DE69428719T2 - Für das yap3 signalpeptid kodierendes dna-konstrukt - Google Patents
Für das yap3 signalpeptid kodierendes dna-konstruktInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein DNA-Konstrukt, welches das YAP3- Signalpeptid zur Sekretion eines heterologen Polypeptids umfaßt, eine Hefezelle, welche das DNA-Konstrukt enthält, und ein Verfahren zur Herstellung heterologer Polypeptide in Hefe von dem DNA-Konstrukt.
- Hefeorganismen produzieren eine Reihe von Proteinen, welche intrazellulär synthetisiert werden, jedoch eine Funktion außerhalb der Zelle besitzen. Solche extrazellulären Proteine werden als sekretierte Proteine bezeichnet. Diese sekretierten Proteine werden zunächst innerhalb der Zelle in einer Vorläufer- oder einer Präproteinform exprimiert, die eine Präsequenz enthält, welche die effektive Leitung des exprimierten Produkts durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) sicherstellt. Die Präsequenz, normalerweise als Signalpeptid bezeichnet, wird während der Translokation vom Rest des Proteins abgespalten. Nachdem das Protein in den sekretorischen Stoffwechselweg eingetreten ist, wird es zum Golgi-Apparat transportiert. Vom Golgi kann das Protein verschiedenen Routen folgen, welche zu Kompartimenten wie der Zellvakuole oder der Zellmembran führen, oder es kann aus der Zelle herausgeführt werden, um in das externe Medium sekretiert zu werden (Pfeffer, S. R. und Rothman, J. E., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987), 829-852).
- Zur Expression und Sekretion von für Hefe heterologen Proteinen in Hefe wurden mehrere Vorgehensweisen vorgeschlagen. Die veröffentlichte europäische Patentanmeldung Nr. 88 632 beschreibt ein Verfahren, mit dem für Hefe heterologe Proteine exprimiert, prozessiert und sekretiert werden, indem ein Hefeorganismus mit einem Expressionsvehikel, welches für das gewünschte Protein und ein Signalpeptid kodierende DNA beherbergt, transformiert wird, eine Kultur des transformierten Organismus hergestellt wird, die Kultur gezüchtet und das Protein aus dem Kulturmedium gewonnen wird. Das Signalpeptid kann das Signalpeptid des gewünschten Proteins selbst, ein heterologes Signalpeptid oder ein Hybrid eines nativen und heterologen Signalpeptids sein.
- Ein Problem, das bei der Verwendung von für Hefe heterologen Signalpeptiden auftaucht, könnte darin bestehen, daß das heterologe Signalpeptid keine effiziente Translokation und/oder Spaltung nach dem Signalpeptid gewährleistet.
- Der S. cerevisiae-MFα1 (α-Faktor) wird als eine Präpro-Form von 165 Aminosäuren, umfassend ein Signal- oder Präpeptid von 19 Aminosäuren, gefolgt von einem "Leader"- oder Propeptid von 64 Aminosäuren, welche drei N-verknüpfte Glykosylierungsstellen, gefolgt von (LysArg (Asp/Glu, Ala)&sub2;&submin;&sub3;α-Faktor)&sub4;, umfaßt (Kurjan, J. und Herskowitz, L, Cell 30 (1982), 933-943), synthetisiert. Der Signal- Leader-Abschnitt des PräproMFα1 wurde in großem Umfang eingesetzt, um die Synthese und Sekretion heterologer Proteine in S. cerevisiae zu erzielen.
- Die Verwendung von Signal/Leader-Peptiden, die für Hefe homolog sind, ist u. a. aus der US-Patentschrift Nr. 4,546,082, den veröffentlichten europäischen Patentanmeldungen Nr. 116 201, 123 294, 123 544, 163 529 und 123 289, der dänischen Patentanmeldung Nr. 3614/83 aus WO-A-8702670 und J. Cell. Biochem., Vol. 12, 1988 bekannt.
- In EP 123 289 wird die Nutzung des S. cerevisiae-a-Faktor-Vorläufers beschrieben, wohingegen WO 84/01153 die Nutzung des Saccharomyces cerevisiae- Invertase-Signalpeptids und DK 3614/83 die Nutzung des Saccharomyces cerevisiae-PH05-Signalpeptids zur Sekretion fremder Proteine offenbart.
- Die US-Patentschrift Nr. 4,546,082, EP 16 201, 123 294, 123 544 und 163 529 beschreiben Verfahren, mit denen der α-Faktor-Signal-Leader von Saccharomyces cerevisiae (MFα1 oder MFα2) im Sekretionsprozeß exprimierter heterologer Proteine in Hefe genutzt wird. Durch Fusionierung einer DNA-Sequenz, welche für die S. cerevisiae-MFα1-Signal/Leader-Sequenz kodiert, mit dem 5'-Ende des Gens für das gewünschte Protein wurde Sekretion und Prozessierung des gewünschten Proteins demonstriert.
- Eine Reihe sekretierter Proteine werden so geleitet, daß sie einem proteolytischen Prozessierungssystem ausgesetzt sind, welches das an das Carboxyende von zwei aufeinanderfolgenden basischen Aminosäuren gebundene Peptid abspalten kann. Diese enzymatische Aktivität wird in S. cerevisiae von dem KEX 2-Gen kodiert (Julius, D. A. et al., Cell 37 (1984b), 1075). Die Prozessierung des Produkts durch das KEX 2-Genprodukt ist zur Sekretion des aktiven S. cerevisiae-Mating-Faktors α (MFα oder α-Faktor) erforderlich, ist jedoch nicht an der Sekretion von aktivem S. cerevisiae-Mating-Faktor a beteiligt.
