CN1284998A - 多拷贝基因在霉菌中的定点整合方法 - Google Patents

Abstract

提出一种在霉菌中定点整合一个基因多拷贝的方法,其中包括用一段包含至少是编码目的蛋白的一个结构基因的至少一个表达性基因的多个拷贝的DNA片段转化一种霉菌细胞,该霉菌细胞的染色体DNA中含有稀有切点的内切酶限制性切点,如I－SceI,优选导入到预期位点,如在选择性标记基因内部或与之相邻,转化所用的DNA片段位于两段与所述限制性位点的上下游及相邻序列同源的片段之间,在转化过程中使用稀有切点的内切酶,然后选择或筛选霉菌染色体DNA中插入所述表达性多基因拷贝的霉菌细胞。所述DNA片段还包含第三段DNA,该DNA能够使染色体上破裂或部分缺失的选择性标记基因完整。优选的霉菌包括曲霉属,尤其是泡盛曲霉。还提出一种通过本发明方法获得的转化霉菌及培养该转化霉菌的方法,生产和可选可不选地分泌目的蛋白的方法,该方法是在一定条件下培养转化霉菌使编码目的蛋白的基因表达,以及可选可不选地分离或浓缩目的蛋白的方法。

Description

多拷贝基因在霉菌中的定点整合方法

本发明涉及一个基因的多拷贝在霉菌中的定点整合方法，涉及通过本方法获得的一种转化霉菌及该转化霉菌的培养方法，涉及通过培养这些转化霉菌生产和可选可不选地分泌目的蛋白的方法。具体地，本发明提出一种通过转化霉菌来制备蛋白的方法，所述霉菌转化方法是在霉菌，尤其是属于曲霉属的霉菌的染色体上整合至少一个表达基因的多个拷贝，该表达基因中含有编码目的蛋白的结构基因。在本说明书中，“可表达的基因”是指编码一种与宿主生物同源或者异源的蛋白的结构基因，控制该外加结构基因恰当转录和翻译的DNA序列，以及可选可不选地连接的分泌信号DNA序列，其中上述DNA序列在宿主霉菌中应该是功能性的。另外，“霉菌”和“丝状真菌”可认为是同义词的。

发明背景及现有技术

1．丝状真菌和某些菌种如泡盛曲霉(Aspergillus awamoir)，黑曲霉(Aspergillus niger)，青木霉(Trichoderma reesei)，禾谷镰孢(Fusarium graminearum)，已经显示是很诱人的宿主，可用于大规模生产同源和异源的蛋白。这些菌株能够分泌大量的蛋白到培养基中，大规模的发酵技术基本上建立起来，这些霉菌中大多数是GRAS(总体认为是安全的)的，这使得在食品和食品加工业中应用这些菌株成为可能。而且，在英国禾谷镰孢A 3/5，Quorn^R myco-protein真菌已经作为商业性人类食物来源，有十年的历史了(Royer等.；Bio/Technology13(1995)1479-1483)。

真菌的蛋白生产，无论同源或异源，用丝状真菌来生产是非常有效的，产量已经达到克/升的水平。然而，与哺乳动物、细菌或植物性异源蛋白在霉菌中的生产水平相比，产量相对低。为了提高同源和异源的蛋白产量，发展了几种策略。霉菌中常用的使蛋白高水平表达的基本策略是引入编码目的蛋白基因的多拷贝。

2．在过去的几年间，虽然霉菌成功的在实验室和商业规模上用于生产酶、抗体片段和多肽(木聚糖酶，果胶酶等)，但这些基因修饰生物生产的产品在市场中遇到了一些预想不到的困难。

(A)总的说来，人们越来越关注基因修饰生物中使用的抗生素抗性基因。关注的主要原因是这类基因可能会转到肠道微生物并表达，从而使这些微生物对抗生素有抗性。由英国农业、渔业和食品部新食品和方法指导委员会公布的“抗生素抗性标记在基因修饰的食品生物中的应用报告”，(1994)

(B)再者，其它外源性DNA，如用于克隆的载体DNA的残余也是不受欢迎的。

(C)另一个种关注的事实是，这些基因修饰菌株中通常包含随机整合的基因物质。按照一些消费组织的观察，这将构成一种难以预测的安全威胁，这可能是一种接受衍生产物的阻碍。

3．因此，为了在霉菌中以经济的诱人方式生产蛋白，同时又解决以上所述的对基因修饰生物的关注，理想的重组霉菌应当包含编码目的蛋白基因的多拷贝，这些基因整合在基因组中唯一预定的基因座中，而且没有其它的外源DNA。

能够满足这些标准的霉菌菌株还未见文献报道。

常用的将单拷贝或多拷贝基因整合到霉菌基因组中的应用系统，例如整合到曲霉属，木霉属，禾谷镰孢属，都是利用了除编码目的蛋白的基因外，还含有编码抗生素抗性的细菌标志基因(如：氨苄青霉素)和其它的载体序列的载体。因此，基因修饰霉茵通常含有抗生素抗性基因和其它的载体DNA。

单拷贝基因的定点整合已经有常规描述(如Ｔimberlake，“真菌中更多的基因操作(第3章)51-85，选自《基因克隆和分析》一书Bennett和Lasure主编(1991)；Gouka等，Applied andEnvironmental Microbiology 62(1996)，1951-1957)，但却难以用于获得基因组中预定基因座中整合多基因拷贝的霉菌。Gouka等(Curr.Genet.27(1995)536-540)报道了在泡盛曲霉pyrG基因座中定点多拷贝整合的选择，但转化获得的重组菌株中使用的DNA含有载体序列，而且在pyrG基因座中整合的基因拷贝数材料没有显示。已报道的在黑曲霉argB基因座中定点串联整合，结果也类似。(Van denHondel and Punt，“基因转移系统和载体开发”(第1章)，选自《应用分子遗传学》一书(1991)1-28，Peberdy主编。

尽管出于科学的和商业的目的需要，几篇其它报道表明：定点整合多拷贝基因不可能获得(Kubicek-Pranz等。J.of Biotech.20(1991)83-94；Van den Hondel等。Antonie Van Leeuwenhoek 61(1992)153-160；Verdoes等。转基因研究2(1993)84-92；Archer等.，Antonie Van Leeuwenhoek 65(1994)245-250；Van Gemeren等.，应用微生物学和生物工程45(1996)755-763；Van Gemeren，“用泡盛曲霉表达和分泌限定的角质素酶变体”(Chapter 5)ThesisUniversity of Utrecht(1997)ISBN 90-393-1229-X)。

4．以前，文献报道了两种方法，用该方法理论上能够获得包含一个基因多拷贝的霉菌菌株，这些基因多拷贝整合在基因组的预定基因座中，而且没有其它外源性的DNA。

第一种方法描述了由转化真菌制备蛋白，该真菌由表达载体定点整合多拷贝到基因组核糖体DNA基因座后转化获得，方法见国际PCT专利申请WO-A-91/00920；Unilever，公开于1991年1月24日。尽管在酵母中有成功的范例，可以设想该方法可以用于霉菌。因此，利用该方法有可能构建一种霉菌菌株，该菌株中一个基因的多个拷贝整合在基因组的预定基因座位点，而且没有其它的外源DNA序列。

然而霉菌转化方式与酵母转化方式有某种程度上的不同。在啤酒糖酵母中转化DNA是通过同源重组在相应的同源位点部位整合到细胞的基因组中，而在丝状真菌中如曲霉的整合主要是通过非常规的重组在基因组的随机位点整合(Finkelstein，在Finkelstein和Ball主编的“丝状真菌的生物工程学’(1992)一书中113-156页，第6章，‘转化”)。比如，Gouka等分析了大量的泡盛曲霉重组子(Curr.Genet.27(1995)536-540)，结果发现：有近10％的重组体的DNA整合是通过同源重组，而其余的90％的重组体是随机重组。这意味着不得不对定点整合重组体进行筛选。因此，WO-A-91/00920中所述的转化霉菌的方法，需要较长的筛选过程，因为引入霉菌中的DNA不仅通过同源重组在预定位点整合，而且还存在随机整合。

第二种方法描述了单拷贝基因的定点整合，通过该方法任何其它的用于克隆的异源性DNA和其它任何异源性霉菌选择型标记都可去除，方法参见欧洲专利申请EP-A1-0635574；Gist-Brocades NV，公开于1995年1月25日。

