DE69121159T2

DE69121159T2 - Wirt-Vektor-System

Info

Publication number: DE69121159T2
Application number: DE69121159T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Horiuchi; Kenji Sakaguchi; Masamichi Takagi; Koji Yanai
Original assignee: Japan Maize Products Co Ltd
Current assignee: Japan Maize Products Co Ltd
Priority date: 1990-10-04
Filing date: 1991-10-03
Publication date: 1997-03-13
Anticipated expiration: 2011-10-04
Also published as: ATE140974T1; EP0479301B1; EP0479301A2; EP0479301A3; DE69121159D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Wirt-Vektor-System, bei dem die Wirte Rhizopus sind und die Vektoren Mucor circinelloidesstämmig sind.

Beschreibung des Stands der Technik

Es wurde ein Verfahren geschaffen zur Herstellung nützlicher Proteine wie Interferon, Interleukin und anderer mittels genmanipulierter Bakterien. Bei dem Verfahren, das Bakterien als Wirte verwendet, treten jedoch jetzt Probleme auf. Beispielsweise ist bei vielen Bakterien die extrazelluläre Sekretion des Proteins nicht so effizient, was manchmal für die Erzeugung großer Mengen von Zielproteinen sehr nötig ist. Darüberhinaus hat das von E. coli intrazellulär erzeugte Interferon oder Interleukin die falsche Sekundarstruktur, die verschieden ist von der des natürlichen Proteins. Als Ergebnis wird das künstliche Protein in einem menschlichen Körper als ein Antigen erkannt. Daher sind vor der pharmazeutischen Verwendung des Proteins Denaturierungs- und Renaturierungs-Vorgänge des künstlichen Proteins erforderlich.
Ein weiterer wichtiger Vorteil eines Pilz-Gentechnologiesystems ist seine Fähigkeit, glykosiliertes Protein zu erzeugen, was mit Bakterien-Wirt- Vektor-Systemen unmöglich ist. Viele menschliche und tierische Hormone und andere physiologisch wichtige Proteine sind mit Oligosaccharid-Ketten verbunden. Diese Glyko-Komponenten sind manchmal unerläßlich für die physiologischen Funktionen der menschlichen Hormone wie im Fall von Erythropoietin, und sie erhöhen in vielen Fällen die Stabilität der Zielproteine gegen den Angriff von Proteinasen in dem Nährmedium, in den injizierten Körpefflüssigkeiten, etc. Pilze und Hefen erzeugen jeweils unterschiedliche Strukturen von Glyko-Komponenten, was dem menschlichen Immunsystem und anderen unterschiedliche Erkennungssignale gibt. Daher ist der Aufbau verschiedener Fitz-Gensysteme wichtig. Die Wirt-Vektor-Syteme, die tierische und menschliche Zellen als Wirte verwenden, erzeugen ähnlich oder korrekt glykosilierte Proteine, ihre Produktionsfähigkeit der Zielproteine ist jedoch viel niedriger als bei dem Pilzsystem.
Phykomyceten wie Rhizopus oder Mucor werden häufig in der Fermentations-Technologie verwendet. Sie werden den Phykomyceten zugeordnet. Rhizopus hat die extensive Fähigkeit, Enzyme und Proteine extrazellulär abzusondern. Beispielsweise ist die Menge an Glucoamylase, die von Rhizopus niveus in das flüssige Nährmedium abgesondert wird, etwa 20 g/Liter und die, die beim Verfahren mit festem Nährboden abgesondert wird, ist etwa 30 g/kg. Außerdem ist wegen des extrazellulären Sekretionssystems durch die Membran nicht nur die Primärstruktur, sondern auch die Sekundärstruktur des sich ergebenden Proteins die gleiche wie die eines natürlichen Proteins. Daher wird erwartet, daß für die Herstellung verschiedener Arten von kommerziell wichtigen Enzymen und Proteinen transformierte Schimmelpilze verwendet werden. Für Pilze sind jedoch nur einige wenige Transformations-Techniken eingeführt, und bis jetzt wurde keine für Rhizopus verwendete Transformations-Technik bekannt.
WO-A-86/03774 offenbart ein Verfahren zum Transformieren eines Pilzes der Klasse Zygomycetes, insbesondere eines Pilzes der Gattung Mucor, mit einem rekombinanten Expressionsvektor, der in der Pilzspezies repliziert wird. Für die Transformation werden Vektoren verwendet, die von der gleichen Gattung wie der Wirt stammen. Die transformierten Pilze können die Erzeugung von Genprodukten wie Hormonen, Nudeinsäuren oder Enzymen erlauben.
