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CN114540230B - 适合鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基的制备方法及其应用 - Google Patents

适合鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基的制备方法及其应用 Download PDF

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CN114540230B
CN114540230B CN202210171343.9A CN202210171343A CN114540230B CN 114540230 B CN114540230 B CN 114540230B CN 202210171343 A CN202210171343 A CN 202210171343A CN 114540230 B CN114540230 B CN 114540230B
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Abstract

本发明公开了一种鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基M‑MRS的制备方法：酵母提取物/牛肉膏/蛋白胨，溶解在超纯水中，通过加入无水乙醇沉淀法来进行脱多糖处理，上清液除去乙醇；对应得到脱多糖酵母提取物/脱多糖牛肉膏/脱多糖蛋白胨；所述脱多糖酵母提取物/脱多糖牛肉膏/脱多糖蛋白胨用于配制培养基。本发明还同时公开了鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，所涉及的鼠李糖乳杆菌(Lactobacilus rhamnosus)ZFM216的保藏编号为：CCTCC NO:M2020325。本发明的鼠李糖乳杆菌胞外多糖用于制备功能性食品。

Description

适合鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物学中的多糖技术领域，具体涉及到一种鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基的研制及胞外多糖的制备和多糖的生物活性。
背景技术
鼠李糖乳杆菌多存在于人体及动物的肠道内，具有改善胃肠道功能、增强免疫能力、增强肠道屏障功能、促进其他益生菌生长、辅助机体调节肠道微生态环境等作用，在改善食物的流变性特性，提高风味特性等方面也有重要的应用。有研究表明，鼠李糖乳杆菌的这些优异的特性与其分泌的胞外多糖有要的关系。胞外多糖是部分细菌、真菌的菌体在生长代谢过程中，分泌到体外，易与菌体分离的大分子水溶性化合物，在保护机体抵御脱水、营养缺乏、有毒物质、噬菌体、渗透压和拮抗物等不利条件时有重要作用。经过分离纯化获得的鼠李糖胞外多糖组分已被证实具有抗氧化、降血脂、降血糖、降胆固醇、改善肠道微生态平衡、增强免疫力等多种生物活性。
然而，由于受到培养基成分以及培养条件的影响，鼠李糖乳杆菌胞外多糖(EPS)的产量一直不高，而且常用于发酵培养鼠李糖乳杆菌的MRS液体培养基，由于其组成成分中的酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨中含有较多的类似多糖的成分而又不能完全被菌体代谢消耗，会与菌株分泌的胞外多糖混在一起，而又难以去除，对于胞外多糖定量和定性产生了干扰。有研究使用一些改良的培养基，但这些培养基成分中或多或少都含有酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨中的一种或多种成分，不能完全排除干扰。此外也有使用乳清培养基、半定义培养基来避免来自组成成分的干扰，但受制于菌株生长状态不佳等原因，胞外多糖的会出现产量较低情况。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以避免被培养基组成成分干扰的鼠李糖乳杆菌产多糖的培养基的制备方法，以及最佳的产胞外多糖发酵条件和所用菌。
为解决上述技术问题，本发明提供一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacilus rhamnosus)ZFM216，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2020325。
本发明还提供了一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖：利用保藏编号CCTCC NO:M 2020325的鼠李糖乳杆菌(Lactobacilus rhamnosus)ZFM216发酵而得。
本发明还提供了鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基的制备方法，包括以下步骤：
①、酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨的脱多糖预处理：
酵母提取物/牛肉膏/蛋白胨，溶解在超纯水中，通过加入无水乙醇沉淀法来进行脱多糖处理，上清液除去乙醇(通过旋转蒸发仪除去乙醇)；对应得到脱多糖酵母提取物/脱多糖牛肉膏/脱多糖蛋白胨；
所述脱多糖酵母提取物/脱多糖牛肉膏/脱多糖蛋白胨用于配制培养基；
②、鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基M-MRS为：7～8g酵母提取物制备而得的脱多糖酵母提取物、12～13g牛肉膏制备而得的脱多糖牛肉膏、9.5～10.5g蛋白胨制备而得的脱多糖蛋白胨、酵母氮源基础5～6g，麦芽糖21～21.5g，七水硫酸镁0.15～0.25g，硫酸锰0.04～0.06g，磷酸氢二钾1.8～2.2g，柠檬酸三铵1.8～2.2g，无水乙酸钠4.8～5.2g，吐温800.8～1.2mL，超纯水定容至1000mL，调节pH为6.5。
作为本发明培养基的制备方法的改进：
所述鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基M-MRS为：7.5g酵母提取物制备而得的脱多糖酵母提取物、12.5g牛肉膏制备而得的脱多糖牛肉膏、10g蛋白胨制备而得的脱多糖蛋白胨、酵母氮源基础5.51g，麦芽糖21.23g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，无水乙酸钠5g，吐温80 1mL，超纯水定容至1000mL，调节pH为6.5。
说明：
