DE69527835T2

DE69527835T2 - Methode zur herstellung einer variante eines lipolytischen enzymes

Info

Publication number: DE69527835T2
Application number: DE69527835T
Authority: DE
Inventors: Ib Groth Clausen; Jens Sigurd Okkels; Allan Svendsen; Marianne Thellersen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1994-02-22
Filing date: 1995-02-22
Publication date: 2003-04-10
Anticipated expiration: 2015-02-23
Also published as: AU1806795A; FI119514B; BR9506861A; CN1147836A; ATE222604T1; MX9603542A; EP0746618B1; JP3553958B2; EP0746618A1; US5976855A; FI963266A0; CA2183431A1; DE69527835D1; WO1995022615A1; CN1077598C; FI963266A; KR970701264A; JPH09509058A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Variante eines lipolytischen Ausgangsenzyms und Varianten, die durch das Verfahren hergestellt wurden. Weiterhin betrifft die Erfindung ein DNA-Konstrukt kodierend für eine Variante der Erfindung, einen Expressionsvektor und eine Wirtszelle, die das DNA-Konstrukt umfassen und ein Detergensadditiv oder eine Detergenszusammensetzung, die eine Variante umfassen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Schon mehrere Jahre lang sind lipolytische Enzyme als Detergensenzyme benutzt worden, d. h. um Lipid oder Fettflecken aus Kleidern und anderen Textilien zu entfernen.
Zum Beispiel wurden verschiedene mikrobielle Lipasen als Detergensenzyme vorgeschlagen. Beispiele für solche Lipasen schließen ein eine Humicola lanuginosa Lipase, z. B. beschrieben in EP 258 068 und EP 305 216, eine Rhizomucor miehei Lipase, z. B. wie beschrieben in EP 238 023, eine Carcdida Lipase, wie eine C. antarctica Lipase, z. B. die C. antarctica Lipase A oder B, beschrieben in EP 214 761, eine Pseudomonas Lipase wie eine P. alcaligenes und P. pseudoalcaligerces Lipase, z. B. wie beschrieben in EP 218 272, eine P. cepacia Lipase, z. B. wie beschrieben in EP 331 376, eine Bacillus Lipase, z. B. eine B. subtilis Lipase (Dartois et al., 1993), eine B. stearothermophilus Lipase (JP 64/744992) und eine B. pumilus Lipase (EP 91 00664).
Des weiteren ist eine Anzahl von klonierten Lipasen beschrieben worden, einschließlich der Penicillium camembertii Lipase, beschrieben von Yamaguchi, S. et al., 1991, die Geotricum candidum Lipase (Schimada, Y. et al., 1989), und verschiedene Rhizopus Lipasen wie eine R. delemar Lipase (Hass, M. J et al., 1991), eine R. niveus Lipase (Kugimiya, W., 1992), und eine R. oryzae Lipase.
Andere Arten von lipolytischen Enzymen, die als Detergensenzyme vorgeschlagen worden sind, schließen Cutinasen mit ein, z. B. von Pseudomonas mendocina stammend, wie beschrieben in WO 88/09367 oder eine Cutinase von Fusarium solani pisi stammend (z. B. beschrieben in WO 90/09446).
In den letzten Jahren wurden Versuche unternommen, um Lipasevarianten herzustellen, die verbesserte Eigenschaften für Detergenszwecke haben. Z. B. beschreibt WO 92/05249 Lipasevarianten mit verbesserten Eigenschaften, wobei bestimmte Charakteristika von Wildtyp-Lipaseenzymen durch spezifische, d. h. ortsspezifische Modifikationen ihrer Aminosäuresequenzen, verändert wurden. Genauer gesagt sind Lipasevarianten beschrieben, wobei ein oder mehrere Aminosäurereste der sogenannten Lipidkontaktzone der Ausgangslipase modifiziert worden ist.
PCT/DK93/00225 beschreibt Lipasevarianten mit verbesserten Eigenschaften, wobei ein Aminosäurerest, der eine kritische Position innerhalb der Lipase einnahm, modifiziert worden ist.
EP 407 225 beschreibt Lipasevarianten mit verbesserter Resistenz gegenüber proteolytischen Enzymen, die durch genau definierte Aminosäuremodifikationen hergestellt worden sind.
EP 260 105 beschreibt Hydrolasen, wobei ein Aminosäurerest innerhalb eines Bereiches von 15 Å vom akiven Zentrum substituiert worden ist.
Alle oben genannten Lipasevarianten wurden durch Verwendung von ortsspezifischer Mutagenese, die in der Modifikation von spezifischen Aminosäureresten resultierte, die aufgrund ihres Typs oder aufgrund ihrer Lage in der Sekundär- oder Tertiärstruktur der Ausgangslipase ausgewählt wurden, konstruiert.
Ein alternativer Ansatz zur Konstruktion von Mutanten oder Varianten eines vorgegebenen Proteins basierte auf Zufallsmutagenese. Zum Beispiel beschreiben US 4,898,331 und WO 93/01285 solche Techniken.
Es besteht Bedarf für neue lipolytische Enzyme mit verbesserten Wasch- und/oder Geschirrspüleigenschaften, und die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, solche Enzyme herzustellen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die jetzigen Erfinder haben jetzt eine neues Verfahren entwickelt, um Varianten von lipolytischen Enzymen mit verbesserten Wasch- und/oder Geschirrspüleigenschaften im Vergleich zu ihren Ausgangsenzymen herzustellen. Das Verfahren basiert auf Zufallsmutagenese oder lokalisierter Zufallsmutagenese von DNA- Sequenzen, die ein lipolytisches Enzym kodieren.
Genauer gesagt betrifft ein erster Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Variante eines lipolytischen Ausgangsenzyms, wobei das Verfahren umfasst
(a) Behandeln einer DNA-Sequenz kodierend für das lipolytische Ausgangsenzym mit Zufallsmutagenese,
(b) Exprimieren der mutierten DNA-Sequenz, erhalten in Schritt (a), in einer Wirtszelle, und
(c) Screening nach Wirtszellen, die ein mutiertes lipolytisches Enzym exprimieren, das eine verminderte Kalziumabhängigkeit und wahlweise eine verbesserte Toleranz gegenüber einem Detergens oder einer oder mehrerer Detergenskomponenten, im Vergleich zum lipolytischen Ausgangsenzym, hat.
Im vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff "lipolytisches Enzym" ein Enzym anzeigen, das eine lipidabbauende Fähigkeit aufweist, wie die Fähigkeit, ein Triglycerid oder ein Phospholipid abzubauen. Das lipolytische Enzym kann z. B. eine Lipase sein, eine Phospholipase, eine Esterase oder eine Cutinase.
Der Begriff "Zufallsmutagenese" soll in einer konventionellen Weise verstanden werden, d. h. die Einführung von einer oder mehreren Mutationen an zufälligen Positionen des Ausgangsenzyms anzeigen (d. h. im Gegensatz zu ortsspezifischer Mutagenese). Die zufälligen Mutationen werden typischerweise eingeführt, indem man eine große Anzahl an Kopien der DNA-Sequenz, die modifiziert werden soll, einem Mutagen aussetzt und dann auf die Gegenwart von Varianten screent. Geeignete Techniken zur Einführung von zufälligen Mutationen sind weiter unten detailliert diskutiert.
Die Kriterien für das Screening von Schritt (c) werden als von besonderem Nutzen angesehen, um Varianten von lipolytischen Ausgangsenzymen zu identifizieren, die verbesserte Wasch- und/oder Geschirrspüleigenschaften im Vergleich zu ihren Ausgangsenzymen haben.
Im vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff "verminderte Kalziumabhängigkeit" bedeuten, dass das mutierte lipolytische Enzym geringere Mengen Kalzium benötigt als das Ausgangsenzym, um dasselbe Maß an Aktivität zu zeigen, wenn unter ähnlichen Bedingungen getestet wird. Vorzugsweise ist das mutierte lipolytische Enzym der Erfindung im Wesentlichen unabhängig von der Gegenwart von Kalzium, um Enzymaktivität aufzuweisen.
Der Begriff "verbesserte Toleranz gegenüber einem Detergens oder einer Detergenskomponente" soll bedeuten, dass das mutierte lipolytische Enzym bei einer höheren Konzentration des Detergens oder der Detergenskomponente als das lipolytische Ausgangsenzym aktiv ist.
Im vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff "Detergens" eine Mischung von Detergensbestandteilen anzeigen, die normalerweise zum Waschen oder Geschirrspülen benutzt werden. Analog dazu soll eine "Detergenskomponente" eine Komponente oder einen Bestandteil anzeigen, der normalerweise in Detergens- oder Geschirrspülzusammensetzungen gefunden wird, wobei Beispiele dafür in der folgenden Beschreibung gegeben werden.
Die Variante, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wurde, soll so verstanden werden, dass sie zusätzlich zur verminderten Kalziumabhängigkeit und wahlweise zur verbesserten Toleranz gegenüber einem Detergens oder einer oder mehrerer Detergenskomponenten lipolytische Aktivität aufweist, vorzugsweise von einer vergleichbaren Größenordnung wie der des lipolytischen Ausgangsenzyms, oder sie übertreffend, wenn man unter Wasch- und/oder Geschirrspülbedingungen testet.
Die in Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens definierten Kriterien für das Screening können durch jedes geeignete, im Stand der Technik bekannte Verfahren bestimmt sein. Ein besonders geeigneter Assay, der für den vorliegenden Zweck entwickelt wurde, ist im Material- und Methodenteil weiter unten beschrieben.
Letzte Aspekte der Erfindung betreffen eine Variante eines lipolytischen Enzyms und die Verwendung dieser Variante als Detergensenzym, insbesondere zum Waschen oder Geschirrspülen und ein Detergensadditiv und eine Detergenszusammensetzung umfassend die Variante.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Klonierung einer DNA-Sequenz kodierend für ein lipolytisches Ausgangsenzym

Die DNA-Sequenz kodierend für ein lipolytisches Ausgangsenzym, das in Einklang mit der vorliegenden Erfindung einer Zufallsmutagenese unterzogen werden soll, kann von jeder Zelle oder jedem Mikroorganismus, der das infragekommende Ausgangsenzym produziert, durch Verwendung durch von dem Stand der Technik bekannten Verfahren isoliert werden. Z. B. kann die DNA-Sequenz isoliert werden, indem man eine cDNA oder eine genomische Library von einem Organismus, von dem man erwartet, dass er die Sequenz enthält, etabliert, und für positive Klone mit konventionellen Methoden screent. Beispiele für solche Methoden sind die Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden, die aufgrund der Aminosäuresequenz oder DNA-Sequenz des Ausgangsenzyms angefertigt wurden (wenn Sequenzinformation verfügbar ist) oder aufgrund eines verwandten lipolytischen Enzyms (falls Sequenzinformation für das Ausgangsenzym nicht verfügbar ist) in Übereinstimmung mit Standardtechniken (cf. Sambrook et al., 1989), und/oder die Selektion auf Klone, die lipolytische Aktivität exprimieren, wie eine Lipase und/oder die Selektion auf Klone, die ein Protein herstellen, das mit einem Antikörper reagiert, der gegen ein lipolytisches Ausgangsenzym gemacht wurde.
Eine bevorzugte Methode, um eine DNA-Sequenz aus einer cDNA oder genomischen Library zu isolieren, die für ein lipolytisches Ausgangsenzym kodiert, das erfindungsgemäß modifiziert werden soll, besteht in der Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit degenerierten Oligonukleotidsonden, die basierend auf der DNA- oder Aminosäuresequenz des Ausgangsenzyms hergestellt wurden. Z. B. kann die PCR durchgeführt werden unter Verwendung der Techniken, die im US-Patent No. 4,683,202 oder von R. K. Saiki et al. (1988) beschrieben sind.
Alternativ dazu kann die DNA-Sequenz, die für das Ausgangsenzym kodiert, synthetisch mit etablierten Standardmethoden hergestellt werden, z. B. mit der Phosphoramiditmethode, beschrieben von Beaucage and Caruthers (1981), oder der Methode beschrieben von Matthes et al. (1984). Gemäß der Phosphoamiditmethode werden Oligonukleotide synthetisiert, z. B. in einem automatischen DNA-Synthetisierer, gereinigt, aneinandergelagert, ligiert und kloniert in geeigneten Vektoren.
Schließlich kann die DNA-Sequenz, die für das Ausgangsenzym kodiert, aus DNA von gemischt genomischen und synthetischem, gemischt synthetischem und cDNA oder gemischt genomischem und cDNA Ursprung hergestellt werden, indem man Fragmente von synthetischem, genomischem oder cDNA Ursprung (soweit passend), wobei die Fragmente verschiedenen Teilen der gesamten DNA- Sequenz, die für das Ausgangsenzym kodiert, entsprechen, im Einklang mit Standardtechniken ligiert.