- Die Verwendung des Maus-Speichelamylase-Signalpeptids (oder einer Mutante davon), um für die Sekretion von in Hefe exprimierten heterologen Proteinen zu sorgen, wurde in WO 89/02463 und WO 90/10075 beschrieben. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer effizienteren Expression und/oder Sekretion von heterologen Proteinen in Hefe.
- Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß das Signalpeptid der Hefe- Asparaginsäureprotease 3 in der Lage ist, eine verbesserte Sekretion von in Hefe exprimierten Proteinen im Vergleich zu dem Maus-Speichelamylase-Signalpeptid zu ergeben.
- Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein DNA-Konstrukt, umfassend die folgende Sequenz
- 5'-P-SP-(LP)n-PS-HP-3'
- worin
- P eine Promotorsequenz ist,
- SP eine DNA-Sequenz ist, welche für das Hefe-Asparaginsäureprotease 3
- (YAP3)-Signalpeptid kodiert,
- LP eine DNA-Sequenz ist, welche für ein Leader-Peptid kodiert,
- n 0 oder 1 ist,
- PS eine DNA-Sequenz ist, welche für ein Peptid kodiert, das eine Hefe- Prozessierungsstelle definiert, und
- HP eine DNA-Sequenz ist, welche für ein Polypeptid kodiert, das für einen ausgewählten Wirtsorganismus heterolog ist.
- Der Begriff "Signalpeptid" soll eine Präsequenz bedeuten, welche vorwiegend hydrophober Natur ist und als N-terminale Sequenz der Vorläuferform eines in Hefe exprimierten extrazellulären Proteins vorliegt. Die Funktion des Signalpeptids besteht darin, dem heterologen Protein zu erlauben, sekretiert zu werden, um in das endoplasmatische Retikulum einzutreten. Das Signalpeptid wird im Verlauf dieses Prozesses abgespalten. Die YAP3-Signalsequenz, in Fusion mit ihrem nativen Gen, wurde bereits mitgeteilt (vgl. M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, S. 127-137). Ein DNA-Konstrukt, worin die YAP3-Signalsequenz mit einer DNA- Sequenz fusioniert ist, welche für ein heterologes Polypeptid kodiert, wird für neu gehalten. Von dem YAP3-Signalpeptid wurde bisher nicht berichtet, daß es eine effiziente Sekretion von heterologen Polypeptiden in Hefe liefert.
- Im vorliegenden Kontext soll der Begriff "Leader-Peptid" ein Peptid bezeichnen, dessen Funktion darin besteht, dem heterologen Polypeptid zu erlauben, vom endoplasmatischen Retikulum zum Golgi-Apparat und weiter zu einem sekretorischen Vesikel zur Sekretion in das Medium geleitet zu werden (d. h., Export des exprimierten Polypeptids durch die Zellwand oder mindestens durch die zelluläre Membran in den periplasmatischen Raum der Zelle).
- Der Begriff "heterologes Polypeptid" soll ein Polypeptid bezeichnen, welches von dem Wirts-Hefeorganismus in der Natur nicht produziert wird.
- In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen rekombinanten Expressionsvektor, welcher das DNA-Konstrukt der Erfindung umfaßt.
- In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zelle, welche mit dem rekombinanten Expressionsvektor der Erfindung transformiert ist.
- In einem noch weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Polypeptids, wobei das Verfahren umfaßt die Kultivierung einer Zelle, welche zur Expression eines heterologen Polypeptids in der Lage ist und welche mit einem DNA-Konstrukt der Erfindung transformiert ist, in einem geeigneten Medium, um die Expression und Sekretion des heterologen Polypeptids zu erhalten, wonach das heterologe Polypeptid aus dem Medium gewonnen wird.
- In einer speziellen Ausführungsform wird das YAP3-Signalpeptid von der folgenden DNA-Sequenz
- ATG AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TCA CTC
- TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC (SEQ-ID-Nr. 1)
- oder einer geeigneten Modifikation davon, kodierend für ein Peptid mit einem hohen Homologiegrad (mindestens 60%, bevorzugter mindestens 70% Sequenzidentität) zu dem YAP3-Signalpeptid, kodiert. Beispiele "geeigneter Modifikationen" sind Nukleotidsubstitutionen, welche nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz des Peptids führen, sondern welche der Codonverwendung des Hefeorganismus, in den die DNA-Sequenz eingeführt wird, entsprechen können, oder Nukleotidsubstitutionen, welche zu einer unterschiedlichen Aminosäuresequenz des Peptids führen (obwohl die Aminosäuresequenz nicht bis zu dem Grad modifiziert werden sollte, daß sie nicht länger in der Lage ist, als Signalpeptid zu dienen). Andere Beispiele möglicher Modifikationen sind die Insertion von drei oder Mehrfachen von drei Nukleotiden an irgendeinem Ende oder innerhalb der Sequenz oder eine Deletion von drei oder Mehrfachen von drei Nukleotiden an irgendeinem Ende oder innerhalb der Sequenz.
