CN111499736A - 一种静注covid-19人免疫球蛋白的制备方法 - Google Patents
一种静注covid-19人免疫球蛋白的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111499736A CN111499736A CN202010352546.9A CN202010352546A CN111499736A CN 111499736 A CN111499736 A CN 111499736A CN 202010352546 A CN202010352546 A CN 202010352546A CN 111499736 A CN111499736 A CN 111499736A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- component
- covid
- plasma
- human immunoglobulin
- precipitate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 title claims abstract description 51
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims abstract description 51
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims abstract description 51
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 78
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 34
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 27
- 101000623895 Bos taurus Mucin-15 Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims abstract description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000007670 refining Methods 0.000 claims abstract description 6
- 229940022962 COVID-19 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 27
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 19
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims description 18
- 238000011085 pressure filtration Methods 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 12
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 12
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 claims description 3
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 3
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 abstract 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 abstract 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 25
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 8
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 4
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 244000309467 Human Coronavirus Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 208000017574 dry cough Diseases 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 108091005452 macrophage Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000009832 plasma treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及一种静注COVID‑19人免疫球蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)COVID‑19康复者恢复期血浆、或经新型冠状病毒疫苗(SARS‑CoV‑2疫苗)免疫的健康人血浆、或经病毒灭活后的康复者恢复期血浆或免疫血浆；(2)低温乙醇法梯度处理灭活血浆得组分Ⅱ沉淀(FⅡ沉淀)；(3)组分Ⅱ沉淀溶解、精制过滤后超滤；(4)超滤液经配制、除菌过滤后得COVID‑19人免疫球蛋白(IgG)原液，原液经低pH孵放、纳滤、除菌过滤分装后，即得所述静注COVID‑19人免疫球蛋白。