DE69132812T2 - Pichia pastoris Säure-Phosphatase-Gen - Google Patents
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Description
- Diese Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten Biotechnologie unter Verwendung von Hefe-Wirtssystemen und -Expressionsvektoren. In einem Aspekt betrifft die Erfindung neue DNA-Fragmente, die einen Teil oder das gesamte Saure Phosphatase-Gen der Hefe Pichia pastoris enthalten (SEQ ID NO: 1). In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung neue Vektoren, die DNA- Fragmente enthalten, die von dem Saure Phosphatase-Gen von Pichia pastoris (SEQ ID NO: 1) abgeleitet sind. In wiederum einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Wirtszellen, die mit Vektoren transformiert sind, die Fragmente enthalten, die von dem Saure Phosphatase-Gen von Pichia pastoris (SEQ ID NO: 1) abgeleitet sind, In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung der vorangehend beschriebenen DNA-Fragmente zur Ermöglichung der Expression und/oder Sekretion von heterologen Proteinen in Hefe.
- Da sich die rekombinante DNA-Technologie in den letzten Jahren entwickelt hat, ist die kontrollierte Erzeugung einer enormen Vielfalt von nützlichen Polypeptiden durch Mikroorganismen möglich geworden. Viele Polypeptide, wie z. B. das menschliche Wachstumshormon, Leukozyten-Interferone, menschliches Insulin, und humanes Proinsulin sind bereits durch verschiedene Mikroorganismen hergestellt worden. Es wird erwartet, daß die fortgesetzte Anwendung dieser Verfahren, die bereits zur Verfügung stehen, die Erzeugung einer Vielzahl anderer nützlicher Polypeptid-Erzeugnisse erlaubt.
- Die grundlegenden Verfahren, die in dem Gebiet der rekombinanten DNA- Technologie eingesetzt werden, sind dem Fachmann bekannt. Die Elemente, die wünschenswerterweise zur Ausübung der rekombinanten DNA-Technologie vorliegen, schließen die folgenden ein, sind aber nicht darauf begrenzt:
- (1) ein Gen, das für ein oder mehrere gewünschte Polypeptide kodiert, und auf funktionelle Weise mit angemessenen Kontrollsequenzen assoziiert ist, die zur Expression des Gens in dem Wirtsorganismus erforderlich sind;
- (2) ein Vektor, in den das Gen eingesetzt werden kann;
- (3) ein geeigneter Wirtsorganismus, in den der das Gen tragende Vektor transformiert werden kann;
- (4) wenn eine Sekretion eines heterologen Proteins gewünscht ist, eine Signalsequenz, die das heterologe Protein in den Sekretionsweg der Wirtszelle leiten kann und danach aus der Zelle hinaus;
- (5) ein Transformationssystem; und
- (6) ein Verfahren zum Selektieren von Transformanden.
- Es können rekombinante Genkonstrukte derart entworfen werden, daß das rekombinante Protein den sekretorischen Weg des Wirts durchläuft, und in das Wachstumsmedium sekretiert wird. Die Sekretion ist aus mehreren Gründen eine erwünschte Art der rekombinanten Expression. Erstens besitzen einige heterologe Proteine einen toxischen Effekt auf den Wirtsorganismus. Wenn derartige heterologe Genprodukte sekretiert werden anstatt innerhalb des Wirts akkumuliert zu werden, ist es weniger wahrscheinlich, daß sie die normalen zellulären Funktionen stören. Zweitens sind einige Proteine, die inaktiv sind, wenn sie intrazellulär erzeugt werden, aktiv, wenn sie sekretiert werden. Drittens vermeidet eine Sekretion in das Medium die Notwendigkeit des Aufbrechens der Wirtszellen, um das Produkt wiederzugewinnen. Die Produktreinigung ist viel leichter und kostengünstiger, wenn das Erzeugnis in dem Wachstumsmedium vorliegt. Und viertens kann das gewünschte Erzeugnis auf kontinuierliche Weise entfernt werden und das Medium rezyklisiert werden, da das rekombinante Erzeugnis in dem Wachstumsmedium vorliegt.
- Die meisten sekretierten Proteine werden anfänglich innerhalb der Zelle in einer Vorläufer- oder einer Präprotein-Form exprimiert, die eine angefügte aminoterminale Verlängerung enthält, die ein Signalpeptid genannt wird. Das Signalpeptid spielt eine wesentliche Rolle bei dem Transport des angehängten Polypeptids in und/oder durch die begrenzenden zellulären Membranen. Dieses Signalpeptid wird dann proteolytisch durch eine Signalpeptidase während oder nach der Sekretion unter Erhalt eines maturierten Proteinprodukts gespalten.
- Die Sekretion eines heterologen oder fremden Proteins kann erzielt werden, indem die kodierende Sequenz der heterologen DNA an eine DNA geknüpft wird, die ein Signalpeptid kodiert. Es wäre wünschenswert, eine Signalsequenz zu isolieren, die dieses Signalpeptid kodiert, das eine Sekretion ermöglichen bzw. erleichtern würde.
- Die Signalsequenzen sind insbesondere bei der Bildung von Expressionsvektoren nützlich. Die Verwendung derartiger Vektoren würde es möglich machen, geeignete Wirtszellen zu transformieren, so daß sie die heterologen Genprodukte erzeugen und sekretieren. Beispiele von "leader"-Sequenzen, die verwendet worden sind, um erfolgreich rekombinante Proteine aus Hefewirten zu sekretieren, schließen jene aus dem Alpha-Paarungsfaktor von Saccharomyces cerevisieae, den a-Paarungsfaktor und die Killertoxin-Gene ein. Die Isolierung einer Signalsequenz aus einer methylotrophen Hefe wie Pichia pastoris ist nicht beschrieben worden.
- Zweckmäßigerweise kann der Promoter, der in derartigen Vektoren verwendet wird, um die Expression der heterologen Genprodukte zu regulieren, der Promoter sein, der natürlicherweise mit der Signalsequenz assoziiert ist. Es würde besonders vorteilhaft sein, wenn der Promoter, der natürlich mit der Signalsequenz assoziiert ist, ein hohes Niveau an DNA-Transkription bereitstellt und auf exogene Umweltreize anspricht. Ein Beispiel eines derartigen Promoters ist die 5'-gelegene regulatorische Region des Saure Phosphatase (PHO1)-Gens von Pichia pastoris (SEQ ID NO: 2), das mit einem hohen Niveau in Antwort auf die Abwesenheit von Phosphat in dem Medium transkribiert wird, und durch die Anwesenheit von Phosphat in dem Medium reprimiert wird.
- Es ist oft wünschenswert, einen Pichia pastoris-Wirt mit einem rekombinanten DNA-Konstrukt zu transformieren, das an einer genauen Position in dem Pichia pastoris-Genom integrieren wird. Die 5'- und 3'-gelegenen Sequenzen, die das Pichia pastoris-PHO1-Gen flankieren, ebenfalls bekannt als das erste bzw. zweite einsetzbare DNA-Fragment, werden in Expressionsvektoren verwendet, um die Integration der rekombinanten Sequenzen an dem PHO1-Lokus zu leiten. Die Fähigkeit zur Integration von rekombinanten DNAs an den PHO1-Lokus ist aus mindestens zwei Gründen vorteilhaft: 1) bei der Entwicklung von Expressionsstämmen von Pichia pastoris, die vielfache Kopien der gleichen oder anderen Expressionskassetten an dem PHO1-Lokus oder einem anderen Pichia-Lokus besitzen, oder 2) eine stabile Integration einer oder mehrerer Expressionskassetten allein am PHO1-Lokus, in einem Pichia pastoris-Wirtsstamm, wobei die Zerstörung eines essentiellen Gens oder eines Gens des Methanol-Stoffwechselweges unerwünscht ist.
- Zellen, in denen das PHO1-Gen zerstört worden ist, zeigen einen gleichzeitigen Verlust der Saure Phosphatase-Enzymaktivität. Auf den PHO&supmin;-Phänotyp, der auf eine PHO1-Genzerstörung hindeutet, kann ein Screening durchgeführt werden, in dem die Zellen auf Niedrig-Phosphat-Indikatorplatten plattiert werden, und Kolonien über Nacht wachsen gelassen werden. Kolonien, in denen das PHO1- Gen zerstört ist, sind weiß, während solche Kolonien, die ein intaktes PHO1-Gen besitzen, grün sind. Dieser colorimetrische Durchmusterungsprozeß/Screen stellt ein schnelles und leichtes Verfahren zum Nachweisen von Zellen bereit, die Expressionskassetten auf richtige Weise an dem PHO1-Lokus integriert haben, und diesen dadurch zerstörten. Es würde daher einen wesentlichen Beitrag zum Stand der Technik bilden, eine Signalsequenz zu isolieren, die die Sekretion von Proteinen aus einer Wirtszelle ermöglicht/erleichtert.
- Zusätzlich würde es vorteilhaft sein, eine 5'-gelegene regulatorische Region zu isolieren, die hohe Niveaus an DNA-Transkription bereitstellt, und die auf exogene Umweltreize anspricht. Gegenwärtig ist keine 5'-gelegene regulatorische Region im Stand der Technik bekannt, die auf einem hohen Niveau in Antwort auf die Abwesenheit von Phosphat in dem Medium transkribiert wird, und die verwendet werden kann mit der hochproduktiven Fermentationshefe Pichia pastoris.
- Es würde weiterhin vorteilhaft sein, das Strukturgen der Saure Phosphatase ("acid phosphatase", AP) zu isolieren.
- Es würde ebenfalls vorteilhaft sein, neue Vektoren bereitzustellen, die Fragmente des Saure Phosphatase-Gens umfassen.
- Es würde zusätzlich vorteilhaft sein, eine 3'-gelegene Transkriptions- Terminationssequenz zu isolieren.
- Es würden ebenfalls vorteilhaft sein, integrative Vektoren bereitzustellen, die die Integration an dem Pichia pastoris-PHO1-Lokus lenken. Es würde zusätzlich vorteilhaft sein, ein Verfahren zur Identifizierung von Zerstörten ("disruptants") bereitzustellen.
- Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Signalsequenz bereitzustellen, die die Sekretion von Proteinen aus Zellen ermöglicht bzw. erleichtert.
- Es ist weiterhin eine Aufgabe dieser Erfindung, eine 5'-gelegene regulatorische Region bereitzustellen, die in Antwort auf die Abwesenheit von Phosphat transkribiert wird.
- Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, die DNA-Sequenz des Strukturgens der Saure Phosphatase von Pichia pastoris (SEQ ID NO: 4) bereitzustellen.
- Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, neue Vektoren bereitzustellen, die eine regulatorische Region und/oder eine Signalsequenz umfassen, die auf funktionsfähige Weise mit einer heterologen DNA-Sequenz verknüpft sind, die mindestens ein Polypeptid kodiert, und Mittel zum Induzieren dieser regulatorischen Region zur Erleichterung der Expression der heterologen DNA-Sequenz.
- Es ist noch eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, eine 3'-gelegene Transkriptions-Terminationssequenz aus dem Saure Phosphatase-Gen bereitzustellen.
- Wiederum eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, integrative Vektoren bereitzustellen, die die Integration an dem Pichia pastoris-PHO1-Lokus lenken würden.
- Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein Verfahren zur Identifizierung von Null-Mutanten ("disruptants") bereitzustellen.
- Weitere Aspekte, Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der vorliegenden Beschreibung, den Beispielen und den Ansprüchen ersichtlich.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein neues DNA-Fragment bereitgestellt, das die Signalsequenz des Sauren Phosphatase-Gens von Pichia pastoris (SEQ ID NO: 3) umfaßt, das die Sekretion von Proteinen aus Zellen erleichtert/ermöglicht. In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird ein neues DNA-Fragment bereitgestellt, das die 5'-regulatorische Region der Sauren Phosphate von Pichia pastoris umfaßt (SEQ ID NO: 2).
- In wiederum einem anderen Aspekt dieser Erfindung wird ein neues DNA- Fragment bereitgestellt, das die DNA-Sequenz des Strukturgens der Sauren Phosphatase ("acid phophatase", AP) von Pichia pastoris umfaßt (SEQ ID NO: 4).
- Wiederum ein anderer Aspekt dieser Erfindung stellt neue Vektoren bereit, die die regulatorische Region und/oder die Signalsequenz auf funktionsfähige Weise verknüpft mit einer heterologen DNA-Sequenz umfassen, die mindestens ein Polypeptid kodiert, und Mittel zum Induzieren dieser regulatorischen Region bereitstellen, um die Expression der heterologen DNA-Sequenz zu ermöglichen/erleichtern.