- In der Sequenz 5'-P-SP-(LP)n-PS-HP-3' ist n vorzugsweise 1. Mit anderen Worten, obwohl das YAP3-Signalpeptid in einigen Fällen selbst eine Sekretion und/oder Prozessierung des heterologen Polypeptids ergeben kann, ist vorzugsweise eine Leader- oder Propeptid-Sequenz vorhanden. Der Leader kann ein Hefe-MFα1-Leader-Peptid oder ein synthetisches Leader-Peptid sein, z. B. eines der in WO 89/02463 oder WO 92/11378 offenbarten Leader-Peptide oder ein Derivat davon, welches zur Bewirkung der Sekretion eines heterologen Polypeptids in Hefe in der Lage ist. Der Begriff "synthetisch" soll anzeigen, daß die fraglichen Leader-Peptide nicht in der Natur gefunden werden. Synthetische Hefe-Leader- Peptide können beispielsweise nach den in WO 89/02463 oder WO 92/11378 beschriebenen Verfahren konstruiert werden.
- Die Hefe-Prozessierungsstelle, die von der DNA-Sequenz PS kodiert wird, kann geeigneterweise jede gepaarte Kombination von Lys und Arg sein, wie z. B. Lys- Arg, Arg-Lys, Lys-Lys oder Arg-Arg, welche die Prozessierung des heterologen Polypeptids durch die KEX2-Protease von Saccharomyces cerevisiae oder die äquivalente Protease in anderen Hefespezies erlaubt (D. A. Julius et al., Cell 37, 1984, 1075 ff.). Falls die KEX2-Prozessierung nicht günstig ist, z. B. zu einer Spaltung des Polypeptidprodukts führen würde, kann stattdessen eine Prozessierungsstelle für eine andere Protease gewählt werden, die eine Aminosäurekombination umfaßt, welche in dem Polypeptidprodukt nicht vorgefunden wird, z. B. die Prozessierungsstelle für FXa, Ile-Glu-Gly-Arg (vgl. Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
- Das heterologe Protein, welches nach dem Verfahren der Erfindung produziert wird, kann jedes Protein sein, welches vorteilhafterweise in Hefe produziert werden könnte. Beispiele solcher Proteine sind Aprotinin, Gewebefaktor- Reaktionsweg-Inhibitor oder andere Protease-Inhibitoren, Insulin oder Insulinvorläufer, Human- oder Rinderwachstumshormon, Interleukin, Glucagon, Gewebeplasminogenaktivator, transformierender Wachstumsfaktor α oder β, Thrombozyten-Wachstumsfaktor, Enzyme oder ein funktionelles Analogon davon. Im vorliegenden Kontext soll der Begriff "funktionelles Analogon" ein Polypeptid mit einer ähnlichen Funktion wie das native Protein bezeichnen (dies soll sich eher auf die Art als das Niveau der biologischen Aktivität des nativen Proteins beziehen). Das Polypeptid kann dem nativen Protein strukturell ähnlich sein und kann von dem nativen Protein durch Addition einer oder mehrerer Aminosäure(n) an entweder das C- oder das N-terminale Ende oder an beide Enden des nativen Proteins, Substitution einer oder mehrerer Aminosäure(n) an einer oder einer Reihe unterschiedlicher Stelle(n) in der nativen Aminosäuresequenz, Deletion einer oder mehrerer Aminosäure(n) an einem oder beiden Ende(n) des nativen Proteins oder an einer oder mehreren Stelle(n) in der Aminosäuresequenz, oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäure(n) an einer oder mehreren Stelle(n) in der nativen Aminosäuresequenz abgeleitet sein. Solche Modifikationen sind für mehrere der oben genannten Proteine wohlbekannt.
- Das DNA-Konstrukt der Erfindung kann synthetisch nach etablierten Standardverfahren hergestellt werden, z. B. dem von S. L. Beaucage und M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, S. 1859-1869, beschriebenen Phosphoamidit- Verfahren oder dem von Matthes et al., EMBO Journal 3, 1984, S. 801-805, beschriebenen Verfahren. Gemäß dem Phosphoamidit-Verfahren werden Oligonukleotide synthetisiert, z. B. in einem automatischen DNA-Synthesizer, gereinigt, verschmolzen, ligiert und in den Hefe-Expressionsvektor kloniert. Es sollte angemerkt werden, daß die Sequenz 5'-P-SP-(LP)n-PS-HP-3' nicht in einem einzigen Schritt hergestellt werden muß, sondern aus zwei oder mehr Oligonukleotiden, die synthetisch auf diese Weise hergestellt wurden, zusammengebaut werden kann.
- Ein oder mehrere Teil(e) der DNA-Sequenz 5'-P-SP-(LP)n-PS-HP-3' kann/können auch genomischen oder cDNA-Ursprungs sein, beispielsweise durch Erstellung einer genomischen Bank oder cDNA-Bank und Screening auf DNA-Sequenzen, die für diese Teile (typischerweise HP) kodieren, durch Hybridisierung unter Einsatz synthetischer Oligonukleotid-Sonden gemäß Standardtechniken (vgl. Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989) erhalten. In diesem Fall kann eine genomische oder cDNA-Sequenz, die für ein Signalpeptid kodiert, mit einer genomischen oder cDNA-Sequenz die für das heterologe Protein kodiert, verknüpft werden, wonach die DNA-Sequenz durch die Insertion von synthetischen Oligonukleotiden, die für die Sequenz 5'-P-SP-(LP)n-PS-HP-3' kodieren, gemäß wohlbekannten Verfahren modifiziert werden kann.
