DE2759579C2

DE2759579C2 - Cell culture microcarrier

Info

Publication number: DE2759579C2
Application number: DE2759579A
Authority: DE
Inventors: David W. Dr. Somerville Mass. Levine; William G. Cambridge Mass. Thilly; Daniel I.C. Belmont Mass. Wang; Jason S. Toledo Ohio Wong
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1976-11-11
Filing date: 1977-11-08
Publication date: 1983-08-25
Also published as: JPS5735953B2; AU508398B2; SE7712700L; BE860721A; NL177926B; SE417108B; JPS575514B2; FI773377A; JPS5699789A; NL177926C; FI60407C; BR7707551A; SE460906B; JPS5614270B2; DE2749989A1; CH615947A5; ZA776251B; AU3049177A; JPS5362889A; CA1063050A

Description

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Erfindungsgegenstand ist der Im Patentanspruch 1 angegebene Zeilkulturmikrotrager. Die Patentansprüche bis 6 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.The subject of the invention is in claim 1 indicated cell culture microcarriers. The claims to 6 name embodiments of the invention.

Das Wachsenlassen von Säugetierzellen Ist sowohl Im Labor- als auch im Industriemaßstab wichtig. Im Labormaßstab Ist oft der begrenzende Faktor für eine Zellen- oder Virenuntersuchung die Menge des Rohmaterials, die für die Untersuchung zur Verfügung steht. In industriellem Maßstabe werden große Anstrengungen unternommen, um Pharmazeuttka auf der Grundlage von Säugetierzellprodukten zu entwickeln. Es handelt sich dabei hauptsächlich um Impfstoffe für menschliche oder tierische Viren, jedoch auch um menschliche Wachstumshormone sowie andere Körperhormone sowie Biochemlkalien für medizinische Anwendungszwecke.Mammalian cell growth is both Im Laboratory as well as industrial scale important. On a laboratory scale, the limiting factor for a cellular or virus scan the amount of raw material available for scan. In industrial To scale up, great efforts are being made to make Pharmazeuttka based on mammalian cell products to develop. These are mainly human or animal vaccines Viruses, but also human growth hormones and other body hormones and biochemicals for medical purposes.

Einige Säugetierzelltypen wurden für ein Wachstum in Suspensionskulturen adaptiert. Beispiele für derartige Zelltypen sind HeLa (menschlich), BHK (Babyhamsternieren) sowie L-Zellen (Mäuse). Derartige Zellen weisen im allgemeinen nicht normal genetische Komplemente auf, d. h. zu viele oder zu wenige Chromosomen oder abnormale Chromosomen. Oft erzeugen diese Zellen einen Tumor nach einer Einspritzung In ein Tier der entsprechenden Spezies.Some mammalian cell types were designed to grow in Suspension cultures adapted. Examples of such cell types are HeLa (human), BHK (baby hamster kidneys) and L cells (mice). Such cells generally do not have normal genetic complements on, d. H. too many or too few chromosomes, or abnormal chromosomes. Often times these produce cells a tumor after an injection into an animal of the corresponding Species.

Andere Säugetierzelltypen konnten bisher noch nicht für ein Züchten in einer Suspensionskultur adaptiert werden. Sie wachsen nur, wenn sie mit einer geeigneten Oberfläche verknüpft werden. Derartige Zellentypen werden Im allgemeinen als »verankerungsabhängig« bezeich-Other mammalian cell types have not yet been able to be adapted for growing in a suspension culture. They only grow when used with a suitable one Surface can be linked. Such cell types are generally referred to as "anchorage dependent".

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65 net. Erwähnt selen 3T3-Mäusefibroblasten, Mäusemarkknochen, Epithelzellen, von Mäusen übeitragene Leukämlevlrus-erzeugende Stämme von Mäusefibroblasten, primäre und sekundäre Hühnerflbroblasten, WI-38-Menschenflbroblastzellen sowie normale menschliche Embryolungenflbroblastzellen (HEL299, ATCC # CCL137). Einige verankerungsabhängige Zelles wurden gezüchtet, die Tumore verursachen, es konnten jedoch auch andere gezüchtet werden, die keinen Tumor bedingen. Auch können einige verankerungsabhängige Zellen, w^j WI-38 und HEL299, gezüchtet werden, die genetisch normal sind. 65 net. Mentioned selenium 3T3 mouse fibroblasts, mouse marrow bones, epithelial cells, mouse-contributing leukemia leve-producing strains of mouse fibroblasts, primary and secondary chicken fibroblasts, WI-38 human flbroblast cells, and normal human embryonic lung flbroblast cells, and AT299137CC, # HEL299137CC. Some anchorage dependent cells have been grown that cause tumors, but others that do not cause tumors could also be grown. Also, some anchorage dependent cells such as WI-38 and HEL299 can be grown that are genetically normal.

Beträchtliche Fortschritte sind bei der Säugetierzellenvermehrung In großtechnischen Maßstabe unter Einsatz von Vorrichtungen erzielt worden, in denen Suspenslons- !rulturen gezüchtet werden können. Bezüglich der großtechnischen Vermehrung von verankerungsabhängigen Säugetlerzelien hält sich jedoch der Fortschritt in sehr engen Grenzen. Bisher bekannte Methoden zum großtechnischen Vermehren von verankerungsabhänglgen Zellen basieren auf einer linearen Ausdehnung in kleinem Maßstabe durchgeführter Verfahren. In ZellkuJturanlagen wird eine große Anzahl von chargenweise betriebenen Reaktoren, die niedrige Ausbeuten bedingen, verwendet, und zwar In Form von Schalen, Flaschen, in Drehung versetzten Schläuchen und Flaschen. Es handelt sich dabei jeweils um eine einzelne Einheit oder ein isoliertes chargenwaise betriebenes Reaktionsgefäß, wobei jeweils getrennte Kontrollen erforderlich sind. Diese Kontrollen sind jedoch aufgrund wirtschaftlicher Überlegungen sehr primitiv. Veränderungen der Nährmittel wurden durch eine Veränderung des Mediums korrigiert, was eine Maßnahme bedeutet, die zwei Stufen erfordert, und zwar eine Entfernung des Mediums und einen Zusatz des Mediums. Da in einer Anlage mäßiger Größe Hunderte derartiger chargenweise betriebener Reaktionsgefäße eingesetzt werden, erfordert eine einfache Veränderung des Mediums Hunderte von Maßnahmen, die alle genau sowie unter exakt sterilen Bedingungen durchgeführt werden müssen. Fine Vlelstufenmaßnahme, wie eine Zellenübertragung oder -ernte trägt welter zur Verschärfung dieses Problems bei. Daher sind die Kosten einer derartigen Anlage, der Raumbedarf sowie der Personalaufwand erheblich.Considerable advances are being made in large-scale mammalian cell multiplication has been achieved by devices in which Suspenslons-! rulturen can be grown. Regarding the large-scale Propagation of anchorage-dependent mammalian cells, however, keeps progress in very high narrow limits. Previously known methods for the large-scale increase of anchoring dependencies Cells are based on a linear expansion of small-scale procedures. In cell culture systems a large number of batch-operated reactors, which require low yields, are used, in the form of bowls, bottles, rotated hoses and bottles. It deals each around a single unit or an isolated batch-operated reaction vessel, separate controls are required in each case. However, these controls are more economical Considerations very primitive. Changes in nutrients were made by changing the medium corrected, which means an action that requires two stages, namely a removal of the medium and an addition of the medium. Because there are hundreds of such batch-wise operated in a plant of moderate size Reaction vessels are used, a simple change of the medium requires hundreds of measures, all of which must be carried out precisely and under precisely sterile conditions. Fine full-step measure, like cell transfer or harvest, welter contributes to the exacerbation of this problem. Hence the The costs of such a system, the space requirements and the personnel expenditure are considerable.

Es gibt auch noch andere Methoden zur linearen Ausweitung von in kleinen Chargen betriebenen Kulturen, die bekannt geworden sind. Beispielsweise werden In der Literatur als Alternativen Plastikbeutel, aufeinanclergestapelte Platten, Spiralfilme, Glaskugelvermehrungseinrichtungen, künstliche Kapillaren sowie Mikroträger beschrieben. Von diesen Möglichkelten bieten die Mlkroträgersysteme bestimmte einzigartige Vorteile. Beispielsweise kann eine erhebliche Zunahme des erzielbaren Verhältnisses von Wachstumsoberfläche zu Gefäßvolumen (S/V) unter Einsatz von Mikroträgern gegenüber sowohl herkömmlichen als auch in neuerer Zeit entwlkkelten Methoden erzielt werden. Eine Erhöhung des erzlelbaren S/V-Verhältnisses ermöglicht die Konstruktion einer Vermehrungseinrichtung, die aus einer homogenen einzigen Einheit oder einer quasi homogenen Einheit besteht und chargenweise oder halbchargenwelse unter Erzielung hochvolumlger Durchsätze betrieben werden kann. Ein einziges mit einem Rührer versehenes Gefäß mit einer einfachen Steuerung für den pH- und pOj-Wert stellt eine homogene Umgebung für eine i;roße Anzahl von Zellen dar, so daß die Notwendigkeit der Verwendung teurer Inkubatoren, die einen erhebl:i:hen Raumbedarf bedingen, entfällt. Ferner wird die Gesamt-There are other methods of linear expansion of small batch crops as well, who have become known. For example, plastic bags stacked on top of each other are used as alternatives in the literature Plates, spiral films, glass ball augmentation devices, artificial capillaries and microcarriers described. The milk carrier systems offer these possibilities certain unique advantages. For example, there can be a significant increase in the achievable Ratio of growth surface to vessel volume (S / V) using microcarriers versus both traditional and more recently developed ones Methods are achieved. The construction enables an increase in the achievable S / V ratio a propagation device consisting of a homogeneous single unit or a quasi-homogeneous unit exists and operated in batches or semi-batches with high volume throughputs can be. A single vessel equipped with a stirrer with simple controls for pH and pOj value represents a homogeneous environment for a large Number of cells, thus eliminating the need to use expensive incubators, which add a: i: hen Require space, not applicable. Furthermore, the overall

zahl der Operationen, die pro Zelleneinheit erforderlich ist, drastisch herabgesetzt. Daher scheinen Mikroträger bezüglich der Kapitalinvestition, des Raumbedarfs sowie des Personalbedarfs bei der Herstellung von verankerungsabhängigen Zellen im Gegensatz zu den herkömmlichen Erzeugungsmethoden wirtschaftliche Vorteile zu bieten.number of operations required per cell unit is drastically reduced. Hence, microcarriers seem in terms of capital investment, space requirements as well the manpower requirements for the production of anchorage-dependent cells in contrast to conventional ones Production methods to offer economic advantages.

