CN116790638B - 亚洲小车蝗udp-n-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种亚洲小车蝗UDP‑N‑乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因及其应用。其中，亚洲小车蝗UDP‑N‑乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。通过筛选已有亚洲小车蝗转录组数据库，进行亚洲小车蝗UDP‑N‑乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆和测序，用于dsRNA的合成。将上述dsRNA注入亚洲小车蝗第2‑3腹节后，通过RNA干扰亚洲小车蝗几丁质代谢，使亚洲小车蝗因蜕皮困难死亡，从而达到生物防治的目的，减少化学杀虫剂使用，具有极大的生产应用价值，为安全无公害的害虫防治方法的研制提供新途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种亚洲小车蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因及其应用。
背景技术
亚洲小车蝗是内蒙古重要的农业害虫，目前防治仍然主要依靠化学防治，长期施用化学杀虫剂导致一系列问题产生，如农药残留污染环境、昆虫产生抗药性和对非靶标生物产生危害。因此，开发新型环保、可替代化学防治的方法变得尤为紧迫。
RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默的现象，具有效率高、特异性强、操作简便等特点被应用于动植物表型和抗性基因功能鉴定的相关研究中，沉默必要基因导致昆虫生长迟缓、发育缺陷，甚至死亡。因此，学者将其称为第四代杀虫剂。基于RNAi进行害虫防治的前提是筛选靶标序列获得对昆虫具有高致死作用的dsRNA。
几丁质是昆虫表皮及围食膜等部位的重要组成成分，其含量受到几丁质代谢途径中相关酶基因的调控，由于人和其他高等动物并没有几丁质，因此昆虫几丁质代谢中的关键酶基因已被公认为新型杀虫剂作用的靶标。UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因催化可逆反应GlcNAc-1-P+UTP变成UDP-GlcNAc+PPi，由此产生几丁质合成酶的前体物质UDP-GlcNAc，进一步合成几丁质，在昆虫生理代谢中发挥着重要作用。通过RNA干扰亚洲小车蝗几丁质代谢，使亚洲小车蝗因蜕皮困难死亡，从而达到生物防治的目的，提供环保治蝗技术，是目前急需进行的研究课题。
因此，现有技术中亟需一种亚洲小车蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因、亚洲小车蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因RNA干扰序列片段及亚洲小车蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因RNA干扰序列片段合成的dsRNA在亚洲小车蝗防治中的应用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的不足，提供一种亚洲小车蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因、亚洲小车蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因RNA干扰序列片段及亚洲小车蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因RNA干扰序列片段合成的dsRNA在亚洲小车蝗防治中的应用。
为实现以上目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种亚洲小车蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因，核苷酸序列如SEQ IDNO :1所示。设计相应的简并引物后，通过PCR扩增获得其保守区，产物经琼脂糖凝胶电泳检测其片段长度为1464 bp，同时经测序获得其cDNA全长，并命名为OasiUAP1，其全长为3646bp，开放阅读框为1455 bp，编码484个氨基酸。
亚洲小车蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因RNA干扰序列片段，核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。是根据SEQ ID NO:1设计上下游引物经PCR扩增获得。
进一步利用相关试剂盒，根据相应的干扰序列片段合成dsRNA。本发明提供一种亚洲小车蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因的RNA干扰序列片段合成的dsRNA。
上述dsRNA在亚洲小车蝗防治中的应用。注射dsRNA到昆虫2-3腹节，结果表明，dsRNA可以特异性地沉默基因OasiUAP1的mRNA表达，根据畸形表型及存活率可以直观看到干扰后的相应基因对亚洲小车蝗的影响。
本发明的有益效果是：本发明提供一种亚洲小车蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因、亚洲小车蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因RNA干扰序列片段及亚洲小车蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因RNA干扰序列片段合成的dsRNA在亚洲小车蝗防治中的应用，通过RNA干扰亚洲小车蝗几丁质代谢，使亚洲小车蝗因蜕皮困难死亡，从而达到生物防治的目的，减少化学杀虫剂使用，具有极大的生产应用价值。
附图说明
图1为琼脂糖凝胶检测亚洲小车蝗OasiUAP1转录组cDNA序列长度（M为DL2000 DNAMarker，条带从小到大依次为100、250、500、750、1000、2000 bp，1为亚洲小车蝗OasiUAP1基因条带大小）；
图2为注射dsOasiUAP1（即dsRNA）后亚洲小车蝗表型变化（dsOasiUAP1为注射dsRNA的实验组，dsGFP为对照组）；
图3为注射亚洲小车蝗dsOasiUAP1在12、24、48和72 h后基因的表达（dsGFP为对照组，其余为注射dsRNA的实验组）；
图4为注射dsOasiUAP1在12、24、48、72和96 h后的亚洲小车蝗存活率统计分析。
实施方式
