CN118356464A - 黑青稞萃取物用于调节免疫力的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种黑青稞萃取物用于制备调节受体的免疫力的组合物的用途，其中黑青稞萃取物是将黑青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f.)的种子以淀粉酶水溶液进行萃取所得。

Description

黑青稞萃取物用于调节免疫力的用途

技术领域

本发明关于一种黑青稞萃取物，特别是涉及一种以淀粉酶水溶液进行萃取所得黑青稞萃取物，其具有调节免疫力的功能。

背景技术

青稞，别名为裸大麦、元麦、米大麦，是一种禾谷类作物，为大麦的变种之一。在青藏高原，青稞具有3500年的栽培历史，为藏族的主要食用粮食、燃料和牲畜饲料。

青稞主要分布于中国西北、西南各省，其适宜生长在高原清凉气候，具有耐寒性强、生长期短、高产早熟、适应性广等特征。

青稞富含钙、铁、维生素、β-葡聚糖、膳食纤维等多种营养成分。在藏族，青稞谷粒可以炒熟磨粉，食用时加入酥油茶或清茶后用手捏成坨，称为糌粑(Tsampa)；青稞亦可酿制成青稞酒，为一种低度麦酒。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种黑青稞萃取物，其具有调节免疫力的功能。

在一些实施例中，一种黑青稞萃取物用于制备调节受体的免疫力的组合物的用途，其中黑青稞萃取物是将黑青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f.)的种子以淀粉酶水溶液进行萃取所得。

在一些实施例中，前述黑青稞萃取物的萃取步骤是于80℃至100℃下进行50分钟至70分钟。

在一些实施例中，前述黑青稞萃取物的萃取温度为90℃±5℃，且萃取时间为60分钟。

在一些实施例中，淀粉酶可以是α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶中的至少一种或其混合。

在一些实施例中，淀粉酶水溶液中的淀粉酶的浓度为0.3％(w/v)至0.7％(w/v)。

在一些实施例中，淀粉酶水溶液与黑青稞的种子的重量比为5-10：1。在一些实施例中，前述重量比为10：1。

在一些实施例中，调节受体的免疫力为调节免疫相关基因的表现量。在一些实施例中，前述免疫相关基因为白细胞介素-1β(IL-1β)基因、白细胞介素-8(IL-8)基因、白细胞介素-6(IL-6)基因、白细胞介素-10(IL-10)基因、γ-干扰素(IFNG)基因或其组合。

在一些实施例中，调节受体的免疫力为提升自然杀手细胞(NK细胞)的细胞毒杀能力。

在一些实施例中，调节受体的免疫力为降低发炎所产生的一氧化氮(NO)含量。

在一些实施例中，调节受体的免疫力为减少受体的免疫力低下相关症状。在一些实施例中，前述免疫力低下相关症状为精神不济、肠胃不适、嘴破、咳嗽、头痛或其组合。

在一些实施例中，调节受体的免疫力为缓解受体的过敏反应。在一些实施例中，前述过敏反应包括过敏性哮喘、食物过敏及皮肤过敏。

在一些实施例中，调节受体的免疫力为提高受体的血液中总量T细胞及辅助型T细胞的含量。

在一些实施例中，调节受体的免疫力为提升受体的血液中CD4/CD8的比值。

综上所述，任一实施例的黑青稞萃取物是将黑青稞的种子以淀粉酶水溶液进行萃取所得，其可用以制备调节受体的免疫力的组合物。在一些实施例中，前述调节受体的免疫力为调节免疫相关基因的表现量、提升自然杀手细胞的细胞毒杀能力、降低发炎所产生的一氧化氮含量、提高受体的血液中总量T细胞及辅助型T细胞的含量、提升受体的血液中CD4/CD8的比值等功能，从而有效提高受体的总体免疫力、降低受体发炎情形、维持免疫正常，并减少受体的免疫力低下相关症状(例如，精神不济、肠胃不适、嘴破、咳嗽、头痛等症状)、缓解受体的过敏反应(例如，过敏性哮喘、食物过敏、皮肤过敏等过敏反应)。

附图说明

图1是黑青稞萃取物与青稞萃取物的免疫相关基因(IL-1β基因及IL-8基因)的比较实验结果图；

图2是黑青稞萃取物与青稞萃取物的免疫相关基因(IL-6基因及IL-10基因)的比较实验结果图；

图3是黑青稞萃取物与青稞萃取物的免疫相关基因(IFNG基因)的比较实验结果图；

图4是黑青稞萃取物与青稞萃取物的自然杀手细胞(NK细胞)的细胞毒杀能力的比较实验结果图；

图5是黑青稞萃取物的一氧化氮(NO)含量的实验结果图；

图6是受试者在第0周、第2周及第4周的平均血液中总量T细胞含量的结果图；

图7是受试者在第0周、第2周及第4周的平均血液中辅助型T细胞的结果图；

图8是受试者在第0周、第2周及第4周的平均血液中CD4/CD8的比值的结果图；

图9是受试者在第0周及第4周的血液中自然杀手细胞(NK细胞)的细胞毒杀能力的测试结果图；

图10是全部受试者在第0周、第2周及第4周的平均血液中IgE含量的结果图；

图11是IgE含量超目标部分受试者在第0周、第2周及第4周的平均血液中IgE含量的结果图；

图12是受试者服用黑青稞萃取物四周后的体感问卷的调查结果图；以及

图13是受试者服用黑青稞萃取物四周后的整体功效满意度的调查结果图。

具体实施方式

本文中使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，各组之间的差异以学生t检验(student’s t-test)进行分析。图式中「*」或「#」代表p值小于0.05，「**」或「##」代表p值小于0.01，以及「***」或「###」代表p值小于0.001。当「*」或「#」越多时，代表统计上的差异越显著。