所述鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基使用前需按照常规方式灭菌，即，高压锅115℃灭菌20min。
在本发明中，通过单因素试验设计、Plackett-Burman试验设计以及Box-Behnken试验设计等数理统计方法，对影响胞外鼠李糖乳杆菌胞外多糖产量的碳源种类及用量、氮源用量、培养时间、培养温度、初始pH、接种量等培养条件及进行优化，从而获得鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基M-MRS的配方及最佳的产胞外多糖的发酵条件。
作为本发明培养基的制备方法的进一步改进，步骤1)为：
以酵母提取物/牛肉膏/蛋白胨作为原料，按照10g/100mL的料液比，将原料溶解在超纯水中，得原料溶液；
在原料溶液中加入4体积倍的预冷(4℃)的无水乙醇；于4℃中沉淀24±2小时，离心(10000rpm，15min)后收集上清液，去除(通过旋转蒸发仪去除)上清液中的乙醇，从而对应获得脱多糖酵母提取物/脱多糖牛肉膏/脱多糖蛋白胨。备用。
本发明还同时提供了一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
1)、将鼠李糖乳杆菌(Lactobacilus rhamnosus)ZFM216接种于鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基M-MRS，培养后，得发酵培养液；
2)、将发酵培养液灭活(于100℃水浴15分钟)，得灭活后发酵培养液；
说明：此步骤是为了灭活发酵液中的可能降解胞外多糖的酶和菌体；
3)、将灭活后发酵培养液离心(10000rpm转速下离心15分钟，目的是为了离心除菌体)后收集发酵上清液，得去除菌体的上清液；将所述去除菌体的上清液浓缩后，经三氯乙酸(TCA)处理后，得到除蛋白上清液；
4)、除蛋白上清液通过水提醇沉法提取多糖，加水复溶，得粗多糖溶液；
5)、粗多糖溶液经透析(2000Da)后浓缩、冷冻干燥，得鼠李糖乳杆菌胞外多糖。
作为本发明的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法的改进：
所述步骤1)为：将鼠李糖乳杆菌(Lactobacilus rhamnosus)ZFM216按照1％(体积比)的接种量于鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基M-MRS，于37℃静置恒温培养20小时；得发酵培养液；
所述步骤3)中去除蛋白的方法为：将去除菌体的上清液通过旋转蒸发仪60℃浓缩至原体积的20％，加入TCA使其终浓度为40mg/mL(TCA母液浓度为800mg/mL)，4℃静置12小时；离心保留上清，得除蛋白上清液。
作为本发明的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法的进一步改进，所述步骤4)的水提醇沉法为：
将除蛋白上清液，加入4倍体积4℃预冷的无水乙醇，4℃静置12小时，离心所得沉淀自然干燥后加入无菌超纯水复溶，得粗多糖溶液；
所述无菌超纯水为除蛋白上清液体积的18～22％(优选1/5)。
作为本发明的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法的进一步改进，所述步骤5)为：
粗多糖溶液盛于2000Da透析袋于超纯水中透析72小时，每3小时换一次超纯水；透析后的粗多糖溶液经旋转蒸发仪除水，冷冻干燥24小时后得到为鼠李糖乳杆菌胞外多糖。
本发明还同时提供了如上述任一方法制备而得的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的用途：用于制备功能性食品。
说明：鼠李糖乳杆菌胞外多糖具有良好的生物活性，如抗氧化活性、免疫调节活性等。
综上，本发明提供了一种发酵CCTCC NO:M 2020325的鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基的制备方法和菌株的发酵条件，解决目前MRS液体培养基中酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨等原材料存在的多糖类似物对菌株产胞外多糖的干扰，并提高菌株的胞外多糖产量。
本发明的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)是从新鲜牛奶中筛选获得，代号为ZFM216，通过16S rDNA序列鉴定该菌株属于鼠李糖乳杆菌亚种。
该菌株的保藏信息如下：
保藏名称：鼠李糖乳杆菌ZFM216 Lactobacillus rhamnosus ZFM216，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M2020325，保藏时间2020年7月17日。
本发明所得的鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基M-MRS和传统的MRS培养基的区别在于：本发明对MRS培养基的原材料(酵母提取物/牛肉膏/蛋白胨)进行了脱多糖处理避免多糖干扰，使用麦芽糖作为碳源(而常规的MRS培养基中，以葡萄糖作为碳源)，添加了酵母氮源基础保证培养基营养物质的充足，且进行碳、氮源用量等因素的优化使得胞外多糖的产量达最优。
本发明的菌株在M-MRS液体培养基中培养20小时，胞外多糖产量可达496.64±3.15mg/L，比未进行优化(340.1±46.54mg/L)提高了46.01％。粗多糖的Mw分子量是3.22×104Da，总糖含量是70.06％，蛋白含量是1.44％，硫酸基含量是7.04％，糖醛酸含量是17.74％；通过体外抗氧化实验和H2O2损伤小鼠巨噬细胞Raw264.7模型抗氧化实验，表明鼠李糖乳杆菌胞外多糖有较强抗氧化能力(DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力和还原力)，且胞外多糖对细胞没有毒害作用，能够提高细胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活性，降低活性氧和丙二醛水平，具有较好的促进细胞抗氧化的效果。通过小鼠巨噬细胞Raw264.7免疫调节活性实验，表明鼠李糖乳杆菌胞外多糖具有较好的免疫调节活性，能够显著增强细胞的吞噬能力，促进细胞分泌一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、细胞因子白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)，提高一氧化氮合成酶、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达。