Zufallsmutagenese

Die Zufallsmutagenese der DNA-Sequenz, die für das lipolytische Ausgangsenzym kodiert, die entsprechend Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgeführt werden soll, kann praktischerweise ausgeführt werden unter Verwendung eines jeden im Stand der Technik bekannten Verfahrens.
Zum Beispiel kann die Zufallsmutagenese durchgeführt werden unter Verwendung eines geeigneten physikalischen oder chemischen mutagenisierenden Agens, durch Verwendung eines geeigneten Oligonukleotids oder indem man die DNA- Sequenz PCR-vermittelter Mutagenese unterzieht. Des weiteren kann die Zufallsmutagenese durchgeführt werden durch Verwendung einer jeden Kombination dieser mutagenisierenden Agenzien.
Das mutagenisierende Agens kann, z. B., eines sein, das Transitionen, Transversionen, Inversionen, Vertauschen, Deletionen und/oder Insertionen induziert.
Beispiele für ein physikalisches oder chemisches mutagenisierende Agens, das für den vorliegenden Zweck geeignet ist, schließen ultraviolette (UV-) Bestrahlung, Hydroxylamin, N-methyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidin (MNNG), O- Methylhydroxylamin, salpetrige Säure, Ethylmetansulfonat (EMS), Natriumbisulfit, Ameisensäure und Nukleotidanaloga mit ein.
Wenn derartige Agenzien verwendet werden, wird die Mutagenese typischerweise durchgeführt, indem man die DNA-Sequenz, die für das Ausgangsenzym, das mutagenisiert werden soll, kodiert, in Gegenwart des mutagenisierenden Agens der Wahl unter Bedingungen inkubiert, die für das Stattfinden der Mutagenese geeignet sind und auf mutierte DNA, die die gewünschten Eigenschaften hat, selektiert.
Wenn die Mutagenese unter Verwendung eines Oligonukleotids durchgeführt wird, kann während der Synthese des Oligonukleotids an den Positionen, die man verändert haben will, das Oligonukleotid mit den drei Nicht-Ausgangsnukleotiden durch Dotierung oder durch Zusatz verändert werden (may be doped or spiked). Die Veränderung durch Dotierung oder durch Zusatz (The doping or spiking) kann so vorgenommen werden, dass Codons für unerwünschte Aminosäuren vermieden werden. Das veränderte (doped or spiked) Oligonukleotid kann mit jeder veröffentlichten Technik unter Verwendung von z. B. PCR, LCR oder jeder DNA-Polymerase und Ligase in die DNA, die für das lipolytische Enzym kodiert, inkorporiert werden.
Wenn PCR-vermittelte Mutagenese verwendet wird, wird entweder ein chemisch behandeltes oder unbehandeltes Gen, das für ein lipolytisches Ausgangsenzym kodiert, einer PCR unter Bedingungen unterzogen, die den Fehleinbau von Nukleotiden erhöhen (Deshler 1992, Leung et al. 1989).
Ein Mutatorstamm von E. coli (Fowler et al. 1974), S. cereviciae oder jedem anderen mikrobiellen Organismus kann für die Zufallsmutagenese der DNA verwendet werden, die für das lipolytische Enzym kodiert, indem man z. B. ein Plasmid, das das Ausgangsenzym enthält, in einen Mutatorstamm transformiert, den Mutatorstamm mit dem Plasmid wachsen lässt und das mutierte Plasmid aus dem Mutatorstamm isoliert. Das mutierte Plasmid kann anschließend in den Expressionsorganismus transformiert werden.
Die zu mutagenisierende DNA-Sequenz kann praktischerweise in einer genomischen oder cDNA Library, die von einem Organismus hergestellt wurde, der das lipolytische Ausgangsenzym exprimiert, vorliegen. Alternativ kann die DNA- Sequenz auf einem geeigneten Vektor vorliegen, wie ein Plasmid oder ein Bakteriophage, das als solches mit dem mutagenisierenden Agens inkubiert oder auf andere Art diesem ausgesetzt werden kann. Die zu mutagenisierende DNA kann auch in einer Wirtszelle vorliegen, indem sie entweder in das Genom dieser Zelle integriert ist oder indem sie auf einem Vektor, den die Zelle einschließt, vorliegt. Schließlich kann die zu mutagenisierende DNA in isolierter Form sein. Es ist zu verstehen, dass die DNA-Sequenz, die der Zufallsmutagenese unterworfen werden soll, bevorzugt eine cDNA oder eine genomische DNA-Sequenz ist.
In einigen Fällen kann es praktisch sein, die mutierte DNA-Sequenz zu amplifizieren, bevor der Expressionsschritt (b) oder der Screeningschritt (c) durchgeführt wird. Eine derartige Amplifikation kann gemäß im Stand der Technik bekannten Methoden durchgeführt werden, wobei die zur Zeit bevorzugte Methode die PCR- vermittelte Amplifikation unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, die auf Basis der DNA oder Aminosäuresequenz des Ausgangsenzyms hergestellt wurden, ist.
Anschließend an die Inkubation mit dem mutagenisierenden Agens, oder der Exposition, wird die mutierte DNA exprimiert durch Kultivierung einer geeigneten Wirtszelle, die die DNA-Sequenz trägt, unter für die Expression geeigneten Bedingungen. Die zu diesem Zweck verwendete Wirtszelle kann eine sein, die mit der mutierten DNA-Sequenz transformiert ist, die wahlweise auf einem Vektor vorliegt, oder eine solche, die die DNA-Sequenz, die für das Ausgangsenzym kodiert, während der Mutagenesebehandlung trug. Beispiele für geeignete Wirtszellen werden weiter unten angegeben. Die mutierte DNA-Sequenz kann weiterhin eine DNA-Sequenz umfassen, die für Funktionen kodiert, die die Expression der mutierten DNA-Sequenz erlauben.
Es ist zu verstehen, dass die Kriterien für das Screening, das im Schritt (c) oben erwähnt ist, sorgfältig ausgewählt wurden. Darum, ohne auf irgendeine Theorie begrenzt zu sein, glaubt man, dass das Screening nach einer verminderten Kalziumabhängigkeit in Varianten resultiert, die insgesamt verbesserte Eigenschaften haben, insoweit dass die Kalziumabhängigkeit als limitierender Faktor für optimale Aktivität angesehen werden kann, insbesondere unter Bedingungen, wo nur geringe Mengen an freien Kalziumionen vorliegen. Im Zusammenhang mit Detergenslipasen werden normalerweise die benötigten freien Kalziumionen vom Waschwasser zur Verfügung gestellt, und darum hängt die lipolytische Aktivität vom Kalziumgehalt des Wassers ab.
Das Detergens oder die Detergenskomponente, dem gegenüber die Variante verbesserte Toleranz hat, kann von jeder beliebigen Art sein, z. B. wie weiter unten beschrieben. Vorzugsweise ist die Detergenskomponente ein nicht-ionisches, anionisches, kationisches, zwitterionisches oder amphoterisches Tensid. Beispiele für nicht-ionische Tenside schließen Alkoholethoxylat ein, Beispiele für anionische Tenside schließen LAS, Alkylsulfat, Alkoholethoxysulfat und andere dieser Art mit ein.
Insbesondere wird in Betracht gezogen, dass eine verbesserte Toleranz gegenüber einem nicht-ionischen Alkoholethoxylat-Tensid, wobei ein im Handel erhältliches Beispiel dafür Dobanol® ist, verbesserte Wascheigenschaften anzeigen könnte.
Das Screening von Schritt (c) wird praktischerweise durchgeführt durch Verwendung eines Filterassays basierend auf dem folgenden Prinzip:
Ein Mikroorganismus, der in der Lage ist, das mutierte lipolytische Enzym von Interesse zu exprimieren, wird auf einem geeigneten Medium inkubiert und unter Bedingungen, die für die Sekretion des Enzyms geeignet sind, wobei das Medium mit einem doppelten Filter ausgestattet ist, umfassend einen ersten proteinbindenden Filter und darauf einen zweiten Filter, der eine niedrige Fähigkeit zur Proteinbindung aufweist. Der Mikroorganismus befindet sich auf dem zweiten Filter. Im Anschluss an die Inkubation wird der erste Filter, der von den Mikroorganismen sekretierte Enzyme umfasst, vom zweiten Filter, der Mikroorganismen umfasst, abgetrennt. Der erste Filter wird einem Screening nach der erwünschten enzymatischen Aktivität unterzogen und die korrespondierenden mikrobiellen Kolonien, die auf dem zweiten Filter vorliegen, werden identifiziert.
Der für die Bindung der enzymatischen Aktivität verwendete Filter kann jeder beliebige proteinbindende Filter sein, z. B. Nylon oder Nitrocellulose. Der Top- Filter, der Kolonien des exprimierenden Organismus trägt, kann jeder Filter sein, der keine oder geringe Affinität zur Proteinbindung hat, z. B. Celluloseacetat oder DuraporeTM. Der Filter kann mit jeder der Bedingungen, die zum Screening verwendet werden, vorbehandelt sein, oder er kann während der Detektion der enzymatischen Aktivität behandelt werden.
Die enzymatische Aktivität kann durch einen Farbstoff, Fluoreszenz, Prezipitation, einen pH-Indikator, IR-Absorbation oder jede andere bekannte Technik zur Detektion von enzymatischer Aktivität detektiert werden.
Die detektierende Verbindung kann durch jedes immobilisierende Agens immobilisiert sein, z. B. Agarose, Agar, Gelatine, Polyacrylamid, Stärke, Filterpapier, Tuch; oder jede Kombination von immobilisierenden Agenzien.
Lipaseaktivität kann detektiert werden mit Brilliangrün, Rhodamin B oder Sudanschwarz in Kombination mit einem Lipid, z. B. Olivenöl oder Schmalz. Die Kriterien für das Screening, um Varianten von lipolytischen Ausgangsenzymen zu identifizieren, die verbesserte Wascheigenschaften haben, können z. B. EGTA, EDTA, nicht-ionische oder anionische Tenside, alkalischer pH oder jede Detergenszusammensetzung in Kombination mit einem der oben genannten Detektoren von enzymatischer Aktivität sein.
Es ist zu verstehen, dass die Kriterien für das Screening, die im erfindungsgemäßen Filterassay verwendet werden, so gewählt werden können, dass sie mit den erwünschten Eigenschaften oder Verwendungen des Enzyms, das gescreent werden soll, übereinstimmen. Z. B. kann es in einem Screening nach Lipasen mit besonderer Verwendung in der Papier- und Sägespanindustrie relevant sein, nach einer Säurelipase zu screenen, die eine erhöhte Temperaturstabilität hat. Dies kann durch Verwendung eines Puffers mit saurem pH (z. B. pH 4) und/oder Inkubation bei höherer Temperatur vor oder während dem Assay durchgeführt werden.
Die im Schritt (c) produzierten Wirtszellen können weiteren Runden von Mutagenese, wie oben definiert in den Schritten (a)-(c), unterzogen werden, praktischerweise indem man stringentere Kriterien für die Selektion verwendet als die bei einer vorherigen Mutagenesebehandlung verwendeten.
Die Wirtszellen, auf die in Schritt (c) selektioniert wurde, können direkt zur Herstellung der Variante des lipolytischen Enzyms verwendet werden. Alternativ dazu kann die DNA, die für die Variante kodiert, von der Wirtszelle isoliert werden und in eine andere geeignete Wirtszelle eingebracht werden, praktischerweise unter Verwendung des Verfahrens, das weiter unten im Abschnitt mit dem Titel "Expression einer erfindungsgemäßen Variante" beschrieben ist, wobei geeignete Wirtszellen auch aufgeführt sind.

Lokalisierte Zufallsmutagenese

Erfindungsgemäß kann die Zufallsmutagenese vorteilhaft auf einem Teil des fraglichen lipolytischen Ausgangsenzyms lokalisiert sein. Dies kann, z. B., vorteilhaft sein, wenn eine bestimmte Region des Enzyms als für eine bestimmte Eigenschaft des Enzyms von besonderer Bedeutung identifiziert worden ist, und von der man bei einer Modifikation erwartet, dass sie in einer Variante mit verbesserten Eigenschaften resultiert. Eine solche Region kann normalerweise identifiziert werden, wenn die Tertiärstruktur des Ausgangsenzyms aufgeklärt wurde und mit der Funktion des Enzyms in Bezug gebracht wurde.
Die lokalisierte Zufallsmutagenese wird praktischerweise unter Verwendung von PCR-vermittelten Mutagenesetechniken wie weiter oben beschrieben oder jeder anderen geeigneten, im Stand der Technik bekannten Technik durchgeführt werden.
Alternativ dazu kann die DNA-Sequenz, die für den Teil der DNA kodiert, der modifiziert werden soll, isoliert werden, z. B. indem man sie in einen geeigneten Vektor einsetzt, und dieser Teil kann anschließend einer Mutagenese unterzogen werden unter Verwendung von jeder beliebigen der oben beschriebenen Mutagenesemethoden.