- In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung werden neue DNA-Vektoren bereitgestellt, die eine 3'-Transkriptions-Terminationssequenz aus dem Sauren Phosphatase-Gen von Pichia pastoris (SEQ ID NO: 5) umfassen.
- Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung stellt integrative Vektoren bereit, die die Integration des Vektors an dem PHO1-Lokus von Pichia pastoris lenken.
- Wiederum ein weiterer Aspekt der Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens zum Identifizieren von Null-Mutanten ("disruptants).
- Fig. 1 stellt eine Restriktionskarte des Saure Phosphatase-Gens von Pichia astoris (SEQ ID NO: 1) dar.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein neues isoliertes DNA-Fragment bereit, das ein Saure Phosphatase-Gen umfaßt, einschließlich seines Promoters (oder der 5'- regulatorischen Region), der Signal-, der Transkriptions-, der Terminations- und der flankierenden Sequenzen, abgeleitet aus Pichia pastoris (SEQ ID NO: 1).
- Die Saure Phosphatase ("acid phosphatase", AP) ist ein extrazelluläres Enzym, das von Pichia pastoris und anderen Hefen unter Bedingungen des Mangels an anorganischem Phosphat sekretiert wird. Die sekretierte Saure Phosphatase katalysiert die Entfernung von Phosphat aus organischen Substraten, und stellt auf diese Weise Phosphat für das Zellwachstum und das Überleben der Zelle bereit.
- Das Gen, das für die Saure Phosphatase kodiert, ist aus mehreren Hefespezies isoliert und studiert worden, und die regulierbare Natur der Expression des Saure Phosphatase-Gens ist in dem Saure Phosphatase-Promoterelement lokalisiert worden. Unter Bedingungen von niedrigen Medienkonzentrationen an anorganischem Phosphat wird der Promoter (oder die 5'-regulatorische Region) der Sauren Phosphatase angeschaltet, das Saure Phosphatase-Gen wird transkribiert und anschließend in das Saure Phosphatase-Enzym translatiert. Das neu synthetisierte Saure Phosphatase-Enzym setzt Phosphat aus organischen Substraten frei und stellt das Phosphat der Zelle zur Verfügung. Der anschließende Anstieg der Phosphatkonzentration moduliert den Saure Phosphatase-Promoter, was zu einer herabgesetzten Saure Phosphatase-Gen-Transkription, begleitet von einem herabgesetzten Bedarf an Saure Phosphatase-Proteinen, führt. Somit kann der Saure Phosphatase-Promoter induziert oder reprimiert durch niedrige bzw. hohe Phosphatkonzentrationen werden. Die Identifizierung und Isolierung des Saure Phosphatase-Promoters von Pichia pastoris ist bedeutend. Da die Regulation der Expression der Sauren Phosphatase unter den Hefespezies, für die diese Expression analysiert worden ist, variiert, wird erwartet, daß die enge Regulation, die für die Saure Phosphatase-Expression in Pichia pastoris beobachtet wurde, von der Verfügbarkeit und der Verwendung der homologen Promotersequenzen abhängt. Die Identifizierung und Isolierung der Signalsequenz des PHO1-Gens von Pichia pastoris (SEQ ID NO: 3) ist dahingehend von Bedeutung, das sie zusätzlich zu der Tatsache, daß sie die erste Signalsequenz ist, die von einem Pichia pastoris Gen isoliert wurde, die erste Signalsequenz darstellt, die von einer methylotrophen Hefe isoliert wurde. Es wurde festgestellt, daß es zu nativen Gen- Signalsequenzen, z. B. der Signalsequenz des t-PA ("Tissue Plasminogen Activator", Gewebeplasminogenaktivator) oder der Invertasegene gleichwertig oder überlegen ist beim Lenken der Sekretion von heterologen Proteinen aus Pichia pastoris, z. B. t-PA oder Invertase.
- Es ist oft wünschenswert, rekombinante Expressionsvektoren in das Wirtsgenom zu integrieren, anstatt sie als autonom replizierende Elemente zu halten. Integrierte Vektoren sind bedeutend stabiler als autonome Vektoren, und sind für die Ausübung der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Insbesondere sind lineare stellenspezifische integrative Vektoren, wie in US-Patent 4,882,279 beschrieben, das hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird, bevorzugt. Derartige Vektoren umfassen eine seriell angeordnete Sequenz von mindestens 1) einem ersten einsetzbaren DNA-Fragment; 2) einem selektierbaren Markergen; und 3) einem zweiten einsetzbaren DNA-Fragment.
- Die ersten und zweiten einsetzbaren DNA-Fragmente sind jeweils mindestens etwa 200 Nukleotide lang und besitzen Nukleotidsequenzen, die zu Anteilen der genomischen DNA der zu transformierenden Spezies homolog sind. Die verschiedenen Komponenten des integrativen Vektors sind seriell angeordnet unter Bildung eines linearen DNA-Fragmentes derart, daß die Expressionskassette und das selektierbare Markergen zwischen dem 3'-Ende des ersten einsetzbaren DNA- Fragments und dem 5'-Ende des zweiten einsetzbaren DNA-Fragments angeordnet sind. Das erste und zweite DNA-Fragment sind in bezug aufeinander in dem seriell angeordneten linearen Fragment so angeordnet, wie sie auch in dem parentalen Genom orientiert sind. Die Nukleotidsequenzen, die als das erste und zweite einsetzbare DNA-Fragment nützlich sind, sind Nukleotidsequenzen, die mit getrennten Anteilen der nativen genomischen Stelle homolog sind, an der die genomische Modifikation geschehen soll. Beispielsweise wenn eine genomische Modifikation an dem Lokus des Saure Phosphatase-Gens geschehen soll, müssen die beiden einsetzbaren DNA-Fragmente in dem linearen Fragment in bezug aufeinander in der gleichen relativen Orientierung orientiert sein, wie sie auch in dem parentalen Genom existieren. Beispiele für Nukleotidsequenzen, die als das erste und zweite einsetzbare DNA-Fragment verwendet werden könnten, sind Nukleotidsequenzen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus dem Saure Phosphatase-PHO1-Gen, dem Alkohol-Oxidase-AOX1-Gen, dem Histidinol- Dehydrogenase-HIS4-Gen und dem Dihydroxyaceton-Synthetase-DHAS-Gen besteht.
- Das erste einsetzbare DNA-Fragment kann eine funktionelle regulatorische Region enthalten, die die regulatorische Region umfassen kann, die in der Expressionskassette verwendet wird. Die Verwendung des ersten einsetzbaren DNA-Fragments als die regulatorische Region für eine Expressionskassette ist eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung. Wahlweise kann die Insertionsstelle oder Insertionsstellen und eine 3'-Terminationssequenz direkt 3'-gelegen zu dem ersten einsetzbaren DNA-Fragment platziert werden. Diese Konformation des linearen stellenspezifischen integrativen Vektors besitzt den zusätzlichen Vorteil des Bereitstellens einer fertigen Stelle für die Insertion eines Strukturgens ohne das Hinzufügen einer kompatiblen 3'-Terminationssequenz zu erfordern.
- Es ist ebenfalls erforderlich, mindestens ein selektierbares Markergen in die DNA mit aufzunehmen, die zum Transformieren des Wirtsstamms verwendet wird.
- Dies erleichtert/ermöglicht die Selektion und Isolierung von jenen Organismen, die die transformierende DNA eingebaut haben. Das Markergen verleiht dem transformierten Organismus ein phänotypisches Merkmal, das der Wirt nicht besaß, z. B. das Wiederherstellen der Fähigkeit, eine spezifische Aminosäure zu erzeugen, wenn der untransformierte Wirt einen Defekt in dem spezifischen Aminosäurebiosynthese-Stoffwechselweg besaß, oder eine Resistenz gegenüber Antibiotika und dergleichen mehr. Beispielhafte selektierbare Markergene können aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus dem HIS4-Gen und dem ARG4-Gen von Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae, dem Invertasegen (SUC2) aus Saccharomyces cerevisiae, und dem G418R-Kanamycin-Resistenzgen aus den transponierbaren Elementen Tn601 oder Tn903 besteht.
- Wenn das erste einsetzbare DNA-Fragment keine regulatorische Region enthält, wird es nötig sein, eine geeignete regulatorische Region in funktioneller Verknüpfung mit dem Strukturgen einzusetzen, um eine funktionsfähige Expressionskassette bereitzustellen. Wenn keine 3-Terminationssequenz an der Insertionsstelle zum Vervollständigen der Expressionskassette bereitgestellt ist, ist auf ähnliche Weise eine 3'-Terminationssequenz auf funktionsfähige Weise mit dem Strukturgen zu verknüpfen, das zu einsetzen ist.
- Es ist wichtig, daß die Integration an einer Position in dem Genom stattfindet, die keine nachteilhafte Auswirkung auf die Wirtszelle besitzen wird. Es war eine überraschende Entdeckung, daß die Integration eines rekombinanten Expressionskonstrukts an dem Genlokus der Sauren Phosphatase von Pichia pastoris (PHO1) nicht für den Pichia-Wirt schädlich war und zu einer stabilen Integration der rekombinanten Sequenzen führte. Die gerichtete Integration an dem PHO1-Lokus wird durch Verwendung der 5'- und 3'-Sequenzen erreicht, die das PHO1-Gen von Pichia pastoris (die ebenfalls als erste und zweite einsetzbare DNA- Fragmente bezeichnet werden) flankieren in rekombinanten Expressionsvektoren.
- Eine weitere Entdeckung war ein Verfahren zum Durchmustern von transformierten Zellen zum Identifizieren jener, die die Expressionsvektorsequenzen integriert haben durch Zerstören des PHO1-Lokus. Die Zellen, in denen das PHO1-Gen zerstört worden ist, zeigen einen begleitenden Verlust der Enzymaktivität der Sauren Phosphatase. Der Pho&supmin;-Phänotyp, der ein PHO1-Zerstörung anzeigt, kann durch Durchmustern gefunden werden, indem die Zellen auf Indikatorplatten mit niedrigem Phosphat plattiert werden und Kolonien über Nacht wachsen gelassen werden. Kolonien, in denen das PHO1-Gen zerstört ist, sind weiß, während jene Kolonien mit einem intakten PHO-Gen grün sind. Dieser colorimetrische Screen stellt ein schnelles und einfaches Verfahren zum Nachweisen von Zellen bereit, die Expressionskassetten besitzen, die auf richtige Weise an dem PHO1-Lokus integriert sind. Eine partielle Restriktionskarte des Saure Phosphatase-Gens von Pichia pastoris (SEQ ID NO: 1) ist in Fig. 1 dargestellt. Dieses Gen ist durch die Nukleotidsequenz weiter gekennzeichnet, die in Tabelle 1 dargestellt wird.
- Durch die vorliegende Erfindung werden ebenfalls neue DNA-Fragmente bereitgestellt, die die 5'-regulatorische Region (SEQ ID NO: 2), die Signalsequenz (SEQ ID NO: 3), das Strukturgen (SEQ ID NO: 4) und die 3'-Transkriptions- Terminationssequenz (SEQ ID NO: 5) der Saure Phosphatase von Pichia pastoris umfassen.
- Die folgenden Tabellen bezeichnen die Sequenzen des Saure Phosphatase-Gens (SEQ ID NO: 1) von Pichia pastoris und Fragmente davon. Tabelle 1 Saure Phosphatase-Gen SEQ ID NO: 1 Tabelle 2 5'-regulatorische Region SEQ ID NO: 2: Tabelle 3 Signalsequenz SEQ ID NO: 3: Tabelle 4 Saure Phosphatase-Strukturen SEQ ID NO: 4: Tabelle 5 3'-Transkriptions-Terminationssequenz SEQ ID NO: 5:
- Das Saure Phosphatase-Gen wird aus Pichia pastoris-Kulturen wie Pichia pastoris NRRL Y-11430 durch Verfahren wiedergewonnen, wie sie in den folgenden Beispielen ausgeführt sind. Ein allgemeines Verfahren zur Gewinnung des Saure Phosphatase-Gens von Pichia pastoris (SEQ ID NO: 1) besteht in dem Verwenden einer Saure Phosphatase-Sonde, wie den Niedrigphosphatsonden ("low phosphate (LP) probes"), die in den folgenden Beispielen beschrieben sind, zum Durchmustern einer Genbank von Pichia pastoris-DNA. Andere Sonden können auf Grundlage der in Tabelle 1 offenbarten Sequenz selektiert oder synthetisiert werden. Eine Hybridisierung der Sonden kann mit jedem geeigneten Protokoll, das dem Fachmann bekannt ist, durchgeführt werden. Pichia pastoris-Banken können durch Techniken hergestellt werden, die im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich, aber nicht begrenzt hierauf, des Verfahrens, das durch Cregg et al. (1985) Mol. Cell Bio. 5, 3376-3385 beschrieben wurde.