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种静注COVID-19人免疫球蛋白的制备方法。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019，COVID-19)是一种由严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起的急性传染性疾病。SARS-CoV-2是具有包膜的单股正链RNA病毒，冠状病毒科β属的冠状病毒，是目前感染人类冠状病毒家族中的第七个成员，主要通过呼吸道飞沫和密切接触传播，也可能通过气溶胶和消化道粪-口等途径传播。 COVID-19临床以发热、干咳、乏力为主要表现，部分患者可出现呼吸困难、腹泻等症状，可进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克和出凝血功能障碍等症状，严重者可致患者死亡。
各国正在开展COVID-19的治疗药物和抗病毒疫苗的临床实验。根据COVID-19临床症状分为：轻型、普通型、重型以及危重型四种类型。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)》中，康复者恢复期血浆治疗正式列为重型和危重型病例的治疗方法，主要适用于病情进展较快、重症和危重症新冠肺炎患者。
COVID-19康复者恢复期血浆中存在较高滴度SARS-CoV-2特异性免疫球蛋白，能够中和新型冠状病毒，是治愈COVID-19患者关键所在。静注COVID-19人免疫球蛋白(pH4)含有高效价SARS-CoV-2中和抗体，其对SARS-CoV-2感染者治疗的作用机制包括：
(1)抗SARS-CoV-2中和抗体中和体内SARS-CoV-2病毒，使其失去感染性，缓解病毒对机体损伤；参与体液免疫和细胞免疫；
(2)IgG封闭了巨噬细胞Fc受体抑制炎症介质释放，减轻炎症反应；
(3)激活补体促进细胞吞噬功能，有效地抵抗病毒严重感染；
(4)含有多种抗体形成的复杂免疫网络，具有免疫替代和免疫调节的双重作用。
从COVID-19康复者恢复期血浆中提取制备静注COVID-19人免疫球蛋白(pH4)，避免直接使用 COVID-19康复者恢复期血浆进行临床治疗需要进行血型配型试验，并且是纯度高、贮存运输使用更高效的制品。抗体谱广，对抗其它致病原，缓解并发症。
本发明提供的静注COVID-19人免疫球蛋白(pH4)的制备工艺，不仅能够为COVID-19的治疗提供特异性的药物和将来作为制备产业化的COVID-19人免疫球蛋白的技术储备，制备的制品可以在患者救治及高风险人群的预防中发挥作用。减轻民众对COVID-19的恐慌、畏惧，对稳定社会具有十分重要的意义
发明内容
本发明首先涉及一种静注COVID-19人免疫球蛋白(IgG)的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)血浆原料包括：COVID-19康复者恢复期血浆(或经病毒灭活后)、经新型冠状病毒疫苗 (SARS-CoV-2疫苗)免疫的健康人血浆；
(2)低温乙醇法梯度处理灭活血浆得组分Ⅱ沉淀(FⅡ沉淀)；
(3)组分Ⅱ沉淀溶解、精制过滤后超滤；
(4)超滤液经配置、除菌过滤后得COVID-19人免疫球蛋白(IgG)原液；
(5)所述人免疫球蛋白原液经低pH孵放、纳滤(滤膜孔径20nm)、除菌过滤后，分装即得所述静注 COVID-19人免疫球蛋白。
步骤(2)所述低温乙醇法梯度处理灭活血浆得组分Ⅱ沉淀的步骤如下：
1)醋酸缓冲液调整血浆pH值至5.97±0.50，缓慢加入95％乙醇至乙醇浓度20％，乙醇处理温度控制在-4.0±2.0℃，搅拌至少2小时，处理完毕后以小于0.2MPa压滤得组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分I+Ⅱ+Ⅲ上清，其中组分I+Ⅱ+Ⅲ上清经处理后废弃或冻存以备用；优选的，调整血浆pH值时，每千克血浆醋酸缓冲液加入速度应小于3ml/分钟，最优选的，醋酸缓冲液的添加速度为：每千克血浆2ml/分钟。
2)用组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀重量10～30倍注射用水的溶解并稀释组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀，调整pH至5.30±0.50，缓慢加入95％乙醇，至乙醇浓度14％，乙醇处理反应温度控制在-2.0±2.0℃，搅拌至少2小时，反应完毕后以小于0.2MPa的压力压滤，压滤后的上清为组分I+Ⅲ上清，沉淀为组分I+Ⅲ沉淀，其中组分I+Ⅲ沉淀经处理后废弃；