Das lipolytische Ausgangsenzym

Das lipolytische Ausgangsenzym, das erfindungsgemäß modifiziert werden soll, kann jedes Enzym sein, das lipolytische Aktivität, wie weiter oben definiert, hat. Beispiele für lipolytische Enzyme schließen eine Lipase, eine Esterase, eine Cutinase und eine Phospholipase ein.
Vorzugsweise wird das lipolytische Ausgangsenzym modifiziert durch lokalisierte Zufallsmutagenese an einem Teil der DNA-Sequenz, der eine Lipidkontaktzone oder einen Teil davon kodiert.
Bei allen bislang kristallisierten Lipasen hat man gefunden, dass sie zumindest eine oberflächliche Schleifenstruktur (loop structure) umfassen (auch als ein Deckel oder eine Klappe bezeichnet), die das aktive Zentrum bedeckt, wenn die Lipase in ihrer inaktiven Form ist (ein Beispiel für eine solche Lipase ist in Bardy et al., 1990, beschrieben). Wenn die Lipase aktiviert ist, wird die Schleifenstruktur verschoben, um die Reste des aktive Zentrums zu exponieren, und eine hydrophobe Oberfläche, die das Serin des aktive Zentrums umgibt, wird erzeugt, die eine erhöhte Oberflächenhydrophobizität hat und die mit dem Lipidsubstrat bei oder während der Hydrolyse wechselwirkt. Diese Aktivierung wird "interfaciale Aktivierung" genannt und wird von Tilbeurgh et al. (1993) weiter diskutiert.
Für den vorliegenden Zweck wird die bei Aktivierung erschaffene Oberfläche als "Lipidkontaktzone" bezeichnet und soll Aminosäurereste einschließen, die innerhalb liegen oder Teil dieser Oberfläche bilden, wahlweise in der Form von Schleifenstrukturen. Diese Reste können an einer Wechselwirkung der Lipase mit dem Substrat bei oder während der Hydrolyse teilnehmen, wobei die Lipase Triglyceride der Lipidphase hydrolysiert, wenn sie durch Kontakt mit der Lipidoberfläche aktiviert ist.
Die Lipidkontaktzone enthält eine Bindungsgegend für das Lipidsubstrat, wobei das der Teil der Lipidkontaktzone ist, an den das einzelne Lipidsubstratmolekül vor der Hydrolyse bindet. Diese Bindungsgegend wiederum enthält eine Acylbindende hydrophobe Spalte und eine sogenannte Hydrolysetasche, die sich in der Gegend um das Serin des aktiven Zentrums herum befindet, und in der die Hydrolyse des Lipidsubstrats angeblich stattfinden soll. Bei allen heute bekannten Lipasen ist die Lipidkontaktzone leicht zu erkennen, z. B. aus einer dreidimensionalen Struktur der Lipase, die durch geeignete Computerprogramme erzeugt wird. Die Konformation einer inaktiven bzw. einer aktiven Lipase ist in den Fig. 1 und 2 von WO 92/05249 gezeigt.
Die Lipidkontaktzone der in der vorliegenden Anmeldung detailliert diskutierten Humicola lanuginosa Lipase ist durch die Aminosäurenreste 21-25, 36-38, 56-62, 81-98, 110-116, 144-147, 172-174, 199-213 und 248-269 definiert. Diese Reste sind auf Basis von Computer-Modellsimulationen der Wechselwirkung zwischen der Lipase und einem Lipidsubstrat identifiziert worden.
Die Lipidkontaktzone von anderen lipolytischen Enzymen wird bestimmt, indem man
a) den hydrophoben Vektor der molekularen 3-D Struktur berechnet,
b) einen Schnitt im rechten Winkel zu diesem Vektor durch das Cα-Atom des zweiten Aminosäurerests nach dem Serin des aktiven Zentrums in der linearen Sequenz macht, und
c) alle Reste mit zumindest einem Atom auf der Seite des Schnitts, zu der der Vektor zeigt, mit einschließt, und
d) von diesen Resten all diejenigen, die zumindest ein Atom innerhalb 5 Ångström von der Oberfläche des Proteins haben, wählt (im Fall einer Lipase in entweder ihrer offenen oder geschlossenen Form).
Der hydrophobe Vektor wird aus der Proteinstruktur berechnet, im Falle einer Lipase entweder der offenen oder geschlossenen Form, indem man alle Vektoren der Reste aufaddiert, und zwar für die Reste, die eine Oberflächenzugänglichkeit von zumindest 10% haben (Lee, B. and Richards, F. M. 1971. Mol. Biol. 55: 379- 400). Der Startpunkt des Vektors des Restes ist als das Cα-Atom des Restes definiert, und seine Richtung geht durch das Massenzentrum der Seitenkette. Die Magnitude eines jeden Vektors eines Restes ist definiert als die freie Energie des relativen Transfers des Restes.
Die Oberflächenzugänglichkeit eines jeden Restes wird unter Verwendung des Connollyprogramms berechnet.
Vorzugsweise wird die lokalisierte Zufallsmutagenese durchgeführt an einem Teil der DNA-Sequenz, der für eine Deckelregion und/oder eine hydrophobe Spalte der Ausgangslipase kodiert, oder einen Teil dieser Deckel-Region und/oder hydrophoben Bindungsspalte.
Das lipolytische Ausgangsenzym, das erfindungsgemäß modifiziert werden soll, kann jeden beliebigen Ursprung haben. Das bedeutet, dass das Enzym Säuger-, Pflanzen-, Wirbeltier- oder jeden anderen Ursprung haben kann. Allerdings ist es gegenwärtig bevorzugt, dass das Enzym von mikrobiellem Ursprung ist, insofern eine Anzahl von mikrobiellen Stämmen gefunden wurden, die Enzyme von besonderem Nutzen für Detergenszwecke produzieren.
Insbesondere kann die DNA-Sequenz des lipolytischen Ausgangsenzyms von einem Pilz erhältlich sein, d. h. einer Hefe oder einem filamentösen Pilz: z. B. kann die DNA-Sequenz eine solche sein, die von einem Stamm von Humicola sp., z. B. H. Lanuginosa erhältlich ist, von einem Stamm von Rhizomucor sp., z. B. Rh. miehei, von einem Stamm von Rhizopus sp., von einem Stamm von Candida sp., von einem Stamm von Fusarium sp., z. B. F. solani pisi, von einem Stamm von Venturia spp., z. B. V. inaequalis, von einem Stamm von Colletotrichum spp., z. B. C. gloeosporioides, oder C lagenarium, oder von einem Stamm von Penicillium spp., z. B. P. spinulosum oder P. camembertii.
Im vorliegenden Zusammenhang soll "erhältlich sein von" nicht nur ein Enzym, das von einem Stamm des fraglichen Organismus produziert wird, bedeuten, sondern auch ein Enzym kodiert von einer DNA-Sequenz, die von einem solchen Stamm isoliert wurde, und das in einem Wirtsorganismus produziert wurde, der mit besagter DNA-Sequenz transformiert wurde. Des weiteren soll der Begriff ein Enzym bedeuten, das von einer DNA-Sequenz synthetischen und/oder cDNA- Ursprungs kodiert ist, und das die die Identifizierung zulassenden Charakteristiken des fraglichen Enzyms hat.
Von besonderem Interesse als ein lipolytisches Ausgangsenzym ist eine Lipase erhältlich von einem Stamm von H. lanuginosa, z. B. den H. lanuginosa Stamm DSM 4109, einem Stamm von Rh. mucor, oder einem Stamm von C. antarctica.
Die Variante kann eine Variante der H. lanuginosa Lipase sein, die weiterhin umfasst die Addition von einer oder mehreren Aminosäureresten an entweder das N- oder das C-terminale Ende der Lipase, oder an beide, Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten an einer oder mehreren verschiedenen Stellen in der Aminosäuresequenz, Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten an einem oder an beiden Enden der Lipase oder an einer oder mehreren Stellen der Aminosäuresequenz, oder Insertion von einem oder mehreren Aminosäureresten an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz. Die Modifikation der DNA-Sequenz kann durch ortsspezifische oder durch Zufallsmutagenese oder durch eine Kombination dieser Techniken gemäß gut bekannter Verfahren erfolgen.
Das lipolytische Ausgangsenzym, das erfindungsgemäß modifiziert werden soll, kann von einem Bakterium erhältlich sein. Z. B. kann die DNA-Sequenz, die für das lipolytische Ausgangsenzym kodiert, erhältlich sein von einem Stamm von Pseudomonas spp., wie P. cepacia, P. alcaligenes, P. pseudoalcaligenes, P. mendocina (auch P. putida genannt), P. syringae, P. aeroginosa oder P. fragi, einem Stamm von Bacillus spp., z. B. B. subtilis oder B. pumilus oder einem Stamm von Streptomyces sp., z. B. S. scabies.
Das bakterielle lipolytische Ausgangsenzym kann eine Lipase sein, stammend von einer beliebigen der oben genannten Spezies, z. B. eine Pseudomonas-Lipase wie beschrieben in EP 218 272, EP 331 376 und EP 407 225, oder eine Cutinase, z. B. wie beschrieben in WO 88/09367.

Varianten der Erfindung

Um den Bezug zu erleichtern, werden verschiedene Varianten der Erfindung beschrieben unter Verwendung der folgenden Nomenklatur:
Original Aminosäure(n) : Position(en) : Substituierte Aminosäure(n)
Gemäß dieser Nomenklatur ist z. B. die Substitution von Aspartat durch Valin in Position 96 angegeben als:
Asp 96 Val oder D96V
Eine Deletion von Aspartat an derselben Position ist angegeben als:
Asp 96* oder D96*
und die Insertion eines zusätzlichen Aminosäurerests, wie Lysin, ist angegeben als:
Asp 96 ValLys oder D96VK
Multiple Mutationen sind mit Pluszeichen getrennt, d. h.:
Asp 96 Val + Glu 87 Lys oder D96V + E87K
repräsentieren Mutationen an den Positionen 96 und 87, die Aspartat und Glutamat mit Valin bzw. Lysin substituieren.
Wenn eine oder mehrere alternative Aminosäurereste an einer bestimmten Position inseriert werden können, so ist das angegeben als
D96V,N oder
D96V oder D96N
Des weiteren, wenn hier eine zur Modifikation geeignete Position angegeben wird, ohne dass irgendeine spezielle Modifikation vorgeschlagen ist, ist es zu verstehen, dass jeder beliebige Aminosäurerest den Aminosäurerest, der an dieser Position vorliegt, substituieren kann. Wenn also, z. B. eine Modifikation eines Aspartats an Position 96 erwähnt ist, aber nicht spezifiziert ist, so ist zu verstehen, dass das Aspartat deletiert sein kann, oder durch jede andere Aminosäure substituiert sein kann, d. h. jede beliebige ausgewählt aus R, N, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V, oder dass ein weiterer Aminosäurerest an dieser Position inseriert werden kann.
Vorzugsweise umfasst eine erfindungsgemäße Variante zumindest eine der folgenden Mutationen K46R, E57G, G61S, S83T, S58F, D62C, T64R, I90F, G91A, N92H, N94I, N94K, L97M, K98I, I100V, D102K, A121V, E129K, D167G, R205K, E210W, K237M, N259W, I252L, D254W, P256T, G263A, L264Q oder T267W.
Diese Positionen wurden als wichtig für die enzymatische Aktivität und/oder die Toleranz gegenüber Detergens gefunden, oder werden dafür gehalten. Die Nummerierung der Aminosäurereste bezieht sich auf die Aminosäuresequenz der reifen Lipase.
Vorzugsweise umfasst die nach diesem Aspekt erfindungsgemäße Variante zumindest eine der folgenden Mutationen S83T, N94K, A121V, D167G, R205K.
Es soll verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung Varianten der H. lanuginosa Ausgangslipase mit einschließt und Kombinationen von zwei oder mehr der hier definierten Mutationen, oder eine Kombination von einer oder mehr der hier definierten Mutationen mit jeder beliebiger Mutation offenbart in WO 92/05249, WO 94/25577 und WO 94/01541 umfasst.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Variante der H. lanuginosa Lipase erhältlich von DSM 4109, die zumindest eine der folgenden Mutationen umfasst:
N94K+D96A
S83T+N94K+D96N
E87K+D96V
E87K+G91A+D96A
N94K+F95L+D96H
F95C+D96N
E87K+G91A+D96R+I100V
E87K+G91A
S83T+E87K+Q249R
S83T+E87K+W89G+G91A+N94K+D96V
N73D+S85T+E87K+G91A+N94K+D94A
E87K+G91A+L93I+N94K+D96A
D167G+E210V
N73D+E87K+G91A+N94I+D96G
S83T+E87K+G91A+N92H+N94K+D96M
E56R+D57L+V60M+D62N+S83T+D96P+D102E
D57G+N94K+K96L+L97M
E87K+G91A+D96R+I100V+E129K+K237M+I252L+P256T+G263A+L264Q
E56R+D57G+S58F+D62C+T64R+E87G+G91A+F95L+D96P+K98I+K237M
D167G
N73D+E87K+G91A+N94I+D96G
N251W+D254W+T267W
S83T+E87K+G91A+N92H+N94K+D96M
D57G+N94K+D96L+L97M
Man hat gefunden, dass diese Varianten eine verminderte Kalziumwiderstandsfähigkeit und/oder eine verbesserte Toleranz gegenüber Detergenskomponenten, wie das nicht-ionische Tensid Alkoholethoxylat, aufweisen, und sie werden, dementsprechend, als von besonderem Nutzen für Detergens- oder Geschirrspülzwecke angesehen. Die Varianten wurden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugt und anschließend dahingehend charakterisiert, welche Mutationen eingefügt wurden, und sie sind zusätzlich in den weiter hinten folgenden Beispielen beschrieben. Es wird klar sein, dass ein alternatives Verfahren zur Konstruktion dieser Varianten auf ortsspezifischer Mutagenese basieren würde, unter Verwendung von geeigneten Oligonukleotidsonden. Diese Methode ist in den Beispielen 3 bis 6 beispielhaft gezeigt.

Expression einer erfindungsgemäßen Variante

Erfindungsgemäß kann eine mutierte DNA-Sequenz, die für eine Variante eines lipolytische Enzyms kodiert und die durch die oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, oder durch jedes alternative im Stand der Technik bekannte Verfahren, exprimiert werden, in enzymatischer Form, unter Verwendung eines Expressionsvektors, der typischerweise Kontrollsequenzen einschließt, die für einen Promotor, Operator, eine ribosomale Bindungsstelle, ein translationales Initiationssignal, und, wahlweise, ein Repressorgen oder verschiedene Aktivatorgene kodiert.
Der rekombinante Expressionsvektor, der die DNA-Sequenzen, die für die erfindungsgemäße Variante kodieren, trägt, kann jeder Vektor sein, der praktischerweise rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann, und die Wahl des Vektors wird oft von der Wirtszelle abhängen, in die er eingeführt werden soll. Darum kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor, d. h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, sein, z. B. ein Plasmid, ein Bakteriophage oder ein extrachromosomales Element, Minichromosom oder ein artifizielles Chromosom. Alternativ dazu kann der Vektor einer sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Genom der Wirtszelle integriert wird und zusammen mit dem Chromosom/den Chromosomen, in die er integriert hat, repliziert.
Im Vektor sollte die DNA-Sequenz operativ verbunden mit einer geeigneten Promotorsequenz sein. Der Promotor kann jede beliebige DNA-Sequenz sein, die transkriptionelle Aktivität in der gewählten Wirtszelle zeigt und kann von Genen stammen, die für Proteine kodieren, die entweder homolog oder heterolog zur Wirtszelle sind. Beispiele für geeignete Promotoren, um die Transkription der DNA-Sequenz, die für die erfindungsgemäße Variante kodiert, zu veranlassen, speziell in einem bakteriellen Wirt, sind der Promotor des Lac-Operon von E. coli, die Promotoren des Agarasegens dagA von Streptomyces coelicolor, die Promotoren des α-Amylasegens (amyL) von Bacillus licheniformis, z. B. wie beschrieben in WO 93/10249 die Promotoren des maltogenen Amylasegens (amyM) von Bacillus stearothermophilus, die Promotoren der α-Amylase (amyQ) von Bacillus amyloliquefaciens, die Promotoren der Gene xylA und xylB von Bacillus subtilis etc. Beispiele für nützliche Promotoren zur Transkription in einem Pilz als Wirt sind die, die vom Gen, das die TAKA-Amylase von A. oryzae kodiert, stammen, von der Aspart-Proteinase von Rhizomucor miehei, von der neutralen α- Amylase von A. niger, von der säurestabilen α-Amylase von A. niger, von der Glucoamylase von A. niger, von der Lipase von Rhizomucor miehei, von der alkalischen Protease von A. oryzae, von Triose-Phosphat-Isomerase von A. oryzae oder von der Acetamidase von A. nidulans.
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor kann auch einen geeigneten Transkriptionsterminator umfassen und, bei Eukaryoten, Sequenzen zur Polyadenylierung, die operabel mit der DNA-Sequenz, die eine erfindungsgemäße Variante kodiert, verbunden sind. Sequenzen für die Termination und Polyadenylierung können passenderweise von denselben Quellen stammen wie der Promotor.
Der Vektor kann weiterhin eine DNA-Sequenz umfassen, die den Vektor befähigt, in der fraglichen Wirtszelle zu replizieren. Beispiele für solche Sequenzen sind die origins of replication der Plasmide pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 und pIJ702.
Der Vektor kann auch einen Selektionsmarker umfassen, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle komplementiert, wie die dal-Gene aus B.subtilis oder B.licheniformis, oder ein Gen, das Antibiotikaresistenz verleiht, wie Ampicillin, Kanamycin, Chloramphenicol oder Tetracyclinresistenz. Desweiteren kann der Vektor Selektionsmarker von Aspergillus umfassen, wie amdS, argB, niaD und sC, ein Marker der Hygromycinresistenz bewirkt, oder die Selektion kann durch Co-Transformation erreicht werden, z. B. beschrieben in WO 91/17243.
Während intrazelluläre Expression in mancher Hinsicht von Vorteil sein kann, z. B. wenn bestimmte Bakterien als Wirtszellen verwendet werden, ist es generell bevorzugt, dass die Expression extrazellulär ist. Das lipolytische Ausgangsenzym kann selbst eine Präregion umfassen, die die Sekretion des exprimierten Enzyms in das Kulturmedium gestattet. Falls es wünschenswert ist, kann diese Präregion durch eine andere Präregion oder eine Signalsequenz ersetzt werden, was praktischerweise erreicht wird, indem man die DNA-Sequenzen, die für die entsprechenden Präregionen kodieren, substituiert.
Die Verfahren, die verwendet werden, um das erfindungsgemäße DNA-Kontrukt, das für eine Variante eines lipolytischen Ausgangsenzyms kodiert, den Promotor, den Terminator und andere Elemente miteinander zu ligieren und sie in geeignete Vektoren einzuführen, die die zur Replikation nötigen Informationen enthalten, sind dem Fachmann gut bekannt (cf., z. B., Sambrook et al. (1989)).
Die erfindungsgemäßen Zelle umfassend entweder ein DNA-Konstrukt oder einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor, wie oben definiert, wird vorteilshaft als Wirtszelle bei der rekombinanten Herstellung einer erfindungsgemäßen Variante eines lipolytischen Ausgangsenzyms verwendet. Die Zelle kann mit dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt, das für die Variante kodiert, transformiert werden, praktischerweise indem das DNA-Konstrukt in das Wirtschromosom integriert. Diese Integration wird generell als Vorteil angesehen, da die DNA-Sequenz wahrscheinlicher stabil in der Zelle behalten wird. Die Integration von DNA- Konstrukten in das Wirtschromosom kann nach konventionellen Verfahren durchgeführt werden, z. B. mit homologer oder heterologer Rekombination. Alternativ dazu kann die Zelle mit einem Expressionsvektor transformiert werden, wie weiter unten im Zusammenhang mit den verschiedenen Wirtszelltypen beschrieben.
Die erfindungsgemäße Zelle kann eine Zelle eines höheren Organismus, wie eines Säugetiers oder eines Insekts, sein, ist aber bevorzugt eine mikrobielle Zelle, z. B. eine bakterielle oder eine Pilzzelle (einschließlich Hefe).
Beispiele für geeignete Bakterien sind grampositive Bakterien wie Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, oder Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus oder gramnegative Bakterien wie E.coli. Die Transformation der Bakterien kann, z. B., durch Protoplastentransformation erreicht werden oder unter Verwendung von kompeten zellen in einer Art und Weise, die per se bekannt ist.
Der Hefeorganismus kann vorzugsweise aus einer Spezies von Saccharomyces oder Schizosaccharomyces ausgewählt sein, z. B. Saccharomyces cerevisiae. Der filamentöse Pilz kann vorteilhafterweise zu einer Spezies von Aspergillus gehören, z. B. Aspergillus oryzae, Aspergillus niger oder Aspergillus nidulans. Pilzzellen können durch ein Verfahren transformiert werden, das die Bildung von Protoplasten und die Transformation der Protoplasten, gefolgt von einer Regeneration der Zellwand, einschließt, in einer Art und Weise, die per se bekannt ist. Ein geeignetes Verfahren zur Transformation von Aspergilluswirtszellen ist in EP 238 023 beschrieben.
In noch einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Variante eines lipolytischen Ausgangsenzyms, wobei das Verfahren für das Kultivieren einer Wirtszelle wie oben beschrieben unter zur Produktion der Variante führenden Bedingungen sowie die Gewinnung der Variante aus den Zellen und/oder dem Kulturmedium umfasst.
Das für die Kultivierung der Zellen verwendete Medium kann jedes konventionelle Medium sein, das für das Wachstum der fraglichen Wirtszelle und für den Erhalt von Expression der erfindungsgemäßen Variante eines lipolytischen Ausgangsenzyms geeignet ist. Geeignete Medien sind aus kommerziellen Quellen verfügbar oder können gemäß veröffentlichten Rezepten (z. B. in Katalogen der "American Type Culture Collection") hergestellt werden.
Die von den Wirtszellen sekretierte erfindungsgemäße Variante kann praktischerweise aus dem Kulturmedium durch gut bekannte Verfahren gewonnen werden, einschließend das Abtrennen der Zellen vom Medium durch Zentrifugation oder Filtration, und die Precitipation von Proteinkomponenten des Mediums durch die Verwendung von Salz, wie Ammoniumsulfat, gefolgt von chromatographischen Verfahren, wie Ionenaustauscherchromatografie, Affinitätschromatografie oder ähnliche.

