CN105396129B

CN105396129B - 一种利用脊髓灰质炎减毒株生产的灭活疫苗

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Publication number: CN105396129B
Application number: CN201510765995.5A
Authority: CN
Inventors: 姜德玉; 王一丁; 姚志东; 佟伟; 张星星; 沈建锋; 薛峰; 高强; 尹卫东
Original assignee: SINOVAC BIOTECH CO Ltd
Current assignee: SINOVAC BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2015-11-11
Filing date: 2015-11-11
Publication date: 2019-12-06
Anticipated expiration: 2035-11-11
Also published as: CN105396129A

Abstract

本发明提供了一种利用脊髓灰质炎减毒株生产的灭活疫苗，属于生物制品制备领域。本发明的脊髓灰质炎灭活疫苗改变了传统方法由野生毒株制备得到的方式，采用减毒株Sabin株生产脊髓灰质炎灭活疫苗。本发明通过将脊髓灰质炎Sabin株I型、II型、III型病毒液经过超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心超滤脱蔗糖、除菌过滤得到的纯化的脊髓灰质炎病毒液，有效分离脊髓灰质炎病毒液中的实心病毒颗粒与空心病毒颗粒，而且有效地去除了杂质蛋白，大大提高了离心产物中实心病毒颗粒的含量，进一步利用该病毒液制备得到免疫原性良好、杂质含量低、安全性和稳定性高的脊髓灰质炎灭活疫苗。

Description

一种利用脊髓灰质炎减毒株生产的灭活疫苗

技术领域

本发明涉及生物制品制备领域，具体地，涉及一种利用脊髓灰质炎减毒株Sabin株生产的灭活疫苗。

背景技术

脊髓灰质炎病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)，内含单股正链RNA基因，蛋白衣壳为二十面体立体对称结构，无包膜。脊髓灰质炎病毒有3种血清型，分别为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。脊髓灰质炎病毒颗粒包括实心结构病毒颗粒和空心结构病毒颗粒，其中实心结构病毒颗粒能与机体细胞反应产生中和抗体。脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒引起的具有很强传染力的疾病，主要感染五岁以下的儿童。1/200的患者会产生不可逆的腿部瘫痪，更严重的会导致吞咽和说话的困难。有5％-10％的患者因为呼吸肌麻痹导致死亡。目前尚无治疗脊灰的有效手段，脊髓灰质炎疫苗的接种是最有效的预防该疾病发生和传染的方法。

目前上市的脊髓灰质炎病毒疫苗有减毒疫苗(OPV)和灭活疫苗(IPV)。OPV是多数国家计划免疫中的主要疫苗品种之一。1985年至2003年有超过5.5亿儿童在94个国家已经接种了OPV疫苗。虽然OPV免疫力强、作用时间长，免疫剂量少，免疫程序简单，为消除脊灰发挥了重要作用，但OPV的接种引起的脊灰疫苗相关病例(VAPP)和脊髓灰质炎疫苗衍生株(VDPV)威胁始终存在，甚至成为影响公众健康、社会稳定的问题。由于OPV是一种减毒活疫苗，必然存在一定的安全问题。首先，减毒的脊灰病毒一旦毒力返祖，可直接导致脊髓灰质炎相关疾病；其次，疫苗株经循环形成的衍生株也可引发相关病例；此外，极少部分免疫缺陷的接种者使用减毒活疫苗后会成为衍生脊灰病毒的携带者，他们会长期排出病毒导致疾病传播。相对而言，IPV的使用则可以彻底消除减毒活疫苗引起的病毒感染以及由疫苗衍生脊灰病毒造成的疾病爆发风险。为了彻底消除脊灰，WHO制定了全球消除脊灰行动计划，预计到2015年消除脊灰野病毒并在2018年认证全球无脊灰状态。在此过程中，将逐步使用IPV和sIPV代替OPV。

IPV使用野毒株salk株作为生产原料，对生物安全等级要求严格，因此生产商的数量十分有限；此外，由于IPV的价格相对高昂，主要用于发达国家的计划免疫和发展中国家的私人市场。