3)加入组分I+Ⅲ上清重量的1/40～1/60的1mol/L氯化钠溶液量，用1mol/L碳酸氢钠调整pH至7.20±0.50，缓慢加入95％乙醇，至乙醇浓度25％，乙醇处理反应温度控制在-6.0±2.0℃，搅拌至少2小时，反应完毕后以小于0.2MPa的压力压滤，压滤后沉淀为组分Ⅱ沉淀，上清为组分Ⅱ上清，组分Ⅱ上清经处理后废弃；
步骤(3)所述的组分Ⅱ沉淀溶解、精制过滤后超滤的步骤为：
1)用组分Ⅱ沉淀的3至10倍量的注射用水使组分Ⅱ沉淀充分溶解，用1mol/L HCL调整至pH 4.1±0.3，随后反应液温度控制控制在0～4℃内，搅拌至少2小时，用深层滤器控制滤过压力小于0.2MPa的条件下过滤，收集澄清液；
2)选用孔径30kD或50kD的超滤膜，用5～10个制品体积的注射用水进行超滤透析，超滤液温度控制在0～15℃，超滤后控制蛋白含量在50～60g/L，pH控制在4.1±0.3；
步骤(4)所述的超滤液经配置、除菌过滤后得COVID-19人免疫球蛋白(IgG)原液的步骤为：
1)原液配制：在超滤后滤液中加入麦芽糖，麦芽糖含量为90～110g/L；
2)蛋白原液除菌过滤后制品得COVID-19人免疫球蛋白(IgG)原液。
3)原液经低pH孵放、纳滤(滤膜孔径20nm)、除菌过滤后，分装即得所述静注COVID-19人免疫球蛋白。
本发明还涉及以所述的静注COVID-19人免疫球蛋白(IgG)的制备方法制备获得的抗COVID-19病毒的人免疫球蛋白(IgG)产品。
本发明还涉及所述的静注COVID-19人免疫球蛋白(IgG)的制备方法在制备抗COVID-19病毒的人免疫球蛋白(IgG)产品中的应用。
附图说明
图1、静注COVID-19人免疫球蛋白制品纯度检测(醋酸纤维素薄膜电泳法)
图2、静注COVID-19人免疫球蛋白制品的分子大小(HPLC)
图3、静注COVID-19人免疫球蛋白制备工艺流程图
具体实施方式
主要缓冲液配方
1、醋酸缓冲液：配制10㎏ pH4.0醋酸-醋酸钠溶液计算，所需醋酸钠量1.089㎏，冰醋酸量为2.4L，补加注射用水至10kg；
2、1mol/L氯化钠：配制10㎏ 1mol/L氯化钠溶液计算，所需氯化钠量0.585㎏，补加注射用水至10kg；
3、1mol/L碳酸氢钠：按配制10㎏ 1mol/L碳酸氢钠溶液计算，所需碳酸氢钠量：0.84㎏，补加注射用水至10kg。
4、1mol/L HCL：配制10.0L 1.0mol/LHCL，所需HCL量为834ml，补加注射用水至10L；
实施例1、静注COVID-19人免疫球蛋白制品的制备
1、将COVID-19康复者恢复期血浆经亚甲蓝光化学法病毒灭活，将灭活血浆过滤至血浆储存袋内即为原料血浆，冰冻保存或直接进行后续的低温乙醇制备工作。
2.20％乙醇处理血浆样本得组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀：
2.1pH值：测定血浆原pH值，用醋酸缓冲液调整血浆pH值至5.97±0.50，每千克血浆醋酸缓冲液加入速度应小于3ml/分钟。
2.2预处理乙醇浓度：缓慢加入95％乙醇，至乙醇浓度20％。
2.3乙醇处理反应温度：反应温度控制在-4.0±2.0℃，搅拌至少2小时。
2.4压滤：压滤后沉淀为组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀，上清为组分I+Ⅱ+Ⅲ上清，控制压滤过程的压力小于0.2MPa；其中组分I+Ⅱ+Ⅲ上清经处理后废弃或冻存以备用。
在本方法的初试阶段，制备的人免疫球蛋白原液中IgG分子分布集中度较低，单体与二聚体的和约为 97.5％(初试时，每千克血浆醋酸缓冲液加入速度8ml/min)，药典要求IgG单体与二聚体含量之和应不低于 95.0％，数据虽达标，但仍有提升空间；
经全流程优化后，测试结果显示，在20％乙醇处理原料血浆的步骤中，酸碱缓冲液添加速度对制品中 IgG分子分布集中度分布影响最大。由此，最终确定本体系下，20％乙醇低温处理原料血浆的步骤中，每千克血浆醋酸缓冲液加入速度应小于3ml/分钟，优选为2ml/分钟。
检测结果显示：按优选方案制备的静注COVID-19人免疫球蛋白(pH4)分子大小分布99.33％，其他各项质量指标均符合国家药典标准(见后文实施例2部分)。
3. 14％乙醇处理组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀得组分I+Ⅲ上清：
3.1组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀的溶解：用沉淀重量10～30倍注射用水稀释，调整pH至5.30±0.50。
3.2乙醇浓度：缓慢加入95％乙醇，至乙醇浓度14％。
3.3温度：反应温度控制在-2.0±2.0℃，搅拌至少2小时。
3.4压滤：压滤后的上清为组分I+Ⅲ上清，沉淀为组分I+Ⅲ沉淀，控制压滤过程的压力小于0.2MPa；其中组分I+Ⅲ沉淀经处理后废弃。
4. 25％乙醇处理组分I+Ⅲ上清得组分Ⅱ沉淀
4.1 1mol/L氯化钠量：加入1mol/L氯化钠溶液量为组分I+Ⅲ上清重量的1/40～1/60。
4.2 pH值：测定上清液pH值，用1mol/L碳酸氢钠调整pH至7.20±0.50。
4.3乙醇浓度：缓慢加入95％乙醇，至乙醇浓度25％。
4.4温度：反应温度控制在-6.0±2.0℃，搅拌至少2小时。
