DE2759579C2

DE2759579C2 - Zellkulturmikroträger

Info

Publication number: DE2759579C2
Application number: DE2759579A
Authority: DE
Inventors: David W. Dr. Somerville Mass. Levine; William G. Cambridge Mass. Thilly; Daniel I.C. Belmont Mass. Wang; Jason S. Toledo Ohio Wong
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1976-11-11
Filing date: 1977-11-08
Publication date: 1983-08-25
Also published as: AU508398B2; FR2370792B1; JPS5614270B2; IN147612B; BR7707551A; JPS5735953B2; JPS5699790A; SE417108C; SE8006993L; JPS5699789A; FI773377A; SE417108B; DE2749989C3; AU3049177A; FI60407B; DE2749989A1; SE460906B; DE2749989B2; JPS5362889A; NL177926B

Description

35

Erfindungsgegenstand ist der Im Patentanspruch 1 angegebene Zeilkulturmikrotrager. Die Patentansprüche bis 6 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Das Wachsenlassen von Säugetierzellen Ist sowohl Im Labor- als auch im Industriemaßstab wichtig. Im Labormaßstab Ist oft der begrenzende Faktor für eine Zellen- oder Virenuntersuchung die Menge des Rohmaterials, die für die Untersuchung zur Verfügung steht. In industriellem Maßstabe werden große Anstrengungen unternommen, um Pharmazeuttka auf der Grundlage von Säugetierzellprodukten zu entwickeln. Es handelt sich dabei hauptsächlich um Impfstoffe für menschliche oder tierische Viren, jedoch auch um menschliche Wachstumshormone sowie andere Körperhormone sowie Biochemlkalien für medizinische Anwendungszwecke.

Einige Säugetierzelltypen wurden für ein Wachstum in Suspensionskulturen adaptiert. Beispiele für derartige Zelltypen sind HeLa (menschlich), BHK (Babyhamsternieren) sowie L-Zellen (Mäuse). Derartige Zellen weisen im allgemeinen nicht normal genetische Komplemente auf, d. h. zu viele oder zu wenige Chromosomen oder abnormale Chromosomen. Oft erzeugen diese Zellen einen Tumor nach einer Einspritzung In ein Tier der entsprechenden Spezies.

Andere Säugetierzelltypen konnten bisher noch nicht für ein Züchten in einer Suspensionskultur adaptiert werden. Sie wachsen nur, wenn sie mit einer geeigneten Oberfläche verknüpft werden. Derartige Zellentypen werden Im allgemeinen als »verankerungsabhängig« bezeich-

60

65 net. Erwähnt selen 3T3-Mäusefibroblasten, Mäusemarkknochen, Epithelzellen, von Mäusen übeitragene Leukämlevlrus-erzeugende Stämme von Mäusefibroblasten, primäre und sekundäre Hühnerflbroblasten, WI-38-Menschenflbroblastzellen sowie normale menschliche Embryolungenflbroblastzellen (HEL299, ATCC # CCL137). Einige verankerungsabhängige Zelles wurden gezüchtet, die Tumore verursachen, es konnten jedoch auch andere gezüchtet werden, die keinen Tumor bedingen. Auch können einige verankerungsabhängige Zellen, w^j WI-38 und HEL299, gezüchtet werden, die genetisch normal sind.

Beträchtliche Fortschritte sind bei der Säugetierzellenvermehrung In großtechnischen Maßstabe unter Einsatz von Vorrichtungen erzielt worden, in denen Suspenslons- !rulturen gezüchtet werden können. Bezüglich der großtechnischen Vermehrung von verankerungsabhängigen Säugetlerzelien hält sich jedoch der Fortschritt in sehr engen Grenzen. Bisher bekannte Methoden zum großtechnischen Vermehren von verankerungsabhänglgen Zellen basieren auf einer linearen Ausdehnung in kleinem Maßstabe durchgeführter Verfahren. In ZellkuJturanlagen wird eine große Anzahl von chargenweise betriebenen Reaktoren, die niedrige Ausbeuten bedingen, verwendet, und zwar In Form von Schalen, Flaschen, in Drehung versetzten Schläuchen und Flaschen. Es handelt sich dabei jeweils um eine einzelne Einheit oder ein isoliertes chargenwaise betriebenes Reaktionsgefäß, wobei jeweils getrennte Kontrollen erforderlich sind. Diese Kontrollen sind jedoch aufgrund wirtschaftlicher Überlegungen sehr primitiv. Veränderungen der Nährmittel wurden durch eine Veränderung des Mediums korrigiert, was eine Maßnahme bedeutet, die zwei Stufen erfordert, und zwar eine Entfernung des Mediums und einen Zusatz des Mediums. Da in einer Anlage mäßiger Größe Hunderte derartiger chargenweise betriebener Reaktionsgefäße eingesetzt werden, erfordert eine einfache Veränderung des Mediums Hunderte von Maßnahmen, die alle genau sowie unter exakt sterilen Bedingungen durchgeführt werden müssen. Fine Vlelstufenmaßnahme, wie eine Zellenübertragung oder -ernte trägt welter zur Verschärfung dieses Problems bei. Daher sind die Kosten einer derartigen Anlage, der Raumbedarf sowie der Personalaufwand erheblich.

Es gibt auch noch andere Methoden zur linearen Ausweitung von in kleinen Chargen betriebenen Kulturen, die bekannt geworden sind. Beispielsweise werden In der Literatur als Alternativen Plastikbeutel, aufeinanclergestapelte Platten, Spiralfilme, Glaskugelvermehrungseinrichtungen, künstliche Kapillaren sowie Mikroträger beschrieben. Von diesen Möglichkelten bieten die Mlkroträgersysteme bestimmte einzigartige Vorteile. Beispielsweise kann eine erhebliche Zunahme des erzielbaren Verhältnisses von Wachstumsoberfläche zu Gefäßvolumen (S/V) unter Einsatz von Mikroträgern gegenüber sowohl herkömmlichen als auch in neuerer Zeit entwlkkelten Methoden erzielt werden. Eine Erhöhung des erzlelbaren S/V-Verhältnisses ermöglicht die Konstruktion einer Vermehrungseinrichtung, die aus einer homogenen einzigen Einheit oder einer quasi homogenen Einheit besteht und chargenweise oder halbchargenwelse unter Erzielung hochvolumlger Durchsätze betrieben werden kann. Ein einziges mit einem Rührer versehenes Gefäß mit einer einfachen Steuerung für den pH- und pOj-Wert stellt eine homogene Umgebung für eine i;roße Anzahl von Zellen dar, so daß die Notwendigkeit der Verwendung teurer Inkubatoren, die einen erhebl:i:hen Raumbedarf bedingen, entfällt. Ferner wird die Gesamt-

zahl der Operationen, die pro Zelleneinheit erforderlich ist, drastisch herabgesetzt. Daher scheinen Mikroträger bezüglich der Kapitalinvestition, des Raumbedarfs sowie des Personalbedarfs bei der Herstellung von verankerungsabhängigen Zellen im Gegensatz zu den herkömmlichen Erzeugungsmethoden wirtschaftliche Vorteile zu bieten.

