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CN112341540A - 用于治疗covid-19感染的抗s1蛋白受体结合域多克隆抗体 - Google Patents

用于治疗covid-19感染的抗s1蛋白受体结合域多克隆抗体 Download PDF

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CN112341540A
CN112341540A CN202011255850.8A CN202011255850A CN112341540A CN 112341540 A CN112341540 A CN 112341540A CN 202011255850 A CN202011255850 A CN 202011255850A CN 112341540 A CN112341540 A CN 112341540A
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Abstract

本发明涉及用于治疗COVID‑19感染的抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体。其一方面提供制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体制剂的方法，包括步骤：提供S1受体蛋白抗原‑抗体亲和层析柱；利用封闭式多细胞组分自动化分离系统快速分离外周血以获得血浆组分；使所得血浆使用S1受体蛋白抗原‑抗体亲和层析柱进行多克隆抗体的制备和纯化，得到抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体制品。另一方面涉及快速分离获取用以制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体的血浆的方法，其将取自人的外周血使用封闭式多细胞组分自动化分离系统分离，得到可用于制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体的血浆。本发明方法呈现如说明书所述优异技术效果。

Description

用于治疗COVID-19感染的抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种从全血中快速分离成分血浆用以制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体的方法。特别涉及一种使用封闭式多细胞组分自动化分离系统快速提取COVID-19患者康复期血浆并制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体的方法。尤其是涉及使用封闭式多细胞组分自动化分离系统即MulticomponentAutomated Cell Separation System(MACSS，ThermoGenesis Corp.)从全血中快速分离成分血浆用以制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体的方法。该抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体可用于新型冠状病毒COVID-19感染患者的治疗。本发明还涉及用于治疗COVID-19感染的抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体。
背景技术
2019冠状病毒病(Coronavirus Disease 2019，COVID-19)也称新型冠状病毒，是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus2，SARS-CoV-2)所致疾病，潜伏期为1～14d，多为3～7d。临床表现流感样症状，以发热、干咳、乏力为主要表现。根据症状严重程度，临床分为轻型、普通型、重型和危重型。重症病例多在1周后出现呼吸困难，危重型患者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒、出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等，严重者可导致患者死亡。
冠状病毒Spike蛋白(Spike glycoprotein，S glycoprotein，亦称S蛋白)由1160～1400个氨基酸组成，包含21～35个N-糖基化位点。S蛋白以三聚体的形式在病毒表面形成特殊的花冠结构。S蛋白在宿主细胞蛋白酶的作用下被裂解为S1和S2两部分，S1主要功能是与宿主细胞表面受体结合，S2亚基介导病毒-细胞、细胞-细胞膜融合。冠状病毒主要通过S1蛋白与宿主细胞受体结合介导病毒的入侵并决定病毒组织或宿主嗜性。2019-nCoV和SARS病毒一样，都是通过识别人类宿主的ACE2蛋白从而进入细胞的，尤其是，S蛋白结构域的细胞受体结合域(Receptor binding domain，RBD)直接参与了宿主受体的识别，该区域的氨基酸变异会导致病毒的种属嗜性和感染特性的变化，因此，这一区是COVID-19亚基疫苗和抗体药物研究中的重要靶序列之一。
随着恢复期血浆被成功的用于治疗多种急性病毒性传染病，如在埃博拉、严重急性呼吸综合症(SARS)病毒和中东呼吸综合征(MERS)病毒流行时均曾制备恢复者的血浆用于治疗或医学研究，其独到的治疗技术优势越来越受到肯定和认同，针对新型冠状病毒目前虽暂无特异性药物治疗，但发现新型冠状病毒肺炎康复者体内有高滴度抗体，能对抗新冠病毒，可以降低患者体内的病毒含量，其中有些可能会中和病毒并防止新一轮感染。康复者血浆中特异性抗体可中和患者体内SARS-CoV-2病毒，有助于改善患者临床症状和预后转归。新型冠状病毒肺炎康复者血浆治疗的目的是使新型冠状病毒感染者，在当前没有特效药物治疗的情况下，达到对症和支持疗法，尤其是重型和危重型患者能减轻症状，提高患者的活动耐力。
抗体(antibody)是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。它是一种由浆细胞(效应B细胞)分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质。抗体按特异性可分为单克隆抗体及多克隆抗体，单克隆抗体只针对抗原上的一个抗原决定簇起作用；而由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。单克隆抗体制备的开发时间较长，产量较低、成本高。多克隆抗体的制备方法相对简单、产量高，但目前制备多克隆抗体的工艺大多采用了先用相关抗原免疫动物，然后采集动物的血清或是腹水进行纯化的方法，该方法不仅费时费力，消耗大量的成本，并且由于来源于动物，所制备的多克隆抗体具有一定的免疫原性，不但容易被自身的免疫系统清除或排斥，更可造成机体的不良反应。
目前绝大多数的供体血浆来源均来自于单采血浆站采集的捐献者的血液成分，经过血浆分离机分离后得到，例如常规的离心操作方法等。此类方法具有很大的局限性：首先捐赠者需要去单采血站进行登记，这不利于偏远地区的捐赠者进行血浆采集工作；其次在单采血浆的过程中，捐赠者需要注射血液抗凝剂以防止采集的血液在体外凝结；再者，成分血采集时间一般为2～3hr，在采血及血液分离过程中，捐赠者需全程保持固定姿势，相对较长的时间导致一些捐赠者不能耐受采血活动，这也是导致采血失败的主要原因之一。克服上述采集血浆方法的局限性进而提高血浆获取效率对于提高临床治疗能力是有益的。
本发明提供了一种封闭式多细胞组分自动化分离系统(MulticomponentAutomated Cell Separation System，MACSS)可以在短时间内从COVID-19患者康复期的外周血全血中，直接分离出成分血浆而不需要对捐赠者输注抗凝剂或对血浆成分有影响的其他试剂因子如组分Ficoll等，保证了采集的血浆具有高度的原始性，不会破坏血浆中所含有的免疫球蛋白G的活性和功能。并且，外周血全血经由该分离系统分离后，可直接分离为三种组分：红细胞、血浆、单个核细胞悬液；血浆可进一步进行工艺制备，纯化出抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体用于新冠患者的临床治疗，红细胞及单个核细胞悬液可直接用于其他制备工艺。然而，已经发现，即使采用按传统的方式采用封闭式多细胞组分自动化分离系统分取血浆，然而存在例如所得血浆的抗体滴度较低的问题。因此，提高血浆的抗体滴度是本领域技术人员直接面临的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种获取具有较高抗体滴度的血浆的方法，尤其是快速提取COVID-19患者康复期血浆且该血浆具有较高抗体滴度的方法，以及将此血浆用于制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体的方法。已经出人意料的发现，使用本发明的方法，可以获得如本文所述一个或者多个方面的技术效果。本发明基于此类发现而得以完成。