JP-A-2053480 offenbart ein Verfahren zum Trarisformieren eines Pilzes der Gattung Rhizopus, z. B. Rhizopus niveus. Die entsprechenden Protoplasten-Zellen werden in Gegenwart von für das Zielprotein codierenden DNA-Fragmenten oder die DNA enthaltenden Plasmiden mit Polyethylenglykol behandelt, um die gewünschte DNA enthaltende verschmolzene Zellen zu erhalten.
T. Suarez et al, 1988, Mol. Gen. Genet., Bd. 212, Seiten 120-123, betrifft die Transformation von Phykomyces-Protoplasten für Kanamycin-Resistenz. Transformanten konnten erhalten werden mit einem ein Phykomyces-Insert aufweisenden Plasmid.
Unter diesen Umständen stellten die Erfinder vorliegender Erfindung erfolgreich eine Transformations-Technik bereit, die für Rhizopus verwendet wird (siehe japanische Patentoffenlegungsschrift (KOKAI) JP- A-2-53480).
Es war jedoch kein Vektor bekannt, der für die Erzeugung eines Enzyms unter Verwendung von Rhizopus als Wirt geeignet war. Es ist eine Aufgabe vorliegender Erfindung, ein Wirt-Vektor-System bereitzustellen, das geeignet ist für die Erzeugung von Proteinen und Enzymen unter Verwendung von Rhizopus als Wirt, was wegen ihrer großen Produktion an Zelimasse die gesteigerte Fähigkeit bewirkt, Proteine und Enzyme extrazellulär und in der Zelle zu erzeugen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Wirt-Vektor-System, aufweisend Rhizopus-Species. und ein von Mucor circinelloides stammendes Plasmid, wobei das Plasmid einen Replikationsstartpunkt von pLeu4 enthält und in der Lage ist, die Rhizopus-Species zu transformieren, um ein gewünschtes Zielprotein zu erzeugen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pLeu4. Die Figuren 2 und 3 zeigen ein Herstellungsverfahren der Plasmide pJPLeu4 und pJPLeu4l. Figur 4 zeigt ein Herstellungsverfahren des Plasmids PLeu4l.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Fadenförmige Pilze Rilizopus niveus (IFO4810) werden als Wirt des Wirt-Vektor-Systems der Erfindung verwendet. Außerdem können die Rhizopus-Species ausgewählt werden aus der Gruppe, die besteht aus Rhizopus delemar wie dem Stamm ATCC 9374, Rhizopus javanicus, wie den Stämmen ATCC 22581 und 22580, Rhizopus oligosporus, wie dem Stamm ATCC 22959, Rhizopus nigricans, wie dem Stamm ATCC 24862, und Rhizopus oryzae, wie den Stämmen JCM 5557=IAM 6015 und JCM 5558=IAM 6019.
Ein von Mucor circinelloides stammendes Plasmid ist ein Vektor des Systems der Erfindung. Die Verwendung des von Mucor circinelloides stammenden Plasmids als der Vektor ermöglicht es, den Wirt, Rhizopus mveus, zu transformieren.
Zu Beispielen des Mucor circinelloides-stämmigen Plasmids gehören die Plasmide pLeu4, pPS11, pMA67, pJL1, pJL2, pMCL1302, pMCL002, pJPLeu4, pPPLeu4, pLeu41, pJPLeu41 und pPPLeu41 (s. Figuren 2-4).
Die oben angeführten Plamide sind nach den folgenden Verfahren erhältlich.
Plasmid pLeu4 ist erhältlich gemäß dem in dem Artikel von Roncero, M.I.G et al, Gene, 84, 335-343 (1989) berichteten Verfalrren. Dessen Offenbarung wird hiermit durch Bezugnahme zum Offenbarungsgehalt dieser Beschreibung gemacht.
Plasmid pPS11 ist erhältlich aus Phycomyces blakesleeanus (Stamm NRRL1555) gemäß dem in dem Artikel von T. Suarez et al, Mol. Gen. Genet. 212 120-123, 1988, beschriebenen Verfahren. Dessen Offenbarung wird hiermit durch Bezugnahme zum Offenbarungsgehalt dieser Beschreibung gemacht.
Plasmid pMA67 ist erhältlich aus Plasmid pMCL1302 gemäß dem in dem Artikel von L. Dickinson et al, Carsberg Research Communications, 52 243-252, 1987, berichteten Verfahren. Dessen Offenbarung wird hiermit durch Bezugnahme zum Offenbarungsgehalt dieser Beschreibung gemacht.