- Alternativ dazu kann die 5'-regulatorische Region (SEQ ID NO: 2), die Signalsequenz (SEQ ID NO: 3), das Strukturgen (SEQ ID NO: 4) und die 3'- regulatorische Region (SEQ ID NO: 5) der Saure Phosphatase erhalten werden, indem die geeignete Sequenz, wie sie in Tabellen 1-5 definiert ist, unter Verwendung von bekannten enzymatischen oder chemischen Mitteln synthetisiert wird. Geeignete Mittel schließen chemische Verfahren auf Grundlage der Phosphotriester-, der Phosphit- oder der Cyanoethylphosphoramidit-Chemie ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Der Fachmann wird ebenfalls erkennen, daß die isolierte 5'-regulatorische Region (SEQ ID NO: 2), Signalsequenz (SEQ ID NO: 3), das Strukturgen (SEQ ID NO: 4) und die 3'-Transkriptions-Terminationssequenz (SEQ ID NO: 5) der Saure Phosphatase von Pichia pastoris der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu der anschließend isolierten 5'-regulatorischen Region, der Signalsequenz, des Strukturgens, und der 3'-Transkriptions- Terminationssequenzen der Sauren Phosphatase von Pichia pastoris eine de minimis-Anzahl von Nukleotidunterschieden in Folge einer klonalen Variation oder Sequenzfehlern, die sich ereignen können, enthalten können.
- Die Modifikation der 5'-regulatorischen Region (SEQ ID NO: 2), der Signalsequenz (SEQ ID NO: 3), des Strukturgens (SEQ ID NO: 4) und der 3'- Transkriptions-Terminationssequenz (SEQ ID NO: 5) der Sauren Phosphatase von Pichia pastoris kann ebenfalls durchgeführt werden, wie ein Hinzufügen von Linker-DNA oder das Durchführen einer Mutagenese (z. B. einer M13- Mutagenese) unter Bereitstellung oder Entfernung einer Restriktionsschnittstelle bzw. von Restriktionsschnittstellen und dergleichen.
- Sobald das Saure Phosphatase-Gen von Pichia pastoris gewonnen wurde, kann es in eukaryontischen oder prokaryontischen Plasmid-Wirtssystemen, wie dem in E. coli gehaltenen pBR322, oder in einem beliebigen anderen geeigneten im Stand der Technik bekannten System gehalten oder repliziert werden.
- Der Fachmann wird also erkennen, daß zahlreiche zusätzliche DNA-Sequenzen ebenfalls in dem verwendeten Vektor eingesetzt werden können, wie bakterielle Plasmid-DNA, verschiedene Markergene, Bakteriophagen-DNA, autonomreplizierende Sequenzen und centromere DNA, um nur einige wenige repräsentative Beispiele zu nennen.
- Die 5'-regulatorische Region der Sauren Phosphatase (SEQ ID NO: 2) ist innerhalb des DNA-Fragments enthalten, das sich von Nukleotid -399 bis ungefähr Nukleotid 0, wie in Fig. 1 und Tabelle 2 gezeigt, erstreckt. Dieses Fragment ist in der Lage, die Transkription von DNA in RNA zu bewirken, wenn es auf funktionsfähige Weise verknüpft ist mit und positioniert an dem 5'-Ende einer heterologen DNA-Sequenz, die für mindestens ein Polypeptid kodiert.
- Zum Verwenden der 5'-regulatorischen Region (SEQ ID NO: 2) der Sauren Phosphatase, die hierin offenbart ist, kann das in Fig. 1 und Tabelle 2 beschriebene Fragment auf funktionsfähige Weise mit heterologen DNA-Sequenzen verknüpft sein, die mindestens ein Polypeptid kodieren. Für diese Patentschrift sind heterologe DNA-Sequenzen, Kombinationen von DNA-Sequenzen, die nicht natürlich in dem Wirt oder in Assoziation mit der regulatorischen Region auftreten, geeignet. Geeignete heterologe DNA-Sequenzen, die mindestens ein Polypeptid kodieren, die auf funktionsfähige Weise mit der 5'-regulatorisehen Region der Sauren Phosphatase (SEQ ID NO: 2) verknüpft sein könnten, schließen Gewebeplasminogenaktivator, humanes Serumalbumin und Invertase ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Heterologe DNA-Sequenzen, die erfindungsgemäß verwendet werden, sollten ein 5'-ATG-Startcodon, ein 3'-Stopcodon enthalten und können zusätzlich Nukleotidsequenzen einschließen, deren Funktion das Stabilisieren der mRNA oder das Lenken der Polyadenylierung ist.
- Die Kombination der 5'-regulatorischen Region der Sauren Phosphatase (SEQ ID NO: 2), auf funktionsfähige Weise verknüpft mit einer heterologen DNA- Sequenz, kann in einen geeigneten Vektor eingesetzt sein. Zahlreiche Hefevektor- Wirts-Kombinationen sind möglich und dem Fachmann bekannt. Zusätzliche Sequenzen wie Markergene oder andere Sequenzen, die den Vektor zur Wachstumsamplifizierung und schnellen Vermehrung in Bakterien oder Hefe befähigen, können ebenfalls vorliegen.
- Geeignete Wirtszellen, die mit einem Vektor transformiert werden können, der die 5'-regulatorische Region der Sauren Phosphatase enthält, schließen Hefen wie jene aus den Gattungen Saccharomyces, Pichia und Hansenula, vorzugsweise Pichia, und am stärksten bevorzugt Pichia pastoris, ein.
- Die Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit einem Vektor, der die 5'- regulatorische Region der Sauren Phosphatase (SEQ ID NO: 2) enthält, kann durch jedes beliebige, dem Fachmann bekannte geeignete Transformationsverfahren erzielt werden.
- Die 5'-regulatorische Region der Sauren Phosphatase (SEQ ID NO: 2) wird durch die Konzentration von Phosphat in dem Medium kontrolliert. Genauer gesagt, diese regulatorische Region wird durch niedrige Phosphatkonzentrationen dereprimiert. Deshalb wird die 5'-regulatorische Region durch Verändern der Konzentration von Phosphat, das in dem Medium vorliegt, reguliert.
- Die Signalsequenz der Sauren Phosphatase (SEQ ID NO: 3) ist in einem DNA- Fragment enthalten, das sich von Nukleotid 1 bis ungefähr Nukleotid 66, wie in Fig. 1 und Tabelle 3 gezeigt, erstreckt. Um die hierin offenbarte Signalsequenz der Sauren Phosphatase (SEQ ID NO: 3) zu nutzen, kann das in Fig. 1 und Tabelle 3 beschriebene Fragment auf funktionsfähige Weise mit heterologen DNA-Sequenzen verknüpft werden, die mindestens ein Polypeptid kodieren. Geeignete heterologe DNA-Sequenzen schließen jene DNA-Sequenzen ein, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Gewebeplasminogenaktivator, humanem Serumalbumin und Invertase, sind aber nicht hierauf beschränkt.
- Die Kombination der Signalsequenz der Sauren Phosphatase (SEQ ID NO: 3), auf funktionsfähige Weise verknüpft mit einer heterologen DNA-Sequenz, kann dann mit einem geeigneten Promoter verknüpft werden. Zweckmäßigerweise wird der eingesetzte Promoter der Promoter sein, der mit der sogenannten "Leadersequenz" assoziiert ist. Alternativ dazu kann man den natürlich auftretenden PHO1- Promoter durch andere heterologe Promoter ersetzen, die eine transkriptionale Regulation erlauben würden. Ein Beispiel eines geeigneten heterologen Promoters würde der Alkohol-Oxidase (AOX1) Promoter (oder die 5'-regulatorische Region) von Pichia pastoris sein, der/die in US 4,808,537 offenbart ist.
- Geeignete Vektoren, in die dieses DNA-Fragment, das die Signalsequenz (SEQ ID NO: 3) der Sauren Phosphatase eingesetzt werden könnte, können wie vorstehend beschrieben erhalten werden. Zusätzlich können geeignete Wirtszellen, die mit dem resultierenden Vektor, der ein für eine Signalsequenz kodierendes DNA- Fragment enthält, transformiert werden können, Hefen einschließen wie jene aus den Gattungen Saccharomyces, Hansenula und Pichia, wobei Pichia pastoris bevorzugt ist. Die Transformation dieser Wirtszellen kann durch jedes geeignete dem Fachmann bekannte Mittel erzielt werden. Die Signalsequenz, die auf funktionsfähige Weise mit einem Protein verknüpft ist, das durch eines dieser Vektor/Wirts-Systeme erzeugt worden ist, kann die Sekretion des Proteins aus der Wirtszelle lenken.
- Das Strukturgen der Sauren Phosphatase (SEQ ID NO: 4) ist in einem DNA- Fragment enthalten, das sich von Nukleotid 67 bis Nukleotid 1407, wie in Fig. 1 und Tabelle 4 gezeigt, erstreckt. Das Strukturgen der Sauren Phosphatase (SEQ ID NO: 4) kann in der rekombinanten Biotechnologie für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, einschließlich, aber nicht hierauf beschränkt: (a) DNA-Konstrukte zum Durchführen der zerstörenden homologen Rekombination (ein Prozeß zum Einsetzen heterologer DNA-Sequenzen in das Pichia pastoris- Genom an dem Saure Phosphatase-Lokus und dem darauf folgenden Zerstören der Genaktivität der Sauren Phosphatase und (b) das Erzeugen des Sauren Phosphatase-Proteins zur Verwendung in verschiedenen Bioassays.
- Die 3'-Transkriptions-Terminationssequenz der Sauren Phosphatase (SEQ ID NO: 5) beendet die Transkription von mRNA oder stabilisiert mRNA, wenn sie auf funktionsfähige Weise mit dem 3'-Ende einer DNA-Sequenz verknüpft ist, die für die Erzeugung eines Polypeptids kodiert. Diese 3'-Transkriptions- Terminationssequenz der Sauren Phosphatase (SEQ ID NO: 5) ist in dem DNA- Fragment enthalten, das sich von Nukleotid 1408 bis ungefähr Nukleotid 1594, wie in Fig. 1 und Tabelle 5 gezeigt, erstreckt. Die 3'-Transkriptions- Terminationssequenz der Sauren Phosphatase (SEQ ID NO: 5) kann auf funktionsfähige Weise mit einer heterologen DNA-Sequenz verknüpft werden, die für ein Polypeptid kodiert, und verwendet werden zum Beenden der Transkription von oder zur Stabilisierung von mRNA in Hefen wie jenen aus den Gattungen Saccharomyces, Hansenula und Pichia, aber ist besonders gut geeignet zur Verwendung in Pichia pastoris.
- Die folgenden nicht als Begrenzung gedachten Beispiele werden bereitgestellt, um die Ausübung der vorliegenden Erfindung weiter zu veranschaulichen.