Mikroträger bieten ferner den Vorteil einer kontinuierlichen Verfahrensweise, da die Zellen in einer gesteuerten Umgebung wachsen. Daher bieten Mikroträger eine Möglichkeit, verankerungsabhängige Säugetierzellen unter festeingestellten Umgebungsbedingungen zu züchten, die zur Erzielung eines konstanten und optimalen Zellenwachstums gesteuert werden können.Microcarriers also offer the advantage of a continuous procedure, since the cells in a controlled Environment grow. Therefore, microcarriers offer an opportunity to anchorage-dependent mammalian cells to grow under fixed environmental conditions that achieve a constant and optimal Cell growth can be controlled.

Eines der bisher bekanntgewordenen vielversprechenden Mikroträgersysteme wird von van Wezel beschrieben und sieht die Verwendung von Diethylaminoethyl (DEAE)-substituierten Dextrankügelchen in einem mit einem Rührer versehenen Tank vor (A. L. van Wezel, »Growth of Cell Strains and Primary Cells on Microcarriers, in Homogeneous Culture«, Mature 216:64 (1967); D. van Hemert, D. G. Kilburn und A. L van Wezel »Homogeneous Cultivation of Animal Cells for the Production of Virus and Virus Products«, Biotechnol. Bioeng. 11:875 (1969) und A. L. van Wezef, »Microcarrier Cultures of Animal Cells«, Tissue Culture, Methods and Applications, P. F. Kruse und M. K. Patterson, Academic Press, New York, S. 372 (1973). Diese Kügelchen werden unter dem Warenzeichen DEAE-Sephadex A50 in den Handel gebracht.. Chemisch werden diese Kügelchen aus einer vernetzten Dextranmatrix mit Diethylaminoethylgruppen gebildet, die kovalent mit den Dextranketten verknüpft sind. Die im Handel erhältlichen DEAE-Sephades A50-Kügelchen besitzen eine Teilchengröße von 40 bis 120 μ und eine angenommene positive Ladungskapazität von ungefähr 5,4 mÄq/g des trockenen vernetzten Dextrans (wobei das Gewicht der verknüpften DEAE-Anteile unberücksichtigt ist). Andere Anionenaustauscherharze, wie DEAE-Sephadex A25, QAE-Sephadex A50 sowie QAE-Sephadex A25, sollen ebenfalls, wie von van Wezel angegeben wird, das Zellwachstum unterstützen.One of the promising microcarrier systems that has become known so far is described by van Wezel and sees the use of diethylaminoethyl (DEAE) -substituted dextran beads all in one tank equipped with a stirrer (A. L. van Wezel, "Growth of Cell Strains and Primary Cells on Microcarriers, in Homogeneous Culture ", Mature 216: 64 (1967); D. van Hemert, D. G. Kilburn, and A. L van Wezel "Homogeneous Cultivation of Animal Cells for the Production of Virus and Virus Products," Biotechnol. Bioeng. 11: 875 (1969) and A. L. van Wezef, "Microcarrier Cultures of Animal Cells", Tissue Culture, Methods and Applications, P.F. Kruse and M.K. Patterson, Academic Press, New York, p. 372 (1973). These globules are marketed under the trademark DEAE-Sephadex A50. Chemically, these beads become formed from a cross-linked dextran matrix with diethylaminoethyl groups that are covalent with the dextran chains are linked. The commercially available DEAE-Sephades A50 beads are particle size from 40 to 120 µ and an assumed positive charge capacity of about 5.4 meq / g dry linked dextran (whereby the weight of the linked DEAE components is not taken into account). Other anion exchange resins, such as DEAE-Sephadex A25, QAE-Sephadex A50 and QAE-Sephadex A25, should also as stated by van Wezel, support cell growth.

Das von van Wezel vorgeschlagene System kombiniert viele Oberflächen mit beweglichen Oberflächen und gestattet innovative Zellmanipulationen, wobei darüber hinaus eine Übertragung in den technischen Maßstab möglich ist und Umgebungssteuerungen durchführbar sind. Trotz dieser Fähigkeiten werden diese Methoden noch nicht in merklichem Ausmaße ausgewertet, da Schwierigkeiten bei der Zellenerzeugung infolge bestimmter nachteiliger Effekte festgestellt werden, die durch die Kügelchen vei ursacht werden. Von diesen Nachteilen seien ein anfängliches Absterben von Zellen innerhalb eines hohen Prozentsatzes des Zellinokulums sowie ein unzureichendes Zellenwachstum sogar im Falle von solchen Zellen erwähnt, die verknüpft sind. Die Gründe für diese nachteiligen Effekte sind noch nicht restlos aufgeklärt; es wird jedoch vermutet, daß sie auf eine Toxizltät der Kügelchen oder auf eine Nährmitteladsorption zurückgehen (s. van Wezel), A. L. (1967), Nature 216:65-65; A. L. van Wezel (1973), Tissue Culture, Methods and Applications; P. R. Kruse und M. R. Patterson, S. 372-377, Academic Press, New York; P. van Hemert, D. G. Kilburn und A. L. van Wezel (1969), Biotechnol. Bioeng. 11:875-885, C. Horng und W. McLlmans (1975), Biotechnol. Bioeng. 17:713-732).The system proposed by van Wezel combines many surfaces with movable surfaces and allows innovative cell manipulations, and in addition a transfer to the technical scale is possible and environmental controls are feasible. Despite these skills, these methods will not yet evaluated to any noticeable extent because of difficulties in cell production certain adverse effects caused by the globules are noted. Of these Disadvantages are initial cell death within a high percentage of the cell inoculum as well as insufficient cell growth even in the case of those cells which are linked. the The reasons for these adverse effects have not yet been fully clarified; however, it is believed that they are based on toxicity of the beads or due to adsorption of nutrients (see van Wezel), A. L. (1967), Nature 216: 65-65; A. L. van Wezel (1973), Tissue Culture, Methods and Applications; P. R. Kruse and M. R. Patterson, pp. 372-377, Academic Press, New York; P. van Hemert, D. G. Kilburn and A. L. van Wezel (1969), Biotechnol. Bioeng. 11: 875-885, C. Horng and W. McLlmans (1975) Biotechnol. Bioeng. 17: 713-732).

Es könnte sein, daß dl .· nachteiligen Wirkungen dieser Im Handel erhältlichen Ionenaustauscherharze auf Ihre Herstellungsmethode zurückgehen. Einige dieser Produktiansmethoden für Polyhydroxyrnaterlalien werden beispielsweise in den US-PS 32 77 025, 32 75 576, 30 42 667 und 32 08 994 beschrieben. Unabhängig von dem Grund sind die derzeit im Handel erhältlichen Materialien einfach für ein gutes Zellenwachstum einer erheblichen Vielzahl von Zelltypen nicht zufriedenstellend.
Eine Lösung zur Beseitigung der nachteiligen Wirkungen, die dann festgestellt werden, wenn man im Handel erhältliche Mikroträger für ein Zellenwachstum verwenden will, wird in der US-PS 40 36 693 beschrieben. Diese US-PS beschreibt ein Verfahren zur Behandlung dieser im Handel erhältlichen Ionenaustauscherharze mit mais kroretikularen Polyanionen, wie Carboxymethylcellulose. Diese Methode hat sich zwar als erfolgreich erwiesen, es wäre jedoch noch vorteilhafter, wenn die Kügelchen von Anfang an so hergestellt werden können, daß sie Eigenschaften besitzen, die für ein ausgezeichnetes Wachstum von verankerungsabhängigen Zellen geeignet sind.It is possible that the adverse effects of these commercially available ion exchange resins are due to their method of manufacture. Some of these production methods for polyhydroxy materials are described, for example, in US Pat. Nos. 3,277,025, 3,275,576, 3,042,667 and 3,200,8994. Regardless of the reason, the currently commercially available materials are simply not satisfactory for good cell growth in a wide variety of cell types.
One solution to eliminating the adverse effects found in using commercially available microcarriers for cell growth is described in US Pat. No. 4,036,693. This US patent describes a method of treating these commercially available ion exchange resins with corn-based polyanions such as carboxymethyl cellulose. While this approach has been found to be successful, it would be even more advantageous if the beads can be designed from the outset to have properties suitable for excellent anchorage-dependent cell growth.