如果用第二种方法制备包含多拷贝基因的转化霉菌，那么过程非常麻烦，因为对于随后的每个需要引入的拷贝都需要重复整个过程。

虽然获得多拷贝基因整合的第二种方法中的重复操作，在该特定方案中以简单的叙述方式提及(3页，22-23行，6页21-25行，7页29-30行，8页，9-11，15-16行)，但在实际操作的例子中没有显示。事实上，“连续应用同样的技术”的声明，在第8页第9～11行中提及，表明了在预定基因座引入多拷贝基因的这种方法的操作烦琐特点，这种特点在单位点和多位点两种情况都存在。

该方法更进一步的缺点是早期引入的目的外源DNA，在随后的重复操作中有被去除的危险。

总的来说，上面所提及的1～4条表明在霉菌生物技术领域需要一种构建含编码目的蛋白基因的多拷贝的霉菌菌株方法，构建的霉菌在基因组的预定基因座中整合目的基因而无细菌抗生素抗性基因或其它外源性的DNA，如用于克隆的载体DNA残余。理想化的重组微生物应当仅含异源性的编码目的蛋白的基因。

发明概述

本发明可应用于霉菌生物技术领域，而且提出了一个新的更先进的方法，用于在霉菌中定点整合一个基因的多拷贝，而且无任何不想要的DNA，即转化霉菌中没有遗留下用于选择重组体的选择性标记或用于克隆的其它DNA。本发明基于在霉菌细胞的染色体靶点中特定引入双链断裂，这种断裂可明显增加在该基因座中的定点整合。用与断裂点两侧区域同源的修复DNA修复断裂，该修复DNA中包括编码至少一个目的蛋白基因的至少一个基因的多个拷贝，在修复的同时在断裂位点中整合上述多拷贝。

本发明提出一种转化霉菌的方法，其中：

(1)目的基因的多拷贝整合在所说霉菌的染色体中，

(2)与通常的霉菌随机整合相比，在霉菌染色体中的整合是通过同源重组的定点整合，

(3)这种定点整合的发生，可以优先从任何可能的随机的发生整合事件中筛选出来，如通过缺陷标记基因的恢复来选择，

(4)可避免外源DNA如抗生素抗性基因和来源于其它生物的DNA序列序列的残留，而且

(5)稀有切点内切酶，如Ⅰ-SceⅠ被用于在霉菌染色体中引入双链断裂。

尽管强调使用Ⅰ-SceⅠ作为稀有切点内切酶，但可以设想用其它稀有切点内切酶，包括HO内切酶和VDE，后者也被称为PⅠ-SceⅠ。

附图简述

图1．质粒pUR5710，pUR5711，pUR5712的构建示意图，其中：

amp：氨苄青霉素抗性基因，

pyrG：源自泡盛曲霉的pyrG基因，‘pyrG或pyrG’分别表示该基因在5’端和3’端被截短。

图2．质粒pUR5713(图2A)，pUR5714(图2B)的构建示意图，其中：

pBS-SK=pBluescript^R-SK。

图3．质粒pUR5716，pUR5718的构建示意图，其中：COS=COS位点。

图4．质粒pUR5729的构建示意图，其中：

PexlA=泡盛曲霉1，4-β-内源性木糖酶A基因启动子序列

Cut=腐皮镰孢(F.solani pisi)角质素酶基因的编码区(合成的CDNA拷贝)，以及

TexlA=泡盛曲霉1，4-β-内源性木糖酶A基因的终止序列。

图5．粘粒pUR5722，pUR5725的构建示意图。

图6．质粒pUR5736，pUR5737的构建示意图，其中：

Pgpd=构巢曲霉gpd基因启动子序列，

hph=源自埃希氏大肠杆菌的潮霉素磷酸转移酶基因的编码区，

TtrpC=构巢曲霉trpC基因终止子序列。

图7．质粒pUR5724的构建示意图，其中：

Ⅰ-SceⅠ=编码啤酒糖酵母的Ⅰ-SceⅠ内切酶的合成基因。

图8．用Ⅰ-SceⅠ内切酶在泡盛曲霉中定点整合一个基因多拷贝方法的实验设计。图的上半部分描绘了pyrG基因，该基因的编码区用浅灰色阴影框表示，下面为泡盛曲霉AWCSCE株中含Ⅰ-SceⅠ切割位点的靶基因座的示意图。在pyrG基因5’非功能区和染色体上pyrG基因座3’端侧翼序列之间有Ⅰ-SceⅠ位点。引入AWCSCE株中的片段含有一段pyrG基因的3’端非功能区，一个或多个基因拷贝(深灰色阴影框1，2和n表示)及一段附加序列，所述的pyrG基因的3’端(部分)非功能区，这部分序列与染色体上靶基因座中突变pyrG基因部分同源，所述的多个基因拷贝包含编码至少一个目的蛋白的结构基因的至少一个基因，所述的附加序列来自pyrG基因座序列且与靶基因座中Ⅰ-SceⅠ位点紧邻的下游序列同源。将Ⅰ-SceⅠ内切酶或含Ⅰ-SceⅠ基因的表达质粒同时共引入该细胞中。在Ⅰ-SceⅠ位点双链断裂介导的同源重组后，完整的pyrG被修复且多基因拷贝同时被整合在pyrG位点，这一点在图的下半部分阐明。

图9．泡盛曲霉基因组DNA的Southern印迹的放射自显影结果图，所用探针为带有Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点的末端标记的18bp寡核苷酸，基因组DNA用Sau3A消化。M代表1kb的DNA标准(BRL)，泳道1，2和3含用Hinf Ⅰ消化后的质粒pSCM522样品(含Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点的对照DNA，用Boehringer Mannheim公司的Ⅰ-SceⅠ内切酶，产品号1497235)，其浓度分别相应于200，20和单拷贝的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点。泳道4和5含有用Sau3A消化后的泡盛曲霉基因组DNA(7.5μg)。泳道6和7含用质粒pUR5712样品，浓度分别对应于泡盛曲霉中单拷贝，20和200拷贝的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点。

图10．两个泡盛曲霉pyrG突变株基因组DNA的Southern印迹的放射自显影结果图。基因组DNA用BglⅡ和Ⅰ-SceⅠ消化，用来自质粒PAW4.1长为2.4kb内含泡盛曲霉pyrG基因的BamHⅠ和HindⅢ片段作探针对该基因组进行探测。M代表1kb的DNA标准(BRL)，泳道1和2含泡盛曲霉pyrG突变株基因组DNA。带3含源自非转化的野生型泡盛曲霉菌的基因组DNA。

图11．泡盛曲霉株AWCSCE的转化后获得的重组菌株的Southern分析(见实施例4)。基因组DNA用SalⅠ或BglⅡ消化，用不同的探针杂交(见实施例5)。用于图12的Southern印迹的两个探针是：

pyrG=来自含泡盛曲霉tprG基因的PAW4.1的2.4kb的BamHⅠ和HindⅢ酶切片粉，

TexlA=来自含用exlA终止子的质粒pUR5729的0.5kb的AflⅡ和SacIⅠ酶切的片段。

图的上部分描述了野生型pyrG基因。SalIⅠ酶切消化将获得3.3kb和3.8kb各一段片段，这些片段与pyrG探针杂交。BglⅡ消化将获得9.0kb和2.7kb各一段片段，这些片段不能与TexlA探针杂交。

再下面是泡盛曲霉AWCSCE中含Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点的靶基因座示意图。SalⅠ酶切消化将获得3.3kb和3.0kb各一段片段，其中仅3.3kb片段与pyrG探针杂交。BglⅡ消化将获得9.0kb和2.7kb各一段片段，这些片段不能与TexlA探针杂交。

图的下部分恢复后的pyrG基因示意图，其中不含或含有多个拷贝的角质素酶基因。SalⅠ酶切消化将获得3.3kb片段，含pUR5718的重组体将获得一段3.7kb片段，含pUR5722的重组体将获得一段9.6kb片段，含pUR5725的重组体将获得一段17.1kb片段，所有这些片段都将与pyrG探针杂交。BglⅡ酶切消化将获得9.0kb片段，含pUR5718的重组体将获得一段2.6kb片段，含pUR5722或pUR5725的重组体将获得一段1.7kb或1.9kb片段(根据角质素酶基因与pyrG基因的方向不同而不同)和一个源自角质素酶基因串联重复单元的1.5kb片段，只有在角质素酶表达盒中含有exlA终止子的片段与TexlA探针杂交。

