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KR102435803B1 - 돌가사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 개선용 조성물 - Google Patents

돌가사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 개선용 조성물 Download PDF

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KR102435803B1
KR102435803B1 KR1020200098434A KR20200098434A KR102435803B1 KR 102435803 B1 KR102435803 B1 KR 102435803B1 KR 1020200098434 A KR1020200098434 A KR 1020200098434A KR 20200098434 A KR20200098434 A KR 20200098434A KR 102435803 B1 KR102435803 B1 KR 102435803B1
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extract
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immunity
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차희재
김희수
김석만
황혜진
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동의대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 면역 개선용 조성물에 관한 것으로, 돌가사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 개선용 조성물에 의하는 경우, 천연물을 이용함에 따라 부작용에 우려가 없으면서, 대식세포의 식균작용 활성화를 유도하여 면역 증강 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 대식세포에서의 산화질소(Nitric Oxide, NO)의 생성을 증가시키거나; 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2; PGE2)의 생성을 증가시키거나; 면역반응 관련 인자의 발현을 증가시키거나; 핵인자-카파B(Nuclear Factor-kappa B; NF-κB) 전사 활성을 증가시키거나; 톨러이수용체(TLR4) 및 골수분화인자88(MyD88)의 발현을 증가시킴으로써 면역반응을 활성화하여 면역 증강 효과를 나타내는 돌가사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 개선용 조성물에 관한 것이다.

Description

돌가사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 개선용 조성물{COMPOSITION FOR IMPROVING IMMUNITY COMPRISING DOLGASARI EXTRACT AS AN ACTIVE INGREDIENT}
본 발명은 돌가사리(Chondracanthus tenellus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 개선용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 돌가사리 추출물을 유효성분으로 포함하여 대식세포의 식균작용 활성화를 유도함으로 면역 증강 효과가 있는, 면역 개선용 조성물에 관한 것이다.
2000년 이후, 전 세계적으로 급성호흡기증후군 SARS, 조류독감, 에볼라 바이러스, 코로나 바이러스 등과 같은 급성 신종 전염병이 나타나면서 건강에 관한 관심이 더욱 높아지고 있다. 이와 같은 전염병 또는 다양한 질병에 걸리지 않기 위해 면역력을 향상시키는 것이 중요하다.
면역이란 생체의 내부환경이 외부인자인 항원에 대하여 방어하는 현상으로 이러한 현상은 외부로부터 인체에 침입한 바이러스, 박테리아 및 기생충과 같은 유해균에 저항할 수 있으며, 내부에 생긴 암세포에 저항하거나 제거하는 데 있어서 매우 중요한 역할을 한다.
특히, 면역은 체내에 들어와 항체를 생산하게 하는 항원의 특이성에 따라 선천성 면역과 후천성 면역으로 구분할 수 있으며, 선천성 면역은 외부로부터 항원이 들어오기 전에 존재하는 면역 체계로 외부로부터 침입한 유해균에 즉각 반응한다. 이에 비해 후천성 면역은 항원이 침입하게 되면, 그 항원에 의하여 면역이 획득되어 반응을 유도한 항원에 대해서만 나타나는 특이성을 갖는 면역 반응이다.
상기와 같이 체내에서 면역을 담당하는 주요 세포는 혈액 중 백혈구로, 그 중에서도 식균 작용을 하는 대식세포, B세포, T세포 및 NK세포로 구성되어 항체를 생산하고 바이러스나 암세포를 파괴하는 등의 면역 반응을 유도하는 림프구가 있다.
상기 백혈구는 총 혈액량의 1% 이하를 차지하며, 혈액 내에서 유일하게 핵과 세포기관을 가진 완전한 세포이다. 골수 내 조혈 모세포에서 생성되며 성숙되면 혈액 중으로 방출되어 감염이나 외부물질에 대항하여 신체를 보호하는 면역 기능을 수행하는 다섯가지 세포로 구성되어 있다.
다섯가지 세포는 호중구, 호산구, 호염기구, 림프구, 단핵구로 구성되며 백혈구의 40~70%를 차지하고, 박테리아 및 진균감염에 대해 방어하며 모든 염증반응에 있어 초기 반응을 빠르게 수행하는 호중구(neutrophil), 기생충 감염 및 알레르기 반응에 관여하는 호산구(eosinophil), 알레르기 반응 및 항원에 대한 반응으로 염증부위로 혈관을 확장시키는 히스타민을 분비하는 호염기구(basophil), 미생물이나 항원 등과 같은 다른 외부 침입체와 결합하여 이들을 몸 밖으로 제거하는 면역세포를 도우며 T-림프구, B-림프구, 자연살상세포로 이루어져 있는 림프구(lymphocyte), 조직 내에서 외부 물질에 대한 탐식작용을 수행하며, 만성 감염기간동안 수가 증가하게 되는 단핵구(monocyte)로 구성되어 있다.
상기 다섯가지의 세포는 백혈구 생성에 문제를 유발하는 질환이 의심되거나 감염 시, 백혈병을 진단할 때, 골수의 기능이나 치료상태를 감시하기 위해 판단 지표로 사용된다.　
이 중, 단핵구는 혈액 속을 순환한 후 조직에 들어가게 되어 형태적, 기능적으로 그 조직에 특징적인 대식세포로 분화하게 되고, 이는 염증에 대항하여 싸우거나 선천적 면역 반응을 시작하는 이펙터 세포로서 작용하는 주요 면역 세포이다.
상기 대식세포는 그램 음성 박테리아의 막 성분인 LPS(LopolySaccharide, LPS)를 비롯한 미생물 성분 뿐만 아니라 다수의 생물학적 물질에 의해 활성화되며, 톨러라이스 수용체(Toll-like resubsides, TLR)가 이를 인식하고 여러 신호 경로를 촉발해 대식세포가 활성화되고, 이로 인해 선천성 면역 반응의 초석인 활성 대식세포의 식균 작용을 통해 병원체, 이물질 및 세포 잔해를 제거 할 수 있다.
