CN116751798B - 亚洲小车蝗海藻糖酶基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种亚洲小车蝗海藻糖酶基因及其应用。通过生物信息学方法，从已有亚洲小车蝗转录组数据库中获取海藻糖酶基因片段，获得序列为SEQ ID NO:1基因cDNA全长序列。依据SEQ ID NO:1，设计并合成dsRNA。将上述dsRNA注入亚洲小车蝗第2‑3腹节后，dsRNA特异性地沉默海藻糖酶基因mRNA表达，干扰亚洲小车蝗几丁质代谢，从而使亚洲小车蝗难以蜕去旧表皮，导致死亡。多次实验表明干扰96小时后，存活率仅为17%，具有特异性及高的致死率，对于害虫防治具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种亚洲小车蝗海藻糖酶基因及其应用。
背景技术
亚洲小车蝗分布于内蒙古、河北、北京、甘肃、宁夏等草原及农牧交错区，是我国北方为害最严重的优势种蝗虫之一。对北方草原地区造成严重危害，直接威胁到农牧业生产。因其防治仍以化学防治为主，每年大量的农药用于草原及农牧交错区而引发蝗虫对多种杀虫剂产生了抗药性。因此，新型环保治蝗技术的研发已经迫在眉睫。
RNA干扰(RNAi)是指通过导入与内源性mRNA编码区同源的dsRNA时，该mRNA发生降解而导致目标基因表达沉默的现象，沉默目标基因使其正常生物功能减弱或者缺失达到确定基因生物功能的目的。基于RNAi进行害虫防治的前提是筛选靶标序列获得对昆虫具有高致死作用的dsRNA。
几丁质是昆虫表皮及围食膜等部位的重要组成成分，由于人和其他高等动物并没有几丁质，因此昆虫几丁质代谢中的关键酶基因已被公认为新型杀虫剂作用的靶标。海藻糖酶能将海藻糖水解为葡萄糖，通过糖酵解为各个组织器官提供能量，或为几丁质合成提供原料，因而海藻糖酶在昆虫体内起着非常重要的作用。通过dsRNA特异性地沉默海藻糖酶基因mRNA表达，通过RNA干扰，干扰亚洲小车蝗几丁质代谢，使亚洲小车蝗难以蜕去旧表皮，导致死亡，从而达到生物防治的目的，提供环保治蝗技术，是目前急需进行的研究课题。
因此，现有技术中亟需一种亚洲小车蝗海藻糖酶基因、亚洲小车蝗海藻糖酶基因RNA干扰序列片段及亚洲小车蝗海藻糖酶基因RNA干扰序列片段合成的dsRNA在亚洲小车蝗防治中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供亚洲小车蝗海藻糖酶基因、亚洲小车蝗海藻糖酶基因RNA干扰序列片段及亚洲小车蝗海藻糖酶基因RNA干扰序列片段合成的dsRNA在亚洲小车蝗防治中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种亚洲小车蝗海藻糖酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。设计相应的简并引物后，通过PCR扩增获得其保守区，产物经琼脂糖凝胶电泳检测其片段长度为1601 bp，同时经测序获得其cDNA全长，并命名为OasiTRE1，其全长为1868 bp，开放阅读框为1587bp，编码528个氨基酸。
亚洲小车蝗海藻糖酶基因的RNA干扰序列片段，核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。根据SEQ ID NO:1设计上下游引物，经PCR扩增获得。
进一步利用相关试剂盒，根据相应的干扰序列片段合成dsRNA。本发明提供亚洲小车蝗海藻糖酶基因的RNA干扰序列片段合成的dsRNA。
该dsRNA在亚洲小车蝗防治中的应用，注射dsRNA到亚洲小车蝗2-3腹节，dsRNA可特异性地沉默海藻糖酶基因mRNA表达，干扰亚洲小车蝗几丁质代谢，使亚洲小车蝗难以蜕去旧表皮，直至死亡，在48 h达到最大干扰效率，相对表达量为69.98%。
本发明的有益效果是：本发明获得了亚洲小车蝗海藻糖酶基因、亚洲小车蝗海藻糖酶基因RNA干扰序列片段及由亚洲小车蝗海藻糖酶基因RNA干扰序列片段合成的dsRNA，提供了将该dsRNA用于亚洲小车蝗防治的生物学防治方法，通过dsRNA特异性地沉默海藻糖酶基因mRNA表达，通过RNA干扰，干扰亚洲小车蝗几丁质代谢，使亚洲小车难以蜕去旧表皮，导致死亡，提供环保治蝗技术，可有效减少化学杀虫剂的使用，保护环境，提高经济收益，降低生产成本，市场应用前景好。