Mikroträger bieten ferner den Vorteil einer kontinuierlichen Verfahrensweise, da die Zellen in einer gesteuerten Umgebung wachsen. Daher bieten Mikroträger eine Möglichkeit, verankerungsabhängige Säugetierzellen unter festeingestellten Umgebungsbedingungen zu züchten, die zur Erzielung eines konstanten und optimalen Zellenwachstums gesteuert werden können.

Eines der bisher bekanntgewordenen vielversprechenden Mikroträgersysteme wird von van Wezel beschrieben und sieht die Verwendung von Diethylaminoethyl (DEAE)-substituierten Dextrankügelchen in einem mit einem Rührer versehenen Tank vor (A. L. van Wezel, »Growth of Cell Strains and Primary Cells on Microcarriers, in Homogeneous Culture«, Mature 216:64 (1967); D. van Hemert, D. G. Kilburn und A. L van Wezel »Homogeneous Cultivation of Animal Cells for the Production of Virus and Virus Products«, Biotechnol. Bioeng. 11:875 (1969) und A. L. van Wezef, »Microcarrier Cultures of Animal Cells«, Tissue Culture, Methods and Applications, P. F. Kruse und M. K. Patterson, Academic Press, New York, S. 372 (1973). Diese Kügelchen werden unter dem Warenzeichen DEAE-Sephadex A50 in den Handel gebracht.. Chemisch werden diese Kügelchen aus einer vernetzten Dextranmatrix mit Diethylaminoethylgruppen gebildet, die kovalent mit den Dextranketten verknüpft sind. Die im Handel erhältlichen DEAE-Sephades A50-Kügelchen besitzen eine Teilchengröße von 40 bis 120 μ und eine angenommene positive Ladungskapazität von ungefähr 5,4 mÄq/g des trockenen vernetzten Dextrans (wobei das Gewicht der verknüpften DEAE-Anteile unberücksichtigt ist). Andere Anionenaustauscherharze, wie DEAE-Sephadex A25, QAE-Sephadex A50 sowie QAE-Sephadex A25, sollen ebenfalls, wie von van Wezel angegeben wird, das Zellwachstum unterstützen.

Das von van Wezel vorgeschlagene System kombiniert viele Oberflächen mit beweglichen Oberflächen und gestattet innovative Zellmanipulationen, wobei darüber hinaus eine Übertragung in den technischen Maßstab möglich ist und Umgebungssteuerungen durchführbar sind. Trotz dieser Fähigkeiten werden diese Methoden noch nicht in merklichem Ausmaße ausgewertet, da Schwierigkeiten bei der Zellenerzeugung infolge bestimmter nachteiliger Effekte festgestellt werden, die durch die Kügelchen vei ursacht werden. Von diesen Nachteilen seien ein anfängliches Absterben von Zellen innerhalb eines hohen Prozentsatzes des Zellinokulums sowie ein unzureichendes Zellenwachstum sogar im Falle von solchen Zellen erwähnt, die verknüpft sind. Die Gründe für diese nachteiligen Effekte sind noch nicht restlos aufgeklärt; es wird jedoch vermutet, daß sie auf eine Toxizltät der Kügelchen oder auf eine Nährmitteladsorption zurückgehen (s. van Wezel), A. L. (1967), Nature 216:65-65; A. L. van Wezel (1973), Tissue Culture, Methods and Applications; P. R. Kruse und M. R. Patterson, S. 372-377, Academic Press, New York; P. van Hemert, D. G. Kilburn und A. L. van Wezel (1969), Biotechnol. Bioeng. 11:875-885, C. Horng und W. McLlmans (1975), Biotechnol. Bioeng. 17:713-732).

Es könnte sein, daß dl .· nachteiligen Wirkungen dieser Im Handel erhältlichen Ionenaustauscherharze auf Ihre Herstellungsmethode zurückgehen. Einige dieser Produktiansmethoden für Polyhydroxyrnaterlalien werden beispielsweise in den US-PS 32 77 025, 32 75 576, 30 42 667 und 32 08 994 beschrieben. Unabhängig von dem Grund sind die derzeit im Handel erhältlichen Materialien einfach für ein gutes Zellenwachstum einer erheblichen Vielzahl von Zelltypen nicht zufriedenstellend.
Eine Lösung zur Beseitigung der nachteiligen Wirkungen, die dann festgestellt werden, wenn man im Handel erhältliche Mikroträger für ein Zellenwachstum verwenden will, wird in der US-PS 40 36 693 beschrieben. Diese US-PS beschreibt ein Verfahren zur Behandlung dieser im Handel erhältlichen Ionenaustauscherharze mit mais kroretikularen Polyanionen, wie Carboxymethylcellulose. Diese Methode hat sich zwar als erfolgreich erwiesen, es wäre jedoch noch vorteilhafter, wenn die Kügelchen von Anfang an so hergestellt werden können, daß sie Eigenschaften besitzen, die für ein ausgezeichnetes Wachstum von verankerungsabhängigen Zellen geeignet sind.