Die Erfindung (vgl. Patentanspn-ch 1) beruht auf der Erkenntnis, daß die Ladungskapazität von Mikroträgern auf einen bestimmten Wert eingestellt oder innerhalb eines bestimmten Bereiches gesteuert werden muß, damit ein gutes Wachstum einer Vielzahl von verankerungsabhängigen Zelltypen bei vernünftigen Mlkroträgerkonzentrationen erzielt werden kann. Unter Einsatz dieser Kügelchen ist ein gutes Wachstum einer Vielzahl von verankerungsabhängigen Zellen möglich. Unter Verwendung dieser Mikroträgersysteme gezüchtete Zellen können gehärtet oder zur Herstellung von Tier- oder Pflanzenviren, Impfstoffen, Hormonen, Interferon oder anderen Zeilwachstumsnebenprodukten verwendet werden.
Ein Beispiel für die verbesserten Mikroträger sind solehe Mikroträger, die unter Verwendung von Polymeren mit daran sitzenden Hydroxygruppen erzeugt worden sind, beispielsweise vernetzte Dextrankügelchen. Diese Kügelchen können mit einer wäßrigen Lösung eines tertiären oder quaternären Amins, wie Diethylaminoethyl-Chlorid: Chlorid, sowie einem alkalischen Material, wie Natriumhydroxid, behandelt werden. Die spezifische Ladungskapazität der Kügelchen wird durch Veränderung der absoluten Mengen an Dextran, tertiärem Aminsalz und alkalischem Material gesteuert, wobei das Verhältnls dieser Materialien und/oder die Behandlungszeit und -temperatur ebenfalls variiert werden können.The invention (see patent application 1) is based on the knowledge that the charge capacity of microcarriers must be set to a certain value or controlled within a certain range so that good growth of a large number of anchorage-dependent cell types can be achieved at reasonable microcarrier concentrations. Using these beads, a variety of anchorage-dependent cells can grow well. Cells grown using these microcarrier systems can be hardened or used in the production of animal or plant viruses, vaccines, hormones, interferon, or other cell growth byproducts.
An example of the improved microcarriers are such microcarriers that have been created using polymers with attached hydroxyl groups, such as crosslinked dextran beads. These beads can be treated with an aqueous solution of a tertiary or quaternary amine such as diethylaminoethyl chloride: chloride as well as an alkaline material such as sodium hydroxide. The specific charge capacity of the beads is controlled by changing the absolute amounts of dextran, tertiary amine salt and alkaline material, the ratio of these materials and / or the treatment time and temperature also being variable.

Erfindungsgemäß hergestellte Mikroträger können In Kulturen eingesetzt werden, ohne daß dabei ein hoher Anteil an Zellen anfänglich verlorengeht, wie dies bisher bei der Verwendung von im Handel erhältlichen Mikroträgern festgestellt wurde. Ferner breiten sich gebundene Zellen auf den Kügelchen aus und wachsen zusammen, wöbe¹ extrem hohe Zellkonzentrationen In dem Suspensionsmedium erzielt werden. Die Konzentration von Mikroträgern in Suspension Ist nicht auf .sehr niedrige Gehalte beschränkt, so wie dies Im Falle der bisher bekannten Materialien festgestellt wurde. Das Zellenwachstum scheint nur durch Faktoren begrenzt zu werden, die nicht In jinem Zusammenhang mit den Mlkroträgern stehen. Aufgrund dieser Tatsachen läßt sieh eine erhebliche Zunahme der volumetrlschen Produktivität von Zellkulturen erzielen. Nunmehr Ist es möglich, die Vorteile auszuschöpfen, die bei der Verwendung von Mikroträgern beim Wachstum von Zellen möglich sind, insbesondere beim Züchten von verankerungsabhängigen Zellen.Microcarriers produced according to the invention can be used in cultures without initially losing a high proportion of cells, as was previously found when using commercially available microcarriers. Further, spread-bound cells on the beads and grow together, wöbe ¹ extremely high cell concentrations are obtained in the suspension medium. The concentration of microcarriers in suspension is not limited to .very low levels, as has been found in the case of the materials known to date. Cell growth appears to be limited only by factors unrelated to the milk carriers. On the basis of these facts, a considerable increase in the volumetric productivity of cell cultures can be achieved. It is now possible to take advantage of the advantages of using microcarriers in growing cells, particularly in growing anchorage-dependent cells.

Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zelEtThe invention is illustrated by the accompanying drawings explained in more detail. It is

Flg. 1 eine graphische Darstellung, welche die Wachstumscharakteristiken normaler dlplolder menschlicher Embryolungenfibroblastzellen (HEL299) bei einer Mlkroträgerkonzentration von 2 g trockenem vernetztem Dextran/Liter sowohl im Falle von im Handel erhältlichen DEAF.-behandelten Dextranmikroträgern als auch erfindungsgemäß erzeugten DEAE-beharidelten Mikroträgern wiedergibt;Flg. 1 is a graph showing the growth characteristics normal dlplolder of human embryonic lung fibroblast cells (HEL299) at a protein carrier concentration of 2 g dry cross-linked dextran / liter both in the case of commercially available DEAF.-treated dextran microcarriers and DEAE-treated microcarriers produced according to the invention reproduces;

Fig. 2 eine graphische Darstellung, welche die Wachstumscharakteristiken von sowohl normalen dlplolden menschlichen Embryolungenfibroblastzellen (HEL299) als auch von sekundären Hühnerembryofibroblasten bei einer Mikroträgerkonzentration von 5 g trockenem vernetztem Dextran/Liter unter Verwendung der erfindungsgemäßen verbesserten DEAE-behandelten Mikroträger wiedergibt.Fig. 2 is a graph showing the growth characteristics from both normal dlplolden human embryonic lung fibroblast cells (HEL299) as well as from secondary chick embryo fibroblasts at a microcarrier concentration of 5 g dry crosslinked Dextran / liter using the improved DEAE treated microcarriers of the present invention reproduces.

Unter dem Begriff »Mikroträger«, »Zellkulturmikroträger« sowie »Zellwachstumsmikroträger« sind kleine einzelne Teilchen zu verstehen, die für eine Zellenverknüpwelsen, mit einer wäßrigen Lösung eines alkalischen Materials und eines tertiären oder quaternären Amins behandelt werden. Die Kügelchen können zu Beginn in einem wäßrigen Medium ohne die anderen Bestandteile angequollen oder einfach mit einem wäßrigen Medium, das die erforderliche Base und das AmIn enthüll, kontaktiert werden. Diese Methode unter Einsatz von alkalischen Materlallen zum Katalysleren der Verknüpfung von positiv geladenen Aminogruppen mit den Hydroxylenthaltenden Polymeren wird in der US-PS 17 77 970 beschrieben.Under the term »microcarrier«, »cell culture microcarrier« as well as "cell growth microcarriers" are to be understood as small individual particles that are responsible for a with an aqueous solution of an alkaline material and a tertiary or quaternary amine be treated. The beads can initially be placed in an aqueous medium without the other ingredients swollen or simply contacted with an aqueous medium revealing the required base and amine will. This method using alkaline materials to catalyze the linkage of positively charged amino groups with the hydroxyl-containing polymers is disclosed in US Pat. No. 1,777,970 described.

Beispiele für geeignete Hydroxyl-enthaltende Polymere sind Polysaccharide, wie Dextran, Dextrin, Stärke, Cellulose, Polyglukose sowie substituierte Derivate dieser Substanzen. Bestimmte synthetische Polymere, wie Polyvinylalkohol, sowie hydroxysubstltulerte Acrylate oder Methacrylate, beispielsweise Hydroxyethylmethacrylat. sind ebenfalls geeignet. Dextran, insbesondere verhetztes Dextran in Form von kleinen Kügelchen, ist besondersExamples of suitable hydroxyl-containing polymers are polysaccharides, such as dextran, dextrin, starch, cellulose, Polyglucose and substituted derivatives of these substances. Certain synthetic polymers, such as polyvinyl alcohol, and also hydroxy-substituted acrylates or methacrylates, for example hydroxyethyl methacrylate. are also suitable. Dextran, particularly hurried dextran in the form of small spheres, is special

immer, sind Mikroträge; poröse Kügelchen, die aus Polymeren gebildet werden. Gewöhnlich verknüpfen sich die Zellen mit den äußeren Oberflächen derartiger Kügelchen und wachsen darauf.always, are micro-contributions; porous beads made from polymers are formed. Usually the cells attach to the outer surfaces of such beads and grow on it.

Wie vorstehend erwähnt, wurde nunmehr gefunden, daß das Ausmaß der Ladungskapazität auf den Zellkulturmikroträgern auf einen bestimmten Bereich für ein ausreichendes Zellwachstum bei vernünftigen Mikroträgerkonzentrationen eingestellt und/oder gesteuert werden muß. Geeignete Arbeitsbereiche hängen von verschiedenen Faktoren ab, wie den jeweils zu züchtenden Zellen, der Art der Mikroträger, der Konzentration der Mikroträger sowie von anderen Kulturparametern, beispielsweise der Zusammensetzung des Mediums, ab. In allen Fällen liegt jedoch das Ausmaß der Ladungskapazität, das sich als geeignet erwiesen hat, deutlich unter dem Ausmaß, das auf im Handel erhältlichen Anionenaustauscherharzen 7ij finden iS!. wie sie bisher für Vii.kroträgerzellkulturen eingesetzt worden sind. Beispielsweise nimmt man an. daß die DEAE-Sephadex A50-Kügelchen, die von van Wezel vorgeschlagen wurden, eine Ladungskapazität von ungefähr 5,4 mÄq/g des trockenen und nichtbehandeiten (ohne DEAE) vernetzten Dextrans aufweisen. Im Gegensatz zu dieser relativ hohen Ladungskapazität wurden erfindungsgemäß Mikroträger hergestellt, die sich für ein gutes Zellenwachstum als geeignet erwiesen haben, die eine Ladungskapazität zwischen 0.1 und 4.5 mÄq/g der trockenen nichtbehandeiten Mikroträger aufweisen. Unterhalb 0,1 mÄq/g nimmt man an, daß die Zellen sich nur unter Schwierigkeiten mit den Mikroträgern verbinden. Oberhalb 4,5 mÄq/g tritt ein Verlust des Ausgangszelleninokulums auf, wobei sogar die überlebenden Zellen nicht gut wachsen, insbesondere bei relativ hohen Mikroträgerkonzentrationen.As mentioned above, it has now been found that the extent of the charge capacity on the cell culture microcarriers to a specific range for adequate cell growth at reasonable microcarrier concentrations must be set and / or controlled. Suitable work areas depend on different Factors such as the cells to be grown, the type of microcarrier, the concentration of Microcarriers as well as other culture parameters, for example the composition of the medium. In in all cases, however, the extent of the charge capacity which has been found to be suitable is well below to the extent that on commercially available anion exchange resins 7ij find iS !. as previously for Vii.kroträgerzellkulturen have been used. For example, one assumes. that the DEAE-Sephadex A50 beads, suggested by van Wezel have a loading capacity of about 5.4 meq / g dry and untreated (without DEAE) have crosslinked dextran. In contrast to this relatively high one Charge capacity microcarriers were produced according to the invention, which are suitable for good cell growth have proven suitable, which have a loading capacity between 0.1 and 4.5 meq / g of the dry non-treated Have microcarriers. Below 0.1 meq / g, the cells are believed to have difficulty moving connect to the microcarriers. Above 4.5 meq / g, loss of parental cell inoculum occurs, with even the surviving cells do not grow well, especially at relatively high microcarrier concentrations.

