DE2749989C3

DE2749989C3 - Züchten von verankerungsabhängigen Zellen in einer Mikroträgerkultur

Info

Publication number: DE2749989C3
Application number: DE2749989A
Authority: DE
Inventors: David W. Somerville Levine; William G. Prof. Cambridge Thilly; Daniel I.C. Prof. Belmont Wang; Jason S. Toledo Ohio Wong
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1976-11-11
Filing date: 1977-11-08
Publication date: 1980-07-03
Also published as: AU508398B2; FR2370792B1; JPS5614270B2; IN147612B; BR7707551A; JPS5735953B2; JPS5699790A; SE417108C; SE8006993L; JPS5699789A; FI773377A; SE417108B; DE2759579C2; AU3049177A; FI60407B; DE2749989A1; SE460906B; DE2749989B2; JPS5362889A; NL177926B

Description

Anteile an den vernetzten Dextranküpelchen aus tertiären oder quaternären Amingrupper. bestehen.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die positiv peladenen chemischen Anteile an den vernetzten Dextrankiigclchen aus Diäthylaminonthylgruppen bcM.-hen.

Erfindungspci'cnsrjnd ist <Jas 1. 1 Pa'en'Anspruch 1 angegebene Veiijhicn. Die P.· · tan*-nru'che 2 b-s '> pennen Ausgestaltungen der ·■' f.miur.i η

Das Wachsenlassen von Saugetip·, eilen ist sowohl im Labor- als auch im lnJii.>trierr· ."M.tb wichtig. Im Labormaßstab ist >>f· der begrenzenden l-'akinr l.ir eine Zellen- oder Vi er inte^rsuchung '!ie Menge des Rohmaterials, die für die I n>t τικηιΐ.^ nir Verfügung 4(1 Steht. In industriellem MaßMr>ru· werden große Anstrengungen unternommen. 1 m Phama/'ntika juf der Grundlage von SäugeiiT/fi'prodntc.-jn /u entwickeln. Es handelt s'ch dabei hjupts;;_thich jm Impfstoffe gegen menschliche "der tierische Viren, iedoch auch um 4-, menschliche Wachstumshormone sowie andere Korperhormone sowie Riochemikalien lur medi/imsche Anwendungszwrcke.

Einige Säugcliei zeiltypen wurden für ein Wachstum in Suspenionskultu'en adaptiert Beispiele fur derartige yi Zelltypen sind llel.a (menschlich). BUK (Babyhamster nieren) sowie 1. /eilen (Mäuse). Derartige Zellen weisen im allgemeinen nicht normal genc'ische Komplemente Huf. d.h. /u viele oder /u wenige Chromosomen oder abnormale Chromosomen Oft cveugen diese /eilen y, einen Tumor nach cner Einspritzung 111 ein Tier der entsprechenden S,)e< ic

Andere Säugeticr/c!.typen konnten bisher noch nicht für ein Züchten in einer Suspersionskuliur adaptiert werden. Sie wachsen nur. wenn sie mit einer geeigneten ho Oberfläche verknüpft werden. Derartige Zellentypen werden im allgemeinen als »verankerungsabhängig« bezeichnet. Erwähnt seien 3T3-Mäusefibroblasten, Mäusemarkknochen, Epithelzellen, von Mäusen übertragene Leukämievirus-erzetigende Stämme von Mäusefibroblast-n, primäre und sekundäre Hühnerfibroblasten, Wl-Jti-Menschenfibroblastzellen sowie normale menschliche Embryolungenfibrolastzellen. Einige verankerungsabhängige Zellen wurden gezüchtet, die Tumore verursachen; es konnten jedoch auch andere gezüchtet werden, die keinen Tumor bedingen. Auch können einige verankerungsabhängige Zellen gezüchtet werden, die genetisch normal sind.

Beträchtliche Fortschritte sind bei der Säugetierzellenvermehrung in großtechnischem Maßstabe unter Einsatz von Vorrichtungen erzielt worden, in denen Suspension-skulturen gezüchtet werden können. Bezüglich der großtechnischen Vermehrung von verankerungsabhängigen Säugetierzellen hält sich jedoch der Fortschritt in sehr engen Grenzen. Bisher bekannte Methoden zum großtechnischen Vermehren von verankerungsabhängigen Zellen basieren auf einer linearen Ausdehnung in kleinem Maßstabe durchgeführter "erfahren. In Zellkulturanlagen wird eine große Anzahl von chargenweise betriebenen Reaktoren, die niedrige Ausbeuten bedingen, verwendet, und zwar in Form von Schalen, Flaschen, in drehungsversetzten Schläuchen und Flaschen. Es handelt sich dabei jeweils um eine diskrete Einheit oder ein isoliertes chargenweise betriebenes Reaktionsgefäß, wobei jeweils getrennte Kontrollen erforderlich sind. Diese Kontrollen sind jedoch aufgrund wirtschaftlicher Überlegungen sehr primitiv. Veränderungen der Nährmittel wurden durch eine Veränderung des Mediums korrigiert, was eine Maßnahme bedeutet, die zwei Stuten erfordert, und zwar eine Entfernung des Mediums und einen Zusatz des Mediums. Da in einer Anlage mäßiger Größe Hunderte derartiger chargenweise betriebener Reak lionsgefäße eingesetzt werden, erfordert eine einfache Veränderung des Mediums Hunderte von Maßnahmen, die alle genau sowie unter exakt sterilen Bedingungen durchgeführt werden müssen. Eine Vielstufenmaßnah mc. wie eine Zellcnübertragung oder ernte trägt weiter zur Verschärfung dieses Problems bei. Daher sind die Kosten einer derartigen Anlage, der Raumbedarf sowie der Pcrsonalaufwand er! eblich.

Es gibt auch noch andere Methoden /ur linearen Ausweitung von in kleinen (hf pen betriebenen Kulturen. d'e bekanntgeworden sind. Beispielsweise werden in der Literatur als Alternativen Plastikbeutel, aufeinandergestapelte Platten. Spiralfilme. Glaskugel vermehrungseinrichtungen. kunstliche Kapillaren sowie Mikroträger beschrieben. Von diesen Möglichkeiten bieten die Mikron i|icrsystemc bestimmte einzigartige Vorteile Beispielsweise kann eine erhebliche Zunahme des er/ielbaren Verhältnisses von Wachstiimsobcrfla ehe zu Gefäßvolumen (S/V) unter Einsatz von Mikroträgern gegenüber sowohl herkömmlichen als auch in neuerer /cit entwickelten Methoden ei zielt werden. Eine l·rhöhung des erzielbaren S'V Verhältnisses ermöglicht die Konstruktion einer Vermehrungscin richtung, die aus einer homogenen einzigen F.inheit oder einer quas' homogenen Einheit besteht undchargenwei se oder halbchargenweisc unter Erzielung hochvolumi ger Durchsätze betrieben werden kann. F.in einziges mn einem Rührer versehenes Gefäß mit einer einfachen Steuerung für den pH- und nO.-Wert stellt eine homogene Umgebung für eine große Anzahl von Zellen dar. so daß die Notwendigkeit der Verwendung teurer Inkubatoren, die einen erheblichen Raumbedarf bedingen, entfällt. Ferner wird die Gesamtzahl der Operationen, die pro Zelleneinhcit erforderlich ist, drastisch herabgesetzt. Daher scheinen Mikroträger bezüglich der Kapitalinvestition, des Raumbedarfs sowie des Personalbedarfs bei der Herstellung von verankerungsabhängiger· Zellen im Gegensatz zu den herkömmlichen