Die Erfindung (vgl. Patentanspn-ch 1) beruht auf der Erkenntnis, daß die Ladungskapazität von Mikroträgern auf einen bestimmten Wert eingestellt oder innerhalb eines bestimmten Bereiches gesteuert werden muß, damit ein gutes Wachstum einer Vielzahl von verankerungsabhängigen Zelltypen bei vernünftigen Mlkroträgerkonzentrationen erzielt werden kann. Unter Einsatz dieser Kügelchen ist ein gutes Wachstum einer Vielzahl von verankerungsabhängigen Zellen möglich. Unter Verwendung dieser Mikroträgersysteme gezüchtete Zellen können gehärtet oder zur Herstellung von Tier- oder Pflanzenviren, Impfstoffen, Hormonen, Interferon oder anderen Zeilwachstumsnebenprodukten verwendet werden.
Ein Beispiel für die verbesserten Mikroträger sind solehe Mikroträger, die unter Verwendung von Polymeren mit daran sitzenden Hydroxygruppen erzeugt worden sind, beispielsweise vernetzte Dextrankügelchen. Diese Kügelchen können mit einer wäßrigen Lösung eines tertiären oder quaternären Amins, wie Diethylaminoethyl-Chlorid: Chlorid, sowie einem alkalischen Material, wie Natriumhydroxid, behandelt werden. Die spezifische Ladungskapazität der Kügelchen wird durch Veränderung der absoluten Mengen an Dextran, tertiärem Aminsalz und alkalischem Material gesteuert, wobei das Verhältnls dieser Materialien und/oder die Behandlungszeit und -temperatur ebenfalls variiert werden können.

Erfindungsgemäß hergestellte Mikroträger können In Kulturen eingesetzt werden, ohne daß dabei ein hoher Anteil an Zellen anfänglich verlorengeht, wie dies bisher bei der Verwendung von im Handel erhältlichen Mikroträgern festgestellt wurde. Ferner breiten sich gebundene Zellen auf den Kügelchen aus und wachsen zusammen, wöbe¹ extrem hohe Zellkonzentrationen In dem Suspensionsmedium erzielt werden. Die Konzentration von Mikroträgern in Suspension Ist nicht auf .sehr niedrige Gehalte beschränkt, so wie dies Im Falle der bisher bekannten Materialien festgestellt wurde. Das Zellenwachstum scheint nur durch Faktoren begrenzt zu werden, die nicht In jinem Zusammenhang mit den Mlkroträgern stehen. Aufgrund dieser Tatsachen läßt sieh eine erhebliche Zunahme der volumetrlschen Produktivität von Zellkulturen erzielen. Nunmehr Ist es möglich, die Vorteile auszuschöpfen, die bei der Verwendung von Mikroträgern beim Wachstum von Zellen möglich sind, insbesondere beim Züchten von verankerungsabhängigen Zellen.

Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zelEt

Flg. 1 eine graphische Darstellung, welche die Wachstumscharakteristiken normaler dlplolder menschlicher Embryolungenfibroblastzellen (HEL299) bei einer Mlkroträgerkonzentration von 2 g trockenem vernetztem Dextran/Liter sowohl im Falle von im Handel erhältlichen DEAF.-behandelten Dextranmikroträgern als auch erfindungsgemäß erzeugten DEAE-beharidelten Mikroträgern wiedergibt;

Fig. 2 eine graphische Darstellung, welche die Wachstumscharakteristiken von sowohl normalen dlplolden menschlichen Embryolungenfibroblastzellen (HEL299) als auch von sekundären Hühnerembryofibroblasten bei einer Mikroträgerkonzentration von 5 g trockenem vernetztem Dextran/Liter unter Verwendung der erfindungsgemäßen verbesserten DEAE-behandelten Mikroträger wiedergibt.

Unter dem Begriff »Mikroträger«, »Zellkulturmikroträger« sowie »Zellwachstumsmikroträger« sind kleine einzelne Teilchen zu verstehen, die für eine Zellenverknüpwelsen, mit einer wäßrigen Lösung eines alkalischen Materials und eines tertiären oder quaternären Amins behandelt werden. Die Kügelchen können zu Beginn in einem wäßrigen Medium ohne die anderen Bestandteile angequollen oder einfach mit einem wäßrigen Medium, das die erforderliche Base und das AmIn enthüll, kontaktiert werden. Diese Methode unter Einsatz von alkalischen Materlallen zum Katalysleren der Verknüpfung von positiv geladenen Aminogruppen mit den Hydroxylenthaltenden Polymeren wird in der US-PS 17 77 970 beschrieben.

Beispiele für geeignete Hydroxyl-enthaltende Polymere sind Polysaccharide, wie Dextran, Dextrin, Stärke, Cellulose, Polyglukose sowie substituierte Derivate dieser Substanzen. Bestimmte synthetische Polymere, wie Polyvinylalkohol, sowie hydroxysubstltulerte Acrylate oder Methacrylate, beispielsweise Hydroxyethylmethacrylat. sind ebenfalls geeignet. Dextran, insbesondere verhetztes Dextran in Form von kleinen Kügelchen, ist besonders

immer, sind Mikroträge; poröse Kügelchen, die aus Polymeren gebildet werden. Gewöhnlich verknüpfen sich die Zellen mit den äußeren Oberflächen derartiger Kügelchen und wachsen darauf.

Wie vorstehend erwähnt, wurde nunmehr gefunden, daß das Ausmaß der Ladungskapazität auf den Zellkulturmikroträgern auf einen bestimmten Bereich für ein ausreichendes Zellwachstum bei vernünftigen Mikroträgerkonzentrationen eingestellt und/oder gesteuert werden muß. Geeignete Arbeitsbereiche hängen von verschiedenen Faktoren ab, wie den jeweils zu züchtenden Zellen, der Art der Mikroträger, der Konzentration der Mikroträger sowie von anderen Kulturparametern, beispielsweise der Zusammensetzung des Mediums, ab. In allen Fällen liegt jedoch das Ausmaß der Ladungskapazität, das sich als geeignet erwiesen hat, deutlich unter dem Ausmaß, das auf im Handel erhältlichen Anionenaustauscherharzen 7ij finden iS!. wie sie bisher für Vii.kroträgerzellkulturen eingesetzt worden sind. Beispielsweise nimmt man an. daß die DEAE-Sephadex A50-Kügelchen, die von van Wezel vorgeschlagen wurden, eine Ladungskapazität von ungefähr 5,4 mÄq/g des trockenen und nichtbehandeiten (ohne DEAE) vernetzten Dextrans aufweisen. Im Gegensatz zu dieser relativ hohen Ladungskapazität wurden erfindungsgemäß Mikroträger hergestellt, die sich für ein gutes Zellenwachstum als geeignet erwiesen haben, die eine Ladungskapazität zwischen 0.1 und 4.5 mÄq/g der trockenen nichtbehandeiten Mikroträger aufweisen. Unterhalb 0,1 mÄq/g nimmt man an, daß die Zellen sich nur unter Schwierigkeiten mit den Mikroträgern verbinden. Oberhalb 4,5 mÄq/g tritt ein Verlust des Ausgangszelleninokulums auf, wobei sogar die überlebenden Zellen nicht gut wachsen, insbesondere bei relativ hohen Mikroträgerkonzentrationen.