4.5压滤：压滤后沉淀为组分Ⅱ沉淀，上清为组分Ⅱ上清，控制压滤过程的压力小于0.2MPa；组分Ⅱ上清经处理后废弃。
5.组分Ⅱ沉淀的精制过滤：
5.1组分Ⅱ沉淀的溶解：注射用水量为组分Ⅱ沉淀的3至10倍，搅拌使组分Ⅱ沉淀充分溶解。
5.2pH值：测其溶解液pH值，用1mol/L HCL调整至pH 4.1±0.3，
5.3温度：反应液温度控制控制在0～4℃内。
5.3组分II深滤：用深层滤器过滤，收集澄清液，控制滤过压力小于0.2MPa。
6.超滤：
6.1超滤膜：选用孔径30kD或50kD的超滤膜。
6.2超滤：用5～10个制品体积的注射用水进行超滤透析，超滤液温度控制在0～15℃，超滤后蛋白含量在50～60g/L，pH控制在4.1±0.3。
6.3原液配制：在超滤后滤液中加入辅料麦芽糖，含量应为90～110g/L，复测pH应为4.1±0.3，蛋白含量应为50～60g/L。
7、原液低pH孵放、纳滤、除菌过滤及分装：
超滤后的蛋白原液用不超过0.22微米的微孔滤膜(绝对孔径)除菌过滤，除菌过滤后制品即为原液，即完成静注COVID-19人免疫球蛋白(pH4)制品原液的制备。
随后将所述静注COVID-19人免疫球蛋白制品原液依次经过低pH孵放(pH4.1±0.3、24℃±1℃、21天)、纳米膜过滤(滤膜孔径小于20nm)、除菌过滤及分装，即得所述静注COVID-19人免疫球蛋白制品。
实施例二、静注COVID-19人免疫球蛋白的质量检定
1、原液SARS-CoV-2中和抗体效价
静注COVID-19人免疫球蛋白原液(pH4)含SARS-CoV-2中和抗体，对于阻断病毒入侵细胞起主要作用。SARS-CoV-2中和抗体效价情况，体现了其抑制病毒入侵细胞的能力，是静注COVID-19人免疫球蛋白 (pH4)的质量控制重要指标。
通过中和试验，检测市售静注人免疫球蛋白(pH4)、原料混合血浆及实施例1制备的静注COVID-19 人免疫球蛋白原液(pH4)的SARS-CoV-2中和抗体效价。具体结果如表1：
表1 SARS-CoV-2中和抗体效价
采用中和试验，静注COVID-19人免疫球蛋白原液(pH4)的SARS-CoV-2中和抗体价为1879。结果显示，本方法制备的静注COVID-19人免疫球蛋白制品(pH4)具有较高的SARS-CoV-2中和抗体效价，表明其能在抵抗病毒入侵中发挥显著效果。
2、制品蛋白纯度及分子大小分布
蛋白纯度、分子大小分布是评价人免疫球蛋白类制品蛋白质量的关键性指标。采用本方法制备的静注 COVID-19人免疫球蛋白制品，检测其纯度及分子大小分布。检测结果如图1、图2所示。
图1为静注COVID-19人免疫球蛋白制品的醋酸纤维素薄膜电泳结果，结果显示，采用本方法制备的人免疫球蛋白制品，蛋白纯度为97.3％，高于国家药典标准；
图2为静注COVID-19人免疫球蛋白制品的HPLC图谱，结果显示，原液中，IgG单体为99.2％，高于国家药典标准。
最后需要补充的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种静注COVID-19人免疫球蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)血浆原料包括：COVID-19康复者恢复期血浆、或经新型冠状病毒疫苗(SARS-CoV-2疫苗)免疫后的健康人血浆、或经病毒灭活后的康复血浆或免疫血浆；
(2)低温乙醇法梯度处理灭活血浆得组分Ⅱ沉淀(FⅡ沉淀)；
(3)组分Ⅱ沉淀溶解、精制过滤后超滤；
(4)超滤液经配置、除菌过滤后得COVID-19人免疫球蛋白(IgG)原液；
(5)所述人免疫球蛋白原液依次经低pH孵放、纳滤(滤膜孔径20nm)、除菌过滤后，分装即得所述静注COVID-19人免疫球蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述低温乙醇法梯度处理灭活血浆得组分Ⅱ沉淀的步骤如下：
1)醋酸缓冲液调整血浆pH值至5.97±0.50，缓慢加入95％乙醇至乙醇浓度20％，乙醇处理温度控制在-4.0±2.0℃，搅拌至少2小时，处理完毕后以小于0.2MPa压滤得组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ上清，其中组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ上清经处理后废弃或冻存以备用；优选的，调整血浆pH值时，每千克血浆醋酸缓冲液加入速度应小于3ml/分钟，最优选的，醋酸缓冲液的添加速度为：每千克血浆2ml/分钟；
2)用组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀重量10～30倍注射用水的溶解并稀释组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀，调整pH至5.30±0.50，缓慢加入95％乙醇，至乙醇浓度14％，乙醇处理反应温度控制在-2.0±2.0℃，搅拌至少2小时，反应完毕后以小于0.2MPa的压力压滤，压滤后的上清为组分Ⅰ+Ⅲ上清，沉淀为组分Ⅰ+Ⅲ沉淀，其中组分Ⅰ+Ⅲ沉淀经处理后废弃；
