lipase, der eine Invertasesignalsequenz vorangeht (pUR6801),
2. reife Lipase, der eine KEX2-Spaltstelle, eine Glycosylierungsstelle und die Invertasesignalsequenz vorangehen (pUR6002).
Zum Erhalt der vorstehend erwähnten Konstrukte wurden die folgenden Routen befolgt (Figur 9; die verwendeten Restriktionserkennungsstellen sind mit einem Sternchen markiert):
zu 1. und 2.
a. Das Plasmid pUR2730 wurde mit SacI und HindIII verdaut, und das Vektorfragment wurde isoliert.
b. Das Plasmid pUR6038 wurde mit EcoRI und HindIII verdaut, und das Fragment mit dem Lipasegen wurde isoliert.
c. Synthetische SacI-EcoRI-DNA-Fragmente wurden wie in Beispiel 3 beschrieben synthetisiert und konstruiert und bestanden aus den folgenden Sequenzen:
Im Falle von pUR6801:
I.
5' CATCACACAAACAAACAAAACAAAATGATGCTTTTGCAAGCCTTCCTTTTCCTT--
3' TCGAGTAGTGTGTTTGTTTGTTTTGTTTTACTACGAAAACGTTCGGAAGGAAAAGGAA
-TTGGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCCGCGGACACATATGCAGCTACGAGAT 3'
-AACCGACCAAAACGTCGGTTTTATAGACGGCGCCTGTGTATACGTCGATGCTCTA 5'
Dieses Fragment ergibt eine korrekte Verbindung des GAL7- Promoters und des Lipasegens mit dazwischenliegender Sequenz, die die Invertasesignalsequenz codiert.
Im Falle von pUR6002:

II.

5' CATCACACAAACAAACAAAACAAAATGATGCTTTTGCAAGCCTTCCTTTTCCT--
3' TCGAGTAGTGTGTTTGTTTGTTTTGTTTTACTACGAAAACGTTCGGAAGGAAAAGGA--
-TTTGGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCCTCCGGTACTAACGAAACTTCTGATAA--
-AAACCGACCAAAACGTCGGTTTTATAGACGGAGGCCATGATTGCTTTGAAGACTATT--
-GAGATGAAGCGAAGCTGCTGACACATATGCAGCTACGAGAT 3'
-CTCTCTTCGACTTCGACGACTGTGTATACGTCGATGCTCTA 5'
Dieses Fragment ergibt eine korrekte Verbindung des GAL7- Promoters und des Lipasegens, wobei sich dazwischen die Sequenzen befinden, die eine KEX2-Spaltstelle, eine Glycosylierungsstelle und die Invertasesignalsequenz codieren.
d. Das SacI-HindIII-Vektorfragment, eines der synthetischen SacI-EcoRI-Fragmente (I) und das EcoRI-HindIII- DNA-Fragment mit dem Lipasegen wurden ligiert. Für die Konstruktion von pUR6801 ist dies in Figur 9 gezeigt (pUR6802 ist auf gleiche Weise unter Verwendung des synthetischen Fragments II konstruiert).
e. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli transformiert. Aus einzelnen Kolonien wurde nach Kultivierung die Plasmid-DNA isoliert und die korrekten Plasmide (laut Restriktionsenzymanalyse) wurden selektiert und in großen Mengen isoliert.
f. Die Plasmide pUR6801 und pUR6802 wurden unter Anwendung des Spheroplast-Verfahrens (22) in den S. cerevisiae- Stamm SU10 (21) transformiert, wobei eine Selektion auf das Vorliegen des LEU2d-Genprodukts angewandt wurde.
g. Die Transformanten wurden über Nacht in definiertem Medium (0,68% Hefestickstoffbase w/o Aminosäuren, 2% Glucose, Histidin und Uracil) herangezogen, 1:10 in Induktionsmedium (1% Hefeextraxt, 2% Bactopepton, 5% Galactose) verdünnt und 40 Stunden lang herangezogen.
h. Die Zellen wurden durch Zentrifugation isoliert, und Zellextrakte wurden hergestellt (23).
1. Die Zellextrakte wurde durch SDS-Gelelektrophorese (7) analysiert und auf Nitrocellulose geblottet.
j. Die Nitrocellulose-Blots wurden mit Lipase-Antikörpern inkubiert und anschließend mit I125-markiertem Protein A inkubiert, worauf eine Fluorografie folgte (Fig. 10).
Wie in Fig. 10 gezeigt, produzieren die das Plasmid pUR6801 enthaltenden SU10-Zellen ein Lipaseenzym mit dem korrekten Molekulargewicht im Vergleich zu Lipase aus P. glumae. Zusätzlich zum korrekten Protein kann auch ein nicht prozessiertes und glycosyliertes Lipaseprotein gesehen werden. Die von S. cerevisiae produzierte P. glumae-Lipase ist enzymatisch aktiv.

BEISPIEL 7: HERSTELLUNG VON P. GLUMAE-LIPASE DURCH S. CEREVISIAE UNTER VERWENDUNG VON MEHRFACHKOPIEN-INTEGRATION

Der Mehrfachkopien-Integrationsvektor wurde aus dem Plasmid pARES6 (24) gewonnen, indem man das 335 bp Hefe-RNA- Polymerase I-Promotorelement durch das 4.5 BglII B-Fragment von S. cerevisiae-rDNA (25) ersetzte. Auch der 2µm- Replikationsursprung wurde entfernt, und das BglII-HindIII- DNA-Fragment, das Chloroplasten-DNA aus S. oligorhiza umfaßt, wurde durch eine Polylinker-DNA-Sequenz ersetzt. Dies führte zum Plasmid pUR2790, von dem eine detaillierte Abbildung in Fig. 11 gezeigt ist.
Die wesentlichen Sequenzen von pUR2790 für die Mehrfachkopien-Integration in das Hefegenom sind: 1. rDNA-Sequenzen für die Mehrfachkopien-Integration in das Hefegenom, 2. das S. cerevisiae LEU2d-Gen (26); es handelt sich um das LEU2-Gen mit einem defizienten Promotor.
Unter anderem wurden die folgenden Mehrfachkopien-Integrationsexpressionplasmide konstruiert, welche codieren:
1. reife Lipase, der die Invertasesignalsequenz vorangeht (pUR6803),
2. reife Lipase, der eine KEX2-Spaltstelle, eine Glycosylierungsstelle und die Invertasesignalsequenz vorangehen (pUR6804).
Um die vorstehend erwähnten Konstrukte zu erhalten, waren die befolgten Routen (Fig. 12; die verwendeten Restriktionserkennungsstellen sind einem Sternchen markiert):
zu 1 und 2:
a. Das Plasmid pUR2790 wurde mit HindIII teilweise verdaut. Das lineare Plasmid wurde isoliert, vollständig mit BglII verdaut, und das HindIII-BglII-Vektorfragment wurde durch Agarosegelelektrophorese und Elektroelution isoliert.
b. Das Plasmid pUR6801 wurde mit BglII teilweise und mit HindIII vollständig verdaut, und das BglII-HindIII-DNA- Fragment mit dem Lipasegen wurde isoliert (pUR6804 wurde auf gleiche Weise unter Verwendung des Plasmids pUR6802 anstelle von pUR6801 konstruiert).
c. Das BglII-HindIII-Vektorfragment von pUR2790 und das BglII-HindIII-Fragment mit dem Lipasegen wurden ligiert (Fig. 12), was zum Plasmid pUR6803 führte.
d. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli transformiert. Aus einzelnen Kolonien wurde nach Kultivierung die Plasmid- DNA isoliert, und die laut Restriktionsenzymanalyse korrekten Plasmide, pUR6803 und pUR6804, wurden selektiert und in großen Mengen isoliert.
e. Die Plasmide pUR6803 und pUR6804 wurden in den S. cerevisiae-Stamm YT6-2-1 L (26) = SU50 nach dem Spheroplast- Verfahren (22) transformiert, wobei auf das Vorliegen des LEU2d-Genprodukts selektiert wurde. Der Wirtsstamm SU50 ist für den essentiellen Nährstoff Leucin (LEU2) defizient, was bedeutet, daß der Stamm SU50 nicht zur Produktion von Leucin fähig ist. Daher kann er nur wachsen, wenn das Wachstumsmedium genügende Mengen an Leucin enthält. Der auf den Vektoren pUR6803 und pUR6804 vorliegende defiziente Promotor des LEU2-Gens ist für die Mehrfachkopien-Integration des Plasmidvektors in das Hefegenom essentiell. Die Mehrfachkopien-Integration findet auf dem rDNA-Locus des Hefegenoms aufgrund homologer Rekombination der rDNA-Sequenzen des Plasmids und der rDNA- Sequenzen des Hefegenoms statt.
f. Die Integranten wurden über Nacht in definiertem Medium (68% Hefestickstoffbase w/o Aminosäuren, 2% Glucose, Histidin und Uracil) herangezogen, 1:10 in Induktionsmedium (1% Hefeextrakt, 2% Bactopepton, 5% Galactose) verdünnt und 40 Stunden lang herangezogen.
g. Die Zellen wurden durch Zentrifugation isoliert, und Zellextrakte wurden hergestellt (23).
h. Die Zellextrakte wurden durch SDS-Gelelektrophorese (7) analysiert und auf Nitrocellulosefilter geblottet.
i. Die Nitrocellulose-Blots wurden mit Lipaseantikörpern inkubiert und anschließend mit I125-markiertem Protein A inkubiert, worauf eine Fluorografie folgte (Fig. 13).
Wie in Figur 13 dargestellt, produzieren Integranten von SU50 mit dem Plasmid pUR6803 Lipaseenzym mit dem korrekten Molekulargewicht im Vergleich zur Lipase aus P. glumae. Zusätzlich zum korrekten Protein kann man auch ein nicht prozessiertes und glycosyliertes Lipaseprotein sehen. Die von S. cerevisiae produzierte P. glumae-Lipase ist enzymatisch aktiv.
Auf diese Weise sind Hefestämme erhalten worden, die mehrfach integrierte Kopien (bis zu 100 Kopien pro haploidem Genom) von entweder dem Plasmid pUR6803 oder pUR6804 (einschließlich der Lipaseexpressionkassette) für die Herstellung von aktiver P. glumae-Lipase tragen. Dieses Mehrfachkopien- Integrationssystem ist sogar unter nicht selektiven Bedingungen stabil.