Es wurde gefunden, daß zum Wachsen von normalen diploiden menschlichen Fibroblasten auf vernetzten Dextranmikroträgern ein günstiger Ladungskapazitätsbereich, der durch die DEAE-Gruppen zur Verfugung gestellt wird, ungefähr 1.0 bis ungefähr 2,8 mÄq/g des trockenen nichtbehandeiten vernetzten Dextrans beträgt. Dieser Bereich kann in Abhängigkeit von den verschiedenen Zelitypen oder Kulturbedingungen schwanken; er reicht gemäß der Erfindung von 0,1 bis 4,5 mÄq/g. Die optimalen Bedingungen können dabei durch Routineexperimente ermittelt werden.

Mikroträger mit der erforderlichen LedungskapazitSt können in der Weise hergestellt werden, daß Mikroträger aus Polymeren, die daran sitzende Hydroxylgruppen auf-

./It, WCPiM 3UCm niCut 20 güilSüg, uti 03 im iiäuuC! CruumlCri IiHu rC!titiV billig ist

und Mikroträger erzeugt, die ein ausgezeichnetes Zellwachstum fördern.

Jedes alkalische Material kann für die Reaktion eingesetzt werden. Die Alkalimetallhydroxide, wie Natrlum- oder Kaliumhydroxid, sind jedoch die zweckmäßigen alkalischen Substanzen. Entweder tertiäre oder quaternäre Amine sind geeignete Quellen für positiv geladene Gruppen, die mit den Hydroxy-enthaltenden Polymeren verknüpf, werden können. Besonders günstige Materlallen sind die chlor- oder bromsubstituierten tertiären Amine oder Salze davon, wie Dlethylamlnoethylchlorld. Dlethylanilnoethylbmmld, Dlmetliylamlnoethylchloild, Dlmethylamlnoethylbromld, Dleihylamlnomethylchlorld, Dlethylamlnomethylbromld, Dl-(hydroxyethyl)-aminoethylchlorld, Dl-(hydroxyethyl)-amlnoethylbromld, Dl-fhydroxyethyD-amlnomethylchlorld, Dl-(hydroxyethyD-aminomethylbromld, /Ϊ-Morphollnoethylethylchlor!d, Λ-Morphollnoethylbromidi fl-Mnrnhollnomethylchlorld, ß-Morphollnomethylbromld sowie Salze davon, belsplelswelse die Hydrochloride.

Ein breiter Bereich bezüglich der Reaktionstemperaturen und -zelten kann eingehalten werden. Am besten werden die Reaktionen bei Temperaturen zwischen ungefähr 18 und 65⁰C durchgeführt. Man kann jedoch auch andere Temperaturen einhalten. Die Reaktionskinetik hängt In einem erheblichen Ausmaß natürlich von der Reaktionstemperatur sowie der Reaktantenkonzentratlon ab. Sowohl die Zelt als auch die Temperatur beeinflussen die erzielte Endaustauschkapazität.

Der Grund dafür, daß die Ladungskapazität der Mikroträger beim Zellwachstum so kritisch ist, ist bisher noch nicht restlos aufgeklärt. Ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, kann man annehmen, daß die Ladungskapazität auf der Oberfläche bestimmte lokale Diskontlnultäten der mittleren Zusammensetzung bedingt, welche den hauptsächlichen steuernden Einfluß auf das Mlkroträgerkuiturzelienwachstum ausüben. Dies bedeutet jedoch nicht, daß auch andere Möglichkeiten existieren.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1
Herstellung von Zellkulturmikroträgern

Zellkulturmikroträger können In der folgenden Weise hergestellt werden: Trockene, nichtgeladene und vernetzte Dextrankügelchen werden zur Gewinnung von Teilchen mit einem Durchmesser von ungefähr 75 pm gesiebt. 1 g dieser Fraktion wird zu 10 ml destilliertem

Wasser gegeben, worauf die Kügelchen quellen gelassen werden. Eine zufriedenstellende Im Handel erhältliche Quelle für trockenes vernetztes Dextran Ist Sephadex G-50.

Eine wäßrige Lösung, die 0,01 Mol Dläthylamlnoäthylchlorld: Chlorid, zweimal aus Methylenchlorid umkrlstalllslert, und 0,015 Mol Natriumhydroxid enthält, wird in ilnem 10 ml Volumen hergestellt. Die wäßrige Lösung wird dann der Suspension aus gequollenen Dextrankügelchen zugesetzt, die dann kräftig In einem Schüttelwasserbad während einer Zeltspanne von 1 Stunde bei 60° C bewegt wird. Nach einer Stunde werden die Kügelchen von der Reaktionsmischung durch Filtration unter Verwendung eines Whatman-Fllterpaplers Nr. 595 abgetrennt und mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen.

Nach dieser Methode hergestellte Kügelchen enthalten ungefähr 2,0 mÄq Ladungskapazität pro Gramm trockenem, nlchtbehandeltem vernetztem Dextran. Diese Ladungskapazität kann durch Messen der Anlonenaustauscherfärilgkelt der Kügelchen In der folgenden Welse ermittelt werden: Die Kugelzubereitungen werden gründlich mit 0,1 η HCl zur Sättigung aller Austauscherstellen mit Cl"-Ionen gewaschen. Dann erfolgt ein Spülen mit 10-* η HCl zur Entfernung von nichtgebundenen Chlor-Idlonen. Anschließend werden die Kügelchen mit einer 10%lgen (Gewicht/Gewicht) Natriumsulfatlösung zur Gegenabsättlgung der Austauschstellen mit SO₄* gewaschen. Der Ablauf der Natriumsulfatwäsche wird gesammelt und enthält freigesetzte Chloridionen. Diese Lösung wird mit 1 m Silbernitrat unter Verwendung von verdünntem Kallumchromat als Indikator titriert.