Erzeugungsmethoden wirtschaftliche Vorteile zu bieten. Mikroträger bieten ferner den Vorteil einer kontinuierlichen Verfahrensweise, da die Zellen in einer gesteuerten Umgebung wachsen. Daher bieten Mikroträger eine Möglichkeit, verankerup.gsabhängige Säugetierzellen unter festeingestellten Umgebungsbedingungen zu züchten, die zur Erzielung eines konstanten und optimalen Zellenwachstums gesteuert werden können.

Eines der bisher bekanntgewordenen vielversprechenden Mikroträgersysteme wird von van Wezel beschrieben und sieht die Verwendung von Diäthylaminoäthyl (DEAE)-substituierten Dextrankügelchen in einem mit einem Rührer versehenen Tank vor (A. L. von Wezel, »Growth of Cell Strains and Primary Cells on Microcarriers in Homogeneous Culture«, Nature 216: 64 [1967]; D. van Hemert, D. G. iCilburn an A. L van Wezel »Homogeneous Cultivation of Animal Cells for the Production of Virus and Virus Products«, Biotechnol. Bioeng 11: 875 [1969] und A. L van Wezel, »Microcarrier Cultures of Animal Cells«, Tissue Culture, Methods and Applications, P. F. Kruse und M. K. Patterson, Academic Press, New York, S. 372 [1973]) Diese Kügelchen werden unter dem Hande^;>namen DEAE-Sephadex A50 (lonenaustauschersystem) in den Handel gebracht. Chemisch werden diese Kügelchen aus einer vernetzten Dextramatrix mit Diäthylaminoäthylgruppen gebildet, die kovalent mit den Dextranketten verknüpft sind. Die im Handel erhältlichen DEAE-Sephadex A50-Kügelchen besitzen eine Teilchengröße von 40 bis 120 μ und eine angenommene jo positive Ladungskapazität von ungefähr 5,4 mÄq/g des trockenen vernetzten Dextrans (wobei das Gewicht der verknüpften DEAE-Anteile unberücksichtigt ist). Andere Anionenaustaiischerharze sollen ebenfalls, wie von van Wezel angegeben wird, das Zellwachstum unter- j-, stützen.

Das von van Wezel vorgeschlagene System kombiniert viele Oberflächen mit beweglichen Oberflächen und gestattet innovative Zellmanipulationen, wöbe' darüber hinaus eine Übertragung in den technischen Maßstab mcjlich ist und Umgebungssteucrungen durchführbar sind. Trotz dieser Fähigkeilen werden diese Methoden noch nicht in merklichem Ausmaße ausgewertet, da Schwierigkeiten bei der Zellenerzeugung infolge bestimmter nachteiliger Effekte festgestellt 4-, werden, die durch die Kügelchen verursacht werden. Von diesen Kachteilen seien ein anfängliches Absterben von Zellen innerhalb eines hohen Prozentsatzes des Zcllinokulums sowie ein unzureichendes Zcllenwaohsturn sogar im Falle von solchen Zellen erwähnt, die -,o vorknüpf! sind. Die Gründe für diese nachteiligen t.ffekte siiid noch nicht restlos aufgeklärt, es wird jedoch vet mutet, da'5 sie auf eine Toxizität der Kugele hen oder auf eine NährmitteladForption zurückgehen (s. van Wezel. A. L.[1967], Nature 216:64-65; A. L. van Wezel « [1973]. Tissue Culture, Methods and Applications; P. R. Kruse und M. R. Patterson. S. 372 - 377. Academic Press. New York; P. van Hemert. D. G. Kilburn und A. L van Wezel [1969], Biotechnol. Bioerg. II: 875-885. C. Horng und W. Mcl.imans [1975], Biotechnol. Bioeng. 17: ω 713-732).

Es könnte sein, daß die nachteiligen Wirkungen dieser im Handel erhältlichen Ionenaustauscherharze auf ihre Herstellungsmethode zurückgehen. Einige dieser Produktionsmethoden für Polyhydroxymaterialien werden &5 beispielsweise in den US-PS 32 77 025, 32 75 576, 30 42 667 und 32 08 994 beschrieben. Unabhängig von dem Grund sind die ücrcil im Handel erhählichen Materialien einfach für ein gutes Zellenwachstum einer erheblichen Vielzahl von Zelltypen nicht zufriedenstellend.

Eine Lösung zur Beseitigung der nachteiligen Wirkungen, die dann festgestellt werden, wenn man im Handel erhältliche Mikroträger für ein Zellenwachstum verwenden will, wird in der US-PS 40 36 693 beschrieben. Diese US-PS beschreibt ein Verfahren zur Behandlung dieser im Handel erhählichen Ionenaustauscherharze mit makroretikularen Polyanionen, wie Carboxymethylcellulose. Diese Methode hat sich zwar als erfolgreich erwiesen, es wäre jedoch noch vorteilhpfter, wenn die Kügelchen von Anfang an so hergestellt werden können, daß sie Eigenschaften besitzen, die für ein ausgezeichnetes Wachstum von verankerungsabhängigen Zellen geeignet sind.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die Ladungskapazität von Mikroirägern eingestellt und/ oder innerhalb eines bestimmten Bereiches gesteuert werden muß, damit ein gutes Wachstum einer Vielzahl von verankerungsabhängigen Zelltyp⁰-¹ bei vernünftiger Mikroträgerknn7entrationen eme·* werden kann. Unter Berücksichtigung dieser Erkenntnis wurden Mikroträgerkügelchen mit gesteuerten Ladungskapazitäten erzeugt. Unter Einsatz dieser Kügelchen isi ein gutes Wachstum einer Vielzahl von verankerungsabhängigen Zellen möglich. Unter Verwendung dieser Mikroträgersysteme gezüchtete Zellen können gehärtet oder zur Herstellung von Tier- oder Pflanzenviren. Impfstoffen, Hormonen. Interferon oder anderen Zeilwachstumsnebenproduku-n verwendet werden.

