CN117887724A - 一种飞蝗Kune-Kune基因及其dsRNA和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种飞蝗Kune‑Kune基因及其dsRNA和应用。本发明通过生物信息学方法，从飞蝗转录组中获取Kune‑Kune基因的片段，进一步进行克隆、测序后，得到序列为SEQ ID NO：1。依据SEQ ID NO：1，设计并合成该基因的dsRNA，该基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示序列，将其注射进入飞蝗体腔后可以特异性沉默该靶标基因，飞蝗在蜕皮时因蜕皮困难死亡，未死亡的虫体翅芽外翻，在饲养3天后全部死亡。由于本发明的特异性及高效的致死率，对于害虫防治具有重要的现实意义，可为害虫防治提供新的途径。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种飞蝗Kune-Kune基因及其dsRNA和应用。
背景技术
飞蝗(Locusta migratoria)隶属于直翅目蝗总科飞蝗属，是一种重要的农业害虫。飞蝗可分为以黄底黑背体色为主的群居型(Gregaria)和以绿色和灰色为主的散居型(Solitary)两种不同的型，当飞蝗聚集成群成为群居性蝗虫后就会发生蝗灾，由于飞蝗取食范围广(可食用几乎各种阔叶绿色植物的叶片)、食量大(成虫的蝗虫可以食用其体重两倍以上的食物)、迁飞和运动能力强(后腿肌肉和翅发达)且具有高繁殖力，所以蝗灾一旦发生会对我们的农牧业生产造成严重的威胁。其危害不只是表现在农牧业上，蝗虫食用大量植物，破坏了生态环境，使植被减少，导致土地侵蚀和沙漠化，破坏生态平衡。目前对于蝗灾的防治主要还是使用化学杀虫剂，但化学杀虫剂的长期使用，越来越多的问题也被凸显出，如环境污染、抗药性、对非靶标物种的危害以及农药残留等。因此开发安全、绿色环保和有效的生物杀虫剂已迫在眉睫，越来越多的科学家已开始重视生物杀虫剂的研发。
RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。随着RNAi现象的的发现，由于其特异性，使得其可以对害虫特定基因进行靶向干扰，从而具有专一性；同时，其易降解，故对环境无毒害，相对安全。截至目前，RNAi是公认的最适合作为新一代杀虫剂的核心技术。将RNAi技术应用于害虫防治中，靶标基因的筛选是一个重要的环节。
隔膜连接在无脊椎动物中为上皮组织提供封闭连接的功能，为细胞旁流动的溶质提供了关键的阻滞作用，允许组织形成独特的隔室，用于内部器官功能的正常发挥并赋予表皮屏障功能以限制病原体的侵入。隔膜连接蛋白是生物体整个生命过程中许多发育事件所必需的。研究表明在昆虫中存在两种不同类型的隔膜连接，分别为光滑隔膜连接和褶皱隔膜连接，它们在超微结构和分子组成上各有不同。光滑隔膜连接存在于中肠和其他内胚层来源的上皮中，而褶皱隔膜连接主要存在于外胚层来源的上皮组织中。Kune-kune(Kune)是一种重要的褶皱隔膜连接蛋白的核心功能成分，目前仅在模式昆虫黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)对其功能进行了相关研究，Kune与果蝇胚胎气管的形成密切相关。而本发明揭示了Kune基因在飞蝗中主要参与表皮的形成，在飞蝗蜕皮发育过程中发挥着重要作用，LmKune基因可作为后续开发核酸生物农药的靶标分子。
发明内容
本发明针对上述问题提供了一种飞蝗Kune-Kune基因及其dsRNA和应用。
为达到上述目的本发明采用了以下技术方案：
本发明提供了一种飞蝗Kune-Kune基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述飞蝗Kune-Kune基因的获得方法，包括以下步骤：
步骤1，基于飞蝗转录组数据库获得该基因的全长序列；
步骤2，根据步骤1获得的基因设计上游引物、下游引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4所示；
步骤3，提取飞蝗三龄若虫总RNA，采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA；
步骤4，以第一链cDNA为模板，结合设计的上、下游引物，通过PCR扩增获得飞蝗Kune-Kune基因。
本发明还提供了一种基于所述飞蝗Kune-Kune基因合成的dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