- Die folgenden Stämme sind in diesen Beispielen verwendet worden:
- Pichia pastoris KM71 (AOX1, his4)
- Pichia pastoris GS115 (his4) NRRL Y-15851
- Pichia pastoris GS190 (arg4) NRRL Y-18014
- Pichia pastoris GS247 (Ade&supmin;)
- Pichia pastoris KM71:GS102 (Mut&supmin;)
- Pichia pastoris GS115:GS102 (Mut&spplus;)
- Pichia pastoris MD100-20 (his4, Ade&supmin;)
- Pichia pastoris MB102-26 (pho&supmin;, his4, ade&supmin;)
- Pichia pastoris MB102-28
- Pichia pastoris MB102-51
- Pichia pastoris KM71:pPSU216 (Mut&supmin;)
- Pichia pastoris GS115:pPSU216 (Mut&spplus;)
- E. coli. JM103 delta (lac pro) thi rps1
- (strA) supE end A sbcB hsdR
- t-PA-überexprimierende Bowes-Melanom-Zellinie ATCC# CRL9607 (menschliche Melanomzellen)
- Die Medien, Puffer und Lösungen, die in den folgenden Beispielen eingesetzt wurden, besitzen die nachfolgend angegebenen Zusammensetzungen:
- Biotin 2 ug/L
- Calciumpantothenat 400 ug/L
- Folsäure 2 ug/L
- Nikotinsäure 400 ug/L
- p-Aminobenzoesäure 2 ug/L
- Pyridoxinhydrochlorid 400 ug/L
- Riboflavin 200 ug/L
- Thiamin-HCl 400 ug/L
- Borsäure 500 ug/L
- Kupfer(II)-sulfat 40 ug/L
- Kaliumiodid 100 ug/L
- Eisen(III)-chlorid 200 ug/L
- Mangansulfat 400 ug/L
- Zinksulfat 400 ug/L
- Inosit 2 mg/L
- Natriummolybdat 200 ug/L
- Ammoniumsulfat 5 g/L
- Kaliumdihydrogenphosphat 30 mg/L
- Kaliumchlorid 1,5 g/L
- Natriumchlorid 1,7 mM
- Calciumchlorid 0,68 mM
- Magnesiumsulfat 4,2 mM
- Tris-HCl, pH 8,0 10 mM
- EDTA 1 mM
- NaCl 180 mM
- Na&sub3;PO&sub4;, pH 7,7 10 mM
- EDTA 1mM
- NaCl 150 mM
- Na-citrat 15 mM
- Ficoll 200 mg/L
- Polyvinylpyrrolidon 200 mg/L
- Rinderserumalbumin 200 mg/L
- LiCl 100 mM
- Tris-HCl, pH 7,4 100 mM
- EDTA 0,1 mM
- Phenol 500 ml/L
- Chloroform 480 ml/L
- Isoamylalkohol 20 ml/L
- Chloroform 960 ml/L
- Isoamylalkohol 40 ml/L
- LP-Indikatorplatten 1X LP-Medium
- 1 Liter 22,5 mM Zitronensäure pH 4,8
- 20 g Dextrose
- 60 mg 5-Brom-4-chlor-3-Indolylphosphat (Sigma)
- 25 g Noble Agar (Difco)
- SCE-Puffer 9,1 g Sorbit
- 1,47 g Natriumcitrat
- 0,168 g EDTA
- pH auf 5,8 mit HCl in 50 ml
- dH&sub2;O und Autoklavieren
- YNB-Medium 6,75 g Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren (DIFCO) in 1 L Wasser
- Um das Saure Phosphatase-Gen von Pichia pastoris (SEQ ID NO: 1) zu isolieren und charakterisieren, wurden die folgenden Experimente durchgeführt. Pichia astoris GS115 (NRRL Y-15851) wurde in sowohl einer Umgebung mit einer hohen Phosphatkonzentration (HP) [bestehend aus Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren (DIFCO), 2% Dextrose, und 20 mg/l Histidin] und in einer Umgebung mit niedriger Phosphatkonzentration ("low phosphate"; LP) [bestehend aus LP-Medium, 2% Dextrose und 20 mg/l Histidin] jeweils in einem Gesamtvolumen von 300 ml wachsen gelassen. Die Zellen wurden pelletiert, einmal mit 10 ml REB gewaschen und in 4 ml REB in einem 30 ml fassenden Corex-Röhrchen resuspendiert. Dann wurden 8 g Glasperlen und 4 ml PCI zugegeben. Die Suspension wurde auf einem Vortex-Mischer bei hoher Geschwindigkeit gemischt, acht mal für jeweils 20 Sekunden, mit einem Kühlen auf Eis für 20 Sekunden zwischen den Mischvorgängen. Die Suspension wurde dann bei 10.000 · g für 10 min. zentrifugiert. Die wässerige (obere) Schicht wurde zweimal mit 4 ml PCI und 4 ml CI extrahiert. Die RNA wurde aus der wässerigen Phase bei -20ºC mit 0,1 Volumen 3M Kaliumacetat, pH 5,2 und 2,5 Volumen Ethanol präzipitiert. Die poly-A&spplus;-RNA wurde gemäß Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual) selektiert, wobei LiCl anstatt NaCl eingesetzt wurde. Die Synthese von LP- oder HP-mRNA-markierten cDNA-Sonden unter Verwendung von 2 ug jeder Art von poly-A&spplus;-RNA war ebenfalls in Übereinstimmung mit Maniatis et al. 60 ng einer gereinigten Pichia pastoris-Plasmidbank in YEP 13 [Broach et al., Gene: 8121 (1979)] wurde verwendet, um E. coli MC1061 (Mandel und Higa, 1970, J. Mol. Biol. 53: 154) zu transformieren. Dies ergab etwa 8.000 Kolonien. Die Kolonien wurden doppelt auf Nitrocellulosefiltern replikaplattiert, auf LB- Platten, die 100 ug/ml Ampicillin und 170 ug/ml Chloramphenicol enthielten, amplifiziert, durch Standardverfahren lysiert (Grunstein und Wallis, 1979, Methods in Enzymology 68, 379-389), für 90 min. bei 80ºC gebacken, und separate Filter wurden mit jeweils der LP- oder HP-cDNA-Sonde hybridisiert. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung von 2X SSPE, 1X Denhardt'scher Lösung, 0,2% Natriumdodecylsulfat (SDS), und 2,5 · 10&sup5; Cpm markierten cDNA-Sonden pro ml Hybridisationslösung durchgeführt. Die Hybridisierung war bei 55ºC für 40 Stunden in einem Gesamtvolumen von 25 ml. Im Anschluß an die Hybridisierung wurden die Filter zweimal in 2X SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur gewaschen und zweimal in 0,2X SSC, 0,1% SDS bei 65ºC, dann getrocknet und mit einem Röntgenfilm exponiert.
- Es wurden 24 genomische Klone identifiziert, die stärker mit der LP-cDNA- Sonde als mit der HP-cDNA-Sonde hybridisierten und deshalb geeignete Kandidaten dafür waren, Inserts zu enthalten, die das Saure Phosphatase-Gen kodieren. Diese 24 Klone wurde dann mit LP- und HP-Sonden erneut gescreent wie vorher, wobei 14 dieser erneut gescreenten Klone wiederum stärker mit der LP-cDNA- Sonde hybridisierten. Es wurde Plasmid-DNA von jeder dieser 14 Klone isoliert, mit EcoRI verdaut, durch Agarose-Gelelektrophorese getrennt, im Doppel auf Nitrocellulose-Filter geblottet, und jeder Filter wurde mit entweder der LP- oder HP-cDNA unter den gleichen Bedingungen wie zuvor hybridisiert. Genfragmente von 4 getrennten Klonen hybridisierten stark mit der LP-cDNA-Sonde und schwach, wenn überhaupt, mit der HP-cDNA-Sonde. Diese Fragmente wurden dann einer Restriktionskartierung unterzogen unter Verwendung von EcoRI + HindIII, EcoRI + SalI- und EcoRI + BamHI-Doppelverdaus und wiederum mit der LP-cDNA-Sonde hybridisiert. Die Fragmente kodierten nicht verwandte Phosphat-regulierte Gensegmente, wie durch die Unterschiede in ihren Restriktionskarten bestimmt wurde.
- Die Regionen, die mit diesem Verfahren als für die LP-regulierten Gene kodierend identifiziert wurden, wurden in pUC8 oder pUC19 (New England Biolabs) subkloniert. Die resultierenden Plasmide wurden mit ³²P durch Nick-Translation markiert (Maniatis). Die markierten Plasmide wurden als Sonden für RNA-Blots von LP- und HP-RNA (S ug/Blot) verwendet. Einer der ursprünglich 24 Klone, als pLP24 identifiziert, wurde für die weitere Untersuchung ausgewählt.
- Plasmid pLP2411, das in Beispiel I gebildet wurde und von dem angenommen wird, daß es das Saure Phosphatase-Gen von Pichia pastoris (SEQ ID NO: 1) oder ein Fragment davon enthält, wurde auf die folgende Weise weiter charakterisiert. 10 ug pLP24 wurden mit EcoRI/SalI verdaut und das 2,1 kb umfassende Fragment wurde Gel gereinigt.
- 10 ug pYM25 (NRRL B-18015) wurden mit SphI/SalI verdaut und das 3,1 kb umfassende Fragment wurde Gel gereinigt. 5 ug pUC19 wurden mit EcoRI/SalI verdaut, PCI-extrahiert, CI-extrahiert und EtOH-präzipitiert. 100 ng des Eco-RI/SalI-linearisierten pUC19 wurden mit 200 ng des 2,1 kb umfassenden Eco-RI/SalI-Fragment von pLP24 und 450 ng des 3,1 kb umfassenden SphI/SalI- Fragments von pYM25 in einer 3-Teile-Ligation in 20 ul Ligationspuffer + 1 mM ATP + 1U T4-DNA-Ligase ligiert. Es wurde der E. coli-Stamm MC 1061 transformiert und das richtige Plasmid wurde durch die Anwesenheit eines 2,1 kb umfassenden EcoRI/SalI-Fragments und eines 3,1 kb umfassenden SphI/SalI- Fragments identifiziert. Das richtige Plasmid wurde pLP2411 genannt.
- Das Plasmid pLP2411, das von Plasmid pLP24 (siehe Beispiel II) abgeleitet ist, wurde mit XuhI verdaut, mit der Klenow-DNA-Polymerase zum Bilden von stumpfen Enden behandelt, und mit dem 2,1 kb umfassenden HpaI-Fragment aus Plasmid pYM25 ligiert. Dieses Fragment enthielt das ARG4-Gen von Saccharomyces cerevisiae. (Das Plasmid pYM25 ist als NRRL B-18015 erhältlich). Das resultierende Plasmid wurde als pLP2412 bezeichnet.
- pLP2412 wurde dann mit EcoRI und BamHI verdaut. Das 3,3 kb umfassende Fragment wurde isoliert und zum Transformieren von Pichia pastoris GS 190 (NRRL Y-18014) zu einer Arg&spplus;-Prototrophie verwendet (Das Transformationsverfahren ist in Beispiel IV beschrieben). Die Arginin-Prototrophen wurden durch ihre Fähigkeit zum Wachstum in Medien, denen Arginin fehlt, identifiziert. Sie wurden isoliert und auf LP-Indikatorplatten auf die Gegenwart der Sauren Phosphatase hin durchgemustert/gescreent. Die Kolonien wurden auf LP- Indikatorplatten replikaplattiert und über Nacht bei 30ºC wachsen gelassen. Die Kolonien auf den LP-Indikatorplatten waren entweder grün (PHO1) oder weiß (pho1). Die weißen Kolonien waren Transformanden, die die vorgenannte 3,3 kb umfassende Expressionskassette enthielten, stabil integriert durch Zerstörung ("disruption") an dem PHO1-Locus des Genoms von Pichia pastoris.
- Genomische DNAs von stabilen Arg&spplus;-Stämmen wurden durch Southern- Filterhybridisierung analysiert, um die Lage bzw. Position der Expressionskassette zu bestimmen. Das 3,3 kb umfassende EcoRI-BamHI-Fragment, das das Arg4-Gen von Saccharomyces cerevisiae enthielt, hatte sich spezifisch integriert und die genomische Sequenz zerstört, die analog zu dem in pLP2411 enthaltenen DNA-Fragment war, was bestätigte, das dieser Locus für die Saure Phosphatase (PHO1) kodierte. Dieser Transformand wurde als GS 190:pLP2412 bezeichnet.
- Das folgende Protokoll wurde bei der Transformation von Pichia pastoris angewendet.
- Hefezellen wurden in etwa 10 ml YPD-Medium inokuliert und bei 30ºC für 16-20 Stunden in einer Schüttelkultur gehalten. Die Zellen wurden dann auf A600 von ungefähr 0,01 bis 0,1 verdünnt und in der log-Phase in YPD-Medium bei 30ºC für ungefähr 6-8 Stunden gehalten. Es wurden 100 ml YPD-Medium mit 0,5 ml der Starterkultur bei einem A600 von ungefähr 0,1 inokuliert und bei 30ºC für ungefähr 16-20 Stunden in Schüttelkultur gehalten. Die Kultur wurde dann mit einer A600 geerntet, die etwa 0,2 bis 0,3 (nach schätzungsweise 16-20 Stunden) betrug, durch Zentrifugation unter Verwendung einer DAMON IEC DPR-6000- Zentrifuge bei 1500 g für 5 Minuten.
- Zum Herstellen von Sphäroblasten wurden die Zellen einmal in 10 ml sterilem Wasser gewaschen (es wurde nach jedem Waschschritt wie vorstehend beschrieben eine Zentrifugation durchgeführt), einmal in 10 ml frisch hergestelltem SED, einmal in 10 ml sterilem 1M Sorbit, und in 5 ml SCE-Puffer resuspendiert. 5 ul von 4 mg/ml Zymolyase 60.000 (erhältlich von Miles Laboratories) wurden zugesetzt und die Zellen wurden bei 30ºC für etwa 30 Minuten inkubiert.