Detergensadditive und Zusammensetzung zum Geschirrspülen und Waschen

Wegen der verminderten Kalziumabhängigkeit der erfindungsgemäßen Variante und/oder ihrer verbesserten Toleranz gegenüber Detergens oder Detergenskomponenten, ist die Variante besonders gut geeignet für den Einsatz in einer Detergenszusammensetzung, z. B. Detergenszusammensetzungen, die im Einsatz im pH- Bereich von pH 7-13, besonders im Bereich von pH 8-11, beabsichtigt sind.

Detergenszusammensetzungen

Erfindungsgemäß kann eine erfindungsgemäße Lipasevariante typischerweise eine Komponente einer Detergenszusammensetzung sein. Als solche kann sie in der Detergenszusammensetzung eingeschlossen sein, in Form eines nicht- staubenden Granulats, einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms. Nicht-staubende Granulate können gemacht werden, wie z. B. beschrieben in US 4,106,991 und 4,661,452 (beide an Novo Industry A/S) und können wahlweise durch im Stand der Technik bekannte Verfahren beschichtet werden. Beispiele für wachsige Beschichtungsmaterialien sind Poly(ethylenoxyd)produkte (Polyethylenglycol, PEG) mit mittleren Molekulargewichten von 1000 bis 20000; ethoxylierte Nonylphenole, die von 16 bis 50 Ethylenoxideinheiten haben; ethoxylierte Fettalkohle, in denen der Alkohol zwischen 12 bis 20 Kohlenstoffatome enthält und in denen 15 bis 80 Ethylenoxideinheiten sind; Fettalkohle; Fettsäuren; und Mono-, Di- und Triglyceride von Fettsäuren. Beispiele für filmbildende Beschichtungsmaterialien, die für das Anbringen durch Flüssig-Bett- Techniken (fluid bed techniques) geeignet sind, sind im Patent GB 1483591 gegeben. Flüssige Enzympräparationen können, z. B., durch die Zugabe eines Polyols, wie Propylenglycol, einem Zucker oder Zuckeralkohol, Milchsäure oder Borsäure nach etablierten Verfahren stabilisiert werden. Andere Enzymstabilisatoren sind im Stand der Technik gut bekannt. Geschützte Enzyme können nach dem in EP 238, 216 offenbarten Verfahren hergestellt werden.
Die erfindungsgemäße Detergenszusammensetzung kann in jeder geeigneten Form sein, z. B. als Puder, Granulatkörner, Paste oder Flüssigkeit. Ein flüssiges Detergens kann wässrig, typischerweise bis zu 70% Wasser und 0-30% organisches Lösungsmittel enthaltend, oder nichtwässrig sein.
Die Detergenszusammensetzung umfasst ein oder mehrere Tenside, wobei jedes einzelne davon anionisch, nicht-ionisch, kationisch oder zwitterionisch sein kann. Das Detergens wird üblicherweise 0-50% eines anionischen Tensides enthalten, wie lineares Alkylbenzolsulfonat (LAS), Alphaolefinsulfonat (AOS), Alkylsulfat (Fettalkoholsulfat) (AS), Alkoholethoxysulfat (AEOS oder AES), sekundäre Alkansulfonate (SAS), Alpha-Sulfo-Fettsäure-Methylester, Alkyl- oder Alkenylbernsteinsäure, oder Seife. Es kann auch 0-40% an nichtionischem Tensid enthalten, wie Alkoholetoxylat (AEO oder AE), karboxyliertes Alkoholethoxylat, Nonylphenolethoxylat, Alkylpolyglycosid, Alkyldimethylaminoxid, ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid, Fettsäuremonoethanolamid oder Polyhydroxyalkylfettsäureamid (z. B. wie beschrieben in WO 92/06154).
Die Detergenszusammensetzung kann zusätzlich ein oder mehrere andere Enzyme umfassen, wie eine Amylase, eine Pullulanase, eine Cutinase, eine Protease, eine Cellulase, eine Peroxidase, eine Oxidase, (z. B. Laccase) und/oder eine andere Lipase.
Das Detergens kann 1-65% eines Detergensbuilders oder von Komplexbildnern, wie Zeolit, Diphosphat, Triphosphat, Phosphonat, Citrat, Nitrilotriessigsäure (NTA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTMPA), Alkyl- oder Alkenylbernsteinsäure, lösliche oder geschichtete Silikate (z. B. SKS-6 von Hoechst) enthalten. Das Detergens kann auch unaufgebaut (unbuilt) sein, d. h. im Wesentlichen frei von Detergensbilder.
Das Detergens kann ein oder mehrere Polymere umfassen. Beispiele sind Carboxymethylcellulose (CMC), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Polyethylenglycol (PEG), Poly(vinylalkohol) (PVA), Polycarboxylate, wie Polyacrylate, Maleinsäure/Acrylsäurecopolymere und Laurylmethacrylat/Acrylsäurecopolymere.
Das Detergens kann ein Bleichsystem enthalten, welches eine H&sub2;O&sub2;-Quelle umfassen kann, wie Perborat oder Percarbonat, das kombiniert werden kann mit einem Bleichaktivator, der Persäure bildet, wie Tetraacetyldiamin (TAED) oder Nonanoyloxybenzolsulfonat (NOBS). Alternativ dazu kann das Bleichsystem Peroxysäuren umfassen, z. B., vom Amid, Imid oder Sulfontyp.
Die Enzyme der erfindungsgemäßen Waschmittelzusammensetzung können unter Verwendung von konventionellen Stabilisierungsmitteln stabilisiert sein, z. B. ein Polyol, wie Propylenglycol oder Glycerin, ein Zucker oder Zuckeralkohol, Milchsäure, Borsäure oder ein Borsäurederivat, wie, z. B., ein aromatischer Borsäureesther, und die Zusammensetzung kann formuliert werden wie beschrieben in, z. B. WO 92/19709 und WO 92/19708.
Das Detergens kann auch andere konventionelle Detergensinhaltsstoffe enthalten, wie, z. B., Faserkonditionierer einschließlich Lehme, Schaumförderer, Seifenschaumunterdrücker (suds suppressors), Anti-Korrosionsmittel, Schmutzlöser, Mittel, die die Schmutzablagerung verhindern (anti-soil-redeposition agents), Farbstoffe, Bakterizide, optische Aufheller oder Parfums.
Der pH (gemessen in wässriger Lösung bei Gebrauchskonzentration) wird üblicherweise neutral oder alkalisch sein, z. B. im Bereich von 7-11.
Besondere Arte der Detergenszusammensetzung, die im Bereich der Erfindung sind, schließen ein:

(1) Eine Detergenszusammensetzung, als Granulat formuliert, mit einer Schüttdichte von zumindest 600 g/l umfassend

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 7-12%
Alkoholethoxysulfat (z. B. C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; Alkohol, 1-2 EO) oder Alkylsulfat (z. B. C&sub1;&sub6;&submin;&sub1;&sub8;) 1-4%
Alkoholethoxylat (z. B. C&sub1;&sub4;&submin;&sub1;&sub5; Alkohol, 7 EO) 5-9%
Natriumkarbonat (als Na&sub2;CO&sub3;) 14-20%
lösliche Silikate (als Na&sub2;O, 2SiO&sub2;) 2-6%
Zeolit (als NaAlSiO&sub4;) 15-22%
Natriumsulfat (als Na&sub2;SO&sub4;) 0-6%
Natriumcitrat/Zitronensäure (als C&sub6;H&sub5;Na&sub3;O&sub7;/C&sub6;H&sub8;O&sub7;) 0-15%
Natriumperborat (als NaBO&sub3;.H&sub2;O) 11-18%
TAED 2-6%
Carboxymethylcellulose 0-2%
Polymere (z. B. Maleinsäure/Acrylsäure Copolymer, PVP, PEG) 0-3%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein) 0,0001-0,1%
Nebenbestandteile (z. B. Seifenschaumunterdrücker (suds suppressors), Parfüm, optische Aufheller, Fotobleiche) 0-5%

(2) Eine Detergenszusammensetzung, als Granulat formuliert, mit einer Schüttdichte von zumindest 600 g/l enthaltend

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 6-11%
Alkoholethoxysulfat (z. B. C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; Alkohol, 1-2 EO) oder Alkylsulfat (z. B. C&sub1;&sub6;&submin;&sub1;&sub8;) 1-3%
Alkoholethoxylat (z. B. C&sub1;&sub4;&submin;&sub1;&sub5; Alkohol, 7 EO) 5-9%
Natriumkarbonat (als Na&sub2;CO&sub3;) 15-21%
lösliche Silikate (als Na&sub2;O, 2SiO&sub2;) 1-4%
Zeolit (als NaAlSiO&sub4;) 24-34%
Natriumsulfat (als Na&sub2;SO&sub4;) 4-10%
Natriumcitrat/Zitronensäure (als C&sub6;H&sub5;Na&sub3;O&sub7;/C&sub6;H&sub8;O&sub7;) 0-15%
Carboxymethylcellulose 0-2%
Polymere (z. B. Maleinsäure/Acrylsäure Copolymer, PVP, PEG) 1-6%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein) 0,0001-0,1%
Nebenbestandteile (z. B. Seifenschaumunterdrücker (suds suppressors), Parfüm) 0-5%

(3) Eine Detergenszusammensetzung, als Granulat formuliert, mit einer Schüttdichte von zumindest 600 g/l enthaltend

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 5-9%
Alkoholethoxylat (z. B. C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub5; Alkohol, 7 EO) 7-14%
Seife als Fettsäure (z. B. C&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub2; Fettsäure) 1-3%
Natriumkarbonat (als Na&sub2;CO&sub3;) 10-17%
lösliche Silikate (als Na&sub2;O, 2SiO&sub2;) 3-9%
Zeolit (als NaAlSiO&sub4;) 23-33%
Natriumsulfat (als Na&sub2;SO&sub4;) 0-4%
Natriumperborat (als NaBO&sub3;·H&sub2;O) 8-16%
TAED 2-8%
Phosphonat (z. B. EDTMPA) 0-1%
Carboxymethylcellulose 0-2%
Polymere (z. B. Maleinsäure/Acrylsäure Copolymer, PVP, PEG) 0-3%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein) 0,0001-0,1%
Nebenbestandteile (z. B. Seifenschaumunterdrücker (suds suppressors), Parfüm, optische Aufheller) 0-5%

(4) Eine Detergenszusammensetzung, als Granulat formuliert, mit einer Schüttdichte von zumindest 600 g/l enthaltend

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 8-12%
Alkoholethoxylat (z. B. C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub5; Alkohol, 7 EO) 10-25%
Natriumkarbonat (als Na&sub2;CO&sub3;) 14-22%
lösliche Silikate (als Na&sub2;O, 2SiO&sub2;) 1-5%
Zeolit (als NaAlSiO&sub4;) 25-35%
Natriumsulfat (als Na&sub2;SO&sub4;) 0-10%
Carboxymethylcellulose 0-2%
Polymere (z. B. Maleinsäure/Acrylsäure Copolymer, PVP, PEG) 1-3%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein) 0,0001-0,1%
Nebenbestandteile (z. B. Seifenschaumunterdrücker (suds suppressors), Parfüm) 0-5%