BEISPIEL 8: PRODUKTION VON GUAR-α-GALACTOSIDASE IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE UNTER VERWENDUNG VON MEHRFACHKOPIENINTEGRATION

In diesem Beispiel wird die Expression eines heterologen Proteins, α-Galactosidase aus Guar (Cyamopsis tetra gonoloba), in Saccharomyces cerevisiae unter Anwendung der Mehrfachkopien- Integration beschrieben. Das Guar-α-Galactosidase codierende Gen wurde an homologe Expressionssignale fusioniert, wie es von Oberbeeke (21) beschrieben ist, was zum Expressionsvektor pUR2730 führte. Die α-Galactosidase-Expressionskassette von pUR2730 besteht aus dem S. cerevisiae GAL7-Promotor, der S. cerevisiae-Invertasesignalsequenz und dem reife Galactosidase kodierenden α-Galactosidase-Gen. Der verwendete Mehrfachkopien-Integrationsvektor ist pUR2770, der identisch mit pMIRY2.1 (27) ist. Die α-Galactosidase- Expressionskassette wurde isoliert und in den Mehrfachkopien- Integrationsvektor pUR2770 insertiert, was zu pUR2774 führte. Dieser Mehrfachkopien-Integrationsvektor enthält den α- Galactosidase-Expressionsvektor, ribosomale DNA-Sequenzen aus S. cerevisiae und das defiziente LEU2-Gen (LEU2d) aus S. cerevisiae als Selektionsmarker. Der Mehrfachkopien- Integrationsvektor wurde in S. cerevisiae transformiert, und Mehrfachkopien-Integranten wurden erhalten. Die Mehrfachkopien-Integranten waren mitotisch stabil, und die Mehrfachkopien-Integranten exprimierten und sekretierten das Pflanzenprotein α-Galactosidase. Dieses Beispiel zeigt deutlich, daß es möglich ist, Mehrfachkopien-Integration in das Genom von S. cerevisiae zu erhalten, und daß die Mehrfachkopien- Integranten zur Herstellung von Proteinen verwendet werden können. Alle DNA-Manipulationen wurden wie bei Maniatis (7) beschrieben ausgeführt.

1. Konstruktion des Mehrfachkopien-Integrationsvektors pUR2774

Der Mehrfachkopien-Integrationsvektor pUR2770 wurde mit HindIII teilweise verdaut, und das linearisierte Vektorfragment wurde isoliert. Das lineare Vektorfragment wurde vollständig mit BamHI verdaut, und das erhaltene 8 kb Vektorfragment wurde isoliert. Die α-Galactosidase-Expressionskassette wurde durch Verdau mit HindIII und BglII und Isolierung des 1,9 kb DNA-Fragments aus pUR2730 isoliert. Die α-Galactosidase- Expressionskassette wurde in das isolierte Vektorfragment von pUR2770 ligiert, was zum Mehrfachkopien-Integrationsvektor pUR2774 führte (siehe auch Fig. 14). Das Ligationsgemisch wurde in E. coli transformiert. Aus einzelnen Kolonien wurde nach Kultivierung die Plasmid-DNA isoliert, und die laut Restriktionsenzymanalyse korrekten Plasmide wurden selektiert und in großen Mengen isoliert. Der Mehrfachkopien- Integrationsvektor pUR2774, linearisiert mit Sinai, wurde nach dem Spheroplast-Verfahren (22) in den S. cerevisiae-Stamm YT6-2-1 L (26) transformiert, indem auf das Vorliegen des LEU2d-Genprodukts selektiert wurde.

2. Analyse des Integrationsmusters der Mehrfachkopien- Integranten

Die ribosomale DNA of S. cerevisiae liegt in ± 150 identischen Kopien auf der rDNA-Einheit vor, die Gene umfaßt, welche die 175, 5.8S und 265 rDNA-Komponenten der Ribosomen von S. cerevisiae spezifizieren. Diese rDNA-Einheiten liegen als in Tandemanordnung wiederholte Sequenzen in einem großen Genduster auf dem Chromosom XII von S. cerevisiae vor. Die vollständige Sequenz der rDNA-Einheit ist bekannt, die rDNA- Einheit ist 9,0 kb groß und enthält zwei BglII-Stellen (28,29,30). Wenn aus S. cerevisiae isolierte chromosomale DNA mit BglII verdaut wird, entstehen aus dem rDNA-Gencluster zwei Fragmente mit einer Länge von 4,5 kb. Diese Genanordnung ist in Fig. 15A schematisch wiedergegeben. Die den ribosomalen DNA-Fragmenten entsprechende 4,5 kb-Bande ist im Restriktionsmuster auf einem Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegel aufgrund der großen Zahl der in einem haploiden Genom vorliegenden ribosomalen DNA-Einheiten nachweisbar. Das Plasmid pUR2774 weist eine Länge von 9,8 kb auf und enthält eine einzelne BglII-Restriktionsenzymerkennungsstelle. Wenn das Plasmid pUR2774 in Tandemanordnung in hoher Kopienzahl integriert wird, entsteht beim Verdau der chromosomalen DNA mit BglII ein 9,8 kb-DNA-Fragment. Mit einem Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegel kann ein Vergleich zwischen der Intensität der 4,5 kb-DNA-Bande, die den ± 150 Kopien der ribosomalen DNA- Einheit entspricht, und der aus dem integrierten Plasmid stammenden 9,8 kb-DNA-Bande durchgeführt werden. Diese Gencluster-Anordnung ist in Fig. 15B gezeigt. Dieser Vergleich ergibt eine vernünftige Abschätzung der Zahl integrierter pUR2774-Plasmide. pUR2774 wurde linearisiert und in den Hefestamm YT6-2-1 L (SU50), der LEU2 ist, transformiert. Die Transformanten wurden auf definiertem MM-Medium ohne Leucin als Extra-Kontrolle auf den LEU2+-Phänotyp ausgestrichen. Zur Überprüfung, ob die Integration des Mehrfachkopien-Vektors pUR2774 tatsächlich stattfand, wurde aus den unabhängigen Integranten SU50A, SU50B, SU50C und SU50D chromosomale DNA isoliert. Die gesamte DNA wurde mit BglII verdaut und durch Gelelektrophorese analysiert. Ein Beispiel eines derartigen Ethidiumbromid-gefärbten Gels ist in Fig. 16 gezeigt. Wie erwartet, können in den Restriktionsmustern der Integranten SU50B und SU50C zwei Hauptbanden bei 4,5 und 9,8 kb unterschieden werden. Der zugrundeliegende Stamm gibt nur eine einzelne Bande bei 4,5 kb, die rDNA-Einheit. Somit können wir schließen, daß diese Integranten zusätzlich zu den mehrfachen rlbosomalen DNA-Einheiten überraschenderweise außerdem mehrfach integrierte Kopien des 9,8 kb Plasmids pUR2774 enthalten. Man fand, daß unterschiedliche Mehrfachkopien- Integranten unterschiedliche Kopienzahlen des Plasmids pUR2774 enthielten, die von 10 bis 100 variierten. Zur Bestätigung des Vorliegens des α-Galactosidase-Gens wurde eine Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten Sonde durchgeführt. Die Sonde für das α-Galctosidase-Gen wurde aus pUR2731, einem pUR2730-Derivat, durch Verdau mit PvuII und HindIII und Isolierung des das α-Galactosidase-Gen enthaltenden 1,4 kb-Fragments isoliert. Zur Identifizierung der rDNA- Sequenzen wurde durch Verdau von pUR2770 mit SmaI und HindIII und anschließender Isolierung und Markierung des 2,0 kb- Fragments eine Sonde hergestellt. Nach Hybridisierung mit der α-Galactosidase-Sonde (siehe Fig. 17) fand man, daß die im Ethidiumbromid-gefärbten Gel nachgewiesene 9,8 kb-Bande tatsächlich dem α-Galactosidase-Gen entspricht, weil diese einzelne Bande in den Autoradiografien vorlag, während in der Spur, die die verdaute Gesamt-DNA aus dem zugrundeliegenden YT6-2-1 L-Stamm enthielt, keine Hybridisierungssignale nachgewiesen wurden. Da wir die 9,8 kb-Bande nachweisen konnten, konnten beim Integrationsprozeß keine umfangreichen Umordnungen und/oder Deletionen stattgefunden haben. Die Hybridisierung mit der rDNA-Sonde führte zu Signalen, die einer 4,5 kb- Bande und einer 9,8 kb-Bande entsprechen, woraus folgt, daß die 4,5 kb-Bande tatsächlich die erwarteten ribosomalen DNA- Sequenzen enthält. Wie durch die α-Galactosidase-Sonde nachgewiesen, geht die 9,8 kb-Bande aus der Mehrfachkopien- Integration von pUR-2774 hervor. Diese 9,8 kb-DNA-Bande gibt auch mit der rDNA-Sonde ein positives Signal, weil pUR2774 auch ribosomale DNA-Sequenzen enthält. Aus den in Fig. 18 gezeigten Ergebnissen kann unter der Annahme, daß die 4,5 kb lange ribosomale DNA-Bande 150 Kopien rDNA repräsentiert, abgeschätzt werden, daß die pUR2774 enthaltende 9,8 kb-Bande 50 bis 100 Kopien enthält. Daher ist es durch Transformation des Mehrfachkopien-Integrationsplasmids pUR2774 tatsächlich möglich, 50 bis 100 Kopien pro Zelle der α-Galactosidase- Expressionskassette in das Genom von S. cerevisiae zu dirigieren.