附图说明
图1为琼脂糖凝胶检测亚洲小车蝗OasiTRE1转录组cDNA序列长度（M为DL2000 DNAMarker，条带从小到大依次为100、250、500、750、1000、2000 bp，1为亚洲小车蝗OasiTRE1基因条带大小）；
图2为注射dsOasiTRE1（即dsRNA）后亚洲小车蝗表型变化（dsOasiTRE1为注射dsRNA的实验组，dsGFP为对照组）；
图3为注射dsOasiTRE1在12、24、48和72 h后基因的表达（dsGFP为对照组，其余为注射dsRNA的实验组）；
图4为注射dsOasiTRE1在12、24、48、72和96 h后的亚洲小车蝗存活率统计分析。
实施方式
以下结合附图对本发明作详细描述。
实施例1：亚洲小车蝗OasiTRE1基因cDNA全长序列获得及氨基酸序列分析
1.亚洲小车蝗OasiTRE1基因cDNA片段获得
基于已有亚洲小车蝗转录组数据库，对其Unigene进行搜索，经NCBI Blastx分析后，确定获得亚洲小车蝗OasiTRE1基因片段。
2.亚洲小车蝗OasiTRE1基因cDNA全长序列获得
将上述基因片段通过GeneDoc软件进行拼接，并采用primer premier 5.0软件设计上下游引物：
上游引物OasiTRE1F：5’-ATGAAGCAGAAAAAACCGTC-3’
下游引物OasiTRE1R：5’-CCATCAGCTGAAATCTATATTCTT-3’
本发明所用引物均由北京厚生博泰生物技术有限公司合成。
选取生长健康、大小一致、雌雄各半的4龄蝗蝻，在体式显微镜下将蜕皮后12、24、48和72 h蝗蝻表皮迅速解剖并冷冻于液氮中。每头蝗蝻均采用如上方式处理，共设3组生物学重复，依照Promega的Eastep® Super Total RNA Extraction Kit试剂盒提取RNA。采用GoScript® Reverse Transcription Mix, Oligo(dT)试剂盒将所提RNA反转录成第一链cDNA，以此做为模板，结合设计的上下游引物，通过PCR扩增后送测，获得亚洲小车蝗OasiTRE1基因cDNA全长片段，通过TIANgel Midi Purification Kit试剂盒（天根）进行PCR产物回收和纯化后克隆到pMD18-T载体（Promega）中，再转入大肠杆菌感受态细胞E. coliDH5α（天根）中，对菌液进行培养后，采用TIANprep Mini Plasmid Kit试剂盒（天根）提取质粒，检测后，将菌液送往北京厚生博泰生物技术有限公司进行测序，测序得到核苷酸为SEQID NO :1。
如图1所示，琼脂糖凝胶检测亚洲小车蝗OasiTRE1转录组cDNA序列长度为1601bp，经北京厚生博泰生物技术有限公司测序得到亚洲小车蝗OasiTRE1基因全长序列，序列长度为1868 bp，开放阅读框为1587 bp，编码528个氨基酸。
3.亚洲小车蝗OasiTRE1基因氨基酸序列分析
通过ExPaSy在线软件对已获得的亚洲小车蝗OasiTRE1基因核苷酸进行翻译，预测亚洲小车蝗OasiTRE1的开放阅读框编码528个氨基酸，分子量为61.33KD，等电点为6.57，功能域预测发现不具有信号肽，亚洲小车蝗OasiTRE1氨基酸序列与东亚飞蝗（Locusta migratoria manilensis）LmTRE1基因的氨基酸序列的同源度达到90%以上。
实施例2：亚洲小车蝗OasiTRE1的dsRNA合成
1.亚洲小车蝗OasiTRE1基因dsRNA的引物设计
基于亚洲小车蝗OasiTRE1基因序列，采用primer premier5.0软件设计dsRNA引物（含T7启动子：taatacgactcactataggg），其干扰序列为SEQ ID NO :2：
上游引物OasiTRE1-RNAiF：
5’-taatacgactcactatagggTGAAAGAAAATCCCGACAGGT-3’