(5) Eine wässrige, flüssige Detergenszusammensetzung umfassend

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 15-21%
Alkoholethoxylat (z. B. C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub5; Alkohol, 7 EO oder C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub5; Alkohol, 5 EO) 12-18%
Seife als Fettsäure (z. B. Ölsäure) 3-13%
Alkenylbernsteinsäure (C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub4;) 0-13%
Aminoethanol 8-18%
Zitronensäure 2-8%
Phosphonat 0-3%
Polymere (z. B. PVP, PEG) 0-3%
Borat (als B&sub4;O&sub7;) 0-2%
Ethanol 0-3%
Propylenglycol 8-14%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein) 0,0001-0,1%
Nebenbestandteile (z. B. Dispergentien, Seifenschaumunterdrücker (suds suppressors), Parfüm, optische Aufheller) 0-5%

(6) Eine wässrige, strukturierte, flüssige Detergenszusammensetzung enthaltend

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 15-21%
Alkoholethoxylat (z. B. C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub5; Alkohol, 7 EO oder C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub5; Alkohol, 5 EO) 3-9%
Seife als Fettsäure (z. B. Ölsäure) 3-10%
Zeolit (als NaAlSiO&sub4;) 14-22%
Kaliumcitrat 9-18%
Borat (als B&sub4;O&sub7;) 0-2%
Carboxymethylcellulose 0-2%
Polymere (z. B. PEG, PVP) 0-3%
Ankerpolymere, wie z. B. Laurylmethacrylat/Acrylsäurecopolymer; molares Verhältnis 25 : 1; MW 3800 0-3%
Glyzerin 0-5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein) 0,0001-0,1%
Nebenbestandteile (z. B. Dispergenzien, Seifenschaumunterdrücker (suds suppressors), Parfüm, optische Aufheller) 0-5%

(7) Eine Detergenszusammensetzung, als Granulat formuliert, mit einer Schüttdichte von zumindest 600 g/l umfassend

Fettalkoholsulfat 5-10%
Ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid 3-9%
Seife als Fettsäure 0-3%
Natriumkarbonat (als Na&sub2;CO&sub3;) 5-10%
lösliche Silikate (als Na&sub2;O, 2SiO&sub2;) 1-4%
Zeolit (als NaAlSiO&sub4;) 20-40%
Natriumsulfat (als Na&sub2;SO&sub4;) 2-8%
Natriumperborat (als NaBO&sub3;·H&sub2;O) 12-18%
TAED 2-7%
Polymere (z. B. Maleinsäure/Acrylsäure Copolymer, PVP, PEG) 1-5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein) 0,0001-0,1%
Nebenbestandteile (z. B. optische Aufheller, Seifenschaumunterdrücker (suds suppressors), Parfüm) 0-5%

(8) Eine Detergenszusammensetzung, als Granulat formuliert, umfassend

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 8-14%
Ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid 5-11%
Seife als Fettsäure 0-3%
Natriumkarbonat (als Na&sub2;CO&sub3;) 4-10%
Lösliche Silikate (als Na&sub2;O, 2SiO&sub2;) 1-4%
Zeolit (als NaAlSiO&sub4;) 30-50%
Natriumsulfat (als Na&sub2;SO&sub4;) 3-11%
Natriumcitrat (als C&sub6;H&sub5;Na&sub3;O&sub7;) 5-12%
Polymere (z. B. PVP, Maleinsäure/Acrylsäure Copolymer, PEG) 1-5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein) 0,0001-0,1%
Nebenbestandteile (z. B. Seifenschaumunterdrücker (suds suppressors), Parfüm) 0-5%

(9) Eine Detergenszusammensetzung, als Granulat formuliert, umfassend

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 6-12%
nicht-ionisches Tensid 1-4%
Seife als Fettsäure 2-6%
Natriumkarbonat (als Na&sub2;CO&sub3;) 14-22%
Zeolit (als NaAlSiO&sub4;) 18-32%
Natriumsulfat (als Na&sub2;SO&sub4;) 5-20%
Natriumcitrat (als C&sub6;H&sub5;Na&sub3;O&sub7;) 3-8%
Natriumperborat (als NaBO&sub3;·H&sub2;O) 4-9%
Bleichaktivator (z. B. NOBS oder TAED) 1-5%
Carboxymethylcellulose 0-2%
Polymere (z. B. Polycarboxylate oder PEG) 1-5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein) 0,0001-0,1%
Nebenbestandteile (z. B. optische Aufheller, Parfüm) 0-5%

(10) Eine wässrige, flüssige Detergenszusammensetzung umfassend

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 15-23%
Alkoholethoxysulfat (z. B. C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub5; Alkohol, 2-3 EO 8-15%
Alkoholethoxylat (z. B. C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub5; Alkohol, 7 EO oder C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub5; Alkohol, 5 EO) 3-9%
Seife als Fettsäure (z. B. Laurylsäure) 0-3%
Aminoethanol 1-5%
Natriumcitrat 5-10%
Hydrotrop (z. B. Natriumtoluolsulfonat) 2-6%
Borat (als B&sub4;O&sub7;) 0-2%
Carboxymethylcellulose 0-1%
Ethanol 1-3%
Propylenglycol 2-5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein) 0,0001-0,1%
Nebenbestandteile (z. B. Polymere, Dispergentien, Parfüm, optische Aufheller) 0-5%

(11) Eine wässrige, flüssige Detergenszusammensetzung umfassend

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure) 20-32%
Alkoholethoxylat (z. B. C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub5; Alkohol, 7 EO oder C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub5; Alkohol, 5 EO) 6-12%
Aminoethanol 2-6%
Zitronensäure 8-14%
Borat (als B&sub4;O&sub7;) 1-3%
Polymere (z. B. Maleinsäure/Acrylsäure Copolymer, Ankerpolymer, wie, z. B., Laurylmethacrylate/Acrylsäurecopolymer) 0-3%
Glyzerin 3-8%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein) 0,0001-0,1%
Nebenbestandteile (z. B. Hydrotrope, Dispergentien, Parfüm, optische Aufheller) 0-5%

(12) Eine Detergenszusammensetzung, als Granulat formuliert, mit einer Schüttdichte von zumindest 600 g/l umfassend

Anionische Tenside (lineares Alkylbenzolsulfonat, Alkylsulfat, Alpha-Olefinsulfonat, Alphasulfofettsäuremethylesther, Alkansulfonate, Seife) 25-40%
Nichtionische Tenside (z. B. Alkoholethoxylat) 1-10%
Natriumkarbonat (als Na&sub2;CO&sub3;) 8-25%
lösliche Silikate (als Na&sub2;O, 2SiO&sub2;) 5-15%
Natriumsulfat (als Na&sub2;SO&sub4;) 0-5%
Zeolit (als NaAlSiO&sub4;) 15-28%
Natriumperborat (als NaBO&sub3;·4H&sub2;O) 0-20%
Bleichaktivator (TAED oder NOBS) 0-5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein) 0,0001-0,1%
Nebenbestandteile (z. B. Parfüm, optische Aufheller) 0-3%
(13) Detergensformulierungen wie beschrieben in 1)-12), wobei das gesamte oder ein Teil des linearen Alkylbenzolsulfonats durch (C&sub1;&sub2;-C&sub1;&sub8;) Alkylsulfat ersetzt ist.

(14) Eine Detergenszusammensetzung, als Granulat formuliert, mit einer Schüttdichte von zumindest 600 g/l umfassend

(C&sub1;&sub2;-C&sub1;&sub8;) Alkylsulfat 9-15%
Alkoholethoxylat 3-6%
Polyhydroxyalkylfettsäureamid 1-5%
Zeolit (als NaAlSiO&sub4;) 10-20%
Geschichtete Disilicate (z. B. SK56 von Hoechst) 10-20%
Natriumcarbonat (als Na&sub2;CO&sub3;) 3-12%
Lösliches Silikat (als Na&sub2;O, 2SiO&sub2;) 0-6%
Natriumcitrat 4-8%
Natriumpercarbonat 13-22%
TAED 3-8%
Polymere (z. B. Polycarboxylate und PVP) 0-5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein) 0,0001-0,1%
Nebenbestandteile (z. B. optische Aufheller, Fotobleiche, Parfüm, Seifenschaumunterdrücker (suds suppressors)) 0-5%

(15) Eine Detergenszusammensetzung, als Granulat formuliert, mit einer Schüttdichte von zumindest 600 g/l umfassend

(C&sub1;&sub2;-C&sub1;&sub8;) Alkylsulfat 4-8%
Alkoholethoxylat 11-15%
Seife 1-4%
Zeolit MAP oder Zeolit A 35-45%
Natriumcarbonat (als Na&sub2;CO&sub3;) 2-8%
Lösliches Silikat (als Na&sub2;O, 2SiO&sub2;) 0-4%
Natriumpercarbonat 13-22%
TAED 1-8%
Carboxymethylcellulose 0-3%
Polymere (z. B. Polycarboxylate und PVP) 0-3%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein) 0,0001-0,1%
Nebenbestandteile (z. B. optische Aufheller, Phosphonat, Parfüm) 0-3%
(16) Detergensformulierungen wie beschrieben in 1)-15), die eine stabilisierte oder eingekapselte Persäure enthalten, entweder als zusätzliche Komponente oder als Ersatz für bereits spezifizierte Bleichsysteme.
(17) Detergenszusammensetzung wie beschrieben in 1), 3), 7), 9) und 12), wobei Perborat durch Percarbonat ersetzt ist.
(18) Detergenszusammensetzung wie beschrieben in 1), 3), 7), 9), 12), 14) und 15), die zusätzlich einen Mangankatalysator enthalten. Der Mangankatalysator kann, z. B., eine der Verbindungen sein, die beschrieben sind in "Efficient manganese catalysts for low-temperatur bleaching", Nature 369, 1994, pp. 637-639.
(19) Detergenszusammensetzung, als nicht-wässrige Detergensflüssigkeit formuliert, umfassend ein flüssiges, nicht-ionisches Tensid, wie, z. B., linearen alkoxylierten primären Alkohol, ein Builder System (z. B. Phosphat), Enzym und Alkali. Das Detergens kann auch anionische Tenside und/oder ein Bleichsystem umfassen.
Eine erfindungsgemäße Lipasevariante kann in Konzentrationen eingeschlossen sein, wie sie üblicherweise in Detergenzien verwendet werden. Gegenwärtig ist beabsichtigt, dass in einer erfindungsgemäßen Detergenszusammensetzung eine erfindungsgemäße Lipasevariante in einer Menge zugegeben werden kann, die 0,00001-1 mg (berechnet als reines Enzymprotein) der Lipasevariante pro Liter Waschflüssigkeit entspricht.

Geschirrspülzusammensetzung

Die GeschirrspülDetergenszusammensetzung umfasst ein Tensid, das anionisch, nicht-ionisch, kationisch, amphoterisch oder eine Mischung dieser Typen sein kann. Das Detergens wird 0-90% an nicht-ionischen Tensiden enthalten, wie wenig- bis nicht-schaumende, etoxylierte, propoxylierte geradkettige Alkohole.
Die Detergenszusammensetzung kann Detergensbildersalze von anorganischem und/oder organischem Typus enthalten. Die Detergensbilder können unterteilt werden in Phosphor-enthaltende und nicht-Phosphor-enthaltende Typen. Die Detergenszusammensetzung enthält gewöhnlich 1-90% an Detergensbildern.
Beispiele für Phosphor-enthaltende, anorganische, alkalische Detergensbilder, wenn vorhanden, schließen die wasserlöslichen Salze mit ein, besonders Alkalimetall-Pyrophosphate, Orthophosphate, Polyphosphate und Phosphonate. Beispiele für nicht-phosphor-enthaltende anorganische Bilder, wenn vorhanden, schließen wasserlösliche Alkalimetallcarbonate, Borate und Silikate mit ein, sowie die verschiedenen Arten von wasserunlöslichen, kristallinen oder amorphen Aluminiumsilikate, von denen Zeolite die am besten bekannten Vertreter sind.
Beispiele von geeigneten organischen Buildern schließen Alkalimetall, Ammonium und substituiertes Ammonium, Citrate, Succinate, Malonate, Fettsäuresulfonate, Carboxymetoxysuccinate, Ammoniumpolyacetate, Carboxylate, Polycarboxylate, Aminopolycarboxylate, Polyacetylcarboxylate und Polyhydroxysulphonate mit ein.
Andere geeignete organische Builder schließen die Polymere und Copolymere mit hohem Molekulargewicht mit ein, deren Bildereigenschaften bekannt sind, z. B. geeignete Polyacrylsäure, Polymaleinsäure und Polyacrylsäure/Polymaleinsäurecopolymere und ihre Salze.
Die Geschirrspüldetergenszusammensetzung kann Bleichmittel des Chlor/Bromtyps oder des Sauerstofftyps enthalten. Beispiele von anorganischen Bleichmitteln des Chlor/Bromtyps sind Lithium-, Natrium- oder Calciumhypochlorit und Hypobromit sowie chloriniertes Trinatriumphosphat. Beispiele für organische Bleichmittel des Chlor/Bromtyps sind heterozyklische N-brom und Nchlorimide, wie Trichloroisocyanursäure, Tribromisocyanursäure, Dibromisocyanursäure und Dichlorisocyanursäure, und deren Salze mit, die Wasserlöslichkeit sicherstellenden, Kationen wie Kalium und Natrium. Hydantoinverbindungen sind auch geeignet.
Die Sauerstoffbleichen sind bevorzugt, z. B. in Form eines anorganischen Persalzes, bevorzugt mit einem Bleichmittelvorläufer oder als Peroxysäureverbindung. Typische Beispiele für geeignete Verbindungen als Peroxybleichen sind Alkalimetallperborate, sowohl Tetrahydrate als auch Monohydrate, Alkalimetallperkarbonate, Persilikate und Perphosphate. Bevorzugte Aktivatormittel sind TAED und Glycerintriacetate.
Die erfindungsgemäße Geschirrspüldetergenszusammensetzung kann unter Verwendung von konventionellen Stabilisatoren für das Enzym/die Enzyme, z. B. ein Polyol, wie z. B. Propylenglycol, ein Zucker oder ein Zuckeralkohol, Milchsäure, Borsäure oder ein Borsäurederivat, z. B. ein aromatischer Boratester stabilisiert werden.
Die Geschirrspüldetergenszusammensetzung kann auch andere Enzyme umfassen, insbesondere eine Amylase, eine Protease und/oder eine Cellulase.
Die erfindungsgemäße Geschirrspüldetergenszusammensetzung kann auch andere konventionelle Detergensinhaltsstoffe enthalten, z. B. Entflockungsmittel, Füllmaterial, Schaumunterdrücker, Antikorrosionsmittel, schmutzlösende Mittel, Komplexbildner, Mittel, die die Schmutzablagerung verhindern (anti-soilredeposition agents), dehydratisierende Mittel, Farbstoffe, Bakterizide, Leuchtkraftverstärker (fluorescers), Verdickungsmittel und Parfums.
Schließlich kann die erfindungsgemäße Variante in konventionellen Geschirrspüldetergenzien verwendet werden, z. B. jede der Detergenzien, die in einem der folgenden Patentpublikationen beschrieben ist:
EP 551670, EP 533239, WO 9303129, EP 507404, US 5141664, GB 2247025, EP 414285, GB 2234980, EP 408278, GB 2228945, GB 2228944, EP 387063, EP 385521, EP 373851, EP 364260, EP 349314, EP 331370, EP 318279, EP 318204, GB 2204319, EP 266904, US 5213706, EP 530870, CA 2006687, EP 481547, EP 337760, WO 93/14183, US 5223179, WO 93/06202, WO 93/05132, WO 92/19707, WO 92/09680, WO 92/08777, WO 92/06161, WO 92/06157, WO 92/06156, WO 91/13959, EP 399752, US 4941988, US 4908148.
Des weiteren können die erfindungsgemäßen Lipasevarianten in Weichermacherzusammensetzungen verwendet werden:
Die Lipasevariante kann in Weichspülern verwendet werden, z. B. wie beschrieben in "Surfactant and Consumer Products", Ed. von J. Falbe, 1987, pp 295-296;
"Tenside Surfactants Detergents", 30 (1993), 6, pp 394-399; JAOCS, Vol. 61 (1984), 2, pp 367-376; EP 517 762; EP 123 400; WO 92/19714; WO 93/19147; US 5,082,578; EP 494 769; EP 544 493; EP 543 562; US 5,235,082; EP 568 297; EP 570 237.
Die Erfindung ist in den begleitenden Zeichnungen weiter beschrieben, wobei
Fig. 1 eine Restriktionskarte von pYESHL ist,
Fig. 2 eine Restriktionskarte des Plasmids pAO1 ist,
Fig. 3 eine Restriktionskarte des Plasmids pAHL ist, und
Fig. 4 und 5 die Konstruktion von Genen, die für erfindungsgemäße Varianten kodieren.
Die Erfindung ist weiter in den folgenden Beispielen beschrieben, die in keiner Weise dazu gedacht sind, den beanspruchten Bereich der Erfindung zu limitieren.

