TW202430201A - 黑青稞萃取物用於調節免疫力的用途 - Google Patents
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Abstract
一種黑青稞萃取物用於製備調節受體的免疫力的組合物的用途，其中黑青稞萃取物是將黑青稞（
Hordeum vulgare L.var.
nudum Hook.f.）的種子以澱粉酶水溶液進行萃取所得。
Description
本發明關於一種黑青稞萃取物，特別是涉及一種以澱粉酶水溶液進行萃取所得黑青稞萃取物，其具有調節免疫力的功能。
青稞，別名為裸大麥、元麥、米大麥，是一種禾穀類作物，為大麥的變種之一。在青藏高原，青稞具有3500年的栽培歷史，為藏族的主要食用糧食、燃料和牲畜飼料。
青稞主要分佈於中國西北、西南各省，其適宜生長在高原清涼氣候，具有耐寒性強、生長期短、高產早熟、適應性廣等特徵。
青稞富含鈣、鐵、維生素、β-葡聚糖、膳食纖維等多種營養成分。在藏族，青稞穀粒可以炒熟磨粉，食用時加入酥油茶或清茶後用手捏成坨，稱為糌粑（Tsampa）；青稞亦可釀製成青稞酒，為一種低度麥酒。因此，青稞也可作為啤酒、醫藥和保健品生產的原料。
有鑑於此，本發明提供一種黑青稞萃取物，其具有調節免疫力的功能。
在一些實施例中，一種黑青稞萃取物用於製備調節受體的免疫力的組合物的用途，其中黑青稞萃取物是將黑青稞（
Hordeum vulgare L.var.
nudum Hook.f.）的種子以澱粉酶水溶液進行萃取所得。
在一些實施例中，前述黑青稞萃取物的萃取步驟是於80℃至100℃下進行50分鐘至70分鐘。
在一些實施例中，前述黑青稞萃取物的萃取溫度為90℃±5℃，且萃取時間為60分鐘。
在一些實施例中，澱粉酶可以是α-澱粉酶、β-澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、異澱粉酶至少一或其混合。
在一些實施例中，澱粉酶水溶液中的澱粉酶的濃度為0.3%（w/v）至0.7%（w/v）。
在一些實施例中，澱粉酶水溶液與黑青稞的種子的重量比為5-10：1。在一些實施例中，前述重量比為10：1。
在一些實施例中，調節受體的免疫力為調節免疫相關基因的表現量。在一些實施例中，前述免疫相關基因為白細胞介素-1β（IL-1β）基因、白細胞介素-8（IL-8）基因、白細胞介素-6（IL-6）基因、白細胞介素-10（IL-10）基因、γ-干擾素（IFNG）基因或其組合。
在一些實施例中，調節受體的免疫力為提升自然殺手細胞（NK細胞）的細胞毒殺能力。
在一些實施例中，調節受體的免疫力為降低發炎所產生的一氧化氮（NO）含量。
在一些實施例中，調節受體的免疫力為減少受體的免疫力低下相關症狀。在一些實施例中，前述免疫力低下相關症狀為精神不濟、腸胃不適、嘴破、咳嗽、頭痛或其組合。
在一些實施例中，調節受體的免疫力為緩解受體的過敏反應。在一些實施例中，前述過敏反應包括過敏性哮喘、食物過敏及皮膚過敏。
在一些實施例中，調節受體的免疫力為提高受體的血液中總量T細胞及輔助型T細胞的含量。
在一些實施例中，調節受體的免疫力為提升受體的血液中CD4/CD8的比值。
綜上所述，任一實施例的黑青稞萃取物是將黑青稞的種子以澱粉酶水溶液進行萃取所得，其可用以製備調節受體的免疫力的組合物。在一些實施例中，前述調節受體的免疫力為調節免疫相關基因的表現量、提升自然殺手細胞的細胞毒殺能力、降低發炎所產生的一氧化氮含量、提高受體的血液中總量T細胞及輔助型T細胞的含量、提升受體的血液中CD4/CD8的比值等功能，進而有效提高受體的總體免疫力、降低受體發炎情形、維持免疫正常，並減少受體的免疫力低下相關症狀（例如，精神不濟、腸胃不適、嘴破、咳嗽、頭痛等症狀）、緩解受體的過敏反應（例如，過敏性哮喘、食物過敏、皮膚過敏等過敏反應）。
本文中使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差（SD）表示，各組之間的差異以學生t檢驗（student’s t-test）進行分析。圖式中「*」或「#」代表p值小於0.05，「**」或「##」代表p值小於0.01，以及「***」或「###」代表p值小於0.001。當「*」或「#」越多時，代表統計上的差異越顯著。
術語「萃取物」係指藉由萃取作用所製備之產物。萃取物可以溶於溶劑中之溶液形式呈現，或萃取物可為不含或大體上不含溶劑之濃縮物或精華呈現，亦可以乾燥後之粉體呈現。
黑青稞（black hulless barley），學名為
Hordeum vulgare L.var.