- Die Sphäroblastenbildung wurde wie folgt verfolgt. Es wurden 100 ul umfassende Aliquots von Zellen zu 900 ul von 5% SDS und 900 ul 1 M Sorbit vor oder kurz nach der Zugabe von Zymolyase zugegeben, und zu verschiedenen Zeitpunkten während des Inkubationszeitraums. Die Inkubation wurde zu dem Zeitpunkt gestoppt, an dem die Zellen in SDS, aber nicht in Sorbit lysieren würden. Sobald sie gebildet waren, wurden die Sphäroblasten einmal in 10 ml sterilem 1 M Sorbit durch Zentrifugation bei 1000 g für 5-10 Minuten gewaschen, einmal in 10 ml sterilem CaS durch Zentrifugation gewaschen, und auf 0,6 ml in CaS resuspendiert.
- Für die eigentliche Transformation wurden DNA-Proben in Wasser oder TE- Puffer (bis zu einem Gesamtvolumen von 20 ul) in 12 · 75 mm sterilen Polypropylen-Röhrchen gegeben. (Für kleine Mengen an DNA findet die maximale Transformation unter Verwendung von etwa 1 ul von 5 mg/ml ultraschallbehandelter E. coli-DNA in jeder Probe statt.) Es wurden 100 ul Sphäroblasten zu jeder DNA-Probe zugegeben und bei Raumtemperatur für etwa 20 Minuten inkubiert. 1 ml PEG-Lösung wurde zu jeder Probe zugegeben und bei Raumtemperatur für etwa 15 Minuten inkubiert. Die Proben wurden dann bei 1000 g für 5-10 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Die Pellets wurden in 150 ul SOS resuspendiert und bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. 850 ul steriles 1M Sorbit wurden zu jedem Pellet gegeben, und die Proben wurden wie nachstehend beschrieben plattiert.
- Es wurden 10 ml Regenerations-Agar pro Platte mindestens 30 Minuten bevor die Transformationsproben fertig waren, gegossen. Aliquots von 10 ml Regenerations-Agar wurden ebenfalls auf Röhrchen in einem 45-50ºC-Bad verteilt, während des Zeitraums, in dem die Transformationsproben in SOS waren. Die Proben wurden dann in die Röhrchen gegeben, auf Platten gegossen, die eine feste Bodenagarschicht enthielten, und bei 30ºC für 3-5 Tage inkubiert.
- Die Sphäroblastenqualität zu verschiedenen Zeitpunkten wurde wie folgt bestimmt. Es wurden 10 ul der Probe entfernt und durch Zugabe von 190 ul 1M Sorbit verdünnt. Es wurden 10 ul der Verdünnung entfernt und ein weiteres Aliquot von 990 ul 1M Sorbit wurden zugegeben. 100 ul von beiden Verdünnungen wurden durch Verlaufenlassen plattiert ("spread-plated") auf YPD- Agarmedium zum Bestimmen der Konzentration der nicht-sphäroblastierten Gesamtzellen, die in der Präparation verblieben. 100 ul jeder Verdünnung wurden zu 10 ml Regenerationspuffer gegeben, der mit 40 ug/ml sämtlicher Aminosäuren, die der Wirt erfordert, ergänzt worden war, um die gesamten regenerationsfähigen Sphäroblasten zu bestimmen. Gute Werte für ein Transformationsexperiment waren 1-3 · 10&sup7; gesamt regenerierbare Sphäroblasten/ml und etwa 1 · 10³ intakte Zellen/ml.
- Das folgende Verfahren wurde bei der Herstellung von DNA von Pichia pastoris eingesetzt.
- Die Hefezellen wurden in 100 ml YNB-Medium plus 2% Dextrose bei 30ºC wachsen gelassen, bis der A600 gleich 1-2 war und dann unter Verwendung einer DAMON IEC DPR-6000-Zentrifuge bei 2000 g für 5 Minuten pelletiert. Das Pellet wurde einmal in dH&sub2;O gewaschen, einmal in SED, einmal in 1 M Sorbit und dann in 5 ml einer Lösung von 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0 und 1 M Sorbit resuspendiert. Die Zellen wurden dann mit 50-100 ul einer 4 mg/ml enthaltenden Lösung von Zymolyase 6000 (Miles Laboratories) gemischt und bei 30ºC für eine Stunde inkubiert. Die resultierenden Sphäroblasten wurden dann bei 1000 g für 5-10 Minuten zentrifugiert und in 5 ml Lyse-Puffer [0,1% SDS, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA und 50 mM NaCl] suspendiert. Proteinase K (Boehringer Mannheim) und RNase A (Sigma) wurden jeweils zu 100 ug/ml gegeben und die Lösung wurde bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Die DNA wurde durch leichtes Mischen der Präparation mit einem gleichen Volumen an CI deproteinisiert, und die Phasen wurden durch Zentrifugation bei 12.000 g für 20 min. getrennt. Die obere (wässrige) Phase wurde in ein frisches Röhrchen abgezogen und mit einem gleichen Volumen an PCl extrahiert. Die Phasen wurden wir zuvor getrennt und die obere Phase wurde in ein Röhrchen gegeben, das 2-3 Volumen an kaltem 100% Ethanol enthielt. Die Proben wurden vorsichtig gemischt und die DNA wurde durch Aufspulen auf ein Plastikstäbchen gesammelt. Die DNA wurde dann direkt in 1 ml TE-Puffer gelöst und über Nacht bei 4ºC gegen 100 Volumen TE- Puffer dialysiert.
- Zum Isolieren eines Plasmids, das das gesamte PHO1-Gen von Pichia pastoris (SEQ ID NO: 1) enthält, wurde die ursprüngliche genomische Bank von Pichia astoris in MC1061 unter den vorangehend beschriebenen Bedingungen mit dem 600 bp umfassenden BamHI-Fragment von pLP24 hybridisiert. Dieses Verfahren identifizierte 5 positive Klone. Es wurde Plasmid-DNA von diesen Klonen hergestellt, mit BamHI verdaut, auf Nitrocellulose-Filter geblottet und mit der gleichen 600 bp umfassenden Sonde hybridisiert. Jeder der 5 Klone besaß das 2,0 kb umfassende BamHI-Fragment, das das PHO1-Gen von Pichia pastoris enthielt. Einer dieser Klone wurde für die weitere Analyse ausgewählt, und als pLP2420 bezeichnet.
- Das 2,0 kb umfassende BamHI-Fragment von pLP2420 wurde durch übliches Didesoxysequenzieren von Restriktionsenzym-verdauten Fragmenten, die in M13 (erhältlich von New England Biolabs) subkloniert wurden, sequenziert. Die Analyse der Sequenz enthüllte einen offenen Leserahmen von 468 Aminosäuren, der vollständig innerhalb des 2,0 kb umfassenden BamHI-Fragments enthalten war.
- Das 2,0 kb umfassende BamHI-Fragment von pLP2420, das das PHO1-Gen enthielt, wurde in die BamHI-Schnittstelle von pYM8 ligiert, einem Plasmid, das das HIS4-Gen von Saccharomyces cerevisiae und pBR322-Sequenzen enthält. [(pYM8 kann wie folgt hergestellt werden: 10 ug pYA2 (NRRL B-15874) wurden mit SphI/ThaI verdaut, und das 3,4 kb umfassende Fragment wurde Gel gereinigt. 10 ug pBR322 wurden mit SphI/NruI verdaut und das 3,95 kb umfassende Fragment wurde Gel gereinigt. 100 ng des 3,95 kb umfassenden pBR322- Fragments wurden mit 250 ng des 3,4 kb umfassenden pYA2-Fragments unter Standardbedingungen ligiert. Das richtige Plasmid wurde auf der Grundlage eines 3,1 kb umfassenden XhoI/SphI-Fragments identifiziert und pYM8 genannt]. Das resultierende Plasmid wurde als pLP2430 bezeichnet und war fähig, sich dank einer zufälligen ARS-Funktion ("autonomous replication sequence"; autonom replizierende Sequenz), die sich in der HIS4-Gensequenz von Saccharomyces cerevisiae befand, in Pichia pastoris autonom zu replizieren.
- GS190:pLP2412 (Pho&supmin;) ein Pichia pastoris-Stamm, dem die Saure Phosphatase- Aktivität fehlt (siehe Beispiel III), wurde mit dem Pichia pastoris-Stamm MD100- 20 (His4, Ade&supmin;) gepaart. Das angewendete Paarungsverfahren war das gleiche wie das in US 4,812,405 offenbarte, das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird. Der Stamm MD 100-20 wurde wie folgt entwickelt: Zellen des Pichia astoris-Stamms GS 115 (his4) (NRRL Y-15851) wurden mit Zellen des Stamms GS247 (Ade&supmin;) unter Bedingungen gemischt, von denen bekannt ist, daß sie die Zygotenbildung und Diploidisierung fördern (das Protokoll für dieses Verfahren ist in US 4,812,405 zu finden), und auf YNB + Dextrose-Platten zum Selektieren auf die prototrophen Diploiden plattiert. Der diploide Stamm wurde MD100 genannt. MD100 wurde unter Bedingungen gezüchtet, die bekanntermaßen die Sporulation von Pichia pastoris-Diploiden induzieren (ebenfalls wie in US 4,812,405 offenbart), und die Sporennachkommen wurden auf YNB-Dextrose + Adenin + Histidin-Platten gezüchtet. Es wurden einzelne Kolonien auf ihre Fähigkeit zum Wachstum in der Abwesenheit von Adenin- oder Histidin- Ergänzungen getestet. Ein Stamm, der in der Lage war, ohne ergänzendes Histidin zu wachsen, aber nicht in der Lage war, ohne ergänzendes Adenin zu wachsen, wurde identifiziert und MD100-20 genannt.
- Ein diploider Stamm von dieser Kreuzung, MB102 Pho&spplus;/Pho&supmin;, HIS4/his4, Ade&spplus;/Ade&supmin;) wurde unter Erhalt von haploiden Nachkommen sporuliert (US 4, 812,405). Diese Nachkommen wurden auf LP-Indikatorplatten und YNB- Dextrose-Platten, mit oder ohne Histidin- oder Adenin-Ergänzungen, zum Isolieren des Stamms MB 102-26 (Pho&supmin;, his4, Ade&supmin;) gescreent.
- Der Stamm MB102-26 wurde mit dem Plasmid pLP2430 wie in Beispiel IV beschrieben transformiert. Es wurden His&spplus;-Transformanden selektiert und auf die Expression der Sauren Phosphatase auf LP-Indikatorplatten (siehe Beispiel III) gescreent. 5 Transformanden waren für die Expression der Sauren Phosphatase positiv.
- Zwei dieser Transformanden MB 102-26:pLP2430-T1 und MB 102-26:pLP2430- T3 wurden für die geeignete Regulation der Expression der Sauren Phosphatase hin analysiert. Jeder Stamm wurde in HP- oder LP-Medium für 24 Stunden wachsen gelassen bis auf einen A&sub6;&sub0;&sub0; von 2,0. Zellen jeder Kultur wurden mit einem Assay auf die Expression der Sauren Phosphatase untersucht (Bostian et al. 1980; Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 4504-4508), parallel mit untransformierten HIS4- Zellen (MB102-28), die den Pho&supmin;-Phänotyp trugen, und HIS4-Zellen (MB102-51), die den Pho&spplus;, Wildtyp-Phänotyp trugen (Tabelle I). Das Induktionsniveau der pLP2430-Transformanden war im wesentlichen mit dem des Wildtyp-Stamms identisch. Deshalb enthielt das 2,0 kb umfassende BamHI-Fragment, enthaltend das PHO1-Gen eingesetzt in pLP2430, die gesamte kodierende Region der Sauren Phosphatase sowie die Sequenzen, die ausreichen, um eine geeignete Phosphatregulierte Expression der Sauren Phosphatase zu verleihen. Tabelle I
- Dieses Beispiel zeigt, daß die PHO1-Signalsequenz (SEQ ID NO: 3) ihre Funktion ausübt, wenn sie auf operative Weise mit heterologen Genen verbunden ist. Das 2,2 kb umfassende SmaI-PvuII-Fragment, das das SUC2-Gen von Saccharomyces cerevisiae enthält, wurde aus pSEYC306 [(Johnson et al., Cell 48, 875 (1987)] isoliert und in die SmaI-Schnittstelle von entweder pAO810 oder pPSV218 (siehe Beispiele XI und XII zur Beschreibung dieser Ausgangsplasmide) kloniert. Dieses Verfahren bildete die Plasmide pAPINV1 bzw. pAPINV2. Diese benutzen den AOX1-Promoter von Pichia pastoris zum Regulieren der Transkription eines offenen Leserahmens der PHO1-Signalsequenz (SEQ ID NO: 3) in das SUC2-Strukturgen:
- ...GTGTTCGCT
- CGA GAA TCC CCC GGG GAT CCG TCG
- ACC TGC AGC CCA GCT TTG
- SUC2-Sequenz
- ACA AAC GAA...