术语「萃取物」系指藉由萃取作用所制备的产物。萃取物可以溶于溶剂中的溶液形式呈现，或萃取物可为不含或大体上不含溶剂的浓缩物或精华呈现，亦可以干燥后的粉体呈现。

黑青稞(black hulless barley)，学名为Hordeum vulgare L.var.nudumHook.f.，俗称黑大麦，黑元麦等。黑青稞为禾本科大麦属谷物成熟种子，因其颖壳及籽粒表皮呈现黑紫色而命名，形状为椭圆形或菱形。黑青稞富含钙、铁、维生素、β-葡聚糖、膳食纤维、微量元素等多种营养成分。

在一些实施例中，将黑青稞的种子与淀粉酶水溶液混合后，于特定温度下进行萃取一定时间可得到黑青稞萃取物。其中，黑青稞的种子为成熟的种子、经脱壳后的种子、经加工处理后的种子等。举例来说，用来萃取的黑青稞的种子是将黑青稞种子去壳后再经粉碎磨成粉末。

其中，淀粉酶水溶液是将淀粉酶溶于水中所得。在一些实施例中，淀粉酶可以是α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶至少一或其混合。在一些实施例中，淀粉酶可以是葡萄糖淀粉酶(glucan 1,4-alpha-glucosidase)。

在一些实施例中，淀粉酶水溶液中的淀粉酶的浓度可以为0.3％(w/v)至0.7％(w/v)。举例来说，淀粉酶的浓度为0.5％(w/v)。

在一些实施例中，黑青稞的种子与淀粉酶水溶液混和的重量比为5-10：1。举例来说，前述重量比为10：1。于此，若淀粉酶水溶液过少则萃取效率将会明显下降。

在一些实施例中，黑青稞萃取物的萃取温度为80℃至100℃。举例来说，萃取温度为85℃至95℃。在一些实施例中，黑青稞萃取物的萃取时间为50分钟至70分钟。举例来说，萃取时间为60分钟。在一示范例中，黑青稞萃取物是在90℃±5℃下萃取60分钟所得。于此，若萃取时间过短，则萃取效率将明显下降；若萃取时间过长，则所得萃取物中的有效成分可能会产生降解。

在一些实施例中，黑青稞萃取物的制备步骤更包括过滤、浓缩及调整酸碱度。举例来说，将去壳黑青稞的种子磨成粉末后并加入0.3％(w/v)至0.7％(w/v)的淀粉酶水溶液中，于80℃至100℃下进行萃取50分钟至70分钟以得到黑青稞第一萃取液。接着，使用400目数的滤网将黑青稞第一萃取液进行过滤以去除细微固体。然后将过滤后的黑青稞第一萃取液于60℃±5℃下进行减压浓缩至溶液的白利糖度值(Degrees Brix)为5.0±0.5时停止浓缩，以得到黑青稞萃取物。其中，若所得到的黑青稞萃取物的pH值高于4.0，则可加入0.26％的苹果酸使其pH值降为3.2±0.5。

在一些实施例中，黑青稞萃取物具有调节免疫力的功能。举例来说，调节免疫力为调节免疫相关基因的表现量、提升自然杀手(NK)细胞的细胞毒杀能力、降低发炎所产生的一氧化氮含量、提高血液中的IgE含量、提高血液中总量T细胞及辅助型T细胞的含量、提升血液中CD4/CD8的比值等。换言之，受体服用黑青稞萃取物后可有效地提升总体免疫力、抗发炎、降低发炎情形、减少过敏反应、维持正常免疫功能等。

在一些实施例中，黑青稞萃取物可提高白细胞介素-1β(IL-1β)基因、白细胞介素-8(IL-8)基因、白细胞介素-6(IL-6)基因、白细胞介素-10(IL-10)基因等免疫相关基因的表现，并可降低γ-干扰素(IFNG)基因的表现。其中，IL-1β基因编码的蛋白质可活化血管内皮细胞、淋巴细胞，破坏局部组织并使免疫细胞更容易进入；IL-8基因编码的蛋白质可对嗜中性粒细胞有细胞趋化作用并调节发炎反应；IL-6基因及IL-10基因分别编码的蛋白质可提升抗发炎能力；以及，IFNG基因编码的蛋白质为巨噬细胞活化因子，若活化则呈发炎反应，故透过抑制IFNG基因的表现可降低发炎情形。

在一些实施例中，黑青稞萃取物可活化NK细胞的细胞毒性，即提升其细胞毒杀能力，以提升人体免疫力。由于活化的NK细胞引发目标细胞的细胞凋亡(apoptosis)反应，故可毒杀被病毒感染的细胞、癌细胞、癌化细胞、老化细胞或受压力的细胞。