nudum Hook.f.，俗稱黑大麥，黑元麥等。黑青稞為禾本科大麥屬穀物成熟種子，因其穎殼及籽粒表皮呈現黑紫色而命名，形狀為橢圓形或菱形。黑青稞富含鈣、鐵、維生素、β-葡聚糖、膳食纖維、微量元素等多種營養成分。
在一些實施例中，將黑青稞的種子與澱粉酶水溶液混合後，於特定溫度下進行萃取一定時間可得到黑青稞萃取物。其中，黑青稞的種子為成熟的種子、經脫殼後的種子、經加工處理後的種子等。舉例來說，用來萃取的黑青稞的種子是將黑青稞種子去殼後再經粉碎磨成粉末。
其中，澱粉酶水溶液是將澱粉酶溶於水中所得。在一些實施例中，澱粉酶可以是α-澱粉酶、β-澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、異澱粉酶至少一或其混合。在一些實施例中，澱粉酶可以是葡萄糖澱粉酶（glucan 1,4-alpha-glucosidase）。
在一些實施例中，澱粉酶水溶液中的澱粉酶的濃度可以為0.3%（w/v）至0.7%（w/v）。舉例來說，澱粉酶的濃度為0.5%（w/v）。
在一些實施例中，黑青稞的種子與澱粉酶水溶液混和的重量比為5-10：1。舉例來說，前述重量比為10：1。於此，若澱粉酶水溶液過少則萃取效率將會明顯下降。
在一些實施例中，黑青稞萃取物的萃取溫度為80℃至100℃。舉例來說，萃取溫度為85℃至95℃。在一些實施例中，黑青稞萃取物的萃取時間為50分鐘至70分鐘。舉例來說，萃取時間為60分鐘。在一示範例中，黑青稞萃取物是在90℃±5℃下萃取60分鐘所得。於此，若萃取時間過短，則萃取效率將明顯下降；若萃取時間過長，則所得萃取物中的有效成分可能會產生降解。
在一些實施例中，黑青稞萃取物的製備步驟更包括過濾、濃縮及調整酸鹼度。舉例來說，將去殼黑青稞的種子磨成粉末後並加入0.3%（w/v）至0.7%（w/v）的澱粉酶水溶液中，於80℃至100℃下進行萃取50分鐘至70分鐘以得到黑青稞第一萃取液。接著，使用400目數的濾網將黑青稞第一萃取液進行過濾以去除細微固體。然後將過濾後的黑青稞第一萃取液於60℃±5℃下進行減壓濃縮至溶液的白利糖度值（Degrees Brix）為5.0±0.5時停止濃縮，以得到黑青稞萃取物。其中，若所得到的黑青稞萃取物的pH值高於4.0，則可加入0.26%的蘋果酸使其pH值降為3.2±0.5。
在一些實施例中，黑青稞萃取物具有調節免疫力的功能。舉例來說，調節免疫力為調節免疫相關基因的表現量、提升自然殺手（NK）細胞的細胞毒殺能力、降低發炎所產生的一氧化氮含量、提高血液中的IgE含量、提高血液中總量T細胞及輔助型T細胞的含量、提升血液中CD4/CD8的比值等。換言之，受體服用黑青稞萃取物後可有效地提升總體免疫力、抗發炎、降低發炎情形、減少過敏反應、維持正常免疫功能等。
在一些實施例中，黑青稞萃取物可提高白細胞介素-1β（IL-1β）基因、白細胞介素-8（IL-8）基因、白細胞介素-6（IL-6）基因、白細胞介素-10（IL-10）基因等免疫相關基因的表現，並可降低γ-干擾素（IFNG）基因的表現。其中，IL-1β基因編碼的蛋白質可活化血管內皮細胞、淋巴細胞，破壞局部組織並使免疫細胞更容易進入；IL-8基因編碼的蛋白質可對嗜中性粒細胞有細胞趨化作用並調節發炎反應；IL-6基因及IL-10基因分別編碼的蛋白質可提升抗發炎能力；以及，IFNG基因編碼的蛋白質為巨噬細胞活化因子，若活化則呈發炎反應，故透過抑制IFNG基因的表現可降低發炎情形。
在一些實施例中，黑青稞萃取物可活化NK細胞的細胞毒性，即提升其細胞毒殺能力，以提升人體免疫力。由於活化的NK細胞引發目標細胞的細胞凋亡（apoptosis）反應，故可毒殺被病毒感染的細胞、癌細胞、癌化細胞、老化細胞或受壓力的細胞。
在一些實施例中，黑青稞萃取物可有效降低發炎所產生的一氧化氮含量，以降低發炎率。人體內的巨噬細胞與病原體接觸時會促使一氧化氮含量產生並造成細胞死亡。因此，降低發炎所產生的一氧化氮含量可減少發炎情形。
在一些實施例中，黑青稞萃取物可提高血液中總量T細胞及輔助型T細胞的含量、提升血液中CD4/CD8的比值，以提高免疫力。因T細胞主要負責細胞免疫調節及細胞激素的分泌，而輔助型T細胞是負責激活免疫反應，故提升總量T細胞及輔助型T細胞的含量可提高免疫力。CD4是輔助性T細胞表面的標記，而CD8則是抑制性T細胞表面的標記，故CD4/CD8比值為觀察免疫功能是否正常的重要指標。一般而言，CD4/CD8比值偏低表示免疫力低弱，而提升CD4/CD8的比值代表免疫力的提高。
在一些實施例中，黑青稞萃取物可有效降低受體血液中的IgE含量，以減緩過敏反應。一般而言，近期過敏症狀或屬於經常過敏的受體的血液中容易出現IgE含量明顯升高的情形。因此，受體服用黑青稞萃取物後，其血液中的IgE含量降低，並可減緩過敏反應，如減緩過敏性哮喘（如較少發生咳嗽、頭痛等感冒症狀）、減少食物過敏（如較少感到腸胃不適）、減少皮膚過敏（如感到不易嘴破或嘴破癒合速度較快）等。
在一些實施例中，黑青稞萃取物減少受體的免疫力低下相關症狀，如精神不濟、腸胃不適、嘴破、咳嗽、頭痛等症狀。
在一些實施例中，黑青稞萃取物緩解受體的過敏反應，如過敏性哮喘、食物過敏及皮膚過敏。
在一些實施例中，黑青稞萃取物用於製備調節受體免疫力的組合物。舉例來說，組合物可以為含有黑青稞萃取物的粉末的膠囊型態、含有液態黑青稞萃取物的飲品。在一些實施例中，一種組合物，包含容器與裝在容器內的黑青稞萃取物。舉例來說，黑青稞萃取物飲品中為容器內裝有含有黑青稞萃取物的黑青稞飲料。
在一些實施例中，前述受體為人。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有效含量的黑青稞萃取物。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地（parenterally）、口服的、或局部地（topically）投藥劑型。