WHO推荐发展中国家在消灭脊灰最后阶段使用一种由减毒株(Sabin株)生产的新型灭活脊灰疫苗来代替OPV疫苗的使用，从而彻底消除因接种该疫苗导致的VDPV和VAPP的发生。这在消灭脊灰的最后阶段并全面使用灭活疫苗的背景下，具有重要的补充意义：使用减毒株生产的Sabin-IPV，较使用野毒株(Salk株)生产的IPV灭活疫苗，具有生产更安全、成本更低廉的特点，更适合在发展中国家推广使用。目前，对脊灰野毒株Salk株的管理极为严格，在中国境内不允许使用野毒株来生产IPV，选择利用生产OPV用的脊灰减毒株Sabin株研制灭活疫苗，即Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(sIPV)，是全球消除脊灰的重要途径。

传统的sIPV疫苗纯化工艺通常包括超滤浓缩、离子交换层析、除菌过滤等步骤。离子交换层析的分离方法在sIPV疫苗纯化工艺中成本比较高，且无法有效地将实心病毒颗粒与空心病毒颗粒分离。此外，由于实心病毒能与机体细胞反应，诱导机体产生中和抗体，并经大鼠体内免疫原性试验证实：实心病毒颗粒产生的中和抗体至少是空心病毒颗粒的10倍。另外，sIPV生产使用的减毒株Sabin株与IPV生产使用的野毒株Salk株有本质上的区别，比如病毒的基因序列、等电点、稳定性等均不相同，由于传统的生产工艺不适应sIPV的生产导致疫苗产率较低。因此，亟待需要一种利用减毒株Sabin株生产脊髓灰质炎灭活疫苗新的方法，能够有效分离脊髓灰质炎病毒液中的实心病毒颗粒与空心病毒颗粒，而且有效地去除了杂质蛋白，大大提高了离心产物中实心病毒颗粒的含量，使利用该病毒液制备得到的脊髓灰质炎灭活疫苗免疫原性良好、有效滴度高、杂质含量低、安全性和稳定性高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫原性良好、有效滴度高、杂质含量低、安全性和稳定性高的脊髓灰质炎灭活疫苗。

本发明提供的脊髓灰质炎病毒灭活疫苗是利用减毒株Sabin株制备得到。

进一步地，本发明的灭活疫苗是将减毒株Sabin株I型、II型、III型的单价病毒纯化液灭活后混合，添加保护剂制备得到。

本发明的脊髓灰质炎病毒灭活疫苗中减毒株Sabin株I型、II型、III型的抗原含量分别为7-25DU、25-68DU、25-68DU。

优选地，本发明的脊髓灰质炎病毒灭活疫苗中减毒株Sabin株I型、II型、III型的抗原含量分别为12-18DU、36-54DU、36-54DU。

更优选地，本发明的脊髓灰质炎病毒灭活疫苗中减毒株Sabin株I型、II型、III型的抗原含量分别为15DU、45DU、45DU。

上述减毒株Sabin株I型、II型、III型的单价病毒纯化液通过以下方法制备得到：

(1)分别将Sabin株I型、II型、III型病毒液超滤浓缩；

(2)蔗糖密度梯度离心；

(3)收集合并离心液。

其中，步骤(1)的病毒液超滤浓缩是通过以下方法实现的：

1)澄清将病毒液经连续3级孔径为3-0.8μm、0.8-0.65μm、0.65-0.22μm的滤芯过滤或离心(包括连续流离心)转速为2000-5000rpm，离心时间为0.5-4个小时，得到病毒澄清液；

2)浓缩病毒澄清液经切向流膜过滤或中空纤维过滤浓缩，浓缩倍数为50-200倍，使用截留分子量为100万-500万。

其中，步骤(2)的密度梯度离心方法为：

依次从离心机边孔以50～100rpm依次泵入超离缓冲液，病毒超滤浓缩液,低浓度蔗糖溶液，最后以50～150rpm泵入高浓度蔗糖溶液直至中孔流出液体离心转速为28000～35000rpm，离心时间为：6～20小时，离心温度为2～8℃。