图的底部显示了pyrG和TexlA探针的位置。

图12.重组体的Southern印迹的放射自显影结果。M代表1kb的分子量标准(BRL)，

泳带1：AWC-pUR5718#S1重组体；

泳带2：AWC-pUR5718#S2重组体；

泳带3：AWC-pUR5718#1重组体；

泳带4：非转化的野生型泡盛曲霉菌株；

泳带5：泡盛曲霉pyrG突变株AWCSCE；

泳带6：AWC-pUR5725#1重组体；

泳带7：AWC-pUR5725#2重组体；

泳带8：AWC-pUR5722#A1重组体；

泳带9：AWC-pUR5722#A2重组体；

泳带10：AWC-pUR5722#B1重组体；

泳带11：AWC-pUR5722#B2重组体；

泳带12：AWC-pUR5722#B3重组体；

A：基因组DNA用SalⅠ酶切，用pyrG探针杂交(见图11)

B：基因组DNA用BglⅡ酶切，用TexlA探针杂交。

发明详述

本发明提供了一种在霉菌中定点整合一个基因多拷贝的方法，该方法包括：

(ⅰ)提供一种染色体DNA中含稀有内切酶限制性位点的霉菌细胞，

(ⅱ)用一段DNA转化该霉菌细胞，所说DNA由5’到3’方向顺序含：

(a)第一段DNA片段，该片段与霉菌染色体DNA中所含的稀有切点的内切酶限制性位点上游部分和相邻的DNA同源，

(b)至少一个表达性基因的多个拷贝，其中含有编码目的蛋白的结构基因，

(c)第二段DNA片段，该片段与霉菌染色体DNA中所含的稀有切点的内切酶限制性位点的下游部分和相邻的DNA同源

在霉菌转化过程中，使用稀有切点的内切酶，

(ⅲ)筛选或检出所说表达基因插入到霉菌染色体DNA中的霉菌细胞。

对于定点整合，需要在靶位点上用限制性内切酶产生双链断裂，而在染色体的其它位置不形成断裂，这样的酶的一个例子是来源于啤酒糖酵母属的Ⅰ-SceⅠ限制性内切酶。编码该内切酶的核酸序列和该序列的一些应用在国际专利申请WO96/14408中有描述，该申请由Pasteur研究所提交并于1996年5月17日公开。按照本发明的方法，其它的一些已知的稀有切点的内切酶同样可以应用，如VDE又名PⅠ-SceⅠ(M.Jasin；遗传学动态(TIG)12(1996年6月，第6期)224-228；带有稀有切点内切酶位点的基因组的基因操作，M.Brenneman等，美国国家科学院院刊93(1996)3608-3612；用位点特异性核酸内切酶通过电穿孔刺激人细胞的染色使内同源重组和HO内切酶(M.Chiurazzi；植物细胞8(1996年11月)2057-2066；通过HO核酸内切酶制激Arabidopsis中的使细胞染色体内同源重组。进一步讲，如果特定的霉菌基因组中实际上并没有很熟悉的限制性内切酶的限制性位点，那么该内切酶也可以应用，可以考虑作为该特定霉菌基因组的稀有切点的内切酶。

构成表达性基因一部分的编码目的蛋白的结构基因，可以是与霉菌同源或异源的基因。

在某种情况下，在霉菌的染色体DNA中天然存在稀有切点内切酶的限制性酶切位点。但如果霉菌没有这些稀有切点内切酶的限制性酶切位点的话，可将该位点引入到预定的基因座。

转化霉菌的筛选可使用选择性标记。优选那些天然存在的野生型霉菌菌株的特征性选择标记，在转化前是突变型的菌株是选择性标记缺陷的，如：乳清苷5’磷酸脱羧酶基因(pyrG基因)，而在野生型的泡盛曲霉菌株表达。另外其它含有营养缺陷标记的座位，包括trpC，argB，和niaD基因的座位也可以应用，其它可能的选择性标记包括可制备出易于检测产物的基因。有时，引入到霉菌中的DNA本身就可以作为选择性标记。比如，当引入的DNA表达产生非转化霉菌不能产生的一种产物，而且易于或不难检测时；或者DNA的存在与否可以使用PCR技术确定时。

优选目的基因座位于选择性标记内部或紧邻选择性标记。为了修复任何破裂的或(部分)缺失的基因，转化霉菌的DNA片段可包含第三段DNA，该片段可使染色体上任何破裂或(部分)缺失的基因完整。这将允许直接筛选含靶位点整合基因的多拷贝的霉菌。

霉菌染色体DNA中，与第一段DNA同源的、稀有切点内切酶的限制性酶切位点上游的DNA部分，可以是选择性标记基因的一部分。或者，霉菌染色体DNA中，与第二段DNA同源的、稀有切点内切酶的限制性酶切位点下游的DNA部分，可以是选择性基因的一部分。或者上下游部分是同一选择性标记基因的部分。

如果存在两个或多个稀有内切酶限制性位点的话，整合的基因拷贝数量将增加，或几个不同的基因在不同的位点引入，或两种可能都存在。优选的表达性基因包含：(1)在所述霉菌中可操作的启动子(2)可选可不选的编码分泌信号肽的DNA片段，该片段利于目的蛋白从所述霉菌中分泌(3)编码目的蛋白的结构基因(4)可选可不选的在所述霉菌中可操作的终止子，其中启动子和可选可不选的终止子控制结构基因的表达。更优选地，所述启动子，分泌信号肽和终止子与待转化的霉菌同源。这种情况下，可将外源DNA数量控制在最低限度。

与选择性酶切位点介导的整合相似，在霉菌的转化中加入稀有切点的内切酶。当引入霉茵中的DNA的量尽可能低的时候，优选这种方法。

在霉菌的转化中，稀有切点内切酶的提供可以象类似的限制性介导的整合那样添加(REMI；Kuspa and Loomis，美国国家科学院院刊89(1992)8803-8807；Redman and Rodriguez，Exp.Mycol.18(1994)230-246)。优选地，导入到霉菌中的外源DNA的量越低越好。

但由于其它的原因，用编码稀有切点内切酶的DNA共转染霉菌，这样可以方便地在原位形成稀有切点的内切酶，上述片段可在转化过程中或转化后该DNA表达。优选的DNA是构成质粒的一部分但不整合入基因组，这样转化体在进一步培养一段时间后质粒将丢失，而目的DNA还在基因组中存在。可以通过进一步的检测来确定受体菌株的基因组DNA中稀有确定内切酶的丢失。

优选的霉菌属属于真菌门，更优选属于子囊菌亚门，担子菌亚门，鞭毛菌亚门，接合菌亚门和半知菌亚门的霉菌，尤其优选的是选自曲霉属的霉菌，特别是泡盛曲霉。本发明还提出了一种转化霉菌，该霉菌可按照本发明的霉菌中基因多拷贝定点整合的方法获得。一旦获得按照本发明转化的霉菌，就可以按照本发明的方法进一步的培养。

本发明还提出了生产和可选可不选地分泌目的蛋白的方法，所述方法通过在一定条件下培养上述方法得到的霉菌从而使编码目的蛋白的结构基因得以表达；以及可选可不选地分离或浓缩目的蛋白的方法。

引入基因多拷贝的一种方法，是如下面标题为“构建多拷贝载体”部分中所描述的引入完整表达盒的多个拷贝。另一种方法是引入结构基因的几个拷贝(多顺反子)。编码的多肽制备完成后，可被切割成单个肽，如用酶KEX2。

本发明通过下面的实施例进行例示，这些例子中所用材料和方法都有描述。

实施例1A.在泡盛曲霉中用Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点定点整合一个基因多个拷贝的实验设计。

实施例1B确定泡盛曲霉基因组中天然的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点的存在。

实施例1C泡盛曲霉pyrG突变株AWCSCE的构建，其中在突变的pyrG基因座中含Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点。