在一些实施例中，黑青稞萃取物可有效降低发炎所产生的一氧化氮含量，以降低发炎率。人体内的巨噬细胞与病原体接触时会促使一氧化氮含量产生并造成细胞死亡。因此，降低发炎所产生的一氧化氮含量可减少发炎情形。

在一些实施例中，黑青稞萃取物可提高血液中总量T细胞及辅助型T细胞的含量、提升血液中CD4/CD8的比值，以提高免疫力。因T细胞主要负责细胞免疫调节及细胞激素的分泌，而辅助型T细胞是负责激活免疫反应，故提升总量T细胞及辅助型T细胞的含量可提高免疫力。CD4是辅助性T细胞表面的标记，而CD8则是抑制性T细胞表面的标记，故CD4/CD8比值为观察免疫功能是否正常的重要指针。一般而言，CD4/CD8比值偏低表示免疫力低弱，而提升CD4/CD8的比值代表免疫力的提高。

在一些实施例中，黑青稞萃取物可有效降低受体血液中的IgE含量，以减缓过敏反应。一般而言，近期过敏症状或属于经常过敏的受体的血液中容易出现IgE含量明显升高的情形。因此，受体服用黑青稞萃取物后，其血液中的IgE含量降低，并可减缓过敏反应，如减缓过敏性哮喘(如较少发生咳嗽、头痛等感冒症状)、减少食物过敏(如较少感到肠胃不适)、减少皮肤过敏(如感到不易嘴破或嘴破愈合速度较快)等。

在一些实施例中，黑青稞萃取物减少受体的免疫力低下相关症状，如精神不济、肠胃不适、嘴破、咳嗽、头痛等症状。

在一些实施例中，黑青稞萃取物缓解受体的过敏反应，如过敏性哮喘、食物过敏及皮肤过敏。

在一些实施例中，黑青稞萃取物用于制备调节受体免疫力的组合物。举例来说，组合物可以为含有黑青稞萃取物的粉末的胶囊型态、含有液态黑青稞萃取物的饮品。在一些实施例中，一种组合物，包含容器与装在容器内的黑青稞萃取物。举例来说，黑青稞萃取物饮品中为容器内装有含有黑青稞萃取物的黑青稞饮料。

在一些实施例中，前述受体为人。

在一些实施例中，前述之任一组合物可为医药品。换言之，此医药品包含有效含量的黑青稞萃取物。

在一些实施例中，前述的医药品可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成适合于经肠道地、非经肠道地(parenterally)、口服的、或局部地(topically)投药剂型。

在一些实施例中，经肠道或口服的投药剂型可为，但不限于，锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)或类似之物。在一些实施例中，非经肠道地或局部地投药剂型可为，但不限于，注射品(injection)、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(externalpreparation)或类似之物。在一些实施例中，注射品的投药方式可为皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)或病灶内注射(intralesional injection)。

在一些实施例中，前述的医药品可包含被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。在一些实施例中，医药上可接受的载剂可为下列载剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。关于选用的载剂的种类与数量是落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。在一些实施例中，作为医药上可接受的载剂的溶剂可为水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、或含有醇的水性溶液(aqueous solutioncontaining alcohol)。

在一些实施例中，前述的任一组合物可为非医药用食用产品。换言之，食用产品包含特定含量的黑青稞萃取物。在一些实施例中，食用产品可为一般食品、保健食品或膳食补充品。

在一些实施例中，前述的食用产品可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成适合于口服的剂型。在一些实施例中，前述之一般食品可为食用产品本身。在一些实施例中，一般食品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)或调味料。

在一些实施例中，所得的黑青稞萃取物可进一步作为食品添加物(foodadditive)，以制得含有黑青稞萃取物的食品组合物。于此，能藉由现有技术方法于原料制备时添加任一实施例的黑青稞萃取物，或是于食品的制作过程中添加任一实施例的黑青稞萃取物，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食用产品(即食品组合物)。

在一些实施例中，前述含有黑青稞萃取物的组合物，所含有的黑青稞萃取物可为液态或固态。举例来说，固态可为粉末或锭型。

在一些实施例中，组合物的使用量为1.2克/日至2克/日的液态黑青稞萃取物。

在一些实施例中，组合物的使用量为0.15克/日至0.22克/日的固态黑青稞萃取物。

例1：黑青稞萃取物的制备方法

首先，将去壳的黑青稞的种子(产地中国)以粉碎机(SAMPO 1.5LKJ-SD15G)磨成粉末后，并加入0.5％(w/v)的α-淀粉酶(购自ABenzymes；型号10338)水溶液中。于此，0.5％(w/v)的α-淀粉酶水溶液与黑青稞的种子粉末的重量比为10：1。

接着，于90℃±5℃下萃取60分钟以得到黑青稞第一萃取液，并使用400目数的滤网将黑青稞第一萃取液进行过滤以去除细微固体。然后将过滤后的黑青稞第一萃取液以浓缩机(厂牌/型号：BUCHI-Rotavapor R-100)于60℃±5℃下进行减压浓缩至黑青稞第一萃取液的白利糖度值(Degrees Brix)为5.0±0.5时停止浓缩，并对所得浓缩产物进行酸碱值测定。于此，若所得到的浓缩产物的pH值未高于4.0，则浓缩产物即为黑青稞萃取物；若所得到的浓缩产物的pH值高于4.0则可加入0.26％的苹果酸使其pH值降为3.2±0.5后，即得到黑青稞萃取物。