超离缓冲液与病毒超滤浓缩液的体积比为1:5～1：10；病毒超滤浓缩液与低浓度蔗糖溶液的体积比为1：1～2:1；高浓度蔗糖加入标准为只要离心机中空流出液体即可停止加入高浓度蔗糖。

其中，所述低浓度蔗糖质量百分比为25％～45％，高浓度蔗糖质量百分比为55％～60％。

其中，超离缓冲液选自0.1～0.5M的PB、PBS和PBST中的一种。

进一步地，步骤(2)的密度梯度离心方法中，纯化脊髓灰质炎病毒液时，当脊髓灰质炎病毒液为Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ时，超离缓冲液的pH值为：6.0～7.0；当脊髓灰质炎病毒液为Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅲ型时，超离心缓冲液的pH值为：6.5～7.5。

本发明方法的步骤(3)中，根据不同性质的病毒颗粒沉降系数不同，导致其处于不同糖度位置，进而分离不同的超离液，即收集并合并处于相同位置的离心液。其中超离液1(含实心病毒)主要位于糖度54％，超离液2(含空心病毒和少量实心病毒)为50％-54％的糖度位置。

上述步骤(3)中，收集离心液后，还包括采用离子交换层析方法对离心液进行纯化，具体为：使用DEAE SepharoseFastFlow，分别检测I、II、III型病毒颗粒的260/280或254/280值，收集流穿峰。离子交换的pH值根据病毒型别稳定性的差异，选择范围为pH6.5-7.5。平衡缓冲液和样品的电导率控制在15-45ms/cm范围内。

本发明通过对sIPV的传统纯化工艺进行了改进，将原有的离子交换层析工艺步骤替换为密度梯度离心(或者连续流密度梯度离心)工艺，有效地将实心病毒颗粒与空心病毒颗粒分离，不仅提高了单位剂量sIPV病毒液的免疫原性，而且大大降低了以此病毒液制备得到的疫苗使用后的副反应，同时降低了生产成本。

本发明的利用脊髓灰质炎减毒株生产的灭活疫苗，在制备该疫苗的过程中，纯化脊髓灰质炎病毒采用的密度介质为蔗糖溶液，蔗糖分为高浓度蔗糖溶液和低浓度蔗糖溶液。高浓度蔗糖溶液为55％～60％，低浓度蔗糖溶液为：25％～45％。根据蔗糖密度可以有效的分离具有免疫原性的实心病毒颗粒(沉降系数约150S)和免疫原性较差或无免疫原性的空心病毒颗粒(沉降系数约80S)，从而达到选择性收集目标区域的目的。利用上述方法不但可以有效分离脊髓灰质炎实心病毒颗粒与空心病毒颗粒。而且有效地去除了杂质蛋白，大大提高了离心产物中实心病毒颗粒的含量，提高sIPV疫苗的纯度，疫苗的安全性和有效性。

由上述技术方案，本发明利用脊髓灰质炎减毒株Sabin株生产的灭活疫苗至少具有以下优点及有益效果：

(一)由于将Sabin株I型、II型、III型病毒液中脊髓灰质炎Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型病毒的实心病毒颗粒与空心病毒颗粒有效分离、使疫苗具有较强的免疫原性。

(二)疫苗中抗原纯度较高，有效滴度高，杂蛋白质去除比较彻底，疫苗安全性和稳定性较高。

(三)极大降低企业生产脊髓灰质炎灭活疫苗的生产成本，克服了使用野毒株salk株作为生产原料，对生物安全等级要求严格且数量有限、价格较高的问题，提供了一种新的以减毒株Sabin株为原料生产的脊髓灰质炎灭活疫苗。

附图说明

图1为实施例2密度梯度离心法蛋白质和抗原含量检测结果图。

图2为脊髓灰质炎病毒电镜照片，其中图2A为实心病毒颗粒电镜照片，图2B为空心病毒颗粒电镜照片。

图3为实施例2中sIPV II型病毒液的密度梯度离心法蛋白质和抗原含量检测结果图。

图4为实施例2中sIPV III型病毒液的密度梯度离心法蛋白质和抗原含量检测结果图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。