또한, 활성화된 대식세포는 염증성 사이토카인과 매개체의 분비를 통해 병원체를 중화 시키거나 간접적으로 면역 조절에 참여하며 림프구에 대한 항원의 처리 및 발현을 통해 면역력 강화 활동을 증가시킨다.
한편, 다양한 종류의 해양 생물은 풍부한 생물 활성 물질 때문에 오랫동안 식자원과 질병의 예방과 치료에 기여해왔으며, 최근 많은 연구에서 식용 해조류의 추출물이나 성분이 상당한 면역억제적 특성을 가지고 있다는 것을 입증하고 있다.
해조류는 면역 조절제로서 면역 체계와 상호 작용하여 숙주 반응을 억제하거나 향상시킬 수 있으며, 다양한 해조류 추출물은 면역 자극제를 보유하며 면역 결핍 바이러스 활성을 억제하는 것으로 보고되었고, 특정 해초 성분은 수지상 세포의 성숙과 T 세포 및 자연 살해 세포의 활성화를 통해 면역 조절 효과를 향상시킨다는 연구결과도 나타났다.
보다 자세하게, 해양조류로부터 분리된 다당류가 대식세포 활동을 자극하면서 TLR4/ nuclear factor-κB (NF-κB) 및/또는 미토겐 활성 단백질 키나제(mitogen-activated protein kinase , MAPKs)의 활성화를 통해 산화질소(NO), 프로스타글란딘 E2(PGE2)와 같은 다양한 사이토카인과 면역 매개체의 분비 및 생성을 증가시켜 대식세포 작용을 촉진하고 종양 세포에 대한 대식세포의 세포독성을 향상시킬 수 있어, 해양 조류는 면역 조절을 위한 치료제 또는 보충제로 사용하기에 적절하다고 판단된다.
상기 해양 조류 중 홍조류인 돌가사리는 한국을 포함한 일본과 중국의 해안 지역에 널리 분포하고 있으며 황산 칼슘 다당류와 탄산 칼슘과 같은 미네랄이 풍부하여, 오랫동안 식자원으로 사용되어 왔다.
Piao et al.에서 인간 각질 세포에서 자외선 B 방사선-유도 된 세포 독성에 대한 돌가사리 추출물의 보호 효과는 강력한 항산화 활성과 관련이 있다고 보고했으나, 현재 항산화 활성 이외에 돌가사리에 대한 다른 약리학적 효능 연구는 활발히 이루어지지 않은 실정이다.
이러한 이유로, 본원 발명에서는 천연물인 돌가사리 추출물을 이용하여 대식세포 활성화를 통해 면역기능 증진을 나타냄으로써 부작용이 없으면서도 면역 개선 효과가 있는 면역 개선용 조성물을 완성하였다.
KR 10-2019-0022017 A
본 발명의 목적은 대식세포의 식균작용 활성화를 유도하여 면역 증강 효과가 있는 면역 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 면역 개선용 조성물은 산화질소(Nitric Oxide, NO) 생성 증가, 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2; PGE2) 생성 증가, 면역반응 관련 인자 발현 증가, 핵인자-카파B(Nuclear Factor-kappa B; NF-κB) 전사 활성 증가, 톨러이수용체(TLR4) 및 골수분화인자88(MyD88)의 발현 증가시킴으로써 면역반응을 활성화하여, 면역 개선 효과가 있는 돌가사리(Chondracanthus tenellus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 돌가사리(Chondracanthus tenellus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 개선용 조성물을 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돌가사리(Chondracanthus tenellus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 개선용 조성물을 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 개선용 조성물은 돌가사리(Chondracanthus tenellus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 개선용 조성물에 관한 것이다.
상기 면역 개선용 조성물은 대식세포의 식균작용 활성화를 유도하여 면역 증강 효과가 있는 것이다.
상기 면역 개선용 조성물은 산화질소(Nitric Oxide, NO) 생성 증가, 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2; PGE2) 생성 증가, 면역반응 관련 인자 발현 증가, 핵인자-카파B(Nuclear Factor-kappa B; NF-κB) 전사 활성 증가, 톨러이수용체(TLR4) 및 골수분화인자88(MyD88)의 발현 증가시킴으로써 면역반응을 활성화하는 것이다.
상기 면역반응 관련 인자는 유도형 산화질소 합성효소(iNOS), 이클로옥시게나제-2(COX-2), 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-6(IL-6) 및 인터루킨-10(IL-10)로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.
상기 추출물은 물, C1 내지 C6의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출된다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 약학 조성물은 상기 면역 개선용 조성물을 유효성분으로 포함하여 제조한 것이다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 식품 조성물은 상기 면역 개선용 조성물을 유효성분으로 포함하여 제조한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물'은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 식물 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것 뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 식물 추출물에 포함되는 것이다.
본 발명에서 이용되는 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 면역 개선용 조성물은 돌가사리(Chondracanthus tenellus) 추출물을 유효성분으로 포함한다.
돌가사리(Chondracanthus tenellus)는 석호라고도 하며 홍조식물문 진정홍조강 돌가사리목에 해당하며, 한국(전 연안), 일본, 중국, 필리핀, 태평양 도서에 분포한다. 엽체는 길이 5~15cm, 너비 1~2mm이고, 납작한 원주상의 가지가 다수 어긋나기 또는 마주나기 하며, 정단부는 뾰족하다. 몸은 자색 또는 홍자색이고, 연골질이며, 물속에서 형광을 내기도 한다. 낭과는 거의 구상이며 작고 자루가 없다. 조간대 하부에서 조하대에 걸쳐 암초 위에 생육한다.
돌가사리는 한천제조에 혼합원료로도 사용되어지며, 황산 칼슘 다당류 및 탄산 칼슘 등의 미네랄이 풍부해 식자원으로 주로 사용되었으며 항산화 활성이 있는 것으로 보고된다.
상기 면역 개선용 조성물은 대식세포의 식균작용 활성화를 유도하여 면역 증강 효과가 있는 것이다.