在一些實施例中，經腸道或口服的投藥劑型可為，但不限於，錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）或類似之物。在一些實施例中，非經腸道地或局部地投藥劑型可為，但不限於，注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation） 或類似之物。在一些實施例中，注射品的投藥方式可為皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）或病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，前述之醫藥品可包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在一些實施例中，作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline, PBS）、或含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為非醫藥用食用產品。換言之，食用產品包含特定含量的黑青稞萃取物。在一些實施例中，食用產品可為一般食品、保健食品或膳食補充品。
在一些實施例中，前述之食用產品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於口服的劑型。在一些實施例中，前述之一般食品可為食用產品本身。在一些實施例中，一般食品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）或調味料。
在一些實施例中，所得的黑青稞萃取物可進一步作為食品添加物（food additive），以製得含有黑青稞萃取物的食品組合物。於此，能藉由習知方法於原料製備時添加任一實施例的黑青稞萃取物，或是於食品的製作過程中添加任一實施例的黑青稞萃取物，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食用產品（即食品組合物）。
在一些實施例中，前述含有黑青稞萃取物的組合物，所含有的黑青稞萃取物可為液態或固態。舉例來說，固態可為粉末或錠型。
在一些實施例中，組合物的使用量為1.2克/日至2克/日的液態黑青稞萃取物。
在一些實施例中，組合物的使用量為0.15克/日至0.22克/日的固態黑青稞萃取物。
例
1
：黑青稞萃取物的製備方法
首先，將去殼的黑青稞的種子（產地中國）以粉碎機（SAMPO 1.5L KJ-SD15G）磨成粉末後，並加入0.5%（w/v）的α-澱粉酶（購自ABenzymes；型號10338）水溶液中。於此，0.5%（w/v）的α-澱粉酶水溶液與黑青稞的種子粉末的重量比為10：1。
接著，於90℃±5℃下萃取60分鐘以得到黑青稞第一萃取液，並使用400目數的濾網將黑青稞第一萃取液進行過濾以去除細微固體。然後將過濾後的黑青稞第一萃取液以濃縮機（廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100）於60℃±5℃下進行減壓濃縮至黑青稞第一萃取液的白利糖度值（Degrees Brix）為5.0±0.5時停止濃縮，並對所得濃縮產物進行酸鹼值測定。於此，若所得到的濃縮產物的pH值未高於4.0，則濃縮產物即為黑青稞萃取物；若所得到的濃縮產物的pH值高於4.0則可加入0.26%的蘋果酸使其pH值降為3.2±0.5後，即得到黑青稞萃取物。
例
2
：一般青稞萃取物（以下稱白青稞萃取物）的製備方法
首先，將去殼的白青稞的種子（產地中國）以粉碎機（SAMPO 1.5L KJ-SD15G）磨成粉末後，並加入0.5%（w/v）的α-澱粉酶（購自ABenzymes；型號10338 ）水溶液中。於此，0.5%（w/v）的α-澱粉酶水溶液與青稞的種子粉末的重量比為10：1。
接著，於90℃±5℃下萃取60分鐘以得到青稞第一萃取液，並使用400目數的濾網將青稞第一萃取液進行過濾以去除細微固體。然後將過濾後的青稞第一萃取液以濃縮機（廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100）於60℃±5℃下進行減壓濃縮至青稞第一萃取液的白利糖度值（Degrees Brix）為5.0±0.5時停止濃縮，並對所得濃縮產物進行酸鹼值測定。於此，若所得到的濃縮產物的pH值未高於4.0，則濃縮產物即為白青稞萃取物；若所得到的濃縮產物的pH值高於4.0則可加入0.26%的蘋果酸使其pH值降為3.2±0.5後，即得到白青稞萃取物。
例
3
：免疫相關基因實驗
於此，所檢測的免疫相關基因為IL-1β（GeneID：3553）基因、IL-8（GeneID：3576）基因、IL-6（GeneID：3569）基因及IL-10（GeneID:3586）基因。
首先，取1.5x10
5個THP-1人類單核白血球細胞（human acute monocytic leukemia；ATCC, TIB202；以下稱THP-1細胞）至每孔含有2毫升細胞培養基的六孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時。於此，所使用的細胞培養基為添加有10%的牛血清（fetal bovine serum；購自Gibco）、0.05mM的2-巰基乙醇（2-mercaptoethanol）、100 units/mL的青黴素及100 μg/mL的鏈黴素的RPMI-1640培養基（購自Gibco）。
將THP-1細胞分為空白組、對照組及實驗組。移除各組別的細胞培養基並更換為每孔2mL實驗培養基，然後置於37°C下分別接續培養48小時。其中，實驗組的實驗培養基為含有0.125mg/mL的例1中所得到的黑青稞萃取物的細胞培養基、對照組的實驗培養基為含有0.125mg/mL的例2中所得到的青稞萃取物的細胞培養基，而空白組的實驗培養基為未添加萃取物的細胞培養基。
收集各組的THP-1細胞，並以RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G）萃取出各組的RNA。接著，各組取1000奈克（ng）的RNA作為模板，透過SuperScript