综上，本发明提供了一种适合鼠李糖乳杆菌产胞外多糖的培养基、最佳的发酵条件和胞外多糖的提取方法，并对胞外多糖的化学抗氧化活性、细胞毒性、细胞模型抗氧化能力、细胞免疫调节活性进行了研究，为鼠李糖乳杆菌相关食品的研发提供了技术支持。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是鼠李糖乳杆菌ZFM216在MRS液体培养基中的多糖浓度变化情况。
图2是鼠李糖乳杆菌ZFM216产胞外多糖的单因素实验结果；
图2中，A为：培养时间和培养温度对多糖产量的影响，B为：初始pH和接种量对多糖产量的影响，C为：碳源及其用量对多糖产量的影响，D为：氮源用量对多糖产量的影响。
图3是鼠李糖乳杆菌ZFM216胞外多糖的体外化学抗氧化效果；
图3中，A为：多糖对DPPH自由基清除效果，B为：多糖对羟基自由基清除效果，C为：多糖对超氧阴离子自由基的清除效果，D为：多糖还原力的能力。
图4是鼠李糖乳杆菌ZFM216胞外多糖对细胞的毒性实验结果。
图5是H2O2诱导小鼠巨噬细胞Raw264.7损伤程度测试结果。
图6是鼠李糖乳杆菌ZFM216胞外多糖对Raw264.7细胞的抗氧化效果；
图6中，A为：多糖对活性氧水平的影响，B为：多糖对超氧化物歧化酶活力的影响，C为：多糖对过氧化氢酶活力的影响，D为：多糖对丙二醛含量的影响。
图7是鼠李糖乳杆菌ZFM216胞外多糖对Raw264.7细胞吞噬能力影响。
图8是鼠李糖乳杆菌ZFM216胞外多糖对Raw264.7细胞免疫调节活性；
图8中，A为：多糖对细胞释放NO的影响，B为：多糖对细胞释放IL-1β的影响，C为：多糖对细胞释放IL-6的影响，D为：多糖对细胞释放TNF-α的影响。
图9是RT-qPCR检测Raw264.7细胞的一氧化氮合成酶和细胞因子mRNA表达情况；
图9中，A为：多糖对一氧化氮合成酶mRNA的相对表达量的影响，B为：多糖对IL-1β的mRNA的相对表达量的影响，C为：多糖对IL-6的mRNA的相对表达量的影响，D为：多糖对TNF-α的mRNA的相对表达量的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、鼠李糖乳杆菌(Lactobacilus rhamnosus)菌株的获取
取1mL鲜牛奶(新希望双峰乳液奶牛养殖基地(杭州)鲜牛奶)到无菌试管中，按照10－1进行梯度稀释，吸取10－2、10－3、10－4和10－5稀释度的稀释液1ml均匀涂布于MRS平板中，放置在37℃培养箱中培养48h。挑选平板上的单菌落，接种到MRS平板上继续培养3天，将有产酸迹象的单菌落接种到乳酸菌培养基，观察菌落形态、显微形态特征，研究生理生化变化，并对细菌进行分子生物学鉴定，40％甘油保藏于-80℃保存。
所得的鼠李糖乳杆菌ZFM216活化菌株通过16S rDNA测序进行鉴定。在-80℃保存的菌株，通过在MRS固体平板上，用划线法，37℃培养箱中培养48h挑选单菌落进行活化，活化2次，在固体培养基上的发酵产物呈乳白色，菌落周围有大量粘稠状物质连接。用无菌接种环轻轻挑取菌落，有明显拉丝情况，证明该菌种的产胞外糖能力较强，选为具有产多糖能力菌株。
本发明鼠李糖乳杆菌保藏信息如下：
保藏名称：鼠李糖乳杆菌ZFM216 Lactobacillus rhamnosus ZFM216，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M2020325，保藏时间2020年7月17日。
实施例2、鼠李糖乳杆菌在常规的MRS培养基中的产多糖情况
1)、MRS培养基的配制：
MRS液体培养基：蛋白胨10g、酵母提取物5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、吐温-80 1mL、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g，加超纯水定容至1L。高温灭菌(1.1个大气压，115℃下灭菌20min)。
MRS固体培养基：在上述MRS液体培养基的基础上加入15g/L的琼脂，其余等同。
2)、鼠李糖乳杆菌MRS发酵液的制备：
活化菌株：超净台紫外灭菌30min，取出存于-80℃的Lactobacillus rhamnosusZFM216冻存管，置于常温解冻待用。取一次性灭菌接种环蘸取菌株冻存管液，在MRS固体平板上，用划线培养法活化菌株，然后置于37℃恒温培养箱中，倒置培养48h后，挑选长势较好菌落在新的MRS固体平板上划线培养48小时。
初代液体培养：于超净台中用无菌接种环挑取一个长势良好的菌落接种于10mL的MRS液体培养基，37℃静置培养20小时。
发酵液获取：取上述初代液体培养液，以1％(体积比)的接种量接种于100mL的MRS液体培养基进行液体发酵，37℃静置培养合适时间(0-32小时)后，100℃水浴15分钟灭活酶及菌体离心(10000rpm的转速下离心10分钟)，收集上清液，即得发酵液。
3)、发酵液中多糖总量的变化情况：
发酵液除蛋白质：发酵液通过旋转蒸发仪(蒸发温度约为60℃)除去水分至原体积的1/5，即，约20mL时，加入TCA使其终浓度为40mg/mL(所用TCA母液浓度为800mg/mL)，4℃静置12小时；离心(10000rpm的转速下离心10分钟)保留上清即为除蛋白质后的上清液。
粗多糖获取：向除蛋白质后的上清液，加入4倍体积4℃预冷的无水乙醇，置于4℃沉淀12小时，10000rpm离心15分钟，保留沉淀，室温干燥至恒重后，加4mL超纯水复溶，得粗多糖溶液。
透析：上述粗多糖溶液4mL盛于2000Da的透析袋，放入盛有超纯水的2L烧杯中(每个烧杯中透析袋的数量不超过4个)，透析72小时，每3小时更换1次超纯水(每次超纯水的用量为2L)，透析结束后收集透析袋内液体，旋转蒸发仪(60℃)浓缩至原体积的20％，冷冻干燥机(-60℃)干燥24小时，得粗多糖。
绘制产胞外多糖曲线：MRS培养基发酵菌体培养32小时，每2小时测一次发酵液多糖浓度。通过苯酚硫酸法测发酵液中的总糖浓度，用于表示发酵液中的多糖含量，以培养时间为横坐标，发酵液多糖含量为纵坐标绘制鼠李糖乳杆菌在MRS液体培养基中的发酵液中的多糖变化曲线，未接种鼠李糖乳杆菌ZFM216的MRS作为对照，结果见图1。结果表明MRS培养基中原先就存在一些类似多糖的物质，含量为964.49±3.96mg/L，这些物质随时间并不会出现减少的情况，而接种菌株的MRS发酵液中多糖总量的变化出现逐渐下降后稳定的情况，最终含量为582.30±4.85mg/L，说明原材料中存在的类似多糖的物质可能是菌株的能够代谢和利用的，而随着菌株的生长，原材料中不能被利用的多糖的及未被代谢掉的多糖和菌株产生的胞外多糖混杂在一起，后期无法分别开，因此MRS不能够用来发酵鼠李糖乳杆菌收集其产生的胞外多糖。