所述dsRNA的合成方法，包括以下步骤：
步骤1，根据飞蝗Kune-Kune基因设计合成dsRNA的上、下游引物，如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；
步骤2，以测序正确的飞蝗Kune-Kune基因全长质粒为模板，使用设计的上、下游引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤3，PCR扩增产物经试剂盒纯化后按照试剂盒说明体外转录合成dsRNA。
本发明还提供了一种所述dsRNA在防治飞蝗中的应用，作用在飞蝗蜕皮发育过程中。
本发明还提供了一种用于防治飞蝗的核酸试剂，包含所述dsRNA。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本发明具体为通过生物信息学方法，从飞蝗转录组中获取Kune基因的片段，进一步进行克隆、测序后，得到序列为SEQ ID NO：1。依据SEQ ID NO：1，设计并合成该基因的dsRNA，该基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示序列，将其注射进入飞蝗体腔后可以特异性沉默该靶标基因，飞蝗在蜕皮时因蜕皮困难死亡，未死亡的虫体翅芽外翻，在饲养3天后全部死亡。由于本发明的特异性及高效的致死率，对于害虫防治具有重要的现实意义，可为害虫防治提供新的途径。
附图说明
图1为三龄飞蝗注射dsRNA注射48h后对Kune基因mRNA水平表达的影响(左为对照组注射dsGFP，右为实验组注射dsLmKune)，其中**0.001<P<0.05。
图2为dsRNA对三龄飞蝗若虫蜕皮发育的影响(左图为对照组注射dsGFP，右图为实验组注射dsLmKune)。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明的技术方案，下面通过实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1：飞蝗Kune基因的序列及其dsRNA的获得
1、飞蝗Kune基因序列的获得
1)在飞蝗转录组数据库中搜索LmKune基因序列
基于黑腹果蝇Kune-Kune的基因序列在飞蝗转录组数据库中进行比对搜索，经过序列分析及比对后，共获得1条飞蝗Kune基因序列。
2)PCR扩增所需引物设计：
根据上述1)中的基因片段，并采用primerpremier 5.0软件设计上游引物和下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3(ATGGGGAAGACGAAGACAGG)和SEQ ID NO：4(TCAAATTACTGTATGGGCGG)所示，由上海生工生物工程股份有限公司合成。使用Trizol(TaKaRa)提取飞蝗三龄若虫总RNA，采用M-MLV反转录酶(TaKaRa)将所提RNA反转录成第一链cDNA。从而获得后续PCR反应所需模板。
3)PCR扩增反应
以2)中的cDNA作为模板，结合设计的上下游引物，通过PCR扩增获得Kune基因全长片段，通过Gel Extroaction Kit(康为试剂)将PCR产物进行切胶纯化，将纯化后的产物克隆到(Promega)中，转入DH5α感受态细胞，挑取单克隆，菌检后将菌液送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序。将测序正确的菌液，扩大培养后，采用PlasmidMini Kit(Omega)提取质粒备用，测序得到核苷酸序列为SEQ ID NO：1的序列。
2、飞蝗Kune基因dsRNA的合成
1)飞蝗Kune基因dsRNA引物的设计
基于飞蝗Kune基因的序列SEQ ID NO：1，采用primer premier5.0软件设计合成dsRNA的引物，其上下游引物的序列分别为SEQ ID NO：5：taatacgactcactatagggTTGCTAGCTTTCTGGTGGCT和SEQ ID NO：6：taatacgactcactatagggACTGTATGGGCGGCTTTTCT(斜体部分为T7启动子)。所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。
2)飞蝗Kune基因dsRNA的合成