Es wurde gefunden, daß zum Wachsen von normalen diploiden menschlichen Fibroblasten auf vernetzten Dextranmikroträgern ein günstiger Ladungskapazitätsbereich, der durch die DEAE-Gruppen zur Verfugung gestellt wird, ungefähr 1.0 bis ungefähr 2,8 mÄq/g des trockenen nichtbehandeiten vernetzten Dextrans beträgt. Dieser Bereich kann in Abhängigkeit von den verschiedenen Zelitypen oder Kulturbedingungen schwanken; er reicht gemäß der Erfindung von 0,1 bis 4,5 mÄq/g. Die optimalen Bedingungen können dabei durch Routineexperimente ermittelt werden.It has been found that normal diploid human fibroblasts can be grown on crosslinked dextran microcarriers a favorable cargo capacity range provided by the DEAE groups is about 1.0 to about 2.8 meq / g of the dry untreated crosslinked dextran. This Range may vary depending on different cell types or culture conditions; achieved according to the invention from 0.1 to 4.5 meq / g. The optimal conditions can thereby be determined by routine experiments be determined.

Mikroträger mit der erforderlichen LedungskapazitSt können in der Weise hergestellt werden, daß Mikroträger aus Polymeren, die daran sitzende Hydroxylgruppen auf-Microcarrier with the required LedungskapazitSt can be produced in such a way that microcarriers made of polymers that have hydroxyl groups attached to them

./It, WCPiM 3UCm niCut 20 güilSüg, uti 03 im iiäuuC! CruumlCri IiHu rC!titiV billig ist./It, WCPiM 3UCm niCut 20 güilSüg, uti 03 im iiäuuC! CruumlCri IiHu rC! TitiV is cheap

und Mikroträger erzeugt, die ein ausgezeichnetes Zellwachstum fördern.and produces microcarriers that promote excellent cell growth.

Jedes alkalische Material kann für die Reaktion eingesetzt werden. Die Alkalimetallhydroxide, wie Natrlum- oder Kaliumhydroxid, sind jedoch die zweckmäßigen alkalischen Substanzen. Entweder tertiäre oder quaternäre Amine sind geeignete Quellen für positiv geladene Gruppen, die mit den Hydroxy-enthaltenden Polymeren verknüpf, werden können. Besonders günstige Materlallen sind die chlor- oder bromsubstituierten tertiären Amine oder Salze davon, wie Dlethylamlnoethylchlorld. Dlethylanilnoethylbmmld, Dlmetliylamlnoethylchloild, Dlmethylamlnoethylbromld, Dleihylamlnomethylchlorld, Dlethylamlnomethylbromld, Dl-(hydroxyethyl)-aminoethylchlorld, Dl-(hydroxyethyl)-amlnoethylbromld, Dl-fhydroxyethyD-amlnomethylchlorld, Dl-(hydroxyethyD-aminomethylbromld, /Ϊ-Morphollnoethylethylchlor!d, Λ-Morphollnoethylbromidi fl-Mnrnhollnomethylchlorld, ß-Morphollnomethylbromld sowie Salze davon, belsplelswelse die Hydrochloride.Any alkaline material can be used for the reaction will. However, the alkali metal hydroxides such as sodium or potassium hydroxide are the most convenient alkaline substances. Either tertiary or quaternary amines are suitable sources of positively charged amines Groups that link to the hydroxy-containing polymers can become. Particularly inexpensive materials are the chlorine- or bromine-substituted tertiary amines or salts thereof, such as Dlethylamlnoethylchlorld. Dlethylanilnoethylbmmld, Dlmetliylamlnoethylchloild, Dlmethylamlnoethylbromld, Dleihylamlnomethylchlorld, Dlethylamlnomethylbromld, Dl- (hydroxyethyl) -aminoethylchlorld, Dl- (hydroxyethyl) -amlnoethylbromld, Dl-fhydroxyethyD-aminomethylchlorld, Dl- (hydroxyethyD-aminomethylbromld, / Ϊ-Morphollnoethylethylchlor! D, Λ-Morphollnoethylbromidi fl-Mnrnhollnomethylchlorld, ß-Morphollnomethylbromld and salts thereof, belsplelswelse the hydrochloride.

Ein breiter Bereich bezüglich der Reaktionstemperaturen und -zelten kann eingehalten werden. Am besten werden die Reaktionen bei Temperaturen zwischen ungefähr 18 und 65⁰C durchgeführt. Man kann jedoch auch andere Temperaturen einhalten. Die Reaktionskinetik hängt In einem erheblichen Ausmaß natürlich von der Reaktionstemperatur sowie der Reaktantenkonzentratlon ab. Sowohl die Zelt als auch die Temperatur beeinflussen die erzielte Endaustauschkapazität.A wide range of reaction temperatures and times can be maintained. Most preferably, the reactions are carried out at temperatures between about 18 and 65 ⁰ C. However, other temperatures can also be maintained. The reaction kinetics depend to a considerable extent, of course, on the reaction temperature as well as the reactant concentration. Both the tent and the temperature influence the final exchange capacity achieved.

Der Grund dafür, daß die Ladungskapazität der Mikroträger beim Zellwachstum so kritisch ist, ist bisher noch nicht restlos aufgeklärt. Ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, kann man annehmen, daß die Ladungskapazität auf der Oberfläche bestimmte lokale Diskontlnultäten der mittleren Zusammensetzung bedingt, welche den hauptsächlichen steuernden Einfluß auf das Mlkroträgerkuiturzelienwachstum ausüben. Dies bedeutet jedoch nicht, daß auch andere Möglichkeiten existieren.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.The reason why the charge capacity of the microcarriers is so critical during cell growth has not yet been fully elucidated. Without wishing to be bound by theory, it can be assumed that the charge capacity on the surface causes certain local discontinuities in the mean composition which exert the main controlling influence on the growth of the milk carrier cells. However, this does not mean that other possibilities also exist.
The following examples illustrate the invention.

Beispiel 1
Herstellung von Zellkulturmikroträgernexample 1
Production of cell culture microcarriers

Zellkulturmikroträger können In der folgenden Weise hergestellt werden: Trockene, nichtgeladene und vernetzte Dextrankügelchen werden zur Gewinnung von Teilchen mit einem Durchmesser von ungefähr 75 pm gesiebt. 1 g dieser Fraktion wird zu 10 ml destilliertemCell culture microcarriers can be used in the following manner are produced: Dry, uncharged and cross-linked dextran beads are used to obtain Sieved particles approximately 75 µm in diameter. 1 g of this fraction is distilled to 10 ml

Wasser gegeben, worauf die Kügelchen quellen gelassen werden. Eine zufriedenstellende Im Handel erhältliche Quelle für trockenes vernetztes Dextran Ist Sephadex G-50.Given water, whereupon the beads are left to swell will. A satisfactory one commercially available Source of dry crosslinked dextran is Sephadex G-50.

Eine wäßrige Lösung, die 0,01 Mol Dläthylamlnoäthylchlorld: Chlorid, zweimal aus Methylenchlorid umkrlstalllslert, und 0,015 Mol Natriumhydroxid enthält, wird in ilnem 10 ml Volumen hergestellt. Die wäßrige Lösung wird dann der Suspension aus gequollenen Dextrankügelchen zugesetzt, die dann kräftig In einem Schüttelwasserbad während einer Zeltspanne von 1 Stunde bei 60° C bewegt wird. Nach einer Stunde werden die Kügelchen von der Reaktionsmischung durch Filtration unter Verwendung eines Whatman-Fllterpaplers Nr. 595 abgetrennt und mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen.An aqueous solution containing 0.01 mol of Dläthylamlnoäthylchlorld: Chloride, twice crystallized from methylene chloride, and containing 0.015 mol of sodium hydroxide, is made in a 10 ml volume. The aqueous solution is then the suspension of swollen dextran beads added, which then vigorously in a shaking water bath for a period of 1 hour at 60 ° C is moved. After one hour, the beads are removed from the reaction mixture by using filtration a No. 595 Whatman filter paper and washed with 500 ml of distilled water.

Nach dieser Methode hergestellte Kügelchen enthalten ungefähr 2,0 mÄq Ladungskapazität pro Gramm trockenem, nlchtbehandeltem vernetztem Dextran. Diese Ladungskapazität kann durch Messen der Anlonenaustauscherfärilgkelt der Kügelchen In der folgenden Welse ermittelt werden: Die Kugelzubereitungen werden gründlich mit 0,1 η HCl zur Sättigung aller Austauscherstellen mit Cl"-Ionen gewaschen. Dann erfolgt ein Spülen mit 10-* η HCl zur Entfernung von nichtgebundenen Chlor-Idlonen. Anschließend werden die Kügelchen mit einer 10%lgen (Gewicht/Gewicht) Natriumsulfatlösung zur Gegenabsättlgung der Austauschstellen mit SO₄* gewaschen. Der Ablauf der Natriumsulfatwäsche wird gesammelt und enthält freigesetzte Chloridionen. Diese Lösung wird mit 1 m Silbernitrat unter Verwendung von verdünntem Kallumchromat als Indikator titriert.Beads made by this method contain approximately 2.0 meq of charge capacity per gram of dry, untreated crosslinked dextran. This charge capacity can be determined by measuring the anion exchange temperature of the beads in the following catfish: The bead preparations are thoroughly washed with 0.1 η HCl to saturate all exchange sites with Cl "ions. Then rinsing with 10- * η HCl takes place to remove The beads are then washed with a 10% (w / w) sodium sulfate solution to counter-saturate the exchange sites with SO ₄ *. The sodium sulfate wash is collected and contains released chloride ions. This solution is mixed with 1 M silver nitrate using titrated from dilute potassium chromate as an indicator.