Ein Beispiel für die verbesserten Mikroträger sind solche Mikroträger, die unter Verwendung von Polymeren mit daran sitzenden Hydroxygruppen erzeugt worden sind, beispielsweise vernetzte Dextrankügelchen. Diese Kügelchen können mit einer wäßrigen Lösung eines tertiären oder quaternären Amins, wie Diälhylaminoäthylchlorid : Chlorid, sowie einem alkalischen Material, wie Natriumhydroxid, behandelt werden. Die spezifische Ladungskapazität der Kügelchen wird durch Veränderung der absoluten Mengen an Dexfan. tertiärem Aminsalz und alkalischem Material gesteuert, wobei das Verhältnis dieser Materialien und/oder die Behandlungszeit und -tempen»tur eben falls variiert werden können.

Derart hergestellte Mikroträger können in Kulturen cingesetz¹ werden, ohne daß dabei ein hoher Anteil an Zellen anfänglich verlorengeht, wie dies bisher bei der Verwendung von im Handel erhählichen Mikroträgcrn festgestellt wurde. Ferner breiten sich gebundene Zellen auf den Kügelchen aus und wachsen zusammen, wobei extrem hohe Zellkon/entrationen in dem Suspensionsmedium erzielt werden. Die Konzentration vo:· Mikroträgern in Suspension ist nicht auf sehr niedrige Gciialtc beschränkt, so wie dies im Falle der bisher bekannten Materialien festgestellt wurde. Pas Zellcnwachstum scheint nur durch Faktoren begrenzt zu werden, die nicht in einem Zusammenhang mit den Mikroträgern stehen. Aufgrund dieser Tatsachen läßt sich eine erhebliche Zunahme der volumetrischen Produktivität von Zellkulturen erzielen. Nunmehr ist es möglich, die Vorteile auszuschöpfen, die bei der Verwendung von Mikroträgern beim Wachsäum von Zellen möglich sind, insbesondere beim Züchten von verankerungsabhängigen Zellen.

Die Erfindung wird durch die Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 eine graphische Darstellung, welche die

Wachütumscharakteristiken normaler diploider menschlicher Embryolungenfibroblastzellen bei einer Mikroträgerkonzentration von 2 g trockenen vernetztem Dextran/Liter sowohl im Falle vun im Handel erhältlichen DEAE-behandelfen Dextfafimikrotfägefn als auch effindüngsgemäD erzeugten DEAE-behahdelten Mikroträgern wiedergibt,

Fig.2 eine graphische Darstellung, welche die Wachstumscharaktcristiken von sowohl normalen di-.ploiden menschlichen Embryolungenfibroblastzellen als auch von sekundären Hühnefembfyöfibroblaslen bei einer Mikroträgerkonzentration von 5 g trockenem vernetztem Dextran/Liter unter Verwendung der verbesserten DEAE-behandelten Mikroträger wiedergibt.

linier dem Begriff »Mikroträger«, »Zellkulturmikroträger« sowie »Zellwachstumsmikroträger« sind kleine diskrete Teilchen zu verstehen, die für eine Zellenverkriüufünc und wachstum geeignet sind. Oft wenn a""h nicht immer, sind Mikroträger poröse Kügelchen, die aus Polymeren gebildet werden. Gewöhnlich verknüpfen sich die Zellen mit den äußeren Oberflächen derartiger Kügelchen und wachsen darauf.

Wie vorstehend erwähnt, wurde nunmehr gefunden, daß das Ausmaß der Ladungskapazität auf den Zellkulturmikroträgern auf einen bestimmten Bereich für ein ausreichendes Zellwachstum bei vernünftigen Mikroträgerkonzentrationen eingestellt und/oder gesteuert werden muß. Geeignete Arbeitsbereiche sowie bevorzugte Bereiche hängen von verschiedenen Faktoren ab, wie den jeweils zu züchtenden Zellen, der Art der Mikroträger, der Konzentration der Mikroträger sowie von anderen Kulturparametern, beispielsweise der Zusammensetzung des Mediums, ab. In allen Fällen liegt jedoch das Ausmaß der Ladungskapazität, das sich als geeignet erwiesen hat, deutlich unter dem Ausmaß, das auf im Handel erhältlichen Anionenaustauscherharzen zu finden ist, wie sie bisher für Mikroträgerzellkulturen eingesetzt worden sind. Beispielsweise nimmt man an. daß die DEAE-Sephadex ASO-Kügelchen, die von van Wezel vorgeschlagen wurden, eine Ladungskapazität von ungefähr 5,4 mÄq/g des trockenen und nichtbehandelten (ohne DEAE) vernetzten Dextrans aufweisen. Im Gegensatz zu dieser relativ hohen Ladungskapazität wurden erfindungsgemäß Mikroträger verwendet, die sich für ein gutes Zellenwachstum als geeignet erwiesen haben, die eine Ladungskapazität zwischen ungefähr 0.1 und ungefähr 4,5 mÄq/g der trockenen nichtbehandelten Mikroträger aufweisen. Unterhalb ungefähr 0,1 mÄq/g nimmt man an. daß die Zellen sich nur unter Schwierigkeiten mit den Mikroträgern verbinden. Oberhalb ungefähr 4.5 mÄq/g tritt ein Verlust des Ausgangszelleninokulums auf, wobei sogar die überlebenden Zellen nicht gut wachsen, insbesondere bei relativ hohen Mikroträgerkonzentrationen.

Es wurde gefunden, daß zum Wachsen von normalen diploiden menschlichen Fibroblasten auf vernetzten Dextramikroträgern ein bevorzugter Ladungskapazitätsbereich, der durch die DEAE-Gruppen zur Verfugung gestellt wird, 1,0 bis 2,8 mÄq/g des trockenen nichtbehandelten vernetzten Dextrans beträgt. Der bevorzugte Bereich kann in Abhängigkeit von den verschiedenen Zelltypen oder Kulturbedingungen schwanken, man nimmt jedoch an, daß die bevorzugten Bereiche für gegebene Bedingungen zwischen 0,1 und 43 mÄq/g liegen. Die bevorzugten und optimalen Bedingungen können durch Routineexperimente ermittelt werden.

Natürlich gibt es gewisse Schwierigkeiten bei der Bestimmung der Ladungskapazitäl der Mikroträger, bezogen auf eine Einheitsgewichtsbasis. Beispielsweise liefern zwei Kügelchen, die in jeder Hinsicht identisch sind, mit der Ausnahme, daß sie aus Materialien mit verschiedenen Dichten riiit der gleichen Ladungsverteilung darauf hergestellt worden sind, verschiedene Werte für ihre Ladungskapazität pro Gewichtseinheit. In ähnlicher Weise können zwei Kügelchen mit identischen Ladungskapazitäten pro Gewichtseinheit verschiedene Ladüngsverteilungen aufweisen.