为此，本发明的第一方面提供了一种快速分离获取用以制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体的血浆的方法，该方法是将取自人的外周血使用封闭式多细胞组分自动化分离系统分离成三个组分层：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层，接着将得到血浆进行病毒灭活，任选地将该血浆在-20℃以下冻存，得到可用于制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体的血浆。
根据本发明第一方面的方法，其中所述病毒灭活是亚甲蓝光化学法病毒灭活。
根据本发明第一方面的方法，其中所述外周血是选自下列来源的外周血：①SARS-CoV-2自然感染者(亦可称COVID-19患者)、②SARS-CoV-2自然感染者通过血清抗体滴度/血清中和抗体滴度确认后的康复者(即COVID-19患者康复期)、③SARS-CoV-2疫苗注射者、④SARS-CoV-2疫苗注射者并经过血清抗体滴度/血清中和抗体滴度确认后的免疫者。
根据本发明第一方面的方法，其所获得的血浆丙氨酸氨基转移酶活性低于40U/L。
根据本发明第一方面的方法，其所获得的血浆之HbsAg、梅毒、HIV-I、HIV-II抗体、HCV抗体用经批准的检测试剂盒检测后为阴性。
根据本发明第一方面的方法，其所获得的血浆中，蛋白质含量高于50g/L。
根据本发明第一方面的方法，其中所述外周血是静脉穿刺法采集的外周血并置于包含抗凝剂的血液采集袋内。
根据本发明第一方面的方法，其中在用封闭式多细胞组分自动化分离系统进行分离前，还向所述外周血中添加分离助剂；在一个实施方案中，所述分离助剂是包含油酸钠和硫酸镁的灭菌水溶液；在一个实施方案中，所述分离助剂中油酸钠浓度为5％，硫酸镁以镁离子计为0.25mol/L；在一个实施方案中，所述分离助剂是照如下方法配制的：将规定量的油酸钠和硫酸镁溶解于注射用水中，用0.45μm微孔滤膜过滤，封装于玻璃瓶中，121℃热压灭菌15min，即得；在一个实施方案中，所述分离助剂与外周血的体积比为1：100。
根据本发明第一方面的方法，其包括如下步骤：
(1)、通过静脉穿刺法采集的外周血(例如COVID-19患者康复期捐赠的外周血)250mL，置血液采集袋内(例如采集袋内装有抗凝剂，例如为枸橼酸钠)，将血液采集袋置于水平摇床上充分混匀15min；
(2)、使用封闭式多细胞组分自动化分离系统即Multicomponent Automated CellSeparation System，将一次性使用分离杯的塑料针头插入到血液采集袋上的无菌接口内，将采血袋挂起，使其中的40mL血液自然流入分离杯内的中央舱室；在加入血液前所述中央舱室内预先添加有0.4mL分离助剂；用无菌接合仪焊接管路将血液采集袋与一次性分离杯分离，再使该一次性分离杯置于水平摇床上充分混匀10min；
(3)、将一次性分离杯配平后放置于可编程的离心机进行离心操作，并按照如下程序设定离心机的参数：
程序编号 加速 减速 相对离心力/RCF 持续时间/min
1 9 7 2000 8.5
2 9 7 50 2
3 9 7 500 2
4 9 7 50 1
5 9 7 250 0.5
6 9 7 50 1
在离心的初始高速部分即2000RCF期间，外周血样本中的细胞通过密度分层在一次性使用分离杯中分为三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
将速度降低至50RCF，并且在此第一次低速离心期间，大部分红细胞被引导至红细胞回收舱；
短暂增加速度至500RCF，以进一步将处理室中的细胞分层；
再次降低至50RCF，进一步除去红细胞；
在采集血浆之前，相对离心力短暂增加至250RCF，在此期间，细胞浓缩层和血浆进一步分层；
再次降低至50RCF，细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，使大部分血浆保留在中央舱室中；
(4)、离心机减速并停止旋转，在一次性分离杯中分别单独采集红细胞、细胞浓缩层、血浆；
(5)、利用无菌接管机连接一次性分离杯上中央舱室的管路和转移袋的管路，将中央舱室中的分离后的血浆转移至转移袋内；用无菌接合仪焊接管路后，将分离后的血浆用亚甲蓝光化学法病毒灭活，然后在6h内快速冻结至-20℃以下，保存，备用于制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体的制剂。
进一步的，本发明第二方面提供了制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体制剂的方法，该方法包括如下步骤：
(1)提供S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱；
(2)利用封闭式多细胞组分自动化分离系统快速分离外周血(例如COVID-19患者康复期的外周血)以获得血浆组分；
(3)使步骤(2)所得血浆使用S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱进行抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的制备和纯化，得到抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体制品。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(1)的S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱可通过本领域已知的方法制备得到。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(1)的S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱制备包括如下步骤：
1a)构建具有S1蛋白受体结合域基因序列的表达载体，制备pET32(a)-RBD载体质粒(基本上，本步骤具体包括如下操作：制备感受态DH5α和BL21大肠杆菌，合成并验证SARS-Cov-2 S1蛋白受体结合域基因序列，筛选高效的表达S1蛋白的菌株)；
1b)大规模诱导表达纯化目的重组蛋白(S1蛋白含受体结合域)(基本上，本步骤具体包括如下操作：用菌株进行诱导表达，制备细菌裂解液，Ni2+柱纯化目的蛋白的即抗原蛋白或称S1蛋白；
1c)制备S1蛋白抗原亲和层析柱(基本上，本步骤具体包括如下操作：使S1蛋白偶联于CNBr activated SepharoseTM4FastFlow填料，将偶联填料装入层析空柱，对填充柱进行冲洗和平衡得到S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱。
尽管以上制备S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱的方法是本领域已知的，本发明仍然愿意在此详述或归纳。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(2)如本发明第一方面任一实施方案所述。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(3)中制备和纯化抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的方法包括如下步骤：
3a)取血浆，用Mab Loading Buffer(例如，其为包含如下组分的水溶液：Na2HPO45.12g/L、NaH2PO4 0.872g/L、NaCl 9g/L，pH7.2)稀释10倍，再用0.22μm滤膜过滤，得到稀释血浆；
3b)预备亲和层析纯化仪，将亲和层析柱装入纯化仪上，依次用Mab ElutionBuffer和Mab Loading Buffer冲洗并平衡管路及层析柱(例如，Mab Elution Buffer为包含如下组分的水溶液：柠檬酸17.22g/L、柠檬酸三钠5.3g/L，pH3.0)；
3c)平衡好后，将稀释血浆以5mL/min的流速上样1个柱体积；
3d)上样完成后，用Mab Loading Buffer中继续冲洗亲和柱，洗去未结合的杂蛋白，直至紫外基线平衡[例如，所述Mab Loading Buffer的配方为：Na2HPO4 5.12g/L、NaH2PO4 0.872g/L、NaCl 9g/L，pH7.2；例如，上样后冲洗亲和柱的Mab Loading Buffer中增补添加了2.6g/L甘氨酸，即该增补添加2.6g/L甘氨酸的Mab Loading Buffer的配方为：Na2HPO4 5.12g/L、NaH2PO4 0.872g/L、NaCl 9g/L、甘氨酸2.6g/L，pH7.2]；
3e)接着，使用Mab elution Buffer洗脱目的抗体，收集抗体洗脱液的目的蛋白峰，将所得抗体洗脱液调节pH至7.0±0.1(该操作中，使用4mL洗脱液与1mL中和液的混合液调节pH值，所述中和液为pH10.0的浓度12.114g/L的Tris溶液)；