면역이란, 자기(self)와 비-자기(non-self)를 구별하여 외부로부터 침입하는 미생물, 세균, 바이러스 뿐만 아니라 체내 조직이나 불필요한 산물 등을 비-자기 항원(antigen)으로 인식하여 특이적으로 반응하여 항체를 생산하고 이를 제거함으로 생체의 항상성을 유지하는 현장이며 체내에 존재하는 자기 방어체계이다. 이러한 방어체계인 면역은 항원에 대한 특이성에 따라 선천 면역(innate immunity, non-specific immunity)과 획득면역(acquired immunity, specific immunity)으로 구분된다.
상기 선천면역(innate immunity)은 자연면역, 자연저항 이라고도 한다. 항원에 대해 비특이적으로 반응하며 특별한 기억작용은 없다. 선천적인 면역체계로는 항원의 침입을 차단하는 피부·점액조직, 상산성의 위산, 혈액에 존재하는 보체(complement) 등이 있다. 세포로는 식균작용을 담당하는 대식세포와 다형핵 백혈구, 감염세포를 죽일 수 있는 NK세포(natural killer cell) 등이 있다. 또한, 대식세포에 의해 생산되는 사이토카인이 있다. 실제로 대부분의 감염은 선천면역에 의해 방어된다.
또한, 획득면역(acquired immunity)은 선천면역을 보강하는 역할을 하며 후천면역, 적응면역(adaptive immunuty)이라고도 한다. 항원이 체내에 침입하면 림프구에 의한 면역반응이 일어나 항원에 대한 강한 저항성이 기억되어 다시 항원이 침입할 때 특이적으로 반응하여 효과적으로 항원을 제거할 수 있다.
항원 감염에 대한 최초의 인식은 주로 대식세포(macrophage)가 수행하며, 대식세포가 항원을 탐식하는 과정에서 면역반응을 매개하는 사이토카인이 생산된다.
상기 대식세포는 특별한 자극이 없으면 조직 내에서 휴지기 대식세포 (resident macrophage) 상태로 조용히 존재하다, 염증 반응에 의해 활성화 되면 염증 반응 대식세포(inflammatory macrophage)가 된다. 염증반응 대식세포 상태가 되면 지질 매개 물질이나 보체 단백질, 사이토카인 등을 만들어 염증반응에 관여하기도 하며, 섬유아세포와 혈관 내피 세포의 성장 인자를 생산하여 손상 조직 치유에 관여하기도 한다.
상기 사이토카인은 신체의 방어체계를 제어하고 자극하는 신호물질로 사용되는 당단백질로 면역, 감염병, 조혈기능, 조직회복, 세포의 발전 및 성장에 중요한 기능을 한다. 사이토카인은 국소부위에 염증을 유발함으로써 면역세포가 감염부위에 모이게 하는 기능을 가지고 있어, 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)이라 불리기도 한다. 가장 중요한 면역기능은 인터루킨(Interleukin-1,-6,-10,-12,-1β), 인터페론 감마(IFN-γ), 종양괴사인자-α (TNF-α)로 알려진 사이토카인의 집단에 의해 수행된다.
인터루킨(interleukin)은 면역반응이 일어나는 여러 단계에 작용하여 면역반응을 조절함으로써 인체의 방어작용에 중요한 역할을 하는 물질로, 그 종류는 IL-1,6,10,12 등이 있다. 이 중 IL-12는 p35와 p40 단백질로 구성된 사이토카인으로, 선천면역과 획득면역을 서로 연결시키는 매우 중요한 면역학적 기능을 하며, 내인성 항원의 제거에 관여하는 여러 가지 작동세포 즉, 대식세포(macrophage), NK세포 및 T-세포의 활성화를 유도한다.
종양괴사인자(TNF, tumor necrosis factor)는 염증반응과 관련된 세포 신호전달 단백질로서, 급성기반응을 유도하는 사이토카인이다. 종양괴사인자는 종양괴사인자-α(TNF-α)와 림포독소(lymphotoxin)라 불리는 종양괴사인자-β(TNF-β)로 나뉘지만, 일반적으로 종양괴사인자는 종양괴사인자-α를 의미한다.
상기 종양괴사인자는 세균벽에서 나오는 내독소인 지다당체에 의해 T세포에서 분비되는 종양을 괴사시키는 물질을 말하는 것으로, 가장 중요한 염증 인자이며 때때로 중증의 전신적 염증을 유발하기도 한다. 그러나 면역학적 측면에서 TNF는 감염부위로 혈액 내 백혈구인 호중구 및 단핵구를 집합시키고 감염세포의 살해능을 가지는 대식세포로의 분화 및 활성화를 유도하는 것으로 보고 있다. 이러한 종양괴사인자의 기능은 화학 주성을 가지는 사이토카인의 생산 유도능과 함께 혈관내피세포 및 백혈구 간의 부착분자(adhesionmolecule)의 친화력을 높이는 기능에 의한다.
이와 같이 면역기능에 있어서 대식세포는 단백질 분해 효소나 지질 대사물질, 인터루킨, TNF 등의 사이토카인, NO 및 PGE2 와 같은 면역 매개체를 분비하여 생산하여 염증 반응의 진행과 유지에 중요한 역할을 하기도 하며, 미생물, 항원, 죽은 조직, 적혈구 등을 제거하는 식균작용으로 면역 반응을 나타낸다.
상기 면역 개선용 조성물은 산화질소(Nitric Oxide, NO)의 생성을 증가시키거나; 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2; PGE2)의 생성을 증가시키거나; 면역반응 관련 인자의 발현을 증가시키거나; 핵인자-카파B(Nuclear Factor-kappa B; NF-κB) 전사 활성을 증가시키거나; 톨러이수용체(TLR4) 및 골수분화인자88(MyD88)의 발현을 증가시킴으로써 면역반응을 활성화하는 것이다.
