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CN112080445A - 植物乳杆菌zj316和在抑制幽门螺旋杆菌方面的应用 - Google Patents

植物乳杆菌zj316和在抑制幽门螺旋杆菌方面的应用 Download PDF

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CN112080445A
CN112080445A CN202010841691.3A CN202010841691A CN112080445A CN 112080445 A CN112080445 A CN 112080445A CN 202010841691 A CN202010841691 A CN 202010841691A CN 112080445 A CN112080445 A CN 112080445A
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lactic acid
acid bacterium
lactobacillus
helicobacter pylori
supernatant
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Application number
CN202010841691.3A
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顾青
郦萍
薛冰尧
周青青
洪维鍊
赵雯
刘福东
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Zhejiang Gongshang University
Original Assignee
Zhejiang Gongshang University
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Abstract

植物乳杆菌ZJ316和在抑制幽门螺旋杆菌方面的应用,植物乳杆菌ZJ316,寄存编号为CCTCC No:M208077,用于抑制幽门螺旋杆菌的乳酸菌。

Description

植物乳杆菌ZJ316和在抑制幽门螺旋杆菌方面的应用
技术领域
本发明涉及到乳酸菌领域,尤其涉及到植物乳杆菌ZJ316和在抑制幽门螺旋杆菌方面的应用。
背景技术
机体被幽门螺杆菌感染(Helicobacter pylori)后,可导致多种胃部疾病。并且H.pylori在成人中感染率高达40%~60%,严重威胁着人们的身体健康与生活质量。目前针对幽门螺杆菌治疗普遍使用是标准三联疗法和四联疗法,可以在一定程度上根除H.pylori,但根除率仅为60%~80%。此外抗生素的长期使用也会引发腹泻、恶心、食欲紊乱等多种不良反应。因此寻找一种新型的无副作用的治疗方案迫在眉睫。
乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸、活性物质、促消化因子的革兰氏阳性菌的统称,是属于益生菌的其中一种。乳酸菌在自然界分布极为广泛,具有丰富的生物多样性,至少包含18个属,共200多种。乳酸菌具有提高人体免疫力、促进人体营养成分的吸收,抑制致病菌的生长,以达到治疗如胃炎等致病病原菌引起的疾病等多种益生功能。所以,乳酸菌目前已经被广泛应用于食品饮料制造、医药产品制造以及新型生物科学技术研发等。近年来,人们对乳酸菌的功能认知和接受程度也是比较可观的。在日常生活中,有各种各样的乳酸菌制剂已广泛应用于辅助治疗胃肠道等疾病过程中。国内外大量研究表明乳酸菌可以针对由H.pylori感染所引起的疾病达到提供辅助治疗或单独治疗效果的作用,并得到在无副作用的情况下不错的治疗效果,如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus LB、L.acidophilus La1)、唾液乳杆菌L.salivaius)、鼠李糖乳杆菌GG(L.rhamnosus GG)、干酪乳杆菌(L.casei)、格氏乳杆菌(L.gasseri LG21)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、植物乳杆菌(L.plantarum ZDY2013)等。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一植物乳杆菌ZJ316和在抑制幽门螺旋杆菌方面的应用,其中所述植物乳杆菌ZJ316能够应用于抑制幽门螺旋杆菌。