3f)将收集的抗体洗脱液装入3万分子量的透析袋，用20mM的PB缓冲液(Na2HPO45.8g/L，NaH2PO4 0.6g/L，pH7.4)进行透析，透析完毕后用聚乙二醇进行浓缩，接着用注射用水进行超滤脱盐处理，使得到蛋白浓度大于1mg/mL的抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体，将其用0.22μm滤膜过滤，所得滤液为多克隆抗体原液，即作为成品的抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体；任选的
3g)将以上所得多克隆抗体原液加氯化钠溶解或者用无菌氯化钠注射液稀释配制成可供静脉注射使用的抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的注射液。
进一步的，本发明第三方面提供了一种抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体制剂，其是用于治疗COVID-19感染的抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体，其是照包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)提供S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱；
(2)利用封闭式多细胞组分自动化分离系统快速分离外周血(例如COVID-19患者康复期的外周血)以获得血浆组分；
(3)使步骤(2)所得血浆使用S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱进行抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的制备和纯化，得到抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体制品。
根据本发明第三方面的多克隆抗体制剂，其中步骤(1)的S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱可通过本领域已知的方法制备得到。
根据本发明第三方面的多克隆抗体制剂，其中步骤(1)的S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱制备包括如下步骤：
1a)构建具有S1蛋白受体结合域基因序列的表达载体，制备pET32(a)-RBD载体质粒(基本上，本步骤具体包括如下操作：制备感受态DH5α和BL21大肠杆菌，合成并验证SARS-Cov-2 S1蛋白受体结合域基因序列，筛选高效的表达S1蛋白的菌株)；
1b)大规模诱导表达纯化目的重组蛋白(S1蛋白含受体结合域)(基本上，本步骤具体包括如下操作：用菌株进行诱导表达，制备细菌裂解液，Ni2+柱纯化目的蛋白的即抗原蛋白或称S1蛋白；
1c)制备S1蛋白抗原亲和层析柱(基本上，本步骤具体包括如下操作：使S1蛋白偶联于CNBr activated SepharoseTM4FastFlow填料，将偶联填料装入层析空柱，对填充柱进行冲洗和平衡得到S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱。
根据本发明第三方面的多克隆抗体制剂，其中步骤(2)如本发明第一方面任一实施方案所述。
根据本发明第三方面的多克隆抗体制剂，其中步骤(3)中制备和纯化抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的方法包括如下步骤：
3a)取血浆，用Mab Loading Buffer(例如，其为包含如下组分的水溶液：Na2HPO45.12g/L、NaH2PO4 0.872g/L、NaCl 9g/L，pH7.2)稀释10倍，再用0.22μm滤膜过滤，得到稀释血浆；
3b)预备亲和层析纯化仪，将亲和层析柱装入纯化仪上，依次用Mab ElutionBuffer和Mab Loading Buffer冲洗并平衡管路及层析柱(例如，Mab Elution Buffer为包含如下组分的水溶液：柠檬酸17.22g/L、柠檬酸三钠5.3g/L，pH3.0)；
3c)平衡好后，将稀释血浆以5mL/min的流速上样1个柱体积；
3d)上样完成后，用Mab Loading Buffer中继续冲洗亲和柱，洗去未结合的杂蛋白，直至紫外基线平衡[例如，所述Mab Loading Buffer的配方为：Na2HPO4 5.12g/L、NaH2PO4 0.872g/L、NaCl 9g/L，pH7.2；例如，上样后冲洗亲和柱的Mab Loading Buffer中增补添加了2.6g/L甘氨酸，即该增补添加2.6g/L甘氨酸的Mab Loading Buffer的配方为：Na2HPO4 5.12g/L、NaH2PO4 0.872g/L、NaCl 9g/L、甘氨酸2.6g/L，pH7.2]；
3e)接着，使用Mab elution Buffer洗脱目的抗体，收集抗体洗脱液的目的蛋白峰，将所得抗体洗脱液调节pH至7.0±0.1(该操作中，使用4mL洗脱液与1mL中和液的混合液调节pH值，所述中和液为pH10.0的浓度12.114g/L的Tris溶液)；
3f)将收集的抗体洗脱液装入3万分子量的透析袋，用20mM的PB缓冲液(Na2HPO45.8g/L，NaH2PO4 0.6g/L，pH7.4)进行透析，透析完毕后用聚乙二醇进行浓缩，接着用注射用水进行超滤脱盐处理，使得到蛋白浓度大于1mg/mL的抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体，将其用0.22μm滤膜过滤，所得滤液为多克隆抗体原液，即作为成品的抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体；任选的
3g)将以上所得多克隆抗体原液加氯化钠溶解或者用无菌氯化钠注射液稀释配制成可供静脉注射使用的抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的注射液。
在本发明的制备方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与本发明其它任一实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于本发明其它任一实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。
下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
本发明提供一种从快速提取的COVID-19患者康复期血浆中制备得到抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体，其具有相当高的抗体滴度，对于COVID-19疾病的治疗提供了一种优异技术方案。
本发明提供的从外周血中快速获得成分血浆用以制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体的方法为上述临床治疗方案提供了可能。
如本发明所述的，本发明方法获得了如本文所述一个或者多个方面的技术效果，例如获取血浆速度快，所制得的血浆和抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体的抗体滴度高。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。
本发明处理血样时，如未另外说明，使用封闭式多细胞组分自动化分离系统，即Multicomponent Automated Cell Separation System(MACSS)或
Figure BDA0002773088920000081
System，ThermoGenesis Corp.生产的设备，www.thermogenesis.com，其是一种半自动化、功能封闭的系统，可从血样中收集精确容积的细胞浓缩液组分，包括：血浆、红细胞沉淀物、单个核细胞沉淀物组分。该分离系统由四个主要组件构成：①一次性使用分离杯、②可充电控制模块、③交流供电模块对接、④DataTrak软件系统。其中的一次性使用分离杯包括单独的回收舱室(红细胞回收舱、细胞浓缩回收舱)、中央舱室(血浆回收舱)和集成的夹紧机制。分离系统的控制模块组件是一个微处理器控制的设备，在离心过程中与一次性使用分离杯结合使用，以引导红细胞、浓缩的单有核细胞(细胞浓缩液)及血浆转移到一次性使用分离杯内的独立舱室中。离心后，将控制模块放置在对接站上，以便使用
Figure BDA0002773088920000082
DataTrak软件下载处理数据。
本发明以下制备例1～制备例3是采用本领域已知的操作方法制备S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱，该层析柱可以用于从COVID-19患者康复期血浆中制备得到本发明目的物质抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体，以用于COVID-19患者的治疗。
制备例1、具有S1蛋白受体结合域基因序列的表达载体的构建
1、主要试剂配制的方法
(1)质粒：pGEM-T Easy载体、PET32(a)载体