산화질소(Nitric Oxide, NO)는 반응성이 높은 자유 라디칼 중의 하나로 산소나 superoxide에 의해 N2O3, NO2, nitrite 및 nitrate 등의 안정한 nitrogen oxide로 전환된다. 산화질소(Nitric Oxide, NO)는 NO 합성효소 (nitric oxide synthase, NOS)에 의해 세포 내의 L-arginine으로부터 만들어지며, 체내 항상성 유지를 위한 endothelial NOS(eNOS)와 neuronal NOS(nNOS), 염증성 인자에 의해 생산되는 inducible NOS(iNOS)로 분류된다. 특히 iNOS에 의해 생산되는 NO는 외부로부터 유입된 병원체로부터 인체를 방어하는 데 중요한 역할을 하며, 순환계 질환, 염증 질환 및 암과 밀접한 연관이 있는 것으로 알려져 있다.
프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2; PGE2)는 산화질소(NO)와 마찬가지로 손상된 부위나 조직에서 통증과 발열의 전달에 주로 관여하는 중요한 염증 반응의 매개물질로서 COX-2에 의해 합성된다. 조직이 손상되면 물리적인 손상 뿐 아니라 염증을 매개하는 물질들이 다량 생성되기 때문에 통증이 유발되게 되는데, 이 중 PGE2는 조직손상이 일어나는 부위에서 생성 되어 말초신경 말단부위에 작용하여 통증에 대한 역치를 감소시키게 되며, 과량 생산되면 과도한 면역반응을 야기하여 혈관 확장, 부종, 발열 및 통증 등의 증상을 일으키게 되어 적정량 생산되는 것이 중요하다.
또한, 프로스타글란딘(PGE2)는 염증 반응의 매개체로서의 역할 뿐 아니라, Th2 type 면역반응을 촉진하고 대식세포에서 IL-10과 같은 항염증성 사이토카인의 생성을 촉진하는 면역반응의 조절자이다.
핵인자-카파B(Nuclear Factor-kappa B; NF-κB)는 많은 면역 조절 매개체를 조절하는 대식세포 활성화의 주요 전사 인자이며 비활성 NF-κB 이량체 (p65 / 50)는 세포기질에서 IκB-α와 상호 작용하여 복합체를 형성한다.
상기 핵인자-카파B 억제제(IκB-α)는 핵인자-카파B(NF-κB) 전사인자를 억제하는 기능을 하는 세포 단백질이며, 핵인자-카파B(NF- κB)를 세포질에서 비활성 상태로 격리시켜 억제하는 역할을 한다.
상기 IκB-α가 유비퀴틴-단백질계를 통해 인산화 및 분해됨에 따라, NF-κB 이량체가 NF-κB/IκB-α복합체로부터 방출되고 핵으로 변환되어 대상 유전자의 전사활성을 시작하게 된다.
TLRs은 숙주 세포 인식 및 미생물 병원체의 특정 패턴에 의한 염증 반응의 유도 뿐 아니라 선천 면역의 활성화에도 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
TLRs 중, 톨러이수용체(TLR4)는 염증 및 면역 반응에 핵심적인 역할을 하며 어댑터 분자 중 하나인 골수분화인자88(MyD88) 종속 경로를 통해 TNF 수용체 관련 인자 6(TRAF6)를 활성화한다.
또한, TRAF6는 NF-κB 및 MAPK 신호 전달 경로의 활성화를 촉진함으로써 면역 조절 관련 다운 스트림 유전자 발현을 조절하는 신호 전달 경로의 중요한 매개체로서 기능한다.
상기 산화질소(Nitric Oxide, NO), 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2; PGE2) 및 면역반응 관련 인자의 발현 증가, 핵인자-카파B(Nuclear Factor-kappa B; NF-κB) 전사활성, 톨러이수용체(TLR4) 및 골수분화인자88(MyD88) 발현이 증가함에 따라 면역활성은 증진될 수 있다.
상기 면역반응 관련 인자는 유도형 산화질소 합성효소(iNOS), 이클로옥시게나제-2(COX-2), 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-6(IL-6) 및 인터루킨-10(IL-10)로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.
상기 추출물은 물, C1 내지 C6의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출된다.
상기 돌가사리 추출물은 돌가사리 분쇄물을 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 C1 내지 C6의 알코올과 같은 극성 용매, 또는 알코올과 물의 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합 용매로 용출할 수 있으며, 보다 상세하게는 추출 용매로 에탄올을 이용할 수 있다. 이때, 추출 온도는 10℃ 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 추출한 추출물일 수 있다.
상기 추출 용매는 시료의 중량 기준으로 2 내지 50배를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 20배이다. 추출을 위해 시료는 추출 용매에서 침출을 위해 1 내지 48 시간 동안 방치될 수 있으며, 상세하게는 1 내지 24시간 동안 방치될 수 있다.
여과된 추출물을 진공 회전 농축기로 감압 농축하여 수득한 결과물일 수 있으나, 본 발명의 면역 개선 효과를 나타낼 수 있는 돌가사리 추출물인 한, 이에 제한되지 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이의 조정제물 또는 정제물을 모두 포함한다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 약학 조성물은 상기 면역 개선용 조성물을 유효성분으로 포함하여 제조한 것이다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 면역치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 식품 조성물은 상기 면역 개선용 조성물을 유효성분으로 포함하여 제조한 것이다.
바람직하게, 상기 식품 조성물로 사용하기 위해 돌가사리 추출물 만을 이용하는 경우, 돌가사리 특유의 향으로 인해 면역 개선용 조성물의 기호도가 떨어지는 문제가 있다.
이에, 붉은참반디 추출물 및 멱쇠채 추출물을 소량 첨가하여, 복합 조성물을 제조하는 경우, 면역 개선 효과가 동등하게 유지되거나 향상되며 기호도를 높일 수 있다.