- Schließlich kann die DNA-Sequenz S'-P-SP-(LP)n-PS-HP-3' gemischten synthetischen und genomischen Ursprungs, gemischten synthetischen und cDNA- Ursprungs oder gemischten genomischen und cDNA-Ursprungs sein, hergestellt, indem Fragmente synthetischen, genomischen oder cDNA-Ursprungs (wie angebracht), wobei die Fragmente verschiedenen Teilen der gesamten DNA-Sequenz entsprechen, gemäß Standardverfahren fusioniert werden. So kann in Betracht gezogen werden, daß die DNA-Sequenz, die für das Signalpeptid oder das heterologe Polypeptid kodiert, genomischen oder cDNA-Ursprungs sein kann, während die Sequenz 5'-P-SP-(LP)n-PS synthetisch hergestellt sein kann.
- Der rekombinante Expressionsvektor, welcher die Sequenz 5'-P-SP-(LP)n-PS-HP- 3' trägt, kann jeder Vektor sein, der zur Replikation in Hefeorganismen in der Lage ist. In dem Vektor kann die Promotorsequenz (P) jede DNA-Sequenz sein, welche transkriptionale Aktivität in Hefe zeigt, und kann von Genen stammen, welche für Proteine kodieren, die für Hefe entweder homolog oder heterolog sind. Der Promotor stammt vorzugsweise von einem Gen, das für ein für Hefe homologes Protein kodiert. Beispiele geeigneter Promotoren sind die MFα1-, TPI-, ADH I-, ADH II- oder PGK-Promotoren von Saccharomyces cerevisiae, oder entsprechende Promotoren aus anderen Hefespezies, z. B. Schizosaccharomyces pombe. Beispiele geeigneter Promotoren werden beispielsweise von Russell und Hall, J. Biol. Chem. 258, 1983, S. 143-149; Russell, Nature 301, 1983, S. 167-169; Ammerer, Meth. Enzymol. 101, 1983, S. 192-201; Russell et al., J. Biol. Chem. 258, 1983, S. 2674-2682; Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 225, 1980, S. 12073-12080; Kawasaki und Fraenkel, Biochem. Biophys. Res. Comm. 108, 1982, und T. Alber und G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, S. 419-434, beschrieben.
- Die oben genannten Sequenzen sollten auch funktionsfähig mit einem geeigneten Terminator, z. B. dem TPI-Terminator (vgl. T. Alber und G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, S. 419-434) oder dem Hefe-CYC1-Terminator, verknüpft sein.
- Der rekombinante Expressionsvektor der Erfindung umfaßt ferner eine DNA- Sequenz, welche dem Vektor die Replikation in Hefe ermöglicht. Beispiele solcher Sequenzen sind die Replikationsgene REP 1-3 und der Replikationsursprung des Hefe-Plasmids 2u. Der Vektor kann auch einen selektierbaren Marker umfassen, z. B. das Schizosaccharomyces pombe-TPI-Gen wie von P. R. Russell, Gene 40, 1985, S. 125-130, beschrieben, oder das Hefe-URA3-Gen.
- Die eingesetzten Verfahren, um die Sequenz 5'-P-SP-(LP)n-PS-HP-3' in einen geeigneten Hefevektor einzuführen, der die zur Hefereplikation erforderliche Information enthält, sind Fachleuten wohlbekannt (vgl. beispielsweise Sambrook, Fritsch und Maniatis, oben zitiert). Es versteht sich, daß der Vektor konstruiert werden kann, indem entweder zuerst ein DNA-Konstrukt, welches die gesamte Sequenz enthält, hergestellt wird und anschließend dieses Fragment in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert wird oder indem nacheinander DNA- Fragmente, die genetische Informationen für die individuellen Elemente enthalten (wie z. B. die Promotorsequenz, die Signalsequenz, die Leader-Sequenz oder DNA, die für das heterologe Polypeptid kodiert), inseriert werden, gefolgt von der Ligierung.
- Der mit dem Vektor der Erfindung transformierte Hefeorganismus kann jeder geeignete Hefeorganismus sein, welcher bei Kultivierung große Mengen des fraglichen heterologen Polypeptids produziert. Beispiele geeigneter Hefeorganismen können Stämme von Saccharomyces, wie z. B. Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri oder Saccharomyces uvarum, Schizosaccharomyces, wie z. B. Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces, wie z. B. Kluyveromyces lactis, Yarrowia, wie z. B. Yarrowia lipolytica, oder Hansenula, wie z. B. Hansenula polymorpha, sein. Die Transformation der Hefezellen kann beispielsweise durch Protoplastenbildung, gefolgt von Transformation, in an sich bekannter Weise bewirkt werden.
- Das zur Kultivierung der Zellen verwendete Medium kann jedes herkömmliche Medium sein, das zur Züchtung von Hefeorganismen geeignet ist. Das sekretierte heterologe Protein, von dem ein signifikanter Anteil in korrekt prozessierter Form in dem Medium vorliegen wird, kann aus dem Medium durch herkömmliche Verfahren, einschließlich Abtrennung der Hefezellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Präzipitation der proteinhaltigen Komponenten des Überstands oder Filtrats mit Hilfe eines Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, gefolgt von Reinigung mittels einer Vielfalt von Chromatographieverfahren, z. B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder dgl., gewonnen werden.
- Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher beschrieben, worin
- Fig. 1A und 1B schematisch die Konstruktion des Plasmids pLAC257 zeigen;
- Fig. 2 die DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des EcoRI-XbaI- Inserts in pLaC257 zeigt (SEQ-ID-Nr. 2);
- Fig. 3A und 3B schematisch die Konstruktion des Plasmids pLaC242Apr zeigen;
- Fig. 4 die DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des EcoRI-XbaI- Fragments von pAPRSc 1 zeigt, wobei die kursiv dargestellte Proteinsequenz von dem zufällig ausgewählten expressionsklonierten DNA-Fragment stammt (SEQ- ID-Nr. 4);
- Fig. 5 schematisch die Konstruktion des Plasmids pLaC263 zeigt;
- Fig. 6 die DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des EcoRI-XbaI- Tragments von pLaC263 zeigt (SEQ-ID-Nr. 6);
- Fig. 7A und 7B die DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des humanen Gewebefaktor-Reaktionsweg-Inhibitors (TFPI), einschließlich seines nativen Signalpeptids, zeigen (SEQ-ID-Nr. 8);
- Fig. 8A die DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des spx3- Signalpeptids und 212-Leader-Peptids (in WO 89/02463 gezeigt), N-terminal mit der TFPI-Sequenz in dem Plasmid pYES-212TFPI161-117Q fusioniert, zeigt (SEQ-ID-Nr. 10);
- Fig. 8B die DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des YAP3- Signalpeptids und 212-Leader-Peptids, N-terminal mit der TFPI-Sequenz in dem Plasmid pYES-ykTFPI161-117Q fusioniert, zeigt (SEQ-ID-Nr. 12); und
- Fig. 9 Restriktionskarten der Plasmide pYES21, pP-212TFPI161-117Q, pYES- 212TFPI161-117Q und pYES-ykTFPI161-117Q zeigt.
- Die Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen erläutert, welche den Umfang der beanspruchten Erfindung in keiner Weise beschränken sollen.
- Alle Expressionsplasmide enthalten 2 u-DNA-Sequenzen zur Replikation in Hefe und verwenden entweder das S. cerevisiae-URA3-Gen oder das Schizosaccharomyces pombe-Triosephosphatisomerase-Gen (POT) als selektierbare Marker in Hefe. POT-Plasmide werden in der EP-Patentanmeldung Nr. 171 142 beschrieben. Ein Plasmid, welches das POT-Gen enthält, ist von einem hinterlegten E. coli-Stamm (ATCC 39685) erhältlich. Die POT-Plasmide enthalten ferner den 5. cerevisiae-Triosephosphatisomerase-Promotor und -Termina-tor (PTPI und ITPI). Sie sind mit pMT742 (M. Egel-Mitani et al., Gene 73, 1988, S. 113-120) identisch (siehe Fig. 1), mit Ausnahme des durch die Sph-XbaI-Restriktionsstellen definierten Bereichs, umfassend den PTPI und den kodierenden Bereich für Signal/Leader/Produkt. Die URA3-Plasmide verwenden PTPI und den Iso-I- Cytochrom-C-Terminator (Tcycl).
- Der PTPI wurde gegenüber der in pMT742 gefundenen Sequenz modifiziert, lediglich um die Konstruktionsarbeit zu erleichtern. Eine interne SphI- Restriktionsstelle wurde durch SphI-Spaltung, Entfernung von einzelsträngigen Enden und erneute Ligierung eliminiert. Ferner wurden DNA-Sequenzen, die stromaufwärts des Promotors liegen und keinen Einfluß darauf haben, durch Bal31-Exonukleasebehandlung, gefolgt vom Hinzufügen eines SphI- Restriktionsstellen-Linkers, entfernt. Diese Promotorkonstruktion, die auf einem 373-bp-SphI-EcoRI-Fragment vorliegt, wird als PTPIS bezeichnet und bei Einsatz in bereits beschriebenen Plasmiden wird diese Promotormodifikation durch das Hinzufügen eines δ zu der Plasmidbezeichnung angezeigt.
- Schließlich wurde eine Reihe von synthetischen DNA-Fragmenten eingesetzt, von denen alle mit einem automatischen DNA-Synthesizer (Applied Biosystems Modell 380A) unter Einsatz von Phosphoramidit-Chemie und kommerziell erhältlichen Reagenzien synthetisiert wurden (S. L. Beaucage und M. H. Caruthers (1981), Tetrahedron Letters 22, 1859-1869). Die Oligonukleotide wurden mittels Polyacrylamidgelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen gereinigt. Vor der Verschmelzung von komplementären Paaren solcher DNA-Einzelstränge wurden diese mittels T4-Polynukleotidkinase und ATP einer Kinasebehandlung unterzogen.
- Alle anderen eingesetzten Verfahren und Materialien sind allgemeiner Stand der Technik (J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
- Das modifizierte Maus-Speichelamylase-Signalpeptid (MSA3SP) (beschrieben in WO 89/02463) der Expressionskassette des Plasmids pLSC6315D3 (beschrieben in Beispiel 3 von WO 92/11378), welches eine DNA-Sequenz enthält, die für den Insulinvorläufer MI3 (B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)) kodiert, wurde in den folgenden Schritten durch das YAP-3-Signalpeptid ersetzt:
- Ein Konstrukt für den leichten Austausch von Signalpeptiden wurde hergestellt. Durch stellengerichtete Mutagenese wurde eine Asp718-Stelle gerade vor dem Signal-Initiationscodon in pLaC196δ (vgl. WO 89/02463, Fig. 5) mit dem Doppelprimer-Verfahren unter Einsatz eines mutagenen Primers NOR494 eingeführt:
- wobei fett gedruckte Buchstaben Mutationen anzeigen und die unterstrichene Sequenz das Initiationscodon anzeigt.