为明确原材料中存在的多糖的来源，将配制1L的MRS培养基用量的酵母提取物5g、牛肉膏10g、蛋白胨10g，按照质量/体积为10％的比例充分溶解在超纯水中，然后加入4倍体积4℃预冷的无水乙醇，置于4℃中沉淀12小时，将所得沉淀物经过除蛋白和2000Da透析袋透析(在室温条件下干燥至恒重后加10mL超纯水复溶后，加入TCA使其终浓度为40mg/mL，4℃静置12小时；离心保留上清即为除蛋白质后的上清液。上清液装入2000Da透析袋，透析72小时，每3小时更换1次超纯水)，透析结束后收集透析袋内液体，旋转蒸发仪除去水分后，加入4mL超纯水复溶后，测量总糖含量，酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨中的多糖含量分别为312.25±5.12mg/L，489.37±7.83mg/L，134.02±5.34mg/L，这些占MRS培养基中多糖的约97％，证实了MRS培养基中存在的多糖的主要来源。
综上可知：现有的MRS培养基由于原材料中存在的多糖，用来发酵菌株产多糖并不妥。
实施例3、鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基的制备
1)、酵母提取物、牛肉膏和蛋白胨按如下进行脱多糖处理：
将酵母提取物/牛肉膏/蛋白胨按照设定的质量/体积为10％(酵母提取物按5g/50mL，牛肉膏、蛋白胨按10g/100mL)的比例充分溶解在超纯水中，然后加入4倍体积4℃预冷的无水乙醇，置于4℃中沉淀12小时；所述上清液通过10000rpm，15min离心收集，再通过旋转蒸发仪(约60℃)去除上清液中的乙醇，分别对应脱多糖后的酵母提取物/牛肉膏/蛋白胨；备用。
其他条件按MRS液体培养基来配制培养基；
2)、酵母提取物、牛肉膏和蛋白胨在以上脱多糖处理的基础上，对可能影响菌株胞外多糖产量的培养时间(0-32h)、培养温度(27、32、37、42、47℃)、菌株接种量(1、3、5、7、9％)、初始pH(5、5.5、6、6.5、7、7.5、8)、碳源及其用量(葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖；5-25g)，氮源用量(酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨；未脱多糖之前的质量2.5-15g)，酵母氮源基础用量(1-6g)进行单因素试验。单因素试验结果如图2。
图2C中显示：麦芽糖表现最好。
由试验结果可知：菌株分别在：培养时间为20小时，培养温度为37℃，初始pH为6.5，碳源为15g麦芽糖，酵母提取物用量为7.5g，牛肉膏用量为12.5g，蛋白胨用量为10g，酵母氮源基础用量为3g时，多糖产量具有最佳表现，多糖产量为340.14±6.54mg/L。
3)、在单因素试验的最佳结果基础上，使用Design Expert软件进行Plackett-Burman试验设计，进行筛选，筛选出多糖产量影响显著的因子，对设计方案及EPS产量的实验结果如表1。
表1、Plackett-Burman实验设计及胞外多糖产量
4)、根据Plackett-Burman实验设计的结果，筛选出3个影响最为极显著的因素(麦芽糖，酵母氮源基础、初始pH)进行Box-Behnken实验设计，实验设计及结果如表2，根据实验结果通过软件计算得二阶方程：
Y＝494.32+24.14A+23B+6.21C-19.66AB-2.44AC-24BC-39.19A2-36.28B2-46.2C2
根据二阶方程，当麦芽糖21.23g，酵母氮源基础5.51g、初始pH为6.5时，胞外多糖预测最高产量为500.16mg/L，按照此条件进行发酵实验验证，实际胞外多糖产量为496.64±3.15mg/L，接近预测值，证明模型可行，能够较好的进行模拟。
表2、Box-Behnken实验设计及胞外多糖产量
5)、综上，鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基组成的优选配方为：酵母提取物7.5g制备而得的脱多糖酵母提取物、牛肉膏12.5g制备而得的脱多糖牛肉膏、蛋白胨10g制备而得的脱多糖蛋白胨、酵母氮源基础5.51g，麦芽糖21.23g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，无水乙酸钠5g，吐温80 1mL，超纯水定容至1000mL，调节pH为6.5，高压锅115℃灭菌20min，由此获得的培养基命名为M-MRS液体培养基。
鼠李糖乳杆菌产胞外多糖的优选发酵条件为：菌株按照1％(体积比)的接种量在M-MRS液体培养基中37℃静置恒温培养20小时，得发酵培养液，在此条件下鼠李糖乳杆菌ZFM216胞外多糖产量为496.64±3.15mg/L。
实施例4、一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)、将鼠李糖乳杆菌(Lactobacilus rhamnosus)ZFM216接种于鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基M-MRS，培养后，得发酵培养液；
具体如下：
鼠李糖乳杆菌(Lactobacilus rhamnosus)ZFM216按照1％(体积比)的接种量在100mL的M-MRS液体培养基中37℃静置恒温培养20小时，得发酵培养液。
2)、将发酵培养液灭活(于100℃水浴15分钟)，得灭活后发酵培养液；
说明：此步骤是为了灭活发酵液中菌体以及可能降解胞外多糖的酶；
3)、将灭活后发酵培养液离心(10000rpm转速下离心15分钟，目的是为了离心除菌体)后收集发酵上清液，得去除菌体的上清液；将所述去除菌体的上清液浓缩后，经三氯乙酸(TCA)处理后得到除蛋白上清液。
去除蛋白的方法为：将上述去除菌体的上清液通过旋转蒸发仪60℃浓缩至原体积的20％(约20mL)，加入TCA使其终浓度为40mg/mL(TCA母液浓度为800mg/mL)，4℃静置12小时；离心(10000rpm转速下离心15分钟)保留上清，得除蛋白质上清液。
4)、除蛋白上清液通过水提醇沉法提取多糖，加水复溶，得粗多糖溶液；
具体如下：
向除蛋白上清液，加入4倍体积(约80mL)4℃预冷的无水乙醇，4℃静置12小时，离心(10000rpm离心15分钟)所得沉淀自然干燥(室温干燥至恒重后)后加入无菌超纯水复溶，得粗多糖溶液；
所述无菌超纯水为除蛋白上清液体积的1/5(约4mL)。
5)、粗多糖溶液经透析(2000Da)后浓缩、冷冻干燥，得鼠李糖乳杆菌胞外多糖。