Es ist auch eine andere Definition dadurch möglich, daß der Bereich geeigneter Ladungen bezüglich der Ladungskapazität pro Gewichtseinheit der Mikroträger in ihrer fertigen funktioneilen Form spezifiziert wird. Diese Basis würde verschiedene Faktoren berücksichtigen, beispielsweise das Gewicht an gebundenen DEAE- oder anderen positiv geladenen Gruppen sowie die Hydratisierung der Küⁿe!chsn St^ währAnri A\t* bekannte Definition auf trockenem vernetztem Dextran basiert und derartige Faktoren nicht berücksichtigt. In einem wäßrigen Zellenkulturmedium sollte die Dichte der Mikroträger nahe !,Og/ccm liegen, so daß die Mikroträger leicht in der Kultur dispergiert werden können. Auf dieser Basis wurde ermittelt, daß der Bereich geeigneter Ladungskapazitäten für Mikroträger gemäß der Erfindung zwischen ungefähr 0.012 und ungefä)-·' 0.25 mÄq/g beträgt.

Die Bereiche geeigneter Ladungskapazitäten, wie sie vorstehend auf Gewichtsbasis spezifiziert worden sind, gelten unter der Voraussetzung, daß die Mikroträger eine im wesentlichen gleichmäßige Ladungsverteilung über ihre Masse hinweg aufweisen.

Da das Ladungsmuster auf der äußeren Oberfläche wichtig sein kann, ist es außerdem zweckmäßig, daß man in der Lage ist. den geeigneten Ladungskapazitätsbereich im Hinblick auf das wahrscheinliche Oberflächenmuster zu definieren. Dies kann in der Weise geschehen, daß man von der Voraussetzung ausgeht, daß der aktive Teil der Mikroträger nur auf der äußeren Oberfläche der Kügelchen bis zu einer Tiefe von ungefähr 20 Ä liegt. Nimmt man ferner an, daß die geladenen Gruppen in den vorstehend erwähnten Fällen gleichmäßig über die Kügelchen verteilt sind, dann können die erwähnten Bereiche in eine Ladungskapazität in dieser äußeren Schale umgewandelt werden. Bedient man sich dieser Annäherung, dann kann der Bereich der Ladungskapazität, der sich als geeignet erwiesen hat, von ungefähr 0.012 mÄq/cm³ bis ungefähr 0.25 mÄq/cm^! definiert werden. Diese Näherung berücksichtigt Veränderungen des Mikroträ^ ?rvolumens infolge von verschiedenen Ladungsdichten.

Mikroträger mit der erforderlichen Ladungskapazität können in der Weise hergestellt werden, daß Mikroträger aus Polymeren, die daran sitzende Hydroxylgruppen aufweisen, mit einer wäßrigen Lösung eines alkalischen Materials und eines tertiären oder quaternären Amins behandelt werden. Die Kügelchen können zu Beginn in einem wäßrigen Medium ohne die anderen Bestandteile angequollen oder einfach mit einem wäßrigen Medium, das die erforderliche Base und das Amin enthält, kontaktiert werden. Diese Methode unter Einsatz von alkalischen Materialien zum Katalysieren der Verknüpfung von positiv geladenen Aminogruppen mit den Hydroxyl-enthaltenden Polymeren wird in der US-PS 17 77 S70 beschrieber,.

Beispiele für geeignete Hydroxyl-enlhaltende Polymere sind Polysaccharide, wie Dextran. Dextrin. Stärke.

Cellulose, Polyglukose sowie substituierte Derivate dieser Substanzen. Bestimmte synthetische Polymere, wie Polyvinylalkohol sowie hydroxysubstituierte Acrylate oder Methacrylate, beispielsweise Hydroxyäthylmethacrylat, sind ebenfalls geeignet. Dextran, insbesondere verheiztes Dextran in Form von kleinen Kügelchen, ist besonders bevorzugt, da es im Handel erhäifSch und relativ billig ist und Mikroträger erzeugt, die ein ausgezeichnetes Zellwachstum fördern.

Jedes alkalische Material kann für die Reaktion eingesetzt werden. Die Alkalifnetallhyetroxide, wie Natrium· oder Kaliumhydroxid, sind jedoch die zweckmäßigen alkalischen Substanzen. Entweder tertiäre oder quaternäre Amine sind geeignete Quellen für positiv geladene Gruppen, die mit den Hydroxyenthallenden Polymeren verknüpft werden können. Besonders günstige Materialien sind die chlor- oder bromsubstituierten tertiären Amine oder Salze davon,

mid, Dimethylaminoäthylchlorid, Dimethylaminoäthylbromid. Diäthylaminomethylchlorid, Diäthylaminomethylbromid, Di-(hydroxyäthyl)-aminoäthylchlorid, Di-(hydroxyäthyl)-aminoäthylbromtd, Di-(hydroxyäthyl)-aminomethylchlorid, Di(hydroxyäthyl)-aminomethylbromid, ^-Morpholinoäthyläthylchlorid. /3-Morpholinoäthylbromid. ß-Morpholinomethylchlorid. /?-Morpholinomethylbromid sowie Salze davon, beispielsweise die Hydrochloride.

Ein breiter Bereich bezüglich der Reaktionstemperaturen und -zeiten kann eingehalten werden. Zweckmäßig ' erden die Reaktionen bei Temperaturen zwischen ungefähr 18 und 65°C durchgeführt. Man kann jedoch auch andere Temperaturen einhalten. Die Reaktionskinetik hängt in einem erheblichen Ausmaß natürlich von der Reaktionstemperatur sowie der Reaktantenkonzentration ab. Sowohl die Zeit als auch die Temperatur beeinflussen die erzielte F.ndaustauscherkapazität.

Der Grund dafür, daß die Ladungskapazitäl der Mikroträger beim Zellwachstum so kritisch ist, ist bisher noch nicht restlos aufgeklärt. Ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, kann man annehmen, daß die Ladungskapazität auf der Oberfläche bestimmte lokale Diskontinuitäten der mittleren Zusammensetzung bedingt, welche den hauptsächlichen steuernden Einfluß auf das Mikroträgerkulturzellenwachstum ausüben. Dies bedeutet jedoch nicht, daß auch andere Möglichkeiten existieren.