붉은참반디(Sanicula rubriflora F. Schmidt ex Maxim)는 숲속 계곡에 자라는 여러해살이풀로, 줄기는 높이 20~50cm, 꽃이 핀 후에 더욱 높이 자란다. 뿌리잎은 지름 6~20cm, 깊게 3갈래로 갈라지며, 양쪽 갈래는 다시 2갈래로 갈라진다. 줄기잎은 줄기 위쪽에서 1쌍이 마주나며, 잎자루가 없다. 꽃은 4~6월에 피는데 줄기잎 사이에서 꽃자루가 1~5개 난 후 각각에 자루가 짧은 꽃이 여러 개 달리며, 어두운 자주색이다. 열매는 분과, 1~3개씩 달리고, 겉에 끝이 꼬부라진 가시가 있다. 우리나라 경상북도, 전라북도 이북에 나며, 일본, 중국 동북부, 러시아 아무르, 우수리 등에 분포한다. 애기참반디에 비해서 뿌리잎은 더욱 크며, 열매 위쪽에는 갈고리 모양의 가시가 있으므로 구분되며, 참반디에 비해 잎자루가 없는 1쌍의 잎이 달리고 꽃이 흑자색이므로 구분된다. 붉은참바디라고도 한다.
멱쇠채(Scorzonera austriaca Willd)는 서해안 양지바른 풀밭에서 드물게 자라는 여러해살이풀이다. 줄기는 곧추서며 높이 20~40cm, 어릴 때 거미줄 같은 흰 털이 있으나 크면서 없어진다. 뿌리잎은 모여나고 오랫동안 남아 있으며, 선형 또는 도피침형, 길이 14~18cm, 폭 10~18mm, 끝은 뾰족하고 밑은 좁아지면서 잎자루처럼 되며 가장자리는 밋밋하다. 줄기잎은 거의 없거나 비늘 모양으로 어긋나며 끝은 뾰족하고 밑은 넓어져서 줄기를 감싸고 털이 없다. 꽃은 5~6월에 피는데 지름 2.5cm의 머리모양꽃이 줄기 끝에서 1개씩 달린다. 머리모양꽃은 혀 모양의 양성꽃으로 되며, 꽃부리는 노란색이고 끝은 5갈래로 깊게 갈라진다. 열매는 수과, 선형, 능선이 있다. 우산털은 깃털 모양이다. 우리나라 평안남·북도, 황해도, 경기도 등에 자생하며, 중국, 몽골, 러시아, 유럽 등에 분포한다. 쇠채에 비해서 전체가 소형이고, 뿌리잎과 줄기잎은 크기와 모양이 다르며, 줄기잎은 비늘 모양으로 작고, 머리모양꽃은 줄기 끝에 1개 혹은 2~4개가 달린다. 뿌리와 어린잎을 식용한다.
보다 바람직하게, 본원발명의 면역 개선용 조성물은 돌가사리 추출물 100 중량부에 대하여, 붉은참반디 추출물 5 내지 10 중량부 및 멱쇠채 추출물 5 내지 10 중량부를 포함할 수 있다. 상기 추출물을 더 포함하는 경우, 돌가사리 추출물 특유의 해초 향이 중화되어 기호성 높은 식품 조성물로 제공할 수 있다.
구체적인 예로, 상기 식품 조성물을 이용하여 면역 개선 효과를 증강시킬 수 있는 가공식품을 제조할 수 있다. 이런 가공식품에는 예를 들어, 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육류가공식품, 국수 등을 포함한다. 과자는 비스킷, 파이, 케익, 빵, 캔디, 젤리, 껌, 시리얼등을 포함한다. 음료는 음용수, 탄산음료, 기능성 이온음료, 기능성이온음료, 주스(예를 들어, 사과, 배, 포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토 주스 등), 식혜 등을 포함한다. 주류는 청주, 위스키, 소주, 맥주, 양주, 과실주 등을 포함한다. 발효식품은 간장, 된장, 고추장 등을 포함한다. 통조림은 수산물 통조림 (예들 들어, 참치, 고등어, 꽁치, 소라 통조림 등), 축산물 통조림(쇠고기, 돼지고기, 닭고기, 칠면조 통조림 등), 농산물 통조림(옥수수, 복숭아, 파인애플 통조림 등)을 포함한다. 우유가공식품은 치즈, 버터, 요구르트 등을 포함한다. 육류가공식품은 돈까스, 비프까스, 치킨까스, 소세지. 탕수육, 너겟류, 너비아니 등을 포함한다. 밀봉포장생면 등의 국수를 포함한다. 이 외에도 상기 조성물은 레토르트식품, 스프류 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 면역 개선용 조성물은 대식세포의 식균작용 활성화를 유도하여 면역 증강 효과가 있는 것이다.
보다 구체적으로, 산화질소(Nitric Oxide, NO), 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2; PGE2), 면역반응 관련 인자, 핵인자-카파B(Nuclear Factor-kappa B; NF-κB) 전사 활성, 톨러이수용체(TLR4) 및 골수분화인자88(MyD88)의 발현을 증가를 통해 면역반응 활성효과를 나타낼 수 있는 돌가사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 개선용 조성물에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 돌가사리 추출물의 처리에 따른 세포 생존율 측정 결과이다.
도 2은 본 발명의 일 실시예에 따른 돌가사리 추출물의 처리에 따른 RAW 264.7 세포의 식균활성 측정 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 돌가사리 추출물의 처리에 따른 NO 및 PGE2 생산이 증가하는지 여부에 따른 분석 결과이다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 따른 돌가사리 추출물의 처리에 따른 사이토카인 생산이 증가하는지 여부에 따른 ELISA 분석 결과이다.
도 5은 본 발명의 일 실시예에 따른 돌가사리 추출물의 처리에 따른 iNOS, COX-2 및 사이토카인의 발현이 NO, PGE2 및 사이토카인 생성과 관련이 있는지 확인하기 위한 웨스턴 블롯 분석 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 돌가사리 추출물의 처리에 따른 TLR4, MyD88, NF-kB 및 p-IkB-a의 활성화 정도에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
[제조예 1: 돌가사리 추출물의 제조]
본 실험에 사용된 돌가사리는 Jin Jin Hyun (제주 대학교 의과 대학)이 제공했다. 돌가사리 에탄올 추출물(EECT)을 얻기 위해 돌가사리 건조된 분말 100g에 80% 에탄올을 각각 1.5L씩 첨가한 후 초음파 분쇄기에 30분씩 5회 추출하여 필터를 통해 상층액만 분리하였다. 이 과정을 3회 반복하여 얻어진 상층액을 감압 농축 및 동결 건조하여 얻은 분말을 황산화 디메틸(dimethyl sulfoxide, DMSO, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에 용해시키고, 세포 배양 배지로 희석하여 실험에 사용하기 전에 최종 처리 농도를 조절하였다.