(2)菌株：DH5α、BL21
(3)LB液体培养基：称取5g蛋白胨(Trypton)、5g NaCl、2.5g酵母抽提物，蒸馏水定容500mL，高压消毒，4℃保存备用。
(4)LB固态培养基：上述液体培养基中加入终浓度为20％的琼脂。
(5)Amp/LB培养基：待LB溶液尚未完全冷却而不烫手时，即应取出培养基，并轻轻摇动以使琼脂均匀分布于整个培养基中。继之加入1mg/L的Amp 250μl，入250mL培养基中，使其Amp终浓度为100μg/mL。
(6)30％丙烯酰胺储存液：称取29g丙烯酰胺和1g甲叉双丙烯酰胺，热水溶解至100mL，储存于棕色瓶中，4℃保存。
(7)1.5M Tris-HCl：称取Tris加入规定量ddH2O中，以HCl调其PH至8.8，放置于透明玻璃瓶中保存。
(8)5×Tris-Glycine缓冲液：称取94g Glycine、15.1g Tris，加入50mL 10％SDS，定容至1000mL，棕色瓶中保存。
(9)10％过硫酸铵：称取0.2g过硫酸铵加入2mL双蒸水溶解。
(10)5×SDS-PAGE loading buffer：0.6g SDS+30mg BPB+甘油3mL+1M Tris-HCl1.5mL，加去离子水溶解至定容6mL。
(11)5×TAE缓冲液：242g Tris+冰醋酸57.1mL+EDTA缓冲液100mL，用ddH2O定容1000mL。
2、pET32(a)-RBD载体质粒的制备及验证
2.1感受态DH5α和BL21大肠杆菌的制备：
LB平板接种DH5α和BL21大肠杆菌，37℃培养过夜。挑取单个菌落转种3mL的LB液体培养液继续振荡培养过夜。取1mL过夜菌液转种100mL LB培养液，37℃振荡培养2hr至OD值为0.5；将细菌转入预冷50mL聚丙烯离心管中，在冰上放置15min；4℃，2000g/min离心10min，收集细菌。弃上清，并尽量将残留的培养液去除。菌体以10mL预冷的0.1M CaCl2溶液重悬，冰上放置30min。低温离心2000g/min×10min，弃上清，回收细菌。收集的菌体再次以2mL预冷的0.1M CaCl2溶液重悬中，迅速分装成100μl/管的EP管中，将新鲜制备的感受态大肠杆菌用于转化。
2.2基因序列合成及验证：
按照SARS-Cov-2 S1蛋白受体结合域基因序列信息进行人工基因合成，其序列是已知的，例如可以参见文献(Wu F,Zhao S,Yu B,et al.A new coronavirus associatedwith human respiratory disease in China[J].NPG Open Access,579(7798))。该基因完成合成后与pGEM-T Easy载体连接。该序列合成时5’末端插入了BamH I酶切位点，3’末端插入了XhoI酶切位点。利用BamH I和XhoI酶切位点将SARS-Cov-2 S1蛋白基因序列从pGEM-T Easy载体上切下来，同时用BamH I和XhoI酶切位点组合对pET32(a)表达载体进行双酶切。胶回收这两个基因片段。用连接酶将双酶切后的SARS-Cov-2 S1蛋白基因序列与pET32(a)表达载体链接，转化大肠杆菌DH5α。挑取单克隆菌落进行培养，提取重组质粒并进行双酶切鉴定，确认阳性重组质粒。将重组质粒送测序。经过DNA测序验证，确定重组质粒的序列和阅读框是正确的。
2.3筛选高效的表达S1蛋白的菌株：
取适量转化后的宿主细胞涂布到带抗性的LB固体培养基中，37℃培养过夜，第二天挑选10株以上的单克隆菌落，接种于3mL带抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养过夜，同时转化pET32(a)空载体的宿主菌作为对照。第三天，上述各样品各取5μl培养后的菌液接种于新的5mL带抗性的液体LB培养基中，以37℃，200rpm培养5hr后，每个样品加入终浓度为1mM的IPTG，再以37℃，200rpm培养5hr。取1mL培养产物，离心收集菌体，用50μl 20mM的PBS缓冲液重悬菌体，加入12.5μl蛋白电泳上样缓冲液(60mM Tris-HCl，25％甘油(W/V)，2％SDS(W/V)，5％2-巯基乙醇(V/V)，0.1％溴酚蓝(W/V)，pH6.8)，沸水煮10min，以12000rpm离心10min后，取20μl上清液进行SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝染色，在预测分子量大小的地方有一条明显的蛋白条带，而转化pET32(a)空载体的菌没有这条带。进一步将诱导后的菌体超声破碎后离心取上清液和沉淀，SDS-PAGE电泳显示，目标蛋白主要以可溶形式存在于上清中。
制备例2：重组蛋白(S1蛋白含受体结合域)的大规模纯化
1、主要试剂配制：
(1)PMSF(100mmol/L)：17.4mg PMSF溶于1mL异丙醇，-20℃冰箱贮存；
(2)NiSO4溶液0.1mol/L 10mL：0.2629g NiSO4加入蒸馏水定容至10mL；
(3)平衡缓冲液：20mmol/L Tris-Cl，pH＝7.5、300mmol/L NaCl；
(4)2M咪唑贮存液：2.724g咪唑加入Tris-Cl溶液(20mmol/L，pH＝7.5)，定容至20mL，4℃冰箱中存放；
(5)洗脱液：①100mmol/L Tris-Cl(pH7.5)贮存液(1L)：12.114g Tris溶于950mL蒸馏水中，用浓HCl调pH至7.5，定容至1L；②2mol/L NaCl贮存液500mL：58.44g NaCl溶于450mL蒸馏水中，待完全溶解后定容至500mL；
(6)柱料再生溶液：①盐酸胍溶液(10mL)：盐酸胍5.7318g，0.1152mL乙酸，用蒸馏水定容至10mL、②100mmol/L EDTA(10mL)：0.2923g EDTA，用蒸馏水定容至10mL。
2、目的蛋白的大规模诱导表达
2.1选取筛选后的高效菌株接种到40mL LB液体培养基中，37℃，160rpm振摇过夜复苏。将过夜复苏的菌种40mL接种于2000mL LB液体培养基中，待OD600值约为0.6时，加2mLIPTG(0.8mmol/L)使终浓度为0.8mmol/L，28℃，150rpm培养4h诱导表达。诱导结束后，8000rpm离心5min收集菌体，弃去上清。加入平衡缓冲液，重悬菌体沉淀，8000rpm离心5min，重复上述操作一次，收集菌体沉淀。离心管事先称重，以计算菌体重量。得到最终菌重为1.3g。加入10mL平衡缓冲液，-20℃冰箱冻存。
2.2细菌裂解液的制备：
将菌体从-20℃冰箱中取出，加入PMSF(每一克湿菌加入4μl，0.1mol/L PMSF)，菌体悬液反复冻融3次，然后置于冰水浴中超声波破碎菌体10min(5s/次)，强度40％，高速离心机4℃，12000rpm，离心30min。将上清转移至另外一个离心管中待用。
2.3目的蛋白的Ni2+柱纯化：
采用AKTA UPC10纯化仪进行蛋白纯化。将AKTA纯化仪的A泵管，B泵管放入已经用0.22μm滤膜过滤的纯水中，进样阀4、5出口管和收集阀的废液出口接到废液瓶中，指定冲洗液A泵管，B泵管。运行前，设定报警压力为0.3MPa，设定流速为2mL/min，用水冲洗仪器管路约5min。根据纯化量与亲和填料最大载量的关系，选择已装好的Ni SepharoseTM 6FastFlow亲和柱。将亲和柱的上端和下端管路与AKTA UPC10纯化仪器链接，用约5倍柱体积的纯水冲洗，分别将A泵管放入His Loading Buffer中，B泵管放入His elution Buffer(Na2HPO43.58g/L，NaH2PO4 1.56g/L，NaCl 29.22g/L，咪唑20.4g/L，pH7.4)中。先用100％B泵冲洗约20mL，再切换到100％A泵冲洗柱子约10倍柱体积，同时冲洗干净所有收集管道。平衡好后，将紫外调零，并设置峰收集150mAu，50mL/管，将A泵管从His Loading Buffer中移入到重组抗原的上清液中，以2mL/min的流速上样。待上样完成后，将A泵管放入His Loading Buffer中冲洗亲和柱，洗去未结合的杂蛋白，直至紫外基线平衡。当紫外基线平衡后，切换10到0％B泵用His elution Buffer洗脱目的抗原，收集洗脱液。洗脱液装入3万分子量的透析袋，用20mM Tris缓冲液(Tris 2.42g/L，pH8.0)在2～8℃透析2天，更换透析液3次以上，得到目的蛋白(即抗原蛋白，本文亦可称S1蛋白)。
2.4 SDS-PAGE电泳检测：
透析完成后，取10μl进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示在全菌和超声裂解后上清液在相对分子质量约34KD(预期的目的蛋白的相对分子质量大小34KD)处有一强的蛋白表达带，表明目的蛋白存在于细菌裂解上清液中，目的蛋白以可溶性形式表达且蛋白纯度大于80％，蛋白浓度大于2mg/mL。
制备例3：S1蛋白抗原亲和层析柱的制备
本发明采用抗原-抗体亲和层析的纯化方式进行抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的纯化。CNBr activated SepharoseTM4FastFlow填料的蛋白载量为20～60mg/mL。依据需要纯化蛋白量大小确定析空柱型号及亲和填料的用量。