依本发明的一个方面,本发明提供了一种用于抑制幽门螺旋杆菌的乳酸菌,其特征在于,是植物乳杆菌ZJ316,寄存编号为CCTCC No:M208077。
根据本发明的一个实施例,所述乳酸菌来自于婴儿粪便。
根据本发明的一个实施例,所述乳酸菌具有耐酸性。
根据本发明的一个实施例,所述乳酸菌具有耐受胆盐性。
根据本发明的一个实施例,所述乳酸菌抗氧化能力优于鼠李糖乳杆菌LGG。
根据本发明的一个实施例,所述乳酸菌具有尿素酶活性抑制性。
根据本发明的一个实施例,所述乳酸菌对于幽门螺旋杆菌的细菌菌体具有破坏性。
根据本发明的一个实施例,所述乳酸菌适于被培养以获得发酵上清液,其中所述发酵上清液的DPPH自由基清除能力强于所述乳酸菌菌体本身。
根据本发明的一个实施例,所述乳酸菌是指包含菌体表面物质或菌体分泌物质其中的一或全部组合的培养液。
根据本发明的一个实施例,所述乳酸菌适于被培养以获得发酵上清液,其中所述发酵上清液的羟自由基清除能力强于所述乳酸菌菌体本身。
根据本发明的一个实施例,所述乳酸菌的还原能力强于鼠李糖乳杆菌L.rhamnosus LGG。
上述的用于抑制幽门螺旋杆菌的一乳酸菌,其通过如下方式筛选:
培养多种乳酸菌和幽门螺旋杆菌以获得所述乳酸菌的上清液和菌悬液以及幽门螺旋杆菌的菌悬液,其中一种所述乳酸菌为植物乳杆菌ZJ316;
接种幽门螺旋杆菌的菌悬液于一琼脂培养基;以及
注入多种乳酸菌的上清液或者是菌悬液至所述琼脂培养基形成的圆孔至形成抑菌圈,以抑菌圈最大为筛选标准。
根据本发明的一个实施例,所述乳酸菌的菌悬液的抑菌作用强于上清液。
根据本发明的一个实施例,在上述方法中,以琼脂双层牛津杯方进行抑菌圈测定。
根据本发明的一个实施例,所述筛选方法被实施为如下步骤:
活化和重悬乳酸菌、幽门螺旋杆菌,乳酸菌同时收集上清液和菌悬液,备用。
加热融化已灭菌的10mL的BHI固体培养基(1.5%琼脂),轻轻振荡混匀,倒平板,静置30分钟,等待凝固;
将灭过菌的牛津杯按照适宜间隔放置于刚倒的平板上;
将幽门螺旋杆菌菌悬液按照1%的接菌量接种于7mL BHI半固培养基(0.7%琼脂和7%小牛血清)中,充分混匀后倒入培养皿中,轻轻混匀,使培养基均匀覆盖培养皿表面无气泡;
待半固体培养基充分凝固后,用镊子将牛津杯拔出,形成的圆柱形孔洞;以及
注入100μL乳酸菌悬浮液或上清液至圆孔中,将平板放置于含有微需养袋的厌氧盒中37℃静置培养48h,直至出现明显的抑菌圈,测量抑制圈(mm)的大小,选择抑菌圈最大的乳酸菌。
根据本发明的另一方面,本发明提供了一用于抑制幽门螺旋杆菌的组合物,其包括乳酸菌和载剂,其中所述乳酸菌是植物乳杆菌ZJ316,寄存编号为CCTCC No:M208077。
根据本发明的一个实施例,所述乳酸菌为死菌或者是活菌。
根据本发明的一个实施例,所述组合物是一可供口服投药的剂型。
根据本发明的一个实施例,所述剂型是选自溶液、悬浮液、乳剂、粉末、锭剂、丸剂、糖浆、口含锭、片剂、口嚼胶、浓浆和胶囊所构成的群组
根据本发明的一个实施例,所述组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂或者稀释剂。
附图说明
图1是乳酸菌LGG和ZJ316的疏水作用力示意图。
图2是乳酸菌LGG和ZJ316的清除DPPH能力示意图。
图3是乳酸菌LGG和ZJ316的清除羟自由基能力示意图。
图4是乳酸菌LGG和ZJ316的还原能力示意图。
图5A至图5F分别是ZJ316处理幽门螺杆菌前后的扫描电镜示意图。