MATERIAL UND METHODEN

Humicola lanuginosa DSM 4109 erhältlich von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg 1b, D-3300 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland.
pYESHL ist ein Hefe/E. coli Shuttlevektor, der eine geringe Menge der H. lanuginosa Lipase in Hefe exprimiert und sekretiert. Genauer gesagt ist pYESHL ein Derivat von PYES2 (bezogen von Invitrogen Corp., UK), wobei der GAL1- Promotor ausgeschnitten wurde und das Humicola lanuginosa Lipasegen und TPI (Triosephosphatisomerase)-Promotor aus S. cerevisiae (Alber, T und Kawasaki, G., J. Mol. Appl. Genet 1, 419-434 (1982)) zwischen die SphI und XbaI Stellen kloniert wurden. Eine Restriktionskarte von pYESHL ist in Fig. 1 gezeigt.

Filterassay mit niedrigem Calcium

Verfahren

1) Stelle SC Ura Replikaplatten (geeignet, um auf Stämme, die den erfindungsgemäßen Expressionsvektor tragen, zu selektionieren) mit einem ersten, proteinbindenden Filter (Nylonmembran) und darauf einen zweiten Filter, der wenig Protein bindet (Celluloseacetat) zur Verfügung.
2) Verteile Hefezellen, die ein Gen für eine Ausgangslipase oder ein mutiertes Lipasegen enthalten, auf dem Doppelfilter und inkubiere 2 oder 3 Tage bei 30º Celsius.
3) Behalte die Kolonien auf dem oberen Filter, indem der obere Filter auf eine neue Platte transferiert wird.
4) Entferne den proteinbindenden Filter in eine leere Petrischale.
5) Schütte eine Agaroselösung enthaltend eine Olivenölemulsion (2% P. V. A.: Olivenöl = 3 : 1), Brilliantgrün (Indikator; 0,004%), 100 mM Trispuffer pH 9 und EGTA (Endkonzentration 5 mM) auf den unteren Filter, um Kolonien, die Lipaseaktivität exprimieren, in Form von blaugrünen Punkten zu identifizieren.
6) Identifiziere die in Schritt 5) gefundenen Kolonien, die eine reduzierte Kalziumabhängigkeit im Vergleich zur Ausgangslipase haben.

DobanolTM25-7 Filterassay:

Das Screening nach verbesserter Toleranz gegenüber einer Detergenskomponente wird durch Verwendung eines Filterassays durchgeführt, der dem oben beschriebenen entspricht, außer dass die in 5) definierte Lösung weiterhin 0,02% DobanolTM25-7 umfasst.

Kontruktion von Zufallsmutagenese Libraries

a) unter Verwendung eines gesamten, für eine Lipase kodierenden, Gens
Das Plasmid pYESHL wird mit 12 M Ameisensäure 20 Minuten lang bei Raumtemperatur behandelt. Das resultierende, für die Lipase kodierende, Gen wird vom Ameisensäure-behandelten Plasmid unter Verwendung von PCR unter mutagenen Bedingungen amplifiziert (0,5 mM MnCl&sub2; und 1/5 der normalen Menge an ATP, siehe z. B. Leung et al., 1989).
Von dieser Behandlung erwartet man, dass sie ein breites Spektrum an Mutationen ergibt, weil Ameisensäure hauptsächlich Transversionen ergibt und PCR- generierte Mutationen hauptsächlich Transitionen.
Die resultierenden PCR-Fragmente werden entweder durch doppelte Rekombination (Muhlrad et al., 1992) in vivo in den Shuttlevektor kloniert oder durch Verdauung und Ligation in den Shuttlevektor und Transformation von E. coli.
Acht zufällig gepickte Klone wurden sequenziert, und man fand, dass sie 2-3 Mutationen im Durchschnitt enthielten - sowohl Transversionen als auch Transitionen.
Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden sieben Librarys gemacht, die von 10.000 bis 140.000 Klone enthielten.
b) Durchführung von lokalisierter Zufallsmutagenese
Ein mutagener Primer (Oligonukleotid) wird synthetisiert, der den Teil der DNA- Sequenz, die mutagenisiert werden soll, entspricht, mit Ausnahme des Nukleotids /der Nukleotide, die dem Aminosäurecodon/den Aminosäurecodons entsprechenen, das/die mutagenisiert werden soll(en).
Anschließend wird der resultierende mutagene Primer in einer PCR-Reaktion verwendet, gemeinsam mit einem geeigneten Gegenprimer. Das resultierende PCR-Fragment wird gereinigt und verdaut und in den Shuttlevektor kloniert. Alternativ dazu, und wenn nötig, wird das resultierende PCR-Fragment in einer zweiten PCR-Reaktion als Primer benutzt, mit einem zweiten geeigneen Gegenprimer, so dass der Verdau und die Klonierung der mutagenisierten Region in den Shuttlevektor ermöglicht wird. Die PCR-Reaktionen werden unter Normalbedingungen durchgeführt.
DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems ABI DNA-Sequenzierers, Modell 373A, durchgeführt, gemäß dem Protkoll im ABI Dye Terminator Cycle Sequencing Kit.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Konstruktion von zufälligen Lipasevarianten

Zufallsmutagenisierte Libraries des gesamten H. lanuginosa Lipasegens sowie der Aminosäuren (aa) 91-97 und 206-211 davon wurden, wie in Material und Methoden weiter oben beschrieben, hergestellt.
Die Aminosäureregionen 91-97 und 206-211 wurden für die erste Runde von lokalisierter Mutagenese ausgewählt, weil man fand, dass diese Regionen wichtig für die Waschleistung sind. Die Region 91-97 ist ein Teil der Deckelregion der Lipase, und die Region 206-211 stellt einen Teil der hydrophoben Spalte der Lipase dar.
Für jede dieser Regionen wurde ein Oligonukleotid synthetisiert, das 93% der Wildtyp-Nukleotide umfasste und 2,33% von jedem der drei anderen Nukleotide, an den Aminosäurecodons, die man mutagenisieren wollte. Wo dies ohne Ändern der Aminosäure möglich war, wurde das dritte Nukleotid in Codons (die "Wobble"-Base) mit 50% G/50%C synthetisiert, um eine größere Wahrscheinlichkeit für Veränderungen in Aminosäuren mit einem oder zwei Codons zu erhalten. Die Zusammensetzung der mutagenen Oligonukleotide der Region 91-97 ist in Tabelle 1 gezeigt.
Unter Verwendung dieses Oligonukleotids wird eine berechnete Mutationsfrequenz von ungefähr 65-70% in der Library erhalten, dafür dass ein Aminosäurenaustausch in die Ausgangslipase eingeführt wurde. Die Mutationsfrequenz dafür, dass zwei oder mehr Aminosäurenaustausche eingeführt wurden, ist geringer als 35%. Diese geringere Mutationsfrequenz wird gewählt, um sicherzustellen, dass die in positiven Klonen beobachteten Aminosäurenaustausche an der Verbesserung des Enzyms beteiligt sind und nicht nur "neutrale" Austausche aufgrund einer hohen Mutationsfrequenz sind.
Der mutagene Primer wurde in einer PCR-Reaktion zusammen mit einem geeigneten Gegenprimer verwendet. Die resultierenden PCR-Fragmente wurden aufgereinigt und im Fall der Region 206-211 verdaut und in den Shutlevektor kloniert. Im Fall der Region 91-97 wurde das resultierende PCR-Fragment in einer zweiten PCR-Reaktion als Primer verwendet, zusammen mit einem zweiten geeigneten Gegenprimer. Dieser Schritt war nötig, um in der Lage zu sein, die mutagenisierte Region zu verdauen und in den Shuttlevektor zu klonieren.
Libraries der Region 91-97 und der Region 206-211 wurden hergestellt, die von 10.000 bis 80.000 Klone pro Library enthalten. Die meisten Kolonien waren positiv (mehr als 90%), wenn sie unter Bedingungen getestet wurden, bei denen die Ausgangslipase positiv ist, d. h. Lipaseaktivität aufweist. Die positive Reaktion wurde in einem Filterassay mit 2,5 mM Ca (anstatt 5 mM EGTA) festgestellt.
450.000 Kolonien aus den verschiedenen Libraries wurden unter Verwendung des Dobanol®25-7 und Niedrigkalzium-Assays, wie beschrieben in Material und Methoden weiter oben, gescreent. 25 "Niederkalzium" Positive aus der aa 91-97 Library (Deckel-Region) und zwölf Dobanol®25-7 Positive aus der gesamten Genlibrary wurden isoliert. 14 der "Niederkalzium" Positiven aus der Mutagenese von AA 91-97 wurden sequenziert.
Die drei anderen Mutationen (in Codon 83, 103, 145), außerhalb der mutagenisierten Region, kann durch Fehlinkorporation bei der PCR erklärt werden, obwohl die Mutation bei S83T eine Transversion ist, was für PCR-Fehlinkorporation recht ungewöhnlich ist. Tabelle 1:
Tabelle 1: Erklärung der Konstruktion von Oligonukleotiden, wie sie zur lokalisierten Zufallsmutagenese von Aminosäuren 91-97 der H. lanuginosa Lipase verwendet wurden. Die in der Sequenz gezeigten Zahlen beziehen sich auf die Flaschen, deren Zusammensetzung rechts von der Sequenz erscheint. Tabelle 2
Tabelle 2: Die Stammnummer bezieht sich auf die ursprünglich gepickten Klone, die im Aspergillus-Expressionsvektor pAHL kloniert sind. Der Variantentyp bezieht sich auf identische Klone, die wahrscheinlich während der Amplifikation der Zufallsmutageneselibrary entstanden sind. Die Variantentypen I und II sind in 0,01% DobanolTM25-7 aktiv, während die restlichen so inaktiv wie der Wildtyp sind. Tabelle 3
Tabelle 3: Die Wildtypesequenz ist in der obersten Zeile gezeigt. Nur die Nukleotide, die sich vom Wildtyp unterscheiden, sind bei den Sequenzen der Varianten ausgeschrieben. Die Basen von Codon 91 und 93 wurden mit (einer) 1 : 1 (Mischung) von C/T bzw. T/G dotiert. Ansonsten wurden die Nukleotide bei den Codons 91-97 dotiert unter Verwendung von 93% wt und 2,33% der drei anderen Nukleotide.

BEISPIEL 2

Analog zum in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden die folgenden Varianten durch Zufallmutagenese erzeugt. Die tatsächlichen Kriterien für das Screening, das zur Selektion von einigen der Varianten verwendet wurde, sind auch beschrieben.
D167G+E210V

5 mM EGTA; 0,01% DobanolTM25-7; 0,006% LAS

E87K+G91A+L93I+N94K+D96A

5 mM EGTA; 0,02% DobanolTM25-7

N73D+S85T+E87K+G91A+N94K+D96A
S83T+E87K+W89G+G91A+N94K+D96V
E87K+G91A+D96R+I100V
S83T+E87K+Q249R
E87K+G91A

BEISPIEL 3

Expression der Humicola lanuginosa Lipase in Aspergillus oryzae Die Klonierung der Humicola lanuginosa Lipase ist in EP 305 216 beschrieben. Dort ist auch die Expression und Charakterisierung der Lipase in Aspergillus oryzae beschrieben. Das verwendete Expressionsplasmid wird p960 genannt.
Das in dieser Anmeldung verwendete Expressionsplasmid ist identisch mit p960, mit Ausnahme von untergeordneten Modifikationen knapp 3' von der für die Lipase kodierenden Region. Die Modifikationen wurden auf die folgende Art gemacht: p960 wurde mit den Restriktionsenzymen NruI und BamHI verdaut. Zwischen diese beiden Stellen wurde das BamHI/NheI Fragment aus dem Plasmid pBR322, bei dem das NheI Fragment mit Klenowpolymerase aufgefüllt worden war, kloniert und somit das Plasmid pAO1 erzeugt (Fig. 2), das einmalige Bam-HI und NheI Stellen enthält. Zwischen diesen einmaligen Stellen wurden die BamHI/XbaI Fragmente aus p960 kloniert und damit ein pAHL erzeugt (Fig. 3).