具体如下：
透析：上述粗多糖溶液4mL盛于2000Da的透析袋放入盛有超纯水的2L烧杯中透析72小时，每3小时更换1次超纯水(每次超纯水的用量为2L)，透析结束后收集透析袋内液体，旋转蒸发仪(60℃)浓缩至原体积的20％，冷冻干燥机(-60℃)干燥24小时，得鼠李糖乳杆菌胞外多糖。
实验1、鼠李糖乳杆菌胞外多糖的化学组成分析
1)、总糖含量的测定
鼠李糖乳杆菌ZFM216胞外多糖及各纯化组分的总糖含量采用苯酚-硫酸法测定(Dubois,M.,Gilles,K.A.,Hamilton,J.K.,Rebers,P.A.,&Smith,F.Colorimetric methodfor determination of sugars and related substances.Analytical Chemistry 1956,28,350–356.)。
2)、蛋白质含量的测定
采用考马斯亮蓝法测定(Bradford,M.M.A rapid and sensitive method forthe quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principleof protein-dye binding.Analytical Biochemistry 1976,72,248–254.)。
3)、硫酸根含量的测定
硫酸根含量按文献采用浊度法测定(Kawai,Y.,Seno,N.,&Anno,K.A modifiedmethod for chondrosulfatase assay.Analytical Biochemistry 1969,32,314–321.)。
4)、糖醛酸含量的测定
糖醛酸含量采用硫酸-咔唑法，以葡萄糖作为标准测定(Bitter,T.,&Muir,H.M.Amodified uronic acid carbazole reaction.Analytical Biochemistry 1962,4,330–334.)。
所得结果如表3所示。
表3、鼠李糖乳杆菌胞外多糖化学组成
5)鼠李糖乳杆菌胞外多糖的分子量测定
胞外多糖的分子量采用凝胶渗透色谱(GPC)分析法。
样品处理：15mg样品溶解在超纯水中通过0.22μm的过滤器过滤之后加入5mL的样品瓶中，并加入含有0.2mol/L的0.2M NaNO3和0.01M NaH2PO4的超纯水至刻度线，超声分散后待测。
GPC分析测试条件：水相仪：Waters 1525Isocratic HPLC Pump；检测器：Waters2414Refractive Index Detector；色谱柱：PL aquqgel-OH MIXED 8μm；流动相：含有0.2MNaNO3、0.01M NaH2PO4的超纯水；流速：1mL/min；温度：30℃。标准样品为Polymer StandardsService-USA Inc.提供的窄分布聚乙二醇，分子量分别为Mp＝330000、176000、82500、44000、25300、20600、12600、7130、4290、1400、633、430。
鼠李糖乳杆菌胞外多糖的分子量检测结果如表4所示。
表4、鼠李糖乳杆菌胞外多糖分子量测定结果
实验2、鼠李糖乳杆菌胞外多糖的药效试验及结果：
一、胞外多糖的体外抗氧化实验
1.DPPH清除能力测定：将0.5mL DPPH乙醇溶液(0.2mM)与0.5mL不同浓度(1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mg/mL)的EPS样品溶液充分混合，并在37℃下在黑暗中反应1小时。在517nm波长下测定吸光度。以维生素C(Vc)作为阳性对照。
样品吸光度(多糖样品+DPPH)记作As；对照吸光度(仅多糖不含DPPH)记作Ac；空白吸光度(仅DPPH不含多糖样品)记作Ab。
多糖样品的DPPH自由基清除活性计算公式为：R＝[1-(As-Ac)/Ab]×100％，结果见图3A。
2.羟基自由基清除能力测定：将硫酸亚铁溶液(FeSO4，6mM)、过氧化氢溶液(H2O2，v/v 3％)、不同浓度的多糖样品溶液(1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mg/mL)、水杨酸乙醇溶液(9mm)和蒸馏水(各0.5ml)的混合物在37℃下培养1小时，在517nm波长下测定吸光度。Vc作为阳性对照。
样品吸光度记作As；对照吸光度(不含H2O2)记作Ac；空白吸光度(不含多糖样品)记作Ab。
多糖样品对羟基自由基清除活性计算公式同1，结果见图3B。
3.超氧阴离子自由基清除能力测定：将Tris-HCl缓冲液(3.0mL，50mM，pH 8.2)与不同浓度的多糖样品(0.5mL，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0mg/mL)的混合物在25℃下培养30min。然后，添加邻苯三酚(0.5mL，7mM)并在25℃下反应10min。添加HCl(0.5mL，10m)以终止反应。在325nm波长下测定吸光度。以Vc作为阳性对照。
样品吸光度记作As；对照吸光度(不含邻苯三酚)记作Ac；空白吸光度(不含多糖样品)记作Ab。
多糖样品对超氧阴离子的清除率计算公式同1，结果见图3C。
4.还原力测定：磷酸盐缓冲液(0.5mL，0.2M，pH6.6)、铁氰化钾溶液(K3[Fe(CN)6]、0.5mL，1.0％，w/v)和不同浓度(0.5mL，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0mg/mL)的EPS样品的混合物在50℃下培养30min。然后加入三氯乙酸(0.5mL，10％)，4500rpm离心15分钟。1mL上清液与FeCl3溶液(0.5mL，0.1％，w/v)和2.5mL超纯水充分混合。反应10分钟后，在700nm处测量吸光度。Vc作为阳性对照，结果见图3D。
由图3看出，EPS显示出较强的抗氧化能力，且EPS的抗氧化能力在试验浓度范围内呈现明显的浓度依赖性。在胞外多糖浓度为5mg/mL时，EPS对DPPH清除率是75.95％，羟基自由基清除率是45.50％、超氧阴离子清除率是56.32％，还原力约为阳性对照维他命C的61％。
二、胞外多糖对细胞的毒性测试
噻唑蓝(MTT)可以被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞不可以。二甲基亚砜(DMSO)可以溶解细胞中的甲臜，在570nm处有吸光值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，通过测量吸光值可以间接反映活细胞数量。