图6A至图6F分别是ZJ316处理前后幽门螺杆菌ZJC03的透射电镜示意图。
具体实施方式
以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例,本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
可以理解的是,术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”,即在一个实施例中,一个元件的数量可以为一个,而在另外的实施例中,该元件的数量可以为多个,术语“一”不能理解为对数量的限制。
本发明通过体外抑菌实验筛选出一株先前从婴儿粪便中筛选分离出的植物乳酸菌ZJ316为研究对象,并考察其在胃肠道中的耐受性、疏水性、凝集能力、抗氧化性和抑制尿素酶活性能力。同时观察植物乳杆菌ZJ316对幽门螺杆菌超微结构的影响。
所述植物乳杆菌ZJ316(Lactobacillus plantarum ZJ316),保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国武汉武汉大学,保藏编号CCTCC No:M208077,保藏日期2008年5月23日,其分离自婴儿粪便中。
(1)本发明利用改良版的琼脂双层牛津杯法,通过测量抑菌圈的直径大小,从13株乳酸菌中筛选出一株抑制幽门螺杆菌效果最好的菌株——植物乳酸菌ZJ316,作为之后实验的研究对象,并以鼠李糖乳杆菌LGG作为阳性对照。
(2)植物乳酸菌ZJ316具有耐酸性,并且可以在低酸环境(pH=3.0)条件下生长,在pH 3.0时处理2h、4h存活率分别为86.7±1.6%和83.0±1.0%。同时具有较强的耐受胆盐的能力,在浓度为0.3%胆盐中处理2h、4h的存活率分别为79.0±3.6%和70.3±1.5%。植物乳酸菌ZJ316除了具有在胃肠道中耐受性还具有较强的疏水性、自凝集能力和交互凝集能力,且效果均优于鼠李糖乳杆菌LGG。
(3)植物乳杆菌ZJ316抗氧化能力测定分别从清除DPPH自由基、清除羟自由基和测定还原能力三方面进行分析。实验结果显示发酵液上清液的DPPH自由基清除能力(58.33%±0.018)和还原能力(2.08±0.078)要优于菌体,菌体的羟自由基清除率(75.70%±0.035)要优于发酵液上清液,且植物乳杆菌ZJ316抗氧化能力优于鼠李糖乳杆菌LGG。
(4)植物乳杆菌ZJ316可以降低尿素酶活性,而且发酵上清液的抑制率(92.51%±0.06)明显大于菌体(67.47%±0.023)。通过扫描电镜和透射电镜观察来探究植物乳杆菌ZJ316的抗菌作用机制。结果发现,乳酸菌处理过的幽门螺杆菌的细菌菌体变形,细胞结构明显变化,细胞壁和细胞膜均有一定程度的破坏。有些菌体严重变形、胞内中心类核区缺失。证明植物乳杆菌ZJ316在体外具有明显的抑菌效果,但具体抑菌机理尚未阐明,仍需进一步研究证明。
实验材料与方法
实验菌株
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ZFM222)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum ZJ316)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus ZFM216)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei ZFM220)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus ZFM826)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ZFM814)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei ZFM811)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ZFM 