®III反轉錄酶（購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051）將RNA反轉錄為相應之cDNA。再藉由ABI StepOnePlus
TM即時PCR系統（ABI StepOnePlus
TMReal-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））、KAPA SYBR FAST（購自Sigma公司，美國，編號38220000000）及表1的引子（SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8）對各組的cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction）以觀察THP-1細胞內IL-1β基因、IL-8基因、IL-6基因、IL-10基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應20秒，接著95°C反應3秒，60°C反應30秒，並重複40個迴圈，並使用2-ΔCt方法進行基因定量，如圖1及圖2所示。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量基因的mRNA表現量，進而推斷基因編碼的蛋白質的表現量。
需要特別說明的是，圖1及圖2中的基因表現是以相對表現倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，且各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析。並且，「*」是與空白組相比的P值。
表1
| 目標基因 | 引子名稱 | 序列編號 | 序列 | 引子長度 |
| IL-1β | IL-1β_F | SEQ ID NO:1 | AGCTACGAATCTCCGACCAC | 20 |
| IL-1β_R | SEQ ID NO:2 | CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA | 22 | |
| IL-8 | IL-8_F | SEQ ID NO:3 | ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC | 23 |
| IL-8_R | SEQ ID NO:4 | AACCCTCTGCACCCAGTTTTC | 21 | |
| IL-6 | IL-6_F | SEQ ID NO:5 | CCTGAACCTTCCAAAGATGGC | 21 |
| IL-6_R | SEQ ID NO:6 | TTCACCAGGCAAGTCTCCTCA | 21 | |
| IL-10 | IL-10_F | SEQ ID NO:7 | TCAAGGCGCATGTGAACTCC | 20 |
| IL-10_R | SEQ ID NO:8 | GATGTCAAACTCACTCATGGCT | 22 |
於表1中，F為順向引子（Forward primer），而R為反向引子（Reverse primer）。
請參閱圖1。將空白組的IL-1β基因及IL-8基因的相對表現量視為1.00（即空白組的各組基因的表現量為100%）。相較於空白組，實驗組的IL-1β基因的相對表現量為1.68而對照組的IL-1β基因的相對表現量為1.59，且實驗組的IL-8基因的相對表現量為1.57而對照組的IL-8基因的相對表現量為1.56。於此，實驗組相較於空白組的IL-1β基因表現量提高1.68倍、IL-8基因表現量提高1.57倍。換言之，實驗組的IL-1β基因及IL-8基因的表現量相較於對照組及空白組有顯著的提升，代表黑青稞萃取物能有效地提高IL-1β基因及IL-8基因的表現量。換言之，當受體服用黑青稞萃取物時，能提高的IL-1β基因及IL-8基因的表現量，進而活化免疫細胞、調解發炎反應並提高總體免疫力及達成抗發炎的功能。
請參閱圖2。將空白組的IL-6基因及IL-10基因的相對表現量視為1.00（即空白組的各組基因的表現量為100%）。相較於空白組，實驗組的IL-6基因的相對表現量為2.08而對照組的IL-6基因的相對表現量為1.87，且實驗組的IL-10基因的相對表現量為2.05而對照組的IL-10基因的相對表現量為1.72。於此，實驗組相較於空白組的IL-6基因表現量提高2.08倍、IL-10基因表現量提高2.05倍。換言之，實驗組的IL-6基因及IL-10基因的表現量相較於對照組及空白組有顯著的提升，代表黑青稞萃取物能有效地提高IL-6基因及IL-10基因的表現量，且此二基因表現量較對照組所使用之青稞萃取物的表現量有顯著的提升。換言之，當受體服用黑青稞萃取物時，能提高的IL-6基因及IL-10基因的表現量，進而提高總體免疫力及抗發炎的能力。
例
4
：免疫相關（抗發炎）基因實驗
於此，所檢測的免疫相關（抗發炎）基因為IFNG（GeneID： 3458）基因。
首先，取1x10
6個HaCaT人類角質細胞（Human keratinocytes；ATCC；以下稱HaCaT細胞）至每孔含有2毫升細胞培養基的六孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時。於此，所使用的細胞培養基為添加有10%的牛血清（fetal bovine serum；購自Gibco）、100 units/mL的青黴素及100 μg/mL的鏈黴素的DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium;購自Gibco）。