Nach der Titration werden die Kügelchen gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gespült. In PBS suspendiert und Im Autoklaven behandelt. Diese Methode liefert hydratlslerte Kügelchen mit einem Durchmesser von ungefähr 120 bis 200 μιη, die ungefähr 2,0 mÄq Ladungskapazität pro g trockenem, nlchtbehandeltem und vernetztem Dextran tragen.

Beispiel 2

Wachstum von verankerungsabhängigen Zellen mit erfindungsgemäßen Zellkulturmlkroträgern Im Gegensatz zu im Handel erhältlichem lonenaustauscherharz

Alle Zellen werden in einem modifizierten Dulbecco-Eagle-Medlum gezüchtet. Zum Wachsenlassen von normalen dlplolden Flbroblasten wird das Medium mit 10% Kälberfötusserum ergänzt. Zum Wachsenlassen von primären und sekundären Hühnerfibroblasten wird das Medium mit \% Hühnerserum, 1% Kälberserum und 2% Tryptosephosphatbrühe ergänzt. Die Ansätze werden auf 100-mm-Kunststoffschalen behandelt.

Primäre Hühnerembryofibroblasten werden durch Zerkleinern und anschließendes Trypsinisieren von 10 Tage alten Embryos hergestellt. Sekundäre Hühnerembryofibroblasten werden am ersten Tag des primären Zusammenlaufens durch Trypsinisierung hergestellt. Für in Kunststoffschalen gezüchtete Zellen beträgt die Verdoppelungszeit ungefähr 20 Stunden.

Es wurden menschliche Fibroblasten, die auf Embryolungen zurückgehen, verwendet. Diese Zellen besitzen eine Verdoppelungszeit von 19 Stunden in Kunststoffschalen.

Mikroträgerkulturen werden dadurch initiiert, daß einfach die Zellen und die Kügelchen in einer gerührten Kultur vereinigt werden. 100 ml Kulturvolumina in 250-ml-GIasflaschen (64 cm Durchmesser), die mit einem magnetisch angetriebenen, mit Teflon überzogenen Rührstab mit einer Abmessung von 4,5 cm ausgestattet sind, werden verwendet. Die Ruhrgeschwindigkeit beträgt ungefähr 90 Upm. Es werden direkte Proben aus den Kulturen entnommen. Die Proben werden mikroskopisch untersucht und photographlert. Die Zellen werden durch Zählen der Keime numeriert, wobei eine Modifizierung der Methode von Sanford et al. (Sanford, K. K., Earle, W. R., Evans, V. J., Waltz, H. K., und Shannon,

J. E. [1951] J. Nat. Cancer Inst., U: 773), wiesle von van Wezel beschrieben wird (van Wezel, A. L. [1973]). angewendet wird. Tissue Culture, Methods and Applications. Kruse, P. F. und Patterson, M. R., S. 372 bis 377, Academic Press, New York.

"ι Kügelchen mit daran gebundenen Zellen werden von dem Kulturmedium In der Welse abgetrennt, daß man die Kügelchen bei 1 g während einer Zeltspanne von wenigen Minuten absetzen läßt, und dann die überstehende Flüssigkeit ahsaiigt. dirs« Methode erleichtert erheblich den Ersatz des Mediums sowie die Abtrennung von Zellen von den Mlkroträgem nach der Trypsinisierung.

Im Handel erhältliches DEAE Sephadex A-50 wird als Mikroträger für die dlplolden menschlichen Flbroblasten verwendet und mit Trägern verglichen, die gemäß Beispiel 1 synthetisiert und titriert worden sind. Im Falle beider Kügelchentypen beträgt die Trägerkonzentration 2 g des trockenen nlchtbehandelten und vernetzten Dextrans pro Liter. Die Ladungskapazität von DEAE Sephadex A-50 beträgt 5,4 mÄq/g des trockenen vernetzten Dextrans, während diejenige der frisch synthetisierten Kügelchen zu 2,0 mÄq/g ermittelt wird. Die Ergebnisse gehen aus der Flg. 1 hervor.

Im Falle dieses Zelltyps wird der Verlust an ursprüng-Hchem Inoculum auf A-50 Mlkroträgem festgehalten, während die Flbroblasten sich verknüpfen, vermehren und auf den Mlkroträgem gemäß vorliegender Erfindung In sechs Tagen die Konfluenz erreichen. Dieses Verhalten stimmt mit dem angegebenen Verhalten dieses ZeI-lentyps auf Standardplatten überein. Wie aus der Flg. 1 ersichtlich ist, beträgt die Endzellendichte, die mit den neuen Mlkroträgem bei 2 g des trockenen vernetzten Dextrans/Llter erzielt wird, 1,2 χ 10' Zellen/ml.

Bei Kulturen, welche die neuen Träger enthalten, sind weder ein anfänglicher Zeitverlust noch eine Inhibierung bezüglich des Erreichens des Zusammenlaufens festzustellen. Darüber hinaus wachsen die Kulturen, was noch wichtiger Ist, normal bei höheren Mikroträgerkonzentratlonen. Beispielsweise zeigt die Flg. 2 wie menschliche Fibroblasten sowie sekundäre Hühnerembryofibroblasten die Sättigungskonzentrationen nahe 4x10' Zellen/ml erreichen, wenn 5 g trockenes vernetztes Dextran pro Liter Im Falle der neuen Träger mit einer Ladungskapazität von 2,0 mÄq/g Dextran verwendet werden. Wie ersichtlich, tritt sogar bei dieser relativ hohen Mikroträgerkonzentration kein signifikanter Inokulumverlust auf.

Sekundäre Hühnerembryofibroblasten werden ebenfalls

bei einer Mikroträgerkonzentration von 10 g/l gezüchtet.

Unter Einhaltung der vorstehend beschriebenen Bedin-

gungen wird eine Sättigungskonzentration von 6 χ 10' Zellen/ml erzielt. Setzt man dem Medium ein weiteres Prozent Kälberfötusserum zu, dann wird eine Sättigungskonzentration von 8 χ 10' Zellen/ml erzielt. Es wird kein signifikanter Zelleninokulumverlust festgestellt.

Primäre Hühnerembryofibroblasten werden bei einer Mikroträgerkonzentration von 5 und 10 g/l gezüchtet. Die Wachstumseigenschaften sind ähnlich denjenigen der sekundären Hühnerfibroblasten. obwohl leichte Ino-

kulumverluste und etwas längere Verzögerungszelten festgestellt werden.