实施例1细胞工作种子的制备与病毒液的制备

1、高密度细胞工作种子制备

使用199培养液稀释Vero主细胞种子稀释比例为60:1，接种到175cm²细胞方瓶中培养，培养温度为36.0℃±1℃。待细胞铺满细胞瓶，按1:4～1:6继续传代4代。最后一代传至5个40层细胞工厂，进行胰酶消化，离心去上清。使用含10％DMSO的冻存液进行重悬，混合后细胞浓度为2.5×10⁷个/ml。将细胞种子在程序降温仪进行梯度降温，保持每分钟下降1℃。温度降至-196℃后移至液氮中保存，工作细胞种子的有效期为10年。

2、脊髓灰质炎I、II、III型原液的制备

(1)一级细胞培养称取微载体，用0.01M PBS溶胀过夜，用适量的PBS漂洗2次，置于高压蒸汽灭菌柜121℃灭菌。将细胞种子从液氮中取出，在39±1℃的水浴中迅速摇动融化，计数后，加入生长液中，进行一级细胞培养，培养体积约为5L。调整各培养参数，温度为36.5℃、pH值为7.20、溶氧为50％、转速为30rpm。细胞培养至平台期时2.5×10⁶cells/ml，进行消化传代。

(2)二级细胞培养将步骤(1)培养完成的细胞经消化制备成细胞悬液，接种至20L细胞反应器，调整各培养参数，温度为36.5℃、pH值为7.20、溶氧为50％、转速为30rpm，开始培养。细胞培养至平台期时5×10⁶cells/ml，准备进行消化。

(3)三级细胞培养

步骤(2)培养完成后的细胞制备成细胞悬液，接种至工作体积120L细胞反应器中，设置温度为36.5℃、pH值为7.20、转速为30rpm、溶氧为50％。细胞密度培养至1.5×10⁶cells/ml准备接种病毒。

3、病毒液培养

按MOI 0.001分别接种脊髓灰质炎病毒Sabin株I、II、III型种子，将培养参数调整为转速：30rpm，温度：32.5℃，pH值：7.40，溶氧：25％。待微载体上细胞病变超过95％，停止培养，收获病毒液，培养时间为49小时。

4、病毒液的超滤浓缩

2)浓缩病毒澄清液经300万截留分子量的Pall切向流膜过滤系统进行浓缩，浓缩倍数为100倍。

实施例2 Sabin株脊髓灰质炎Ⅰ型、II型、III病毒液的纯化与效果验证

1、蔗糖溶液的低、高浓度分别为25％，55％。密度梯度离心缓冲液为0.5mol/L PBS缓冲液，其pH值为：6.5。使用日立CP70MX/ME超速离心机，依次从边孔以100rpm泵入100ml超离心缓冲液，约700ml的实施例1超滤浓缩获得的sIPV I型(或sIPV II型或sIPV III型)病毒超滤液,低浓度蔗糖溶液500ml，最后以100rpm泵入高浓度蔗糖溶液直至中孔流出液体，在4℃经30000rpm超滤离心10h。离心完成后，第一管收集500ml，之后用50ml离心管收集，50ml/管，可以收集25-27管。检测每管的抗原含量和蛋白质含量，根据糖度的检测结果等体积分别合并仅含有有效抗原成分的部分(糖度为54％的超离液1)，和含有混合的非有效抗原成分和有效抗原成分的部分(糖度为50％-54％超离液2)对两种超离液的糖度、抗原含量、蛋白含量、HCP含量，BSA含量和DNA含量进行检测，检测结果见表1、表2、表3。

2、同时设对照试验：采用传统工艺分子筛层析同时进行病毒纯化，柱子型号为xk16/100，填料为Sepharose CL6B。上样量为柱体积的3.5％。UV检测器检测波长260，280和254nm。设置系统流速为15cm/h(0.5ml/min)。收集第2个UV吸收峰，即分子筛纯化液。检测抗原含量、蛋白含量、HCP含量、BSA含量和DNA含量，结果见表1、表2、表3。