下游引物OasiTRE1-RNAiR：
5’-taatacgactcactatagggATTTTCACGGGCTTCATCTG-3’
本发明所有引物均由北京厚生博泰生物技术有限公司合成。
2.基于亚洲小车蝗OasiTRE1基因特异性dsRNA合成
以上述亚洲小车蝗海藻糖酶基因提取质粒为模板，用含有T7启动子序列上下游引物进行PCR扩增。得到长度为497 bp的基因片段（SEQ ID NO :2）。采用TIANgel MidiPurification Kit试剂盒（天根）对PCR产物进行回收和纯化后按照T7 RiboMAXTM ExpressRNAi System（Promega）试剂盒说明体外转录合成dsRNA。检测其浓度，确保dsRNA浓度至少达到300 ng/μL，并存于-80℃超级低温冰箱备用。
实施例3：亚洲小车蝗OasiTRE1基因的dsRNA干扰实验
1.特异性dsRNA注射
选取60头生长健康、大小一致雌雄各半的4龄3天蝗蝻进行实验。使用0.26 mm规格微量注射器（SHIMADZU，Japan）将5 μL(1000 ng/µL)合成的dsRNA（即dsOasiTRE1）轻轻注射进入蝗蝻腹部的2-3腹节之间。同时选取60头蝗蝻设立为对照组，注射相同体积和浓度的dsGFP至对照组体内。将注射后亚洲小车蝗置于通风良好的养虫笼内（白天温度控制在25±2℃，晚上21±2℃、相对湿度40±5%、光暗周期14 h：10 h条件），每天饲喂新鲜小麦幼苗和麦麸，选取处理后12、24、48和72 h蝗蝻迅速解剖并冷冻于液氮中。
2.亚洲小车蝗OasiTRE1基因的沉默检测
收集注射dsOasiTRE1后12、24、48、72 h的蝗蝻，同时选取注射相同头数的dsGFP蝗蝻设立为对照组，进行总RNA提取，并反转录成第一链cDNA，采用Real-time PCR方法检测目的基因(OasiTRE1)和内参基因(β-actin)的相对表达量，从而对其沉默效率进行计算。结果表明，与对照组比较，注射dsOasiTRE1后不同处理时间下，处理组表达显著降低，参见图3，在48 h干扰效率达到最大，相对表达量为69.98%。每组设置3个生物学重复，每个生物学重复取3头蝗蝻。
3.注射dsRNA后4龄蝗蝻表型观察
如图2所示，4龄蝗蝻注射dsRNA后，对照组蝗蝻全部正常生长发育至成虫，注射dsOasiTRE1后实验组蝗蝻出现身体白色部分变红、背板、腿部等出现黑色小圆点，尽管有些蝗蝻可以蜕皮长翅，但翅发育不完全；参见图4，图中横轴表示时间，纵轴表示存活蝗蝻头数，注射dsOasiTRE1 96小时后，亚洲小车蝗实验组存活10头，存活率仅为17%，这与注射dsGFP的对照组（96小时后存活55头，存活率为92%）相比，致死效果明显。害虫防治研究主要采用注射法及饲喂法，两种方法具有同样作用原理及效果，本发明采用注射法进行实验研究。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (3)
1.一种亚洲小车蝗海藻糖酶基因的RNA干扰片段，其特征在于：核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
2.根据权利要求1所述的亚洲小车蝗海藻糖酶基因的RNA干扰片段合成的dsRNA。
3.根据权利要求2所述的dsRNA在亚洲小车蝗防治中的应用，通过所述dsRNA特异性地沉默海藻糖酶基因mRNA表达，干扰亚洲小车蝗几丁质代谢，使亚洲小车蝗难以蜕去旧表皮，直至死亡。
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| 亚洲玉米螟幼虫膜结合海藻糖酶基因RNAi效应;靳婷婷;戈峰;吴杰;;中国生物防治学报(03);全文 * |
| 飞蝗可溶型海藻糖酶基因的序列分析及mRNA表达特性;刘晓健;张欢欢;李大琪;崔淼;马恩波;张建珍;;昆虫学报(11);全文 * |
| 飞蝗海藻糖酶基因的分子特性及功能;刘晓健;孙亚文;崔淼;马恩波;张建珍;;中国农业科学(22);全文 * |
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