例2：一般青稞萃取物(以下称白青稞萃取物)的制备方法

首先，将去壳的白青稞的种子(产地中国)以粉碎机(SAMPO 1.5LKJ-SD15G)磨成粉末后，并加入0.5％(w/v)的α-淀粉酶(购自ABenzymes；型号10338)水溶液中。于此，0.5％(w/v)的α-淀粉酶水溶液与青稞的种子粉末的重量比为10：1。

接着，于90℃±5℃下萃取60分钟以得到青稞第一萃取液，并使用400目数的滤网将青稞第一萃取液进行过滤以去除细微固体。然后将过滤后的青稞第一萃取液以浓缩机(厂牌/型号：BUCHI-Rotavapor R-100)于60℃±5℃下进行减压浓缩至青稞第一萃取液的白利糖度值(Degrees Brix)为5.0±0.5时停止浓缩，并对所得浓缩产物进行酸碱值测定。于此，若所得到的浓缩产物的pH值未高于4.0，则浓缩产物即为白青稞萃取物；若所得到的浓缩产物的pH值高于4.0则可加入0.26％的苹果酸使其pH值降为3.2±0.5后，即得到白青稞萃取物。

例3：免疫相关基因实验

于此，所检测的免疫相关基因为IL-1β(GeneID：3553)基因、IL-8(GeneID：3576)基因、IL-6(GeneID：3569)基因及IL-10(GeneID:3586)基因。

首先，取1.5x10⁵个THP-1人类单核白血球细胞(human acute monocyticleukemia；ATCC,TIB202；以下称THP-1细胞)至每孔含有2毫升细胞培养基的六孔细胞培养盘中，于37℃下培养24小时。于此，所使用的细胞培养基为添加有10％的牛血清(fetalbovine serum；购自Gibco)、0.05mM的2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)、100units/mL的青霉素及100μg/mL的链霉素的RPMI-1640培养基(购自Gibco)。

将THP-1细胞分为空白组、对照组及实验组。移除各组别的细胞培养基并更换为每孔2mL实验培养基，然后置于37℃下分别接续培养48小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.125mg/mL的例1中所得到的黑青稞萃取物的细胞培养基、对照组的实验培养基为含有0.125mg/mL的例2中所得到的青稞萃取物的细胞培养基，而空白组的实验培养基为未添加萃取物的细胞培养基。

收集各组的THP-1细胞，并以RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，LotNo.FC24015-G)萃取出各组的RNA。接着，各组取1000纳克(ng)的RNA作为模板，透过III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)将RNA反转录为相应的cDNA。再藉由ABI StepOnePlus^TM实时PCR系统(ABI StepOnePlus^TM Real-Time PCRsystem(Thermo Fisher Scientific公司，美国))、KAPA SYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)及表1的引子(SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8)对各组的cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcription polymerasechain reaction)以观察THP-1细胞内IL-1β基因、IL-8基因、IL-6基因、IL-10基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，接着95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环，并使用2-ΔCt方法进行基因定量，如图1及图2所示。于此，藉由cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量基因的mRNA表现量，从而推断基因编码的蛋白质的表现量。

需要特别说明的是，图1及图2中的基因表现是以相对表现倍率呈现，其中使用Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，且各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析。并且，「*」是与空白组相比的P值。

表1

于表1中，F为顺向引子(Forward primer)，而R为反向引子(Reverse primer)。

请参阅图1。将空白组的IL-1β基因及IL-8基因的相对表现量视为1.00(即空白组的各组基因的表现量为100％)。相较于空白组，实验组的IL-1β基因的相对表现量为1.68而对照组的IL-1β基因的相对表现量为1.59，且实验组的IL-8基因的相对表现量为1.57而对照组的IL-8基因的相对表现量为1.56。于此，实验组相较于空白组的IL-1β基因表现量提高1.68倍、IL-8基因表现量提高1.57倍。换言之，实验组的IL-1β基因及IL-8基因的表现量相较于对照组及空白组有显著的提升，代表黑青稞萃取物能有效地提高IL-1β基因及IL-8基因的表现量。换言之，当受体服用黑青稞萃取物时，能提高的IL-1β基因及IL-8基因的表现量，从而活化免疫细胞、调解发炎反应并提高总体免疫力及达成抗发炎的功能。

请参阅图2。将空白组的IL-6基因及IL-10基因的相对表现量视为1.00(即空白组的各组基因的表现量为100％)。相较于空白组，实验组的IL-6基因的相对表现量为2.08而对照组的IL-6基因的相对表现量为1.87，且实验组的IL-10基因的相对表现量为2.05而对照组的IL-10基因的相对表现量为1.72。于此，实验组相较于空白组的IL-6基因表现量提高2.08倍、IL-10基因表现量提高2.05倍。换言之，实验组的IL-6基因及IL-10基因的表现量相较于对照组及空白组有显著的提升，代表黑青稞萃取物能有效地提高IL-6基因及IL-10基因的表现量，且此二基因表现量较对照组所使用的青稞萃取物的表现量有显著的提升。换言之，当受体服用黑青稞萃取物时，能提高的IL-6基因及IL-10基因的表现量，从而提高总体免疫力及抗发炎的能力。