3)加入组分Ⅰ+Ⅲ上清重量的1/40～1/60的1mol/L氯化钠溶液量，用1mol/L碳酸氢钠调整pH至7.20±0.50，缓慢加入95％乙醇，至乙醇浓度25％，乙醇处理反应温度控制在-6.0±2.0℃，搅拌至少2小时，反应完毕后以小于0.2MPa的压力压滤，压滤后沉淀为组分Ⅱ沉淀，上清为组分Ⅱ上清，组分Ⅱ上清经处理后废弃。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的组分Ⅱ沉淀溶解、精制过滤后超滤的步骤为：
1)用组分Ⅱ沉淀的3至10倍量的注射用水使组分Ⅱ沉淀充分溶解，用1mol/L HCL调整至pH 4.1±0.3，随后反应液温度控制控制在0～4℃内，搅拌至少2小时，用深层滤器控制滤过压力小于0.2MPa的条件下过滤，收集澄清液；
2)选用孔径30kD或50kD的超滤膜，用5～10个制品体积的注射用水进行超滤透析，超滤液温度控制在0～15℃，超滤后控制蛋白含量在50～60g/L，pH控制在4.1±0.3。
4.根据权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的超滤液经配置、除菌过滤后得COVID-19人免疫球蛋白(IgG)原液的步骤为：
1)原液配制：在超滤后滤液中加入麦芽糖，麦芽糖含量为90～110g/L；
2)蛋白原液除菌过滤后制品即为COVID-19人免疫球蛋白原液。
5.权利要求1-4任一所述的静注COVID-19人免疫球蛋白的制备方法制备获得的抗COVID-19病毒的人免疫球蛋白(IgG)产品。
6.权利要求1-4任一所述的静注COVID-19人免疫球蛋白的制备方法在制备抗COVID-19病毒的人免疫球蛋白(IgG)产品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010352546.9A CN111499736B (zh) | 2020-04-28 | 2020-04-28 | 一种静注covid-19人免疫球蛋白的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010352546.9A CN111499736B (zh) | 2020-04-28 | 2020-04-28 | 一种静注covid-19人免疫球蛋白的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111499736A true CN111499736A (zh) | 2020-08-07 |
| CN111499736B CN111499736B (zh) | 2021-04-30 |
Family
ID=71867855
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010352546.9A Active CN111499736B (zh) | 2020-04-28 | 2020-04-28 | 一种静注covid-19人免疫球蛋白的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111499736B (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112094344A (zh) * | 2020-11-11 | 2020-12-18 | 英科博雅基因科技（天津）有限公司 | 从covid-19康复者血浆中纯化抗s1蛋白受体结合域多克隆抗体的方法 |
| CN112225799A (zh) * | 2020-10-19 | 2021-01-15 | 英科博雅基因科技（天津）有限公司 | 自动化分离系统快速提取covid-19患者康复期血浆的方法 |
| CN112010968B (zh) * | 2020-10-19 | 2021-01-19 | 英科博雅基因科技（天津）有限公司 | 快速提取covid-19患者康复期血浆用于制备免疫球蛋白g的方法 |
| CN112341540A (zh) * | 2020-11-11 | 2021-02-09 | 英科博雅基因科技（天津）有限公司 | 用于治疗covid-19感染的抗s1蛋白受体结合域多克隆抗体 |
| CN112375142A (zh) * | 2020-11-18 | 2021-02-19 | 深圳市卫光生物制品股份有限公司 | 静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法 |
| CN113278067A (zh) * | 2021-02-09 | 2021-08-20 | 武汉中生毓晋生物医药有限责任公司 | 一种新型冠状病毒猪源性免疫球蛋白的制备方法 |
Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1457884A (zh) * | 2003-06-10 | 2003-11-26 | 成都蓉生药业有限责任公司 | 静脉注射人免疫球蛋白的双重病毒灭活/去除方法 |
| CN101161232A (zh) * | 2007-11-20 | 2008-04-16 | 哈尔滨世亨生物工程药业股份有限公司 | 静脉注射人乙型肝炎免疫球蛋白制备方法 |
| CN102178951A (zh) * | 2011-01-28 | 2011-09-14 | 哈尔滨派斯菲科生物制药股份有限公司 | 一种生产静注人免疫球蛋白的方法 |