将100μL的RAW264.7细胞接种在96孔微孔板上，在CO2的含量为5％，温度37℃的培养箱中培养24小时。然后，移除培养基，用200μL PBS轻轻冲洗细胞两次，将100μL DMEM和不同浓度的胞外多糖样品(100、200、300、400、500、600和700μg/mL)加入孔中，持续培养24小时，不含多糖样品的DMEM作为对照。再添加10μL MTT培养4小时，然后移除培养基并添加100μL二甲基亚砜，反应1小时后在570nm处测量吸光度，结果如图4所示，通常，当细胞存活率低于90％时，样品被认为具有细胞毒性。在本实验的试验浓度范围内，多糖样品有促进RAW264.7细胞的生长，且存活率与多糖浓度呈正相关，这也表明多糖样品对细胞没有毒性作用。如图4所示，在样品浓度为300μg/mL时，EPS对细胞存活率出现明显提高作用，为对照的109.13％，当浓度达到600μg/mL时，细胞存活率最高，为对照的115.76％，而当多糖浓度达到700μg/mL时，细胞存活率略低于前一浓度，这可能与细胞生长的上限有关。
三、胞外多糖对RAW264.7细胞的抗氧化实验
1.H2O2诱导RAW264.7细胞损伤模型的建立
建立合适的氧化应激模型对研究多糖的抗氧化作用具有重要意义，如果细胞模型中的细胞存活率过高，细胞不能处于氧化应激状态，但如果细胞存活率过低，细胞将受到严重损伤，无法完成修复，当细胞存活率为50％～70％时，H2O2浓度可作为细胞氧化应激的适宜浓度。
将100μL的RAW264.7细胞按照3×104个细胞/孔的密度接种96孔微孔板上，在CO2的含量为5％，温度37℃的培养箱中培养24小时。然后移除培养基并用200μL PBS轻轻冲洗细胞两次，将100μL含有不同浓度H2O2(200至700μM，以100μM为间隔)的DMEM培养基加入孔中继续培养1小时，DMEM不含H2O2作为对照。MTT法比较不同浓度H2O2对细胞存活率的影响,结果见图5。
如图5所示，随着H2O2浓度的逐渐增加，细胞存活率逐渐降低。当H2O2浓度为500μM时，细胞存活率为63.12％。因此，选择该浓度建立H2O2损伤细胞模型。
2.活性氧水平(ROS)测定
当细胞处于氧化应激状态时，体内ROS水平显著升高。当DCFH-DA处理细胞时，可在细胞内分解为DCFH。在ROS水平较高的情况下，DCFH容易被氧化成有荧光的DCF，荧光能反映氧化强度，可通过分光光度计进行测定。EPS样品作为抗氧化剂可以结合到细胞膜上进入细胞，与细胞内外的自由基结合，阻断DCFH形成DCF。
将RAW264.7细胞(100μL，3×104细胞/孔)接种在96孔微孔板上，在CO2的含量为5％，温度37℃的培养箱中培养24小时。移除培养基，并用PBS轻轻冲洗细胞2次，添加100μL含有DCFH-DA(最终浓度25μM)的PBS，培养1小时。移除PBS，加入100μL含有H2O2(最终浓度为500μmol/L)和不同浓度的EPS样品(100、200、300、400、500、600和700μg/mL)对DMEM培养基，继续培养1小时。去除培养基后，用PBS洗涤细胞，将细胞悬浮在PBS中，用荧光酶标仪测定荧光强度，激发波长和发射波长分别为485nm和530nm。用含H2O2的DMEM(最终浓度为500μmol/L)处理的细胞(不含多糖样品)作为空白对照，Vc作为阳性对照。每个处理5个重复，结果见图6A。
从图6A可以看出，H2O2处理的模型组的荧光强度几乎是正常组的两倍。在添加多糖样品组中，较模型组，ROS水平出现降低，降低程度取决于多糖的浓度。在多糖浓度为700μg/mL时，降低活性氧水平最好。
3.超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)酶活力及丙二醛(MDA)含量测定
抗氧化酶，例如超氧化物歧化酶过氧化氢酶可清除超氧自由基，保护细胞免受自由基损伤。将RAW264.7细胞(2mL，3×104细胞/孔)接种在6孔微孔板上，在CO2的含量为5％，温度37℃的培养箱中培养24小时。移除培养基，并添加1mL含H2O2(最终浓度为500μmol/L)以及不同浓度的EPS样品(100、300、500和700μg/mL)的DMEM培养基，培养1小时。去除上清液并用PBS洗涤细胞，在冰上裂解细胞并收集裂解液进行抗氧化测定，Vc(200μmol/L)作为阳性对照，用相应试剂盒测定SOD、CAT活性及MDA含量。每个处理5个重复，结果见图6B、C、D。
在一定范围内，当体内活性氧水平出现升高，细胞过氧化物酶系统可将体内活性氧调节至正常水平。SOD可催化超氧阴离子自由基歧化生成氧气和过氧化氢，CAT可催化过氧化氢分解为氧气和水。然而，当大量的活性氧超过细胞自身的调节时，就会引起细胞氧化应激，导致体内蛋白质等生物大分子的损伤，降低酶的活性。在本实验中，如图6BC所示，正常细胞内SOD和CAT酶活性分别为52.03±4.83和8.144±0.46u/mg prot，与之相比，H2O2处理组中，两种酶的活性出现显著降低(p<0.05)，SOD降低到32.44±2.66u/mg prot，CAT降低到3.14±0.85u/mg prot。当加入多糖样品后，可以发现多糖样品对酶活性的提高起到了积极的作用，并且酶活性的提高与多糖浓度呈正相关。在700μg/mL浓度下，EPS处理细胞的SOD活性增加到44.07±5.26U/mg prot，CAT活性增加到5.43±0.58U/mg prot。
MDA是生物体内自由基脂质过氧化的最终产物，可引起蛋白质和核酸变性，并具有细胞毒性，细胞内MDA含量是反映机体潜在抗氧化能力的重要参数。如图6D所示，正常组细胞中的MDA含量为3.22±0.22nmol/mg prot，模型组MDA含量为6.93±0.45nmol/mg prot，出现显著增加(p<0.05)。加入EPS样品后，实验组MDA含量随EPS浓度的增加而降低。在700μg/mL浓度下，MDA含量降至4.09±0.31nmol/mg prot，与模型组相比有显著性差异(p<0.05)，表明EPS成分可以减少细胞内自由基，防止脂质过氧化。
四、胞外多糖对Raw264.7细胞免疫调节活性实验
1.胞外多糖对Raw264.7细胞吞噬能力的影响
吞噬作用是生物体的防御机制之一，它可以清除组织液和血液中的一些细菌、病毒和外来颗粒，吞噬活性已被广泛用作评价巨噬细胞免疫调节活性的指标。将100μL的RAW264.7细胞接种在96孔微孔板上，在CO2的含量为5％，温度37℃的培养箱中培养24小时。然后，移除培养基，用200μL PBS冲洗细胞两次，加入100μL的DMEM含有不同浓度的EPS(100、200、300、400、500、600和700μg/mL)，培养箱中继续培养24小时，LPS(1μg/mL)处理组用作阳性对照。去除上清液后，用PBS轻轻清洗细胞两次，向每个孔中添加中性红(100μL，0.1％，w/w)，并继续培养1小时。随后，去除中性红，用PBS清洗细胞两次，然后添加裂解缓冲液(200μL，冰醋酸：乙醇＝1:1)。在室温下放置2小时后，在540nm处测量吸光度。结果如图7所示，经LPS处理的细胞的吞噬活性显著高于对照组(P<0.01)。当EPS浓度达到500μg/mL之前，巨噬细胞的吞噬活性增加，之后其作用略有减弱。当浓度为500μg/mL时，吞噬活性达到最大值，为对照组的128.92％。在400-700μg/mL时，EPS的效果与阳性对照LPS相当(p<0.05)。这一结果表明，EPS可以通过促进吞噬活性激活RAW 264.7细胞。