例4：免疫相关(抗发炎)基因实验

于此，所检测的免疫相关(抗发炎)基因为IFNG(GeneID：3458)基因。

首先，取1x10⁶个HaCaT人类角质细胞(Human keratinocytes；ATCC；以下称HaCaT细胞)至每孔含有2毫升细胞培养基的六孔细胞培养盘中，于37℃下培养24小时。于此，所使用的细胞培养基为添加有10％的牛血清(fetal bovine serum；购自Gibco)、100units/mL的青霉素及100μg/mL的链霉素的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium；购自Gibco)。

将HaCaT细胞分为空白组、控制组、对照组及实验组。移除各组别的细胞培养基并更换为每孔2mL的实验培养基，然后置于37℃下分别接续培养24小时。其中，实验组的实验培养基为含有2μg/ml的脂多醣(Lipopolysaccharide,LPS；购自Sigma，SI-L2880-25MG)及0.125mg/mL的例1中所得到的黑青稞萃取物的细胞培养基、对照组的实验培养基为含有2μg/ml的LPS及0.125mg/mL的例2中所得到的青稞萃取物的细胞培养基、控制组的实验培养基为含有2μg/ml的LPS的细胞培养基，而空白组的实验培养基为未添加萃取物或LPS的细胞培养基。

收集各组的HaCaT细胞，并以500μL的RB缓冲液将细胞裂解后，以RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Lot No.FC24015-G)萃取出各组的RNA。接着，各组取1000纳克(ng)的RNA作为模板，透过III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)将RNA反转录为相应的cDNA。再藉由ABI StepOnePlus^TM实时PCR系统(ABIStepOnePlus^TM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国))、KAPASYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)及表2的引子(SEQ ID NO:9至SEQ IDNO:10)对各组的cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-timereverse transcription polymerase chain reaction)以观察HaCaT细胞内IFNG基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，接着95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环，并使用2-ΔCt方法进行基因定量，如图3所示。于此，藉由cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量基因的mRNA表现量，从而推断基因编码的蛋白质的表现量。

需要特别说明的是，图3中的基因表现是以相对表现倍率呈现，其中使用Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，且各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析。并且，「#」是与控制组相比的P值。

表2

于表2中，F为顺向引子(Forward primer)，而R为反向引子(Reverse primer)。

请参阅图3。将空白组的IFNG基因的相对表现量视为1.00(即空白组的各组基因的表现量为100％)，而控制组作为LPS诱导发炎情形的IFNG基因相对表现量为2.07。相较于空白组及控制组，实验组的IFNG基因的相对表现量为0.69而对照组的IFNG基因的相对表现量为0.93。于此，实验组及对照组均可抑制IFNG基因的表现，而实验组的黑青稞萃取物显著地抑制IFNG基因。换言之，实验组的IFNG基因的表现量相较于控制组、空白组及对照组有显著的下降，代表黑青稞萃取物能有效地抑制IFNG基因的表现量。换言之，当受体服用黑青稞萃取物时，能抑制IFNG基因的表现量，从而降低巨噬细胞活化的机率并提高总体免疫力及降低发炎情形。

例5：杀手细胞细胞毒杀能力试验

荧光染料3,8-二氨基-5-[3(二乙基甲氨基)丙基]-6-苯基啡瞇二碘(3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridiniumdiiodide，Propidium Iodide,PI；碘化丙啶)是种可对DNA染色的细胞核染色试剂，它可在嵌入双链DNA后释放红色荧光。而由于PI不能通过活细胞膜但却能穿过破损的细胞膜而对其细胞核进行染色，故PI可作为死细胞核酸试剂，常用于细胞凋亡检测。PI也经常被用来与钙黄绿素乙酰氧基甲酯(Calcein acetoxymethyl ester,Calcein AM；钙黄绿素AM)或者二乙酸荧光素(fluorescein diacetate，FDA)等荧光探针一起使用，以同时对活细胞和死细胞染色进行测试。

于此，藉由将人类周边血液单核球细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC；购自：以下称PBMC细胞)(其中约含有10％的自然杀手细胞)与K562人类骨髓性白血病细胞(K562人类血癌细胞，购自美国典型培养物保存中心(American Type CultureCollection，ATCC)，产品编号CCL-243；以下称K562细胞)共培养，再以死细胞染剂PI搭配流式细胞仪检测，分析死细胞数目，间接推知各组自然杀手细胞的细胞毒杀能力。

首先，先由健康捐赠者提供周边血，并从中分离出PBMC。使用含EDTA抗凝剂的紫头采血管(购自greiner bio-one，商品编号455036)收集数字受试者的静脉血各6毫升，接着将抽取后的静脉血以转速300×g离心15分钟并从中取2mL的血沉棕黄层(buffy coat)的白细胞层。将白细胞层以2毫升DPBS稀释为4毫升，接着将稀释后的白细胞层中缓慢加入至含有3毫升的细胞分离液(Ficoll-Paque Plus细胞分离液，购自GE Healthcare，商品编号17144002)的离心管，其中于加入期间，稀释后的白细胞层与细胞分离液须为分层状态，不能混合。接着，将装有分层的稀释后的白细胞层与细胞分离液的离心管以400×g离心40分钟后去除上清液。从上述离心后离心管内的中间层内取2至3毫升的PBMC细胞，并以3倍体积的1XDPBS润洗后与前述1X DPBS缓冲液混合均匀以形成PBMC混合液。接着将PBMC混合液以转速300×g离心10分钟以形成上清液及PBMC细胞沉淀物。