Die Plasmide pJL1 und pJL2 sind erhältlich aus Phycomyces blakesleeanus (Stamm A459) gemäß dem in dem Artikel von J.L. Revuetta et al, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 83 7344-7347, 1986, berichteten Verfahren. Dessen Offenbarung wird hiermit durch Bezugnahme zum Offenbarungsgehalt dieser Beschreibung gemacht.
Die Plasmide pMCL13O2 und pMCL002 sind erhältlich aus Mucor circinelloides f. lusitanicus (Stamm CBS227.49), welcher der gleiche ist wie Mucor racemosus (Stamm ATCC 12166) gemäß dem in dem Artikel von R. van Heeswijck, Carsberg Research Communications, 51, 433- 443, 1986, berichteten Verfahren. Dessen Offenbarung wird hiermit durch Bezugnahme zum Offenbarungsgehalt dieser Beschreibung gemacht.
Plasmid pJPLeu4 ist erhältlich durch Insertion eines EcoRI-XbaI- Fragments (0,9 kbp) des Plasmids pJL2 in eine SamI-Stelle von pLeu4.
pJPLeu41 ist erhältlich durch Verdau des Plasmids pJPLeu4 mit den Restriktionsenzymen AvaI und SalI und Selbstligation des durch den Verdau erhaltenen Fragments von 7,2 kbp.
Plasmid pPPLeu4 ist erhältlich durch Insertion eines aus Plasmid pPS11 erhaltenen BamHI-Fragments (5,2 kbp) in eine Sanil-Stelle von pLeu4. Plasmid pPPLeu41 ist erhältlich durch Verdau von Plasmid pPPLeu4 mit den Restriktionsenzymen AvaI und SalI und Selbstligation des durch den Verdau erhaltenen Fragments von 11,5 kbp.
Plasmid pLeu41 ist erhältlich durch Verdau von Plasmid pLeu4 mit den Restriktionsenzymen AvaI und SalI und Selbstligation des durch den Verdau erhaltenen Fragments von 6,3 kbp.
Der oben erwähnte Vektor wird in ein Chromosom des Wirts Rhizopus niveus eingeführt oder ist einem Cytoplasma von Rhizopus niveus enthalten bzw. die Vektoren werden in Chromosomen von Wirten Rhizopus niveus eingeführt oder sind in Cytoplasmen von Rhizopus niveus enthalten. Außerdem ist es möglich, daß der Vektor (die Vektoren) in ein Chromosom (Chromosomen) von Rhizopus niveus eingeführt wird (werden) und gleichzeitig in einem Cytoplasma (Cytoplasmen) von Rhizopus niveus enthalten ist (sind). Wenn der Vektor (die Vektoren) in das Chromosom (die Chromosomen) von Rhizopus niveus eingeführt wird (werden), ist die Anzahl der in ein Chromosom eingeführten Vektoren einer oder mehrere. Wenn der Vektor (die Vektoren) in dem Cytoplasma (den Cytoplasmen) von Rhizopus niveus enthalten ist (sind), ist die Anznhl der in einem Cytoplasma enthaltenen Vektoren auch einer oder mehrere.
Das Wirt-Vektor-System der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden auf der Basis des in der japanischen Patentoffenlegungsschrift (KOKAI) JP-A-2-53480 erwähnten Verfahrens. Deren Offenbarung wird hiermit durch Bezugnahme zum Offenbarungsgehalt dieser Beschreibung gemacht.
Sporen von Rhizopus niveus werden kultiviert, um Gerrninationsröhren zu erhalten. Die Germinationsröhren, Sporen oder Myzele werden behandelt mit Novozym 234, Chitinase und Chitosanase, um Protoplasten-Zellen zu erhalten. Die Zellen werden in Gegenwart von Plasmiden von Mucor circinelloides mit Polyethylenglykol behandelt, um verschmolzene Zellen zu erhalten, die die Plasmide von Mucor circinelloides enthalten. Das Wirt-Vektor-System der vorliegenden Erfindung wird erhalten, indem man die verschmolzenen Zellen der Renaturierung unterzieht.
Die Plasmide von Mucor circinelloides sind zyklisch und können verwendet werden, wie sie sind. Alternativ sind die Plasmide in einer linearen DNA-Form (linearen DNA-Formen), welche erhalten wird (werden) durch Schneiden des Plasmids mit einem geeigneten Restriktionsenzym (geeigneten Restriktionsenzymen). Es gibt eine Tendenz, daß die Transformationsrate hoch ist, wenn die zyklischen Plasmide verwendet werden, und daß die Insertionsrate des Plasmids (der Plasmide) in ein Chromosom hoch ist, wenn das lineare verwendet wird.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele genauer veranschaulicht.