实施例1D通过Ⅰ-SceⅠ内切酶的表达在pyrG基因座中引入定点整合。

实施例1E重组事件的Southern印迹分析。

材料与方法

细菌及霉菌菌株

使用DH5α埃希氏大肠杆菌(基因型：F^-，endA1，hsdR17(R_k ^-M_k ⁺)，supE44，thi-1，lamda^-，recA1，gyrA96，relA1，△(argF-lacIZYA)U169，deoR (phi80d(lacZ) △ M15)；Hanahan；J.Mol.Biol.166(1983)557-580)作标准的细菌克隆。为了把基因的多拷贝克隆入粘粒载体中，而使用了大肠杆菌1046菌株，(Cami，B.and Kourilsky，p.；核酸研究5(1978)2381)。

用泡盛曲霉菌株#40(一种泡盛曲霉CBS115.52的衍生菌株，在WO93/12237第9页第13行中提及)构建pyrG衍生菌株，命名为AWCSCE，在pyrG基因座中含Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点。

泡盛曲霉菌株#40(也称为黑曲霉泡盛变种#40(A.nigervar.awamori #40))的制备在WO91/19782中第13页第29～39行有描述，具体如下：

黑曲霉泡盛变种转化子的表达水平可以使用合适的黑曲霉泡盛变种突变株，如黑曲霉泡盛变种#40来提高，该变异株表达的木糖酶明显比野生型菌株要高。该黑曲霉泡盛变种#40突变株是通过突变的黑曲霉泡盛变种孢子的突变和筛选木糖酶的产量而获得的。在麦麸培养基中，黑曲霉泡盛变种#40“xylA”突变株产生190000U的木糖酶，明显的高出黑曲霉泡盛变种突变株转化体的最好产量。

在该特定方案中，使用了下列内切酶位点：

切出粘端的酶                切出平端的酶

AflⅡ    C↓TTAAG    SmaⅠ    CCC↓GGG

BamHⅠ   G↓GATCC

BglⅡ    A↓GATCT

EcoRⅠ   G↓AATTC

HindⅢ   A↓AGCTT

HinfⅠ   G↓ANTC

NdeⅠ    CA↓TATG

NotⅠ    GC↓GGCCGC

PstⅠ    CTGCA↓G

SacⅠ    GAGCT↓C

SalⅠ    G↓TCGAC

Sau3AⅠ  ↓GATC

ScaⅠ    AGT↓ACT

和来自啤酒糖酵母的稀有切点限制性内切酶Ⅰ-SceⅠ 18bp：

5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’(见SEQ ID NO：1)

质粒构建

用标准的重组DNA技术进行克隆(Sambrook等，分子克隆-实验指南。冷泉港实验室，冷泉港，纽约。(1989))。在所有的涉及DNA接头或PCR片段的合成步骤中，接头或PCR片段序列的正确性通过DNA序列分析来确证，仪器使用Pharmacia LKB的ALF荧光测序仪。

靶位点的构建

在质粒PAW4.1中的(Gouka等.；Curr.Genet.27(1995)536-540)中所含的pyrG基因5’端部分的2.0kb片段，克隆入用BamHⅠ/SalⅠ消化过的通用克隆载体pIC20R(Marsh等.；Gene 32(1984)481-485)构建了质粒pUR5710(图1)。随后，将一个含18bp的Ⅰ-SceⅠ内切酶识别的位点(5'TAGGGATAACAGGGTAAT-3'；见SEQ ID NO：1)的合成DNA接头，而且两侧有SalⅠ和HindⅢ位点，克隆入用SalⅠ和HindⅢ处理的pUR5710中。质粒pUR5712的构建方法是，将质粒pAW4.4(Gouka等.；Curr.Genet.27(1995)536-540)中含pyrG编码基因的下游序列的2.0kb的片段，用HindⅢ消化后克隆入用HindⅢ处理的质粒pUR5711中。HindⅢ消化片段的方向与pyrG基因的编码区与野生型的一致。该pUR5712质粒用于构建泡盛曲霉pyrG基因突变株AWCSCE。

修复构建体的构建

为了构建质粒pUR5713(见图2A)，先用HindⅢ消化pAW4.4，然后用Klenow酶补平，再用BamHⅠ处理该片段。分离得到的1.6kb片段，包含pyrG编码区基因的下游序列。而且，用BamHⅠ和HindⅢ消化质粒pAW4.20(Gouka等.；Curr.Genet.27(1995)536-540)，分离0.4kb的片段，该片段位于与上述1.6kb片段紧邻的上游部分，该BamHⅠ和HindⅢ消化的0.4kb和BamHⅠ和HindⅢ消化并补平HindⅢ位点的1.6kb的片段同时克隆入用BamHⅠ和SmaⅠ酶切处理的通用的克隆载体pBluescript^K SK(Stratagene)中，获得质粒pUR5713。质粒pUR5714(见图2B)的构建方法是：将内含质粒pAW4.1中pyrG基因3’部分长为1.0kb的BglⅡ/HindⅢ酶切片段，克隆入用BamHⅠ和HindⅢ消化的pBluescript^R SK。粘粒pUR5716(见图3)衍生自粘粒载体pJB8(Ish-Horowicz，D.and Burke，J.F.；核酸研究。9(1981)2989)方法是用合成的含EcoRⅠ和NotⅠ限制性位点的接头替换EcoRⅠ和HindⅢ的多接头片段，其中合成接头中含有下列序列：

(5’-AATTC AT GCGGCCGC T-3’

3’-G TACGCCGGCG ATCGA-5’，见SEQ ID NO：2)

在这一步的克隆过程中，HindⅢ酶切位点丢失。粘粒pUR5718(见图3)的构建方法是：用NotⅠ和HindⅢ分别消化质粒pUR5714和pUR5713，获得1.0kb的NotⅠ/HindⅢ片段和2.0kb的HindⅢ/NotⅠ片段，然后同时克隆入用NotⅠ酶切的pUR5716中。因此，该载体携带一段序列，该序列与泡盛曲霉pyrG基因突变株AWCSCE菌中pyrG靶基因座中Ⅰ-SceⅠ位点的两侧序列同源。

多拷贝载体的构建

质粒pUR579(见图4)的构建方法是：将从质粒pUR7385(VanGemeren等.；Applied Microbiology and Biotechnology 45，(1996)755-763)中获得的1.5kb的PstⅠ/SacⅠ片段，克隆入用PstⅠ/SacⅠ消化的通用克隆载体pICl9H(Marsh等.；Gene 32(1984)481-485)中，所获得的片段含有源自Solani Pisi木曲霉(cDNA的合成拷贝；Van Gemeren等.；Journal of Biotechnology 401995)155-162)的角质素酶的开放阅读框架，且该基因受到来自泡盛曲霉(Gouka等.；Applied Microbiology and Biotechnology 46，(1996)28-35)的启动子和exlA基因的终止子的控制。在粘粒pUR5718的基础上，又构建了两个粘粒，这两个粘粒含有在exlA表达信号控制下的角质素酶基因的多拷贝。单拷贝的表达盒分离自质粒pUR5729的1.5kb的片段，连接至用HindⅢ消化的粘粒pUR5718中。连接产物转化DH5α埃希氏大肠杆菌，获得粘粒pUR5722(见图5)，该粘粒含串联排列的表达盒的4个拷贝。在体外模型中(Amersham；code PRN1717)，用λDNA包装连接混合物，包装混合物转化埃希氏大肠杆茵1046菌株(两次包装方法按照模型通过的程序进行)。结果获得含串联排列的表达盒的9个拷贝的粘粒pUR5725。