将PBMC细胞沉淀物以5毫升的RPMI 1640细胞培养基(购自Gibco，产品编号31800022)回溶，并加入1μl的Calcein AM(染色体积比1:5000；购自Invitrogen，商品编号A13201)静置5分钟以进行染色。接着，以400×g转速离心PBMC细胞5分钟以去除其上清液，再加入5毫升后1×PBS离心并重复此步骤离心3至5次以确实将多余的Calcein AM去除。

以RPMI 1640细胞培养基将PBMC细胞稀释为1×10⁶/100μl，及将K562细胞稀释为5x10⁴/100μl。接着，将染色稀释后的PBMC细胞以每孔1×10⁶个PBMC细胞接种至V-bottom 96孔盘。接着，依表3进行各组细胞配置空白组、控制组、对照组及实验组。于控制组、对照组及实验组的0小时组及6小时组中再加入每孔5x10⁴个K562细胞至各组含有的染色的PBMC细胞的V-bottom 96孔盘中。此外，空白组分为PBMC细胞组、K562细胞组、K562细胞与酒精(EtOH)组，其中空白组的PBMC细胞组仅加入1×10⁶个PBMC细胞并以RPMI 1640细胞培养基将体积补至每孔200μl、空白组的K562细胞组仅加入5x10⁴个K562细胞并以RPMI 1640细胞培养基将体积补至每孔200μl，且空白组的K562细胞与酒精(EtOH)组加入5x10⁴个K562细胞及95％的酒精RPMI 1640细胞培养基将体积补至每孔200μl。

表3：

接着，在对照组及实验组中加入待测样品(例2中所得到的青稞萃取物及例1中所得到的黑青稞萃取物)，而控制组不额外添加待测样品。其中，对照组的0小时组及6小时组中加入0.125mg/mL的例2中所得到的青稞萃取物。在实验组的0小时组及6小时组中加入0.125mg/mL的例1中所得到的黑青稞萃取物。

于加入待测样品后，立刻在控制组、对照组及实验组的各0小时组，以及空白组的三组中加入1μL PI染剂(Propidium Iodide；购自BD Biosciences，商品编号556463；体积比1：200)。

将空白组各组移至流式细胞仪(Flow cytometry，购自BD，型号Accuri^TMC6 Plus)检测其散布图分布范围，框选PBMC、K562于散布图中的族群，供后续试验进行红荧光(PE-A)的信号定量。接着，检测控制组、对照组及实验组的各0小时组的PE-A荧光信号。

于加入待测样品的6小时后，于控制组、对照组及实验组的各6小时组中加入1μL的PI染剂，并立即利用流式细胞仪进行PE-A荧光信号测定。

接着。于PE-A荧光直方图(histogram)框选出荧光背景值区域(Negative gate)及荧光强度高区域(Positive Gate)，藉由荧光强度高区域(Positive Gate)推算死细胞于总数细胞的比例，因此可比较各孔的红荧光强度高区域的百分比，并以死亡细胞数/原细胞数目的百分比代表NK细胞的毒杀能力。实验结果如图4所示。

请参见图4，控制组的NK细胞的毒杀能力百分比为18.32％、对照组的NK细胞的毒杀能力百分比为87.20％，而实验组的NK细胞的毒杀能力百分比为111.82％，代表实验组的NK细胞的毒杀能力提升了6倍左右。换言之，当受体服用黑青稞萃取物时，能提高NK细胞的毒杀能力，从而提升受体免疫力。

例6：抗发炎试验

首先，取1x10⁴个小鼠巨噬细胞(RAW 264.7；ATCC TIB-71；以下称RAW细胞)至每孔含有200μL的细胞培养基的96孔细胞培养盘中，于37℃、5％的CO₂下培养24小时。于此，所使用的细胞培养基为添加有10％的牛血清(fetal bovine serum；购自Gibco)、1％的青霉素-链霉素(购自Gibco，Cat.15140122)、4mM的L-麸酰胺酸(L-glutamine，购自Gibco)的DEME培养基(购自Gibco)。

将RAW细胞分为空白组、控制组及实验组。移除各组别的细胞培养基并更换为每孔200μL的实验培养基，然后置于37℃下分别接续培养24小时。其中，实验组的实验培养基为含有500ng/ml的脂多醣(Lipopolysaccharide,LPS；购自Sigma，SI-L2880-25MG)、0.125mg/mL的例1中所得到的黑青稞萃取物、1％的AA、4mM的L-麸酰胺酸的DMEM培养基、控制组的实验培养基为含有2μg/ml的LPS、1％的AA、4mM的L-麸酰胺酸的DMEM培养基，而空白组的实验培养基为添加有1％的AA、4mM的L-麸酰胺酸的DEME培养基。

将反应后的各组RAW细胞及其实验培养基取150μL出来加入另依每孔装有130μL的二次水的96孔盘中。并使用Griess试剂套组(Griess reagent kit，Life technologies；1445263)配置Griess试剂(试剂A：试剂B＝1：1)，取20μL的Griess试剂分别加入前述96孔盘中并避光反应30分钟。