Beispiel 1

Herstellung eines auxotrophen Mutanten

1 ml einer Suspensionsiösung, die 10&sup6; bis 10&sup7; Stück/ml Sporen von Rhizopus niveus enthielt, wurde mit UV-Strahlung (0,0036 J/cm²) bestrahlt, und die Lebensfähigkeit wurde gemessen. Die Lösung wurde auf ein Vollagar-Plattenmedium aufgebracht. Nach etwa 20tägigem Kultivieren bei 37ºC wurden Sporen gesammelt und mit Kochsalzlösung gewaschen. Dann wurden die sich ergebenden Sporen einer Stationärkultur in einem flüssigen Mintmalmedium bei 30ºC unterzogen und mit einem G3-Glasfilter ffitriert. Diese Vorgänge wurden wiederholt bis die Sporen nicht mehr wuchsen.
Auf diese Weise erhaltene Sporen wurden in einer Kochsalzlösung suspendiert, und die Suspension wurde auf ein saures Vollagar- Plattenmedium (2,4% Kartoffeldextrose (erhältlich von Difco/USA), 0,1 % HCl, 1,5 % Agar) aufgebracht und bei 30ºC 2-3 Tage lang kultiviert. Nach dem Kultivieren wurden die Sporen auf dem Medium auf ein Mimmalagar-Medium (2 % Glukose, 0,2 % Asparagin, 0,05 % KH&sub2;PO&sub4;, 0,025% MgSO&sub4; 7 H&sub2;O, 1,5% gereinigter Agar), das verschiedene Aminosäuren und Nudeinsäuren enthielt, repliziert.
Ein Leucin (leu)-auxotropher Mutant wurde zur Erhaltung des Stammes R. niveus M 37 auf eine übliche Art aus den replizierten Sporen ausgewählt.