將HaCaT細胞分為空白組、控制組、對照組及實驗組。移除各組別的細胞培養基並更換為每孔2mL的實驗培養基，然後置於37°C下分別接續培養24小時。其中，實驗組的實驗培養基為含有2μg/ml的脂多醣（Lipopolysaccharide, LPS；購自Sigma，SI-L2880-25MG）及0.125mg/mL的例1中所得到的黑青稞萃取物的細胞培養基、對照組的實驗培養基為含有2μg/ml的LPS及0.125mg/mL的例2中所得到的青稞萃取物的細胞培養基、控制組的實驗培養基為含有2μg/ml的LPS的細胞培養基，而空白組的實驗培養基為未添加萃取物或LPS的細胞培養基。
收集各組的HaCaT細胞，並以500 μL的RB緩衝液將細胞裂解後，以RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G）萃取出各組的RNA。接著，各組取1000奈克（ng）的RNA作為模板，透過SuperScript
®III反轉錄酶（購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051）將RNA反轉錄為相應之cDNA。再藉由ABI StepOnePlus
TM即時PCR系統（ABI StepOnePlus
TMReal-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））、KAPA SYBR FAST（購自Sigma公司，美國，編號38220000000）及表2的引子（SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:10）對各組的cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction）以觀察HaCaT細胞內IFNG基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應20秒，接著95°C反應3秒，60°C反應30秒，並重複40個迴圈，並使用2-ΔCt方法進行基因定量，如圖3所示。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量基因的mRNA表現量，進而推斷基因編碼的蛋白質的表現量。
需要特別說明的是，圖3中的基因表現是以相對表現倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，且各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析。並且，「#」是與控制組相比的P值。
表2
| 目標基因 | 引子名稱 | 序列編號 | 序列 | 引子長度 |
| IFNG | IFNG_F | SEQ ID NO:9 | TGCATCGTTTTGGGTTCTCTT | 21 |
| IFNG_R | SEQ ID NO:10 | AGTTTGAAGTAAAAGGAGACAATTTGG | 27 |
於表2中，F為順向引子（Forward primer），而R為反向引子（Reverse primer）。
請參閱圖3。將空白組的IFNG基因的相對表現量視為1.00（即空白組的各組基因的表現量為100%），而控制組作為LPS誘導發炎情形的IFNG基因相對表現量為2.07。相較於空白組及控制組，實驗組的IFNG基因的相對表現量為0.69而對照組的IFNG基因的相對表現量為0.93。於此，實驗組及對照組均可抑制IFNG基因的表現，而實驗組的黑青稞萃取物顯著地抑制IFNG基因。換言之，實驗組的IFNG基因的表現量相較於控制組、空白組及對照組有顯著的下降，代表黑青稞萃取物能有效地抑制IFNG基因的表現量。換言之，當受體服用黑青稞萃取物時，能抑制IFNG基因的表現量，進而降低巨噬細胞活化的機率並提高總體免疫力及降低發炎情形。
例
5
：
殺手細胞細胞毒殺能力試驗
螢光染料 3,8-二氨基-5-[3（二乙基甲氨基）丙基]-6-苯基啡瞇二碘（3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-
phenylphenanthridinium diiodide，Propidium Iodide, PI；碘化丙啶）是種可對DNA染色的細胞核染色試劑，它可在嵌入雙鏈DNA後釋放紅色螢光。而由於PI不能通過活細胞膜但卻能穿過破損的細胞膜而對其細胞核進行染色，故PI可作為死細胞核酸試劑，常用於細胞凋亡檢測。PI也經常被用來與鈣黃綠素乙醯氧基甲酯（Calcein acetoxymethyl ester, Calcein AM；鈣黃綠素AM）或者二乙酸螢光素（fluorescein diacetate，FDA）等螢光探針一起使用，以同時對活細胞和死細胞染色進行測試。
於此，藉由將人類周邊血液單核球細胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC；購自：以下稱PBMC細胞）（其中約含有10%的自然殺手細胞）與K562人類骨髓性白血病細胞（K562人類血癌細胞，購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC），產品編號CCL-243；以下稱K562細胞）共培養，再以死細胞染劑PI搭配流式細胞儀檢測，分析死細胞數目，間接推知各組自然殺手細胞的細胞毒殺能力。
首先，先由健康捐贈者提供周邊血，並從中分離出PBMC。使用含EDTA抗凝劑之紫頭採血管（購自greiner bio-one，商品編號455036）收集數位受試者的靜脈血各6毫升，接著將抽取後的靜脈血以轉速300 ×g離心15分鐘並從中取2mL的血沉棕黃層（buffy coat）的白細胞層。將白細胞層以2毫升DPBS稀釋為4毫升，接著在稀釋後的白細胞層中緩慢加入至含有3毫升的細胞分離液（Ficoll-Paque Plus 細胞分離液，購自GE Healthcare，商品編號17144002）的離心管，其中於加入期間，稀釋後的白細胞層與細胞分離液須為分層狀態，不能混合。接著，將裝有分層的稀釋後的白細胞層與細胞分離液的離心管以400 ×g離心40分鐘後去除上清液。從上述離心後離心管內的中間層內取2至3毫升的PBMC細胞，並以3倍體積的1X DPBS潤洗後與前述1X DPBS緩衝液混合均勻以形成PBMC混合液。接著將PBMC混合液以轉速300 ×g離心10分鐘以形成上清液及PBMC細胞沉澱物。