- Es wurden 10 ug jedes Plasmids, pAPINV1 oder pAPINV2, mit BglII verdaut und verwendet, um GS115 wie in Beispiel IV zu transformieren. Transformanden, die das BglII-Fragment von pAPINV1 enthielten, genannt GS115:pAPINV1, wurden auf Histidin-Prototrophie selektiert und auf den Muf-Phänotyp gescreent, was eine richtige Integration und Zerstörung an dem AOX1-Locus anzeigt. Der Mut-Screen wurde durch Replikaplattieren von Kolonien aus Glucose enthaltenden Medien auf Methanol enthaltende Medien und Bewerten der Wachstumsrate auf Methanol durchgeführt. Ein langsames Wachstum auf Methanol zeigte den Mut&supmin;-Phänotyp an. Transformanden mit dem BalII-Fragment von pAPINV2, als GS115:pAPINV2 bezeichnet, wurden ebenfalls auf Histidin-Phototrophie selektiert, aber sie wurden auf den Pho1&supmin;-Phänotyp gescreent, was eine richtige Integration und Zerstörung an dem PHO1-Locus anzeigt (siehe Beispiel III). Es wurden Transformanden von jeder Klasse identifiziert und in YNB + 2% Glycerin gezüchtet, parallel mit Pichia pastoris -Stämmen KM71:GS102 (Mut&supmin;) und GS115:GS 102(Mut&spplus;), die mit pAPINV1 identische integrierte Plasmide enthielten, mit der Ausnahme, daß das SUC2-Gen seine native Signalsequenz enthält und ihm die PHO1-Signalsequenz fehlt. Diese beiden Stämme sind in EP 256,421 beschrieben. Ebenfalls parallel wurden die Stämme KM71:pPSV216(Mut&supmin;) und GS115:pPSV216(Mut&spplus;) gezüchtet, die mit pAPINV2 identische integrierte Plasmide enthielten, mit der Ausnahme, daß SUC2-Sequenzen fehlten.
- Jede Kultur wurde in YNB + 2% Glycerin bis zu einem A&sub6;&sub0;&sub0; von ungefähr 3,0 wachsen gelassen. Ein Aliquot von jeder wurde entnommen, in sterilem Wasser gewaschen, und in 10 ml YNB + 0,5% MeOH resuspendiert. Mut&spplus;-Kulturen wurden bei A&sub6;&sub0;&sub0; = 0,02 resuspendiert, und Mut&supmin;-Kulturen bei A&sub6;&sub0;&sub0; = 0,2, und bei 30ºC für 24 Stunden auf ungefähr A&sub6;&sub0;&sub0; = 0,3-0,4 wachsen gelassen. Zu diesem Zeitpunkt wurden ungefähr 1,0 mOD&sub6;&sub0;&sub0; einem Assay auf Invertaseaktivität unterzogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt. Tabelle II
- a - sekretierte Invertase - gemessen wie durch Goldstein und Lampenº.
- ohne Triton, ausgedrückt als Invertaseeinheiten/A&sub6;&sub0;&sub0; der einem Assay unterzogenen Kultur. 1 Unit = 1 umol freigesetzte Glucose/Minute bei 37ºC.
- b - Gesamt-Invertase - gemessen in Anwesenheit von 0,2% Triton X-100.
- c - Sekretionseffizienz - sekretierte Invertase/gesamte dem Assay unterzogene Invertase.
- d - PHO1-Signal vorliegend, keine SUC&sub2;-Sequenzen.
- o - Goldstein und Lampen, Methods in Enzymology 42: 504-511, 1975.
- Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß die PHO1-Signalsequenz so wirksam wie die SUC2-Signalsequenz zum Fördern der Invertasesekretion aus Pichia pastoris wirkt.
- Dieses Beispiel zeigt, daß die PHO1-Signalsequenz (SEQ ID NO: 3) ihre Funktion ausübt, wenn sie mit heterologen Genen auf funktionsfähige Weise verknüpft ist.
- Die t-PA-überexpremierende Bowes-Melanom-Zellinie, ATTC# CRL9607, war die Quelle der RNA, die verwendet wurde, um die cDNA-Bank herzustellen. Diese Zellinie wurde durch andere verwendet, um t-PA-Sequenzen zu klonieren (Pennica et al., Nature 301: 214, 1983; Edlund et al., PNAS 80: 349; 1983; Lemontt et al., DNA 4: 419. 1985). Poly A&spplus;-RNA wurde isoliert und mit oligo-dT- geprimed, wobei im allgemeinen dem in Maniatis beschriebenen Verfahren gefolgt wurde (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Die RNA wurde verwendet, um cDNA unter Verwendung eines handelsüblichen cDNA-Cloning Kits (erhältlich von Amersham) herzustellen, und in den λgt11-Klonierungsvektor eingesetzt. λgt11-Phagen, die Inserts enthielten, wurden in den E. coli-Wirt Y1088, unter Verwendung eines handelsüblichen Verpackungsgemischs (erhältlich von Stratgene) infiziert.
- Die Genbank wurde 3-fach plattiert und mit 3 verschiedenen Oligonucleotiden, die entsprechend der veröffentlichten Sequenz der humanen t-PA-cDNA (Pennica et al., supra) entworfen waren, sondiert. Die Oligonucleotide entsprachen dem 5'-, dem mittleren und dem 3'-Abschnitt der cDNA und hatten die folgenden Sequenzen:
- 3'-Sonde: 5'-GAC TGG ATT CGT GAC AAC ATG CGA CCG TGA-3'
- mittlere Sonde: 5'-TCA CAG TAC TCC CAC GTC AGC CTG CGG TTC-3'
- 5'-Sonde: 5'-GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT GAT TGC T-3'
- Fünf Plaques wurden identifiziert, die mit allen 3 Sonden hybridisierten. Restriktionsenzymverdaus der Inserts dieser Klone identifizierten sie basierend auf den veröffentlichten Restriktionsschnittmustern (Pennica et al., supra) als für t-PA kodierend. Die Klone unterschieden sich nur in dem Ausmaß der vorliegenden 5'- nichtkodierenden Sequenz. Die Klone 4 und 5 wurden für die weitere Charakterisierung ausgewählt, weil sie DNA-Inserts von 0,8 kb (5'-Ende), 0,47 kb (Mitte) und 1,3 kb (3'-Ende) nach EcoRI-Verdau enthielten, was das Vorliegen von t-PA- kodierenden Sequenzen mit voller Länge nahelegte. Das BglII-Fragment aus Klon 4 wurde in BamHI-geschnittenen pUC18 subkloniert, und die Ligation wurde in E. coli MC1061-Zellen transformiert. Positive Transformanden wurden durch EcoRI-Verdau identifiziert. Ein Klon, der das Insert in der Strangorientierung trug, wurde durch ein PstI-Restriktionsmuster von 420 bp, 624 bp, 760 bp und 2,7 kb umfassenden Fragmenten identifiziert und pUC18#3 genannt. Ein Klon, der ein Insert in der Gegenstrangorientierung trug, wurde durch ein PstI- Restriktionsmuster von 420 bp, 624 bp und 3,46 kb identifiziert und pUC18#2 genannt. Das Insert kodierte von 2 Nukleotiden vor der ersten Aminosäure des maturierten t-PA bis zu 1972 Nukleotiden der 3'-nichtkodierenden Sequenz.
- Das t-PA-Insert aus pUC18#2 wurde in das Pichia pastoris-Expressionsplasmid pAO810 kloniert. Plasmid pAO810 besteht aus dem Pichia pastoris-AOX1- Promoter, der Pichia pastoris-PHO1-Signalssequenz, dem AOX1-Transkriptionsterminator, dem Pichia pastoris-HIS4-Gen für die Selektion, einem f1-Replikationsursprung und Sequenzen, die für die Replikation und Selektion in Bakterien erforderlich sind. Die Herstellung von pAO810 wird in Beispiel XI beschrieben.
- 2 ug des 1600 bp umfassenden SalI/SmaI-Fragments von pUC18#2, zuvor gereinigt über ein 1%iges Agarosegel, kodierend den 5'-Anteil von t-PA, wurde mit 300 ng von XhoI/SmaI-verdautem pAO810 ligiert. Die Ligationsreaktion wurde in E. coli MC1061-Zellen transformiert und ampR-Kolonien wurden selektiert. Positive Kolonien wurden nach Verdau mit PstI durch ein Muster von 420 bp, 620 bp, 2 kb und 6,3 kb umfassenden Fragmenten identifiziert. Der resultierende Vektor wurde pT1 genannt. Es wurde eine stellengerichtete Mutagenese durchgeführt, die Standardverfahren für Vektoren mit einem f1- Replikationsursprung folgte, um die zwei zusätzlichen Nukleotide 5' zu der kodierenden Sequenz des maturierten t-PA zu entfernen. Das mutagenisierende Oligonucleotid hatte die Sequenz:
- 5' CAA TCT GTC TTC GCT TCT TAC CAA GTG ATC-3'
- Das richtige Plasmid wurde durch Screenen von SalI/XbaI-verdauten Mini-Preps identifiziert. Der ursprüngliche Vektor pT1 hatte ein Restriktionsschnittmuster von 1,2, 2,3 und 6,6 kb. Das richtige mutagenisierte Plasmid hatte ein Muster von 1,2 und 9,8 kb und wurde pT2-3 genannt.
- 50 ug pUC18#3 wurden mit SmaI/Sau3A verdaut. Die drei Banden zwischen 72 und 118 bp (75, 90, 110 bp), die den 3' Anteil von t-PA kodierten, wurden auf einem 8% Polyacrylamidgel gereinigt und mit 0,5 ug von SmaI/BamHI- geschnittenem Plasmid pT2-3 ligiert. Die Ligation wurde in E. coli MC1061- Zellen transformiert und ampR-Kolonien wurden selektiert. Positive Kolonien wurden durch PvuII/ApI-verdaute Mini-Preps identifiziert. Das richtige Plasmid zeigte ein 421 bp umfassendes Fragment (das falsche zeigte ein 225 bp umfassendes Fragment). Der richtige Vektor wurde pT37 genannt. Es wurde gezeigt, daß die 5'-Mutagenese von der richtigen Sequenz war. Jedoch zeigte das Sequenzzieren, daß das Plasmid pUC18-Sequenzen im Anschluß an das Ende der t-PA-3'- nichtkodierenden Sequenz enthielt; es wurde gezeigt, daß das Plasmid pT37 das Sau3A-Fragment von pUC18, Position 1894-2004, das direkt der t-PA-Sequenz folgte, besaß.
- 10 ug des Plasmids pT37 wurden mit StuI verdaut und zum Transformieren des Pichia pastoris-Stamms KM 71 (aox1, his4) verwendet. Die Transformanden wurden auf Histidinprototrophie selektiert. Eine Transformande KM71:pT37 wurde in YNB + 2% Glycerin gezüchtet, parallel mit Stamm KM71:pT7, der ein Plasmid (pT7) enthielt, das fast identisch mit pT37 war, mit der Ausnahme, daß die PHO1-Signalsequenz durch die native humane t-PA-Signalsequenz ersetzt worden war und das die pUC18-Sequenzen an dem 3'-Ende entfernt waren. Eine Beschreibung von pT7 wird nachfolgend bereitgestellt. 50 ml umfassende Kulturen jedes Stammes, die in YNB + 2% Glycerin wuchsen, wurden in 1 Liter umfassende Fermentatoren angeimpft und entweder in einem kontinuierlichen Modus oder einem sog. "fed-batch"-Modus wachsen gelassen. Die Ergebnisse dieses Experimentes sind in Tabelle III gezeigt. Tabelle III *t-PA ug/L
- * t-PA, der durch ELISA unter Verwendung von menschlichem t-PA als Standart einem Assay unterzogen wurde
- ** Effizienz der t-PA-Sekretion = externaler t-PA/erzeugter Gesamt-t-PA
- Die Ergebnisses dieses Experiments zeigen, daß ungeachtet des Fermentationsmodus die PHO1-Signalsequenz (SEQ ID NO: 3) effizienter bei dem Fördern der t-PA-Sekretion in Pichia pastoris war als die native Signalsequenz.