以下结合附图对本发明作详细描述。
实施例1：亚洲小车蝗OasiUAP1基因cDNA全长序列获得及氨基酸序列分析
1.亚洲小车蝗OasiUAP1基因cDNA片段获得
基于已有亚洲小车蝗转录组数据库，对其Unigene进行搜索，经NCBI Blastx分析后，确定获得亚洲小车蝗OasiUAP1基因片段。
2.亚洲小车蝗OasiUAP1基因cDNA全长序列获得
将上述基因片段通过GeneDoc软件进行拼接，并采用primer premier 5.0软件设计上下游引物：
OasiUAP1：上游引物：OasiUAP1F
5’-TTCAGAATGCTGGACATCGG-3’
下游引物：OasiUAP1R
5’-AATTTAGCTTTGTTCACTAGGATGC-3’
本发明所用引物均由北京厚生博泰生物技术有限公司合成。
选取生长健康、大小一致、雌雄各半的4龄蝗蝻，在体式显微镜下将蜕皮后12、24、48和72 h蝗蝻表皮迅速解剖并冷冻于液氮中。每头蝗蝻均采用如上方式处理，共设3组生物学重复，依照Promega的Eastep® Super Total RNA Extraction Kit试剂盒提取RNA。采用GoScript® Reverse Transcription Mix, Oligo(dT)试剂盒将所提RNA反转录成第一链cDNA，以此作为模板，结合设计的上下游引物，通过PCR扩增后送测，获得亚洲小车蝗OasiUAP1基因cDNA全长片段，通过TIANgel Midi Purification Kit试剂盒（天根）进行PCR产物回收和纯化后克隆到pMD18-T载体（Promega）中，再转入大肠杆菌感受态细胞E. coliDH5α（天根）中，对菌液进行培养后采用TIANprep Mini Plasmid Kit试剂盒（天根）提取质粒，检测后，将菌液送往北京厚生博泰生物技术有限公司进行测序，测序得到核苷酸为SEQID NO :1的序列。
如图1所示，琼脂糖凝胶检测亚洲小车蝗OasiUAP1转录组cDNA序列长度为1464bp。
3.亚洲小车蝗OasiUAP1基因氨基酸序列分析
通过ExPaSy在线软件对已获得的亚洲小车蝗OasiUAP1基因核苷酸进行翻译，预测亚洲小车蝗OasiUAP1的开放阅读框编码484个氨基酸，分子量为55.08KD，等电点为6.05，功能域预测发现不具有信号肽，亚洲小车蝗OasiUAP1氨基酸序列与东亚飞蝗（Locusta migratoria manilensis）LmUAP1基因的氨基酸序列的同源度达到90%以上。
实施例2：亚洲小车蝗OasiUAP1基因的dsRNA合成
1.亚洲小车蝗OasiUAP1基因dsRNA的引物设计
基于亚洲小车蝗OasiUAP1基因序列，采用primer premier5.0软件设计dsRNA引物（含T7启动子taatacgactcactataggg），其干扰序列为SEQ ID NO :2；
上游引物：OasiUAP1-RNAiF
5’-taatacgactcactatagggCGGAGTATCGTATCCCAAAG-3’
下游引物：OasiUAP1- RNAiR
5’-taatacgactcactatagggTGCCATCCACCTGACAAA-3’。
本发明所有引物均由北京厚生博泰生物技术有限公司合成。
2.基于亚洲小车蝗OasiUAP1基因特异性dsRNA合成
以上述亚洲小车蝗UAP基因提取质粒为模板，用含有T7启动子序列的上下游引物进行PCR扩增。得到长度为545 bp的基因片段（SEQ ID NO :2）。采用TIANgel MidiPurification Kit试剂盒（天根）对PCR产物进行回收和纯化后按照T7 RiboMAXTM ExpressRNAi System（Promega）试剂盒说明体外转录合成dsRNA。检测其浓度，确保dsRNA浓度至少达到300 ng/μL，并存于-80℃超级低温冰箱备用。
实施例3：亚洲小车蝗OasiUAP1基因的dsRNA致死实验
1.特异性dsRNA注射
选取60头生长健康、大小一致雌雄各半的4龄3天蝗蝻进行实验。使用0.26 mm规格微量注射器（SHIMADZU，Japan）将5 μL(1000 ng/µL)合成的dsRNA轻轻注射进入蝗蝻腹部的2-3腹节之间。同时选取60头蝗蝻设立为对照组，注射相同体积和浓度的dsGFP至对照组体内。将注射后亚洲小车蝗置于通风良好的养虫笼内（白天温度控制在25±2℃，晚上21±2℃、相对湿度40±5%、光暗周期14 h：10 h条件），每天饲喂新鲜小麦幼苗和麦麸，选取处理后12、24、48和72 h蝗蝻迅速解剖并冷冻于液氮中。
2.亚洲小车蝗OasiUAP1基因的沉默检测
收集注射dsOasiUAP1（即dsRNA）后12、24、48、72 h的蝗蝻，同时选取注射dsGFP的相同头数的蝗蝻设立为对照组，进行总RNA提取，并反转录成第一链cDNA，采用Real-timePCR方法分别检测目的基因(OasiUAP1)和内参基因(β-actin)的相对表达量，从而对其沉默效率进行计算。结果表明，与对照组比较，注射dsOasiUAP1后不同处理时间下，处理组表达显著降低，参见图3，在48 h干扰效率达到最大，相对表达量22.22%，干扰率为77.78%。每组设置3个生物学重复，每个生物学重复取3头蝗蝻。
3.注射dsRNA后4龄蝗蝻表型观察
如图2所示，4龄蝗蝻注射dsRNA后，对照组蝗蝻全部正常生长发育至成虫，注射dsOaUAP1后实验组蝗蝻出现全身皱缩而无法完成蜕皮，特别是腹部以及跳跃足部分旧的角质层无法正常蜕去，最终导致蝗虫不能正常活动甚至窒息而死；注射dsOasiUAP1 96 h后，亚洲小车蝗实验组存活率为0，这与注射dsGFP的对照组（存活58只，存活率为97%）相比，致死效果明显，参见图4。害虫防治研究主要采用注射法及饲喂法，两种方法具有同样作用原理及效果，本发明采用注射法进行实验研究。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (4)
1.一种亚洲小车蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的亚洲小车蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因RNA干扰片段，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求2所述的亚洲小车蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因的RNA干扰片段合成的dsRNA。
4.根据权利要求3所述的dsRNA在亚洲小车蝗防治中的应用。
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