3. Produktion von α-Galactosidase durch Mehrfachkopien-Integranten

Die Mehrfachkopien-Integranten SU50A, SU50B, SU50C und SU50D, die ausgewählt wurden, weil sie hohe Kopienzahlen des integrierten Plasmids aufwiesen, wurden auf α-Galactosidase- Aktivität überprüft, indem sie auf 0,67% Hefestickstoffbase w/o Aminosäuren, 2% Glucose über Nacht herangezogen wurden, worauf eine Induktion des GAL7-Promotors durch 1:10- Verdünnung in 1% Hefeextrakt, 2% Bactopepton, 2% Galactose (YPGal) erfolgte. Die α-Galactosidase-Aktivität in den Überständen der Kulturen wurde mittels eines Enzymaktivitätstests, wie von Overbeeke et al. (21) beschrieben, 24 und 48 h nach Beginn der Induktion bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt:
Die in der Tabelle gezeigten Ergebnisse zeigen deutlich, daß es möglich ist, unter Verwendung eines Mehrfachkopien- Integranten hohe Expressionsniveaus eines fremden Gens zu erhalten. Darüber hinaus führt SU50B (235 mg/l) im Vergleich zu einem Expressionssystem mit extrachromosomalen Plasmiden (siehe pUR2730 in Literaturstelle 21) zu einem höheren Niveau an α-Galactosidase-Produktion. Trotz der Tatsache, daß alle vier Mehrfachkopien-Integranten ausgewählt worden sind, weil sie eine hohe Kopienzahl integrierter α-Galactosidase- Expressionskassetten aufwiesen, variieren ihre Expressionsniveaus von 54 bis 235 mg/l.

4. Genetische Stabilität des SU50B-Mehrfachkopien- Integranten

Um zu überprüfen, ob die Integration des Mehrfachkopien-α- Galactosidase-Expressionsplasmids in das S. cerevisiae Genom genetisch stabil ist, wurde das vollständige Testverfahren unter nichtselektiven Bedingungen wiederholt. Der Integrant SU50B wurde auf einer YPD-Agarplatte ausgestrichen, und eine Vorkultur wurde angeimpft und über Nacht in YPD bei 30ºC herangezogen. Anschließend wurde die Vorkultur 1:10 in YPGal verdünnt. Es wurden Proben genommen, die optische Dichte bei 660 nm gemessen, und der α-Galactosidase-Gehalt der Kulturbrühe wurde durch den Enzymaktivitätsassay bestimmt. Überraschenderweise war das Expressionsniveau an α-Galactosidase während des ganzen Versuchs stabil. Dieser Versuch zeigt, daß die mehrfach integrierten Expressionsplasmide in der Tat unter nicht-selektiven Bedingungen viele Generationen lang sehr stabil erhalten bleiben. Ein weiterer wichtiger Befund war, daß die Mehrfachkopien-Integranten auf bei 4ºC aufbewahrten nichtselektiven YPD-Agarplatten über Monate stabil waren. Wenn die Vorkultur des SU50B-Integranten 1:1000 in YP mit 2% Galactose verdünnt und bei 30ºC auf eine identische OD 660 nm herangezogen wird, beträgt die α-Galactosidase-Expression 250 mg/l. Bei diesem Versuch wird die Vorkultur des Mehrfachkopien-Integraten SU50B stärker in YPGal verdünnt, und die Zellen in der induzierten Kultur müssen mehrere Zellteilungen durchführen, bevor die gleiche Biomasse und - demzufolge - α- Galctosidase-Produktion erreicht ist, wie bei einer 1:10- Verdünnung. Daher können wir schließen, daß die Stabilität der α-Galactosidase-Produktion und daher die genetische Stabilität der Mehrfachkopien-Integranten im Vergleich zur Stabilität extrachromosomaler Plasmide unter nichtselektiven Bedingungen sehr gut ist.
Wir haben auch gefunden, daß für die Mehrfachkopien- Integration und genetische Stabilität der Mehrfachkopien- Integranten die Länge des Mehrfachkopien-Integrationsvektors ein wichtiger Parameter ist. Die Verwendung von Mehrfachkopien-Integrationsvektoren mit einer Länge von etwa 12 kb neigt dazu, zu einer niedrigeren Kopienzahl integrierter Vektoren in dem Genom und auch zu einer verminderten - obgleich noch beachtlichen - genetischen Stabilität zu führen. Die Verwendung relativ kleiner Mehrfachkopien-Integrationsvektoren (-+ 3 kb) führt zu einer hohen Kopienzahl integrierter Vektoren, jedoch mit verminderter genetischer Stabilität. Diese Ergebnisse zeigen, daß die optimale Länge für einen Mehrfachkopien-Integrationsvektor, die zu einer hohen Kopienzahl integrierter Vektoren und guter genetischer Stabilität führt, etwa die Länge einer einzelnen ribosomalen DNA-Einheit ist, für S. cerevisiae etwa 9 kb.
Dieses Beispiel zeigt deutlich die erfolgreiche Anwendung der Mehrfachkopien-Integration in S. cerevisiae für die Herstellung von Proteinen. Die hohe genetische Stabilität des Mehrfachkopien-Integranten bringt im Vergleich zum extrachromosomalen Plasmidsystem, bei dem Zellen unter Selektionsdruck gezogen werden müssen, einen wichtigen Vorteil mit sich. Die Mehrfachkopien-Integranten schienen auf YPD-Agarplatten sowie während des Wachstums in YPD- und YPGal-Kulturmedium viele Generationen lang sehr stabil zu sein. Angesichts des hohen Expressionsniveaus des α-Galactosidase-Enzyms und der guten mitotischen Stabilität der integrierten α-Galactosidase- Expressionskassetten ist dieses Integrantensystem eine realistische Option für eine Herstellung des α-Galactosidase- Enzyms oder eines anderen Proteins im großen Maßstab.

BEISPIEL 9: MEHRFACHKOPIEN-INTEGRATION IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE UNTER VERWENDUNG ANDERER DEFIZIENTER SELEKTIONSMARKER

Wir haben gefunden, daß für die Mehrfachkopien-Integration in Hefe zwei Vorbedingungen für den Mehrfachkopien- Integrationsvektor existieren; der Mehrfachkopien-Integrationsvektor sollte ribosomale DNA-Sequenzen und einen Selektionsmarker mit einem spezifischen Grad an Defizienz enthalten. In den vorhergehenden Beispielen wird die Mehrfachkopien-Integration unter Verwendung eines Mehrfachkopien- Integrationsvektors mit ribosomalen DNA-Sequenzen und dem defekten LEU2-Gen (LEU2d) als Selektionsmarker erreicht. In diesem Beispiel wird die Verwendung anderer defekter Selektiosmarker (als LEU2d) beschrieben, um eine Mehrfachkopien- Integration in Hefe zu erreichen. In diesem Beispiel werden Mehrfachkopien-Integrationsvektoren mit entweder einem defizienten TRP1- oder einem defizienten URA3- anstelle des LEU2d-Gens verwendet. Die Expression dieser beiden Gene wurde durch Entfernung eines erheblichen Teils ihrer 5'- flankierenden Regionen eingeschränkt. Unter Verwendung dieser Mehrfachkopien-Integrationsvektoren wurden Mehrfachkopien Integranten erhalten, in die etwa 200 Kopien des Vektors integrierten. Dieses Beispiel zeigt deutlich, daß die Mehrfachkopien-Integration auch durch andere defiziente Selektionsmarker bewirkt werden kann. Alle Standard-DNA-Manipulationen wurden wie bei Maniatis (7) beschrieben durchgeführt.