- Das resultierende Plasmid wurde als pLaC196δ-Asp718 bezeichnet (siehe Fig. 1).
- Die Nukleotidsequenz des Bereichs, welcher die Verbindungsstelle zwischen dem Signalpeptid und dem Leader-Peptid der Expressionskassette in pLSC6315D3 umfaßt, wurde modifiziert, indem das Apa1-HgiAI-Restriktionsfragment durch eine synthetische DNA-Folge, NOR 2521/2522, ersetzt wurde:
- Das resultierende Plasmid wurde als pLSC6315D3R bezeichnet (siehe Fig. 1).
- Das SphI-Asp718-Fragment von pLaC 196δ-Asp718 wurde ligiert mit einem Sph1-Mlu1-geschnittenen Plasmid pLSC6315D3R und einer synthetischen Folge von DNA, welche für das YAP3-Signalpeptid kodiert:
- Das resultierende Plasmid pLaC257 besteht im wesentlichen aus pLSC6315D3, worin das MSA3-Signalpeptid durch das YAP3-Signalpeptid ersetzt wurde (siehe Fig. 2).
- Hefe-Transformation: Der S. cerevisiae-Stamm MT663 (E2-7B XE11-36 a/α, Δtpi/Δtpi, pep 4-3/pep 4-3) (der Hefestamm MT663 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen in Verbindung mit der Einreichung von WO 92/11378 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer DSM 6278) wurde auf YPGaL (1% Bacto-Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Galactose, 1% Lactat) bis zu einer OD von 0,6 bei 600 nm gezüchtet.
- 100 ml der Kultur wurden mittels Zentrifugation geerntet, mit 10 ml Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und in 10 ml einer Lösung, enthaltend 1,2 M Sorbit, 25 mM Na&sub2;EDTA, pH = 8,0, und 6,7 mg/ml Dithiothreitol, erneut suspendiert. Die Suspension wurde 15 Minuten lang bei 30ºC inkubiert, zentrifugiert und die Zellen in 10 ml einer Lösung resuspendiert, die 1,2 M Sorbit, 10 mM Na&sub2;EDTA, 0,1 M Natriumcitrat, pH = 5,8, und 2 mg Novozym® 234 enthielt. Die Suspension wurde 30 Minuten lang bei 30ºC inkubiert, die Zellen wurden mittels Zentrifugation gewonnen, in 10 ml 1,2 M Sorbit und 10 ml CAS (1,2 M Sorbit, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl (Tris = Tris(hydroxymethyl)-aminomethan), pH = 7,5) gewaschen und in 2 ml CAS resuspendiert. Zur Transformation wurden 1 ml CAS-suspendierter Zellen mit etwa 0,1 ug des Plasmids pLaC257 gemischt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur belassen. 1 ml von (20% Polyethylenglycol 4000, 20 mM CaCl&sub2;, 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5) wurde zugegeben und die Mischung weitere 30 Minuten lang bei Raumtemperatur belassen. Die Mischung wurde zentrifugiert und das Pellet in 0,1 ml SOS (1,2 M Sorbit, 33% Vol./Vol. YPD, 6,7 mM CaCl&sub2;, 14 ug/ml Leucin) resuspendiert und 2 h lang bei 30ºC inkubiert. Die Suspension wurde dann zentrifugiert und das Pellet in 0,5 ml 1,2 M Sorbit resuspendiert. Dann wurden 6 ml Top-Agar (das SC-Medium von Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), enthaltend 1,2 M Sorbit plus 2,5% Agar) bei 52ºC zugegeben und die Suspension auf Platten gegossen, welche dasselbe, durch Agar verfestigte, sorbithaltige Medium enthielten.
- Transformantenkolonien wurden nach 3 Tagen bei 30ºC gepickt, erneut isoliert und zur Initiierung von Flüssigkulturen verwendet. Eine Transformante wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt.
- Fermentation: Der Hefestamm MT663, transformiert mit dem Plasmid pLaC257 wurde auf YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton (von Difco Laboratories) und 3% Glucose) gezüchtet. Eine 1-Liter-Kultur des Stamms wurde bei 30ºC zu einer optischen Dichte von 24 bei 650 nm geschüttelt. Nach Zentrifugation wurde der Überstand isoliert.
- MT663-Zellen, transformiert mit dem Plasmid pLSC6315D3 und kultiviert wie oben beschrieben, wurden für einen Vergleich der Ausbeuten an MI3-Insulinvorläufer eingesetzt. Die Ausbeuten an MI3 wurden direkt mit den Kulturüberständen nach dem Verfahren von Snel, Damgaard und Mollerup, Chromatographia 24, 1987, S. 329-332, bestimmt. Die Ergebnisse sind im folgenden dargestellt.
- pSLC63.15D3 (Msa3SP) 100%
- pLaC257 (YAP3) 120%
- Das Plasmid pLSC6315D3 wurde in zwei Schritten modifiziert. Zuerst wurde das MSA3-Signalpeptid durch das spx3-Signalpeptid ersetzt, indem das Sph1-Apa1- Fragment gegen das analoge Fragment aus pLaC212spx3 (vgl. WO 89/02463) ausgetauscht wurde. Aus dem resultierenden Plasmid pSLC63.15spx3 wurde ein 302 bp langes EcoR1-Dde1-Fragment isoliert und mit dem 204 bp langen Nco1- Xbal-Fragment von pKFN1003 (WO 90/10075), enthaltend die für Aprotinin kodierende DNA-Sequenz, über eine synthetische Linker-DNA, NOR2101/2100 (siehe Fig. 3), fusioniert.