[제조예 2: 복합 추출물의 제조]
1. 복합추출물의 제조
제조예 1의 돌가사리 에탄올 추출물(EECT)의 제조 방법과 동일한 방법을 이용하여, 붉은참반디 에탄올 추출물(EERT) 및 멱쇠채 에탄올 추출물(EEST)을 제조하고, 하기 표 1과 같은 중량 범위 내에서 면역 개선용 조성물을 제조하였다.
Y1 Y2 Y3 Y4 Y5
EECT 100 100 100 100 100
EERT - 1 5 10 15
EEST - 1 5 10 15
(단위 : 중량부)
[실험예 1: RAW 264.7 세포에 대한 면역조절활성 효과 실험]
1. 실험방법
세포배양
쥐 대식세포 유사 RAW 264.7 세포는 한국 세포 은행(Korea Cell Line Bank, 한국)에서 구입하여, 10% (v/v) 태아 소 혈청(FBS, WelGene, Inc.), 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신(WelGene, Inc.)이 보충된 둘베코-모디파이드 이글 미디엄(Dulbecco's modified Eagle's medium , DMEM, WelGENE, Inc., Daegu, Republic of Korea)을 이용하여 37 °C 및 5% CO2 (v/v)의 조건에서 배양하였다.
배양 배지를 2 ~ 3 일마다 교체하고, 모든 실험에서 세포를 80 ~ 90 % 합류로 성장시켰다.
세포 생존력 분석, Cell viability assay
세포를 1 x 104 세포 / ml의 밀도로 96- well plate에 seeding 하였다. 16 시간 동안 배양 한 후, 세포를 제시된 EECT 농도(50 μg / ml , 100 μg / ml, 150 μg / ml, 200 μg / ml 및 300 μg / ml) 및 0.5 ng / ml LPS (Sigma-Aldrich Chemical Co.)로 처리하였다.
24시간 배양 후 3-(4,5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5-diphenyltrazolium Bromide(MTT; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 용액 5 mg/ml를 각 well에 첨가하여 3시간 동안 추가 배양하였다.
이어서, 각 well에 존재하는 포르 마잔 결정(formazan crystal)을 DMSO에 용해시키고, 마이크로 플레이트 판독기 (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
LPS로 처리된 세포는 대식세포 활성화를 위한 양성 대조군으로, 다른 처리 없이 DMEM에서 배양된 세포는 음성 대조군으로 사용하였으며, 대식세포 형태 변화는 위상 대비 현미경 검사(독일 오버코첸 주 칼 자이스)로 시각화하였다.
식균 작용 분석 및 형태 관찰
RAW 264.7 세포의 포식 작용은 식균 작용 분석 키트 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 사용하여 평가되었다. 세포를 4- well chamber slides (한국 포천, SPL Life Sciences Co., Co.)에 플레이팅하고 plate에 부착되도록 37℃에서 16 시간 동안 배양 한 후, EECT 또는 LPS로 24 시간 동안 처리하였다.
이어서, 라텍스 비드-토끼 IgG- 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 복합체(latex bead-rabbit IgG-fluorescein isothiocyanate (FITC) complexes)를 1 : 200의 최종 희석액으로 배양 배지에 첨가 하였다. 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션 한 후, 세포를 제공된 분석 완충액을 사용하여 2 회 부드럽게 세척하고 형광 현미경 (Carl Zeiss) 아래에 두어 FITC-표지 된 라텍스 비드를 관찰하였다.
또한, 형광 강도는 유세포 분석기(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 의해 측정되었다.
NO 생산의 측정
24-well 배양 플레이트에서 세포를 5Х104 cell/ml의 밀도로 16시간 동안 예비 배양한 후, 0.5 ng/ml LPS 또는 상이한 농도의 EECT로 처리 하였다. 24시간 배양 후, 채취한 배양 상등액은 동량의 Griess 시약용액(Sigma-Aldrich Chemical Co.)과 혼합하고 실온(RT)에서 30분간 배양하였다. NO 농도는 알려진 질산나트륨(NaNO2) 농도로 생성된 표준 곡선을 참조하여 540nm의 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다.
PGE 2 및 사이토 카인 생산의 측정
PGE2 및 사이토카인 생산을 계산하기 위해 표준 샘플로부터 준비된 표준 곡선을 사용하였다.
배양 상등액을 각 그룹으로부터 채취하고, 벤더의 지시에 따라 상응하는 상업적 효소-연결 면역 흡착 분석 (ELISA) 키트 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 사용하여 PGE2 및 종양 괴사 인자-α (TNF-α), 인터루킨 -1β (IL-1β), 인터루킨-6(IL-6) 및 인터루킨-10(IL-10)을 포함하는 사이토 카인의 수준을 정량화 하였다. 표준 샘플로부터 제조된 표준 곡선을 사용하여 PGE2 및 사이토카인 생산을 계산하였다.
웨스턴 블롯 분석
처리 후, 수집 된 phosphate-buffered saline (PBS)로 세척하고 세포 프로테아제 억제제와 인산염 억제제(Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 함유한 용해 완충액으로 용해시켰다.
병렬 실험에서, 핵 및 세포질 단백질은 제조사의 절차에 따라 핵 추출 키트(Active Motif, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 분리되었으며, 용해물의 단백질 농도는 Bradford assay reagent (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 사용하여 측정하였다.
변성 후, 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide 겔 전기 영동에 의해 분리한 다음, 전기블로팅(electroblotting)에 의해 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 (Merck Millipore, MA, USA, MA)으로 옮겼다.
RT에서 1시간 동안 차단완충제(5% 무지방우유 함유)로 배양한 후, 흔들리면서 해당 1차 항체로 4℃에서 밤새 프로브 하였다.
1 차 항체는 Abcam, Inc. (Cambridge, MA, UK, 영국 메사추세츠 주 캠브리지), Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA, 미국 메사추세츠 주 댄버) 및 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA, 미국 캘리포니아 주 산타 크루즈)에서 구입했다.