1. Konstruktion und Analyse von pMIRY-Plasmiden, die ein defizientes TRP1-Gen als Selektionsmarker enthalten

Um die Möglichkeit zu testen, daß die Mehrfachkopien-Integration in das Genom unter Verwendung verschiedener Arten von Selektionsdruck während der Transformation erreicht werden kann, wurde eine Anzahl pMIRY2.1-analoger Plasmide (pMIRY2.1 ist identisch zu pUR2770) konstruiert, die defiziente Allele zweier üblicherweise als Selektionsmarker verwendeter Gene enthalten, das TRP1- und URA3-Gen von S. cerevisiae. Das TRP1-Gen kodiert das Enzym N-(5'-Phosphoribosyl-1)anthranilat-Isomerase (PRA-Isomerase), die den dritten Schritt bei der Biosynthese von Tryptophan katalysiert (31). Die Transkription des TRP1-Gens wird an mehreren Stellen initiiert, die in zwei Clustern organisiert sind (Fig. 19), eines etwa bei Position -200, relativ zum ATG-Startcodon, und das andere knapp stromaufwärts zu diesem Codon (32). Jedem der beiden Cluster gehen putative TATA-Elemente sowie (dA:dT)-reiche Regionen voran, die als Promotorelemente wirken könnten (3). Wenn die Region stromaufwärts zum TRP1-Gen bis zur EcoRI- Stelle bei Position -102 deletiert wird (TΔ1), wird der erste Clustrer der Transkriptionstartstellen entfernt, und das Expressionsniveau des Gens fällt auf nur 20 bis 25% des Wertes seines Wildtyp-Gegenstücks (31). Dieses besondere defiziente TRP1-Allel wird gegenwärtig als Selektionsmarker in verschiedenen Hefevektoren benutzt. Nach unserer Hypothese ist dieses Maß an Defizienz nicht hoch genug und daher wurde die Deletion in der 5'-flankierenden Sequenz bis entweder zur Position -30 (TΔ2) oder -6 (TΔ3) stromaufwärts zum ATG-Codon ausgedehnt. Das TΔ2-Gen enthält noch einen Teil des stromabwärts befindlichen Clusters der Transkriptionsinitiierungsstellen. In der TΔ3-Deletionsmutante sind beide Cluster sowie alle Poly-dA:dT-Strecken und putativen TATA-Elemente deletiert. Diese zwei mutierten TRP1-Gene sowie das ursprüngliche TΔ1-Gen wurden bei der Konstruktion der Reihe von pMIRY6-T- Plasmiden verwendet. Die Konstruktion dieser Reihe wurde wie folgt durchgeführt (Fig. 20): Zuerst wurde das die TRP1- codierende Region plus 30 bp der 5'-flankierenden Sequenz enthaltende 766 bp AccI-PstI-Fragment (Fig. 19) zwischen die SmaI- und PstI-Stelle von pUC19 kloniert, was zum Plasmid pUC19-TΔ2 führte (die Acci-Stelle wurde durch Auffüllen am 3'-Ende unter Verwendung von T4-Polymerase glatt gemacht). Anschließend wurde das das BglII-B rDNA-Fragment (27) enthaltende 3,5 kb SphI-Fragment aus einem pUC18-Subklon in die SphI-Stelle des pUC19-TΔ2-Polylinkers insertiert, was das Plasmid pMIRY6-TΔ2 ergab. Die Plasmide pMIRY6-TΔ1 und pMIRY6- TA3 sind Derivate von pMIRY6-TΔ2. Um pMIRY6-TΔ1 zu erhalten, wurde das 867 pb EcoRI-BglII-TRP1-Fragment zuerst zwischen die EcoRI- und die BamHI-Stellen von pUC19 kloniert, was das Plasmid pUC19-TΔ1 ergab. Im nächsten Schritt wurde das 1,2 kb ScaI-EcoRI-Fragment von pMIRY6-TΔ2, das einen Teil der pUC19- Sequenz sowie einen Teil des TRP1-Gens enthält (Fig. 20), durch das 1,3 kb-ScaI-EcoRI-Fragment aus pUC19-TΔ1 ersetzt, was die Länge der 5'-flankierten Sequenz des TRP1-Gens von 102 bp wieder herstellt. pMIRY6-TΔ3 wurde auf ähnliche Weise konstruiert. Zuerst wurde das 405 bp AluI-Fragment aus dem TRP1-Gen in die SmaI-Stelle von pUC19 kloniert, was pUC19-TΔ3 ergab. Anschließend wurde das 1,2 kb ScaI-EcoRI-Fragment von pMIRY6-TΔ2 durch das 1,2 kb ScaI-EcoRI-Fragment aus pUC19-TΔ3 ersetzt, wobei pMIRY6-TΔ3 erhalten wurde. Die Plasmide pMIRY6-TΔ1, pMIRY6-TΔ2 und pMIRY6-TΔ3 wurden nach Lineansierung mit HpaI in der rDNA-Sequenz, um zielgerichtete Integration in den rDNA-Locus zu erhalten, in Hefe transformiert. In Fig. 21 ist eine geleelektrophoretische Analyse der gesamten DNA aus zwei unabhängig isolierten Transformanten jedes Typs nach Verdau mit EcoRI im Fall von pMIRY6-TΔ1 und SacI in den Fällen von pMIRY6-TΔ2 und pMIRY6-TΔ3 gezeigt. Im Falle der pMIRY6-TΔ2- (Spuren 3 und 4) und pMIRY6-TΔ3- Transformanten (Spuren 5 und 6) sind die rDNA-Bande und die Plasmid-Banden von vergleichbarer Intensität. Daher ist die Kopienzahl jedes der zwei Plasmide so hoch wie die Zahl an rDNA-Einheiten pro haploidem Genom, die etwa 150 beträgt (33). Die Kopienzahl der pMIRY6-TΔ2- und -TΔ3-Plasmide liegt in der gleichen Größenordnung. Die Transformation mit pMIRY6- TΔ1 hingegen führte nicht zu Transformanten mit hoher Kopienzahl. Wie in Fig. 21 (Spuren 1 und 2) gezeigt, ist keine dem linearisierten pMIRY6-TΔ1-Plasmid entsprechende 6,9 kb-Bande nach SacI-Verdau der gesamten DNA aus pMIRY-TΔ1 transformierten Zellen sichtbar. Die vorstehend beschriebenen Ergebnisse zeigen deutlich, daß eine Mehrfachkopien- Integration in den Hefe-rDNA-Locus nicht notwendigerweise das Vorliegen des LEU2d-Genselektionsmarkers auf dem Vektor erfordert. Statt dessen können defiziente TRP1-Allele verwendet werden, vorausgesetzt ihre Expression fällt unter ein kritisches Niveau.

2. Konstruktion und Analyse eines pMIRY-Plasmids mit einem defizienten URA3-Gen als Selektionsmarker

Nach dem LEU2- und dem TRP1-Gen ist das URA3-Gen einer der am meisten verwendeten Selektionsmarker in Hefevektoren (34). Das URA3-Gen kodiert Orotidin-5'-phosphatcarboxylase (OMP- Decarboxylase). Die Expression dieses Gens wird auf der Stufe der Transkription durch das PPR1-Genprodukt kontrolliert, das als positiver Regulator wirkt (35). Die Deletionsanalyse legt nahe; daß sich die für die PPR1-Induktion von URA3 essentielle Sequenz auf einer 97 bp langen Region befindet, die knapp stromaufwärts zum ATG-Translationsstartcodon angeordnet ist (36). Um einen Promotor des URA3-Gens mit dem gewünschten Grad an Defizienz zu erhalten, haben wir das meiste dieser Region deletiert, wobei wir eine 16 bp stromaufwärts zum ATG- Startcodon befindliche PstI-Stelle benutzten. Zu diesem Zweck wurde ein BglII-Linker in die SmaI-Stelle von pFL1 (368) insertiert, die sich in der 3'-flankierenden Region des URA3- Gens bei Position +880 relativ zum ATG-Translationsstartsignal befindet, was pFL1-BglII lieferte. Das 0,9 kb-PstI- BglII-Fragment, das die URA3-codierende Region zusammen mit ihrer an die BglII-Stelle anstoßenden 3'-flankierenden Region und nur 16 bp ihrer an die PstI-Stelle anstoßenden 5'- flankierenden Region umfaßt, wurde zwischen die PstI- und BamHI-Stelle von pUC19 kloniert, was pUC19-U liefert (Fig. 22). Das einen Teil des BglII-B rDNA-Fragments enthaltende 2,8 kb SacI-StuI-rDNA-Fragment wurde aus pUC-BR isoliert und zwischen die SmaI- und SacI-Stelle in pUC19-UΔ insertiert, was das Plasmid pMIRY7-UΔ ergab. Die Kopienzahl-Analyse zweier unabhängig isolierter pMIRY7-UΔ-Transformanten ist in Fig. 23 gezeigt. Die Plasmid-Bande und die rDNA-Bande weisen vergleichbare Intensitäten auf, was bedeutet, daß das Plasmid in etwa 200 Kopien pro Zelle integriert ist, ein Ergebnis, das dem mit den Plasmiden pMIRY6-TΔ2 und pMIRY6-TΔ3 erhaltenen ähnlich ist. Dieses Beispiel zeigt deutlich, daß die Mehrfachkopien-Integration in den ribosomalen DNA-Locus von Hefe auch unter Verwendung anderer Gene als LEU2d als Selektionsmarker erreicht werden kann. In der Tat scheint es wahrscheinlich, daß jedes beliebige Gen, das an der Biosynthese eines essentiellen Nährstoffs beteiligt ist, dieses Verfahren unterstützen kann, wenn es als Selektionsmarker auf einem pMIRY-Plasmid eingesetzt wird, unter der Voraussetzung, daß es exprimiert wird, aber seine Expression unterhalb kritischen Niveaus liegt.
Dies bedeutet, daß wir überraschenderweise gefunden haben, daß auf dem Mehrfachkopien-Integrationsvektor neben der ribosomalen DNA-Sequenz ein defizientes aber essentielles vorliegen muß, um eine Mehrfachkopien-Integration des Mehrfachkopien-Integrationsvektors in einen S. cerevisisae- Stamm, der bezüglich dieses essentiellen Gens defizient zu erreichen, und daß die erhaltenen Mehrfachkopien-Integranten viele Generationen lang stabil sein können. So kann das Prinzip der Mehrfachkopien-Integration auf alles auxotrophe S. cerevisiae-Stämme ausgedehnt werden, was sie für die Expression eines jeden beliebigen Gens eine Auswahl aus einer Vielzahl von Wirtsstämmen gestattet. Eine derartige Auswahl ist ein wichtiger Faktor bei der Optimierung der Expression von heterologen Genen in Hefe. Insbesondere ist Auxotrophie ein attraktiver Marker zur Verwendung in industriellen Verfahren, weil sogar schlecht definierte en ohne weiteres durch Hitzesterilisation an Tryptophan erreichert werden können.