Es kann natürlich auch bestimmte Kügeichen geben, die nicht für ein gutes Zellenwachstum geeignet sind, obwohl sie eine Ladungskapazität aufweisen, die in die vorstehend angegebenen Bereiche fällt. Dies kann auf Seitenketten an dem Anteil zurückzuführen sein, der die Ladungskapazität bedingt, weiche toxisch sind oder anderweitig in nachteiliger Weise das Zellwachstum Beeinflussen. Ferner können adsorbierte oder absorbierte nachteilige Verbindungen oder Zubereitungen vorliegen, außerdem können die Porosität der Kügeichen oder andere Gründe ausschlaggebend sein. Sind derartige Kügeichen nicht für ein Zellenwachstum mit Ausnahme des Ausmaßes der Ladungskapazität geeignet, dann werden sie nicht als »Zellenwachstumsmikroträger« betrachtet.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1
Herstellung von verbesserten Mikroträgern

Verbesserte Mikroträger können in der folgenden Weise hergestellt werden: Trockene, nichtgeladene und vernetzte Dextfankügelchen werden zur Gewinnung von Teilchen mit einem Durchmesser von ungefähr 75 um gesiebt. Ig dieser Fraktion wird zu 10 ml destilliertem Wasser gegeben, worauf die Kügeichen

■-, quellen gelassen werden.

Eine wäßrige Lösung, die 0,01 Mol Diälhylamino· äthylchlorid: Chlorid, zweimal aus Methylenchlorid umkristallisiert, und 0,015 Mol Natriumhydroxid enthält, wird in einem 10 ml Volumen hergestellt. Die wäßrige

ic Lösung wird dann der Suspension aus gequollenen Dextrankügelchen zugesetzt, die dann kräftig in einem Schüttelwasserbad während einer Zeitspanne von 1 Sfunde bei 60°C bewegt wird. Nach einer Stunde werden die Kügeichen von der Reaklionsmischung durch Filtration unter Verwendung eines Whatman-Filterpapiers Nr. 595 abgetrennt und mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen.
Nach dieser Methode hergestellte Kügeichen enthal-

nichtbchandeltem

trockenem nichtbchandeltem vernetzten! Dextran. Diese Ladungskapazität kann durch Messen der Anionenaustauscherfähigkeit der Kügeichen in der folgenden Weise ermittelt werden: Die Kugelzubereitungen werden gründlich mit 0,1 n.HCl zur Sättigung aller Austauscherstellen mit Cl--Ionen gewaschen. Dann erfolgt ein Spülen mit 10-* η HCI zur Entfernung von nichtgebundenen Chloridionen. Anschließend werden die Kügeichen mit einer 10%igen (Gewicht/Gewicht) Natriumsulfatlösung zur Gegenabsättigung der Austauschstellen mit SO-t- gewaschen. Der Ablauf der Natriumsulfatwäsche wird gesammelt und enthält freigesetzte Chloridionen. Diese Lösung wird mit 1 m Silbernitrat unter Verwendung von verdünntem Kaliumchromat als Indikator titriert.

j5 Nach der Titration werden die Kügeichen gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gespült, in PBS suspendiert und im Autoklaven behandelt. Diese Methode liefert hydralisierte Kügeichen mit einem Durchmesser von

ungefähr 120 bis 200 um, die ungefähr 2,OmAq Ladungskapazität pro g trockenem, nichtbehandeltem und vernetztem Dextran tragen.

Beispiel 2

Wachstum von verankerungsabhängigen Zellen mit
erfindungsgemäß eingesetzten Mikroträgern im Gegensatz zu im
Handel erhältlichem Ionenaustauscherharz

Alle Zellen werden in einem modifizierten Dulbecco-Eagle-Medium gezüchtet. Zum Wachsenlassen von normalen diploiden Fibroblasten wird das Medium mit 10% Kälberfötusserum ergänzt. Zum Wachsenlassen von primären und sekundären Hühnerfibroblasten wird das Medium mit 1% Hühnerserum, 1% Kälberserum und 2% Tryptosephosphatbrühe ergänzt. Die Ansätze werden auf 100-mm-KunststoffschaIen behandelt.

Primäre Hühnerembryofibroblasten werden durch Zerkleinern und anschließendes Trypsinisieren von 10 Tagen alten Embryos hergestellt. Sekundäre Hühnerembryofibroblasten werden am ersten Tag des primären Zusammenlaufens durch Trypsinisierung hergestellt. Für in Kunststoffschalen gezüchtete Zellen beträgt die Verdopplungszeit ungefähr 20 Stunden.

Diploide menschliche Fibroblasten, die auf Embryolungen zurückgehen, sind im Handel erhältlich. Diese Zellen besitzen eine Verdoppelungszeit von 19 Stunden

in Kunststoffschalen.

Mikroträgerkuliuren werden dadurch initiiert, daß einfach die Zellen und die Kügdlchen in einer gerührten Kultur vereinigt werden. 100 ml Kulturvolumina in 250-ml-Glasflaschen (6,5 cm Durchmesser), die mit ·, einem magnetisch angetriebenen, mit Teflon überzogenen Rührstab mit einer Abmessung von 4,5 cm ausgestattet sind, werden verwendfit. Die Rührgeschwindigkeit beträgt ungefähr 90 Upm. Es werden direkte Proben aus den Kulturen entnommen. Die Proben werden mikroskopisch untersucht und photographiert. Die Zeilen werden durch Zählen der Keime numeriert, wobei eine Modifizierung der Methode von Sanford et al. (Sanford, K. K., Earle, W. R., Evans, V. J., Waltz, H. K., und Shannon, J. E. [1951] J. Nat. Cancer Inst., 11: 773) wie sie von van Wezel beschrieben wird (van Wezel, A. L. [1973] angewendet wird. Tissue Culture, Methods and Applications. Kruse, P. F. und Patterson, M. R., S. 372 bis 377, Academic Press.

New York) Jd

Kügelchen mit daran gebundenen Zellen werden von dem Kulturmedium in der Weise abgetrennt, daß man die Kügelchen bei 1 g während einer Zeitspanne von wenigen Minuten absetzen läßt, und dann die überstehende Flüssigkeit absaugt. Diese Methode erleichtert erheblich den Ersatz des Mediums sowie die Abtrennung von Zellen von den Mikroträgern nach der Trypsinisierung.

Im Handel erhältliches DEAE Sephadex Λ-50 wird als Mikroträger für die diploiden menschlichen Fibrobla- jo sten verwendet und mit Trägern verglichen, die gemäß Beispiel 1 synthetisiert und titriert worden sind. Im Falle beider Kügelchentypen beträgt die Trägerkonzentration 2 g des trockenen nichtbehandclten und vernetzten Dextrans pro Liter. Die Ladungskapa/ität von DEAE jj Sephadex A-50 beträgt 5.4 mÄq/g des trockenen vernetzten Dextrans. während diejenige der frisch synthetisierten Kügelchen zu 2.0 mÄq/g ermittelt wird. Die Ergebnisse gehen aus der F i g. 1 hervor.