接着，于反应完后使用ELISA酵素免疫分析仪，以548nm波长读取吸光值。其中，OD值读值越大，代表NO的含量浓度越高，且NO值于此为发炎指标。需要特别说明的是，图5中的NO相对量是以百分比呈现，其中使用Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，且各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析。于图5中，「*」是与空白组相比的P值，而「#」是与控制组相比的P值。

请参见图5。空白组的NO相对量为100％，而控制组的NO相对量为113.84％，代表LPS确实刺激RAW细胞产生发炎反应。实验组的NO相对量为91.82％代表黑青稞萃取物确实在LPS促使发炎的情况下有效降低NO含量，且其NO相对量低于空白组的NO相对量更远低于控制组的NO相对量。由此可知，当受体服用黑青稞萃取物时，能有效降低NO含量并降低发炎率。

例7：人体试验

于此，将2克的例1所制备的黑青稞萃取以48克的水配置为50mL的黑青稞萃取物饮品。

受试人员：10位受试者。其中，受试者为年龄介于20-50岁的健康成年人，且为自觉免疫力低下者。

测试项目：血液总量T细胞与辅助型T细胞占比(免疫力指标)、血液CD4/CD8比值(免疫力指标)、血液中NK细胞毒杀能力、血液IgE浓度(过敏指标)、自评问卷调查(免疫力低下相关症状)。

测试方式：10位受试者连续四周每日饮用50mL的黑青稞萃取物饮品。于饮用前(即第0周)、饮用2周后(即第2周)以及饮用4周后(即第4周)，分别采检受试者30毫升的血液以检测受试者的免疫力指标、过敏指标、NK细胞毒杀能力，以及以自评问卷评量受试者免疫力低下相关症状。其中，血液总量T细胞与辅助型T细胞占比、血液CD4/CD8比值及血液IgE浓度是委托立人医事检验所进行血液检验。血液中NK细胞毒杀能力是委托大江基因医学股份有限公司进行检验。

需要特别说明的是，图式中「*」代表在与第0周比较下其p值小于0.05。、「**」代表在与第0周比较下其p值小于0.01、「***」代表在与第0周比较下其p值小于0.001。

请参见图6。于第0周时，10位受试者血液中的平均总量T细胞占比为67.7％。于服用黑青稞萃取物饮品2周后，10位受试者血液中的平均总量T细胞占比提升为69.6％，约提升了2.8％。于服用黑青稞萃取物饮品4周后，10位受试者血液中的平均总量T细胞占比相对第0周提升为70.3％，约提升了3.8％。由此可知，当受试者服用含有黑青稞萃取物的饮品后可使血液内的总量T细胞占比提高，从而调节体内细胞免疫及分泌细胞激素，并提高免疫力。

请参见图7。于第0周时，10位受试者血液中的平均辅助型T细胞占比为35.0％。于服用黑青稞萃取物饮品2周后，10位受试者血液中的平均辅助型T细胞占比提升为37.6％，约提升了7.4％。于服用黑青稞萃取物饮品4周后，10位受试者血液中的平均辅助型T细胞占比相对第0周提升为38.3％，约提升了9.4％。由此可知，当受试者服用含有黑青稞萃取物的饮品后可使血液内的辅助型T细胞占比提高，从而激活免疫反应并提高免疫力。

请参见图8。CD4是辅助性T细胞表面的标记，而CD8则是抑制性T细胞表面的标记，故CD4/CD8比值为观察免疫功能是否正常的重要指针。于第0周时，10位受试者血液中的平均CD4/CD8比值为1.36。于服用黑青稞萃取物饮品2及4周后，10位受试者血液中的平均CD4/CD8比值均为1.48。由此可知，当受试者服用含有黑青稞萃取物的饮品2周后便其血液中的平均CD4/CD8比值提高，代表受试者的免疫功能正常。

请参见图9。于第0周时，8位受试者血液中的平均NK细胞毒杀能力为126.1％。于服用黑青稞萃取物饮品4周后，8位受试者血液中的平均NK细胞毒杀能力提升7％为133.1％。由此可知，当受试者服用含有黑青稞萃取物的饮品便其血液内的NK细胞的细胞毒杀能力会提高，而提高NK细胞的毒杀能力后，其除了可毒杀癌细胞外，还可以杀死被病毒感染的细胞、癌化细胞及老化或受压力的细胞，故能提升受试者的整体免疫力。

请参见图10。于第0周时，10位受试者血液中的平均IgE浓度为176.7kU/L。于服用黑青稞萃取物饮品2周后，10位受试者血液中的平均IgE浓度下降为167.3kU/L。于服用黑青稞萃取物饮品4周后，10位受试者血液中的平均IgE浓度下降为156.0kU/L。换言之，于第2周时，10位受试者血液中的平均IgE浓度下降了5.3％，且于第4周时，10位受试者血液中的平均IgE浓度下降了11.7％。由此可知，当受试者服用含有黑青稞萃取物的饮品后便其血液中的平均IgE浓度下降，代表受试者的过敏反应减缓。

请参见图11。10位受试者中有3位的IgE浓度超标，故进一步观察3位受试者的IgE浓度变化。于第0周时，3位受试者血液中的平均IgE浓度为499.3kU/L。于服用黑青稞萃取物饮品2周后，3位受试者血液中的平均IgE浓度下降为468.1kU/L。于服用黑青稞萃取物饮品4周后，3位受试者血液中的平均IgE浓度下降为429.3kU/L。换言之，于第2周时，3位受试者血液中的平均IgE浓度下降了6.3％，且于第4周时，3位受试者血液中的平均IgE浓度下降了14.0％。由此可知，当受试者服用含有黑青稞萃取物的饮品后便其血液中的平均IgE浓度下降，代表受试者的过敏反应减缓。