利用PCR扩增反应后测序正确的Kune全长质粒作为模板，使用设计的dsRNA上下游引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6进行PCR扩增，体系如下：PCR MasterMix 25μL、上下游引物分别为0.5μL、Kune全长质粒模板(5ng/μL)2μL、PCR水22μL，反应程序为：94℃5min，一个循环；94℃30sec，58℃30sec，72℃40sec 35个循环；72℃10min。PCR产物经GelExtractionKit(康为试剂)试剂盒纯化后按照T7 RiboMAXTM Express RNAi System(Promega)试剂盒说明体外转录合成dsRNA。使用NaNoDrop 2000(Thermo scientific)进行定量，使其终浓度达到2μg/μL。保存于-80℃超低温冰箱备用。
实施例2：飞蝗Kune基因的dsRNA致死实验
1、特异性dsRNA注射
将2μL(4μg)SEQ ID NO：2的dsRNA用25μL规格微量注射器注射到3龄飞蝗第1天若虫二、三腹节之间，注射处理组37只。注射相同体积浓度的dsGFP至对照组体内，对照组注射34只。将注射后飞蝗置于恒温培养室中饲养(光照：黑暗时间＝14h:10h，温度30±2℃，相对湿度60％)，对照组和处理组每天均饲喂新鲜小麦幼苗和麦麸。
2、飞蝗Kune基因沉默检测
各收集9头注射dsGFP和dsLmKune 48h后取若虫整虫进行总RNA提取，并反转录成第一链cDNA，采用Real-time PCR方法分别检测目的基因(LmKune)和管家基因(β-actin)的相对表达量，从而对其沉默效率进行计算。结果表明，与对照组比较，注射dsRNA后，处理组Kune基因表达显著降低(图1)。每组设置3个生物学重复，每个生物学重复3头若虫。
3、注射dsRNA后表型观察
三龄若虫分别注射dsLmKune(处理组)和dsGFP(对照组)后，对照组虫体在三龄第5天全部成功蜕皮至四龄若虫，且蜕皮后成虫发育状态良好。注射dsLmKune后，三龄若虫有82.1％的虫体因蜕皮异常不能正常发育到四龄，其余17.9％的虫体可以蜕皮，但这部分虫体翅芽外翻，在饲养至四龄第3天时虫体死亡(图2)。
综上，本发明揭示了Kune基因在飞蝗中主要参与表皮的形成，在飞蝗蜕皮发育过程中发挥着重要作用，LmKune基因可作为后续开发核酸生物农药的靶标分子。
以上显示和描述了本发明的主要特征和优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (7)
1.一种飞蝗Kune-Kune基因，其特征在于，所述飞蝗Kune-Kune基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
2.权利要求1所述飞蝗Kune-Kune基因的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，基于飞蝗转录组数据库获得该基因的全长序列；
步骤2，根据步骤1获得的基因设计上游引物、下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；
步骤3，提取飞蝗三龄若虫总RNA，采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA；
步骤4，以第一链cDNA为模板，结合设计的上、下游引物，通过PCR扩增获得飞蝗Kune-Kune基因。
3.基于权利要求1所述飞蝗Kune-Kune基因合成的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.权利要求3所述dsRNA的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，根据飞蝗Kune-Kune基因设计合成dsRNA的上、下游引物，如SEQ ID NO：5和SEQID NO：6所示；
步骤2，以测序正确的飞蝗Kune-Kune基因全长质粒为模板，使用设计的上、下游引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤3，PCR扩增产物经试剂盒纯化后按照试剂盒说明体外转录合成dsRNA。
5.权利要求3所述dsRNA在防治飞蝗中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，作用在飞蝗蜕皮发育过程中。
7.一种用于防治飞蝗的核酸试剂，其特征在于，包含权利要求3所述的dsRNA。
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