Im Falle dieses Zelltyps wird der Verlust an ursprünglichem Inoculum auf A-50 Mikroträgern festgehalten, während die Fibroblasten sich verknüpfen, vermehren und auf den Mikroträgern gemäß der Erfindung in sechs lagen die Konfluenz erreichen. Dieses Verhalten silmmt mit dem angegebenen 4ί Verhalten dieses Zellentyps auf Standardplatten überein. Wie aus der F i g. 1 ersichtlich ist, beträgt die Endzellendichte, die mit den neuen Mikroträgern bei 2 g des trockenen vernetzten Dextrans/Liter erzielt wird. l,2xl0"Zcllen/ml. W

Bei Kulturen, welche die erfindungsgemäß eingesetzten Träger enthalten, sind weder ein anfänglicher Zellverlust noch eine Inhibierung bezüglich des Errcichens des Zusanimenlaufens festzustellen. Darüber hinaus wachsen die Kulturen, was noch wichtiger ist, normal bei höheren Mikroträgerkonzentrationen. Beispielsweise zeigt die F i g. 2. wie menschliche Fibroblasten sowie sekundäre Hühnerembryofibroblasten die Sättigungskonzentrationen nahe 4 χ l0^b Zellen/ml erreichen, wenn 5 g trockenes vernetztes Dextran pro Liter im Falle der neuen Träger mit einer Ladungskapazität von 2,0 mÄq/g Dextran verwendet werden. Wie ersichtlich, tritt sogar bei dieser relativ hohen Mikroträgerkonzentration kein signifikanter Inokulumverlustauf.

Sekundäre Hühnerembryofibroblasten werden ebenfalls bei einer Mikroträgerkonzentration von 10 g/l gezüchtet. Unter Einhaltung der vorstehend besx-hriebenen Bedingungen wird eine Sättigungskonzentration von 6 χ IO⁶ Zellen/ml erzielt. Setzt man dem Medium ein weiteres Prozent iCälberfötusserum zu, dann wird eine Sättigungskonzentfation von 8xlO⁶ Zellen/ml erzielt. Es wird kein signifikanter Zelleninokulumverlust festgestellt.

Primäre Hühnerembryofibroblasten werden bei einer Mikroträgerkonzentration von 5 und 10 g/I gezüchtet. Die Wachstumseigenschaften sind ähnlich denjenigen der sekundären Hühnerfibroblasten, obwohl leichte Inokulumverluste und etwas längere Verzögerungszeiten festgestellt werden.

Es wurden ferner Versuche unternommen, sekundäre Hühnerembryofibroblasten unter Bedingungen zu züchten, die den vorstehend eingehaltenen ähnlich sind, mit der Ausnahme, daß die DEAE Sephadex A-50 Mikroträger mit Konzentrationen von I und 5 g/l verwendet werde. Es wird kein Zellenwachstum festgestellt und ein signifikanter Inokulumverlust beobachtet.

Be is piel 3

Herstellung von Mikroträgern mit
wechselnden Reaktantenmengen

Mikroträgerchargen werden durch Auflösen von Diäthylaminoäthyl-Chlorid : Chlorid und Natriumhydroxid in 20 ml destilliertem Wasser hergestellt. Die Lösung wird dann über trockene Sephadex G-50-Kügelchen gegossen, worauf die Kügelchen auf einen sich hin- und herbewegenden mit Wasser gefüllten Schüttler (Temperatur 6O⁰C) gebracht werden. Ein Teil der Kugelchargen wird mit einer Lösung behandelt, die 0,01 Mol des Amins und 0.015 Mol Natriumhydroxid enthält, während eine andere Portion mit einer Lösung behandelt wird, die 0,03 Mol des Amins und 0.045 Mol Natriumhydroxid enthält. Die Reaktionszeit wird zur Erzielung von verschiedenen mÄq/g innerhalb einer jeden Charge variiert.

Diploide menschliche Fibroblasten werden in Suspen· sionskulturen bei einer Mikroträgerkonzentration von 5,0 g des trockenen nichtbehandelten vernetzten Dextrans pro Liter nach den in Beispiel 2 beschriebenen Methoden gezüchtet, wobei Mikrotrager verwendet werden, die wechselnde mÄq/g aufweisen und aus jeder Charge ausgewählt werden. Anschließend wird die Produktivität (10⁶ gezüchtete Zellen/Liter-Stunde) berechnet und in Abhängigkeit von mÄq/g für jede Kugelcharge, die in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt worden ist, aufgetragen. Kurven, die unter Verwendung von Werten aus beiden Versuchen aufgetragen werden, besitzen eine ähnliche Form, und zvar im allgemeinen eine Glockenform, die Kurve aus den Chargen, die mit Reaktantcn in höheren Konzentrationen behandelt worden sind, weist jedoch einen etwas steileren Anstieg und Abfall auf. Aus jeder Charge werden Träger erhalten, die ein ausgezeichnetes Zellenwachstum bewirken.

Beispiel 4

Herstellung von Mikroträsern unter Einhaltung
wechselnder Verhältnisse Amin/Alkali

Dieses Beispiel erläutert weitere Veränderungen der Ladungskapazität, die durch Veränderung der Verhältnisse DEAE Chlorid : Chlorid/NaOH erzielt werden. Zur Durchführung dieses Beispiels wird die in Beispiel 3 beschriebene Arbeitsweise eingehalten, mit der Ausnah-

me, daß ein breiter Konzentrationsbereich an Natriumhydroxid verwendet wird, während die Konzentration an Diäthylaminoäthylchlorid : Chlorid bei 0,01 Mol pro 20 ml gehalten wird. Die Konzentrationen an Natriumhydroxid betragen 0,01, 0,011, 0,012, 0,013, 0_f014, 0,015, 0,02,0,03,0,05,0,75 und 0,10 Mol pro 20 ml.

Nach 1,25 Stunden bei 60°C werden die Werte von mÄg in Abhängigkeit von der Konzentration an Natriumhydroxid aufgetragen. Aus der graphischen Darstellung ersieht man, daß Natriumhydroxidkonzentrationen von weniger als ungefähr 0,01 keine feststellbare Ladungskapazität erzeugen. Die Ladungskapazität steigt jedoch schnell mit einer Zunahme der Konzentration an und erreicht ein Maximum von etwa 2,3 mÄq/g des trockenen vernetzten Dextrans bei einer konzentration νυη ungefähr 0,014 Mol Natriumhydroxid. Die Ladungskapazität nimmt dann praktisch linear bis auf einen Wert von ungefähr 1,1 mÄq/g bei einer Natriumhydroxidkonzentration von ungefähr 0,10 Mol ab. Eine Veränderung der Reaktionskinetik erfolgt daher, wenn d.-s Verhältnis DEAE-Chlorid : Chlorid zu Natriumhydroxid bei einer konstanten Konzentration von DEAE-Chlorid : Chlorid und vernetztem Dextran variiert wird.