称取30干粉剂CNBr activated SepharoseTM4FastFlow填料溶于100mL的1mM HCl中，再加入500mL 1mM HCl冲洗填料，待填料充分溶胀。用500mL Coupling Buffer(0.1MNaHCO3，0.5M NaCl，pH8.3)冲洗溶胀后的CNBr activated SepharoseTM4FastFlow，然后抽干填料中的多余液体。先将1000mg的S1蛋白在Coupling Buffer中进行透析换液，然后将溶胀后的CNBr activated SepharoseTM4FastFlow填料加入S1蛋白溶液中，在滚轴混匀仪上2～8℃混动过夜。第二天，将偶联S1蛋白的CNBr activated SepharoseTM4FastFlow填料装入层析空柱(柱长25cm，容积50mL)中，并将纯化柱的上端和下端与AKTA纯化仪链接，用Coupling Buffer以10mL/min流速冲洗填料至无蛋白洗出，收集洗出液A。用300mLBlocking Buffer(0.1M TrisHCl，0.5M NaCl，pH8.0)以10mL/min流速冲洗填料后，室温静置2hr。用C液(0.1M乙酸钠/乙酸，0.5M NaCl，pH 4.0)和Blocking Buffer以10mL/min流速交替冲洗填料5个循环，每次5个柱体积。用纯水以10mL/min流速冲洗填料10个柱体积。用20％乙醇以10mL/min流速冲洗填料10个柱体积，得到抗原-抗体亲和柱，即S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱。偶联验证：检测洗出液A的体积V和蛋白浓度C，偶联效率公式为＝(1000C*V)/1000×100％。偶联效率应不低于70％。
实施例1、快速分离COVID-19患者康复期的血浆
1、通过静脉穿刺法采集的COVID-19患者(在本文该名患者标记为患者AX)康复期捐赠的外周血(多于250mL)，置血液采集袋内(采集袋内装有抗凝剂枸橼酸钠)，将血液采集袋置于水平摇床上充分混匀15min；[上述SARS-CoV-2感染者亦可称为COVID-19患者，其是SARS-CoV-2自然感染者并且通过血清抗体滴度/血清中和抗体滴度确认后的康复者]
2、使用ThermoGenesis Corp.的封闭式多细胞组分自动化分离系统即Multicomponent Automated Cell Separation System(MACSS)，将一次性使用分离杯的塑料针头插入到血液采集袋上的无菌接口内，将采血袋挂起，使其中的40mL血液自然流入分离杯内的中央舱室；在加入血液前所述中央舱室内预先添加有0.4mL分离助剂；用无菌接合仪焊接管路将血液采集袋与一次性分离杯分离，再使该一次性分离杯置于水平摇床上充分混匀10min；[所述分离助剂是包含油酸钠和硫酸镁的灭菌水溶液，其中油酸钠浓度为5％，硫酸镁以镁离子计为0.25mol/L。灭菌水溶液的配制方法是本领域技术人员公知的，例如将规定量的油酸钠和硫酸镁溶解于注射用水中，用0.45μm微孔滤膜过滤，封装于玻璃瓶中，121℃热压灭菌15min，即得。所述油酸钠是注射用级别的]
3、将一次性分离杯配平后放置于市售的可编程的离心机(本试验使用ThermoScientificTM离心机)进行离心操作，并按照如下程序设定离心机的参数：
Figure BDA0002773088920000121
Figure BDA0002773088920000131
4、在离心的初始高速部分(2000RCF)期间，外周血样本中的细胞通过密度分层在一次性使用分离杯中分为三个组分：(1)红细胞(RBC)层、(2)细胞浓缩层、以及(3)血浆层；
5、将速度降低至50RCF，并且在此第一次低速离心期间，大部分红细胞被引导至红细胞回收舱；
6、短暂增加速度500RCF，以进一步将处理室中的细胞分层；
7、再次降低至50RCF，进一步除去红细胞；
8、在采集血浆之前，相对离心力短暂增加至250RCF，在此期间，细胞浓缩层和血浆进一步分层。
9、再次降低至50RCF，细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，使大部分血浆保留在中央舱室中。离心机减速并停止旋转，在一次性分离杯中可单独采集红细胞、细胞浓缩层(单有核细胞)及血浆，该分离过程仅需耗时15min。
10、利用无菌接管机连接一次性分离杯上中央舱室的管路和100mL转移袋的管路，将中央舱室中的分离后的血浆转移至100mL转移袋内。用无菌接合仪焊接管路后，将分离后的血浆用亚甲蓝光化学法病毒灭活，然后在6hr内快速冻结至-20℃以下，保存、备用。
11、将以上方法快速分离后的血浆经速率法测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性应不高于40IU/L，HbsAg、梅毒、HIV-I、HIV-II抗体、HCV抗体用经批准的检测试剂盒检测后应为阴性，血浆蛋白质含量应不低于50g/L，满足这些要求的血浆，作为COVID-19患者康复期血浆(亦可简称为血浆)，其可用于后续步骤。
实施例2：利用抗原-抗体亲和层析法纯化Covid-19康复者血浆中的多克隆抗体和 注射液的制备
本实施例使用S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱(其在本发明中亦可称为层析柱、亲和层析柱等，其如本文制备例1～3所述方法制得)，进行抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的制备和纯化。
(1)取Covid-19康复者血浆(实施例1方法制得)，用Mab Loading Buffer(Na2HPO45.12g/L，NaH2PO4 0.872g/L，NaCl 9g/L，pH7.2)稀释10倍，再用0.22μm滤膜过滤，得到稀释血浆；
(2)预备亲和层析纯化仪[将亲和层析纯化仪(AKTA UPC10蛋白纯化仪)的A泵管和B泵管放入已经用0.22um滤膜过滤的纯水中，进样阀4、5出口管和收集阀的废液出口接到废液瓶中，指定冲洗液A泵管、B泵管。运行前，设定报警压力为0.3MPa，设定流速为2mL/min，将A泵管和B泵管放入纯水中，用水冲洗仪器管路约5min]；
将亲和层析柱装入纯化仪上，依次用Mab Elution Buffer和Mab Loading Buffer冲洗并平衡管路及层析柱[将已装好的50mL亲和柱的上端和下端管路与AKTA UPC10蛋白纯化仪链接，用纯水冲洗，接着分别将A泵管放入Mab Loading Buffer中，B泵管放入MabElution Buffer(柠檬酸17.22g/L，柠檬酸三钠5.3g/L，pH3.0)中。先用100％B泵冲洗亲和柱2倍柱体积，再切换到100％A泵冲洗柱子10倍柱体积，同时冲洗干净所有收集管道]；
平衡好后，将A泵管从Mab Loading Buffer中移入到装有上述稀释好的Covid-19康复者血浆稀释液的试剂瓶中，开始以5mL/min的流速上样1个柱体积；
上样完成后，将A泵管转入增补添加2.6g/L甘氨酸的Mab Loading Buffer中继续冲洗亲和柱，洗去未结合的杂蛋白，直至紫外基线平衡；[上述增补添加2.6g/L甘氨酸的MabLoading Buffer的配方为：Na2HPO4 5.12g/L、NaH2PO4 0.872g/L、NaCl 9g/L、甘氨酸2.6g/L，pH7.2)]
接着，切换到100％B泵用Mab elution Buffer洗脱目的抗体，收集抗体洗脱液的目的蛋白峰，将所得抗体洗脱液调节pH至7.0±0.1(该操作中，使用4mL洗脱液与1mL中和液的混合液调节pH值，所述中和液为pH10.0的浓度12.114g/L的Tris溶液)；
将收集的抗体洗脱液装入3万分子量的透析袋，用20mM的PB缓冲液(Na2HPO4 5.8g/L，NaH2PO4 0.6g/L，pH7.4)在2～8℃透析2天(中间换液3次)；
透析后的抗体用聚乙二醇进行浓缩，接着用注射用水进行超滤脱盐处理，使得到蛋白浓度大于1mg/mL(通常控制浓度在1.2～1.4mg/mL范围内)的抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体，将其用0.22μm滤膜过滤，所得滤液在本发明中可称为多克隆抗体原液或者称为原液。
将以上所得多克隆抗体原液可以加氯化钠溶解或者用无菌氯化钠注射液稀释配制成可供静脉注射使用的抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的注射液。
试验例1：间接Elisa检测多克隆抗体的效价
1、用纯化的S1蛋白包被孔酶标板：
用抗原包被液将纯化的S1受体结合域蛋白按1μg/mL(PBS稀释)包被，每孔100μL，同时设置阴性对照孔，4℃过夜。弃抗原液，每孔加250μL洗涤液，37℃振荡洗涤3次，每次3min。封闭：弃洗绦液，每孔加100μL 5％脱脂乳，37℃封闭1hr。弃封闭液，用洗涤液37℃洗3次，每次3min。
2、多克隆抗体产品稀释：