Ⅰ-SceⅠ表达载体的构建

质粒pUR5736(见图6)的构建方法是：用ScaⅠ/BamHⅠ酶切消化质粒pAN7.1(Punt等.；Gene 56(1987)117-124)，该片段含构巢曲霉的gpd基因的启动子部分与埃希氏大肠杆菌hph基因的编码区融合的片段，被含有相同启动子并融合至NdeⅠ和BamHⅠ限制性位点的PCR片段替换。为了获得来自质粒pAN7.1的载体片段，质粒用ScaⅠ酶部分酶切，因为在pUC的骨干结构中还有另外一个ScaⅠ酶切位点。PCR片段来自PCR反应，反应的模板是质粒pAN7.1，引物为MGgpdl(5’GACAAGGTCG-TTGCGTCAGTC-3’；见SEQ ID NO：3)和MGgpd2(5’CGGGATCCTT-CCATATGTGATGTCTGCTCAAGCGG-3’；见SEQ ID NO：4)。随后，源自pUR5736的、含构巢曲霉的gpd基因的启动子和构巢曲霉的trpC基因终止子的BglⅡ/HindⅢ片段，被克隆入通用克隆载体pBluescript^R SK中，获得pUR5737。然后，用BamHⅠ消化pUR5737，并用Klenow酶补平，再用第二个内切酶NdeⅠ消化。含编码Ⅰ-SceⅠ内切酶的合成基因的质粒pSCM525(由巴黎Pasteur研究所Dr.B.Dujon教授惠赠，美国专利号5，474，896，1992年11月5登记)，用ScaⅠ酶切，然后用Klenow酶补平，再用第二个内切酶NdeⅠ消化。所获得的片段插入到质粒pUR5737(NdeⅠ/BamHⅠ片段如上述方法补平)获得Ⅰ-SceⅠ表达载体pUR5724(见图7)。

转化实验

原生质体的制备

分生孢子的制备方法是：在PDA平板(土豆葡萄糖琼脂)上放置硝酸纤维素滤膜(Hybond-N，Amersham)，培养泡盛曲霉几天，然后用生理盐水洗涤滤膜。

原生质体的制备方法如Punt和Van Den Hondel(酶学方法。216(1993)447-457)所述方法。在装有200ml含0.5％的酵母提取物的MM培养基(0.4ml 1M MgSO₄，2ml 100×孢子元素(每升：60g EDTA.2 H₂O，11g CaCl₂·2 H₂O，7.5g FeSO₄·7H₂O，2.8g MnSO₄·H₂O，2.7gZnSO₄·7H₂O，0.8g CuSO₄·5 H₂O，0.9g CoCl₂·-6H₂O，0.5g Na₂MoO₄·2 H₂O，0.8gH₃BO₃，0.5g KI，用NaOH调pH至4.0)，10ml 20％葡萄糖，4ml 50X×AspA(3.5M NaNO₃，0.35M KCl，0.55M KH₂PO₄，用NaOH调pH至6.5)的摇瓶中，按10⁶泡盛曲霉分生孢子/ml接种，30℃200 rpm培养18小时。用无菌的Mirocloth^R收集菌丝体，用冰冷的0.6M的MgSO₄洗涤。将菌丝体重悬于OM培养基(每升：500ml 2.4M MgSO₄，480ml H₂O，16.8ml 0.5M Na₂HPO₄.，3.2ml 0.5 M NaH₂PO₄，pH5.8-5.9)中，浓度为5ml/克菌丝体。随后，按每克菌丝体加入5mg Novozym234^R和6mgBSA。原生质体继续在30℃80～100rpm培养1～2小时。用光学显微镜检测原生质体的形成。用无菌的Miracloth^R收集原生质体，用Falcon试管分成30ml/每份。加入STC(1.2M山梨糖醇，10mM Tris/HClpH7.5，50mM CaCl₂·2H₂O)至50ml，2000rpm 4℃离心10分钟。再用50ml的STC洗涤，并重悬于STC中，终浓度接近10⁸原生质体/ml。

PEG转化：

5～7.5微克单种或两种质粒加至100μl(10⁷)的等分级分原生质体中，混匀并冰浴25分钟。按2×200μl和850μl加入PEG，室温孵育20分钟。最后，用10ml STC洗涤混合物，室温2000rpm离心10分钟。样品铺至MM平板，筛选转化子。

pyrG突变的泡盛曲霉菌株AWCSCE的构建

野生型的泡盛曲霉用纯化的含突变的pyrG基因的E_CORⅠ片段(Qiagen gel extraction kit；Qiagen Cat.no.20021)转化，该片段源自质粒pUR5712，其中在缺失的位点中含有Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点。(见图1和8)。每一转化，用10μg的DNA转化2×10⁶的原生质体。由于pyrG菌株对5-FOA(5-氟-乳清酸；Boeke等。Mol.Gen.Genet.197(1984)_345-346)抗性，pyrG转化子可以直接从野生型菌株中筛选出来。转化子用MM平板筛选，平板含10mM的尿苷，0.75mg/ml的5-FOA，10mM的脯氨酸作为氮源。获得的突变表型的转化子，可通过在不含尿苷的MM平板上培养来检测。不能在无尿苷的MM平板(用AspA-N替换AspA；50×AspA-N 0.35M KCl，0.55M KH₂PO₄，用NaOH调pH至6.5)上生长的两个转化子可进一步通过Southern印迹分析(图9和见下面)。

DNA分离，PCR和Southern分析

用Southern分析在分子水平上来确证，霉已经转化菌和目的DNA已被整合入基因组。为了获得用于提取基因组DNA的菌丝体，在50ml的必需培养基中接种近10⁸的分生孢子，培养基中添加0.5％的酵母提取物，培养22小时至3天，条件是30℃摇床培养，转速为200rpm。通过Miracloth^R(Calbiochem)收集菌丝体，液氮速冻。速冻的样品用Mikro-Dismembrator^R(ex Braun Biotech International)1750rpm研磨1分钟磨成细粉。然后用Qiagen公司的基因组试剂盒(产品号10223)提取霉菌基因组DNA。从丝状真菌中提取基因组DNA的方法由供应商提供。消化细胞壁的步骤省略。

用Pekin Elmer的DNA热循环仪进行PCR反应，在100微升的总的反应体系中，基因组DNA的量接近1微克，引物每条25pMol，dNTP每种10nMol，Taq DNA聚合酶1单位(Gibco-BRL)和10微升的10×Taq DNA聚合酶缓冲液。用石蜡油覆盖反应管。扩增开始时，94℃变性5分钟，然后是94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，循环30次。最后一个循环中的延伸步骤后，再加一个72℃5分钟。使用的引物序列如下：

MGpyr1：5’-GCCAGTACACTACTTCTTCG-3’(见SEQ ID NO：5)

MGpyr2：5’-AGGAGATCGCGAGAAGGTTG-3’(见SEQ ID NO：6)

为作Southern印迹，近2.5微克的DNA用4单位/微克DNA的一种或多种限制性内切酶消化16小时。消化所用的限制性内切酶如下：Sau3A Ⅰ，BglⅡ，I-SceⅠ和SalⅠ。用0.8％的TBE配制的琼脂糖凝胶电泳分离DNA，然后毛细管转移方法(过夜)转移至Hybond N膜上。按照Hybond程序对膜进行(预)杂交。

图9所示的Southern杂交，染色体DNA(7.5微克)用Sau3A Ⅰ消化。所用探针为末端标记的18bp的寡核苷酸，该探针带有Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点。探针的标记是用T4多聚核酸激酶和γ-³²P-ATP。杂交条件是42℃4小时。用2×SSC42℃洗膜5分钟，然后用2×SSC，0.1％SDS42℃洗膜5分钟。

图10所示的Southern印迹，染色体DNA用BglⅡ或BglⅡ与Ⅰ-SceⅠ限制性内切酶消化。所用探针是来自质粒pAW4.1的2.4kb的BamHⅠ和HindⅢ酶切片段。DNA探针的标记使用Gibcol公司的RTSRadPrime DNA标记系统，用α³²P-dCTP标记。电放射自显影结果是用Instant Imager(Packard)获得的。