Transformation von Rhizopus niveus

2-5 x 10&sup7; Stück des sich ergebenden Stammes R. niveus M 37, ein leuauxotropher Mutant, wurden in Wasser suspendiert und mit einem G1- Glasfilter filtriert. Das sich ergebende Filtrat wurde mit einem G3- Glasffiter filtriert. Das so erhaltene Filtrat wurde bei 2500 Upm 7 Minuten lang zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 5-8 ml einer Lösung, die 1 % Glucose, 20% Hefeextrakt, 2 % Polypepton und 0,01 M Prolin enthielt, suspendiert und 4,5 bis 5 Stunden lang bei 30ºC einer Schüttelkultur mit einer Wechselschüttelvorrichtung bei 300 Upm unterzogen.
Nachdem die Bildung von Germinations-Röhren durch Betrachtung mit einem Mikroskop bestätigt war, wurde die Suspension mit einem G1- Glasfilter filtriert und das Filtrat wurde 3 Minuten lang bei 3000 Upm zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 5 ml einer Pufferlösung (A) (13,2 mM Zitronensäure, 33 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 0,3 M Mannitol) suspendiert und 3 Minuten lang bei 3000 Upm zentrifugiert. Der Niederschlag wurde erneut in Pufferlösung (A) suspendiert und 3 Minuten lang bei 3000 Upm zentrifugiert.
Der sich ergebende Niederschlag wurde in 2 ml Pufferlösung (A) suspendiert. 35 mg Novozym 234 (erhältlich von Novo Corporation in Dänemark), 14 mg Chitinase ABC (erhältlich von Advanced Biofactures/USA) und 10 Einheiten Chitosanase (erhältlich von Wako in Japan) wurden in 5 ml Pufferlösung (A) suspendiert. Die Suspension wurde zu der Suspension des Niederschlags hinzugefügt und mittels Verwendung einer Wechselschüttelvorrichtung (bei 60 Upm) 1,5 bis 2 Stunden lang bei 30ºC einer Schüttelkultur unterzogen. Nachdem die Bildung von Protoplasten-Zellen durch Betrachtung mit einem Mikroskop bestätigt war, wurde die Suspension mit einem G2-Glasfilter filtriert. Das Filtrat wurde 4 Minuten lang bei 450 Upm zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 5 ml Pufferlösung (B) (10 mM MOPS (pH 6,3), 50 mM CaCl&sub2;, 0,3 M Mannitol) suspendiert und 4 Minuten lang bei 450 Upm zentrifugiert. Diese Vorgänge des Suspendierens und Zentrifugierens wurden zweimal wiederholt. Der Niederschlag wurde allmählich in 200 µl der Pufferlösung (13) suspendiert und gemischt mit 10 µl einer Suspension des Plasmids pLeu4 (Roncero, M.I.G. et al, Gene, 84, 335-343 (1989); Plasmid pLeu4 hat ein leuA-Gen von Mucor circinelloides und ein ARS-Element, das in Mucor circinelloides funktioniert), die hergestellt wurde durch Suspendieren von etwa 10 bis 20 µg pLeu4 in 10 µl einer Lösung, die 10 mM MOPS (pH 6,3), 50 mM CaCl&sub2; und 1 mg/20µl Heparin enthielt. Die Mischung ließ man 5 Minuten lang in einem Eisbad stehen, und es wurden 10 µl einer Pufferlösung (C) (10 mM MOPS (pH 6,3), 50 mM CaCl&sub2;, 40 % PEG 4000-Lösung) hinzugefügt. Die Mischung ließ man 25 Minuten in einem Eisbad stehen, und es wurden weitere 1,25 ml Pufferlösung (C) hinzugefügt. Dann ließ man die Mischung 25 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Die Mischung wurde mit 10 ml Pufferlösung (B) gemischt und 3 Minuten lang bei 600 Upm zentrifugiert.
Der Niederschlag wurde in 1 ml einer Lösung, die 1 % Glukose, 2 % Hefeextrakt, 2 % Polypepton und 0,3 M Mannitol enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde in ein Eppendrof-Rohr überführt und 30 Minuten lang bei 30ºC der Stationärkultur unterzogen. Dann wurde die Suspension 1 Minute lang bei 1000 Upm zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 1 ml einer 0,4 M Mannitol-Lösung suspendiert und 1 Minute lang bei 1000 Upm zentrifügiert. Diese Vorgänge des Suspendierens und Zentrifugierens wurden zweimal wiederholt. Der Niederschlag wurde in 100 µl einer 0,4 M Mannitol-Lösung suspendiert und mit 5 ml Medium (D) (SIV Minimalmedium, 0,35 M Mannitol und 0,2% H&sub2;SO&sub4; wurden bei 48ºC gelöst), das 1 % gereinigten Agar enthielt, gemischt. Dann wurde die Mischung auf einem Plattenmedium (D), das 1,5 % gereinigten Agar enthielt, zur Ausbildung einer Schicht angeordnet und 2 bis 3 Tage lang bei 30ºC kultiviert. Jede Kolonie wurde auf SW Minimalmedium repliziert und gelagert. Das heißt, Plasmid pLeu4 war komplementär zum leu-auxotrophen Stamm R. niveus M 37, und es war geklärt, daß Plasmid pLeu4 im Stamm R. niveus M 37 als ein Vektor funktionsfähig war.