이후, 스트립을 실온에서 2시간 동안 적절한 horseradish peroxidase-conjugated antibodies (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL, USA)와 함께 배양하고, ECL (Enhanced Chemiluminescence) 검출 시스템(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) 및 Fusion FX Image 시스템 (Vilber Lourmat, Torcy, France)을 사용하여 시각화하였다.
통계적 분석
모든 측정은 3 회 수행되었고 결과는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 제시되었으며, 평균 간의 차이를 분석하기 위해, 통계적으로 유의한 값을 단방향 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 비교한 다음, 그래프-패드 프리즘(Graph-Pad Prism)을 사용한 Tukey HSD 포스트호크 테스트, 버전 5(그래프패드 소프트웨어, Inc, San Diego, CA, USA)를 사용하였다. 실험 결과는 p < 0.05인 것을 통계적으로 유의미하다고 판단하였다.
2. 실험 결과
RAW 264.7 대식세포에 대한 돌가사리 추출물의 세포 독성 평가
실험 조건을 확립하기 위해, RAW 264.7 세포를 24 시간 동안 다양한 농도의 EECT (50 - 300 μg / ml)로 처리하고, 세포 독성을 MTT 분석으로 평가하였다.
도 1에 나타낸 것처럼 EECT의 증가농도와 무관하게 RAW 264.7 세포에 세포독성이 없었으며 대조군과 EECT 처리세포 사이에 유의미한 차이가 발견되지 않았다. 따라서, 후속 실험을 위해 최대 200 μg / ml의 EECT 농도를 선택하였다.
대식세포를 활성화시키기 위한 양성 대조군으로 사용된 0.5 ng/ml 농도의 LPS 또한 RAW 264.7 세포에 세포독성이 없음을 확인하였다.
RAW 264.7 대식세포에서 식균 활성 증가에 대한 돌가사리 추출물의 영향
대식세포의 형태학적 변화는 다양한 외인성인자에 의해 영향을 받을 수 있고 때로는 이들의 활성화와 관련되기 때문에, RAW 264.7 세포의 형태에 대한 EECT의 효과를 조사하였다. 도 2A에 나타낸 바와 같이, 정상 배지에서 배양 된 RAW 264.7 세포는 일반적으로 둥글거나 타원형이었다. 그러나, EECT 처리 농도가 증가함에 따라, 세포는 불규칙하고, 크고, 다이아몬드 형상이 되었으며, 표면은 거칠고 조잡 해졌다. 양성 대조군으로서 RAW 264.7 세포의 LPS 노출은 유사한 형태학적 변화를 야기하는 경향이 있었다.
또한, EECT가 RAW 264.7 세포의 식세포 활성에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 세포에 흡수된 라텍스 비드를 형광 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, EECT- 처리 된 RAW 264.7 세포가 형광-표지 된 라텍스 비드를 포집하는 능력이 대조군과 비교하여 향상되었음을 나타내었다(도 2B 및 C).
또한 유세포 분석을 적용하였고 EECT가 식균 작용을 유의하게 향상시켰음을 확인하였다 (도 2D 및 E). 150 μg / ml EECT로 처리 된 RAW 264.7 세포의 식균 활성은 LPS 양성 대조군의 식균 활성과 유사하여, EECT가 RAW 264.7 세포를 활성화시킬 수 있음을 확인하였다.
RAW 264.7 대식세포에서 NO와 PGE 2 생성 유도에 대한 돌가사리 추출물의 영향
EECT가 NO 및 PGE 2 생산에 미치는 영향을 조사하기 위해 조건화 된 배지에 축적된 아질산염 및 PGE 2 농도를 Griess 시약과 PGE2 ELISA 키트를 사용하여 각각 정량화 하였다. 도 3과 같이 EECT 처리 농도가 증가함에 따라 대조군에 비해 NO와 PGE2 생산량이 크게 증가하였다. 150 및 200 μg/ml EECT로 처리된 세포에 의해 생성된 농도는 LPS 양성 대조군보다 훨씬 높음을 확인하였다.
RAW 264.7 대식세포에서 사이토 카인 생산 강화에 대한 돌가사리 추출물의 영향
RAW 264.7 세포에서 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-10과 같은 사이토 카인의 분비에 대한 EECT의 효과를 평가하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다.
도 4에 도시 된 바와 같이, EECT는 농도-의존적으로 대조군 또는 LPS- 처리 된 세포와 비교하여 모든 시험 된 사이토 카인의 분비를 유의하게 향상시켰다.
RAW 264.7 대식세포에서 유도성 산화 질소 합성 효소 (iNOS), 시클로옥시게나제-2 (COX-2) 및 사이토 카인의 발현 촉진에 대한 돌가사리 추출물의 영향
웨스턴 블롯 분석을 수행하여 EECT 처리에 의해 NO, PGE2 및 사이토 카인의 생성 및 분비가 증가된 것이 조절 유전자의 발현 증가와 관련이 있는지를 조사 하였다.
그 결과, 각각 NO와 PGE2 생산에 관여하는 iNOS와 COX-2의 발현이 대조군에 비해 EECT로 처리된 세포에서 농도 의존적으로 현저하게 증가하였다 (도 5A). 이러한 결과는 EECT가 각각 iNOS 및 COX-2의 발현을 상향 조절함으로써 NO 및 PGE2의 생산을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 이러한 결과와 마찬가지로, 사이토 카인의 발현 또한 EECT 처리에 의해 농도 의존적으로 증가되었다 (도 5B).
또한, 양성 LPS 대조군도 이들 모든 단백질의 발현을 유의하게 증가시켰다.
RAW 264.7 대식세포에서 TLR4, 골수 분화 인자 88 (MyD88) 및 NF-κB 신호 전달 경로 활성화에 대한 돌가사리 추출물의 영향
TLR4, MyD88 및 NF-κB 신호 전달 경로가 EECT- 유도된 RAW 264.7 대식세포 활성화에 관여했는지 여부를 추가로 분석하기 위해, TLR4, MyD88, NF-κB 및 핵 인자-카파 B-α 억제제(IκB-α)를 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)으로 측정하였다.