实施例1A.实验设计

图8显示了在泡盛曲霉中，用Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点定点整合基因多拷贝的方法的实验设计。本系统基于3种组份，靶序列中含Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点的真菌菌株，含与靶基因座序列同源的序列以及编码一个或多个目的蛋白的基因的多个拷贝序列的修复构建体，以及含编码Ⅰ-SceⅠ限制性内切酶基因的表达盒的质粒。为特异的检测同源重组介导的整合，我们用内源性的pyrG基因作为选择性的标记基因(Gouka等.；Curr.Genet.27(1995)536-540)。首先，我们构建了含缺陷型pyrG基因的质粒。其中包括3’末端编码区的和终止子序列两侧的0.8kb的区域，被Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点替换(pUR5712)。用该质粒，通过在真菌中的基因替代的选择性策略构建了pyrG基因缺陷的泡盛曲霉突变株AWCSCE(参见材料与方法)。其次，修复构建体中含与缺陷的pyrG基因互补的序列，其中编码区的5’端的0.14kb的片段缺失，该修复构建体含有与pyrG基因缺陷的泡盛曲霉突变株中pyrG靶基因座的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点两侧同源的序列。该修复构建体中含唯一的HindⅢ限制性酶切位点，可用于编码一个或多个目的蛋白基因的多个拷贝的插入。完整的修复构建体的插入片段两侧有NotⅠ酶切位点，这使得去除载体DNA序列，仅插入片段转化泡盛曲霉成为可能。第三，Ⅰ-SceⅠ限制性内切酶基因的表达盒由启动子，人造Ⅰ-SceⅠ限制性内切酶的ORF(美国专利号；5，474，896；1992年11月5日提交)以及终止子构成，其中启动子来自黑曲霉的高效表达的甘油醛-3-磷酸脱羟基酶(gpdA)(Punt等.；Gene 56(1987)117-124)，终止子是构巢曲霉的trpC基因的终止子(Mullaney等.；Mol.Gen.Genet.199(1985)37-45)。当表达质粒与修复构建体共同引入AWCSCE菌株的原生质体时，Ⅰ-SceⅠ限制性内切酶的暂时性表达可以在Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点引入双链断裂，因此增强了修复构建体同源重组和多基因拷贝的整合。或者，通过与限制性介导的整合类似的方法(REMI；Kuspa and Loomis，美国国家科学院院刊。89(1992)8803-8807；Redman and Rodriguez，Exp.Mycol.18(1994)230-246；Brenneman等美国国家科学院院。93(1996)3608-3612)将Ⅰ-SceⅠ限制性内切酶直接引入细胞。由于同源重组将恢复完整的pyrG基因，因此重组可以通过在无尿苷的MM平板上培养转化细胞直接筛选出来。

实施例1B确定泡盛曲霉中天然的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点的存在事件

在本发明的系统建立之前，我们确定了泡盛曲霉中是否天然存在Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点。Ⅰ-SceⅠ限制性内切酶识别的酶切位点有18个碱基，统计分析中6.9×10¹⁰碱基中(4¹⁸)或每18500个泡盛曲霉基因组中仅有一个这样的排列，因此在泡盛曲霉基因组似乎不可能存在Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点。

为确定是否存在天然的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点，采用Southern印迹分析泡盛曲霉基因组DNA。基因组DNA用不在Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点中作用的Sau3A Ⅰ消化，产生更适于进行Southern印迹的较小的片段，然后用标记的寡核苷酸探针杂交。包括作为对照的，用各含单拷贝的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点并代表每个基因组合单拷贝，20和200拷贝的位点的质粒pUR5712和pSCM522(含有Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点的对照DNA，使用Boehringer Mannheim公司的Ⅰ-SceⅠ限制性内切酶)重构的质粒。用18bp代表Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点的、末端标记的寡核苷酸探针杂交。放射自显影结果见图9，其中作为对照的单拷贝的重构质粒有一条清晰的杂交条带(泳带3和6)，而含泡盛曲霉基因组DNA的第四第五条泳道中无杂交条带。该结果证实在泡盛曲霉基因组DNA中无天然的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点。因此，通过特定的基因工程技术将独特的Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点引入基因组中所选的基因座，然后通过在细胞内表达或引入Ⅰ-SceⅠ限制性内切酶而在基因组的该位点引入了独特的双链断裂。

实施例1C泡盛曲霉pyrG突变株AWCSCE的构建，其中在突变的pyrG基因座中含Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点

泡盛曲霉pyrG突变株AWCSCE获得方法如下，用来自质粒pUR5712的突变pyrG基因替换掉染色体上野生型的pyrG基因，突变基因的缺失位点含Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点。因此，用纯化的含来自质粒pUR5712的插入片段的EcoR Ⅰ片段转化泡盛曲霉菌株。每次转化，用10微克的DNA转化2×10⁶原生质体。7次转化共获得11个5-FOA抗性的克隆。与pyrG显型相比，所有这些转化株，都不能在无尿苷的MM平板上生长。提取这些克隆的基因组DNA，作为模板，用MGyr1和MGyr2引物作PCR。这些引物与缺失部分的两侧区域退火，如果是野生型的pyrG基因，将扩增出一条1.13kb长度的片段；如果是突变型的pyrG基因，将扩增出一条0.36kb长度的片段。11个克隆中的两株扩增出突变型的pyrG基因特异的0.36kb的片段，进一步的用Southern杂交分析。其余的9个5-FOA抗性的克隆很可能是自发的突变。DNA用BglⅡ和Ⅰ-SceⅠ限制性内切酶消化，点样，用来自质粒pAW4.1的含泡盛曲霉pyrG基因的BamHⅠ和HindⅢ片段的探针杂交(见图10)。两株突变株和野生型菌株的DNA都含有9.0kb的BglⅡ酶切片段。另外一条2.7kb的BglⅡ酶切片段在野生型茵株中存在(泳带3)，在突变株中不存在，代之以0.5kb的突变pyrG基因特征性的BglⅡⅩ Ⅰ-SceⅠ限制性酶切片段，该片段在缺失部分含Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位点。这些结果证明，这些突变株是由于用来自质粒pUR5712的pyrG突变基因替代了野生型的pyrG基因。因为泳道1的突变株中还有一条接近2.0kb的原因不明的杂交带，所以对泳道2中的突变株作进一步的实验，并命名为AWCSCE。

实施例1D通过Ⅰ-SceⅠ内切酶的表达在pyrG基因座中引入定点整合。

源自pyrG突变型的泡盛曲霉AWCSCE的原生质体，用修复构建体单独转化或与Ⅰ-SceⅠ表达质粒pUR5724一起转化。修复构建体由突变互补的pyrG基因(pUR5718)和含角质素酶表达盒的4个拷贝(pUR5722)或9个拷贝(pUR5725)的重复单元组成。转化之前，用NotⅠ酶切DNA修复构建体，从载体序列中释放出插入片段，并由此产生出与靶基因座同源的末端。转化实验结果见表1。转化率，通过用含野生型pyrG基因的阳性对照的pAW4.2的平行转化来计算。

无Ⅰ-SceⅠ表达载体pUR5724的pUR5718转化，获得了16个重组子，相应的基因打靶率为10.6％，而含Ⅰ-SceⅠ表达载体共转化，获得了63个重组子，相应地的基因打靶率为41.7％。这些结果表明，通过在AWCSCE菌株pyrG基因中引入双链断裂后，用修复构建体pUR5718的基因打靶率将提高近4倍。用含4个角质素酶表达盒的重复单元pUR5722的转化，在无Ⅰ-SceⅠ表达载体pUR5724时，没有获得重组子。这表明基因打靶率低于3.6％。相比之下，含Ⅰ-SceⅠ表达载体pUR5724时，pUR5722的转化获得5个重组子，相应地基因打靶率为18％。结果表明，含有串联排列的4个角质素酶基因的修复构建体的基因打靶，比仅含pyrG基因的修复构建体的pUR5718基因打靶率低2～3倍。而且，这些结果表明，通过在AWCSCE菌株pyrG基因中引入双链断裂后，用修复构建体pUR5722的基因打靶率提高至少5倍。

用含9个角质素酶表达盒的重复片段pUR5725的转化，在无Ⅰ-SceⅠ表达载体pUR5724时，也没有获得重组子。这表明在这种情况下，基因打靶率低于0.6％。相比之下，含Ⅰ-SceⅠ表达载体pUR57254时，pUR5725的转化获得2个重组子，相应地基因打靶率仅为0.4％。结果表明，含有串联排列的9个角质素酶基因的修复构建体的基因打靶，比仅含pyrG基因的修复构建体的pUR5718基因打靶率低20～100倍。

总之，这些结果证明，通过在AWCSCE菌株pyrG基因中引入双链断裂后，用含外源基因的多拷贝的修复构建体的基因打靶率仅是一种可能性。当修复构建体中所含基因拷贝数增加时，修复构建体的基因打靶效率将很低。这进一步的证实了在前面本发明的背景资料和相关领域资料中提出的多基因拷贝的定点整合问题。