Nach der Titration werden die Kügelchen gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gespült. In PBS suspendiert und Im Autoklaven behandelt. Diese Methode liefert hydratlslerte Kügelchen mit einem Durchmesser von ungefähr 120 bis 200 μιη, die ungefähr 2,0 mÄq Ladungskapazität pro g trockenem, nlchtbehandeltem und vernetztem Dextran tragen.After titration, the beads are washed thoroughly with distilled water, buffered with phosphate Saline (PBS) flushed. Suspended in PBS and autoclaved. This method provides hydrated solids Spheres with a diameter of about 120 to 200 μm, the about 2.0 meq charge capacity Wear per g of dry, untreated and cross-linked dextran.

Example 2

Wachstum von verankerungsabhängigen Zellen mit erfindungsgemäßen Zellkulturmlkroträgern Im Gegensatz zu im Handel erhältlichem lonenaustauscherharzGrowth of anchorage-dependent cells with cell culture media according to the invention In contrast to commercially available ion exchange resin

Alle Zellen werden in einem modifizierten Dulbecco-Eagle-Medlum gezüchtet. Zum Wachsenlassen von normalen dlplolden Flbroblasten wird das Medium mit 10% Kälberfötusserum ergänzt. Zum Wachsenlassen von primären und sekundären Hühnerfibroblasten wird das Medium mit \% Hühnerserum, 1% Kälberserum und 2% Tryptosephosphatbrühe ergänzt. Die Ansätze werden auf 100-mm-Kunststoffschalen behandelt.All cells are grown in a modified Dulbecco-Eagle medlum. The medium is supplemented with 10% fetal calf serum to allow normal dlplolden fluid blasts to grow. For primary and secondary chicken fibroblasts to grow, the medium is supplemented with \% chicken serum, 1% calf serum and 2% tryptose phosphate broth. The approaches are treated on 100 mm plastic trays.

Primäre Hühnerembryofibroblasten werden durch Zerkleinern und anschließendes Trypsinisieren von 10 Tage alten Embryos hergestellt. Sekundäre Hühnerembryofibroblasten werden am ersten Tag des primären Zusammenlaufens durch Trypsinisierung hergestellt. Für in Kunststoffschalen gezüchtete Zellen beträgt die Verdoppelungszeit ungefähr 20 Stunden.Primary chicken embryo fibroblasts are produced by crushing and subsequent trypsinization of 10-day-old embryos. Secondary chick embryo fibroblasts are made by trypsinization on the first day of primary confluence. For in For cells grown in plastic dishes, the doubling time is approximately 20 hours.

Es wurden menschliche Fibroblasten, die auf Embryolungen zurückgehen, verwendet. Diese Zellen besitzen eine Verdoppelungszeit von 19 Stunden in Kunststoffschalen. Human fibroblasts derived from embryonic lungs were used. These cells own a doubling time of 19 hours in plastic trays.

Mikroträgerkulturen werden dadurch initiiert, daß einfach die Zellen und die Kügelchen in einer gerührten Kultur vereinigt werden. 100 ml Kulturvolumina in 250-ml-GIasflaschen (64 cm Durchmesser), die mit einem magnetisch angetriebenen, mit Teflon überzogenen Rührstab mit einer Abmessung von 4,5 cm ausgestattet sind, werden verwendet. Die Ruhrgeschwindigkeit beträgt ungefähr 90 Upm. Es werden direkte Proben aus den Kulturen entnommen. Die Proben werden mikroskopisch untersucht und photographlert. Die Zellen werden durch Zählen der Keime numeriert, wobei eine Modifizierung der Methode von Sanford et al. (Sanford, K. K., Earle, W. R., Evans, V. J., Waltz, H. K., und Shannon,Microcarrier cultures are initiated by simply the cells and beads are combined in a stirred culture. 100 ml culture volumes in 250 ml glass bottles (64 cm diameter) with a magnetically driven, Teflon-coated Stir sticks measuring 4.5 cm are used. The speed of the dysentery is about 90 rpm. Direct samples are taken from the cultures. The samples are microscopic examined and photographed. The cells are numbered by counting the germs, with one modification the method of Sanford et al. (Sanford, K. K., Earle, W. R., Evans, V. J., Waltz, H. K., and Shannon,

J. E. [1951] J. Nat. Cancer Inst., U: 773), wiesle von van Wezel beschrieben wird (van Wezel, A. L. [1973]). angewendet wird. Tissue Culture, Methods and Applications. Kruse, P. F. und Patterson, M. R., S. 372 bis 377, Academic Press, New York.J. E. [1951] J. Nat. Cancer Inst., U: 773), wiesle von van Wezel (van Wezel, A. L. [1973]). applied will. Tissue Culture, Methods and Applications. Kruse, P.F. and Patterson, M.R., pp. 372-377, Academic Press, New York.

"ι Kügelchen mit daran gebundenen Zellen werden von dem Kulturmedium In der Welse abgetrennt, daß man die Kügelchen bei 1 g während einer Zeltspanne von wenigen Minuten absetzen läßt, und dann die überstehende Flüssigkeit ahsaiigt. dirs« Methode erleichtert erheblich den Ersatz des Mediums sowie die Abtrennung von Zellen von den Mlkroträgem nach der Trypsinisierung. "ι beads with cells bound thereto are separated from the culture medium in the catfish, that g the beads at 1 allowed to settle for a tent span of a few minutes, and then ahsaiigt the supernatant. dirs" method greatly facilitates the replacement of the medium and the Separation of cells from the microbial carriers after trypsinization.

Im Handel erhältliches DEAE Sephadex A-50 wird als Mikroträger für die dlplolden menschlichen Flbroblasten verwendet und mit Trägern verglichen, die gemäß Beispiel 1 synthetisiert und titriert worden sind. Im Falle beider Kügelchentypen beträgt die Trägerkonzentration 2 g des trockenen nlchtbehandelten und vernetzten Dextrans pro Liter. Die Ladungskapazität von DEAE Sephadex A-50 beträgt 5,4 mÄq/g des trockenen vernetzten Dextrans, während diejenige der frisch synthetisierten Kügelchen zu 2,0 mÄq/g ermittelt wird. Die Ergebnisse gehen aus der Flg. 1 hervor.Commercially available DEAE Sephadex A-50 is used as a microcarrier for the dlplolden human flbroblasts used and compared with supports which have been synthesized and titrated according to Example 1. In the event of For both types of beads, the carrier concentration is 2 g of the dry, untreated and crosslinked dextran per liter. The loading capacity of DEAE Sephadex A-50 is 5.4 meq / g dry crosslinked Dextrans, while that of the freshly synthesized beads is found to be 2.0 meq / g. The results go out of the wing. 1 emerged.

Im Falle dieses Zelltyps wird der Verlust an ursprüng-Hchem Inoculum auf A-50 Mlkroträgem festgehalten, während die Flbroblasten sich verknüpfen, vermehren und auf den Mlkroträgem gemäß vorliegender Erfindung In sechs Tagen die Konfluenz erreichen. Dieses Verhalten stimmt mit dem angegebenen Verhalten dieses ZeI-lentyps auf Standardplatten überein. Wie aus der Flg. 1 ersichtlich ist, beträgt die Endzellendichte, die mit den neuen Mlkroträgem bei 2 g des trockenen vernetzten Dextrans/Llter erzielt wird, 1,2 χ 10' Zellen/ml.In the case of this cell type, the loss of original Hchem Inoculum retained on A-50 microbial carriers while the bloodblasts associate and multiply and on the milk carrier according to the present invention reach confluence in six days. This behavior corresponds to the specified behavior of this cell type on standard disks. As from the Flg. 1 As can be seen, the end cell density is the same as with the new milk carrier is achieved with 2 g of the dry cross-linked dextran / liter, 1.2 × 10 cells / ml.

Bei Kulturen, welche die neuen Träger enthalten, sind weder ein anfänglicher Zeitverlust noch eine Inhibierung bezüglich des Erreichens des Zusammenlaufens festzustellen. Darüber hinaus wachsen die Kulturen, was noch wichtiger Ist, normal bei höheren Mikroträgerkonzentratlonen. Beispielsweise zeigt die Flg. 2 wie menschliche Fibroblasten sowie sekundäre Hühnerembryofibroblasten die Sättigungskonzentrationen nahe 4x10' Zellen/ml erreichen, wenn 5 g trockenes vernetztes Dextran pro Liter Im Falle der neuen Träger mit einer Ladungskapazität von 2,0 mÄq/g Dextran verwendet werden. Wie ersichtlich, tritt sogar bei dieser relativ hohen Mikroträgerkonzentration kein signifikanter Inokulumverlust auf.For cultures that contain the new carriers there was neither an initial loss of time nor an inhibition of reaching convergence. In addition, more importantly, the cultures grow normally at higher microcarrier concentrations. For example, the Flg. 2 such as human fibroblasts and secondary chick embryo fibroblasts reach saturation concentrations close to 4x10 'cells / ml when 5 g of dry cross-linked dextran per Liters In the case of the new carrier with a cargo capacity of 2.0 meq / g dextran can be used. As can be seen, occurs even at this relatively high microcarrier concentration no significant loss of inoculum.

Sekundäre Hühnerembryofibroblasten werden ebenfallsSecondary chick embryo fibroblasts are also used

bei einer Mikroträgerkonzentration von 10 g/l gezüchtet.grown at a microcarrier concentration of 10 g / L.

Unter Einhaltung der vorstehend beschriebenen Bedin-In compliance with the conditions described above

gungen wird eine Sättigungskonzentration von 6 χ 10' Zellen/ml erzielt. Setzt man dem Medium ein weiteres Prozent Kälberfötusserum zu, dann wird eine Sättigungskonzentration von 8 χ 10' Zellen/ml erzielt. Es wird kein signifikanter Zelleninokulumverlust festgestellt.A saturation concentration of 6 χ 10 'is used Cells / ml. If a further percent of fetal calf serum is added to the medium, a saturation concentration of 8 × 10 cells / ml is achieved. It won't significant cell inoculum loss noted.