| CN103665100A (zh) * | 2014-01-03 | 2014-03-26 | 华兰生物工程重庆有限公司 | 低温乙醇提取静注人免疫球蛋白的方法 |
| CN104231075A (zh) * | 2014-09-02 | 2014-12-24 | 江西博雅生物制药股份有限公司 | 一种乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺 |
| US20150210737A1 (en) * | 2014-01-29 | 2015-07-30 | Hemarus Therapeutics Limited | Integrated process for the production of therapeutics (human albumin, intravenous immunoglobulins, clotting factor viii and clotting factor ix) from human plasma |
| CN105601736A (zh) * | 2016-01-28 | 2016-05-25 | 哈尔滨派斯菲科生物制药股份有限公司 | 一种抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白及其制备方法 |
| CN108003236A (zh) * | 2017-11-06 | 2018-05-08 | 山东泰邦生物制品有限公司 | 一种人免疫球蛋白fⅱ沉淀及压滤工艺 |
| CN108101981A (zh) * | 2018-01-15 | 2018-06-01 | 四川远大蜀阳药业股份有限公司 | 一种静注免疫球蛋白的生产工艺 |
| WO2018204669A1 (en) * | 2017-05-03 | 2018-11-08 | Nanobio Corporation | Intravenous immunoglobulin compositions specific for respiratory syncytial virus and methods of making and using the same |
| CN109456407A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-03-12 | 山东泰邦生物制品有限公司 | 一种血浆人免疫球蛋白的制备方法 |
| CN109575129A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-05 | 贵州泰邦生物制品有限公司 | 一种静注人免疫球蛋白的制备工艺 |
| CN110128532A (zh) * | 2019-05-09 | 2019-08-16 | 上海莱士血液制品股份有限公司 | 一种利用人血浆组份ii+iii生产制备ivig的方法 |
-
2020
- 2020-04-28 CN CN202010352546.9A patent/CN111499736B/zh active Active
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1457884A (zh) * | 2003-06-10 | 2003-11-26 | 成都蓉生药业有限责任公司 | 静脉注射人免疫球蛋白的双重病毒灭活/去除方法 |
| CN101161232A (zh) * | 2007-11-20 | 2008-04-16 | 哈尔滨世亨生物工程药业股份有限公司 | 静脉注射人乙型肝炎免疫球蛋白制备方法 |
| CN102178951A (zh) * | 2011-01-28 | 2011-09-14 | 哈尔滨派斯菲科生物制药股份有限公司 | 一种生产静注人免疫球蛋白的方法 |
| CN103665100A (zh) * | 2014-01-03 | 2014-03-26 | 华兰生物工程重庆有限公司 | 低温乙醇提取静注人免疫球蛋白的方法 |
| US20150210737A1 (en) * | 2014-01-29 | 2015-07-30 | Hemarus Therapeutics Limited | Integrated process for the production of therapeutics (human albumin, intravenous immunoglobulins, clotting factor viii and clotting factor ix) from human plasma |
| CN104231075A (zh) * | 2014-09-02 | 2014-12-24 | 江西博雅生物制药股份有限公司 | 一种乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺 |
| CN105601736A (zh) * | 2016-01-28 | 2016-05-25 | 哈尔滨派斯菲科生物制药股份有限公司 | 一种抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白及其制备方法 |