829)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosusLGG、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei ZFM 815)、清酒乳杆菌(Lactobacillussakei LZ217)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei ZFM225)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri ZFM834)均为本实验室保存。幽门螺杆菌(Helicobacter pyloriZJC03)为浙江大学医学院邵逸夫医院就诊的胃炎和消化性溃疡患者的胃黏膜组织中分离得到的。
主要试剂与耗材
MRS液体培养基、哥伦比亚血琼脂基础培养基、幽门螺杆菌选择性添加剂、脑心浸出液(BHI)肉汤培养基均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。胆盐、无菌绵羊血、无菌的小牛血清、PBS缓冲液购自杭州常青化工有限公司。胃蛋白酶购自启真湖生物科技有限公司。二苯代苦味肼基自由基(DPPH)购自Sigma公司。琼脂、二甲苯、邻菲罗琳、铁氰化钾、三氯化铁、过氧化氢、三氯乙酸、氯化钠、尿素、苯酚红、戊二醛、双氧水等试剂均为国药集团化学试剂有限公司。厌氧盒、微需养产气包均购自日本三菱瓦斯化学株式会社。
实验仪器与设备
表1主要仪器与设备
Tab.1 List of main equipments
Figure BDA0002641669750000051
Figure BDA0002641669750000061
培养基及相关溶液配制
培养基的配制
MRS液体培养基的配制:称取52.4g培养基,加热溶解于1000mL超纯水中,121℃高压灭菌15分钟,备用。
MRS固体培养基的配制:称取52.4g培养基,并加入1.5%的琼脂,加热溶解于1000mL超纯水中,121℃高压灭菌15分钟,备用。
含0.3%和0.5%胆盐MRS培养基配制:在MRS液体培养基配方的基础上分别加入3g和5g胆盐,加热溶解于1000mL超纯水中,121℃高压灭菌15分钟,备用。
哥伦比亚血琼脂基础(CAB)培养基:称取9g培养基,加热溶解于1000mL超纯水中,121℃高压灭菌15分钟,备用。
脑心浸出液(BHI)肉汤培养基:称取25g培养基,加热溶解于500mL超纯水中,121℃高压灭菌15分钟,备用。
其它溶液配制
人工胃液配制:准确称取0.3g胃蛋白酶,0.2g NaCl加入到100mL超纯水中,搅拌均匀,充分溶解后分装至两个蓝口瓶中,分别用HCl调pH至2.0、3.0,再用0.22μm滤膜过滤除菌,于4℃保存待用。
0.1mmol/L DPPH:准确称取0.0394g DPPH溶于1L超纯水中,充分混匀。
2.5mmol/L邻菲罗琳:准确称取0.45g邻菲罗琳溶于1L超纯水中,充分混匀。
1%铁氰化钾:准确称取1g铁氰化钾溶于100mL超纯水中,充分混匀。
10%三氯乙酸:准确称取10g三氯乙酸溶于100mL超纯水中,充分混匀。
0.1%FeCl3:准确称取0.1g FeCl3溶于100mL超纯水中,充分混匀。
0.12%H2O2:准确称取0.12g H2O2溶于100mL超纯水中,充分混匀。
0.9%NaC1:准确称取0.9g NaCl溶于100mL超纯水中,充分混匀。
20mmo1/L尿素:准确称取1.2g尿素溶于1L超纯水中,充分混匀。
14μg/mL苯酚红:准确称取0.014g苯酚红溶于1L超纯水中,充分混匀。
2.5%戊二醛:准确称取2.5mL戊二醛加入97.5mL超纯水中,充分混匀,于4℃保存待用。
实验方法与内容
菌种活化与培养
(1)乳酸菌的活化与培养
将在-80℃甘油管冻存的乳酸菌放置室温解冻,用接种环挑取甘油管中的菌液,在灭过菌的MRS固体平板上划线接种,用封口膜封住平板,放入37℃培养箱中24h进行培养复苏,重复以上步骤,两次传代活化后,挑取乳酸菌单菌落至MRS液体培养基中,37℃恒温静置培养16-18h,菌液以8000r/min离心10分钟,收集上清液备用。用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次菌泥后,用无菌磷酸盐缓冲液重悬,备用。