3、离子交换在XK50/30层析柱中，装入Sephasore DEAE FastFlow层析填料，连接AKTA avant150层析系统。用0.15M的磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行平衡，分别对各型的超离液1、超离液2和分子筛纯化液进行实验，检测紫外吸收波长280/254nm吸收值，收集流穿峰即为脊灰I、II和III型病毒纯化液。

4、sIPV I型病毒液离心后，蛋白质和抗原含量检测结果如图1所示。蛋白质峰与抗原峰相互分离，说明此次试验能有效地将杂蛋白质与sIPV抗原、空心病毒颗粒与实心病毒颗粒分离。抗原峰由两个小峰组成，经电镜观察证实第一个峰(靠近蛋白质峰的小峰)主要包含空心病毒颗粒(空心病毒)，第二个峰(远离蛋白质峰的小峰)主要包含实心病毒颗粒(实心病毒)。电镜照片如图2A、图2B所示。

sIPV II型病毒液离心后，蛋白质和抗原含量检测结果如图3所示。蛋白质峰与抗原峰相互分离，没有交集，说明此次试验能有效地将杂蛋白质与sIPV抗原、空心病毒颗粒与实心病毒颗粒分离。抗原峰由两个小峰组成，经电镜观察证实第一个峰(靠近蛋白质峰的小峰)主要包含空心病毒颗粒(空心病毒)，第二个峰(远离蛋白质峰的小峰)主要包含实心病毒颗粒(实心病毒)。

sIPV III型病毒液离心后，蛋白质和抗原含量检测结果如图4所示。蛋白质峰与抗原峰相互分离，没有交集，说明此次试验能有效地将杂蛋白质与sIPV抗原、空心病毒颗粒与实心病毒颗粒分离。抗原峰由两个小峰组成，经电镜观察证实第一个峰(靠近蛋白质峰的小峰)主要包含空心病毒颗粒(空心病毒)，第二个峰(远离蛋白质峰的小峰)主要包含实心病毒颗粒(实心病毒)。

表1 sIPVⅠ型超离液1、超离液2和分子筛纯化液性质

表2 sIPVⅡ型超离液1、超离液2和分子筛纯化液性质

表3 sIPVⅢ型超离液1、超离液2和分子筛纯化液性质

通过表1-表3研究结果显示，超离液1(含实心病毒)的有效抗原成分含量不低于超离液2(含空心病毒和少量实心病毒)纯化液，远高于分子筛纯化液；而主要杂质DNA、BSA、HCP含量方面显著低于超离液2和分子筛纯化液。

实施例3 Sabin株脊髓灰质炎Ⅰ型、II型、III纯化后的病毒液制备成疫苗的各项指标评价

1、杂质含量

将实施例2获得的Sabin株脊髓灰质炎I型、II型、III型的超离液1和超离液2，以及对照试验中使用传统工艺获得的分子筛纯化液，再进行离子交换、超滤浓缩和灭活等纯化步骤，获得单价病毒原液。将获得的各型别的单价原液根据成品中抗原含量进行稀释和等比例混合，最终成品的抗原含量为I型15DU，II型45DU，III型45DU。然后根据成品定义的抗原量分别配比获得了成品1(仅含有有效抗原成份即实心病毒)、成品2(含有有效抗原成份和非有效抗原成份)和成品3(按传统工艺制备)。三个成品的杂质含量结果见表4。根据统计分析，I型、II型和III型的成品1和成品2的杂质(牛血清白蛋白残留、Vero细胞蛋白质残留、蛋白质含量、DNA残留)均有显著差异并小于成品2的杂质含量(P值均小于0.05)；I型、II型和III型的成品1和成品3的相应杂质含量均有显著差异并小于成品3的杂质含量(P值均小于0.05)。