Primäre Hühnerembryofibroblasten werden bei einer Mikroträgerkonzentration von 5 und 10 g/l gezüchtet. Die Wachstumseigenschaften sind ähnlich denjenigen der sekundären Hühnerfibroblasten. obwohl leichte Ino-Chick primary embryo fibroblasts are grown at microcarrier concentrations of 5 and 10 g / L. The growth characteristics are similar to those of the chicken secondary fibroblasts. although slight ino-

kulumverluste und etwas längere Verzögerungszelten festgestellt werden.kulum losses and somewhat longer delay tents to be established.

Es wurden ferner Versuche unternommen, sekundäre Hühnerembryoflbroblasten unter Bedingungen zu züchten, die den vorstehend eingehaltenen ähnlich sind, mit der Ausnahme, daß die DFAE Sephadex A-50 Mikroträger mit Konzentrationen von 1 und 5 g/l verwendet werden. Es wird kein Zellenwachstum festgestellt und ein signifikanter Inokulumverlust beobachtet.Attempts have also been made to grow chick secondary embryo broblasts under conditions which are similar to those observed above, with the exception that the DFAE Sephadex A-50 microcarrier can be used at concentrations of 1 and 5 g / l. No cell growth is noted and one significant inoculum loss observed.

Example 3

Herstellung von Zellkulturmlkroträgern mit wechselnden ReaktantenmengenProduction of cell culture media carriers with changing Amounts of reactants

Mlkroträgerchargen werden durch Auflösen von Dläthylamlnoäthyl-Chlorld : Chlorid und Natriumhydroxid In 20 ml destilliertem Wasser hergestellt. Die Lösung wird dann über trockene Sephadex G-50-Kügelchen gegossen, worauf die Kügelchen auf einen sich hin- und herbewegenden mit Wasser gefüllten Schüttler (Temperatur 60° C) gebracht werden. Ein Teil der Kugelchargen wird mit einer Lösung behandelt, die 0,01 Mol des Amins und 0,015 Mol Natriumhydroxid enthält, während eine andere Portion mit einer Lösung behandelt wird, die 0,03 Mol des Amins und 0,045 Mol Natriumhydroxid enthält. Die Reaktionszelt wird zur Erzielung von verschiedenen mÄq/g Innerhalb einer jeden Charge variiert.Milk carrier batches are made by dissolving Dläthylamlnoäthyl-Chlorld: chloride and sodium hydroxide Made in 20 ml of distilled water. The solution is then applied over dry Sephadex G-50 beads poured, whereupon the pellets back and forth on you moving shaker filled with water (temperature 60 ° C). Part of the pellet batches is treated with a solution containing 0.01 mol des Amine and 0.015 moles of sodium hydroxide, while another portion is treated with a solution that contains Contains 0.03 moles of the amine and 0.045 moles of sodium hydroxide. The reaction tent is used to achieve various meq / g varies within each batch.

Dlplolde menschliche Flbroblasten werden In Suspenslonskulturen bei einer Mlkroträgerkonzentratlon von 5,0 g des trockenen nlchtbehandelten vernetzten Dextrans pro Liter nach den In Beispiel 2 beschriebenen Methoden gezüchtet, wobei Mikroträger verwendet werden, die wechselnde mÄq/g aufweisen und aus jeder Charge ausgewählt werden. Anschließend wird die Produktivität (10' gezüchtete Zellen/Llter-Stunde) berechnet und In Abhängigkeit von mÄq/g für jede Kugelcharge, die In der vorstehend beschriebenen Welse hergestellt worden Ist, aufgetragen. Kurven, die unter Verwendung von Werten aus beiddeeen Versuchen aufgetragen werden, besitzen eine ähnliche Form, und zwar Im allgemeinen eine Glockenform, die Kurve aus den Chargen, die mit Reaktanten in höheren Konzentrationen behandelt worden sind, weist jedoch einen etwas stelleren Anstieg und Abfall auf. Aus jeder Charge werden Träger erhalten, die ein ausgezeichnetes Zellenwachstum bewirken.Dlplolde human flbroblasts are in suspension cultures with an oil carrier concentration of 5.0 g of the dry, untreated crosslinked dextran cultured per liter according to the methods described in Example 2, using microcarriers, which vary in mEq / g and are selected from each batch. Then productivity (10 'cultured cells / liter-hour) and as a function of mEq / g for each batch of balls produced in the catfish described above has been applied. Curves made using values from both experiments are plotted, have a similar shape, in general a bell shape, the curve from the batches that have been treated with reactants in higher concentrations, however, shows a somewhat more pronounced increase and garbage on. Carriers that produce excellent cell growth are obtained from each batch.

Example 4

Herstellung von Zellkulturmikroträgem unter Einhaltung wechselnder Verhältnisse Amin/AlkaliProduction of cell culture microcarriers in compliance changing amine / alkali ratios

Dieses Beispiel erläutert weitere Veränderungen der Ladungskapazität, die durch Veränderung der Verhältnisse DEAE Chlorid: Chlorid/NaOH erzielt werden. Zur Durchführung dieses Beispiels wird die in Beispiel 3 beschriebene Arbeitsweise eingehalten, mit der Ausnahme, daß ein breiter Konzentrationsbereich an Natriumhydroxid verwendet wird, während die Konzentration an Diäthylaminoäthylchiorid: Chlorid bei 0,01 Mol pro 20 ml gehalten wird. Die Konzentrationen an Natriumhydroxid betragen 0,01, 0,011, 0,012, 0,013, 0,014, 0,015, 0,02, 0,03, 0,05, 0,75 und 0,10 Mol pro 20 ml.This example illustrates further changes in the charge capacity that can be brought about by changing the ratios DEAE Chloride: Chloride / NaOH can be achieved. To carry out this example, the procedure described in Example 3 procedure described, with the exception that a wide range of sodium hydroxide concentration is used while the concentration of Diethylaminoäthylchiorid: chloride at 0.01 mol per 20 ml is held. The concentrations of sodium hydroxide are 0.01, 0.011, 0.012, 0.013, 0.014, 0.015, 0.02, 0.03, 0.05, 0.75 and 0.10 moles per 20 ml.

Nach 1,25 Stunden bei 60° C werden die Werte von mÄg in Abhängigkeit von der Konzentration an Natriumhydroxid aufgetragen. Aus der graphischen Darstellung ersieht man, daß Natriumhydroxidkonzentrationen von weniger als ungefähr 0,01 keine feststellbare Ladungskapazität erzeugen. Die Ladungskapazität steigt jedoch schnell mit einer Zunahme der Konzentration an und erreicht ein Maximum von etwa 2,3 mÄq/g desAfter 1.25 hours at 60 ° C, the values of mÄg become dependent on the concentration of sodium hydroxide applied. From the graph it can be seen that sodium hydroxide concentrations less than about 0.01 produce no detectable charge capacity. The charge capacity increases however, it increases rapidly with an increase in concentration, reaching a maximum of about 2.3 meq / g des

trockenen vernetzten Dextrans bei einer Konzentration von ungefähr 0,014 Mol Natriumhydroxid. Die Ladungskapazität nimmt dann praktisch linear bis auf einen Wert von ungefähr 1,1 mÄq/g bei einer Natriumhydroxidkonzentration von ungefähr 0,10 Mol ab. Eine Veränderung der Reaktionskinetik erfolgt daher, wenn das Verhältnis DEAE-Chlorld : Chlorid zu Natriumhydroxid bei einer konstanten Konzentration von DEAE-Chlorld : Chlorid und vernetztem Dextran variiert wird.dry cross-linked dextran at one concentration from about 0.014 moles of sodium hydroxide. The charge capacity then increases practically linearly up to one value from about 1.1 meq / g at a sodium hydroxide concentration of about 0.10 mole. A change the reaction kinetics therefore takes place when the ratio DEAE-Chlorld: chloride to sodium hydroxide at a constant concentration of DEAE-Chlorld: chloride and cross-linked dextran is varied.

Example 5

Herstellung von menschlichem Interferon in Zellen, die auf verbesserten Mlkroträgern gezüchtet worden sindProduction of human interferon in cells that have been grown on improved milk carriers

Nachfolgend wird die Fähigkeit von auf Mlkroträgern gezüchteten Zellen zur Gewinnung von menschlichem Interferon beschrieben. Die für die Herstellung von menschlichem Interferon eingesetzten Zellen sind normale diplolde menschliche Vorhautflbroblasten (FS-4). Diese Flbroblasten werden In Mlkroträgerkulturen unter Anwendung der In Beispiel 2 beschriebenen Methode gezüchtet. Gemäß Beispiel 1 hergestellte und titrierte Mikroträger werden In einer Konzentration von 5 g trokkenem vernetztem Dextran/I verwendet. Das für das Kulturwachstum verwendete Medium besteht aus DMEM, ergänzt mit 10% Kälberfötusserum.The following is the ability to use on oil carriers cultured cells for the production of human interferon. The ones used for the production of cells used in human interferon are normal diplomatic human foreskin flbroblasts (FS-4). These fluid blasts are grown in culture media using the method described in Example 2 bred. Microcarriers produced and titrated according to Example 1 are used in a concentration of 5 g dry cross-linked dextran / I used. The medium used for culture growth consists of DMEM supplemented with 10% fetal calf serum.

Nach 8 bis 10 Tagen hört das Wachstum der Kulturen auf. Zu diesem Zeltpunkt wird das Wachstumsmedium entfernt. Die Kulturen werden ein- bis viermal mit 100 ml serumfreien DMEM gewaschen. Die Zellen sind dann für die Interferonlnduktlon fertig. Diese erfolgt durch Zugabe von 50 ml serumfreien DMEM-Medlum, das 50 μg/ml Cyclohexamld sowie wechselnde Mengen Poly I · Poly C-Induktlonsmittel enthält, zu den Kulturen. Nach 4 Stunden wird Actinomycln D den Kulturen zur Einstellung einer Endkonzentratlon von 1 ug/ml zugesetzt.After 8 to 10 days, the cultures stop growing. This is where the growth medium becomes removed. The cultures are used one to four times 100 ml of serum-free DMEM washed. The cells are then ready for interferon induction. This takes place by adding 50 ml of serum-free DMEM medium, the 50 μg / ml cyclohexamine and varying amounts Contains poly I · poly C inducers, add to the cultures. After 4 hours, Actinomycln D is added to the cultures to adjust a final concentration of 1 µg / ml added.