BEISPIEL 10: STABILITAT DES MEHRFACHKOPIEN-INTEGRANTEN IN KONTINUIERLICHEN KULTUREN

Der Mehrfachkopien-Integrant wird in einer kontinuierlichen Kultur (Chemostat) mit einem Arbeitsvolumen von 800 ml einer Verdünnungsrate von 0,1 h&supmin;¹ (mittlere Verweilzeit 10 Stunden) kultiviert. Der Integrant SU50B ist ein formant des Stamms Saccharomyces cerevisiae CBS 235.9 in dem Mehrfachkopien-Integrationsvektor pUR2774 (siehe Bespiel 8). Der pH wurde unter Verwendung von 10%igem NH&sub4;OH auf eingeregelt. Das Schäumen wurde unter Verwendung Schaumverhütungsmittels auf Silikonöl-Basis (Rhodorsil 4 Rhone-Poulenc) unterdrückt. Die verwendete laufzusammensetzung war A. Ein stationärer Zustand wurde Stunden lang mit einer stabilen Expression von 360 mg α- Galactosidase bei einer Biomassetrockengewichtskonzentration von 11,06 g/l beibehalten. Ähnliche Bedingungen waren in anderen Versuchen mehr als 500 Stunden lang stabil. Die Restglucosekonzentration lag unterhalb der Nachweisgrenze von 0,05 g/l. Die Restgalactosekonzentration betrug 4,2 +/- 0,1 g/l. Der Einlaß enthielt 170 mg/l aus Hefeextrakt und DHW stammendes Leucin. Dies führte zu einer stationären Leucinkonzentration von 2,0 +/- 0,4 mg/l laut Bestimmung mit einem Aminosäureanalysator. Nach einer Zeitspanne wurden 50 mg/l Leucin zum Zulauf A gegeben. Überraschenderweise fiel die Restleucinkonzentration in der Kultur auf 0,7 +/- 0,2 mg/l. Dies war von einer erheblichen Abnahme der α- Galactosidaseaktivität innerhalb von 80 Stunden auf 144 mg/l begleitet (Fig. 24). In Fig. 25 ist die Bestimmung der Kopienzahl während verschiedener Stufen des Versuchs gezeigt. Es wurden Proben entnommen, chromosomale DNA isoliert, mit BglII verdaut und anschließend ein Southern-Blot unter Verwendung der in Beispiel 8 beschriebenen ribosomalen DNA-Sonde durchgeführt. SU50B 1 ist eine positive Kontrolle, die in einem Schüttelkolben gezogen wurde. Man kann durch Vergleich des kleineren hybridisierenden DNA-Fragments (chromosomale rDNA-Einheiten: + 150 Kopien) mit dem größeren hybridisierenden DNA-Fragment (dem integrierten Vektor) deutlich sehen, daß die Kopienzahl integrierter Vektoren etwa 100 beträgt. Das gleiche gilt für SU50B 2, einem Southern-Blot einer vor Zugabe des Leucins genommenen Probe. Für SU50B 3, einer nach Zugabe des Leucins und dem Abfall der α-Galactosidase- Expression genommenen Probe, hat die Kopienzahl auf etwa 10 abgenommen. Dieser Versuch, zeigt, daß die Abnahme der α- Galactosidase-Expression von einer Abnahme der Kopienzahl des α-Galactosidase-Gens begleitet ist. Die Leucinaufnahme der Kultur ist nach Zugabe von Leucin höher.
Die vorstehend beschriebenen Versuche zeigen in ziemlich überraschender Weise, daß die genetische Stabilität der integrierten Plasmide auf der Tatsache beruht, daß die intrazelluläre Produktion von Leucin trotz des Vorliegens einer nennenswerten Menge extrazellulären Leucins für das Wachstum erforderlich ist. Aufgrund der unzureichenden Effizienz des LEU2d-Promotors ist die Produktion ausreichender Mengen an Leucin nur möglich, wenn eine große Zahl LEU2d-Gene auf dem Chromosom vorliegt.
Eine derart große Zahl integrierter Gene kann unter geeigneten Wachstumsgeschwindigkeits-Bedingungen und geeigneter Mediumzusammensetzung stabil aufrechterhalten werden, wenn sich die Integrationsstelle auf oder in unmittelbarer Verbindung zum ribosomalen DNA-Locus befindet.
DHW: entproteinisierte hydrolysierte Molke von DMV, Niederlande.
UF: ultrafiltriert, Molekülgewichtsgrenze 10 kD.
Hefeextrakt, enthält 8-9% (Gew./Gew.) Leucin.

BEISPIEL 11: DIE STABILITÄT DES MEHRFACHKOPIEN-INTEGRANTEN SU50B BEEINFLUSSENDE PARAMETER

Der Stamm SU50B (wie in Beispiel 10 beschrieben) wurde in den Medien C und D in Schüttelkolben kultiviert. Dieser gibt ein Beispiel zweier extremer Medien, die von einem komplexen reichen Medium zu einem Minimalmedium reichen. Das Medium C (YPGAL) enthält 524 mg/l Leucin. Überraschenderweise war der Integrant in YPGAL-Medien viele Subkultivierungen lang stabil (siehe Beispiel 8). Im Medium D und anderen Minimalmedien mit Leucin nahm die Expression rasch ab. Die Restkonzentration an Leucin (aus dem Hefeextrakt und Pepton stammend) im Medium C nahm von 524 mg/l auf 393 mg/l ab. Die Leucinkonzentration im Medium D verminderte sich von 50 auf etwa 20 mg/l. Die Wachstumsgeschwindigkeit des Stamms in Minimalmedien beträgt etwa 0,1 h&supmin;¹, während die Wachstumsgeschwindigkeit auf dem Medium C 0,27 h&supmin;¹ beträgt. Die Zugabe von Hefeextrakt erhöht die Wachstumsgeschwindigkeit auf 0,27 h&supmin;¹ in Verbindung mit einer verbesserten Stabilität der α-Galactosidase-Produktion. Die komplexen Medien erhöhen nicht nur die Wachstumsgeschwindigkeit, sondern erhöhen auch die α-Galactosidase-Konzentration in der Kultur.
Diese Versuche zeigen deutlich, daß der Mehrfachkopien- Integrant bei hohen Wachstumsgeschwindigkeiten in Gegenwart von Leucin stabil war. Auf der Grundlage dieses Befundes kann ein effizientes Fermentationsverfahren entwickelt werden, was bedeutet, daß eine beträchtliche Menge Protein pro Kulturvolumen pro Stunde erhalten werden kann.

BEISPIEL 12: EXPRESSION DER SYNTHETISCHEN LIPASEGENE IN HANSENULA POLYMORPHA.

Die synthetischen Lipasegene wurden in das H.polymorpha Genom unter Anwendung des folgenden Verfahrens integriert (Fig. 26; in jeder Figur dieses Beispiels sind die verwendeten Restriktionsenzymerkennungsstellen mit einem Sternchen markiert; Restriktionserkennungsstellen in Klammern sind durch das Klonierungsverfahren entfernt worden):
a. Das Plasmid pUR6038 (Fig. 27) wurde vollständig mit den Restriktionsenzymen EcoRI und EcoRI verdaut. Nach Auftrennung der Fragmente durch Agarosegeleletrophorese wurde das Vektorfragment wie in Beispiel 2 beschrieben isoliert.
b. Mehrere verschiedene synthetische Kassetten wurden wie in Beispiel 3 beschrieben zusammengefügt. Diese Kassetten codierten eine Zahl von Aminosäuren, die für eine richtige Verbindung der Invertasesignalsequenz mit unterschiedlicher Länge des Gens für unreife Lipase notwendig sind. Dies wurde durchgeführt, um das am besten geeignete Konstrukt hinsichtlich Expression, Processing und Export des Lipaseenzyms zu ermitteln. Darüber hinaus hatten diese Kassetten EcoRI und EcoRI-Enden. Typische Beispiele sind in Figur 26 angegeben.
c. Die zusammengefügten Kassetten wurden in den unter a. hergestellten Vektor ligiert.
d. Die derart erhaltenen Plasmide (pUR6850, 6851 und 6852; Fig. 28) wurden mit dem Restriktionsenzym XhoI teilweise verdaut, und das linearisierte Plasmid wurde isoliert.
e. Das Plasmid pUR3501 (21, Fig. 29) wurde mit XhoI teilweise verdaut. Nach Agarosegeleletrophorese wurde ein DNA- Fragment von etwa 1500 bp isoliert, das den H. polymorpha-Methanoloxidase (MOX)-Promotor, auf den die ersten Amminosäuren des S. cerevisiae-Invertase signalsequenz-XhoI-DNA-Fragments (von Position 0 bis 1500 aus pUR3501) folgten, enthielt.
f. Das 1,5 kb Fragment von e. wurde in die unter d. hergestellten Vektorfragmente ligiert, was zu den Plasmiden UR6860, 6861 und 6862 führte (Fig. 30).
g. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli transformiert. Aus einzelnen Kolonien wurde nach Kultivierung die Plasmid- DNA isoliert, und die korrekten Plasmide (laut Restriktionsenzymanalyse) wurden ausgewählt und in großen Mengen isoliert.
h. Die in Schritt g. erhaltenen korrekten Plasmide (z.B. pUR6860, 6861 und 6862, Fig. 30) wurden vollständig mit BamHI verdaut, worauf die klebrigen Enden mit Klenow- Polymerase aufgefüllt wurden (Beispiel 2). Als nächster Schritt wurden die linearen Plasmide mit EcoRI verdaut, und die aufgefüllten Bainhi-EcoRI-DNA-Fragmente, die den MOX-Promotor, die Invertasesignalsequenz und das synthetische Lipasegen umfassen, mit einer Länge von etwa 2,5 kb wurden aus dem Agarosegel isoliert.
i. Das Plasmid pUR3511 (der H. polymorpha-Methanoloxidase (MOX)-Terminator in die BamHI-, HindII-Restriktionsstellen vom pEMBL9 kloniert, Fig. 31) wurde mit Sinai und EcoRI verdaut, worauf der Vektor aus einem Agarosegel isoliert wurde.
j. Der pUR3511-Vektor und die in h. erhaltenen 2,5 kb Fragmente wurden ligiert und in E. coli kloniert. In den erhaltenen Konstrukten folgt auf das Lipasegen der MOX- Transkriptionsterminator. Typische Beispiele dieser Konstrukte sind pUR6870, 6871 und 6872 (Fig. 32).
k. Diese Plasmide wurden mit EcoRI und HindIII verdaut, worauf die Fragmente von etwa 3 kb aus einem Agarosegel isoliert wurden. Die klebrigen Enden wurden mit Klenow- Polymerase aufgefüllt.
l. Das Plasmid pUR3513 - es handelt sich um das Plasmid YEp13 (37), aus dem die 2 µm-Sequenzen durch Entfernung eines SalI-Fragments deletiert worden sind (Fig. 33) - wurde mit PvuII verdaut.
m. Das lineare Plasmid pUR3513 und die in k. erhaltenen Fragmente wurden ligiert, wobei die fertigen Konstrukte, darunter pUR6880, 6881 und 6882, erhalten wurden (Fig. 34).

Einführung der Expressionskassetten in das H. polymorpha- Genom.

Die Transformation von Plasmid-DNA in den Hansenula polymorpha-Stamm A16 unter Anwendung der Selektion auf den LEU+- Phänotyp kann wie von (21, 38, 39) beschrieben durchgeführt werden. Die Analyse der Integranten kann unter Anwendung des Southernblot-Verfahrens (7) durchgeführt werden.

BEISPIEL 13: HERSTELLUNG VON GUAR-α-GALACTOSIDASE IN HANSENULA POLYMORPHA UNTER ANWENDUNG DER MEHRFACHKOPIEN-INTEGRATION.