- NOR2101: 5'-T AAC GTC GC (SEQ-ID-Nr. 19)
- NOR2100: 5'-CAT GGC GAC G (SEQ-ID-Nr. 20)
- Das resultierende Plasmid, pLaC242-Apr (siehe Fig. 3), wurde mit Cla1 gespalten, dephosphoryliert und bei der Klonierung von zufällig ausgewählten 5'-CG- Überhang-Fragmenten von DNA, isoliert aus dem S. cerevisiae-Stamm MT663, nach der Beschreibung in WO 92/11378 eingesetzt. Die Transformation und Fermentation des Hefestamms MT663 wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
- Aus der resultierenden Bank wurden Hefe-Transformanten, die das Plasmid pAPR-Sc1 (nach dem in WO 92/11378 beschriebenen Verfahren hergestellt), enthaltend einen Leader, dessen Sequenz in Fig. 4 angegeben ist, beherbergten, durch Screenen ausgewählt. Das spx3-Signalpeptid von pAPR-Sc1 wurde durch das YAP3-Signalpeptid ersetzt, indem das Sph1-Sty1-Fragment aus pLaC257 mit dem 300 bp langen Nhe1-Xbal-Fragment von pAPR-Sc1 über die synthetische Linker-DNA MH1338/1339 (siehe Fig. 5) fusioniert wurde:
- Das resultierende Plasmid wurde als pLaC263 bezeichnet (siehe Fig. 5). Die DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des EcoRI-XbaI-Fragments von pLaC263 sind aus Fig. 6 ersichtlich.
- pAPR-Sc1 (Spx3sP) 100%
- pLaC263 136%
- Ein für Human-TFPI kodierendes synthetisches Gen, dessen DNA-Sequenz von der veröffentlichten Sequenz einer cDNA, die für humanen Gewebefaktor- Reaktionsweg-Inhibitor (TFPI) kodiert, abgeleitet war (Wun et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 6001-6004), wurde durch schrittweise Klonierung von synthetischen Restriktionsfragmenten in das Plasmid pBS(+) hergestellt. Das resultierende Gen war auf einem SaII-Restriktionsfragment von 928 Basenpaaren (bp) enthalten. Das Gen besaß im Vergleich zu der cDNA 26 stille Nukleotidsubstitutionen in degenerierten Codons, was zu 14 nur einmal vorkommenden Restriktionsendonukleasestellen führte. Die DNA-Sequenz des 928-bp-SaII-Fragments und die entsprechende Aminosäuresequenz von Human-TFPI (Präform) ist in Fig. 7 dargestellt (SEQ-ID-Nr. 8).
- Diese DNA-Sequenz wurde anschließend verkürzt, um für eine TFPI-Variante zu kodieren, die aus den ersten 161 Aminosäuren bestand. Eine nicht-glykosylierte Variante, TFPI&sub1;&submin;&sub1;&sub6;&sub1;-117Gln, worin das AAT-Codon für Asn117 durch CAA, kodierend für Gln, ersetzt war, wurde durch stellengerichtete Mutagenese in an sich bekannter Weise unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide konstruiert. Der DNA-Sequenz, die für TFPI&sub1;&submin;&sub1;&sub6;&sub1;-117Gln kodierte, ging die synthetische Signal-Leader-Sequenz 212spx3 (vgl. WO 89/02463) voran, siehe Fig. 8A. Diese Konstruktion wurde in das Plasmid pP-212TFPI161-117Q (basierend auf einem Vektor des POT-Typs (G. Kawasaki und L. Bell, US-Patent 4,931,373) (vgl. Fig. 8) inseriert.
- Ein SphI-XbaI-Fragment von 1,1 kb, enthaltend den kodierenden Bereich für 212spx3-TFPI&sub1;&submin;&sub1;&sub6;&sub1;-117Gln wurde isoliert und in das Plasmid pYES21, das von dem im Handel erhältlichen (Stratagene) Vektor pYES2.0 abgeleitet war, kloniert (vgl. Fig. 8). Dieses Plasmid enthält eine 2u-Sequenz zur Replikation in Hefe, das Hefe-URA3-Gen zur Plasmidselektion in ura3-Stämmen, das β-Lactamasegen zur Selektion in E. coli, den ColEl-Replikationsursprung zur Replikation in E. coli, den f1-Ursprung zur Gewinnung von einzelsträngigem DNA-Plasmid aus superinfizierten E. coli-Stämmen und den Hefe-CYC1-Transkriptionsterminator. Das SphI-XbaI-Fragment wurde vor dem CYC1-Terminator in pYES 2.0 kloniert. Das resultierende Plasmid pYES-212TFPI161-117Q (vgl. Fig. 9) wurde mit PflMI und EcoRI gespalten, um den kodierenden Bereich für das Maus- Speichelamylase-Signalpeptid zu entfernen, welcher durch eine doppelsträngige synthetische Oligonukleotidsequenz, kodierend für das YAP3-Signalpeptid, ersetzt wurde:
- was zu dem Plasmid pYES-ykTFPI161-117Q führte (vgl. Fig. 8B und Fig. 9).