- Darüber hinaus bestätigte eine micro-Edman-Abbau-Analyse, daß die N-terminale Aminosäuresequenz des rekombinanten, sekretierten t-PA aus dem Stamm KM71:pT3 unter Verwendung der PHO1-Signalsequenz (SEQ ID NO: 3) identisch zu dem nativen t-PA war, der aus einer Quelle gezüchteten menschlichen Gewebes (Melanom) gereinigt wurde.
- 5 ug des annäherungsweise 100 bp umfassenden SmaI/Sau3A Fragmentes von pUC18#3 wurden mit 500 ng SmaI/BamHI-geschnittenem pT1 ligiert. Die Ligitationsreaktion wurde in E. coli MC1061-Zellen transformiert und es wurden ampR-Kolonien selektiert. Positive Kolonien wurden durch das Vorliegen einer Bande von 360 bp, anstatt einer Bande von 260 bp, nach Verdau mit ApaI/PvuII identifiziert. Das modifizierte 3'-Ende wurde sequenziert, und es wurde gezeigt, daß es die richtige Sequenz ohne zusätzliche pUC18-Sequenzen hat. Dieses Plasmid wurde pT49 genannt.
- Oligonukleotide, die die authentische t-PA-Signalsequenz kodieren, wurden zu der XbaI-Schnittstelle von Plasmid pT49 gegeben, und zwei Mutagenesen wurden durchgeführt, um 1) die zusätzlichen 8 Nukleotide der Sequenz zu entfernen, die zwischen der t-PA-Signalsequenz und der Sequenz blieben, die für maturierten t- PA kodiert und 2) die PHO1-Signalsequenz zu entfernen. Diese Manipulationen wurden wie folgt erzielt:
- Es wurde ein Oligonukleotid der folgenden Sequenz synthesiert (109 Nukleotide):
- 5' CTA GAT GGA TGC AAT GAA GAG AGG GCT CTG CTG TGT GCT GCT GCT GTG TGG AGC AGT CTT CGT TTC GCC CAG CCA GGA AAT CCA TGC CCG ATT CAG AAG AGG AGC CAG A 3'
- Das komplementäre Oligonukleotid, das für den zweiten Strang erforderlich war, wurde als drei Oligonukleotide mit einer Länge von von 33, 37 bzw. 39 Nukleotiden synthetisiert, die die folgenden Sequenzen hatten:
- 5' CTG GCT GGG CGA AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG 3'
- 5' CTA GTC TGG CTC CTC TTC TGA ATC GGG CAT GGA TTT C 3'
- 5' CAG CAG CAC ACA GCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT 3'
- Das Oligonukleotid mit der vollständigen Länge und die drei komplementierenden Oligonukleotide wurden kinasiert und dann angelagert ("annealt") durch Erhitzen in einem kochenden Wasserbad für 3 min und dann langsames Abkühlen auf Raumtemperatur. Das angelagerte Oligonukleotid wurde dann abgetrennt und aus einem 5%-Polyacrylamidgel isoliert.
- 200 ng von partiell mit XbaI linearisiertem pT49 wurden mit 1 ug des angelagerten doppelsträngigen OIigonukleotids ligiert. Die Ligitionsreaktion wurde in E. coli MC1061-Zellen transformiert und es wurden ampR-Kolonien selektiert. Klone, die das richtig veränderte Plasmid enthielten, wurden durch eine zusätzliche Bande von 700 bp nach Verdau mit AsuII identifiziert. Ein richtiges Plasmid wurde pT544 genannt.
- Die erste Mutagenese wurde erreicht durch eine herkömmliche f1-basierte stellengerichtete Mutagenese unter Verwendung von pT544-DNA (5 ug) und einem Oligonukleotid (1 ug) der folgenden Sequenz:
- 5' GA TTC AGA GGA GCC AGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AG 3'
- Ein Durchmustern auf das richtige Plasmid hin wurde durch einen III-Verdau durchgeführt. Das richtige Restriktionsschnittmuster (1,1, 2,8 und 5,3 kb) zeigte das richtige Plasmid an, das pT64 genannt wurde. (Ein unrichtiges Plasmid zeigte ein Muster von Banden mit 2,8 und 6,3 kb).
- Die zweite Mutageneserunde wurde mit dem Plasmid pT64 durchgeführt, um die PHO1-Signalsequenz zu entfernen. Es wurde ein Oligonukleotid der vorliegenden Sequenz verwendet:
- 5' ACT AAT TAT TCG AAA CGA TGG ATG CAA TGA AGA GAG G 3'
- 3 ug von pT64 und 0,4 ug des vorangehenden Oligonukleotids wurden bei der Mutagenese verwendet. Mini-Preps wurden durch Verdau mit BglII gescreent. Das richtige Plasmid wurde durch drei DNA-Fragmente von 1, 2,8 und 5,3 kb Größe identifiziert (das unrichtige Plasmid zeigte eine kleinste Bande von 1,1 kb anstatt von 1 kb). Die Mutagenese wurde durch Sequenzierung bestätigt und das richtige Plasmid wurde pT7 genannt.
- Dieses Beispiel zeigt, daß der PHO1-Promoter (oder die 5-regulatorische Region) (SEQ ID NO: 2) funktioniert, wenn sie auf funktionelle Weise mit heterologen Genen verknüpft ist. 1 ug des lacZ-enthaltenden Plasmids pSAOH5 (NRRL B- 15862) wurde mit EcoRI und BamHI verdaut, und das 10,1 kb umfassende Vektorfragment wurde aus einem 0,8% Agarosegel isoliert. 5 ug pLP2420 wurden mit EcoRI und BcII verdaut und das 1,6 kb umfassende Fragment, enthaltend 375 bp von pBR322-DNA, 1075 bp der PHO1-5'-flankierenden DNA einschließlich des PHO1-Promoters (SEQ ID NO: 2) und eine 123 bp PHO1- kodierende Sequenz, wurden aus einem 1% Agarosegel isoliert. 100 ng des EcoRI-BamHI Fragments von pSAOHS und 60 ng des 1,6 kb umfassenden EcoRI-BclI-Fragments von pLP2420 wurden in einem 20 ul umfassenden Gemisch von Ligasepuffer mit 1 mM ATP und 1 U T4-DNA-Ligase (erhältlich von Boehringer Mannheim) ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli-JM103 transformiert, und die transformierten Zellen wurden auf LB-Amp-Platten plattiert, die 40 ug/ml X-Gal enthielten. Blaugefärbte Kolonien wurden ausgewählt, in LB-Amp wachsen gelassen und Plasmid-DNA wurde isoliert. Die DNA wurde mit EcoRI und SmaI verdaut und das richtige Plasmid wurde durch Freisetzen eines 1450 bp umfassenden Fragments identifiziert. Das richtige Plasmid wurde pAPB 101 genannt. Eine Expressionskassette, bestehend aus dem E. coli-lacZ-Gen, das unter die Regulation des PHO1-Promoterelements von Pichia pastoris (SEQ ID NO: 2) gestellt war, war in pAPB101 enthalten.
- 10 ug an ungeschnittenen pAPB101 wurden in GS 115-Sphäroblasten transformiert und Histidinprototrophe wurden selektiert. 12 His&spplus;-Kolonien wurden ausgewählt, die Stämme wurden in flüssigen Medien mit einer hohen Phosphatkonzentration (HP) und einer niedrigen Phosphatkonzentration (LP) wachsen gelassen, und einem Assay auf β-Galactosidase-Aktivität unterzogen. Positive Transformanden-Stämme wurden auf Grundlage der β-Galactosidase-Expression nach Wachstum in LP-Medium und einem Fehlen von β-Galactosidase nach Wachstum in HP-Medium identifiziert. Der Assay auf β-Galactosidase war wie in J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, NY 1972. Blaue Kolonien erschienen auf den LP-X-Gal-Platten und weiße Kolonien erschienen auf den HP-X-Gal-Platten.
- Die folgenden Plasmide wurden zur Verwendung in anderen Beispielen dieser Anmeldung hergestellt.
- M13mp19ΔRI wurde hergestellt durch Verdauen von 1 ug M13mp19 mit EcoRI, Auffüllen mit dem Klenow-Fragment und Ligieren des aufgefüllten Fragments mit sich selbst; die Ligation wurde verwendet, um E. coli-JM 103-Zellen zu transformieren und der richtige Phage wurde durch Isolieren von DNA und Verdauen dieser mit EcoRI identifiziert. Der richtige Phage wurde nicht durch EcoRI geschnitten und M13mp19ΔRI genannt. Das Plasmid pAO804 (dessen Herstellung in WO 89/04320 beschrieben ist) wurde mit SstI und EcoRV verdaut und das Fragment von ungefähr 1,2 kb wurde aus einem 0,8% Agarosegel isoliert. (Alle Fragmente bei dieser Herstellung wurden aus 0,8-1,0% Agarosegelen isoliert.) 100 ng Fragment wurden mit 500 ng SstI- und SmaI-verdautem M13mp19ΔRI ligiert. Die Ligation wurde verwendet, um E. coli-JM103-Zellen zu transformieren, und der richtige Phage wurde durch Isolieren von DNA und Verdauen dieser mit SstI und PvuII identifiziert. Der richtige Phage wurde identifiziert durch Vorliegen eines 950 bp umfassenden Fragments, und pPSV 101 genannt.
- Ein Picomol pPSV101 wurde einer in vitro Oligonukleotid-gerichteten stellenspezifischen Mutagenese unter Verwendung von 20 umol eines Oligonukleotides mit der folgenden Sequenz unterzogen:
- 5' CGA GGA ATT CCC CGG GAT CCT TAG ACA T3'
- Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli JM 103-Zellen zu transformieren. Der korrekte Phage wurde identifiziert durch Verdau von Mini-Prep-DNA mit BglI und BamHI, und Enthüllen des Vorliegens von DNA-Fragmenten von 1,4 kb und 0,5 kb. Der richtige Phage wurde pPSV102 genannt.
- Das Plasmid pPSV 102 wurde mit. EcoRI verdaut und 500 ng des 8,5 kb umfassenden Fragments wurden mit 50 ng des folgenden doppelsträngigen synthetischen DNA-Fragments ligiert, das die PHO1-Signalsequenz von Pichia pastoris (SEQ ID NO: 3) unter Verwendung der folgenden optimierten Pichia-Kodons kodiert:
- 5'-AATTC ATG TTC TCT CCA ATT TTG TCC TTG GAA ATT ATT TTA
- 3'-G TAC AAG AGA GGT TAA AAC AGG AAC CTT TAA TAA AAT
- GCT TTG GCT ACT TTG CAA TCT GTC TTC GCT CGA G-3'
- CGA AAC CGA TGA AAC GTT AGA CAG AAG CGA GCT C TTAA-5'
- Das Ligationsgemisch wurde in E. coli-CJ236-Zellen transformiert und die richtigen Phagen-DNA wurde durch Plaquehybridisierung mit einem kodierenden Strang der Hefe-Signalsequenz identifiziert, der mit ³²P markiert worden war, und durch Verdau der hybridisierenden DNA mit SstI und BamHI, was ein 700 bp umfassendes Fragment enthüllte. Das Plasmid wurde pPSV103 genannt.
- Ein Picomol pPSV 103 wurde in vitro mit 20 umol eines Oligonukleotides der Sequenz mutagenisiert:
- 5' CTAA TTA TTC GAA ACG ATG TTC TCT CCA ATT 3'
- Die richtige Phagen-DNA wurde identifiziert durch Plaquehybridisierung mit dem gleichen Oligonukleotid, das vorangehend verwendet wurde. Das richtige Plasmid wurde pPSV 104 genannt.
- Das Plasmid pAO810 wurde hergestellt durch Verdauen von 10 ug pPSV104 mit HindIII und Isolieren eines 400 bp umfassenden DNA-Fragments aus einem 1,2 % Agarosegel. 50 ng dieses Fragments wurden mit 250 ng des 7,9 kb umfassenden HindIII-Restriktionsverdauerzeugnisses von pAO807 (dessen Herstellung nachfolgend beschrieben wird), wie aus einem 0,8% Agarosegel isoliert, ligiert.
- Die Ligation wurde in E. coli-MC1061-Zellen transformiert und ampR-Kolonien wurden selektiert. Das richtige Plasmid wurde durch Vorliegen einer 450 bp umfassenden Bande nach Verdau mit BamHI und EcoRV identifiziert und pAO810 genannt.