实施例1E重组事件的Southern印迹分析

通过在MM平板上划线接种分生孢子，来确证几个野生型表型的重组子。其中包括在Ⅰ-SceⅠ存在和不存在时，用pUR5718转化分别获得的9个和10个重组子，以及用pUR5722和pUR5725转化获得的全部克隆。这些克隆中的10个重组子，每个克隆的分生孢子在MM平板上划线接种。分离分生孢子，然后接种培养以获得提取基因组DNA的菌丝体。DNA分离与Southern印迹方法见材料与方法。基因组DNA用BglⅡ和SalⅠ消化，Southern印迹所用探针为源自pAW4.1的2.4kb的BamHⅠ和HindⅢ酶切pyrG基因片段，或者是包含源自木聚糖内切酶基因终止子(pUR5729)的0.46kb的AflⅠ和SacⅠ的片段，或者是含Ⅰ-SceⅠ基因的0.72kb的BamHⅠ和SalⅠ的片段或pJB8载体。Southern杂交实验设计见图11，用pyrG基因和TexlA基因探针所作的放射自显影结果分别在图12A和12B中描述。Southern印迹中野生型泡盛曲霉基因组DNA用SalⅠ消化，获得在2.4kb、3.3kb和3.8kb获得杂交结果(见图12A，第4泳道)。突变型泡盛曲霉AWCSCE株中，获得杂交结果中的3.0kb的带代替了3.8kb的带(见图12A，第5泳道)。用pUR5718获得的转化体中完整pyrG基因恢复，将导致用3.7kb杂交带代替3kb的条带(见图12A，第1-3泳道)。后一条带与野生型菌株相同片段在大小方面的小差异，是由于pUR5718修复构建体中pyrG基因3’一侧的0.15kb的标记的缺失。由于在角质素酶表达盒中无SalⅠ位点，用质粒pUR5722(含4个角质素酶基因拷贝)和pUR5725(含9个角质素酶基因拷贝)预期将以9.6kb和17.1kb的条带替代3kb的条带。这种替换在pUR5725和pUR5722转化的重组子中可见，这证明了在泡盛曲霉中成功地一步定点整合了多基因拷贝。意想不到的是，在其它的重组子中，在重组过程中，角质素酶基因的一个或多个拷贝丢失。其余的pUR5722转化的重组子中含2个拷贝(见图12A，第9，11和12泳道)，或者仅含一个拷贝(见图12A，第8泳道)。其它的pUR5722转化的重组子(见图12A，第6泳道)中含3个拷贝。

图12B所述的是用BglⅡ消化的基因组DNA的Southern印迹结果，所用探针为TexlA探针。该探针与内源性的exlA基因和引入的角质素酶基因表达盒的多拷贝杂交。因此，野生型的菌株，突变型的AWCSCE菌株和用pUR5718转化的重组子，仅获得6kb的杂交带，该带代表内源性的exlA基因(泳带1-5)。由于角质素酶基因表达盒中含有一个BglⅡ酶切位点，用该酶消化后，在含角质素酶基因表达盒的多拷贝重组子中，将产生1.5kb的条带。重复片段与内源性exlA基因的相对密度反映了存在的角质素酶基因的拷贝数。用pUR5725转化的重组子(泳带6，7)还含有一条1.5kb的条带。该条带的密度相应与3个(带6)或9个(带7)角质素酶基因拷贝数，同时还可以通过片段的大小来确定(图12A)。用pUR5722转化的重组子同样证实了这一点。由于角质素酶基因拷贝相应于pyrG基因的方向的不同，BglⅡ酶切将产生1.5kb和2kb的条带。条带8重组子仅含重复片段，表明仅有单拷贝的角质素酶基因。条带9，11，12重组子含重复片段且密度一致，表明有2个拷贝的角质素酶基因。条带10重组子含重复片段且密度是BORDE片段的3倍多，表明有4个拷贝的角质素酶基因。为了证实重组子中，是否有其它的DNA，如粘粒载体序列或含Ⅰ-SceⅠ表达盒的质粒等共整合到基因组中，同样用Southern杂交，所用探针为包括Ⅰ-SceⅠ基因的0.72kb的BamHⅠ和SalⅠ的片段或pJB8载体(SalⅠ酶切片段)。杂交结果证实：除了pUR5725转化的重组子中有9个拷贝的角质素酶基因外，重组子全都没有其它DNA的整合。(结果未显示)。这表明有可能用于构建食品级的菌株，该菌株含基因的多拷贝而无其它的外源DNA。应当注意的是这里所述的实验中，pUR5722和pUR5725插入片段在转化之前没有进行纯化。而且，可能通过直接转入内切酶而不是应用Ⅰ-SceⅠ表达载体。这些改进将会进一步的提高不含外源DNA菌株的筛选。

本实施例表明：在霉菌中定点整合基因多拷贝的方法的优点是：

-多基因拷贝能够在基因组的预定基因座中引入

-提高在霉茵细胞的靶染色体中引入特定的双链断裂能明显的提高多基因拷贝的定点整合的可能性

-本方法获得的霉茵菌株中无细菌抗生素抗性标记基因或类似复制启动子一类的其它细菌序列，结果获得的霉菌菌株或产生的产物被称为食品级的产物。

参考文献-Archer et al.Antonie Van Leeuwenhoek 65(1994)245-250-Boeke et al.分子和普通遗传学197(1984)345-346-Brenneman et al.美国国家科学院院报  93(1996)3608-3612-Cami，B.and Kourilsky，p.；核酸研究5(1978)2381-Choulika et al.分子和细胞生物学15(1995)1968-1973-Choulika et al.国际合作条约组织国际申请公开WO96/14408(1996)-Colleaux et al.细胞44(1986)521-533-Colleaux et al.美国国家科学院院报  85(1988)6022-6026-Dujon et al.，巴斯德研究所(巴黎)和1992年11月5日提交的美国专利5474896-De Massy and Nicolas，欧洲分子生物学杂志12(1993)1459-1466)-Gimble and Thorner，自然357(1992)301-306-Gouka et al. 应用和环境微生物学   62(1996)1951-1957-Gouka et al.；应用微生物学和生物工程学 46，(1996)28-35-Gouka et al.；现代遗传学  27(1995)536-540-Halfter et al.分子和普通遗传学 231(1992)186-193-Hanahan；发子生物学杂志166(1983)557-580-Hamilton et al.；美国国家科学院院刊  93(1996)9975-9979-Ish-Horowicz，D.and Burke，J.F.；核酸研究9(1981)2989-Jasin，TIG 12(1996)224-228-Kucherlapati，R.and G.R.Smith(1988)编辑，遗传重组，华盛顿特区：美国微生物学联合会-Kuspa and Loomis，美国国家科学院院刊  89(1992)8803-8807-Lee et al.植物细胞 2(1990) 415-425-Lin et al.，分子细胞生物学 4(1984)1020-1034-Marsh et al.；基因32(1984)481-485-Meselson and Radding，美国国家科学院院报 72(1975)358-361-Mullaney et al.分子和普通遗传学199(1985)37-45-Nicolas et al.自然  338(1989)35-39-Offringa et al.欧洲分子生物学杂志 9 (1990) 3077-3084-Paszkowski et al.欧洲分子生物学杂志 7(1988) 4021-4026-Puchta et al.美国国家科学院院报 21(1993) 5034-5040-Puchta et al.美国国家科学院院报 93(1996) 5055-5060-Punt et al.；基因56(1987)117-124-Punt and van den Hondel；酶学方法216(1993)447-457-Redman and Rodriguez，Exp.Mycol.18(1994)230-246-Rouet et al.美国国家科学院院报  91(1994)6064-6068-Rouet et al.分子细胞生物学    14(1994)8096-8106-Royer et al.；生物工程      13(1995)1479-1483-Sambrook et al.；分子克隆一实验指南。冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)-Sargent et al.分子细胞生物学17(1997)267-277-Smith et al.核酸研究        24(1995)5012-5019-Strathern et al.细胞  31(1982)183-192-Sun et al.自然  338(1989)87-90-Sun et al.细胞 64(1991)1155-1161-Szostak et al.，细胞33 breaks(1983)25-35-Thomas and Cappechi，自然 346(1990) 847-850-Timberlake，Bennett和Lasure所编之书“真菌中更多的基因操作”之“基因克隆和分析”(第3章)(1991)，51-58-van den Hondel et al.；BenneH行Lasure所编的书《真菌中更多的基因操作》之“丝状真菌中杂合基因的表达”(18章)(1991)，397-428.-van den Hondel and Punt，Peberdy等编《应用分子遗传学》之“基因转移系统和载体开发”(第1章)(1991)1-28。-van den Hondel et al.Antonie van Leeuwenhoek 61(1992)153-160-Van Gemeren et al.；生物工程学杂志40(1995)155-162-Van Gemeren et al．；应用微生物学和生物工程