SW Minimalmedium

Lösung (A):

Destilliertes Wasser 480 ml
Stickstoffquelle, Asparagin 2 g
50fach konzentrierte Lösung (*) 20 ml
Agar-Pulver 15 g

Lösung (B):

Destilliertes Wasser 490 ml
Glukose 20 g
Lösung (A) und Lösung (B) wurden jeweils in einem Autoklaven behandelt und gemischt.

(*) 50fach konzentrierte Lösung:

KH&sub2;PO&sub4; 250 g
MgSO&sub4; 7H&sub2;O 25 g
Spurenelemente (**) 5 ml
14% (Gew./Gew.) CaCl&sub2;-Lösung 10ml
Thiamin HCl 100 mg
Destilliertes Wasser 1000 ml
Zur Lagerung wurden 2-3 ml Chloroform zugegeben.

(**) Spurenelemente:

Zitronensäure H&sub2;O 29
Fe(NO&sub3;)&sub3; 9H&sub2;O 1,5 g
ZnSO&sub4; 7H&sub2;O 1g
MnSO&sub4; H&sub2;O 300 mg
CuSO&sub4; 5H&sub2;O 50 mg
NaMoO&sub4; 2H&sub2;O 50 mg
Alle DNAs wurden von den erhaltenen Transformanten extrahlert und einer Analyse mittels Southern-Blot-Technik unterzogen. Es ergab sich, daß Plasmid pLeu4 in ein Chromosom des Stamms Rhizopus niveus M 37 in Tandem-Form eingeführt wurde oder in einem Cytoplasma des Stamms Rhizopus niveus M 37 enthalten war.
E. coli wurde unter Verwendung aller von den erhaltenen Transformanten extrahierten DNAs transformiert. Dann wurde das Plasmid pLeu4 in seiner vollständigen Form aus den transformierten E. coli-Zellen zruückgewonnen. Das bedeutet, daß Plasmid pLeu4 ARS- 29.10.96 17:55 Aktivität enthielt und im Stamm Rhizopus niveus M 37 replizierbar war.

Beispiel 2

Mit der gleichen Vorgehensweise, wie sie in Beispiel 1 beschrieben ist, wurden die durch Schneiden des zyklischen Plamids pLeu4 mit jedem der vier Arten von Restriktionsenzymen (Pst I, Bgl II, Sac I und Sca I) erhaltenen linearen DNA-Fragmente in Rhizopus niveus transformiert. Das zyklische Plasmid pLeu4 war das gleiche wie das in Beispiel 1 verwendete und dessen Restriktionskarte in Fig. 1 gezeigt ist. Als Ergebnis wurde leu-Auxotrohpie durch Verwendung jedes Fragments ausgeglichen. Alle DNAs der erhaltenen Transformanten wurden einer Analyse mittels Southern-Blot-Technik unterzogen. Es ergab sich, daß der Anteil von in Chromosome eingeführten Plasmiden höher war als der der Transformation unter Verwendung von zyklischen Plasmiden.