In diesem Beispiel wird die Expression eines heterologen Proteins, α-Galactosidase aus Guar (Cyainopsis tetra gonoloba), unter Anwendung der Mehrfachkopien-Integration in Hansenula polymorpha beschrieben. Das α-Galactosidase codierende Gen wurde an homologe Expressionssignale wie bei Overbeeke (21) beschrieben fusioniert, was zum Expressionsvektor pUR3510 führte. Die α-Galactosidase-Expressionskassette von pUR3510 besteht aus dem H. polymorpha-Methanoloxidase-Promotor, der S. cerevisiae-Invertasesignalsequenz, dem (reife α-Galactosidase codierenden) α-Galactosidasegen und dem H. polymorpha- Methanoloxidase-Terminator. Diese Expressionskassette wurde isoliert und in den Mehrfachkopien-Integrationsvektor pUR2790 insertiert, was zu pUR3540 führte. Der Mehrfachkopien- Integrationsvektor pUR3540 wurde in H. polymorpha transformiert, und überraschenderweise wurden Mehrfachkopien- Integranten erhalten. Die erhaltenen Mehrfachkopien- Integranten exprimierten und sekretierten das Pflanzenprotein α-Galactosidase. Dieses Beispiel zeigt deutlich, daß es möglich ist, Mehrfachkopien-Integranten in H. polymorpha zu erhalten, und, daß diese Mehrfachkopien-Integranten zur Herstellung von Proteinen verwendet werden können. Es erschien auch, daß Mehrfachkopien-Integranten in H. polymorpha unter Anwendung von ribosomalen DNA-Sequenzen aus S. cerevisiaeund einem defizienten Selektionsmarker von S. cerevisiae erhalten wurden. Alle DNA-Manipulationen wurden unter Anwendung von Standardtechniken, wie bei Maniatis (7) beschrieben, durchgeführt.
Das Plasmid pUR3510 (21) wurde mit HindIII und BamHI verdaut, und das die α-Galactosidaseexpressionskassette enthaltende DNA-Fragment wurde isoliert. Der Mehrfachkopien-Integrationsvektor pUR2790 leitet sich von pUR2740 ab, indem das S. oligorhiza-DNA und eine 100 bp ribosomale DNA von S. cerevisiae enthaltende 500 bp-BglII-HindIII-Fragment durch eine mehrere Klonierungsstellen enthaltende BglII-HindIII- Polylinkersequenz ersetzt wurde. Der Mehrfachkopien- Integrationsvektor pUR2790 wurde mit HindIII teilweise verdaut und mit BglII vollständig verdaut und anschließend wurde das Vektorfragment isoliert. Das BglII-HindIII-Vektorfragment und das die α-Galactosidase-Expressionskassette enthaltende HindIII-BamHI-Fragment wurden ligiert, was zum Mehrfachkopien-Integrationsvektor pUR3540 führte (s. auch Fig. 35; alle verwendeten Restriktionserkennungsstellen sind mit einem Sternchen markiert). Das Ligationsgemisch wurde in E. coli transformiert. Aus einzelnen Kolonien wurde nach Kultivierung die Plasmid-DNA isoliert, und die korrekten Plasmide (laut Restriktionsenzymanalyse) wurden ausgewählt und in großen Mengen isoliert.
Der Mehrfachkopien-Integrationsvektor pUR40 wurde mit SmaI linearisiert, und der linearisierte Vektor pUR40 wurde in H. polymorpha A16 (LEU2-)unter Anwendung des von Roggenkamp et al (39) beschriebenen Verfahrens transformiert. Die LEU2+- Kolonien, bei denen es sich um die Mehrfachkopien-Integranten handelte, wurden isoliert und für weitere Versuche verwendet. Der Mehrfächkopien-Integrant und der Elternstamm A16 als Kontrolle wurden unter nichtselektiven Bedingungen (1% Hefeextrakt, 2% Bactopepton, 2% Glucose, 40 Stunden bei 37ºC) herangezogen, und chromosomale DNA wurde, wie von Janowicz et al (40) beschrieben, isoliert. Die gesamte DNA wurde mit HindIII verdaut, und die verdaute chromosomale DNA wurde durch Southern-Hybridisierung (7) analysiert. Ein 878 bp-XhoI- Fragment, das einem Teil des Methanoloxidase-Promotors [Position -1313 bis Position -435, Ledeboer (41)] enthielt, wurde mit ³²P markiert und als Sonde verwendet. Das Ergebnis dieses Hybridisierungsversuchs ist in Fig. 36 gezeigt (Spur 2: Elternstamm und Spur 1: Mehrfachkopien-Integrant). In Spur 2, dem Elternstamm, kann man sehen, daß ein DNA-Fragment von etwa 14 kb mit der Methanoloxidasepromotor-Sonde hybridisiert, das einem das vollständige Methanoloxidasegen enthaltenden DNA-Fragment entspricht, das als einzelne Kopie auf dem Genom vorliegt. In Spur 1, dem Mehrfachkopien-Integrant, wurde ein zusätzliches Hybridisierungssignal erhalten, das einem DNA-Fragment von etwa 8 kb entspricht. Dieses Fragment ist ein Teil des integrierten Vektors pUR3540 und stellt das u.a. die α-Galactosidase-Expressionskassette und den Methanoloxidasepromotor enthaltende HindIII-Fragment dar. Durch Vergleich der Intensitäten der Hybridisierungssignale in Spur 2 kann man abschätzen, daß über 20 Kopien des Mehrfachkopien- Integrationsvektors in das H polymorpha Genom integriert sind. Der Mehrfachkopien-Integrant wurde wie von Overbeeke (21) beschrieben auf α-Galactosidase-Expression analysiert. Nach Induktion mit Methanol wurde im Medium unter Anwendung des Enzymaktivitätsassays α-Galactosidase nachgewiesen. Dieses Beispiel zeigt deutlich, daß die Mehrfachkopien- Integration in H. polymorpha erreicht werden kann und das Mehrfachkopien-Integrationssystem somit für die Herstellung von (z.B. heterologen) Proteinen in H. polymorpha verwendet werden kann. Dieses Beispiel zeigt auch, daß es Mehrfachkopien-Integration eines Expressionsvektors in das Genom einer Hefe (z.B. H. polymorpha) unter Anwendung der zwei Vorbedingungen ribosomaler DNA-Sequenzen und eines defizienten Selektionsmarkers, zu erhalten. Ein derartiger Selektionsmarker kann homolog sein oder aus einem anderen Wirt (z.B. S. cerevisiae) stammen, solange das Expressionsniveau des defizienten Gens unterhalb eines kritischen Niveaus liegt.
BEISPIEL 14: MEHRFACHKOPIEN-INTEGRATION IN KLUYVEROMYCES.
In diesem Beispiel wird ein Verfahren beschrieben, um die Mehrfachkopien-Integration eines Plasmidvektors in das Genom von Kluyveromyces marxianus var. lactis zu erreichen. Es wurden Mehrfachkopien-Integrationsvektoren konstruiert, die aus S. cerevisiae stammende ribosomale DNA-Sequenzen und aus den Mehrfachkopien-Integrationsvektoren (pMIRY6-TΔ1, pMIRY6-TΔ2 und pMIRY6-TΔ3) stammende defiziente Selektionsmarker enthielten. Die Mehrfachkopien-Integrationsvektoren wurden in einen TRP- -K. marxianus-Stamm transformiert, was überraschenderweise zu Transformanten mit mehreren Kopien des in das Genom des Kluyveromycesstamm integrierten Vektors führte. Auch dieses Beispiel zeigt deutlich, daß die Mehrfachkopien- Integration in Hefen unter Verwendung entweder homologer oder heterologer defizienter Selektionsmarker erreicht werden kann.
Aus den Mehrfachkopien-Integrationsvektoren pMIRY6-TΔ1, pMIRY6-TΔ2 und pMIRY6-TΔ3 (s. Beispiel 9) wurde die ribosomale DNA von S. cerevisiae durch Verdau mit SphI, Isolierung des Vektorfragments und. anschließende Ligation des Vektorfragments entfernt. In den erhaltenen Vektor wurde ein 4400 bp ribosomales EcoRI-K. marxianus-Fragment (42, Fig. 37) in die EcoRI-Stelle kloniert, was zu den Mehrfachkopien- Integrationsvektoren pMIRK7TΔ1, pMIRK7TΔ2 und pMIRK7TΔ3 (Fig. 38) führte. Die Mehrfachkopien-Integrationsvektoren wurden nach Linearisierung mit SacI in den K. marxianus-Stamm MSK 110 (a, URA-A, TRP1:URA3) (43) unter Anwendung des LiAc- Verfahrens (44) transformiert. Die Transformanten wurden auf den TRP+-Phänotyp selektiert. Die erhaltenen Integranten wurden unter nichtselektiven Bedingungen (0,67% Hefestickstoff base mit Amminosäuren, 2% Glucose, 30ºC) über 6-7, 30-35 und 60-70 Generationen herangezogen. Dies wurde durchgeführt, indem die Integranten auf eine OD 550 nm von 2 bis 3 herangezogen, in frisches nichtselektives Medium auf eine OD 550 nm von 0,1 verdünnt und anschließend auf eine OD 550 nm von 2 bis 3 herangezogen wurden. Dieser Cyclus wurde mehrere Male wiederholt. Aus diesen Integranten wurde die gesamte DNA isoliert (45), mit PstI verdaut und auf einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt, worauf eine Southern-Analyse unter Verwendung des EcoRI-PstI-Fragments der ribosomalen DNA von K. lactis (Fig. 37) als Sonde folgte. In Fig. 39 ist das mit dem Integranten von pMIRK7ΔT1 erhaltene Ergebnis gezeigt. In Spur 5 ist die Hybridisierung der rDNA-Sonde mit der verdauten chromosomalen DNA des Wirtsstamms gezeigt, die rDNA-Sonde hybridisiert mit den ± 150 wiederholten Kopien der rDNA-Einheit. In Spur 1 ist der pMIRK7ΔT1-Integrant gezeigt. Man kann wie für den Elternstamm die Hybridisierung mit den rDNA-Kopien sehen, aber zusätzlich die wiederholt integrierten Kopien des Mehrfachkopien-Integrationsvektors. Als Kontrolle ist das Hybridisierungsergebnis des linearisierten Mehrfachkopien- Integrationsvektors mit der rDNA-Sonde (Spur 6) gezeigt. Die relative Intensität des Hybridisierungssignals kann herangezogen werden, um die Kopienzahl des integrierten Vektors abzuschätzen. Das Hybridisierungssignal mit den rDNA-Einheiten entspricht ± 150 Kopien. Durch einen Vergleich der Intensität des Hybridisierungssignals der integrierten Kopien des Vektors mit der Intensität des Hybridisierungssignals mit den rDNA-Einheiten kann man abschätzen, daß die Kopienzahl mindestens 50 beträgt. Dieses Ergebnis zeigt, daß die Mehrfachkopien-Integration überraschenderweise auch in der Hefegattung Kluyveromyces erreicht werden kann. In Spur 2, 3 und 4 ist das Integrationsmuster nach nichtselektivem Wachstum des auch in Spur 1 verwendeten Mehrfachkopien-Integranten für 6-7, 30- 35 bzw. 60-70 Generationen gezeigt. Man kann deutlich sehen, daß die relative Intensität der Hybridisierungssignale mit dem integrierten Vektor nicht abnimmt. Dieser überraschende Befund beweist, daß die Mehrfachkopien-Integration sogar nach ausgedehntem Wachstum unter nichtselektiven Bedingungen vollständig stabil ist. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung der Mehrfachkopien-Integranten von pMIRK7ΔT2 und pMIRK7ΔT3 erhalten.
Dieses Beispiel zeigt deutlich, daß es möglich ist, eine Mehrfachkopien-Integration in Kluyveromyces unter Verwendung eines Mehrfachkopien-Integrationsvektors mit den zwei Vorbedingungen ribosomaler DNA-Sequenzen und eines defizienten Selektionsmarkers, in diesem Beispiel sogar eines heterologen Selektionsmarkers, zu erhalten. Die Mehrfachkopien Integranten sind mindestens 60 Generationen lang unter nichtselektiven Bedingungen stabil. Durch Analogie mit den Beispielen 8 und 13 kann die Herstellung eines Proteins in Kluyveromyces unter Verwendung von Mehrfachkopien-Integranten durch Insertion einer Expressionskassette mit einem ein Protein von kommerziellem Interesse codierenden Gen in den Mehrfachkopien-Integrationsvektor und Transformation des erhaltenen Vektors einschließlich der Expressionskassette erreicht werden. Diese Mehrfachkopien-Integranten können für die Herstellung des Proteins vön kommerziellem Interesse verwendet werden. Aufgrund der einzigartigen Eigenschaften des Mehrfachkopien-Integrationssystems, der hohen Kopienzahl und der hohen genetischen Stabilität, können diese Mehrfachkopien- Integrationstransformanten in jedem beliebigen bekannten Fermentationsherstellungsverfahren zur Herstellung eines kommerziell interessierenden Proteins verwendt werden.