| WO2018204669A1 (en) * | 2017-05-03 | 2018-11-08 | Nanobio Corporation | Intravenous immunoglobulin compositions specific for respiratory syncytial virus and methods of making and using the same |
| CN108003236A (zh) * | 2017-11-06 | 2018-05-08 | 山东泰邦生物制品有限公司 | 一种人免疫球蛋白fⅱ沉淀及压滤工艺 |
| CN108101981A (zh) * | 2018-01-15 | 2018-06-01 | 四川远大蜀阳药业股份有限公司 | 一种静注免疫球蛋白的生产工艺 |
| CN109456407A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-03-12 | 山东泰邦生物制品有限公司 | 一种血浆人免疫球蛋白的制备方法 |
| CN109575129A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-05 | 贵州泰邦生物制品有限公司 | 一种静注人免疫球蛋白的制备工艺 |
| CN110128532A (zh) * | 2019-05-09 | 2019-08-16 | 上海莱士血液制品股份有限公司 | 一种利用人血浆组份ii+iii生产制备ivig的方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| A M SISTI等: "Preparation of lyophilized and liquid intravenous immunoglobulin G: development and scale-up", 《VOX SANG》 * |
| SAMIR JAWHARA: "Could Intravenous Immunoglobulin Collected from Recovered Coronavirus Patients Protect against COVID-19 and Strengthen the Immune System of", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES》 * |
| 刘敏亮等: "一种新的静注人免疫球蛋白制剂制备工艺的研究", 《中南药学》 * |
| 张黎等: "献浆员中新型冠状病毒SARS-CoV-2中和抗体检测分析", 《中国药事》 * |
| 杨汇川等: "静注甲型H1N1流感人免疫球蛋白的研制", 《中国生物制品学杂志》 * |
| 王振城: "《实用血液内科学》", 30 June 2018, 上海交通大学出版社 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112225799A (zh) * | 2020-10-19 | 2021-01-15 | 英科博雅基因科技（天津）有限公司 | 自动化分离系统快速提取covid-19患者康复期血浆的方法 |
| CN112010968B (zh) * | 2020-10-19 | 2021-01-19 | 英科博雅基因科技（天津）有限公司 | 快速提取covid-19患者康复期血浆用于制备免疫球蛋白g的方法 |
| CN112225799B (zh) * | 2020-10-19 | 2022-08-16 | 英科博雅基因科技（天津）有限公司 | 自动化分离系统快速提取covid-19患者康复期血浆的方法 |
| CN112094344A (zh) * | 2020-11-11 | 2020-12-18 | 英科博雅基因科技（天津）有限公司 | 从covid-19康复者血浆中纯化抗s1蛋白受体结合域多克隆抗体的方法 |
| CN112094344B (zh) * | 2020-11-11 | 2021-01-29 | 英科博雅基因科技（天津）有限公司 | 从covid-19康复者血浆中纯化抗s1蛋白受体结合域多克隆抗体的方法 |
| CN112341540A (zh) * | 2020-11-11 | 2021-02-09 | 英科博雅基因科技（天津）有限公司 | 用于治疗covid-19感染的抗s1蛋白受体结合域多克隆抗体 |
| CN112341540B (zh) * | 2020-11-11 | 2022-09-06 | 英科博雅基因科技（天津）有限公司 | 用于治疗covid-19感染的抗s1蛋白受体结合域多克隆抗体 |
| CN112375142A (zh) * | 2020-11-18 | 2021-02-19 | 深圳市卫光生物制品股份有限公司 | 静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法 |
| CN113278067A (zh) * | 2021-02-09 | 2021-08-20 | 武汉中生毓晋生物医药有限责任公司 | 一种新型冠状病毒猪源性免疫球蛋白的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111499736B (zh) | 2021-04-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111499736B (zh) | 一种静注covid-19人免疫球蛋白的制备方法 | |