將PBMC細胞沉澱物以5毫升的RPMI 1640細胞培養基（購自Gibco，產品編號31800022）回溶，並加入1μl的Calcein AM（染色體積比1:5000；購自Invitrogen，商品編號A13201）靜置5分鐘以進行染色。接著，以400×g轉速離心PBMC細胞5分鐘以去除其上清液，再加入5毫升後1×PBS離心並重複此步驟離心3至5次以確實將多餘的Calcein AM去除。
以RPMI 1640細胞培養基將PBMC細胞稀釋為1×10
6/100μl，及將K562細胞稀釋為5x10
4/100μl。接著，將染色稀釋後的PBMC細胞以每孔1×10
6個PBMC細胞接種至V-bottom 96孔盤。接著，依表3進行各組細胞配置空白組、控制組、對照組及實驗組。於控制組、對照組及實驗組的0小時組及6小時組中再加入每孔5x10
4個K562細胞至各組含有的染色的PBMC細胞的V-bottom 96孔盤中。此外，空白組分為PBMC細胞組、K562細胞組、K562細胞與酒精（EtOH）組，其中空白組的PBMC細胞組僅加入1×10
6個PBMC細胞並以RPMI 1640細胞基培養將體積補至每孔200μl、空白組的K562細胞組僅加入5x10
4個K562細胞並以RPMI 1640細胞培養基將體積補至每孔200μl，且空白組的K562細胞與酒精（EtOH）組加入5x10
4個K562細胞及95%的酒精RPMI 1640細胞培養基將體積補至每孔200μl。
表3：
| 控制組 | 對照組 | 實驗組 | 空白組 | ||
| 0小時 | PBMC細胞/K562細胞 | PBMC細胞/K562細胞 | PBMC細胞/K562細胞 | PBMC細胞 | |
| K562細胞 | |||||
| 6小時 | PBMC細胞/K562細胞 | PBMC細胞/K562細胞 | PBMC細胞/K562細胞 | K562細胞+95%酒精 |
接著，在對照組及實驗組中加入待測樣品（例2中所得到的青稞萃取物及例1中所得到的黑青稞萃取物），而控制組不額外添加待測樣品。其中，對照組的0小時組及6小時組中加入0.125mg/mL的例2中所得到的青稞萃取物。在實驗組的0小時組及6小時組中加入0.125mg/mL的例1中所得到的黑青稞萃取物。
於加入待測樣品後，立刻在控制組、對照組及實驗組的各0小時組，以及空白組的三組中加入1 μL PI染劑（Propidium Iodide；購自BD Biosciences，商品編號556463；體積比1：200）。
將空白組各組移至流式細胞儀（Flow cytometry，購自BD，型號Accuri™ C6 Plus）偵測其散布圖分布範圍，框選PBMC、K562於散布圖中之族群，供後續試驗進行紅螢光（PE-A）之訊號定量。接著，偵測控制組、對照組及實驗組的各0小時組的PE-A螢光訊號。
於加入待測樣品的6小時後，於控制組、對照組及實驗組的各6小時組中加入1 μL的PI染劑，並立即利用流式細胞儀進行PE-A螢光訊號測定。
接著。於PE-A螢光直方圖（histogram）框選出螢光背景值區域（Negative gate）及螢光強度高區域（Positive Gate），藉由螢光強度高區域（Positive Gate）推算死細胞於總數細胞的比例，因此可比較各孔之紅螢光強度高區域之百分比，並以死亡細胞數/原細胞數目的百分比代表NK細胞的毒殺能力。實驗結果如圖4所示。
請參見圖4，控制組的NK細胞的毒殺能力百分比為18.32%、對照組的NK細胞的毒殺能力百分比為87.20%，而實驗組的NK細胞的毒殺能力百分比為111.82%，代表實驗組的NK細胞的毒殺能力提升了6倍左右。換言之，當受體服用黑青稞萃取物時，能提高NK細胞的毒殺能力，進而提升受體免疫力。
例
6
：抗發炎試驗
首先，取1x10
4個小鼠巨噬細胞（RAW 264.7；ATCC TIB-71；以下稱RAW細胞）至每孔含有200μL的細胞培養基的96孔細胞培養盤中，於37℃、5%的CO
2下培養24小時。於此，所使用的細胞培養基為添加有10%的牛血清（fetal bovine serum；購自Gibco）、1%的青黴素-鏈黴素（購自Gibco，Cat. 15140122）、4 mM的L-麩醯胺酸（L-glutamine，購自Gibco）的DEME培養基（購自Gibco）。
將RAW細胞分為空白組、控制組及實驗組。移除各組別的細胞培養基並更換為每孔200μL的實驗培養基，然後置於37°C下分別接續培養24小時。其中，實驗組的實驗培養基為含有500ng/ml的脂多醣（Lipopolysaccharide, LPS；購自Sigma，SI-L2880-25MG）、0.125mg/mL的例1中所得到的黑青稞萃取物、1%的AA、4 mM的L-麩醯胺酸的DMEM培養基、控制組的實驗培養基為含有2μg/ml的LPS、1%的AA、4 mM的L-麩醯胺酸的DMEM培養基，而空白組的實驗培養基為添加有1%的AA、4 mM的L-麩醯胺酸的DEME培養基。
將反應後的各組RAW細胞及其實驗培養基取150μL出來加入另依每孔裝有130 μL的二次水的96孔盤中。並使用Griess試劑套組（Griess reagent kit，Life technologies；1445263）配置Griess試劑（試劑A：試劑B=1：1），取20μL的Griess試劑分別加入前述96孔盤中並避光反應30分鐘。
接著，於反應完後使用ELISA酵素免疫分析儀，以548 nm波長讀取吸光值。其中，OD值讀值越大，代表NO的含量濃度越高，且NO值於此為發炎指標。需要特別說明的是，圖5中的NO相對量是以百分比呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，且各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析。於圖5中，「*」是與空白組相比的P值，而「#」是與控制組相比的P值。