LITERATURSTELLEN

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LEGENDEN DER FIGUREN

In den Figuren der verschiedenen Plasmide ist die Reihenfolge der Länge angegeben.
Figur 1: Schematische Zeichnung des das P. glumae- Lipasegen umfassenden Plasmids pUR6002.
Figur 2: Vollständige Nukleotidsequenz des P. glumae- Lipasegens; nähere Angaben im Text.
Figur 3: Schematische Zeichnung der Konstruktion von pUR6103; nähere Angaben im Text.
Figur 4: Schematische Zeichnung der Konstruktion der Plasmide pUR6107 und pUR610B; nähere Angaben im Text.
Figur 5:
A. Vollständige Nukleotidsequenz des synthetischen Lipasegens in pUR6038.
B. Nukleotidsequenz der 3'-flankierenden Region des synthetischen Lipasegens in pUR6600.
Figur 6: Beispiel der Konstruktion einer Kassette im synthetischen Lipasegen.
Figur 7: Schematische Zeichnung der Konstruktion des Plasmids pUR6131; nähere Angaben im Text.
Figur 8: Beispiel der verbesserten Beständigkeit einer mutierten Lipase in einem Detergentiensystem.
Figur 9: Schematische Zeichnung der Konstruktion des Plasmids pUR6801. Das Plasmid pUR6801 ist ein S. cerevisiae/E. coli-Shuttle-Vektor, der das synthetische Lipasegen mit Hefeexpressions- und Sekretionssequenzen umfaßt.
Figur 10: Westernanalyse der Lipaseexpression in S. cerevisiae unter Verwendung von pUR6801. Der entsprechende Blot wurde mit lipasespezifischen Antikörpern inkubiert. Standards: 1 µg und 0,25 µg P. glumae-Lipase.
SU10: Gesamtes intrazelluläres Protein des Wirtsstamms Sub.
TF17-Zellen: Gesamtes intrazelluläres Protein von mit pUR6801 transformiertem SU10.
TFL7-Überstand: Gesamtes extrazelluläres Protein von mit pUR6801 transformiertem SU10.
Figur 11: Schematische Zeichnung des Mehrfachkopien Integrationsvektors pUR2790.
Figur 12: Schematische Zeichnung der Konstruktion von pUR6803. Das Plasmid pUR6803 ist ein die Lipaseexpressionskassette umfassender Mehrfachkopien-Integrationsvektor.
Figur 13: Westernanalyse der Lipaseexpression von Mehrfachkopien-Integranten. Die Mehrfachkopien-Integranten wurden durch Transformierung des S. cerevisiae-Stamms SU50 mit dem Mehrfachkopien-Integrationsvektor pUR6803 erhalten; 7 unabhängige Mehrfachkopien-Integranten sind gezeigt. Der entsprechende Blot wurde mit lipasespezifischen Antikörpern inkubiert. Standards: 1 µg und 0,25 pg P. glumae Lipase.
SU50: Gesamtes intrazelluläres Protein des Wirtsstamms SU50.
1-7: Gesamtes intrazelluläres Protein von 7 unabhängigen Mehrfachkopien-Integranten.
Figur 14: Schematische Zeichnung des die α-Galactosidase-Expressionskassette umfassenden Mehrfachkopien-Integrationsvektors pUR2774.
Figur 15:
A. Schematische Zeichnung der genetischen organisation des ribosomalen DNA-Locus von S. cerevisiae.
B. Schematische Zeichnung der genetischen Organisation einer Mehrfachkopien-Integration von pUR2774 in den ribosomalen DNA-Locus von S. cerevisiae (Mehrfachkopien- Integrant SU50B).
Figur 16: Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel von unverdauter und BglII-verdauter Gesamt-DNA der Mehrfachkopien- Integranten SU50B und SU50C.
Figur 17: Southernblot von Gesamt-DNA von Mehrfachkopien-Integranten unter Verwendung der α-Galactosidase-Sonde.
SU50 * BglII: Elternstamm YT6-2-1 L (SU50), Gesamt-DNA, verdaut mit BglII.
C * BglII: Gesamt-DNA des Mehrfachkopien-Integranten SU50C, verdaut mit BglII.
B * BglII: Gesamt-DNA des Mehrfachkopien-Integranten SU50B, verdaut mit BglII.
Unverdaute Gesamt-DNA des Mehrfachkopien- Integranten SU50C.
Figur 18: Southernblot von Mehrfachkopien-Integranten unter Verwendung der ribosomalen DNA-Sonde.
SU50 * BglII: Elternstamm YT6-2-1 L (SU50), Gesamt-DNA, verdaut mit BglII.
C * BglII: Gesamt-DNA des Mehrfachkopien-Integranten SU50C, verdaut mit BglII.
* BglII: Gesamt-DNA des Mehrfachkopien-Integranten SU50B, verdaut mit BglII.
Unverdaute Gesamt-DNA des Mehrfachkopien- Integranten SU50.
Figur 19: Struktur des TRP1-Gens aus (32). [AT]: Poly(dA:dT)-Strecke, (UAS), Teil der allgemeinen Kontrolle, stromaufwärts gelegene Aktivierungsstelle. Die tatsächliche Sequenz ist für die putativen TATA-Elemente angedeutet. Die TRP1-codierende Sequenz ist durch den schwarzen Balken angedeutet. Die verschiedenen MRNA-Spezies sind durch die Pfeile angedeutet. Die Skalierung beruht auf Basenpaaren. Die zur Konstruktion der Promotordeletionen verwendeten Restriktionsstellen sind angedeutet.
Figur 20: Konstruktion der Plasmide pMIRY6-T±1, pMIRY6- T±2 und pMIRY6-T±3, die TRP-Allele mit verschiedenen Promoterdeletionen enthalten. Die für mehrere der Restriktionsstellen angegebenen Koordinaten zeigen deren Position bezüglich des ATG-Startcodons (wobei A die Position +1 ist) . Für jedes Plasmid ist die Position des 5'-Endes des TRP1-Gens angedeutet (-6, -30 oder -102). Eine detalliertere Karte des auf den verschiedenen pMIRY6-Plasmiden vorliegenden rDNA- Fragments ist oben rechts gezeigt. Der nicht-transkribierte rDNA-Spacer ist mit "N" abgekürzt.
Figur 21: Plasmidkopienzahl von pMIRY6-TΔ1-(Spuren 1 und 2), pMIRY6-TΔ2-(Spuren 3 und 4) und pMIRY6-TΔ3-(Spuren 5 und 6) Transformanten. Die Gesamt-DNA wurde aus den transformierten Zellen isoliert und mit EcoRI (im Fall von pMIRY6- TΔ1) und SacI (im Fall von pMIRY6-TΔ2 und pMIRYG-TΔ3) verdaut. Die Fragmente wurden durch Elektrophorese auf einem 0,8%igen Gel aufgetrennt. Die DNA wurde mit EtBr gefärbt. Die Plasmid- und die rDNA-Banden sind angegeben.
Figur 22: Konstruktion des ein URA3-Gen enthaltenden pMIRY7-UA, in dem ein Großteil des Promotors deletiert worden ist. Die für verschiedene der Restriktionsstellen angegebenen Koordinaten beziehen sich auf ihre Position bezüglich des ATG-Startcodons (wobei A die Positon +1 hat). Die Positon des 5'-Endes des URA3± ist angegeben (A16). Eine detailliertere Karte des auf pMIRY7-UΔ vorliegenden rDNA-Fragments ist oben rechts gezeigt. Der nicht-transkribierte Spacer ist mit "N" abgekürzt.
Figur 23: Plasmidkopienzahl von pMIRY7-UΔ-Transformanten. Gesamt-DNA wurde aus den transformierten Zellen isoliert und mit SacI verdaut. Die Fragmente wurden durch Elektrophorese auf einem 0,8%igen Gel aufgetrennt. Die 9,1 kb rDNA-Bande und die 6,4 kb-Plasmid-Bande sind angegeben.
Figur 24: Stabilität des Mehrfachkopien-Integranten SU50B in kontinuierlicher Kultur, nähere Angaben im Text.
Figur 25: Southernblot der mit BglII verdauten Gesamt- DNA des Mehrfachkopien-Integranten SU50B, isoliert in verschiedenen Stadien der kontinuierlichen Kultur.
SU50B 1: SU50B, gezogen im Schüttelkolben.
SU50B 2: SU50B zu Beginn der kontinuierlichen Kultur.
SU50B 3: SU50B nach Zugabe von Leucin.
Figur 26: Schematische Zeichnung der Konstruktionsroute des Lipaseexpressionsvektors für H. polymorpha pUR6880, pUR6881 und pUR6882. Jede einzelne Stufe der Konstruktionsroute ist in einer getrennten Zeichnung (Fig. 27 bis 34) gezeigt; nähere Angaben im Text.
Figur 27: Schematische Zeichnung von pUR6038.
Figur 28: Schematische Zeichnung von pUR6852.
Figur 29: Schematische Zeichnung von pUR3501.
Figur 30: Schematische Zeichnung von pUR6862.
Figur 31: Schematische Zeichnung von pUR3511.
Figur 32: Schematische Zeichnung von pUR6872.
Figur 33: Schematische Zeichnung von pUR3513.
Figur 34: Schematische Zeichnung von pUR6882.
Figur 35: Schematische Zeichnung des H. polymorpha- Mehrfachkopien-Integrationsvektors pUR3540, der die α- Galactosidase-Expressionskassette umfaßt. Alle verwendeten Restriktionsenzymerkennungsstellen sind mit einem Sternchen markiert.
Figur 36: Southern-Analyse der mit HindIII verdauten Gesamt-DNA des unter Verwendung von pUR3540 erhaltenen H. polymorpha-Mehrfachkopien-Integranten.
Spur 1: Mehrfachkopien-Integrant
Spur 2: Nichtransformierter Wirtsstamm.
Figur 37: Die klonierte ribosomale DNA von K. lactis ist gezeigt (42). Aus diesem Vektor wurde das angegebene Bam-HI-SacI-Fragment in pTZ19U (46) subkloniert. Aus dem erhaltenen Vektor wurde das EcoRI-Fragment zur Konstruktion von pMIRK7ΔT1, pMIRK7ΔT2 und pMIRK7ΔT3 verwendet. Das EcoRI- PstI-Fragment wurde als Sonde bei den Hybridisierungsversuchen verwendet.
Figur 38: Schematische Zeichnung der Mehrfachkopien Integrationsvektoren pMIRK7ΔT1, pMIRK7ΔT2 und pMIRK7ΔT3.
Figur 39: Hybridisierung verdauter chromosomaler DNA des Mehrfachkopien-Integranten nach Wachstum unter nichtselektiven Bedingungen mit einer ribosomalen DNA-Sonde. Spur 1-4: Mehrfachkopien-Integrant MIRK7ΔT1, Spur 5: Elternstamm MSK 110, Spur 6: linearisierter Mehrfachkopien-Integrationsvektor pMIRK7ΔT1. Die chromosomale DNA wurde zu Beginn des Versuches (Spur 1), nach 6-7 Generationen (Spur 2), nach 30- 35 Generationen (Spur 3) und nach 60-70 Generationen (Spur 4) isoliert.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins durch einen Fungus, der durch Mehrfachkopien-Integration eines Expressionsvektors in die ribosomale DNA des Fungus transformiert ist, umfassend Schritte, bei denen