表4 6批疫苗成品主要杂质残留量结果*

*计算P值时如果数值为小于(<)值，按照该值进行计算。如果数值为范围值，按照范围上下限的平均值进行计算。

2、免疫原性

根据成品1、成品2和成品3检测的抗原含量，分别配制免疫原性样品，将上述样品进行3倍系列稀释，共4个稀释度；同时将国际标准品稀释至I、II、III型的抗原含量至每剂量15DU、45DU、45DU，并在此基础上进行3倍系列稀释，共4个稀释度样品，每个稀释度样品分别进行单次两后肢肌肉免疫大鼠，0.5ml/只，10只(雌雄各半)每稀释度，免疫后21天采血，分离血清，分别检测血清中抗I、II、III型的中和抗体滴度，计算血清阳转率。成品1、成品2和成品3的血清阳转率和中和抗体几何平均值GMT水平见表5。根据统计分析，I型、II型和III型的成品1和成品2的中和抗体GMT值均无显著差异(P值均大于0.05)；I型、II型和III型的成品1和成品3的中和抗体GMT值均无显著差异(P值均大于0.05)。

表5 成品1、成品2及成品3免疫原性结果

3、稳定性

将成品1、成品2和成品3储存在2-8℃环境下，按时间点取样检测抗原含量、外观、pH值、渗透压摩尔浓度、细菌内毒素、甲醛含量、BSA含量、HCP含量、DNA含量、蛋白质含量等。记录数据至18个月，结果见表6-表12。

表6 2～8℃成品1的D-抗原含量检测结果(标示量的百分比)

*标示量的百分比值是较0月值的百分比值。

表7 2～8℃成品2的D-抗原含量检测结果(标示量的百分比)

*标示量的百分比值是较0月值的百分比值。

表8 2～8℃成品3的D-抗原含量检测结果(标示量的百分比)

*标示量的百分比值是较0月值的百分比值。

表9 2～8℃蛋白质含量检测结果

表10 2～8℃DNA含量检测结果

表11 2～8℃BSA含量检测结果

表12 2～8℃HCP含量检测结果

将成品1(仅含实心病毒)、成品2和成品3在2-8℃环境下储存18个月，成品1的稳定性与成品2、成品3相当均未见明显下降；同时，主要杂质含量成品1远低于成品2、成品3。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种将实心病毒颗粒与空心病毒颗粒分离的脊髓灰质炎病毒灭活疫苗的制备方法，

其中，所述疫苗是首先制备得到减毒株Sabin株I型、II型、III型的单价病毒纯化液，而后将减毒株Sabin株I型、II型、III型的单价病毒纯化液灭活后混合，添加保护剂制备得到的；

所述脊髓灰质炎病毒灭活疫苗中，减毒株Sabin株I型、II型、III型的抗原含量分别为7-25DU、25-68DU、25-68DU；

其中，减毒株Sabin株I型、II型、III型的单价病毒纯化液通过以下步骤制备得到：

(1)分别将Sabin株I型、II型、III型病毒液超滤浓缩；

(2)蔗糖密度梯度离心；

(3)收集合并处于54%糖度位置的离心液；

在上述步骤中，步骤(2)的蔗糖密度梯度离心方法为：

依次从离心机边孔以50～100rpm泵入超滤离心缓冲液、病毒超滤浓缩液、低浓度蔗糖溶液，最后以50～150rpm泵入高浓度蔗糖溶液，直至中孔流出液体时停止泵入高浓度蔗糖溶液，离心转速为28000～35000rpm，离心时间为：6～20小时，离心温度为2～8℃；

其中，所述低浓度蔗糖质量百分比为25％～45％，高浓度蔗糖质量百分比为55％～60％；

超离缓冲液选自0.1～0.5M的PB、PBS和PBST中的一种；

其中，超离缓冲液与病毒超滤浓缩液的体积比为1:5～1：10；病毒超滤浓缩液与低浓度蔗糖溶液的体积比为1：1～2:1。

2.根据权利要求1所述的脊髓灰质炎病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，当脊髓灰质炎病毒液为Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ时，超离缓冲液的pH值为：6.0～7.0；当脊髓灰质炎病毒液为Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅲ型时，超离心缓冲液的pH值为：6.5～7.5。