Ortsspezifische in vitro Mutagenese des Lipasegens

Der Weg, der für das Einführen von Mutationen in das Lipasegen verwendet wurde, ist in Nelson & Long, Analytical Biochemistry, 180, 147-151 (1989) beschrieben. Es schließt die Herstellung eines PCR (Polymerasekettenreaktion) Fragments in 3 Schritten mit ein, das die erwünschten Mutationen, die durch die Verwendung eines chemisch synthetisierten DNA-Strangs als einer der Primer in den PCR- Reaktionen eingeführt wurden, enthält. Aus dem mit PCR erzeugten Fragment kann mit Restriktionsenzymen ein DNA-Fragment isoliert werden, das die Mutation trägt und in das Expressionsplasmid wieder eingefügt werden. Diese Methode ist im Beispiel 5 gründlich beschrieben. In den Fig. 4 und 5 ist die Methode weiter umrissen.
Konstruktion eines Plasmids, das das N94K/D96A-Anlog der Humicola lanuginosa Lipase exprimiert

Linearisierung des Plasmids pAHL

Das zirkuläre Plasmid pAHL wird mit dem Restriktionsenzym SphI in der folgenden 50 ul Reaktionsmischung linearisiert: 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,9, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol, 1 ug Plasmid und 2 Einheiten SphI. Der Verdau wird bei 37ºC 2 Stunden lang durchgeführt. Die Reaktionsmischung wird mit Phenol extrahiert (im Gleichgewicht mit Tris-HCl, pH 7,5) und durch Zugabe von 2 Volumen eiskaltem 96% Ethanol gefällt. Nach Zentrifugation und Trocknen des Pellets, wurde die linearisierte DNA in 50 ul H&sub2;O aufgelöst und die Konzentration auf einem Agarosegel geschätzt.

3-Schritt PCR Mutagenese

Wie in Fig. 5 gezeigt, umfasst die 3-Schritt PCR Mutagenese die Verwendung von vier Primern:
Helfer 1 und Helfer 2 sind komplementär mit Sequenzen außerhalb der kodierenden Region und können darum in Kombination mit jedem beliebigen Mutageneseprimer für die Konstruktion der Sequenz einer Variante verwendet werden.
Alle 3 Schritte werden durchgeführt im folgenden Puffer, enthaltend: 10 mM Tris- HCl, pH 8,3; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl&sub2;; 0,001% Gelatine; 0,2 mM dATP; 0,2 mM dCTP; 0,2 mM dGTP; 0,2 mM TTP; 2,5 Einheiten Tag Polymerase. In Schritt 1 werden 100 umol Primer A, 100 umol Primer B und 1 fmol linearisiertes Plasmid einem Reaktionsgemisch mit einem Reaktionsgemisch mit einem Gesamtvolumen von 100 ul gegeben und 15 Zyklen bestehend aus 2 Minuten bei 95ºC, 2 Minuten bei 37ºC und 3 Minuten bei 72ºC werden durchgeführt.
Die Konzentration des PCR-Produkts wird auf einem Agarosegel geschätzt. Dann wird Schritt 2 durchgeführt. 0,6 umol des Produkts aus Schritt 1 und 1 fmol linearisiertes Plasmid sind in einem Gesamtvolumen von 100 ul des vorher genannten Puffers eingeschlossen und 1 Zyklus bestehend aus 5 Minuten bei 95ºC, 2 Minuten bei 37ºC und 10 Minuten bei 72ºC werden durchgeführt.
Zur Reaktionsmischung aus Schritt 2 wird 100 umol Primer C und 100 umol Primer D gegeben (je 1 ul) und 20 Zyklen bestehend aus 2 Minuten bei 95ºC, 2 Minuten bei 37ºC und 3 Minuten bei 72ºC werden durchgeführt. Diese Arbeitsweise stellte Schritt 3 im Mutageneseverfahren dar.

Isolation des mutierten Isolationsfragments

Das Produkt aus Schritt 3 wird aus einem Agarosegel isoliert und 20 ul H&sub2;O wieder gelöst. Dann wird es mit den Restriktionsenzymen BamHI und BstXI in einem Gesamtvolumen von 50 ul verdaut, mit der folgenden Zusammensetzung: 100 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,9; 10 mM MgCl&sub2;; 1 mM DTT; 10 Einheiten BamHI und 10 Einheiten BstXI. Die Inkubation findet bei 37ºC 2 Stunden lang statt. Das 733 bp BamHI/BstXI Fragment wird aus einem Agarosegel isoliert.

Ligation mit dem Expressionsvektor pAHL

Das Expressionsplasmid pAHL wird mit BamHI und BstXI gespalten, unter den oben angegebenen Bedingungen, und das große Fragment aus einem Agarosegel isoliert. An diesen Vektor wird das mutierte Fragment, isoliert wie oben, ligiert, und die Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli zu transformieren. Die Anwesenheit und Orientierung des Fragments wird verifiziert, indem man eine Plasmidpräparation aus einem Transformanden mit Restriktionsenzymen spaltet. Die Sequenzanalyse wird am doppelsträngigen Plasmid durchgeführt, unter Verwendung des DyeDeoxyTM Terminater Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) auf einem ABI DNA Sequenzer, Modell 373A. Das Plasmid wird pAHLG91A/N94K/D96A genannt und ist identisch mit pAHL, mit Ausnahme der substituierten Codons.

BEISPIEL 4

Konstruktion von Plasmiden, die andere Varianten der Humicola Lipase exprimieren
Die folgende Variante wird, unter Verwendung desselben Verfahrens wie in Beispiel 3 beschrieben, konstruiert. Plasmidname und Primer, die für die Modifikation verwendet werden, sind unten aufgeführt.

BEISPIEL 5

Konstruktion von Plasmiden, die Kombinationen von Analoga der Humicola Lipase exprimieren

Die Plasmide pAHLD167G/E210V
pAHLA121V/R205K/E210Q
und pAHLS83T/E87K/Q249R
wurden konstruiert, indem man zwei aufeinanderfolgende Mutageneseschritte unter Verwendung der geeigneten Primer durchführte.

BEISPIEL 6

Expression von Analoga der Lipase in Aspergillus

Transformation von Aspergillus oryzae (generelles Verfahren) 100 ml YPD (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) wird mit Sporen von A. oryzae inokuliert und unter Schütteln 24 Stunden lang inkubiert. Das Mycelium wird durch Filtration durch ein Miratuch geerntet und mit 200 ml 0,6 M MgSO&sub4; gewaschen. Das Mycelium wird suspendiert in 15 ml 1,2 M MgSO&sub4;, 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;, pH = 5,8. Die Suspension wird auf Eis gekühlt und 1 ml eines Puffers enthaltend 120 mg Novozym® 234, Charge 1687 wird hinzugegeben. Nach 5 Minuten wird 1 ml 12 mg/ml BSA (Sigma, Typ H25) zugegeben und die Inkubation unter mildem Schütteln 1,5-2,5 Stunden lang bei 37ºC fortgesetzt, so lange bis eine große Anzahl Protoplasten in einer Probe, die man unter dem Mikroskop untersucht, sichtbar ist.
Die Suspension wird durch ein Miratuch (miracloth) filtriert, das Filtrat in einen sterilen Behälter überführt und mit 5 ml 0,6 M Sorbitol, 100 mM Tris-HCl, pH = 7,0 überschichtet. Zentrifugation wird bei 1000 g 15 Minuten lang durchgeführt und die Protoplasten von der Oberfläche des MgSO&sub4; Kissens gesammelt. 2 Volumen STC (1,2 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 10 mM CaCl&sub2;) werden zur Protoplastensuspension zugegeben und die Mischung bei 1000 g 5 Minuten lang zentrifugiert. Das Protoplastensediment wird in 3 ml STC resuspendiert und wiedersedimentiert. Das wird wiederholt. Schließlich werden die Protoplasten in 0,2 -1 ml STC resuspendiert.
100 ul der Protoplastensuspension werden mit 5-25 ug p3SR2 gemischt (ein Plasmid, das ein A. nidulans amdS Gen prägt; beschrieben in Hynes et al., Mol. and Cel. Biol., Vol. 3, No. 8, 1430-1439, Aug. 1983) in 10 ul STC. Die Mischung wird 25 Minuten lang auf Raumtemperatur gehalten. 0,2 ml 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl&sub2; und 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5 wird zugegeben und vorsichtig gemischt (zweimal) und schließlich werden 0,85 ml derselben Lösung zugegeben und vorsichtig gemischt. Die Mischung wird 25 Minuten lang auf Raumtemperatur gehalten, bei 2500 g 15 Minuten lang zentrifugiert und das Pellet in 2 ml 1,2 M Sorbitol resuspendiert. Nach einer weiteren Sedimentation werden die Protoplasten auf Minimalplatten (Cove, Biochem. Biophys. Acta 113 (1966) 51-56) enthaltend 1,0 M Saccharose, pH = 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl, um Hintergrundwachstum zu verhindern, verteilt. Nach einer Inkubation von 4-7 Tagen bei 37ºC werden Sporen gepickt, in sterilem Wasser suspendiert und verteilt, um einzelne Kolonien zu erhalten. Dieses Verfahren wird wiederholt und Sporen einer einzelnen Kolonie, nach der zweiten Reisolation, werden als definierte Transformanden gelagert.

Expression von Analoga der Lipase in A. oryzae

Die oben beschriebenen Plasmiden werden in A. oryzae IFO 4177 transformiert durch Co-Transformation mit p3SR2, das das amdS-Gen aus A. nidulans, wie im Beispiel oben beschrieben, trägt. Protoplasten, hergestellt wie beschrieben, werden mit einer Mischung aus gleichen Mengen des Expressionsplasmids und p3SR2 inkubiert, wobei annähernd 5 ug von jedem (Plasmid) verwendet werden. Transformanden, die Acetamid als einzige Stickstoffquelle verwenden konnten, werden zweimal reisoliert. Nach Wachstum auf YPD für drei Tage werden Überstände der Kultur unter Verwendung eines Assays für Lipaseaktivität analysiert. Der beste Transformand wird für weitere Studien ausgewählt und in einer 1 l Schüttelflasche auf 200 ml FG4 Medium (3% Sojamehl, 3% Maltodextrin, 1% Pepton, pH auf 7,0 mit 4 M NaOH eingestellt) 4 Tage lang bei 30ºC wachsen gelassen.

BEISPIEL 7

Reinigung der erfindungsgemäßen Lipasevarianten

Assay für die Lipaseaktivität:
Ein Lipasesubstrat wurde hergestellt, indem man Glycerin Tributyrat (MERCK) unter Verwendung von Gummi-Arabicum als Emulgator emulgierte.
Lipaseaktivität wurde bei pH 7 gemessen unter Verwendung der pH Stat Methode. Eine Einheit an Lipaseaktivität (LU/mg) wurde als die Menge definiert, die benötigt wurde, um Micromol Fettsäure pro Minute freizusetzen.
Schritt 1: - Zentrifugiere den Überstand der Fermentation, verwerfe das Precipitat. Stelle den pH des Überstands auf 7 ein und füge allmählich ein gleiches Volumen von kaltem 96%-igem Ethanol hinzu. Lasse die Mischung 30 Minuten lang in einem Eisbad stehen. Zentrifugiere und verwerfe das Precipitat.
Schritt 2: - Ionenaustauscherchromatografie. Filtriere den Überstand und appliziere ihn auf eine DEAE-Fastflow Säule(Pharmacia TM), die mit 50 mM Tris-Acetat Puffer pH 7 equilibriert worden war. Wasche die Säule mit demselben Puffer, bis die Absorption bei 280 nm geringer als 0,05 OD ist. Eluiere die gebundene Enzymaktivität mit einem linearen Salzgradienten im selben Puffer (0 bis 0,5 M NaCl) unter Verwendung von fünf Säulenvolumen. Vereinige die Fraktionen, die Enzymaktivität enthalten.
Schritt 3: -Hydrophobe Chromatografie. Stelle die Molarität der vereinigten Fraktionen, die Enzymaktivität enthalten, auf 0,8 M ein, durch Zugabe von festem Ammoniumacetat. Appliziere das Enzym auf eine TSK Gel Butyl-Toyopearl 650 C Säule (erhältlich von Tosöh Corporation Japan), die mit 0,8 M Ammoniumacetat vorequilibriert worden war. Wasche das ungebundene Material mit 0,8 M Ammoniumacetat und eluiere das gebundene Material mit destilliertem Wasser.
Schritt 4: - Der Pool enthaltend die Lipaseaktivität wird mit Wasser verdünnt, um die Leitfähigkeit auf 2 mS und den pH auf 7 einzustellen. Appliziere die vereinigten Fraktionen auf eine "High performance Q Spharose" (Pharmacia) Säule, die mit 50 mM Tris-Acetatpuffer pH 7 präequilibriert worden war. Eluiere das gebundene Enzym mit einem linearen Salzgradienten.

BEISPIEL 8

Die Waschleistung von erfindungsgemäßen Lipasevarianten

Die Waschleistung von erfindungsgemäßen Humicola lanuginosa Lipasevarianten wurde bewertet auf Grundlage der Enzymdosierung in mg Protein pro Liter, gemäß dem OD&sub2;&sub8;&sub0;, im Vergleich mit der Wildtyp H lanuginosa Lipase.
Waschversuche wurden in 150 ml Bechergläsern durchgeführt, die in ein thermostatreguliertes Wasserbad platziert wurden. Die Bechergläser wurden mit dreieckigen magnetischen Rührfischen gerührt.
Die experimentellen Bedingungen waren wie folgt:
Verfahren: 3 Zyklen mit Trocknen über Nacht zwischen jedem Zyklus
Waschflüssigkeit: 100 ml pro Becherglas
Musterabschnitte: 6 Musterabschnitte (3,5 · 3,5 cm) pro Becherglas
Stoff: 100% Baumwolle, Teststoffart Nr. 400
Fleck: Schmalz, mit Sudanrot gefärbt (0,75 mg Farbstoff/g an Schmalz). 6 ul Schmalz erhitzt auf 70ºC wurde auf das Zentrum eines jeden Musterabschnitts appliziert. Nach der Applikation des Flecks wurden die Musterabschnitte in einem Ofen 30 Minuten lang bei 75ºC erhitzt. Die Musterabschnitte wurden dann bei Raumtemperatur über Nach gelagert, vor dem ersten Waschdurchgang.
Detergens: LAS (Nansa 1169/P, 30% a. m.) 1,17 g/l
AEO (DobanolTM 25-7) 0,15 g/l
Natriumtriphosphat 1,25 g/l
Natriumsulfat 1,00 g/l
Natriumcarbonat 0,45 g/l
Natriumsilikat 0,15 g/l
pH: 10,2
Lipasekonzentration: 0,075; 0,188; 0,375; 0,75 und 2,5 mg Lipaseprotein pro Liter
Zeit: 20 Minuten
Temperatur: 30ºCelsius
Spülung: 15 Minuten in laufendem Leitungswasser
Trocknen: über Nacht bei Raumtemperatur (~20ºCelsius, 30-50% RH)
Bewertung: Nach dem dritten Waschdurchgang, der Reflektionsgrad bei 460 nm wurde gemessen.

