CN115029357B

CN115029357B - 昆虫m6A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因的dsRNA及其应用

Info

Publication number: CN115029357B
Application number: CN202210717890.2A
Authority: CN
Inventors: 杨美玲; 王慧敏; 胡志豪
Original assignee: Capital Normal University
Current assignee: Capital Normal University
Priority date: 2022-06-21
Filing date: 2022-06-21
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2042-06-21
Also published as: CN115029357A

Abstract

本发明提供一种昆虫m⁶A甲基化阅读蛋白elF3‑S6基因的dsRNA及其应用，首先对昆虫的m⁶A甲基化阅读蛋白elF3‑S6基因进行克隆、测序后，得到序列为SEQ ID NO：1的编码m⁶A甲基化阅读蛋白elF3‑S6的核苷酸序列，然后选择序列为SEQ ID NO：2的基因片段，由该片段合成dsRNA。通过RNA干扰技术，注射合成的dsRNA干扰昆虫elF3‑S6基因的表达后，昆虫因蜕皮困难死亡。本发明为基于RNA干扰的害虫防治提供新的靶标。

Description

昆虫m6A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因的dsRNA及其应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域。具体涉及昆虫m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因的dsRNA及其应用。

背景技术

农业害虫危害是制约我国农业产量的重要因素。目前，在害虫防治工作中，主要以化学防治为主，即化学杀虫剂。随着各类化学杀虫剂的长期大量使用，昆虫逐渐产生较高的抗药性从而降低防治效率，进一步促使化学杀虫剂的过度使用，造成严重的环境污染，对生态环境及粮食安全生产造成了巨大的损害。

化学防治技术的诸多问题已经使得人们不得不寻求开发新型的害虫防治方法。2006年获诺贝尔奖的RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，是一种由双链RNA分子介导的同源RNA高效特异性沉默技术。RNAi技术由于其对靶标基因沉默的特异性和高效性，自一出现便显示出强大的应用潜力，该技术为基因功能、人类疾病治疗和农作物害虫防治等方面的研究都开辟了新途径。基于RNA干扰技术进行害虫防治具有如下特点：1)杀虫具有专一性，选择对害虫专一的基因进行干扰，对非靶标生物无杀伤作用；2)RNA在自然界极易降解、无残留；3)对环境无毒无害，相对安全。因此RNAi技术是一种理想的害虫种类特异的防治体系。

RNA的m⁶A甲基化修饰作为表观遗传学研究的重要内容，承载着许多生物学功能。近几年的研究表明，在昆虫中，m⁶A甲基化修饰通过改变基因的表达方式，可以直接影响昆虫的发育分化。因此昆虫m⁶A甲基化修饰基因已被认为新型杀虫剂作用的靶标。m⁶A甲基化阅读蛋白在昆虫发育分化过程中起着关键作用，采用RNA干扰技术，开展m⁶A甲基化阅读蛋白dsRNA在害虫防治中的应用具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种调控昆虫蜕皮发育的m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因dsRNA及其应用。

本发明提供的一种昆虫m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因片段1，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。获得方法包括以下步骤：基于昆虫的转录组数据库，采用生物信息学方法对昆虫m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因进行搜索，经过序列分析和比对后，获得编码m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6的核苷酸序列SEQ ID NO：1，设计上下游引物SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4，PCR扩增获得，命名为elF3-S6，其长度为1314bp，编码437个氨基酸。

本发明提供的一种昆虫m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因片段2，其核苷酸序列是SEQ ID NO：2，是根据SEQ ID NO：1设计上游引物序列为SEQ ID NO：5和下游引物序列为SEQID NO：6，通过PCR扩增获得。进一步通过T7RiboMAX^TM Express RNAi System(Promega)试剂盒体外转录合成elF3-S6基因的dsRNA。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明提供的昆虫m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因的dsRNA，可以显著抑制昆虫m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因的表达，从而导致昆虫蜕皮困难死亡。

2、本发明提供的m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因的dsRNA用于害虫防治具有专一性和高效性，其仅对飞蝗有杀伤作用，不会对其他非靶标生物造成危害，并且其在自然界易降解、残留低，也不会破坏生态环境。

附图说明

图1：本发明实施例试验中4龄第1天飞蝗若虫注射dsRNA后elF3-S6基因的表达量变化。β-actin为内参基因(左侧为注射dsGFP的对照组，右侧为注射dsRNA的实验组，***P<0.001)。

图2：本发明实施例试验中4龄第1天飞蝗若虫注射dsRNA后对飞蝗发育影响的结果对照图(左侧为注射dsGFP的对照组，右侧为注射dsRNA的实验组)。

图3：本发明实施例试验中4龄第1天飞蝗若虫注射dsRNA后对飞蝗生存曲线的影响。(“实线”为注射dsGFP的对照组，“虚线”为注射dsRNA的实验组)。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明的技术方案，下面结合附图及实施例对本发明进行进一步详细说明。

实施例1：飞蝗m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因片段1的获得

a,基于果蝇和飞蝗的转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因进行搜索，经过序列分析和比对后，获得编码m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6核苷酸序列。采用Primer Premier5.0软件设计特异性引物，上游引物序列为SEQ ID NO：3，下游引物序列为SEQ ID NO：4，所有引物均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。

b,选取生长健康、雌雄各半、大小一致飞蝗四龄若虫，快速解剖其表皮组织，3头一组，3个生物学重复，冷冻于液氮中，参照Invitrogen Trizol试剂盒提取RNA。利用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒去除基因组DNA，并进行反转录合成第一链cDNA。以此cDNA为模板，PCR扩增获得m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因片段1，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确定大小正确后，与pLB-Simple载体相连接，转化至DH5α感受态细胞中，经菌落PCR检测大小正确后，送往华大生物科技有限公司测序，测序结果与转录组搜索结果比对，验证并获得编码该基因的核苷酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