10位受试者于受试者在第0周、第2周及第4周时分别填写自评问卷平量，其包括整体精神状况、肠胃不适状况、嘴破、咳嗽头痛等感冒症状。受试者依据各选项评量自身感觉，并依照答案换算百分比。自评问卷评量与结果如表4所示。

表4

请参见图12。10位受试者于服用黑青稞萃取物饮品4周后，对于「服用后，感到较少发生咳嗽、头痛等微感冒症状」感到「很有感」的受试者人数占比为30％(3人)、感到「稍微有感」的受试者人数占比为60％(6人)、感到「无感」的受试者人数占比为10％(1人)。

对于「服用后，感到较不易嘴破或嘴破愈合速度较快」感到「很有感」的受试者人数占比为10％(1人)、感到「稍微有感」的受试者人数占比为80％(8人)、感到「无感」的受试者人数占比为10％(1人)。

对于「服用后，较少感到肠胃不适」感到「很有感」的受试者人数占比为50％(5人)、感到「稍微有感」的受试者人数占比为30％(3人)、感到「无感」的受试者人数占比为20％(2人)。

对于「服用后，感到整体精神状况获得提升，较不易疲惫」感到「很有感」的受试者人数占比为30％(3人)、感到「稍微有感」的受试者人数占比为40％(4人)、感到「无感」的受试者人数占比为30％(3人)。

请参见图13。10位受试者于服用黑青稞萃取物饮品4周后，对于「整体功效满意度」感到「非常满意」的受试者人数占比为10％(1人)、感到「满意」的受试者人数占比为60％(6人)、感到「普通」的受试者人数占比为30％(3人)，而对于「不满意」的受试者人数占比为0％(0人)。

由此可知，服用黑青稞萃取物可改善受试者的免疫力低下相关症状，以及过敏性哮喘、食物过敏及皮肤过敏等过敏反应。

综上所述，根据本发明任一实施例的黑青稞萃取物可用以制备调节受体的免疫力的组合物，其中黑青稞萃取物是将黑青稞的种子以α-淀粉酶水溶液进行萃取所得，在一些实施例中，黑青稞萃取物具有调节免疫相关基因的表现量、提升自然杀手细胞的细胞毒杀能力、降低发炎所产生的一氧化氮含量、提高受体的血液中总量T细胞及辅助型T细胞的含量、抑制受体血液中IgE含量、提升受体的血液中CD4/CD8的比值等功能，并可提高受体的总体免疫力、降低受体发炎情形、维持免疫正常、减少受体的免疫力低下相关症状(例如，精神不济、肠胃不适、嘴破、咳嗽、头痛等症状)、缓解受体的过敏反应(例如，过敏性哮喘、食物过敏、皮肤过敏等过敏反应)等功效。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

Claims (17)

1.一种黑青稞萃取物用于制备调节一受体的免疫力的组合物的用途，其特征在于，该黑青稞萃取物是将一黑青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f.)的种子以一淀粉酶水溶液进行萃取所得。

2.如权利要求1所述的用途，其中该萃取是于80℃至100℃下进行50分钟至70分钟。

3.如权利要求2所述的用途，其中该萃取的温度为90℃±5℃，且该萃取的时间为60分钟。

4.如权利要求1所述的用途，其中该淀粉酶水溶液中的淀粉酶是α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶中的至少一种或其混合。

5.如权利要求1所述的用途，其中该淀粉酶水溶液中的淀粉酶的浓度为0.3％(w/v)至0.7％(w/v)。

6.如权利要求1所述的用途，其中该淀粉酶水溶液与该黑青稞的种子的重量比为5-10：1。

7.如权利要求6所述的用途，其中该重量比为10：1。

8.如权利要求1所述的用途，其中调节该受体的该免疫力为调节免疫相关基因的表现量。

9.如权利要求8所述的用途，其中该免疫相关基因为白细胞介素-1β基因、白细胞介素-8基因、白细胞介素-6基因、白细胞介素-10基因、γ-干扰素基因或其组合。

10.如权利要求1所述的用途，其中调节该受体的该免疫力为提升自然杀手细胞的细胞毒杀能力。

11.如权利要求1所述的用途，其中调节该受体的该免疫力为降低发炎所产生的一氧化氮含量。

12.如权利要求1所述的用途，其中调节该受体的该免疫力为减少该受体的免疫力低下相关症状。

13.如权利要求12所述的用途，其中该免疫力低下相关症状为精神不济、肠胃不适、嘴破、咳嗽、头痛或其组合。

14.如权利要求1所述的用途，其中调节该受体的该免疫力为缓解该受体的过敏反应。

15.如权利要求14所述的用途，其中该过敏反应包括过敏性哮喘、食物过敏及皮肤过敏。

16.如权利要求1所述的用途，其中调节该受体的该免疫力为提高该受体的血液中总量T细胞及辅助型T细胞的含量。

17.如权利要求1所述的用途，其中调节该受体的该免疫力为提升该受体的该血液中CD4/CD8的比值。