用PBS将制备的成品(实施例1所得克隆抗体原液)分别稀释1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000、128000、256000、512000、1024000倍，加入反应孔，每孔100μL。同时设置阴性对照，37℃孵育1hr。孵育完成后用洗涤液洗3次，每次3min。加入用PBS稀释的辣根过氧化物酸标记的鼠抗人二抗，每孔100μL，37℃孵育1hr。弃二抗，用洗涤液37℃洗3次，每次3min。加入底物溶液，每孔100μL，室温避光反应30min.每孔加50μL终止液，静置5min。测OD值，用酶标仪测每孔450nm波长的OD值，多克隆抗体与阴性血对照的比值≥2.1时，多克隆抗体的最大稀释倍数即为抗体效价。
结果显示：当稀释比为1:512000时多克隆抗体与阴性对照的OD450之比为2.28>2.1。且当稀释比为1:1024000时的OD450比值为1.82<2.1，因此间接Elisa测定多克隆抗体效价为512000。
表1、间接Elisa检测抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体效价
稀释倍数 多克隆抗体 阴性对照 比值
1 1000 1.260 0.070 18.00
2 2000 1.177 0.056 21.01
3 4000 1.334 0.055 24.25
4 8000 1.571 0.059 19.61
5 16000 1.323 0.047 28.14
6 32000 0.976 0.069 14.14
7 64000 0.634 0.054 11.74
8 128000 0.399 0.042 9.50
9 256000 0.283 0.071 3.98
10 512000 0.151 0.066 2.28
11 1024000 0.102 0.056 1.82
本发明试验4A和试验5A所得克隆抗体原液照本试验例1的方法测定，其结果与实施例1所得克隆抗体原液的结果基本一致。
试验例2：抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的蛋白含量测定
在本发明中，使用考马斯亮蓝染色法测定实施例2所得或类似操作所得多克隆抗体原液中的抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体蛋白的含量，结合实施例1或类似操作中外周血投料量(体积)和血浆获得量(体积)、实施例2或类似操作中血浆投料量(体积)和多克隆抗体原液获得量(体积)，计算每40mL外周血能够获得的抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体蛋白的量(mg/40mL，抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体蛋白量mg/40mL外周血)，该数据在本发明中可称为多抗产量。
经测定，实施例1～实施例2所得原液即多克隆抗体原液中的抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体蛋白的浓度为1.263mg/mL，结合所得原液体积等参数算得多抗产量＝36.24mg/40mL。
实施例3、抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的制备
上述实施例1～2的制备过程，在本发明中可称为试验A。
在本实施例3的第1个实验(其在本发明中可称为试验B)中，使用实施例1所述患者的外周血40mL，参照实施例1～2的操作方法，唯一不同是在实施例1步骤2所用的分离助剂中未添加镁盐，依次制得各种物料，包括在参照实施例1操作中制得的产物COVID-19患者康复期血浆、在参照实施例2操作中制得的产物多克隆抗体原液；接着，参照试验例2的方法，测定并算得本试验B的多抗产量＝24.62mg/40mL。
在本实施例3的第2个实验(其在本发明中可称为试验C)中，使用实施例1所述患者的外周血40mL，参照实施例1～2的操作方法，唯一不同是在实施例1步骤2所用的分离助剂中未添加油酸钠，依次制得各种物料，包括在参照实施例1操作中制得的产物COVID-19患者康复期血浆、在参照实施例2操作中制得的产物多克隆抗体原液；接着，参照试验例2的方法，测定并算得本试验C的多抗产量＝21.38mg/40mL。
在本实施例3的第3个实验(其在本发明中可称为试验D)中，使用实施例1所述患者的外周血40mL，参照实施例1～2的操作方法，唯一不同是在实施例1步骤2中未添加分离助剂，依次制得各种物料，包括在参照实施例1操作中制得的产物COVID-19患者康复期血浆、在参照实施例2操作中制得的产物多克隆抗体原液；接着，参照试验例2的方法，测定并算得本试验D的多抗产量＝26.13mg/40mL。
在本实施例3的第4个实验(其在本发明中可称为试验E)中，参照实施例1～2的操作方法，直接使用实施例1所得血浆进行后续的实施例2，唯一不同是在实施例2上样完成后A泵管冲洗亲和柱的洗脱液中未添加甘氨酸而是直接使用Mab Loading Buffer，依次制得各种物料，包括在参照实施例1操作中制得的产物COVID-19患者康复期血浆、在参照实施例2操作中制得的产物多克隆抗体原液；接着，参照试验例2的方法，测定并算得本试验E的多抗产量＝19.62mg/40mL。
从本试验的结果可见，出人意料的发现是，使用封闭式多细胞组分自动化分离系统即Multicomponent Automated Cell Separation System(MACSS)处理血样，并使用本发明亲和层析法制备多克隆抗体蛋白，向血样中同时添加油酸钠和镁盐以及在亲和洗脱液中添加甘氨酸可以显著提到所得多克隆抗体的产量。另外，由于油酸钠、镁盐和甘氨酸添加量相当少，并且所得血浆后续经历亲和层析，它们在最终的多克隆抗体原液中没有残余。
实施例4、抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的制备
通过静脉穿刺法采集的另一名COVID-19患者(在本文该名患者标记为患者AY)康复期捐赠的外周血(多于250mL)，置血液采集袋内(采集袋内装有抗凝剂枸橼酸钠)，将血液采集袋置于水平摇床上充分混匀15min；
使用ThermoGenesis Corp.的封闭式多细胞组分自动化分离系统即Multicomponent Automated Cell Separation System(MACSS)，将一次性使用分离杯的塑料针头插入到血液采集袋上的无菌接口内，将采血袋挂起，使其中的40mL血液自然流入分离杯内的中央舱室；在加入血液前所述中央舱室内预先添加有0.4mL分离助剂；用无菌接合仪焊接管路将血液采集袋与一次性分离杯分离，再使该一次性分离杯置于水平摇床上充分混匀10min；[所述分离助剂是包含油酸钠和硫酸镁的灭菌水溶液，其中油酸钠浓度为5％，硫酸镁以镁离子计为0.25mol/L；灭菌水溶液的配制方法：将规定量的油酸钠和硫酸镁溶解于注射用水中，用0.45μm微孔滤膜过滤，封装于玻璃瓶中，121℃热压灭菌15min，即得；所述油酸钠是注射用级别的]
将一次性分离杯配平后放置于市售的可编程的离心机(本试验使用ThermoScientificTM离心机)进行离心操作，并按照如下程序设定离心机的参数：
程序编号 加速 减速 相对离心力(RCF) 持续时间(min)
1 9 7 2000 8.5
2 9 7 50 2
3 9 7 500 2
4 9 7 50 1
5 9 7 250 0.5
6 9 7 50 1
在离心的初始高速部分(2000RCF)期间，外周血样本中的细胞通过密度分层在一次性使用分离杯中分为三个组分：(1)红细胞(RBC)层、(2)细胞浓缩层、以及(3)血浆层；
将速度降低至50RCF，并且在此第一次低速离心期间，大部分红细胞被引导至红细胞回收舱；
短暂增加速度500RCF，以进一步将处理室中的细胞分层；
再次降低至50RCF，进一步除去红细胞；
在采集血浆之前，相对离心力短暂增加至250RCF，在此期间，细胞浓缩层和血浆进一步分层；
再次降低至50RCF，细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，使大部分血浆保留在中央舱室中；离心机减速并停止旋转，在一次性分离杯中可单独采集红细胞、细胞浓缩层(单有核细胞)及血浆，该分离过程仅需耗时15min；
利用无菌接管机连接一次性分离杯上中央舱室的管路和100mL转移袋的管路，将中央舱室中的分离后的血浆转移至100mL转移袋内；用无菌接合仪焊接管路后，将分离后的血浆用亚甲蓝光化学法病毒灭活，然后在6h内快速冻结至-20℃以下，保存、备用；
将以上方法快速分离后的血浆经速率法测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性应不高于40，HbsAg、梅毒、HIV-I、HIV-II抗体、HCV抗体用经批准的检测试剂盒检测后应为阴性，血浆蛋白质含量应不低于50g/L，满足这些要求的血浆，作为COVID-19患者康复期血浆，其可用于后续步骤；该COVID-19患者康复期血浆可称为试验4A的COVID-19患者康复期血浆。
接着使用上述试验4A的COVID-19患者康复期血浆，照本发明实施例2的方法进行处理，制得在本实施例4中称作为试验4A的多克隆抗体原液。
本实施例以上操作可称为试验4A。