实施例2：飞蝗m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因片段2的获得

根据实施例1获得的飞蝗m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因片段1的核苷酸序列，采用Primer Premier5.0软件设计特异性的引物，上游引物序列为SEQ ID NO：5，下游引物序列为SEQ IDNO：6，所有引物均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。以上述飞蝗m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因片段1克隆载体质粒为模板，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6为上下游引物，PCR扩增获得m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因片段2。

实施例3：飞蝗m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因片段2的dsRNA的获得

用实施例2获得的m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因片段2，经

SV Gel andPCR Clean-Up System(Promega)试剂盒纯化后，参照T7RiboMAX^TM Express RNAi System(Promega)试剂盒说明体外转录合成dsRNA，得到的dsRNA用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测其单一性，以绿色荧光蛋白基因GFP为对照，合成dsGFP，使用NanoDrop 2000进行定量至终浓度达到2.5μg/μl，保存于-80℃冰箱备用。

实施例4：飞蝗m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因dsRNA致死飞蝗试验

1)飞蝗m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因dsRNA注射

本发明选取大小一致、生长健康、雌雄各半4龄第1天飞蝗若虫作为实验对象。将2μl合成的dsRNA用25μl规格微量注射器，顺着血液流动的方向，注射到若虫侧腹部第2-3腹节之间。注射剂量为5μg/头，并设置dsGFP(5μg)的对照组，实验组36头、对照组40头。注射完毕后，将飞蝗若虫饲养在通风良好的15cm×15cm×13cm的塑料网状笼内，饲养条件为光照：黑暗时间＝14h:10h，温度30±2℃，湿度60％，每天饲喂撒有麦麸的新鲜小麦幼苗。

2)飞蝗m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因沉默效果检测

收集注射dsGFP和dselF3-S6的飞蝗若虫，每组3只，雌雄各半，实验组和对照组均取6个生物学重复。采用Trizol法提取总RNA，采用PrimeScript^TM RT reagent Kit withgDNA Eraser反转录获得第一链cDNA，利用Real-time PCR方法分别检测目的基因elF3-S6和管家基因β-actin的相对表达量，对其沉默效率进行计算。如图1所示，结果表明，与对照组比较，注射dselF3-S6后，实验组飞蝗m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因表达显著降低，其沉默效率达99％。

3)注射dsRNA后飞蝗表型的观察

如图2所示，4龄若虫注射dsRNA后，对照组在8天后全部成功蜕皮至5龄，且蜕皮后生长发育状况良好。而实验组注射dselF3-S6后，有34头无法成功蜕皮直至死亡，死亡率达到94.4％，同时有2头若虫可以成功蜕皮至下一龄期，但在5龄第3天时死亡。

4)注入dsRNA后飞蝗死亡情况的观察

如图3所示，注射dsRNA的飞蝗实验组死亡率为100％。这与注射dsGFP的对照组(死亡率为2.5％)相比，致死效果明显。

序列表

<110> 首都师范大学

<120> 昆虫m6A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因的dsRNA及其应用

<141> 2022-06-16

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1314

<212> DNA

<213> Locusta migratoria

<400> 1

atggcgaagt ttgatttgac atcgacgtta ggacagtatt tggacagaca tttagttttt 60

ccgttattag aatttgtatc agcgaagcag atatacgatg aaacggaact tttgcaaggg 120

aagctggata ttctcagcaa gacaaatatg gttgattatg cgatagacat acgaaagcag 180

ttatatccgg atcaagatgt gccagagtca ctgaaacaga agagagcaga agttgtaaca 240

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gaacatcatt tcaatttgaa tatgatggac agtatgtaca agttagcaaa gtataggtat 420

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cagaactggc catctgcctt agaggacttg aataagttgc gtgaatacat tgacactacg 600

acatttgcat cagccctgca ccatttgcag caacgaacat ggttgataca ttggagtttg 660

tttgtctact atacacaccc taaaggaaaa gagctactga ttgaaatgtt cttgcatagg 720

ccgcagtatt taaatgctat ccagactatg tgcccacaca tattaaggta tctagctgct 780

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aggaaactga atgccaacag ccaagattat cggtggggag ctccagagtt ttga 1314

<210> 2

<211> 449

<212> DNA

<213> Locusta migratoria

<400> 2

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ccgttattag aatttgtatc agcgaagcag atatacgatg aaacggaact tttgcaaggg 120

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gtaatgaaca agatggagaa tcttagagat cctgaggcat ttgtgcagaa ccttataaaa 360

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<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Locusta migratoria

<400> 3

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<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Locusta migratoria

<400> 4

tcaaaactct ggagctcccc ac 22

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> Locusta migratoria

<400> 5

taatacgact cactatagga tggcgaagtt tgatttg 37

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> Locusta migratoria

<400> 6

taatacgact cactataggc tggaagacac tgcgtaa 37

Claims

1.一种飞蝗m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因片段1，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。

2.一种飞蝗m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因片段2，其核苷酸序列是SEQ ID NO：2。

3.如权利要求2所述的一种飞蝗m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因片段2合成的dsRNA。

4.如权利要求3所述的一种飞蝗m⁶A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因片段2合成的dsRNA在致死飞蝗中的应用。