Es wurden ferner Versuche unternommen, sekundäre Hühnerembryoflbroblasten unter Bedingungen zu züchten, die den vorstehend eingehaltenen ähnlich sind, mit der Ausnahme, daß die DFAE Sephadex A-50 Mikroträger mit Konzentrationen von 1 und 5 g/l verwendet werden. Es wird kein Zellenwachstum festgestellt und ein signifikanter Inokulumverlust beobachtet.

Beispiel 3

Herstellung von Zellkulturmlkroträgern mit wechselnden Reaktantenmengen

Mlkroträgerchargen werden durch Auflösen von Dläthylamlnoäthyl-Chlorld : Chlorid und Natriumhydroxid In 20 ml destilliertem Wasser hergestellt. Die Lösung wird dann über trockene Sephadex G-50-Kügelchen gegossen, worauf die Kügelchen auf einen sich hin- und herbewegenden mit Wasser gefüllten Schüttler (Temperatur 60° C) gebracht werden. Ein Teil der Kugelchargen wird mit einer Lösung behandelt, die 0,01 Mol des Amins und 0,015 Mol Natriumhydroxid enthält, während eine andere Portion mit einer Lösung behandelt wird, die 0,03 Mol des Amins und 0,045 Mol Natriumhydroxid enthält. Die Reaktionszelt wird zur Erzielung von verschiedenen mÄq/g Innerhalb einer jeden Charge variiert.

Dlplolde menschliche Flbroblasten werden In Suspenslonskulturen bei einer Mlkroträgerkonzentratlon von 5,0 g des trockenen nlchtbehandelten vernetzten Dextrans pro Liter nach den In Beispiel 2 beschriebenen Methoden gezüchtet, wobei Mikroträger verwendet werden, die wechselnde mÄq/g aufweisen und aus jeder Charge ausgewählt werden. Anschließend wird die Produktivität (10' gezüchtete Zellen/Llter-Stunde) berechnet und In Abhängigkeit von mÄq/g für jede Kugelcharge, die In der vorstehend beschriebenen Welse hergestellt worden Ist, aufgetragen. Kurven, die unter Verwendung von Werten aus beiddeeen Versuchen aufgetragen werden, besitzen eine ähnliche Form, und zwar Im allgemeinen eine Glockenform, die Kurve aus den Chargen, die mit Reaktanten in höheren Konzentrationen behandelt worden sind, weist jedoch einen etwas stelleren Anstieg und Abfall auf. Aus jeder Charge werden Träger erhalten, die ein ausgezeichnetes Zellenwachstum bewirken.

Beispiel 4

Herstellung von Zellkulturmikroträgem unter Einhaltung wechselnder Verhältnisse Amin/Alkali

Dieses Beispiel erläutert weitere Veränderungen der Ladungskapazität, die durch Veränderung der Verhältnisse DEAE Chlorid: Chlorid/NaOH erzielt werden. Zur Durchführung dieses Beispiels wird die in Beispiel 3 beschriebene Arbeitsweise eingehalten, mit der Ausnahme, daß ein breiter Konzentrationsbereich an Natriumhydroxid verwendet wird, während die Konzentration an Diäthylaminoäthylchiorid: Chlorid bei 0,01 Mol pro 20 ml gehalten wird. Die Konzentrationen an Natriumhydroxid betragen 0,01, 0,011, 0,012, 0,013, 0,014, 0,015, 0,02, 0,03, 0,05, 0,75 und 0,10 Mol pro 20 ml.

Nach 1,25 Stunden bei 60° C werden die Werte von mÄg in Abhängigkeit von der Konzentration an Natriumhydroxid aufgetragen. Aus der graphischen Darstellung ersieht man, daß Natriumhydroxidkonzentrationen von weniger als ungefähr 0,01 keine feststellbare Ladungskapazität erzeugen. Die Ladungskapazität steigt jedoch schnell mit einer Zunahme der Konzentration an und erreicht ein Maximum von etwa 2,3 mÄq/g des

trockenen vernetzten Dextrans bei einer Konzentration von ungefähr 0,014 Mol Natriumhydroxid. Die Ladungskapazität nimmt dann praktisch linear bis auf einen Wert von ungefähr 1,1 mÄq/g bei einer Natriumhydroxidkonzentration von ungefähr 0,10 Mol ab. Eine Veränderung der Reaktionskinetik erfolgt daher, wenn das Verhältnis DEAE-Chlorld : Chlorid zu Natriumhydroxid bei einer konstanten Konzentration von DEAE-Chlorld : Chlorid und vernetztem Dextran variiert wird.

Beispiel 5

Herstellung von menschlichem Interferon in Zellen, die auf verbesserten Mlkroträgern gezüchtet worden sind

Nachfolgend wird die Fähigkeit von auf Mlkroträgern gezüchteten Zellen zur Gewinnung von menschlichem Interferon beschrieben. Die für die Herstellung von menschlichem Interferon eingesetzten Zellen sind normale diplolde menschliche Vorhautflbroblasten (FS-4). Diese Flbroblasten werden In Mlkroträgerkulturen unter Anwendung der In Beispiel 2 beschriebenen Methode gezüchtet. Gemäß Beispiel 1 hergestellte und titrierte Mikroträger werden In einer Konzentration von 5 g trokkenem vernetztem Dextran/I verwendet. Das für das Kulturwachstum verwendete Medium besteht aus DMEM, ergänzt mit 10% Kälberfötusserum.

Nach 8 bis 10 Tagen hört das Wachstum der Kulturen auf. Zu diesem Zeltpunkt wird das Wachstumsmedium entfernt. Die Kulturen werden ein- bis viermal mit 100 ml serumfreien DMEM gewaschen. Die Zellen sind dann für die Interferonlnduktlon fertig. Diese erfolgt durch Zugabe von 50 ml serumfreien DMEM-Medlum, das 50 μg/ml Cyclohexamld sowie wechselnde Mengen Poly I · Poly C-Induktlonsmittel enthält, zu den Kulturen. Nach 4 Stunden wird Actinomycln D den Kulturen zur Einstellung einer Endkonzentratlon von 1 ug/ml zugesetzt.