5 Stunden nach dem Einsetzen der Induktion wird das indufctionsmedium dekantiert, worauf die Kuiiuren dreibis viermal mit 100 ml warmem serumfreien DMEM gewaschen werden. Die Kulturen werden mit 50 ml DMEM aufgefrischt, das 0,5% menschliches Plasmaprotein enthält. Die Kulturen werden unter Stanuardbedlngungen während weiterer 18 Stunden bebrütet. Zu diesem Zeltpunkt werden die Kulturen dekantiert, worauf das dekantierte Medium auf seine Interferonaktivität untersucht wird. Die Interferonaktivität wird in der Welse ermittelt, daß das 50% Ausmaß des Zellenschutzes von Proben und Standardlösungen von FS-4-Fibroblasten J₀ ermittelt wird, die mit Vesicular Stomatitis Viren (VSV), Indiana-Stamm, herausgefordert worden sind. Die Ergebnisse der Interferonerzeugungsversuche sind nachfolgend tabellarisch zusammengefaßt:5 hours after the onset of induction, the induction medium is decanted, whereupon the cures are washed three to four times with 100 ml of warm, serum-free DMEM. The cultures are replenished with 50 ml of DMEM containing 0.5% human plasma protein. The cultures are incubated under Stanuard conditions for a further 18 hours. At this point, the cultures are decanted, whereupon the decanted medium is examined for its interferon activity. The interferon activity is determined in such a way that the 50% degree of cell protection is determined from samples and standard solutions of FS-4 fibroblasts J ₀ which have been challenged with Vesicular Stomatitis Virus (VSV), Indiana strain. The results of the interferon generation experiments are summarized in the following table:

Induktionsmittel
konzentration,
μ§/ΓΠΐ Induction agent
concentration,
μ§ / ΓΠΐ Zellenkonzentration
während der Erzeugung,
Zellen/mlCell concentration
during generation,
Cells / ml Interferon,
U/10⁶ ZellenInterferon,
U / 10 ⁶ cells 44th 2,0 X 10«2.0 X 10 " 3939 55 2,6 X 10⁶ 2.6 X 10 ⁶ 378378 2525th 2,6 X 10⁶ 2.6 X 10 ⁶ 886886 5050 2,0 X 10⁶ 2.0 X 10 ⁶ -5 000-5,000

Diese Werte stammen aus jeweils getrennten Versuchen und sollen nicht irgendeine Beziehung zu der Induktionsmittelkonzentration wiedergeben.These values are from separate experiments in each case and are not intended to have any relationship to the Show induction agent concentration.

Example 6

Wachstum von Zellen auf d*-n Zellkulturmikroträgern zur Erzeugung von VirenGrowth of cells on d * -n cell culture microcarriers for the generation of viruses

Die Fähigkeit von Mlkroträger-gezüciueten Zellen zur Erzeugung eines Virus wird nachfolgend beschrieben. Primäre und sekundäre Hühnerembryoflbroblasten werden In einer Mlkroträgerkultur nach der In Beispiel 2 beschriebenen Methode gezüchtet, wobei die primären Zellen bei einer Mlkroträgerkonzentratlon von 10 g/l und die sekundären Zellen bei einer Mikroträgerkonzentration von 5 g/l gezüchtet werden. Zur Initiierung der Viruserzeugung wird das Wachstumsmedium entfernt, worauf die Kulturen zweimal mit 100 ml serumfreien DMEM gewaschen werden. Die Infizierung der Zellen mit Slndbls-Virus erfolgt in 50 ml DMEM, ergänzt mit 1% Kälberserum, 2% Tryptosephosphatbrühe sowie soviel Slndbls-Vlren, die einem MOI-Wert von 0,05 (Multlpllzltät der Infektion) entsprechen.The ability of carrier-grown cells to produce virus is described below. Primary and secondary chicken embryo broblasts are cultured in a microcarrier culture according to the method described in Example 2, the primary cells being cultured at a microcarrier concentration of 10 g / l and the secondary cells being cultured at a microcarrier concentration of 5 g / l. To initiate virus production, the growth medium is removed and the cultures are washed twice with 100 ml of serum-free DMEM. The cells are infected with slndbls virus in 50 ml of DMEM, supplemented with 1% calf serum, 2% tryptose phosphate broth and as much slndbls virus as corresponds to an MOI value of 0.05 (multiplicity of infection).

Das Virus wirH 24 Stunden nach der Infektion durch Sammeln der Kulturbrühe, Klären durch geringes Zentrifugleren and Einfrieren der überstehenden Flüssigkeit gehärtet. Die Virusproduktion wird durch Plattenbildung in einem Feld sekundärer Hühnerflbroblasten untersucht. Die Ergebnisse der Infektion dieser Mlkroträgerkulturen sind folgende:The virus passes through 24 hours after infection Collect the culture broth, clarify by slight centrifugation and freeze the supernatant liquid hardened. Virus production is examined by plate formation in a field of secondary chicken broblasts. The results of the infection of these carrier cultures are the following:

Sekundär 4,0 X 10⁶
Primär 1,4 x 10⁶
Primär 6,0 x 10⁶ Secondary 4.0 X 10 ⁶
Primary 1.4 x 10 ⁶
Primary 6.0 x 10 ⁶

8,4 X 10« 2 100
2,3 x 10¹⁰ 16 000
2.6X10¹⁰ 5 0008.4 X 10 «2 100
2.3 x 10 ¹⁰ 16 000
2.6X10 ¹⁰ 5 000

telnislert und für eine weitere Analyse konzentrle.t werden. Telnislert and concentrated for further analysis.

Eine aus 50 Rollflaschen bestehende Kultur enthält ungefähr 10' Zellen. Diese werden mit ungefähr 1 1 Vlruslnokulum (3 χ 10' plattenbildende Einheiten pro ml) infiziert. Dies bedingt eine nominelle Multiplizltät der Infektion von 1 bis 3. Die Infizierten Zellen ergeben 5 bis 20 Nanogramm virusspezifische DNA.A 50 roller bottle culture contains approximately 10 'cells. These are inoculum with about 1 liter (3 χ 10 'plate-forming units per ml) infected. This requires a nominal multiplicity of the Infection from 1 to 3. The infected cells give 5 to 20 nanograms of virus-specific DNA.

Eine einfachere Methode wurde unter VerwendungA simpler method was using

ίο von erflndungsgemäßen Mlkroträgern entwickelt. Line Kultur, die 10 g Kügelchen In 1 I Wachstumsmedium enthält, wird verwendet. Nach dem Erreichen der Konfluenz werden die 10'-Zellen auf den Kügelchen In der Welse Infiziert, daß man die Kügelchen absitzen läßt undίο Developed from garbage carriers according to the invention. Line Culture containing 10 g of beads in 1 L of growth medium is used. After reaching confluence the 10 'cells on the beads are infected in the catfish by allowing the beads to settle and

is das Medium durch 1 I Vlruslnokulum ersetzt. Zur Extraktion werden die Zellen auf den Kügelchen mit Puffer gewaschen und dann In SDS enthaltenden Puffer gegeben. Nach der Copreclpltatlon der DNA mit hohem Molekulargewicht mit dem Detergens wird der Nlederschlag zusammen mit den Kügeichen abzemrifugiert und eine überstehende Flüssigkeit für eine weitere Analyse extrahiert. Die Ausbeute an Virus-DNA ist vergleichbar mit derjenigen, die In einer Rollflaschenkultur erzielt wird, wobei der Arbeltsaufwand 5 bis 10% des Aufwandes beträgt, der Im Falle der Rollflaschenkultur erforderlich Ist.the medium is replaced by 1 liter of blood inoculum. To the After extraction, the cells on the beads are washed with buffer and then in SDS-containing buffer given. After coprecipitation of the high molecular weight DNA with the detergent, the leather coat becomes centrifuged together with the kittens and a supernatant for further analysis extracted. The viral DNA yield is comparable to that obtained in a roller bottle culture where the work effort is 5 to 10% of the effort which is required in the case of roller bottle culture.

Zellentyp Gesamtkonzentr-tion PFU/ml PFU/Zelle zur Herstellung
(Zellen/ml)Cell type Total concentration PFU / ml PFU / cell for production
(Cells / ml)

3535

Die Viruserzeugung wird ferner für die folgenden -to Kombinationen aus Viren und Zellen auf Mlkroträgern ermittelt: Polio/Wl-38, Moloney MuLV/CI-1 Maus und VSV/Hühnerembryoflbroblasten.Virus production is also used for the following -to Combinations of viruses and cells on milk carriers determined: Polio / Wl-38, Moloney MuLV / CI-1 mouse and VSV / chick embryo broblasts.

4545

Example 7

Vergleichswachstum von Zellen In Rollflaschen unter Einsatz der Zellkulturmikroträger zur Herstellung von Mäuseleukämievirus-Provlrus-DNAComparative growth of cells In roller bottles using the cell culture microcarriers for the production of Mouse leukemia virus provlrus DNA

5050

Die mit reverser Transcriptase gebildete DNA von Moloney Leukämievirus (M-MuLV) wird nach einer Infektion von JLS-V 9-Zellen aus Mäusemarkknochen untersucht.The reverse transcriptase generated DNA from Moloney Leukemia Virus (M-MuLV) is generated after infection of JLS-V 9 cells from mouse marrow bones examined.