Beispiel 5

Herstellung von menschlichem Interferon

in Zellen, die auf verbesserten
Mikroträgern gezüchtet worden sind

Nachfolgend wird die Fähigkeit von auf Mikrolrägern gezüchteten Zellen zur Gewinnung von menschlichem Interferon beschrieben. Die für die Herstellung von menschlichem Interferon eingesetzten Zellen sind normale diploide menschliche Vorhautfibroblasten (FS-4). Diese Fibroblasten werden in Mikroträgerkulturen unter Anwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Methode gezüchtet. Gemäß Beispiel 1 hergestellte und titierte Mikroträger werden in einer Konzentration von 5 g trockenem vernetztem Dextran/1 verwendet. Das für das Kulturwachstum verwendete Medium besteht aus DMEM, ergänzt mit 10% Kälberfötusserum.

Nach 8 bis 10 Tagen hört das Wachstum der Kulturen auf. Zu diesem Zeitpunkt wird das w'achsiuinsmerfium entfernt. Die Kulturen werden ein- bis viermal mit 100 ml serumfreien DMEM gewaschen. Die Zellen sind dann für die Interferoninduktion fertig. Diese erfolgt durch Zugabe von 50 ml serumfreien DMEM-Medium, das 50 μg/ml Cyclohexamid sowie wechselnde Mengen Poly I · Poly C-Induktionsmitte! enthält, zu den Kulturen. Nach 4 Stunden wird Actinomycin D den Kulturen zur Einstellung einer Endkonzentration von 1 μg/mI zugesetzt.

5 Stunden nach dem Ersetzen der Induktion wird das Induktionsmedium dekantiert, worauf die Kulturen dreibis viermal mit 100 ml warmem serumfreien DMEM gewaschen werden. Die Kulturen werden mit 50 ml DMEM aufgefrischt, das 0,5% menschliches Plasmaprotein enthält. Die Kulturen werden unter Standardbedingungen während weiterer 18 Stunden bebrütet. Zu diesem Zeitpunkt we den die Kulturen dekantiert, worauf das dekantierte Medium auf seine Interferonaktivität untersucht wird. Die Inteferonaktivität wird in der Weise ermittelt, daß das 50% Ausmaß des Zellenschutzes von Proben und Standardlösungen von FS 4-FibrobIasten ermittelt wird, die mit Vesicular Stomatitis Viren (VSV), Indiana-Stamm, herausgefordert worden sind. Die Ergebnisse der Interferonerzeugungsversuche sind nachfolgend tabellarisch zusammengefaßt:

Induklionsmittel- Zellenkortzentration Interferon konzentration während der Erzeugung

Zellen/ml U/10^ή Zellen

4	2,0 χ 10⁶	39
ίο 5	2,6 X 10⁶	378
25	2,6 x 10*	886
50	2,0 X 10⁶	-5000

Diese Werte stammen aus jeweils getrennten Versuchen und sollen nicht irgendeine Beziehung zu der induktionsmittelkonzcntration wiedergeben.

Beispiel 6

Wachstum von Zellen auf verbesserten

ITlIM WlI UgVI Ii tui LIiIiUUgUIi^ τ ui ■ · ·· v··

Die Fähigkeit von Mikroträger-gezüchteten Zellen zur Erzeugung eines Virus wird nachfolgend beschrieben. Primäre und sekundäre Hühnerembryofibroblasten werden in einer Mikrolrägerkultur nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode gezüchtet, wobei die primären Zellen bei einer Mikroträgerkonzentration von 10 g/l und die sekundären Zellen bei einer Mikroträgerkonzentration von 5 g/l gezüchtet werden. Zur Iniliierung

jo der Viruserzeugung wird das Wachstumsmedium entfernt, worauf die Kultu,en zweimal mit 100ml serumfreien DMEM gewaschen werden. Die Infizierung der Zellen mit Sindbis-Virus erfolgt in 50 ml DMEM, ergänzt mit 1% Kälberserum, 2% Tryptosephosphat-

j5 brühe sowie soviel Sindbis-Viren, die einem MOl-Wert von 0,05 (Multiplizität der Infektion) entsprechen.

Das Virus wird 24 Stunden nach der Infektion durch Sammeln der Kulturbrühe, Klären durch geringes Zentrifugieren und Einfrieren der überstehenden

■ίο Flüssigkeit gehärtet. Die Virusproduktion wird durch Plattenbildung in einem Feld sekundärer Hühnerfibroblasten untersucht. Die Ergebnisse der Infektion dieser Mikroträgerkulturen sind folgende:

Zellentyp	Gesamtkonzen	PFU/ml	PFU/Zelle
	tration zur
	Herstellung
	(Zellen/ml)
Sekundär	4,0 X 10"	8,4 X 10"	2 100
Primär	1,4 X IO⁶	2,3 X 10'°	16 000
Primär	6,0 X 10⁶	?,6 X 10'°	5 000

Die Viruserzeagung wird ferner für die folgenden Kombinationen aus Viren und Zellen auf Mikroträgern ermittelt: PoIio/Wi-38, Moloney MuLV/CI-1 Maus und VSV/Hühnerembryofibroblasten.

B e i s ρ i e I 7

Vergleichswastum von Zellen in Rollflaschen

unter Einsatz von verbesserten Mikroträgern zur

Herstellung von Mäuseleukämievirus-Provirus-DNA

Die mit reverser Transcriptase gebildete DNA von Moioney Leukämievirus (M-MuLV) wird nach einer Infektion von JLS-V9-ZeIIen aus Mäusemarkknochen untersucht

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Eine Methode besteht darin. Zellen in gerollten Flaschen zu züchten. Die Zellen werden in einer Rollflaschenkultur gezüchtet, worauf das Medium entfernt und das Virusinokulum in die Flaschen eingeführt wird. Kurz danach werden die Kulturen mit frischem Medium versetzt und 8 bis 16 Stunden später für eine evtl. Reinigung von Virus-DNA extrahiert Die Kulturen werden mit frischem Puffer gewaschen und die Z-'Ilen mit einer Lösung lysiert, die das Detergens Natriumdodecylsulfat enthält. Die abschließende Abkühlung des Lysats sowie die Zugabe von Salz (1 molar) verursacht eine Coprecipitation des Detergenses mit DNA mit hohem Molekulargewicht Die DNA mit niederem Molekulargewicht, die in der überstehenden Flüssigkeit zurückbleibt, kann entproteinisiert und für eine weitere Analyse konzentriert werden.

Eine aas 50 Rollflaschen bestehende Kultur enthält ungefähr 10^q Zellen. Diese werden mit ungefähr 1 I Virusinokulum (3 χ 10" plattenbildende Einheiten pro ml) infiziert Dies bedingt eine nominelle Multiplizität 2η der Infektion von 1 bis 3. Die infizierten Zellen ergeben 5 bis 20 Nanogramm virusspezifische DNA.