- Die Plasmide pYES-212TFPI161-117Q und pYES-ykTFPI161-117Q wurden in den haploiden Hefestamm YNG318 (MATα ura3-52 leu2-Δ2 pep4-Δ1 his4-539 [cir+]) transformiert. Die Plasmidselektion erfolgte hinsichtlich Ura+-Zellen. Reisolierte Transformanten wurden in 50 ml eines synthetischen Vollmediums, dem Uracil fehlte (SC-ura), 3 Tage lang bei 30ºC gezüchtet. Nach dem Messen der Zelldichte (OD&sub6;&sub0;&sub0;) wurden die Kulturen zentrifugiert und die resultierenden Überstände hinsichtlich des Niveaus der sekretierten FXa/TF/FVIIa-abhängigen chromogenen TFPI-Aktivität analysiert (P. M. Sandset et al., Thromb. Res. 47, 1987, S. 389-400). Die mittlere Aktivität, die für Überstände aus Stämmen, enthaltend das Plasmid pYES-212TFPI161-117Q (d. h., das Plasmid, welches die Maus- Speichelamylase-Signalsequenz enthält), gemessen wurde, betrug 0,65 E/ml OD. Die mittlere Aktivität, die für Überstände aus Stämmen gemessen wurde, die das Plasmid pYES-ykTFPI161-117Q enthielten, betrug 1,00 E/ml OD.
- (i) ANMELDER:
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- (B) STRASSE: Novo Alle
- (C) STADT: Bagsvaerd
- (E) LAND: Dänemark
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- (G) TELEFON: +45 4444 8888
- (H) TELEFAX: +45 4449 3256
- (ii) TITEL DER ERFINDUNG: für das YAP3-Signalpeptid kodierendes DNA-Konstrukt
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 24
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- (A) MEDIUMTYP: Diskette
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- CTGGTTGACC TAGGACCTGC GATGCAAAGA GTGACGAAAG GACCGCAGAT CTTACAGTTT 60
- TAAGCTTCAT TTTTTAGTTT G 81
Claims (16)
1.
DNA-Konstrukt, umfassend die folgende Sequenz
5'-P-SP-(LP)n-PS-HP-3'
worin
P eine Promotorsequenz ist,
SP eine DNA-Sequenz ist, welche für das Hefe-Asparaginsäureprotease 3
(YAP3)-Signalpeptid kodiert,
LP eine DNA-Sequenz ist, welche für ein Leader-Peptid kodiert,
n 0 oder 1 ist,
PS eine DNA-Sequenz ist, welche für ein Peptid kodiert, das eine Hefe-
Prozessierungsstelle definiert, und
HP eine DNA-Sequenz ist, welche für ein Polypeptid kodiert, das
heterolog für einen ausgewählten Wirtsorganismus ist.
2. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, worin die Promotorsequenz aus dem
MFα1-, TPI-, ADH-, BAR1- oder PGK-Promotor von Saccharomyces
cerevisiae oder dem ADH-Promotor von Schizosaccharomyces pombe
ausgewählt ist.
3. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, worin das YAP3-Signalpeptid von der
folgenden DNA-Sequenz
ATG AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TCA
CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC(SEQ-ID-Nr. 1)
oder einer geeigneten Modifikation davon, kodierend für ein Peptid mit
einem hohen Grad an Homologie zu dem YAP3-Signalpeptid, kodiert wird.
4. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, worin n 1 ist.
5. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, worin das Leader-Peptid ein Hefe-
MFα1-Leader-Peptid oder ein synthetisches Leader-Peptid ist.
6. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, worin PS eine DNA-Sequenz ist, die für
Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys, Arg-Arg oder Ile-Glu-Gly-Arg kodiert.
7. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, worin das heterologe Polypeptid aus der
Gruppe, bestehend aus Aprotinin, Gewebefaktor-Reaktionsweg-Inhibitor
oder anderen Protease-Inhibitoren, Insulin oder Insulinvorläufern, Human-
oder Rinderwachstumshormon, Interleukin, Glucagon,
Glucagonähnlichem Peptid 1, Gewebeplasminogenaktivator, transformierendem
Wachstumsfaktor α oder β, Thrombozyten-Wachstumsfaktor, Enzymen
oder einem funktionellen Analogon davon, ausgewählt ist.
8. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, welches ferner eine
Transkriptionsterminationssequenz umfaßt.
9. DNA-Konstrukt nach Anspruch 8, worin die
Transkriptionsterminationssequenz der TPI-Terminator ist.
10. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend ein DNA-Konstrukt nach
irgendeinem der Ansprüche 1-9.
11. Zelle, transformiert mit einem Vektor nach Anspruch 10.
12. Zelle nach Anspruch 11, welche eine Pilzzelle ist.
13. Zelle nach Anspruch 12, welche eine Hefezelle ist.
14. Zelle nach Anspruch 13, welche eine Zelle von Saccharomyces,
Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula oder Yarrowia ist.
15. Zelle nach Anspruch 14, welche ein Zelle von Saccharomyces cerevisiae
oder Schizosaccharomyces pombe ist.
16. Verfahren zur Herstellung eines heterologen Polypeptids, wobei das
Verfahren umfaßt die Kultivierung einer Zelle, welche zur Expression eines
heterologen Polypeptids in der Lage ist und welche mit einem DNA-
Konstrukt nach irgendeinem der Ansprüche 1-9 transformiert ist, in einem
geeigneten Medium, um die Expression und Sekretion des heterologen
Polypeptids zu erhalten, wonach das heterologe Polypeptid aus dem
Medium gewonnen wird.
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