5 Stunden nach dem Einsetzen der Induktion wird das indufctionsmedium dekantiert, worauf die Kuiiuren dreibis viermal mit 100 ml warmem serumfreien DMEM gewaschen werden. Die Kulturen werden mit 50 ml DMEM aufgefrischt, das 0,5% menschliches Plasmaprotein enthält. Die Kulturen werden unter Stanuardbedlngungen während weiterer 18 Stunden bebrütet. Zu diesem Zeltpunkt werden die Kulturen dekantiert, worauf das dekantierte Medium auf seine Interferonaktivität untersucht wird. Die Interferonaktivität wird in der Welse ermittelt, daß das 50% Ausmaß des Zellenschutzes von Proben und Standardlösungen von FS-4-Fibroblasten J₀ ermittelt wird, die mit Vesicular Stomatitis Viren (VSV), Indiana-Stamm, herausgefordert worden sind. Die Ergebnisse der Interferonerzeugungsversuche sind nachfolgend tabellarisch zusammengefaßt:

Induktionsmittel konzentration, μ§/ΓΠΐ	Zellenkonzentration während der Erzeugung, Zellen/ml	Interferon, U/10⁶ Zellen
4	2,0 X 10«	39
5	2,6 X 10⁶	378
25	2,6 X 10⁶	886
50	2,0 X 10⁶	-5 000

Diese Werte stammen aus jeweils getrennten Versuchen und sollen nicht irgendeine Beziehung zu der Induktionsmittelkonzentration wiedergeben.

Beispiel 6

Wachstum von Zellen auf d*-n Zellkulturmikroträgern zur Erzeugung von Viren

Die Fähigkeit von Mlkroträger-gezüciueten Zellen zur Erzeugung eines Virus wird nachfolgend beschrieben. Primäre und sekundäre Hühnerembryoflbroblasten werden In einer Mlkroträgerkultur nach der In Beispiel 2 beschriebenen Methode gezüchtet, wobei die primären Zellen bei einer Mlkroträgerkonzentratlon von 10 g/l und die sekundären Zellen bei einer Mikroträgerkonzentration von 5 g/l gezüchtet werden. Zur Initiierung der Viruserzeugung wird das Wachstumsmedium entfernt, worauf die Kulturen zweimal mit 100 ml serumfreien DMEM gewaschen werden. Die Infizierung der Zellen mit Slndbls-Virus erfolgt in 50 ml DMEM, ergänzt mit 1% Kälberserum, 2% Tryptosephosphatbrühe sowie soviel Slndbls-Vlren, die einem MOI-Wert von 0,05 (Multlpllzltät der Infektion) entsprechen.

Das Virus wirH 24 Stunden nach der Infektion durch Sammeln der Kulturbrühe, Klären durch geringes Zentrifugleren and Einfrieren der überstehenden Flüssigkeit gehärtet. Die Virusproduktion wird durch Plattenbildung in einem Feld sekundärer Hühnerflbroblasten untersucht. Die Ergebnisse der Infektion dieser Mlkroträgerkulturen sind folgende:

Sekundär 4,0 X 10⁶
Primär 1,4 x 10⁶
Primär 6,0 x 10⁶

8,4 X 10« 2 100
2,3 x 10¹⁰ 16 000
2.6X10¹⁰ 5 000

telnislert und für eine weitere Analyse konzentrle.t werden.

Eine aus 50 Rollflaschen bestehende Kultur enthält ungefähr 10' Zellen. Diese werden mit ungefähr 1 1 Vlruslnokulum (3 χ 10' plattenbildende Einheiten pro ml) infiziert. Dies bedingt eine nominelle Multiplizltät der Infektion von 1 bis 3. Die Infizierten Zellen ergeben 5 bis 20 Nanogramm virusspezifische DNA.

Eine einfachere Methode wurde unter Verwendung

ίο von erflndungsgemäßen Mlkroträgern entwickelt. Line Kultur, die 10 g Kügelchen In 1 I Wachstumsmedium enthält, wird verwendet. Nach dem Erreichen der Konfluenz werden die 10'-Zellen auf den Kügelchen In der Welse Infiziert, daß man die Kügelchen absitzen läßt und

is das Medium durch 1 I Vlruslnokulum ersetzt. Zur Extraktion werden die Zellen auf den Kügelchen mit Puffer gewaschen und dann In SDS enthaltenden Puffer gegeben. Nach der Copreclpltatlon der DNA mit hohem Molekulargewicht mit dem Detergens wird der Nlederschlag zusammen mit den Kügeichen abzemrifugiert und eine überstehende Flüssigkeit für eine weitere Analyse extrahiert. Die Ausbeute an Virus-DNA ist vergleichbar mit derjenigen, die In einer Rollflaschenkultur erzielt wird, wobei der Arbeltsaufwand 5 bis 10% des Aufwandes beträgt, der Im Falle der Rollflaschenkultur erforderlich Ist.

Zellentyp Gesamtkonzentr-tion PFU/ml PFU/Zelle zur Herstellung
(Zellen/ml)

35

Die Viruserzeugung wird ferner für die folgenden -to Kombinationen aus Viren und Zellen auf Mlkroträgern ermittelt: Polio/Wl-38, Moloney MuLV/CI-1 Maus und VSV/Hühnerembryoflbroblasten.

45

Beispiel 7

Vergleichswachstum von Zellen In Rollflaschen unter Einsatz der Zellkulturmikroträger zur Herstellung von Mäuseleukämievirus-Provlrus-DNA

50

Die mit reverser Transcriptase gebildete DNA von Moloney Leukämievirus (M-MuLV) wird nach einer Infektion von JLS-V 9-Zellen aus Mäusemarkknochen untersucht.