Eine einfachere Methode wurde unter Verwendung von verbesserten erfindungsgemäßen Mikroträgern entwickelt. Eine Kultur, die 10 g Kügelchen in Il 2> Wachstumsmedium enthält, wird verwendet. Nach dem Erreichen der Konfluenz werden die IC-Zellen auf den Kügelchen in der Weise infiziert, daß man die Kügelchen absitzen läßt und das Medium durch 1 I Virusinokulum ersetzt. Zur Extraktion werden die in Zellen auf den Kügelchen mit Puffer gewaschen und dann in SDS enthaltende Puffer gegeben. Nach der Coprecipitalion der DNA mit hohem Molekulargewicht mit dem Detergens wird der Niederschlag zusammen mit den Kügelchen abzentnfugiert und eine überstehen- Jj de Flüssigkeit für eine weitere Analyse extrahiert. Die Ausbeute an Virus-DNA ist vergleichbar mit derjenigen, die in einer Rollflaschenkultur erzielt wird, wobei der Arbeitsaufwand 5 bis 10% des Aufwandes beträgt, der im Falle der Ro'lflaschenkultur erforderlich ist.

Beispiel 8

Verbesserte Mikroträgererzeugung mit Dimet hy laminoäthyl- Ladungsgruppen

Ein geeigneter Mikroträger wird in der Weise erzeugt, daß ein anderer Austauscheranteil mit der Dextranmatrix gemäß Beispiel 1 verknüpft wird. Dimelhylaminoäthylgruppcn (DMAE) werden mit einer Dextranmatrix nach der folgenden Methode verknüpft: in I g Dextrankügelchen mit einem Durchmesser von 50 bis 75 μηι im trockenen Zustand werden zu 10 ml destilliertem Wasser gegeben, worauf man die Kugel chen anquellen laßt. Eine wäßrige Lösung, die 0.01 Mol Dimethylaminoäthylchlorid : Chlorid und 0.015 Mol ii Natriumhydroxid enthält, wird mit einem Volumen von 10 ml hergestellt. Diese wäßrige Lösung wird den gequollenen Dextrankügelchen zugesetzt Die erhaltene Suspension wird dann kräftig während einer Zeitspanne von I Stunde bei 60 C bewegt. Nach der Umsetzung Mi wird die Kügclchenmasse wie in Beispiel I titriert. Diese Reaktion bindet 1,0mÄq Dimclhylaminoäthyl mit der Dexlranmasse. Zur Erzeugung von Mikroträgern mit größerem Subslilutionsgrad wird die vorstehend beschriebene Reaktion durchgeführt, worauf die Kugel- (ιΊ masse gründlich mit Wasser gewaschen wird. Nachdem der Wasserüberschuß abfiltriert worden ist, wird die Kügclchenmasse gewogen, um die Menge an Wasser.

die von der Kugelchenmasse festgehalten wird, zu bestimmen. Diese Masse wird dann mit der entsprechenden Menge an frischen Reagentien (d. h. DMAE-CL: CL und NaOH) in der Weise versetzt, daß die Endkonzentration an DMAE und NaOH in diesen darauffolgenden Reaktionsmischungen identisch mit der anfangs eingehaltenen ist

Auf diese Weise wird eine Reihe von Mokroträgem mit 1,0,2,0,2,5 und 3,5 mÄq DMAE/g mchtumgesetztem Dextran hergestellt Diploide menschliche Firbroplasten werden in einer Mikroträgerkultur (5 g/l) mit diesen Mikroträgern nach der Methode gemäß Beispiel 2 gezüchtet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

Substitutionsgrad Zellenausbreitung Nettowachstum mÄq/g

2,5 + +

3,2 +

Wie erwartet, steht das Zellenwachstum in einer Beziehung zu dem Substitutionsgrad mit ladungstragenden Gruppen. Bei einem zu hohen Substitutionsgrad erfolgt kein Zellenwachslum, obwohl eine Verknüpfung und eine Ausbreitung erfolgt Bei einem zu niedrigen Substitutionsgrad reicht das Haften der Zellen an die Oberfläche nicht aus, um ein ausreichendes Ausbreiten und Wachstum zu ermöglichen.

Beispiel 9

Verbesserte Mikroträger mit positiv
geladenen Phosphoniumgruppen

Verbesserte Miroträger werden ferner unter Einsatz von Nichtaminaustauschergruppen in der folgenden Weise hergestellt: 1 g trockener Dextrankügelchen werden hergestellt und mit Wasser wie in Beispiel I gequollen. Den gequollenen Kügelchen werden 5 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von Triäthyl-(äthylbromid)-phosphonium (TEP)

C₂IU C₂H,

CjII₄Br

C₁IU

und 5 ml einer 3 molaren Lösung von Natriumhydroxid zugesetzt. Die Aufschlämmung wird bei 65"C zur Umsetzung gebracht. Eine Reihe Mikroträger wird mit 1.1. 1.7 und 2.9 mÄq/g hergestellt. Die Mikroträger mit 1,1 mÄq/g werden durch Umsetzung unter den vorstehend angegebenen Bedingungen während einer Zeitspanne von 4 Minuten hergestellt. Der 1.7 niÄq/g-Mikroträgcr wird während einer Zeitspanne von 1 Stunde und die 2.9 mÄq/g-Mikroträger aufeinanderfolgend dreimal wie in Beispiel 7 umgesetzt Eine Mikroträger· zcllcnkültur mit 5 g/l wird für jeden dieser Träger mit einem kontinuierlichen Zcllcntyp, und zwar )LS'V9, hergestellt, worauf ein Vergleich z.u dem Wachstum dieser Zellen an verbesserten DEAE-Mikrolrägern durchgeführt wird, die wie irt Beispiel 3 hergestellt worden sind. Die Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle hervor.

15 16

mÄq/g Zellenverknüpfung Nettowachstum

und Ausbreitung

DEAE 0,9 1,7 3,8

TEP 1,1 1,7 2,9

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Züchten von verankerungsabhängigen Zellen in einer Mikroträgerkultur, da- ^ durch gekennzeichnet, daß man Mikroträger verwendet, bei denen durch die Menge der positiv geladenen chemischen Anteile an den Mikroträgern eine Austauscherkapazität zwischen 0,1 und 4,5 mÄq/g der trockenen nichtbehandelten Mikroträger zur Verfugung steht

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroträger aus vernetzten Dextrankügelchen bestehen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zum Züchten von normalen diploiden menschlichen Fibroplasten die eingesetzten Mikroträger eine Austauscherkapazität 1,0 bis 2,8 mÄq/g des trockenen nichtbehandelten vernetzten Dextrans beträgt.

4. Verfarn cn nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daü die

geladenen chemischen

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