- ein Fungus mit einem Expressionsvektor transformiert wird, der umfaßt:

a. ein ein DNA-Molekül umfassendes exprimierbares Gen, welches in der 5'-3'-Richtung in folgender Reihenfolge enthält:

a.1 einen in dem Fungus funktionsfähigen Promotor,

a.2 wahlweise ein ein Sekretionssignalpeptid codierendes DNA-Molekül, das die Sekretion des gewünschten Proteins aus dem Fungus erleichtert,

a.2 ein das gewünschte Protein codierendes erstes Strukturgen und

a.4 einen in dem Fungus funktionsfähigen Terminator,

b. ein einen defizienten Selektionsmarker, der für das Wachstum in einem spezifischen Medium notwendig ist, codierendes Gen, welches Gen einen Promotor und ein zweites, ein Polypeptid oder zweites Protein codierendes Strukturgen enthält,

c. genomische DNA, die die Integration des Expressionsvektors in mehreren Kopien in das Genom des Fungus ermöglicht,

und

- der transformierte Fungus mit einer Wachstumsgeschwindigkeit herangezogen wird, bei der die Aufnahme des essentiellen Bestandteils aus dem Medium durch die Funguszellen unzureichend ist und die intrazelluläre de novo-Synthese des essentiellen Bestandteils zur Erhaltung der Wachstumsgeschwindigkeit erforderlich ist,

- wobei Zellen mit Integranten hoher Kopienzahl gegenüber Zellen mit Integranten niedriger Kopienzahl bevorzugt unterhalten werden und

- die Produktion des Proteins gesteigert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das einen defizienten Selektionsmarker codierende Gen aus der aus einem LEU2d-Gen, einem TRP1d-Gen und einem URA3d-Gen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Fungus aus der aus den Hefegattungen Saccharomyces, Kluyveromyces und Hansenula und den schimmelpilzgattungen Aspergillus, Rhizopus und Trichoderma bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der transformierte Fungus auf einem nichtselektiven Medium gezüchtet wird, das alle für das Wachstum des Fungus notwendigen Bestandteile enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das nichtselektive Medium ein industriell angewandtes Wachstumsmedium ist, das aus der aus Molassen, Molke, Hefeextrakt und Gemischen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der transformierte Fungus das (die) für die Expression des gewünschten Proteins erforderliche(n) Gen(e) in multimerer Form auf einem seiner Chromosomen auf oder in unmittelbarer Verbindung mit einem eine ribosomale RNA codierenden Locus umfaßt, wobei auf dem gleichen Locus außerdem multimere Kopien eines defizienten Gens vorliegen, das ein im biochemischen Syntheseweg des essentiellen Bestandteils erforderliches Protein codiert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das exprimierbare Gen ein gewünschtes Protein codiert, das aus der aus Enzymen, hydrolytischen Enzymen, Lipasen und genetisch modifizierten Formen derartiger Enzyme bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Defizienz des Elternstamms durch Disruption oder Deletion aus dem Chromosom eines Gens erreicht wird, das ein im biosynthetischen Herstellungsweg des essentiellen Bestandteil wirksames Enzym codiert.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das Enzym, bezüglich dessen der Elternstamm defizient ist, eine Reaktion in einem Teil des Biosynthesepfads katalysiert, der bis zur Bildung des essentiellen Bestandteils nicht verzweigt ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der wesentliche Bestandteil eine Aminosäure, ein Nukleotid oder ein Vitamin ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die ribosomale DNA aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus in Schimmelpilzen der Gattungen Aspergillus, Rhizopus und Trichoderma vorkommenden ribosomalen DNAs und in Hefen der Gattungen Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula und Pichia vorkommenden ribosomalen DNAs besteht.

12. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Vektor etwa die gleiche Länge wie eine ribosomale DNA-Einheit des Fungus aufweist.

13. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Promotor aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

(i) dem Gal7-Promotor, dem GAPDH-Promotor und dem PGK- Promotor, falls der Fungus eine zur Gattung Saccharomyces gehörende Hefe ist,

(ii) dem Inulinase-Promotor, dem PGK-Promotor und dem LAC4-Promotor, falls der Fungus eine zur Gattung Kluyveromyces gehörende Hefe ist,

(iii) dem DHAS-Promotor und dem MOX-Promotor, falls der Fungus eine zur Gattung Hensenula gehörende Hefe ist,

(iv) dem Glucoamylase-Promotor, dem Glucoseoxidase- Promotor und dem GAPDH-Promotor, falls der Fungus ein zur Gattung Aspergillus gehörender Schimmelpilz ist und

(v) dem Cellulase-Promotor und dem GAPDH-Promotor, falls der Fungus ein zu einer der Gattungen Rhizopus und Trichoderma gehörender Schimmelpilz ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das gewünschte Protein eine Oxidase ist und der Fungus zu einer der Gattungen Hensenula, Pichia und Aspergillus gehört.

15. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das das gewünschte Protein codierende Strukturgen die leichte oder schwere Kette eines Immunoglobulins oder beide Gene oder einen Teil der leichten oder schweren Kette eines Immunoglobulins oder den Teil, der ein FAB-Fragment codiert, oder den Teil hiervon, der die variablen Regionen codiert, codiert.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das Gen (oder die Gene) durch genetische Manipulation modifiziert sind, die zu modifizierten Immunoglobulinen oder Immunoglobulinen mit katalytischer Aktivität (Abzymen) führt.

17. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Expressionsvektor zusätzlich ein ein Enzym codierendes defizientes Gen enthält, das disruptiert oder aus dem Chromosom des Fungus deletiert worden ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das defiziente Gen ein Enzym codiert, das im biosynthetischen Herstellungsweg eines essentiellen Bestandteils, ausgewählt aus der eine Aminosäure, ein Nukleotid und ein Vitamin umfassenden Gruppe, wirksam ist.

19. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Verfahren aus der aus einer normalen Batch-Fermentation, einer semikontinuierlichen Fermentation und einer kontinuierlichen Fermentation bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem das Medium den essentiellen Bestandteil in solcher Konzentration enthält, daß mindestens 20, vorzugsweise mindestens 50, Kopien des defizienten Gens auf dem Chromosom aufrechterhalten werden, welches defiziente Gen ein an der Biosynthese dieses essentiellen Bestandteils beteiligtes Enzym codiert.

21. Verfahren nach Anspruch 20, bei dem die Wachstumsgeschwindigkeit des Fungus zwischen 20 und 100%, vorzugsweise zwischen 80 und 100%, der maximalen Wachstumsgeschwindigkeit eines ähnlichen Fungus liegt, der bezüglich des essentiellen Bestandteils nicht defizient ist, wenn der ähnliche Fungus unter den gleichen Fermentationsbedingungen herangezogen wird.