Ergebnisse:

Dosis-Wirkungskurven für die Lipasevarianten und die native H. lanuginosa Lipase wurden verglichen. Die Dosis-Wirkungskurven wurden berechnet, indem die gemessenen Daten an die folgende Gleichung angepasst wurden:
wobei ΔR der Effekt ausgedrückt in Einheiten des Reflektionsgrads ist,
C ist die Enzymkonzentration (mg/l)
ΔRmax ist eine Konstante, die den Maximaleffekt ausdrückt
K ist eine Konstante; K² drückt die Enzymkonzentration aus, bei der Hälfte des Maximaleffekts erhalten wird.
Basierend auf den charakteristischen Konstanten ΔRmax und K, die für jede Lipasevariante sowie für die Wildtyplipase bestimmt wurden, wurden Verbesserungsfaktoren berechnet. Der Verbesserungsfaktor, definiert als
fVerbesserung = CWT/C (II)
drückt die Menge an Protein der Lipasevariante aus, die man braucht, um denselben Effekt zu erhalten, wie mit 0,25 mg/l des Referenzwildtypproteins (CWT).
Damit war das Verfahren zur Berechnung des Verbesserungsfaktors wie folgt:
1) Der Effekt des Wildtypproteins bei 0,25 mg/l (ΔR(Wilacyp)) wurde unter Verwendung von Gleichnung (I) berechnet;
2) Die Konzentration der Lipasevariante, die denselben Effekt ergab wie der Wildtyp bei 0,25 mg/l wurde berechnet unter Verwendung der folgenden Gleichung:
3) Der Verbesserungsfaktor wurde unter Verwendung von Gleichung (II) berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 weiter unten gezeigt. Tabelle 1

IN DER BESCHREIBUNG ZITIERTE REFERENZEN

Muhlrad et al., 1992, Yeast, Vol. 8, 79-82
Shimada, Y. et al. (1989). cDNA Molecular Cloning of Geotrichum candidum Lipase. J. Biochem., 106, 383-388
Yamaguchi, S. et al. (1991). Cloning and structure of the mono- and diglycerol lipase-encoding gene from Penicillium camembertii U-150. Gene 103, 61-67
Hass, M. J. et al. (1991). Cloning, expression and characterization of a cDNA encoding a lipase from Rhizopus delemar. Gene 109, 107-113
Kugimiya, W. et al. (1992). Cloning and Sequences Analysis of DNA encoding Rhizopus niveus Lipase. Biosci. Boitech. Biochem. 56, 716-719
Dartois, V. et al. (1993). Cloning, nukleotide sequence and expression in Escherichia coli of a lipase gene from Bacillus subtilis 168. Biochemica et Biophysica acta 1131, 253-260.
Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989.
R. K. Saiki et al., Science 239, pp. 487-491, 1988.
Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22, pp. 1859-1869, 1981.
Matthes et al., The EMBO J. 3, pp. 801-805, 1984.
J. O. Deshler, (1992) A simple method for randomly mutating cloned DNA fragments by using chemical mutagens and the polymerase chain reaction. GATA 9(4): 103-106
Leung et al., Technique, Vol. 1, No. 1, pp. 11-15, 1989
Fowler et al., Molec. gen. Genet., 133, pp. 179-191, 1974
Brady et al., "A Serine Protease Triad Forms the Catalytic Centre of a Triacylglycerol Lipase", Nature 343, 1990, pp. 767-770, 1990.
Tilbeyrgh, H. von, Egloff, M.-P., Martinez, C., Rugani, N., Verger, R. and Cambillau (1993) Nature 362, p. 814-820. Interfacial activation of the lipaseprolipase complex by mixed micelles revealed by X-ray crystallography.
Hudson et al., Practical Immunology, Third edition, Blackwell Scientific Publications, 1989
Alber, T. and Kawasaki, G., J. Mol. Appl. Genet 1, 419-434 (1982)

SEQUENZPROTOKOLL

(1) Allgemeine Informationen:
(i) ANMELDER: Novo Nordisk A/S
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Methode zur Herstellung einer Variante eines lipolytischen Enzyms
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSE: Novo Nordisk A/S
(B) STRASSE: Novo Alle
(C) STADT: Bagsvaerd
(D) LAND: Dänemark
(E) POSTLEITZAHL: 2880
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIENART: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Ausgabe #1.0, Version #1.25
(vi) ANWALTSINFORMATIONEN:
(A) NAME: S rensen, Lise Abildgaard
(C) REFERENZ/DOCKET NUMMER: 4153.204-WO
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATIONEN:
(A) TELEFON: +45 4444 8888
(B) TELEFAX: +45 4449 3256
(C) TELEX: 37304
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO: I:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 918 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGART: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS: Humicola lanuginosa
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/BEZEICHNUNG: CDS
(B) ORT: 1..873
(C) NAME/BEZEICHNUNG: mat-Peptid
(D) ORT: 67..873 (x) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 291 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Variante eines lipolytischen Ausgangsenzyms, wobei das Verfahren umfasst

a) Behandeln einer DNA-Sequenz kodierend für das lipolytische Ausgangsenzym mit Zufallsmutagenese,

b) Exprimieren der mutierten DNA-Sequenz erhalten in Schritt a) in einer Wirtszelle, und

c) Screening nach Wirtszellen, die ein mutiertes lipolytisches Enzym exprimieren, das eine verminderte Kalziumabhängigkeit hat.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt c) zusätzlich das Screening nach verbesserter Toleranz gegenüber einem Detergens oder einer Detergenskomponente, im Vergleich zum lipolytischen Ausgangsenzym, umfasst.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zufallsmutagenese durchgeführt wird durch Verwendung eines physikalischen oder chemischen mutagenisierenden Agens, durch Verwendung eines Oligonukleotids oder durch Verwendung von PCR-vermittelter Mutagenese.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das mutagenesierende Agens ausgewählt ist aus Ameisensäure, UV-Bestrahlung, Hydroxylamin, N-Methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidin (MNNG), O-Methylhydroxylamin, Salpetriger Säure, Ethylmethansulfonat (EMS), Natriumbisulfit, und Nukleotidanaloga.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Expression der mutierten DNA- Sequenz durchgeführt wird durch Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit der mutierten DNA-Sequenz, wobei die mutierte DNA-Sequenz wahlweise weiterhin eine DNA-Sequenz umfasst, die für Funktionen kodiert, die die Expression der mutierten DNA-Sequenz erlauben, und Kultivierung der in Schritt b) erhaltenen Wirtszelle unter für die Expression der mutierten DNA- Sequenz geeigneten Bedingungen.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die für die Expression der mutierten DNA- Sequenz verwendete Wirtszelle eine mikrobielle Zelle ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Wirtszelle eine Zelle eines Pilz- oder Bakterienstammes ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle eine Zelle des Genus Aspergillus, wie A. niger, A. oryzae und A. nidulans, oder eine Zelle des Genus Saccharomyces, z. B. S. cereviciae, ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle eine Zelle eines Gram- positiven Bakterienstamms ist, z. B. des Genus Bacilllus, wie Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis oder Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus, oder eine Zelle eines Gram-negativen Bakterienstammes, wie E. coli, ist.

10. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das mutierte lipolytische Enzym eine verbesserte Toleranz gegenüber einem nicht-ionischen, anionischen, kationischen, zwitterionischen oder amphotherischen Tensid hat.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das nicht-ionische Tensid ein Alkoholethoxylat und/oder das anionische Tensid LAS oder ein Alkylsulfat ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die in Schritt c) gescreenten Wirtszellen einer zweiten Mutagenesebehandlung, einem Re-Screening, einer Re-Isolation und/oder einer Re-Klonierung unterzogen werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, wobei die Zufallsmutagenese lokalisiert ist auf einen Teil der DNA-Sequenz, die das lipolytische Ausgangsenzym kodiert.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, wobei das lipolytische Ausgangsenzym eine Lipase, eine Esterase, eine Cutinase oder eine Phospholipase ist.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das lipolytische Ausgangsenzym eine Lipase ist und die lokalisierte Zufallsmutagenese an einem Teil der DNA- Sequenz durchgeführt wird, der eine Lipidkontaktzone oder einen Teil davon in der Ausgangslipase kodiert.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die lokalisierte Zufallsmutagenese durchgeführt wird an einem Teil der DNA-Sequenz, der für eine Deckel-Region und/oder eine hydrophobe Spalte der Ausgangslipase kodiert, oder einen Teil dieser Deckel-Region und/oder hydrophoben Bindungsspalte.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-16, wobei das lipolytische Ausgangsenzym von einem Mikroorganismus erhältlich ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das lipolytische Ausgangsenzym von einem Pilz erhältlich ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die DNA-Sequenz, die das lipolytische Ausgangsenzym kodiert, erhältlich ist von einem Stamm von Humicola sp., Rhizomucor sp., Rhizopus sp. oder Candida sp.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das lipolytische Ausgangsenzym eine Lipase ist und die DNA-Sequenz, die für die Ausgangslipase kodiert, erhältlich ist von einem Stamm von H. lanuginosa, z. B. den H lanuginosa Stamm DSM 4109, einem Stamm von Rh. mucor, oder einem Stamm von C. antarctica.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die der Zufallsmutagenese unterzogene DNA-Sequenz kodiert für zumindest eine der Regionen definiert durch die Aminosäurereste 21-27, 56-64, 81-99, 108-116, 145-147, 174, 202-213, 226- 227, 246-259, oder 263-269 der H. lanuginosa Lipase erhältlich von DSM 4109.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die lokalisierte Zufallsmutagenese in zumindest zwei der genannten Regionen durchgeführt wird.

23. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das lipolytische Ausgangsenzym von einem Bakterium erhältlich ist.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die DNA-Sequenz, die das lipolytische Ausgangsenzym kodiert, erhältlich ist von einem Stamm von Pseudomonas spp., wie P. cepacia, P. alcaligenes, P. pseudolacaligens oder P. fragi oder von einem Stamm von Bacillus.

25. Variante der H. lanuginosa Lipase, erhältlich von DSM 4109, die zumindest eine der folgenden Mutationen umfasst: S83T, G91A, I100V, D167G, und die wahlweise weiterhin umfasst die Addition von einer oder mehreren Aminosäureresten an entweder das N- oder C-terminale Ende der Lipase, oder an beide, die Substitution von einer oder mehreren Aminosäureresten an einer oder mehreren verschiedenen Stellen in der Aminosäuresequenz, Deletion von einer oder mehreren Aminosäureresten an einem oder an beiden Enden der Lipase oder an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäureresten an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz, vorausgesetzt, dass die Variante Lipaseaktivität behält.

26. Variante der H. lanuginosa Lipase erhältlich von DSM 4109 die zumindest eine der folgenden Gruppen von Mutationen umfasst:

N94K+D96A

S83T+N94K+D96N

E87K+D96V

E87K+G91A+D96A

N94K+F95L+D96H

F95C+D96N

E87K+G91A+D96R+I100V

E87K+G91A

S83T+E87K+Q249R

S83T+E87K+W89G+G91A+N94K+D96V

N73D+S85T+E87K+G91A+N94K+D94A

E87K+G91A+L93I+N94K+D96A

D167G+E210V

N73D+E87K+G91A+N94I+D96G

S83T+E87K+G91A+N92H+N94K+D96M

E56R+D57G+V60M+D62N+S83T+D96P+D102E

D57G+N94K+D96L+L97M

E87K+G91A+D96R+I100V+E129K+K237M+I252L+P256T+G263A+L264Q

E56R+D57G+S58F+D62C+T64R+E87G+G91A+F95L+D96P+K98I+K237M

D167G

N73D+E87K+G91A+N94I+D96G

S83T+E87K+G91A+N92H+N94K+D96M

D57G+N94K+D96L+L97M

G91A+N94K+D96A,

und die wahlweise zusätzlich die Addition von einem oder mehreren Aminosäureresten an entweder das N- oder das C-terminale Ende der Lipase, oder an beide, umfasst, Substitution von einer oder mehreren Aminosäureresten an einer oder mehreren verschiedenen Stellen in der Aminosäuresequenz, Deletion von einer oder mehreren Aminosäureresten an einem oder beiden Enden der Lipase oder an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz oder Insertion von einem oder mehreren Aminosäureresten an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz, vorausgesetzt, dass die Variante Lipaseaktivität behält.

27. DNA-Konstrukt kodierend für eine H. lanuginosa Lipasevariante nach Anspruch 25 oder 26.

28. Vektor beinhaltend ein DNA-Konstrukt nach Anspruch 27.

29. Vektor nach Anspruch 28, der ein Plasmid oder ein Bakteriophage ist.

30. Vektor nach Anspruch 28 oder 29, der ein Expressionsvektor ist, der weiterhin DNA-Sequenzen, die die Expression der Variante des lipolytischen Ausgangsenzyms gestatten, umfasst.

31. Wirtszelle beinhaltend ein DNA-Konstrukt nach Anspruch 27 oder ein Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 28 bis 30.

32. Zelle nach Anspruch 31, die eine mikrobielle Zelle ist.

33. Zelle nach Anspruch 32, die eine Zelle eines Pilz- oder Bakterienstammes ist.

34. Zelle nach Anspruch 33, die eine Zelle des Genus Aspergillus ist, wie A. niger, A. oryzae oder A. nidulans, oder eine Zelle des Genus Saccharomyces, z. B. S. cereviciae.

35. Zelle nach Anspruch 33, die eine Zelle eines Grampositiven Bakterienstammes ist, z. B. des Genus Bacilllus, wie Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis oder Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus, oder eine Zelle eines Gram-negativen Bakterienstammes, wie E. coli, ist.

36. Verfahren zur Herstellung einer Variante eines lipolytischen Ausgangsenzyms, die eine verminderte Kalziumabhängigkeit und wahlweise eine verbesserte Toleranz gegenüber einem Detergens oder einer Detergenskomponente im Vergleich zum lipolytischen Ausgangsenzym hat, wobei das Verfahren die Herstellung einer Variante eines lipolytischen Enzyms gemäß dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 24 sowie die Gewinnung der Variante des lipolytischen Enzyms aus der Wirtszelle, die in Schritt c) gescreent wurde, umfasst.

37. Verfahren zur Herstellung einer Variante eines lipolytischen Ausgangsenzyms, die eine verringerte Kalziumabhängigkeit und wahlweise eine verbesserte Toleranz gegenüber einem Detergens oder einer Detergenskomponente im Vergleich zum lipolytischen Ausgangsenzym hat, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 31 bis 35 unter für die Expression der Variante geeigneten Bedingungen, sowie die Gewinnung der exprimierten Variante aus der Kultur, umfasst.

38. Detergensadditiv umfassend eine Lipasevariante nach Anspruch 25 oder 26, wahlweise in der Form eines nichtstaubenden Granulats, einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms.

39. Detergensadditiv nach Anspruch 38, das 0,02-200 mg des Enzymproteins/g des Additivs enthält.

40. Detergensadditiv nach Anspruch 38 oder 39, das zusätzlich ein weiteres Enzym wie eine Protease, Amylase, Peroxidase, Cutinase, Lipase und/oder Cellulase umfasst.

41. Detergenszusammensetzung umfassend eine Lipasevariante nach Anspruch 25 oder 26.

42. Detergenszusammensetzung nach Anspruch 41, die zusätzlich ein weiteres Enzym wie eine Protease, Amylase, Peroxidase, Cutinase, Lipase und/oder Cellulase umfasst.