Beispiel 3

Rhizopus niveus wurde auf einem PD-Medium oder einem Minimalmedium angelegt und bei 30ºC etwa 10 Tage lang kultiviert, um Sporen zu erhalten. Von jedem Myzel wurden Konidienfäden gesammelt und in 30 ml sterilisiertem Wasser suspendiert. Dann wurde das Wasser stark gerührt, um in den Konidienfäden enthaltene Sporen freizusetzen. Aus der sich ergebenden Suspension wurden die Sporen mittels eines G3-Glasffiters gesammelt. Die Sporen-Suspension wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 3000 Upm zentrifugiert, um Sporen zu sammeln. Die Sporen wurden mit einer Kochsalzlösung gewaschen und in einem flüssigen YPG-Medium (1 % Glukose, 2 % Polypepton, 2 % Hefeextrakt) suspendiert (2-5x10&sup7; Stück/ml). Die Sporen-Suspension wurde in ein sterilisiertes Teströhrchen mit einem Baumwollstopfen gegossen und etwa 5 Stunden lang bei 30ºC einer Schüttelkultur (eine Wechselschüttelvorrichtung bei 300 Upm) unterzogen, bis Germinations- Röhren gebildet wurden. Dann wurden übermäßig gekeimte Sporen von Sporen direkt nach der Keimung entfernt. Das Filtrat wurde zentrifugiert und der Niederschlag wurde mit 0,3 x McIlvaine-Pufferlösung (13,3 mM Zitronensäure, 33 mM Na&sub2;HPO&sub4;, pH 5,6) zweimal gewaschen, um die Pufferlösung zu substituieren.
Die gekeimten Spuren wurden in 7 ml der oben angeführten Pufferlösung, die 5 mg/ml Novozym 234 (erhältlich von Novo Corporation in Dänemark), 2 mg/ml Chitinase ABC (erhältlich von Advanced Biofactures/USA) und 1,52 mglml Chitosanase (erhältlich von Wako in Japan) enthielt, suspendiert. Die sich ergebende Suspension wurde in ein Kunststoffröhrchen gegeben und 1,5 bis 2 Stunden lang bei 30º C einer Schüttelkultur bei 40 Upm unterzogen. Der Bodensatz aus Protoplasten Zellen wurde entfernt und das Filtrat wurde 4 Minuten lang der Zentritugierung mittels eines Hängerotors (70 x g) unterzogen, um Protoplasten Zellen zu sammeln. Die gesammelten Zellen wurden zweimal mit Pufferlösung (A) gewaschen und in 400 µ1 Pufferlösung (A) (10 mM MOPS (pH 6,3), 50 mM CaCl&sub2;, 0,3 M Mannitol) suspendiert. 100 µ l der sich ergebenden Lösung wurden gemischt mit einer Plasmid- DNA-Lösung, die im voraus hergestellt worden war durch Lösen von Plasmid pleu 4 in 10 µ 1 Pufferlösung (C) (Pufferlösung (A) versetzt mit Heparin mit der Konzentration von 50 mg/ml) und Stehenlassen in einem Eisbad für 20 Minuten oder mehr. Die Mischung wurde 5 Minuten lang in einem Eisbad stehen gelassen und es wurden 10 µ 1 einer 40 %igen PEG-Lösung (10 mM MOPS (pH 6,3), 50mM CaCl&sub2;, 40 % PEG 4.000-Lösung) hinzugefügt. Die Mischung wurde langsam durchmischt und 25 Minuten lang in einem Eisbad stehen gelassen.
Weitere 1,25 ml der 40 %igen PEG-Lösung wurden hinzugefügt. Dann wurde die Mischung 25 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Mischung wurde mit 10 ml Pufferlösung (A) gemischt und 4 Minuten lang der Zentrifugierung mittels eines Hängerotors (50 x g) unterzogen, um Zellen zu sammeln. 1 ml eines YPG-Mediums, das 0,3 M Mannitol enthielt, wurde zu den gesammelten Protoplasten Zellen hinzugefügt und bei 30º C 30 Minuten stehen gelassen. Dann wurden die Protoplasten Zellen zweimal mit 0,4 M Mannitol-Lösung gewaschen und auf einem Minimalmedium angelegt. Die Anznnl erzeugter Kolonien wurde gezählt und die Kolonieanzahl pro 1 µg DNA wurde berechnet. Die Ergebnisse wurden in den Tabellen 1 und 2 aufgelistet. Tabelle 1