Eine Methode besteht darin. Zellen In gerollten Flasehen zu züchten. Die Zellen werden in einer Rollflaschenkultur gezüchtet, worauf das Medium entfernt und das Virusinokulum In die Flaschen eingeführt wird. Kurz danach werden die Kulturen mit frischem Medium versetzt und 8 bis 16 Stunden später für eine evtl. Reinigung von Virus-DNA extrahiert. Die Kulturen werden mit frischem Puffer gewaschen und die Zellen mit einer Lösung lysiert, die das Detergens Natriumdodecylsulfat enthält. Die abschließende Abkühlung des Lysats sowie die Zugabe von Salz (1 Molar) verursacht eine Coprecipitation des Detergenses mit DNA mit hohem Molekulargewicht. Die DNA mit niederem Molekulargewicht, die in der überstehenden Flüssigkeit zurückbleibt, kann entpro-Beisplel 8

Herstellung von Zellkulturmikroträgern mit
Dlmethylamlnoäthyl-Ladungsgruppen

Ein geeigneter Mikroträger wird In der Welse erzeugt, daß ein anderer Austauscheranteil mit der Dextranmatrlx gemäß Beispiel 1 verknüpft wird. Dlmethylamlnoäthylgruppen (DMAE) werden mit einer Dextranmatrlx nach der folgenden Methode verknüpft: 1 g Dextrankügelchen (Pharmacia G-50) mit einem Durchmesser von 50 bis 75 pm Im trockenen Zustand werden zu 10 ml destilliertem Wasser gegeben, worauf man die Kügelchen anquellen läßt. Eine wäßrige Lösung, die 0,01 Mol Dlmethylamlnoäthylchlorld: Chlorid und 0,015 Mol Natriumhydroxid enthält, wird mit einem Volumen von 10 ml hergestellt. Diese wäßrige Lösung wird den gequollenen Dextrankügelchen zugesetzt. Die erhaltene Suspension wird dann kräftig während einer Zeltspanne von 1 Stunde bei 60° C bewegt. Nach der Umsetzung wird die Kügelchenmasse wie In Beispiel 1 titriert. Diese Reaktion bindet 1,0 mÄq Dlmethylaminoäthyl mit der Dextranmasse. Zur Erzeugung von Zellkulturmikroträgern mit größerem Substitutionsgrad wird die vorstehend beschriebene Reaktion durchgeführt, worauf die Kugelmasse gründlich mit Wasser gewaschen wird. Nachdem der Wasserüberschuß abfiltriert worden ist, wird die Kügelchenmasse gewogen, um die Menge an Wasser, die von der Kügelchenmasse festgehalten wird, zu bestimmen. Diese Masse wird dann mit der entsprechenden Menge an frischen Reagentien (d. h. DMAE-CL: CL und NaOH) in der Weise versetzt, daß die Endkonzentration an DMAE und NaOH in diesen darauffolgenden Reaktionsmischungen Identisch mit der anfangs eingehaltenen ist.

Auf diese Weise wird eine Reihe von Zellkulturmlicroträgern mit 1,0, 2,0, 2,5 und 3,5 mÄq DMAE/g nichtumgesetztem Dextran hergestellt. Zellen werden In einem Zellkulturmlkroträger (5 g/l) mit diesen Zellkulturmikroträgern nach der Methode gemäß Beispiel 2 gezüchtet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

Substitutionsgrad, Zellenausbreitung
mÄq/g

Nettowachstum

1,0
2,0
24
3,2

Wie erwartet, steht das Zellenwachstum in einer Beziehung zu dem Substitutionsgrad mit ladungstragenden Gruppen. Bei einem zu hohen Substitutionsgrad erfolgt kein Zellenwachstum, obwohl eine Verknüpfung und eine Ausbreitung erfolgt. Bei einem zu niedrigen Substitutionsgrad reicht das Haften der Zellen an die Oberfläche nicht aus, um ein ausreichendes Ausbreiten und Wachstum zu ermöglichen.

Beispiel 9

Herstellung von Zellkulturmikroträgern mit positiv
geladenen Phosphoniumgruppen

Zellkukurmikroträger werden ferner unter Einsatz von N'ichtaminaustauschergruppen in der folgenden Weise hergestellt: 1 g trockener Dextrankügelchen werden hergestellt und mit Wasser wie in Beispiel 1 gequollen. Den gequollenen Kügelchen werden 5 ml einer gesattigten wäßrigen Losung von Triäthyl-(äthylbromid)-phosphonium (TEP)

C2H5V y CjHj

C2H5

und 5 ml einer 3 molaren Lösung von Natriumhydroxid zugesetzt. Diese Aufschlämmung wird bei 65° C zur Umsetzung gebracht. Eine Reihe Zellkulturmikroträger wird mit 1,1,1,7 und 2,9 mÄq/g hergestellt Die Zellkulturmikroträger mit 1,1 mÄq/g werden durch Umsetzung unter den vorstehend angegebenen Bedingungen während einer Zeitspanne von 4 Minuten hergestellt. Der 1,7 mÄq/g-Zellkulturmikroträger wird während einer Zeitspanne von 1 Stunde und die 2,9 mÄq/g-Zellkulturmikroträger aufeinanderfolgend dreimal wie in Beispiel 7 umgesetzt. Eine Mikroträgerzellenkultur mit 5 g/l wird für jeden dieser Träger mit einem kontinuierlichen Zellentyp, und zwar JLS-V9, hergestellt, worauf ein Vergleich zu dem Wachstum dieser Zellen an DEAE-Mikroträgern durchgeführt wird, die v/ie in Beispiel 3 hergestellt worden sind. Die Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle hervor.

20 Zeüenverknüpfung
und Ausbreitung

Nettowachstum

25

DEAE
0,9
1,7
3,8

1,1
U
2,9

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Zellkulturmlkioträger mit positiv geladenen chemischen Anteilen, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Menge an positiv geladenen chemischen Anteilen eine Ladungskapazität von 0,1 bis 4,5 mÄq/g der trockenen unbehandelten Mikroträger zur Verfügung steht.

2. Zellkultunnikroträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er aus vernetzten Dextrankügelchen mit einer solchen Menge daran befindlicher positiv geladener Gruppen besteht, daß eine Ladungskapazität zwischen 0,1 und 4,5 mÄq/g der trockenen vernetzten Dextrankügelchen vorliegt.

3. Zeilkulturmikrotrager nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die positiv geladenen Gruppen aus Dläthylaminoäthylgruppen bestehen.

4. Zeilkulturmikrotrager nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Reaktionsprodukt aus vernetzten Dexiruikügelchen und einer wäßrigen Lösung eines tertiäres oder quaternären Amins und einer Base Ist, wobei die wäßrige Lösung eine solche Menge an AmIn und Base in einem solchen Verhältnis enthält, daß die Mikroträger eine Ladungskapazität von 0,1 bis 4,5 mÄq/g des trockenen Dextrans aufweisen.

5. Zeilkulturmikrotrager nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das AmIn aus Diäthylaminoäthyl besteht.

6. ZellkuIturnUkroträger nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Base Natriumhydroxid ist.