在本实施例的另一个实验(其在本发明中可称为试验4B)中，使用试验4A所涉患者的外周血40mL，参照试验4A的操作方法，唯一不同是所用的分离助剂中未添加镁盐，依次制得各种物料，包括制得的产物：多克隆抗体原液；
在本实施例的再一个实验(其在本发明中可称为试验4C)中，使用试验4A所涉患者的外周血40mL，参照试验4A的操作方法，唯一不同是所用的分离助剂中未添加油酸钠，依次制得各种物料，包括制得的产物：多克隆抗体原液；
在本实施例的再另一个实验(其在本发明中可称为试验4D)中，使用试验4A所涉患者的外周血40mL，参照试验4A的操作方法，唯一不同是未添加分离助剂，依次制得各种物料，包括制得的产物：多克隆抗体原液；
在本实施例的再另一个实验(其在本发明中可称为试验4E)中，参照实施例试验4A的操作方法，直接使用实施例4A所得血浆进行后续的亲和层析工艺，唯一不同是血浆上样完成后A泵管冲洗亲和柱的洗脱液中未添加甘氨酸而是直接使用Mab Loading Buffer，依次制得各种物料，包括制得的产物：多克隆抗体原液。
参照试验例2的方法，测定并算得试验4A的多抗产量＝33.46mg/40mL，试验4B的多抗产量＝23.14mg/40mL，试验4C的多抗产量＝20.38mg/40mL，试验4D的多抗产量＝24.83mg/40mL，试验4E的多抗产量＝18.72mg/40mL。这些结果所显示的趋势与实施例1～2的相同。
实施例5、抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的制备
通过静脉穿刺法采集的另一名COVID-19患者(在本文该名患者标记为患者AZ)康复期捐赠的外周血(多于250mL)，置血液采集袋内(采集袋内装有抗凝剂枸橼酸钠)，将血液采集袋置于水平摇床上充分混匀15min；
使用ThermoGenesis Corp.的封闭式多细胞组分自动化分离系统即Multicomponent Automated Cell Separation System(MACSS)，将一次性使用分离杯的塑料针头插入到血液采集袋上的无菌接口内，将采血袋挂起，使其中的40mL血液自然流入分离杯内的中央舱室；在加入血液前所述中央舱室内预先添加有0.4mL分离助剂；用无菌接合仪焊接管路将血液采集袋与一次性分离杯分离，再使该一次性分离杯置于水平摇床上充分混匀10min；[所述分离助剂是包含油酸钠和硫酸镁的灭菌水溶液，其中油酸钠浓度为5％，硫酸镁以镁离子计为0.25mol/L；灭菌水溶液的配制方法：将规定量的油酸钠和硫酸镁溶解于注射用水中，用0.45μm微孔滤膜过滤，封装于玻璃瓶中，121℃热压灭菌15min，即得；所述油酸钠是注射用级别的]
将一次性分离杯配平后放置于市售的可编程的离心机(本试验使用ThermoScientificTM离心机)进行离心操作，并按照如下程序设定离心机的参数：
程序编号 加速 减速 相对离心力(RCF) 持续时间(min)
1 9 7 2000 8.5
2 9 7 50 2
3 9 7 500 2
4 9 7 50 1
5 9 7 250 0.5
6 9 7 50 1
在离心的初始高速部分(2000RCF)期间，外周血样本中的细胞通过密度分层在一次性使用分离杯中分为三个组分：(1)红细胞(RBC)层、(2)细胞浓缩层、以及(3)血浆层；
将速度降低至50RCF，并且在此第一次低速离心期间，大部分红细胞被引导至红细胞回收舱；
短暂增加速度500RCF，以进一步将处理室中的细胞分层；
再次降低至50RCF，进一步除去红细胞；
在采集血浆之前，相对离心力短暂增加至250RCF，在此期间，细胞浓缩层和血浆进一步分层；
再次降低至50RCF，细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，使大部分血浆保留在中央舱室中；离心机减速并停止旋转，在一次性分离杯中可单独采集红细胞、细胞浓缩层(单有核细胞)及血浆，该分离过程仅需耗时15min；
利用无菌接管机连接一次性分离杯上中央舱室的管路和100mL转移袋的管路，将中央舱室中的分离后的血浆转移至100mL转移袋内；用无菌接合仪焊接管路后，将分离后的血浆用亚甲蓝光化学法病毒灭活，然后在6h内快速冻结至-20℃以下，保存、备用；
将以上方法快速分离后的血浆经速率法测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性应不高于40，HbsAg、梅毒、HIV-I、HIV-II抗体、HCV抗体用经批准的检测试剂盒检测后应为阴性，血浆蛋白质含量应不低于50g/L，满足这些要求的血浆，作为COVID-19患者康复期血浆，其可用于后续步骤；该COVID-19患者康复期血浆可称为试验5A的COVID-19患者康复期血浆。
接着使用上述试验5A的COVID-19患者康复期血浆，照本发明实施例2的方法进行处理，制得在本实施例5中称作为试验5A的多克隆抗体原液。
本实施例以上操作可称为试验5A。
在本实施例的另一个实验(其在本发明中可称为试验5B)中，使用试验5A所涉患者的外周血40mL，参照试验5A的操作方法，唯一不同是所用的分离助剂中未添加镁盐，依次制得各种物料，包括制得的产物：多克隆抗体原液；
在本实施例的再一个实验(其在本发明中可称为试验5C)中，使用试验5A所涉患者的外周血40mL，参照试验5A的操作方法，唯一不同是所用的分离助剂中未添加油酸钠，依次制得各种物料，包括制得的产物：多克隆抗体原液；
在本实施例的再另一个实验(其在本发明中可称为试验5D)中，使用试验5A所涉患者的外周血40mL，参照试验5A的操作方法，唯一不同是未添加分离助剂，依次制得各种物料，包括制得的产物：多克隆抗体原液；
在本实施例的再另一个实验(其在本发明中可称为试验5E)中，参照实施例试验5A的操作方法，直接使用实施例5A所得血浆进行后续的亲和层析工艺，唯一不同是血浆上样完成后A泵管冲洗亲和柱的洗脱液中未添加甘氨酸而是直接使用Mab Loading Buffer，依次制得各种物料，包括制得的产物：多克隆抗体原液。
参照试验例2的方法，测定并算得试验5A的多抗产量＝35.37mg/40mL，试验5B的多抗产量＝23.82mg/40mL，试验5C的多抗产量＝21.44mg/40mL，试验5D的多抗产量＝25.36mg/40mL，试验5E的多抗产量＝19.58mg/40mL。这些结果所显示的趋势与实施例1～2的相同。
以上实施例1～2、实施例3～5所得各种血浆的丙氨酸氨基转移酶活性均低于40U/L，HbsAg、梅毒、HIV-I、HIV-II抗体、HCV抗体用经批准的检测试剂盒检测后均为阴性，40mL外周血经封闭式多细胞组分自动化分离系统处理后可得到20.1～21.7mL可用于制备抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的血浆；例如，实施例1所得COVID-19患者康复期血浆，其丙氨酸氨基转移酶活性为13.7U/L，HbsAg、梅毒、HIV-I、HIV-II抗体、HCV抗体用经批准的检测试剂盒检测后均为阴性，蛋白质含量均高于52.4g/L，40mL外周血经封闭式多细胞组分自动化分离系统处理后可得到20.8mL血浆。
虽然本发明上文以SARS-CoV-2自然感染者康复期外周血为例进行抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的制备，然而，众所周知，这些制备方法同样还适用于来自①SARS-CoV-2自然感染者、②SARS-CoV-2自然感染者通过血清抗体滴度/血清中和抗体滴度确认后的康复者、③SARS-CoV-2疫苗注射者、④SARS-CoV-2疫苗注射者并经过血清抗体滴度/血清中和抗体滴度确认后的免疫者的外周血。
以上所述实施例仅是为充分说明本申请而所举的较佳的实施例，本申请的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本申请基础上所作的等同替代或变换，均在本申请的保护范围之内。本申请的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体制剂的方法，该方法包括如下步骤：(1)提供S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱；(2)利用封闭式多细胞组分自动化分离系统快速分离外周血(例如COVID-19患者康复期的外周血)以获得血浆组分；(3)使步骤(2)所得血浆使用S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱进行抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的制备和纯化，得到抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体制品。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)的S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱制备包括如下步骤：
1a)构建具有S1蛋白受体结合域基因序列的表达载体，制备pET32(a)-RBD载体质粒(基本上，本步骤具体包括如下操作：制备感受态DH5α和BL21大肠杆菌，合成并验证SARS-Cov-2S1蛋白受体结合域基因序列，筛选高效的表达S1蛋白的菌株)；