請參見圖5。空白組的NO相對量為100%，而控制組的NO相對量為113.84%，代表LPS確實刺激RAW細胞產生發炎反應。實驗組的NO相對量為91.82%代表黑青稞萃取物確實在LPS促使發炎的情況下有效降低NO含量，且其NO相對量低於空白組的NO相對量更遠低於控制組的NO相對量。由此可知，當受體服用黑青稞萃取物時，能有效降低NO含量並降低發炎率。
例
7
：人體試驗
於此，將2克的例1所製備的黑青稞萃取以48克的水配置為50mL的黑青稞萃取物飲品。
受試人員：10位受試者。其中，受試者為年齡介於20-50歲的健康成年人，且為自覺免疫力低下者。
測試項目：血液總量T細胞與輔助型T細胞占比（免疫力指標）、血液CD4/CD8比值（免疫力指標）、血液中NK細胞毒殺能力、血液IgE濃度（過敏指標）、自評問卷調查（免疫力低下相關症狀）。
測試方式：10位受試者連續四週每日飲用50mL的黑青稞萃取物飲品。於飲用前（即第0週）、飲用2週後（即第2週）以及飲用4週後（即第4週），分別採檢受試者30毫升的血液以檢測受試者的免疫力指標、過敏指標、NK細胞毒殺能力，以及以自評問卷評量受試者免疫力低下相關症狀。其中，血液總量T細胞與輔助型T細胞占比、血液CD4/CD8比值及血液IgE濃度是委託立人醫事檢驗所進行血液檢驗。血液中NK細胞毒殺能力是委託大江基因醫學股份有限公司進行檢驗。
需要特別說明的是，圖式中「*」代表在與第0週比較下其p值小於0.05。、「**」代表在與第0週比較下其p值小於0.01、「***」代表在與第0週比較下其p值小於0.001。
請參見圖6。於第0週時，10位受試者血液中的平均總量T細胞占比為67.7%。於服用黑青稞萃取物飲品2週後，10位受試者血液中的平均總量T細胞占比提升為69.6%，約提升了2.8%。於服用黑青稞萃取物飲品4週後，10位受試者血液中的平均總量T細胞占比相對第0週提升為70.3%，約提升了3.8%。由此可知，當受試者服用含有黑青稞萃取物的飲品後可使血液內的總量T細胞占比提高，進而調節體內細胞免疫及分泌細胞激素，並提高免疫力。
請參見圖7。於第0週時，10位受試者血液中的平均輔助型T細胞占比為35.0%。於服用黑青稞萃取物飲品2週後，10位受試者血液中的平均輔助型T細胞占比提升為37.6%，約提升了7.4%。於服用黑青稞萃取物飲品4週後，10位受試者血液中的平均輔助型T細胞占比相對第0週提升為38.3%，約提升了9.4%。由此可知，當受試者服用含有黑青稞萃取物的飲品後可使血液內的輔助型T細胞占比提高，進而激活免疫反應並提高免疫力。
請參見圖8。CD4是輔助性T細胞表面的標記，而CD8則是抑制性T細胞表面的標記，故CD4/CD8比值為觀察免疫功能是否正常的重要指標。於第0週時，10位受試者血液中的平均CD4/CD8比值為1.36。於服用黑青稞萃取物飲品2及4週後，10位受試者血液中的平均CD4/CD8比值均為1.48。由此可知，當受試者服用含有黑青稞萃取物的飲品2週後便其血液中的平均CD4/CD8比值提高，代表受試者的免疫功能正常。
請參見圖9。於第0週時，8位受試者血液中的平均NK細胞毒殺能力為126.1%。於服用黑青稞萃取物飲品4週後，8位受試者血液中的平均NK細胞毒殺能力提升7%為133.1%。由此可知，當受試者服用含有黑青稞萃取物的飲品便其血液內的NK細胞的細胞毒殺能力會提高，而提高NK細胞的毒殺能力後，其除了可毒殺癌細胞外，還可以殺死被病毒感染的細胞、癌化細胞及老化或受壓力的細胞，故能提升受試者的整體免疫力。
請參見圖10。於第0週時，10位受試者血液中的平均IgE濃度為176.7 kU/L。於服用黑青稞萃取物飲品2週後，10位受試者血液中的平均IgE濃度下降為167.3 kU/L。於服用黑青稞萃取物飲品4週後，10位受試者血液中的平均IgE濃度下降為156.0 kU/L。換言之，於第2週時，10位受試者血液中的平均IgE濃度下降了5.3%，且於第4週時，10位受試者血液中的平均IgE濃度下降了11.7%。由此可知，當受試者服用含有黑青稞萃取物的飲品後便其血液中的平均IgE濃度下降，代表受試者的過敏反應減緩。
請參見圖11。10位受試者中有3位的IgE濃度超標，故進一步觀察3位受試者的IgE濃度變化。於第0週時，3位受試者血液中的平均IgE濃度為499.3 kU/L。於服用黑青稞萃取物飲品2週後，3位受試者血液中的平均IgE濃度下降為468.1 kU/L。於服用黑青稞萃取物飲品4週後，3位受試者血液中的平均IgE濃度下降為429.3 kU/L。換言之，於第2週時，3位受試者血液中的平均IgE濃度下降了6.3%，且於第4週時，3位受試者血液中的平均IgE濃度下降了14.0%。由此可知，當受試者服用含有黑青稞萃取物的飲品後便其血液中的平均IgE濃度下降，代表受試者的過敏反應減緩。
10位受試者於受試者在第0週、第2週及第4週時分別填寫自評問卷平量，其包括整體精神狀況、腸胃不適狀況、嘴破、咳嗽頭痛等感冒症狀。受試者依據各選項評量自身感覺，並依照答案換算百分比。自評問卷評量與結果如表4所示。
表4
| 1、服用後，感到較少發生咳嗽、頭痛等微感冒症狀 | |
| 很有感 （3） | 3人 |
| 稍微有感 （2） | 6人 |
| 無感 （1） | 1人 |
| 2. 服用後，感到較不易嘴破或嘴破癒合速度較快 | |
| 很有感 （3） | 1人 |
| 稍微有感 （2） | 8人 |
| 無感 （1） | 1人 |
| 3. 服用後，較少感到腸胃不適 | |
| 很有感 （3） | 5人 |
| 稍微有感 （2） | 3人 |
| 無感 （1） | 2人 |
| 4. 服用後，感到整體精神狀況獲得提升，較不易疲憊 | |
| 很有感 （3） | 3人 |
| 稍微有感 （2） | 4人 |
| 無感 （1） | 3人 |
| 5. 整體功效滿意度 | |