2.一氧化氮(NO)和细胞因子释放量测定
NO是一种可以巨噬细胞的抗菌活性和抗肿瘤免疫反应的重要物质，活化的巨噬细胞可以增加一氧化氮合酶的活性，并且可以通过测量NO的浓度来测量免疫反应的程度。将1mL的RAW264.7细胞(3×105个细胞/mL)接种在24孔板上，在CO2的含量为5％，温度37℃的培养箱中培养24小时。然后，移除培养基，用PBS冲洗细胞两次，加入1mL不同浓度的胞外多糖DMEM培养液(100、200、300、400、500、600和700μg/mL)处理24小时，收集细胞上清液，通过NO定量试剂盒和ELISA试剂盒测对NO、IL-1β、IL-6和TNF-α进行测量，LPS(1μg/mL)处理组作为阳性对照。如图8A所示，EPS显著诱导原始264.7细胞产生NO(p<0.05)。当浓度为100和200μg/mL时，它们的刺激效果没有显著差异。当EPS浓度达到600μg/mL时，有最大的NO生成量，为24.07μM，与LPS处理组接近(p>0.05)。NO生成的增加表明EPS可能激活巨噬细胞的杀瘤和杀菌活性，并在宿主防御系统中发挥重要作用。
TNF-α、IL-1β和IL-6由活化的巨噬细胞产生的促炎细胞因子，可以预防宿主的外部感染，修复受损的组织和细胞，在免疫反应中发挥重要作用。如图8B、C、D所示，胞外多糖处理的细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量显著高于未处理的巨噬细胞组(对照组)(p<0.05)。随着胞外多糖浓度的增加，TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均出现先增加，后下降的情况。当胞外多糖浓度达到500μg/mL时，IL-6含量出现最大值，为18.67pg/mL，接近LPS组，随后随胞外多糖浓度的增加，含量出现下降趋势。当胞外多糖浓度达到600μg/mL时，TNF-α和IL-1β出现最大含量，分别为153.30pg/mL和35.09pg/mL，TNF-α的含量仍低于LPS组(175.22pg/mL)，IL-1β的含量接近LPS组。可以得出结论，EPS能够刺激RAW 264.7细胞，促进其分泌细胞因子，从而发挥免疫增强作用。
3.RT-qPCR检测iNOS和细胞因子mRNA表达
巨噬细胞的激活和免疫活性的增强与编码免疫相关细胞因子的基因的表达密切相关，为了从分子水平探讨EPS的免疫调节机制，采用RT-qPCR定量分析了EPS对诱导一氧化氮合酶(iNOS)、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达的影响。将1mL的RAW264.7细胞(3×105个细胞/mL)接种在24孔板上，在CO2的含量为5％，温度37℃的培养箱中培养24小时。然后，移除培养基，用PBS冲洗细胞两次，加入1mL含不同浓度胞外多糖的DMEM培养液(100、300、和500μg/mL)或LPS(1μg/mL)37℃处理24小时，弃培养基，PBS清洗2次后，收集细胞，根据Total RNA Kit II试剂盒说明说书提取总RNA。使用NanoDrop2000分光光度计(赛默飞世尔科技公司，美国)测量A260/A280吸光度比，衡量RNA的质量和浓度。通过/>III 1stStrand cDNA Synthesis SuperMix(11141ES60,上海翌圣生物科技有限公司)将RNA反转录成cDNA。根据制造商的说明，使用/>UNICON Blue qPCR SYBR Green Master Mix(11184ES08，上海翌圣生物科技有限公司)通过RT-qPCR分析编码iNOS、TNF-α、IF-1β和IF-6基因的cDNA。采用2-ΔΔCt法计算相对基因表达，以β-actin基因作为内参对照。表5列出了这些基因的引物序列。结果如图9所示，在100至500μg/mL的试验浓度下，EPS显著增加了iNOS和TNF-α、IL-1β、IL-6三种细胞因子的mRNA表达。因此，本发明中的EPS能够通过增加iNOS的和细胞因子的mRNA表达来促进免疫调节活性。
表5、引物序列
对比例1、将“鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基M-MRS”中的“7.5g酵母提取物制备而得的脱多糖酵母提取物、12.5g牛肉膏制备而得的脱多糖牛肉膏、10g蛋白胨制备而得的脱多糖蛋白胨”改成“7.5g酵母提取物、12.5g牛肉膏、10g蛋白胨”，其余等同于M-MRS，所得培养基命名为培养基MRS-1。
对比例2、将“鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基M-MRS”中的“麦芽糖21.23g”改成常规MRS培养基中所用的碳源(即，葡萄糖，21.23g)；其余等同于M-MRS，所得培养基命名为培养基MRS-2。
对比例3、取消“鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基M-MRS”中的“酵母氮源基础5.51g”，其余等同于M-MRS，所得培养基命名为培养基MRS-3。
表6、不同培养基发酵鼠李糖乳杆菌
以上述MRS-1、MRS-2、MRS-2替代实施例4中的“培养基M-MRS”，其余等同于实施例4。所得结果如表6所述：
MRS-1中多糖的总量比M-MRS还要高，其主要原因来自于原材料(酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨)未进行脱多糖处理，原材料中存在的多糖及菌株产生的胞外多糖混杂在一起，无法对鼠李糖乳杆菌实际产生的胞外多糖进行定量，按照此方法得到的多糖，也不能体现出胞外多糖的真正性能；使用MRS-2培养基发酵菌株，测得的胞外多糖总量发现，使用常规的葡萄糖作为碳源，多糖的产量不如本发明中选择麦芽糖作为碳源时的多糖产量；MRS-3培养基没有添加酵母氮源基础，胞外多糖的产量也同样不如本发明，可能在原材料脱多糖处理过程中损失了一些菌株生长的营养元素，本发明通过补充酵母氮源基础能够补充一些生长元素而导致产量上升。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江工商大学