- f1-Bakteriophagen-DNA (50 ug) wurden mit 50 Einheiten RsaI und DraI (nach den Herstellerangaben) verdaut, um das ~458 bp umfassenden DNA-Fragment freizusetzen, das den f1-Reflikationsursprung ("ori") enthält. Das Reaktionsgemisch wurde mit einem gleichen Volumen an PCI extrahiert, gefolgt durch Extrahieren der wässrigen Schichten mit einem gleichen Volumen an CI und schließlich wurde die DNA in der wässrigen Phase durch Einstellen der NaCl- Konzentration auf 0,2 M und Zugeben von 2,5 Volumen an absoluten Ethanol präzipitiert. Das Gemisch wurde auf Eis (4ºC) für 10 Minuten stehen gelassen und das DNA-Präzipitat wurde durch Zentrifugation für 30 Minuten bei 10 000 · g in einer Mikrofuge bei 4ºC gesammelt.
- Das DNA-Pellet wurde zweimal mit 70% wässrigen Ethanol gewaschen. Das gewaschene Pellet wurde vakuumgetrocknet und in 25 ul TE-Puffer gelöst. Diese DNA wurde auf einem 1,5% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und der Gelanteil, der das 458 bp umfassende f1-ori-Fragment enthielt, wurde ausgeschnitten und die DNA in dem Gel wurde auf DE81 (Whatman)-Papier elektroeluiert und von dem Papier in 1 M NaCl eluiert. Die DNA-Lösung wurde wie vorstehend im Detail ausgeführt präzipitiert und das DNA-Präzipitat wurde in 25 ul TE-Puffer gelöst (f1-ori-Fragment).
- pBR322 (2 ug) wurde mit 2 Einheiten DraI (gemäß den Anweisungen des Herstellers) partiell verdaut. Die Reaktion wurde durch PCI-Extrakion, gefolgt durch Präzipitation der DNA wie in Schritt a. vorstehend ausführlich beschrieben, beendet. Das DNA-Pellet wurde in 20 ul TE-Puffer gelöst. Etwa 100 ng dieser DNA wurde mit 100 ng des f1-ori-Fragments (Schritt a) in 20 ul Ligationspuffer durch Inkubieren bei 40ºC über Nacht mit einer Einheit T4-DNA Ligase ligiert. Die Ligation wurde beendet durch Erhitzen auf 70ºC für 10 Minuten und dann verwendet, um den E. coli-Stamm JM103 zu transformieren, um pBRf1-ori zu erhalten, der den f1-ori enthält, der in die DraI-Schnittstellen (Nukleotidpositionen 3232 und 3251) von pBR322 kloniert ist.
- pBRf1-ori (10 ug) wurde für 4 Stunden bei 37ºC mit 10 Einheiten von jeweils PstI und NdeI verdaut. Die verdaute DNA wurde PCI-extrahiert, präzipitiert und in 25 ul TE-Puffer, wie in Schritt I vorstehend ausführlich beschrieben, gelöst. Dieses Material wurde einer Elektrophorese auf einer 1,2% Agarosegel unterzogen und das NdeI - PstI-Fragment (ungefähr 0,8 kb), das den f1-ori enthielt, wurde isoliert und in 20 ul TE-Puffer, wie in Schritt a. vorstehend ausführlich beschrieben, gelöst. Etwa 100 ng dieser DNA wurden mit 100 ng pAO804 gemischt, der mit PstI und NdeI verdaut worden und Phosphortase-behandelt worden war. Eine Beschreibung von pAO804 wird in WO 89/04320 bereitgestellt. Dieses Gemisch wurde in 20 ul Ligationspuffer ligiert, in dem es über Nacht bei 14ºC bei 1 Einheit T4-DNA-Ligase inkubiert wurde. Die Ligationsreaktion wurde durch Erhitzen auf 70ºC für 10 Minuten beendet.
- Diese DNA wurde verwendet, um den E. coli-Stamm JM103 unter Erhalt von pAO807 zu transformieren.
- 200 ng des 1,6 kb umfassenden EcoRI/BcII-Fragments von pLP2420, 100 ng des 0,8 kb umfassenden BglII/HindIII-Fragments von pPG2.5 (siehe nachfolgende Beschreibung) und 100 ng des 2,6 kb umfassenden EcoRI/HindIII-Fragments von pUC8 (New England Biolabs, Inc.) wurden in einer 3-Teile-Ligation in einem Volumen von 20 ul Ligationspuffer, 1 mM ATP, 1U T4-Ligase ligiert und in den E. coli-Stamm MC 1061 für die Amp-Resistenz transformiert. [Plasmid pPG2.5 ist das 2,5 umfassende EcoRI-SalI-Fragment von pPG4.0 (NRRL B-15868), in pBR322 platziert, das den Alkohol-Oxidase-Promoter enthält.] Resistente Klone wurden auf Plasmide hin analysiert, die ein 2,4 kb umfassendes EcoRI + HindIII- Fragment enthielten; das richtige Plasmid wurde pPSV201 genannt. 50 ng von pPSV201 wurden mit BamHI verdaut, dephosphoryliert und mit einem 50-fachen molaren Überschuß eines Oligonucleotids der folgenden Sequenz ligiert:
- 5'-GATCAGATCT-3'
- das die BamHI-Schnittstelle in eine BglII-Schnittstelle umwandelt. Positive Klone wurden auf dieser Grundlage identifiziert und das Plasmid wurde pPSV203 genannt. 10 ng von pPSV203 wurden partiell mit einer begrenzenden Menge an HindIII verdaut und mit dem Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen. Lineare Plasmidfragmente der vollständigen Länge wurden über Gel gereinigt und in einem Volumen von 100 ul mit sich selbst ligiert. Die richtigen Klone wurden auf Grundlage von Plasmid-DNA identifiziert, die ein 1350 bp umfassendes BglII/HindIII-Fragment enthielt, und die richtigen Plasmide wurden pPSV202 genannt.
- 60 ng des 500 bp umfassenden BgIII-BamHI-Fragments von pLP2420 wurden mit 100 ng an BamHI-verdautem pUC8 ligiert. Richtige Plasmide wurden auf der Grundlage eines 422 bp umfassenden NcoI-BamHI-Fragments identifiziert; das resultierende Plasmid wurde pPSV202 genannt. 50 ng von pPSV202 wurden mit BamHI verdaut, dephosphoryliert und mit einem 50-fachen molaren Überschuss eines Oligonukleotids mit der folgenden Sequenz
- 5'GATCAGATCT-3'
- ligiert, dass die BamHI-Schnittstelle in eine BglII-Schnittstelle umwandelt. Das richtige Plasmid wurde auf Grundlage eines 422 bp umfassenden NcoI/BglII- Fragments identifiziert, und pPSV204 genannt.
- 10 ug von pPSV210 wurden mit BglII und SacI verdaut, und das 700 bp umfassende Fragment wurde gelgereinigt. 25 ng dieses Fragments wurden mit 100 ng des gelgereinigten, 8200 bp umfassenden BglII/SacI-Fragments von pAO810 ligiert. Die richtigen Plasmide wurden durch die Gegenwart eines 700 bp umfassenden BglII/SacI-Fragment identifiziert und pPSV212 genannt. 10 ug von pPSV212 wurden mit SphI verdaut, mit der T4-DNA-Polymerase (wie durch Maniatis et al. beschrieben) mit stumpfen Enden versehen, partiell mit BglII verdaut und das 8000 bp umfassende Fragment wurde gelgereinigt. 10 ug von pPSV204 wurden mit NcoI verdaut, mit dem Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen, mit BgIII verdaut und das 440 bp umfassende Fragment wurde gelgereinigt. 100 ng des zuvor beschriebenen 8 kb umfassenden Fragments von pPSV212 wurden mit 15 ng des 440 bp umfassenden Fragments von pPSV204 ligiert. Das richtige Plasmid wurde auf Grundlage eines 5500 bp umfassenden BglII-Fragments identifiziert und pPSV218 genannt.
- ANZAHL DER SEQUENZEN: 5
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 1994 bp
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: Linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Genomische DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 400 bp
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: Linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Genomische DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 66 bp
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: Linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Genomische DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 1341 bp
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: Linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Genomische DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 187 bp
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: Linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Genomische DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
Claims (19)
1. Isoliertes DNA-Fragment, umfassend das Saure Phosphatase-Gen von Pichia
pastoris, das die Nukleotidsequenz besitzt, die in SEQ ID NO: 1 ausgeführt
ist.
2. Isoliertes DNA-Fragment, umfassend die 5'-regulatorische Region der Sauren
Phosphatase von Pichia pastoris, die die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2
besitzt.
3. Isoliertes DNA-Fragment, umfassend die Signalsequenz der Sauren
Phosphatase von Pichia pastoris, das die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 3 besitzt.
4. DNA-Fragment nach Anspruch 2 oder 3, wobei das DNA-Fragment auf
funktionsfähige Weise mit einer heterologen DNA-Sequenz verknüpft ist, die
für mindestens ein Polypeptid kodiert.
5. Verfahren zur Sekretion eines heterologen Proteins aus einer Hefezelle, wobei
die Sekretion durch das Vorliegen einer Signalsequenz aus dem Saure
Phosphatase-Gen (SEQ ID NO: 3) von Pichia pastoris gelenkt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Hefezelle eine Hefezelle der Gattung
Pichia pastoris ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das heterologe Protein der Gewebe-
Plasminogen-Aktivator ist.
8. Isoliertes DNA-Fragment, umfassend das Strukturgen der Sauren
Phosphatase von Pichia pastoris, das die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 4 besitzt.
9. Isoliertes DNA-Fragment, umfassend die
3'-Transkriptions-Terminationssequenz der Sauren Phosphatase von Pichia pastoris, die die
Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 5 besitzt.
10. Vektor, umfassend die DNA-Sequenz SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4
oder NO: 5.
11. Expressionsplasmid, umfassend die für die PHO1-Signalsequenz von Pichia
astoris kodierende DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 3) und die für den
maturierten Gewebe-Plasminogen-Aktivator kodierende DNA, auf funktionsfähige
Weise verknüpft mit der 5'-regulatorischen Region der Alkohol-Oxidase 1
(AOX1) von Pichia pastoris.
12. Verfahren zur Aktivierung der 5'-regulatorischen Region der Sauren
Phosphatase, die von dem Saure Phosphatase-Gen von Pichia pastoris (SEQ ID
NO: 1) abgeleitet ist, um die Expression einer heterologen DNA-Sequenz zu
ermöglichen, die mindestens ein Polypeptid kodiert, umfassend das
Inkontaktbringen einer geeigneten Hefewirtszelle, die mit der 5'-regulatorischen
Region (SEQ ID NO: 2) der Sauren Phosphatase transformiert worden ist
oder mit genetischen Varianten davon in Folge von klonaler Variation oder
Sequenzierungsfehlern, auf funktionsfähige Weise verknüpft mit einer
heterologen DNA-Sequenz, mit einem Medium, in dem die Konzentration von
Phosphat eine Expression bewirken wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Hefewirtszelle Pichia pastoris ist.
14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die heterologe DNA zusätzlich eine
Signalsequenz enthält, insbesondere die Signalsequenz der Sauren Phosphatase
von
Pichia pastoris (SEQ ID NO: 3), die auf funktionsfähige Weise damit
verknüpft ist.
15. Isoliertes DNA-Fragment, umfassend die Signalsequenz der Sauren
Phosphatase von Pichia pastoris (SEQ ID NO: 3), auf funktionsfähige Weise
verknüpft mit einer 5'-regulatorischen Region, insbesondere der 5'-
regulatorischen Region der Sauren Phosphatase von Pichia pastoris (SEQ ID
NO: 2) oder der 5'-regulatorischen Region der Alkohol-Oxidase (AOX1) von
Pichia pastoris.
16. DNA-Fragment nach Anspruch 15, wobei das DNA-Fragment auf
funktionsfähige Weise mit einer heterologen DNA-Sequenz verknüpft ist, die für
mindestens ein Polypeptid kodiert.
17. DNA-Fragment nach Anspruch 4 oder 16, wobei die heterologe DNA für den
Gewebe-Plasminogen-Aktivator kodiert.
18. Verfahren zum Lenken der Integration an dem PHO1-Locus von Pichia pa
storis unter Verwendung eines integrativen Vektors, der die 5'- (SEQ ID NO:
2) und 3'- (SEQ ID NO: 5) flankierenden Sequenzen des PHO1-Gens von
Pichia pastoris oder Varianten davon in Folge von klonaler Variation oder
Sequenzierungsfehlem umfaßt.
19. Verfahren zum Identifizieren von Pichia pastoris-Transformanten, die
Expressionsvektoren, wie sie in Anspruch 18 definiert sind, integriert an dem
PHO1-Locus, enthalten, wobei Pichia pastoris, die transformiert worden ist,
auf Indikatorplatten mit niedrigem Phosphat plattiert, über Nacht wachsen
gelassen wird, und die resultierenden Kolonien auf eine weiße Farbe hin
durchgemustert werden.
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