그 결과, EECT로 24시간 동안 처리된 RAW 264.7 세포에서 TLR4와 MyD88의 총 단백질 수준이 농도의존적으로 증가했음을 보여주었다(도 6A).
또한, LPS로 처리 된 세포에서 두 단백질의 발현은 LPS 처리되지 않은 대조군보다 훨씬 더 높았다. EECT가 NF-κB 신호 경로에 미치는 영향을 조사하기 위해 1시간 동안 EECT로 처리한 세포에서 세포질 및 핵 단백질을 추출하여 NF-κB와 IκB-α의 발현을 조사하였다.
도 6B는 NF-κB 활성화를 위한 하나의 중요한 NF-κB 서브 유닛 인 NF-κB p65의 발현이 EECT- 처리 된 RAW 264.7 세포의 핵에서 증가하고 세포질에서 감소됨을 보여준다.
세포질 분획에서 NF-κB의 세포질 억제제인 IκB-α의 총 단백질 발현은 EECT의 농도가 증가함에 따라 점차 하향 조절되는 반면, 인산화 된 IκB-α (p-IκB-α)의 수준은 처리되지 않은 대조군과 비교하여 상향 조절되었다. LPS로 처리된 RAW 264.7 세포에서도 유사한 경향이 발견되었다.
[실험예 2: 복합 추출물의 효과]
상기 실험예 1에 나타낸 돌가사리 에탄올 추출물(EECT)의 실험 방법과 동일한 방법으로 표 1의 복합 추출물 Y2 내지 Y5의 효과를 비교하여 나타내었다.
그 결과 하기 표 2에 종합적으로 나타내었으며, 객관적인 비교를 위하여, Y1(돌가사리 에탄올 추출물, EECT)의 효과를 지수 5로 나타내었고, 상기 지수는 그 숫자가 높을수록 우수한 것이다.
하기의 평가 지수는 1 내지 10의 지수로 변환하여 나타내었다.
Y1 Y2 Y3 Y4 Y5
면역 증진력 5 3 6 6 2
(단위 : 지수)
상기 표 2에서 나타낸 바와 같이, 붉은참반디 에탄올 추출물(EERT) 및 멱쇠채 에탄올 추출물(EEST)의 바람직한 중량부를 포함하는 Y3 및 Y4에 의하는 경우 대식세포의 식균활성, NO 생성, PGE2 생성, 핵인자-카파B(Nuclear Factor-kappa B; NF-κB) 전사 활성 증가, 톨러이수용체(TLR4) 및 골수분화인자88(MyD88)의 발현의 우수한 활성을 나타내 면역증진효과가 동등 또는 우수함을 확인하였다.
특히, 돌가사리 에탄올 추출물(EECT)에 붉은참반디 에탄올 추출물(EERT) 및 멱쇠채 에탄올 추출물(EEST)의 바람직한 중량부를 포함하고 있는 Y3 및 Y4의 경우, 돌가사리 에탄올 추출물(EECT)만을 포함하는 경우에 비해 더 우수한 면역 증강 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
[실험예 3: 관능성 실험]
1. 관능성 실험
상기 표 1로 구성된 Y1 내지 Y5의 복합조성물을 차로 제조한 이후, 20대 내지 50대의 성인남녀 40명에게 제조된 차를 시음하게 한 후, 맛과 향을 평가하도록 하여 하기 표 2에 종합기호도를 나타내었다.
평가 점수는 각 항목 당 1 내지 10점으로 평가를 요청하였으며, 평가 결과는 평균 점수(반올림)로 환산하여 나타내었다. 상기 지수는 그 숫자가 높을수록 기호도가 높은 것이다.
Y1 Y2 Y3 Y4 Y5
맛 5 3 6 7 3
향 5 4 7 7 2
종합기호도(평균) 5 3 6 7 2
(단위 : 지수)
상기 표 3를 참조하면, 붉은참반디 에탄올 추출물(EERT) 및 멱쇠채 에탄올 추출물(EEST)을 포함하고 있는 Y3 및 Y4가 돌가사리 에탄올 추출물(EECT)만을 포함하는 Y1에 비해 높은 종합기호도를 나타냄을 확인하였다.
결과적으로, 돌가사리 에탄올 추출물(EECT)만을 포함하여 식품 조성물로 이용하고자 하는 경우에는 면역 증강 효과에 비해 기호도가 떨어지는 문제가 있었으나, 복합조성물로 제조 시, 면역 증강 효과는 유지하면서도 전체적인 향미 및 맛이 우수하여 보다 기호성이 높은 식품 조성물로 보급될 수 있다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (7)

  1. 돌가사리(Chondracanthus tenellus) 추출물을 유효성분으로 포함하고,
    붉은참반디 추출물 및 멱쇠채 추출물을 추가로 포함하는
    면역 개선용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 면역 개선용 조성물은 대식세포의 식균작용 활성화를 유도하여 면역 증강 효과가 있는 것인
    면역 개선용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 면역 개선용 조성물은 산화질소(Nitric Oxide, NO)의 생성 증가, 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2; PGE2)의 생성 증가, 면역반응 관련 인자의 발현 증가, 핵인자-카파B(Nuclear Factor-kappa B; NF-κB) 전사 활성 증가, 톨러이수용체(TLR4) 및 골수분화인자88(MyD88)의 발현 증가시킴으로써
    면역반응을 활성화하는 것인
    면역 개선용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 면역반응 관련 인자는 유도형 산화질소 합성효소(iNOS), 이클로옥시게나제-2(COX-2), 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-6(IL-6) 및 인터루킨-10(IL-10)로 이루어진 군에서 선택되는 것인
    면역 개선용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 추출물은 물, C1 내지 C6의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출한 것인
    면역 개선용 조성물.
  6. 제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 면역 개선용 조성물을 포함하는
    약학 조성물.
  7. 제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 면역 개선용 조성물을 포함하는
    식품 조성물.
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