学杂志45，(1996)755-763-Van Gemeren，“在泡盛曲霉中表达和分泌限定的角质素酶变体”

(第5章)Thesis Univetsity of Utrecht(1997)ISBN 90-393-1229-X-Verdoes et al.Transgenic Research 2(1993)84-92-Verdoes，“用于通过丝状真菌过量生产真菌蛋白的菌株改进策略”。(Chapter 1)Thesis Free University Amsterdam (1994)-Verdoes et al.；应用微生物学和生物工程 43(1995)195-205-Wenzlau et al.细胞 56(1989) 421-430-Zimmer and Gruss，自然338(1989)150-153-Zin and Butow，细胞40(1985)887-895

序列表(1)一般信息：

(ⅰ)申请人：(除了美国之外)

  (A)姓名：Unilever N.V.

  (B)街道：Weena 455

  (C)城市：Rotterdam

  (E)国家：荷兰

  (F)邮编：(ZIP)NL-3013

(ⅰ)申请人：(除了美国之外)

  (A)姓名：Unilever PLC

  (B)街道：Unilever House，BlackfriarsWeena 455

  (C)城市：伦敦

  (E)国家：英国

  (F)邮编：(ZIP)EC4P 4BP(GB)

(ⅰ)申请人：(仅对美国)

  (A)姓名：Marcellus Johnannes Augustinus DE GROOT

     c/o Unilever Reseach Vlaardingen

  (B)街道：Olivier Van Noortlaan120

  (C)城市：Vlaardingen

  (E)国家：荷兰

  (F)邮编：(ZIP)NL-3013

(ⅰ)申请人：(仅对美国)

  (A)姓名：Alida Godelieve Maria Beijersbsergen

    c/o Unilever Reseach Vlaardingen

  (B)街道：Olivier Van Noortlaan120

  (C)城市：Vlaardingen

  (E)国家：荷兰

  (F)邮编：(ZIP)NL-3013

(ⅰ)申请人：(仅对美国)

  (A)姓名：Wouter Musters

     c/o Unilever Reseach Vlaardingen

  (B)街道：Olivier Van Noortlaan120

  (C)城市：Vlaardingen

  (E)国家：荷兰

  (F)邮编：(ZIP)NL-3013

(ⅱ)发明题目：霉菌中定点整合基因多拷贝的方法

(ⅲ)序列数：4

(ⅳ)计算机可读形式：

  (A)介质类型：软盘

  (B)计算机：IBM PC兼容机

  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

  (D)软件：Patent In Release # 1.0VERSON # 1.30

    (EPO)

(ⅴ)现有申请材料：

申请号：(未知)(2)SEQ ID NO1：的信息：

(ⅰ)序列特征

  (A)长度：18碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

  (A)描述：/DESC=‘合成DNA’

(ⅶ)早期来源：

  (B)克隆：Ⅰ-SceⅠ限制性内切酶位点来自啤酒糖酵母

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：1TAGGGATAAC AGGGTAAT                          18(2)SEQ ID NO2：的信息：

(ⅰ)序列特征

  (A)长度：20碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

   (A)描述：/DESC=‘合成DNA’

(ⅶ)早期来源：

   (B)克隆：含EcoR Ⅰ和Not Ⅰ位点的合成接头替代EcoR

    Ⅰ/HindⅢ多聚接头片段，破坏HindⅢ位点

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：2AATTCATGCG GCCGCTAGCT                        20(2)SEQ ID NO3：的信息：

(ⅰ)序列特征

  (A)长度：21碱基

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

  (A)描述：/DESC=‘合成DNA’

(ⅶ)早期来源：

  (B)克隆：引物MGGPD1

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：3GACAAGGTCG TTGCGTCAGT C                        21(2)SEQ ID NO4：的信息：

(ⅰ)序列特征

  (A)长度：35碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

  (A)描述：/DESC=‘合成DNA’

(ⅶ)早期来源：

  (B)克隆：引物MGgpd2

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：4CGGGATCCTT CCATATGTGA TGTCTGCTCA AGCGG                 35(2)SEQ ID NO5：的信息：

(ⅰ)序列特征

  (A)长度：20碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

  (A)描述：/DESC=‘合成DNA’

(ⅶ)早期来源：

  (B)克隆：引物MGPyr1

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：5GCCAGTACAC TACTTCTTCG                       20(2)SEQ ID NO6：的信息：

(ⅰ)序列特征

 (A)长度：20碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

 (A)描述：/DESC=‘合成DNA’

(ⅶ)早期来源：

 (B)克隆：引物MGPyr2

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：6AGGAGATCGC GAGAAGGTTG                       20

Claims (16)

1．一种在霉菌中定点整合基因多拷贝的方法，该方法包括：

(ⅰ)提供一种霉菌细胞，其中在其染色体DNA中含有稀有内切酶的限制性位点，

(ⅱ)用一种DNA转化该霉菌细胞，所说DNA按照5’到3’方向顺序含：

(a)第一段DNA片段，与霉菌染色体DNA中所含的稀有切点的内切酶限制性位点的上游部分和相邻的DNA同源，

(b)至少一个表达性基因的多拷贝，其中含有编码目的蛋白的结构基因，

(c)第二段DNA片段，与霉菌染色体DNA中所含的稀有切点的内切酶限制性位点的下游部分和相邻的DNA同源，

在霉菌转化过程中，提供了稀有切点的内切酶，

(ⅲ)筛选或检出所说表达基因多拷贝被插入到霉菌染色体DNA中的霉菌细胞。

2．根据权利要求1的方法，其中稀有切点内切酶是Ⅰ-SceⅠ。

3．根据权利要求1的方法，其中稀有切点内切酶切点被引入预定的基因座。

4．根据权利要求3的方法，其中预定的基因座位于选择性标记基因内部或与之相邻。

5．根据权利要求4的方法，其中所述的DNA包含第三DNA片段，该片段能够使染色体上的破坏或部分缺失的选择性标记基因完整。

6．根据权利要求4的方法，其中霉菌染色体DNA中稀有切点的限制性酶切位点的上游的DNA部分，与第一段DNA同源，是选择性标记基因的一部分。

7．根据权利要求4的方法，其中霉菌染色体DNA中稀有切点的限制性酶切位点的下游的DNA部分，与第二段DNA同源，是选择性标记基因的一部分。

8．根据权利要求1的方法，其中稀有切点内切酶切点在霉菌染色体DNA天然存在。

9．根据权利要求1的方法，其中有两个或多个稀有切点内切酶切点存在。

10．根据权利要求1的方法，其中表达性基因包含：(1)在所述霉菌中可操作的启动子(2)可选可不选的编码分泌信号肽的DNA片段，以利于目的蛋白从所述霉菌中分泌出来，(3)编码目的蛋白的结构基因(4)可选可不选的在所述霉菌中可操作的终止子，其中启动子和可选可不选地的终止子控制了结构基因的表达。

11．根据权利要求1的方法，其中在转化过程中通过加入所述内切酶提供稀有切点的内切酶，和/或通过与编码稀有切点内切酶的DNA共转化霉菌在原位形成稀有切点的内切酶，上述DNA可在转化过程中或转化后表达。

12．根据权利要求1的方法，其中霉菌选自真菌门，优选选自子囊菌亚门，担子菌亚门，鞭毛菌亚门，接合菌亚门和半知菌亚门。

13．根据权利要求12的方法，其中霉菌选自曲霉属的霉菌，优选泡盛曲霉。

14．按照权利要求1中的方法获得的转化霉菌。

15．一种用于培养按照权利要求1中的方法或通过这类方法获得转化霉菌的培养方法。

16．一种生产和可选可不选地分泌目的蛋白的方法，该方法通过在一定条件下实施权利要求15的方法使编码所述目的蛋白的结构基因得以表达，和可选可不选地分离和浓缩目的蛋白方法。

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