| CN111471103A (zh) | 一种新冠病毒（2019-nCOV）的异源抗体及其制备方法 | |
| CN104099301B (zh) | 柯萨奇病毒a16型病毒株、用途、疫苗及其制备方法 | |
| CN101402944A (zh) | 一种ev-71病毒毒种、人用灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN105963692B (zh) | 一种预防手足口病的联合疫苗 | |
| CN105601736B (zh) | 一种抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白及其制备方法 | |
| Sanders et al. | Suppression of interferon response in lymphocytes from patients with uremia | |
| US4199450A (en) | Process of separating from an aqueous medium a protein or a morphologically organized unit by liquid exclusion chromatography | |
| KR101617464B1 (ko) | Ｉｐｖ―ｄｐｔ 백신 | |
| CN102190725A (zh) | 抗手足口病人免疫球蛋白及其制备、使用方法和应用 | |
| CN105396129B (zh) | 一种利用脊髓灰质炎减毒株生产的灭活疫苗 | |
| CN110256556A (zh) | 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌人免疫球蛋白及制备方法 | |
| CN105669860B (zh) | 一种抗手足口病人免疫球蛋白及其制备方法 | |
| CN106075423B (zh) | 一种预防手足口病的联合疫苗 | |
| CN101927011A (zh) | 一种球蛋白溶液的病毒灭活方法 | |
| CN116731162B (zh) | 人免疫球蛋白生产工艺 | |
| CN113278067B (zh) | 一种新型冠状病毒猪源性免疫球蛋白的制备方法 | |
| RU2470664C2 (ru) | Способ получения иммуноглобулина для внутривенного введения, обогащенного иммуноглобулином м, и препарат, полученный этим способом | |
| CN111166877A (zh) | 一种狂犬病人免疫球蛋白的制备方法 | |
| AU756017B2 (en) | The process of preparing immunoglobulin for intravenous injection by viruses double-sterilized without adding any protectant | |
| CN112500477A (zh) | 一种快速从血浆提取人免疫球蛋白的方法 | |
| US10221220B2 (en) | Preparation methods for a novel generation of biological safe KLH products used for cancer treatment, for the development of conjugated therapeutic vaccines and as challenging agents | |
| CN102603891A (zh) | 一种双重病毒灭活制备破伤风人免疫球蛋白的方法 | |
| CN114540317A (zh) | 一种悬浮培养口蹄病毒灭活的工艺方法 | |
| CN111110876A (zh) | 一种特异性人免疫球蛋白病毒灭活工艺 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 430207 No.1-1, Huangjin Industrial Park Road, Zhengdian, Jiangxia District, Wuhan City, Hubei Province Patentee after: Wuhan Biopharmaceutical Co., Ltd. of China National Pharmaceutical Group Address before: 430207 No.1-1, Huangjin Industrial Park Road, Zhengdian, Jiangxia District, Wuhan City, Hubei Province Patentee before: SINOPHARM WUHAN BLOOD PRODUCT CO.,LTD. |