<120> 适合鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基的制备方法及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggaatcctg tggcatccat gaaac 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taaaacgcag ctcagtaaca gtccg 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccttccgaa gtttctggca gcagc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggctgtcaga gcctcgtggc tttgg 25
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgagcacag aaagcatgat c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tacaggcttg tcactcgaat t 21
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggcaacta ttcctgaact caact 25
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caggacaggt atagattctt tccttt 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcctctctg caagagact 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgtatctctc tgaaggact 19

Claims (7)

1.鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
①、酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨的脱多糖预处理：
酵母提取物/牛肉膏/蛋白胨，溶解在超纯水中，通过加入无水乙醇沉淀法来进行脱多糖处理，上清液除去乙醇；对应得到脱多糖酵母提取物/脱多糖牛肉膏/脱多糖蛋白胨；
所述脱多糖酵母提取物/脱多糖牛肉膏/脱多糖蛋白胨用于配制培养基；
②、鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基M-MRS为：7～8g酵母提取物制备而得的脱多糖酵母提取物、12～13g牛肉膏制备而得的脱多糖牛肉膏、9.5～10.5g蛋白胨制备而得的脱多糖蛋白胨、酵母氮源基础5～6g，麦芽糖21～21.5g，七水硫酸镁0.15～0.25g，硫酸锰0.04～0.06g，磷酸氢二钾1.8～2.2g，柠檬酸三铵1.8～2.2g，无水乙酸钠4.8～5.2g，吐温80 0.8～1.2mL，超纯水定容至1000mL，调节pH为6.5。
2.根据权利要求1所述的培养基的制备方法，其特征在于：
所述鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基M-MRS为：7.5g酵母提取物制备而得的脱多糖酵母提取物、12.5g牛肉膏制备而得的脱多糖牛肉膏、10g蛋白胨制备而得的脱多糖蛋白胨、酵母氮源基础5.51g，麦芽糖21.23g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，无水乙酸钠5g，吐温80 1mL，超纯水定容至1000mL，调节pH为6.5。
3.根据权利要求1或2所述的培养基的制备方法，其特征在于所述步骤1)为：
以酵母提取物/牛肉膏/蛋白胨作为原料，按照10g/100mL的料液比，将原料溶解在超纯水中，得原料溶液；
在原料溶液中加入4体积倍的预冷的无水乙醇；于4℃中沉淀24±2小时，离心后收集上清液，去除上清液中的乙醇，从而对应获得脱多糖酵母提取物/脱多糖牛肉膏/脱多糖蛋白胨。
4.鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：利用如权利要求1～3任一项方法制备而得的鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基M-MRS，包括以下步骤：
1)、将保藏编号为CCTCC NO:M 2020325的鼠李糖乳杆菌(Lactobacilus rhamnosus)ZFM216接种于鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基M-MRS，培养后，得发酵培养液；
2)、将发酵培养液灭活，得灭活后发酵培养液；
3)、将灭活后发酵培养液离心后收集发酵上清液，得去除菌体的上清液；将所述去除菌体的上清液浓缩后，经三氯乙酸处理后，得到除蛋白上清液；
4)、除蛋白上清液通过水提醇沉法提取多糖，加水复溶，得粗多糖溶液；
5)、粗多糖溶液经透析后浓缩、冷冻干燥，得鼠李糖乳杆菌胞外多糖。
5.根据权利要求4所述的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：
所述步骤1)为：将鼠李糖乳杆菌(Lactobacilus rhamnosus)ZFM216按照1％的接种量于鼠李糖乳杆菌产胞外多糖培养基M-MRS，于37℃静置恒温培养20小时；得发酵培养液；
所述步骤3)中去除蛋白的方法为：将去除菌体的上清液通过旋转蒸发仪60℃浓缩至原体积的20％，加入TCA使其终浓度为40mg/mL，4℃静置12小时；离心保留上清，得除蛋白上清液。
6.根据权利要求5所述的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤4)为：
将除蛋白上清液，加入4倍体积4℃预冷的无水乙醇，4℃静置12小时，离心所得沉淀自然干燥后加入无菌超纯水复溶，得粗多糖溶液；
所述无菌超纯水为除蛋白上清液体积的18～22％。
7.根据权利要求6所述的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于所述步骤5)为：
粗多糖溶液盛于2000Da透析袋于超纯水中透析72小时，每3小时换一次超纯水；透析后的粗多糖溶液经旋转蒸发仪除水，冷冻干燥24小时后得到为鼠李糖乳杆菌胞外多糖。
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