Eine Methode besteht darin. Zellen In gerollten Flasehen zu züchten. Die Zellen werden in einer Rollflaschenkultur gezüchtet, worauf das Medium entfernt und das Virusinokulum In die Flaschen eingeführt wird. Kurz danach werden die Kulturen mit frischem Medium versetzt und 8 bis 16 Stunden später für eine evtl. Reinigung von Virus-DNA extrahiert. Die Kulturen werden mit frischem Puffer gewaschen und die Zellen mit einer Lösung lysiert, die das Detergens Natriumdodecylsulfat enthält. Die abschließende Abkühlung des Lysats sowie die Zugabe von Salz (1 Molar) verursacht eine Coprecipitation des Detergenses mit DNA mit hohem Molekulargewicht. Die DNA mit niederem Molekulargewicht, die in der überstehenden Flüssigkeit zurückbleibt, kann entpro-Beisplel 8One method is that. Cells in rolled bottles to breed. The cells are grown in roller bottle culture and the medium removed and the virus inoculum is introduced into the bottles. Short then the cultures are mixed with fresh medium and extracted 8 to 16 hours later for a possible purification of virus DNA. The cultures are made with fresh Washed buffer and the cells lysed with a solution containing the detergent sodium dodecyl sulfate. The subsequent cooling of the lysate and the addition of salt (1 molar) cause coprecipitation of high molecular weight DNA detergent. The low molecular weight DNA found in of the excess liquid remains, entpro-Beisplel 8

Herstellung von Zellkulturmikroträgern mit
Dlmethylamlnoäthyl-LadungsgruppenManufacture of cell culture microcarriers with
Methylaminoethyl charge groups

Ein geeigneter Mikroträger wird In der Welse erzeugt, daß ein anderer Austauscheranteil mit der Dextranmatrlx gemäß Beispiel 1 verknüpft wird. Dlmethylamlnoäthylgruppen (DMAE) werden mit einer Dextranmatrlx nach der folgenden Methode verknüpft: 1 g Dextrankügelchen (Pharmacia G-50) mit einem Durchmesser von 50 bis 75 pm Im trockenen Zustand werden zu 10 ml destilliertem Wasser gegeben, worauf man die Kügelchen anquellen läßt. Eine wäßrige Lösung, die 0,01 Mol Dlmethylamlnoäthylchlorld: Chlorid und 0,015 Mol Natriumhydroxid enthält, wird mit einem Volumen von 10 ml hergestellt. Diese wäßrige Lösung wird den gequollenen Dextrankügelchen zugesetzt. Die erhaltene Suspension wird dann kräftig während einer Zeltspanne von 1 Stunde bei 60° C bewegt. Nach der Umsetzung wird die Kügelchenmasse wie In Beispiel 1 titriert. Diese Reaktion bindet 1,0 mÄq Dlmethylaminoäthyl mit der Dextranmasse. Zur Erzeugung von Zellkulturmikroträgern mit größerem Substitutionsgrad wird die vorstehend beschriebene Reaktion durchgeführt, worauf die Kugelmasse gründlich mit Wasser gewaschen wird. Nachdem der Wasserüberschuß abfiltriert worden ist, wird die Kügelchenmasse gewogen, um die Menge an Wasser, die von der Kügelchenmasse festgehalten wird, zu bestimmen. Diese Masse wird dann mit der entsprechenden Menge an frischen Reagentien (d. h. DMAE-CL: CL und NaOH) in der Weise versetzt, daß die Endkonzentration an DMAE und NaOH in diesen darauffolgenden Reaktionsmischungen Identisch mit der anfangs eingehaltenen ist.A suitable microcarrier is produced in such a way that another portion of the exchanger is linked to the dextran matrix according to Example 1. Dimethylaminoethyl groups (DMAE) are linked to a dextran matrix according to the following method: 1 g of dextran beads (Pharmacia G-50) with a diameter of 50 to 75 μm. When dry, add to 10 ml of distilled water, whereupon the beads are allowed to swell. An aqueous solution containing 0.01 mol of methylaminoethyl chloride: chloride and 0.015 mol of sodium hydroxide is prepared with a volume of 10 ml. This aqueous solution is added to the swollen dextran beads. The suspension obtained is then vigorously agitated at 60 ° C. for a period of 1 hour. After the reaction, the bead mass is titrated as in Example 1. This reaction binds 1.0 meq of dimethylaminoethyl with the dextran mass. To generate cell culture microcarriers with a greater degree of substitution, the reaction described above is carried out, after which the ball mass is washed thoroughly with water. After the excess water is filtered off , the bead mass is weighed to determine the amount of water held by the bead mass. This mass is then mixed with the appropriate amount of fresh reagents (ie DMAE-CL: CL and NaOH) in such a way that the final concentration of DMAE and NaOH in these subsequent reaction mixtures is identical to that initially observed.

Auf diese Weise wird eine Reihe von Zellkulturmlicroträgern mit 1,0, 2,0, 2,5 und 3,5 mÄq DMAE/g nichtumgesetztem Dextran hergestellt. Zellen werden In einem Zellkulturmlkroträger (5 g/l) mit diesen Zellkulturmikroträgern nach der Methode gemäß Beispiel 2 gezüchtet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt: In this way, a number of cell culture microcarriers are created made with 1.0, 2.0, 2.5 and 3.5 meq DMAE / g unreacted dextran. Cells are in one Cell culture microcarriers (5 g / l) grown with these cell culture microcarriers according to the method according to Example 2. The results are summarized in the following table:

Substitutionsgrad, Zellenausbreitung
mÄq/gDegree of substitution, cell spread
meq / g

NettowachstumNet growth

1,0
2,0
24
3,21.0
2.0
24
3.2

Wie erwartet, steht das Zellenwachstum in einer Beziehung zu dem Substitutionsgrad mit ladungstragenden Gruppen. Bei einem zu hohen Substitutionsgrad erfolgt kein Zellenwachstum, obwohl eine Verknüpfung und eine Ausbreitung erfolgt. Bei einem zu niedrigen Substitutionsgrad reicht das Haften der Zellen an die Oberfläche nicht aus, um ein ausreichendes Ausbreiten und Wachstum zu ermöglichen.As expected, cell growth is related to the degree of substitution with charge-carrying cells Groups. If the degree of substitution is too high, there is no cell growth, although a link and a spread occurs. If the degree of substitution is too low, the cells will suffice to adhere to the surface not enough to allow sufficient spread and growth.

Example 9

Herstellung von Zellkulturmikroträgern mit positiv
geladenen PhosphoniumgruppenProduction of cell culture microcarriers with positive
charged phosphonium groups

Zellkukurmikroträger werden ferner unter Einsatz von N'ichtaminaustauschergruppen in der folgenden Weise hergestellt: 1 g trockener Dextrankügelchen werden hergestellt und mit Wasser wie in Beispiel 1 gequollen. Den gequollenen Kügelchen werden 5 ml einer gesattigten wäßrigen Losung von Triäthyl-(äthylbromid)-phosphonium (TEP)Cell nuclei microcarriers are also used using Non-amine exchange groups prepared in the following manner: 1 g of dry dextran beads are prepared and swollen with water as in Example 1. The swollen beads are added 5 ml of a saturated aqueous solution of triethyl (ethyl bromide) phosphonium (TEP)

C2H5V y CjHjC2H5V y CjHj

C2H5C2H5

und 5 ml einer 3 molaren Lösung von Natriumhydroxid zugesetzt. Diese Aufschlämmung wird bei 65° C zur Umsetzung gebracht. Eine Reihe Zellkulturmikroträger wird mit 1,1,1,7 und 2,9 mÄq/g hergestellt Die Zellkulturmikroträger mit 1,1 mÄq/g werden durch Umsetzung unter den vorstehend angegebenen Bedingungen während einer Zeitspanne von 4 Minuten hergestellt. Der 1,7 mÄq/g-Zellkulturmikroträger wird während einer Zeitspanne von 1 Stunde und die 2,9 mÄq/g-Zellkulturmikroträger aufeinanderfolgend dreimal wie in Beispiel 7 umgesetzt. Eine Mikroträgerzellenkultur mit 5 g/l wird für jeden dieser Träger mit einem kontinuierlichen Zellentyp, und zwar JLS-V9, hergestellt, worauf ein Vergleich zu dem Wachstum dieser Zellen an DEAE-Mikroträgern durchgeführt wird, die v/ie in Beispiel 3 hergestellt worden sind. Die Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle hervor.and 5 ml of a 3 molar solution of sodium hydroxide was added. This slurry becomes at 65 ° C Implementation brought. A series of cell culture microcarriers is made at 1.1, 1.7 and 2.9 meq / g. The cell culture microcarriers at 1.1 meq / g are by reaction under the conditions given above during a period of 4 minutes. The 1.7 meq / g cell culture microcarrier is used for a period of time of 1 hour and the 2.9 meq / g cell culture microcarriers consecutively three times as in Example 7 implemented. A microcarrier cell culture of 5 g / l is used for each of these carriers with a continuous cell type, namely JLS-V9, whereupon a comparison with the growth of these cells on DEAE microcarriers which v / ie have been prepared in Example 3 is carried out. The results go from the following Table.

20 Zeüenverknüpfung
und Ausbreitung 20 Linking Lines
and spread

NettowachstumNet growth

2525th

DEAE
0,9
1,7
3,8DEAE
0.9
1.7
3.8

1,1
U
2,91.1
U
2.9

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen1 sheet of drawings

Claims

Patent claims:

1. Cell culture media with positively charged chemical Shares, characterized in that by the amount of positively charged chemical Share a charge capacity of 0.1 to 4.5 meq / g of the dry, untreated microcarriers Available.

2. Zellkultunnikroträger according to claim 1, characterized characterized as being positive from crosslinked dextran beads with such an amount thereon charged groups that a charge capacity between 0.1 and 4.5 meq / g of the dry crosslinked Dextran beads is present.

3. Zeilkultur microcarrier according to claim 2, characterized characterized in that the positively charged groups consist of Dläthylaminoäthylgruppen.

4. Zeilkulturmikroträger according to claim 1, characterized in that it is a reaction product of crosslinked Dexirui beads and an aqueous solution a tertiary or quaternary amine and a base, the aqueous solution being such an amount of AmIn and base in such a ratio that the microcarriers have a charge capacity of 0.1 to 4.5 meq / g of dry dextran.

5. Zeilkulturmikroträger according to claim 4, characterized in that the amine from diethylaminoethyl consists.

6. ZellkuIturnUkroträger according to claim 5, characterized characterized in that the base is sodium hydroxide.