In Ex 1, Ex 2 und Ex 3, wurden 25, 20 bzw. 10 µ g Plasmid-DNA verwendet. Tabelle 2
In Ex 1, Ex 2 und Ex 3 wurden 20, 10 bzw. 20 g Plasmid-DNA verwendet.
N.T.: nicht getestet.
In den obigen Experimenten verwendete Plasmid-DNA wurde, wie nachstehend erklärt, gemäß den in den Fig. 2 bis 4 gezeigten Flußdiagrammen hergestellt.
pJPLeu 4: Ein EcoRI-XbaI-Fragment (0,9 kbp) wurde aus Plasmid pJL2 isoliert, und die Enden des Fragments wurden mit T4 Polymerase geglättet. Das Fragment wurde unter Verwendung von T4 DNA Ligase ligiert mit Plasmid pleu 4, das vorausgehend mit Sam 1 verdaut und dephosphoryliert wurde, um Plasmit pJPLeu 4 zu erhalten.
pJPLeu4l: Plasmid pJPLeu 41 wurde erhalten durch Verdau von Plasmid pJPLeu 4 mit Ava 1 und Sal 1, Glätten der Enden des sich ergebenden 7,2 kbp Fragments mit T4 Polymerase und Selbstligation des Fragments.
pPPLeu4: BamHI Fragment (5,2 kbp) wurde aus Plasmid pPS11 isoliert, und die Enden des sich ergebenden 7,2 kbp Fragments wurden mt T4 Polymerase geglättet. Das Fragment wurde unter Verwendung von T4 DNA Ligase ligiert mit Plasmid pLeu4, das vorausgehend mit Sam 1 verdaut und dephosphoryliert worden war, um Plasmid pJPLeu 4 zu erhalten.
pPPLeu41: Plasmid pPPLeu4l wurde erhalten durch Verdau von pPPLeu4 mit Aval und Sall, Glätten der Enden des sich ergebenden 11,5 kbp Fragments mit T4 Polymerase und Selbstligation des Fragments.
pLeu4l: Plasmid pLeu4l wurde erhalten durch Verdau von pLeu4 mit Aval und Sall, Glätten der Enden des sich ergebenden 6,3 kbp Fragments mit T4 Polymerase und Selbstligation des Fragments.

Claims

1. Wirt-Vector-System für die Erzeugung eines Zielproteins in Rhizopus, wobei das System eine Rhizopus-Spezies und mindestens ein Mucor circinelloides-stämmiges Plasmid aufweist, wobei das Plasmid einen Replikationsstartpunkt von pLeu4 enthält und in der Lage ist, die Rhizopus-Spezies zu transformieren und das Zielprotein zu erzeugen.

2. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 1, bei dem die Rhizopus- Spezies ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Rhizopus niveus, Rhizopus delemar, Rhizopus javanicus, Rhizopus oligosporus, Rhizopus nigricans und Rhizopus oryzae.

3. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 2, bei dein die Rhizopus- Spezies Rhizopus niveus ist.

4. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 3, bei dem mindestens ein Plasmid in ein Chromosom von Rhizopus niveus eingefügt ist.

5. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 3, bei dem mindestens ein Plasmid extrachromosomai ist.

6. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 3, bei dem nündestens ein Plasmid in ein Chromosom von Rhizopus niveus eingefügt ist und mindestens ein Plamid extrachromosomai ist.

7. Wirt-Vektor-System nach Anspruch 3, bei dem das Plasmid pMCL1302, pMCL002, pMA67 oder pLeu4 ist.