1b)大规模诱导表达纯化目的重组蛋白(S1蛋白含受体结合域)(基本上，本步骤具体包括如下操作：用菌株进行诱导表达，制备细菌裂解液，Ni2+柱纯化目的蛋白的即抗原蛋白或称S1蛋白；
1c)制备S1蛋白抗原亲和层析柱(基本上，本步骤具体包括如下操作：使S1蛋白偶联于CNBr activated SepharoseTM 4FastFlow填料，将偶联填料装入层析空柱，对填充柱进行冲洗和平衡得到S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱。
3.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)如权利要求5～8任一项所述。
4.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)中制备和纯化抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的方法包括如下步骤：
3a)取血浆，用Mab Loading Buffer(例如，其为包含如下组分的水溶液：Na2HPO45.12g/L、NaH2PO40.872g/L、NaCl 9g/L，pH7.2)稀释10倍，再用0.22μm滤膜过滤，得到稀释血浆；
3b)预备亲和层析纯化仪，将亲和层析柱装入纯化仪上，依次用Mab Elution Buffer和Mab Loading Buffer冲洗并平衡管路及层析柱(例如，Mab Elution Buffer为包含如下组分的水溶液：柠檬酸17.22g/L、柠檬酸三钠5.3g/L，pH3.0)；
3c)平衡好后，将稀释血浆以5mL/min的流速上样1个柱体积；
3d)上样完成后，用Mab Loading Buffer中继续冲洗亲和柱，洗去未结合的杂蛋白，直至紫外基线平衡[例如，所述Mab Loading Buffer的配方为：Na2HPO4 5.12g/L、NaH2PO40.872g/L、NaCl 9g/L，pH7.2；例如，上样后冲洗亲和柱的Mab Loading Buffer中增补添加了2.6g/L甘氨酸，即该增补添加2.6g/L甘氨酸的Mab Loading Buffer的配方为：Na2HPO45.12g/L、NaH2PO4 0.872g/L、NaCl 9g/L、甘氨酸2.6g/L，pH7.2]；
3e)接着，使用Mab elution Buffer洗脱目的抗体，收集抗体洗脱液的目的蛋白峰，将所得抗体洗脱液调节pH至7.0±0.1(该操作中，使用4mL洗脱液与1mL中和液的混合液调节pH值，所述中和液为pH10.0的浓度12.114g/L的Tris溶液)；
3f)将收集的抗体洗脱液装入3万分子量的透析袋，用20mM的PB缓冲液(Na2HPO4 5.8g/L，NaH2PO4 0.6g/L，pH7.4)进行透析，透析完毕后用聚乙二醇进行浓缩，接着用注射用水进行超滤脱盐处理，使得到蛋白浓度大于1mg/mL的抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体，将其用0.22μm滤膜过滤，所得滤液为多克隆抗体原液，即作为成品的抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体；任选的
3g)将以上所得多克隆抗体原液加氯化钠溶解或者用无菌氯化钠注射液稀释配制成可供静脉注射使用的抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的注射液。
5.快速分离获取用以制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体的血浆的方法，该方法是将取自人的外周血使用封闭式多细胞组分自动化分离系统分离成三个组分层：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层，接着将得到血浆进行病毒灭活，任选地将该血浆在-20℃以下冻存，得到可用于制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体的血浆。
6.根据权利要求5的方法，所述病毒灭活是亚甲蓝光化学法病毒灭活；或者，所述外周血是选自下列来源的外周血：①SARS-CoV-2自然感染者(亦可称COVID-19患者)、②SARS-CoV-2自然感染者通过血清抗体滴度/血清中和抗体滴度确认后的康复者(即COVID-19患者康复期)、③SARS-CoV-2疫苗注射者、④SARS-CoV-2疫苗注射者并经过血清抗体滴度/血清中和抗体滴度确认后的免疫者。
7.根据权利要求5的方法，其所获得的血浆丙氨酸氨基转移酶活性低于40U/L；或者，其所获得的血浆之HbsAg、梅毒、HIV-I、HIV-II抗体、HCV抗体用经批准的检测试剂盒检测后为阴性；在一个实施方案中，其所获得的血浆中，蛋白质含量高于50g/L；在一个实施方案中，其中所述外周血是静脉穿刺法采集的外周血并置于包含抗凝剂的血液采集袋内；在一个实施方案中，其中在用封闭式多细胞组分自动化分离系统进行分离前，还向所述外周血中添加分离助剂；在一个实施方案中，所述分离助剂是包含油酸钠和硫酸镁的灭菌水溶液；在一个实施方案中，所述分离助剂中油酸钠浓度为5％，硫酸镁以镁离子计为0.25mol/L；在一个实施方案中，所述分离助剂是照如下方法配制的：将规定量的油酸钠和硫酸镁溶解于注射用水中，用0.45μm微孔滤膜过滤，封装于玻璃瓶中，121℃热压灭菌15min，即得；在一个实施方案中，所述分离助剂与外周血的体积比为1：100。
8.根据权利要求5的方法，其包括如下步骤：
(1)、通过静脉穿刺法采集的外周血(例如COVID-19患者康复期捐赠的外周血)250mL，置血液采集袋内(例如采集袋内装有抗凝剂，例如为枸橼酸钠)，将血液采集袋置于水平摇床上充分混匀15min；
(2)、使用封闭式多细胞组分自动化分离系统即Multicomponent Automated CellSeparation System，将一次性使用分离杯的塑料针头插入到血液采集袋上的无菌接口内，将采血袋挂起，使其中的40mL血液自然流入分离杯内的中央舱室；在加入血液前所述中央舱室内预先添加有0.4mL分离助剂；用无菌接合仪焊接管路将血液采集袋与一次性分离杯分离，再使该一次性分离杯置于水平摇床上充分混匀10min；
(3)、将一次性分离杯配平后放置于可编程的离心机进行离心操作，并按照如下程序设定离心机的参数：
程序编号 加速 减速 相对离心力/RCF 持续时间/min 1 9 7 2000 8.5 2 9 7 50 2 3 9 7 500 2 4 9 7 50 1 5 9 7 250 0.5 6 9 7 50 1
在离心的初始高速部分即2000RCF期间，外周血样本中的细胞通过密度分层在一次性使用分离杯中分为三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
将速度降低至50RCF，并且在此第一次低速离心期间，大部分红细胞被引导至红细胞回收舱；
短暂增加速度至500RCF，以进一步将处理室中的细胞分层；
再次降低至50RCF，进一步除去红细胞；
在采集血浆之前，相对离心力短暂增加至250RCF，在此期间，细胞浓缩层和血浆进一步分层；
再次降低至50RCF，细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，使大部分血浆保留在中央舱室中；
(4)、离心机减速并停止旋转，在一次性分离杯中分别单独采集红细胞、细胞浓缩层、血浆；
(5)、利用无菌接管机连接一次性分离杯上中央舱室的管路和转移袋的管路，将中央舱室中的分离后的血浆转移至转移袋内；用无菌接合仪焊接管路后，将分离后的血浆用亚甲蓝光化学法病毒灭活，然后在6h内快速冻结至-20℃以下，保存，备用于制备抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体的制剂。
9.用于治疗COVID-19感染的抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的多克隆抗体制剂，其是照包括如下步骤的方法制备得到的：(1)提供S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱；(2)利用封闭式多细胞组分自动化分离系统快速分离外周血以获得血浆组分；(3)使步骤(2)所得血浆使用S1受体蛋白抗原-抗体亲和层析柱进行抗S1蛋白受体结合域多克隆抗体的制备和纯化，得到抗S1蛋白受体结合域的多克隆抗体制品。
10.根据权利要求9的多克隆抗体制剂，其中步骤(2)如权利要求5～8任一项所述。
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WO2023109419A1 (en) * 2021-12-14 2023-06-22 Beijing Acrobiosystems Biotechnology Co., Ltd A neutralizing antibody that can bind sars-cov-2 virus and its application

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