| 非常滿意（4） | 1人 |
| 滿意（3） | 6人 |
| 普通 （2） | 3人 |
| 不滿意 （1） | 0人 |
請參見圖12。10位受試者於服用黑青稞萃取物飲品4週後，對於「服用後，感到較少發生咳嗽、頭痛等微感冒症狀」感到「很有感」的受試者人數占比為30%（3人）、感到「稍微有感」的受試者人數占比為60%（6人）、感到「無感」的受試者人數占比為10%（1人）。
對於「服用後，感到較不易嘴破或嘴破癒合速度較快」感到「很有感」的受試者人數占比為10%（1人）、感到「稍微有感」的受試者人數占比為80%（8人）、感到「無感」的受試者人數占比為10%（1人）。
對於「服用後，較少感到腸胃不適」感到「很有感」的受試者人數占比為50%（5人）、感到「稍微有感」的受試者人數占比為30%（3人）、感到「無感」的受試者人數占比為20%（2人）。
對於「服用後，感到整體精神狀況獲得提升，較不易疲憊」感到「很有感」的受試者人數占比為30%（3人）、感到「稍微有感」的受試者人數占比為40%（4人）、感到「無感」的受試者人數占比為30%（3人）。
請參見圖13。10位受試者於服用黑青稞萃取物飲品4週後，對於「整體功效滿意度」感到「非常滿意」的受試者人數占比為10%（1人）、感到「滿意」的受試者人數占比為60%（6人）、感到「普通」的受試者人數占比為30%（3人），而對於「不滿意」的受試者人數占比為0%（0人）。
由此可知，服用黑青稞萃取物可改善受試者的免疫力低下相關症狀，以及過敏性哮喘、食物過敏及皮膚過敏等過敏反應。
綜上所述，根據本發明任一實施例的黑青稞萃取物可用以製備調節受體的免疫力的組合物，其中黑青稞萃取物是將黑青稞的種子以α-澱粉酶水溶液進行萃取所得，在一些實施例中，黑青稞萃取物具有調節免疫相關基因的表現量、提升自然殺手細胞的細胞毒殺能力、降低發炎所產生的一氧化氮含量、提高受體的血液中總量T細胞及輔助型T細胞的含量、抑制受體血液中IgE含量、提升受體的血液中CD4/CD8的比值等功能，並可提高受體的總體免疫力、降低受體發炎情形、維持免疫正常、減少受體的免疫力低下相關症狀（例如，精神不濟、腸胃不適、嘴破、咳嗽、頭痛等症狀）、緩解受體的過敏反應（例如，過敏性哮喘、食物過敏、皮膚過敏等過敏反應）等功效。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
圖1是黑青稞萃取物與青稞萃取物的免疫相關基因（IL-1β基因及IL-8基因）的比較實驗結果圖；
圖2是黑青稞萃取物與青稞萃取物的免疫相關基因（IL-6基因及IL-10基因）的比較實驗結果圖；
圖3是黑青稞萃取物與青稞萃取物的免疫相關基因（IFNG基因）的比較實驗結果圖；
圖4是黑青稞萃取物與青稞萃取物的自然殺手細胞（NK細胞）的細胞毒殺能力的比較實驗結果圖；
圖5是黑青稞萃取物的一氧化氮（NO）含量的實驗結果圖；
圖6是受試者在第0週、第2週及第4週的平均血液中總量T細胞含量的結果圖；
圖7是受試者在第0週、第2週及第4週的平均血液中輔助型T細胞的結果圖；
圖8是受試者在第0週、第2週及第4週的平均血液中CD4/CD8的比值的結果圖；
圖9是受試者在第0週及第4週的血液中自然殺手細胞（NK細胞）的細胞毒殺能力的測試結果圖；
圖10是全部受試者在第0週、第2週及第4週的平均血液中IgE含量的結果圖；
圖11是IgE含量超標的部分受試者在第0週、第2週及第4週的平均血液中IgE含量的結果圖；
圖12是受試者服用黑青稞萃取物四週後的體感問卷的調查結果圖；以及
圖13是受試者服用黑青稞萃取物四週後的整體功效滿意度的調查結果圖。
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Claims (17)
- 一種黑青稞萃取物用於製備調節一受體的免疫力的組合物的用途，其中該黑青稞萃取物是將一黑青稞（ Hordeum vulgare L.var. nudum Hook.f.）的種子以一澱粉酶水溶液進行萃取所得。
- 如請求項1所述的用途，其中該萃取是於80℃至100℃下進行50分鐘至70分鐘。
- 如請求項2所述的用途，其中該萃取的溫度為90℃±5℃，且該萃取的時間為60分鐘。
- 如請求項1所述的用途，其中該澱粉酶水溶液中的澱粉酶是α-澱粉酶、β-澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、異澱粉酶至少一或其混合。
- 如請求項1所述的用途，其中該澱粉酶水溶液中的澱粉酶的濃度為0.3%（w/v）至0.7%（w/v）。
- 如請求項1所述的用途，其中該澱粉酶水溶液與該黑青稞的種子的重量比為5-10：1。
- 如請求項6所述的用途，其中該重量比為10：1。
- 如請求項1所述的用途，其中調節該受體的該免疫力為調節免疫相關基因的表現量。
- 如請求項8所述的用途，其中該免疫相關基因為白細胞介素-1β（IL-1β）基因、白細胞介素-8（IL-8）基因、白細胞介素-6（IL-6）基因、白細胞介素-10（IL-10）基因、γ-干擾素（IFNG）基因或其組合。
- 如請求項1所述的用途，其中調節該受體的該免疫力為提升自然殺手細胞（NK細胞）的細胞毒殺能力。
- 如請求項1所述的用途，其中調節該受體的該免疫力為降低發炎所產生的一氧化氮（NO）含量。
- 如請求項1所述的用途，其中調節該受體的該免疫力為減少該受體的免疫力低下相關症狀。
- 如請求項12所述的用途，其中該免疫力低下相關症狀為精神不濟、腸胃不適、嘴破、咳嗽、頭痛或其組合。
- 如請求項1所述的用途，其中調節該受體的該免疫力為緩解該受體的過敏反應。
- 如請求項14所述的用途，其中該過敏反應包括過敏性哮喘、食物過敏及皮膚過敏。
- 如請求項1所述的用途，其中調節該受體的該免疫力為提高該受體的血液中總量T細胞及輔助型T細胞的含量。
- 如請求項1所述的用途，其中調節該受體的該免疫力為提升該受體的該血液中CD4/CD8的比值。
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