(2)幽门螺杆菌的活化与培养
将在-80℃甘油管冻存幽门螺杆菌放置室温解冻,在加入抗生素以及7%无菌绵羊血的CAB血琼脂平板上划线接种,放入含有微需养袋的厌氧盒(85%N2、10%CO2、5%O2)中,37℃培养48h-72h进行复苏,经活化两代后,将菌体用BHI液体培养基冲下制成1×108CFU/mL菌悬液,备用。
抑制幽门螺杆菌生长的乳酸菌筛选
通过使用改良版的琼脂双层牛津杯法进行抑菌圈的测定。实验操作如下:
(1)将乳酸菌、幽门螺杆菌按照2.2.5.1中的方法进行活化和重悬,乳酸菌同时收集上清液和菌悬液,备用。
(2)加热融化已灭菌的10mL的BHI固体培养基(1.5%琼脂),轻轻振荡混匀,倒平板,静置30分钟,等待凝固。
(3)将灭过菌的牛津杯按照适宜间隔放置于刚倒的平板上。
(4)将幽门螺杆菌菌悬液按照1%的接菌量接种于7mL BHI半固培养基(0.7%琼脂和7%小牛血清)中,充分混匀后倒入培养皿中,轻轻混匀,使培养基均匀覆盖培养皿表面无气泡,切记不要将培养基倒入牛津杯中。
(5)待半固体培养基充分凝固后,用镊子将牛津杯拔出,形成的圆柱形孔洞。
(6)注入100μL乳酸菌悬浮液或上清液至圆孔中,将平板放置于含有微需养袋的厌氧盒中37℃静置培养48h,直至出现明显的抑菌圈,测量抑制圈(mm)的大小。选择抑菌圈最大的乳酸菌,作为之后实验的重点研究对象。
乳酸菌耐受人工胃液能力测定
将乳酸菌按照2.2.5.1中的方法进行活化和培养,制得菌悬液。菌悬液分别被接种于pH为2.0、3.0人工胃液中,充分震荡混匀后放置在37℃生化培养箱中进行培养。分别在2h、4h取样50μL,进行梯度稀释和平板涂布,37℃培养至明显出现单菌落,开始计数。每组做三个平行,以未经人工胃液处理的菌株作对照,从而计算出存活率。
乳酸菌耐受胆盐能力测定
将乳酸菌按照2.2.5.1中的方法进行活化和培养,制得菌悬液。菌悬液按3%(v/v)接种量分别接种于含0.3%、0.5%浓度胆盐的MRS液体培养基中,置于37℃生化培养箱中培养。分别在2h、4h取样50μL,进行梯度稀释和平板涂布,37℃培养至明显出现单菌落,开始计数,每组做三个平行,以不加胆盐培养的菌株为对照,从而计算出存活率。
乳酸菌疏水性的测定
将乳酸菌按照2.2.5.1中的方法进行活化和培养,制得菌悬液,并调OD600=0.5±0.05。取2mL菌悬液和2mL二甲苯充分震荡混合,在通风橱静置1h后测定下层水相的吸光值。
Figure BDA0002641669750000081
其中A0是菌悬液在600nm的初始吸光值;At是静置1h后的吸光值。
乳酸菌凝集能力的测定
(1)乳酸菌自凝集能力的测定
将乳酸菌按照2.2.5.1中的方法进行活化和培养,制得菌悬液,并调OD600=0.5±0.05,取若干灭菌1.5mL离心管,取1mL菌悬液于离心管中,室温静置培养,分别在静置1、2、3、4、5、6、24h和48h后分别吸取上层液体测600nm处的吸光值。
Figure BDA0002641669750000091
其中A0是自凝聚前在600nm的初始吸光值;At是静置t h后的吸光值。
(2)乳酸菌交互凝集能力的测定
将乳酸菌、幽门螺杆菌按照2.2.5.1中的方法进行活化和培养,制得菌悬液,并调OD600=0.5±0.05。取若干灭菌1.5mL离心管,等量的乳酸菌和H.pylori混合于离心管中,彻底振荡5min,室温静置培养,分别在静置1、2、3、4、5、6、24h和48h后分别吸取上层液体测600nm处的吸光值。
Figure BDA0002641669750000092
其中AX是交互凝集前在600nm处乳酸菌的吸光值,Ay交互凝集前在600nm处H.pylori的吸光值,Amin是静置t h后混合的吸光值。
乳酸菌抗氧化能力的测定
(1)清除DPPH能力的测定
将DPPH溶于甲醇溶液,配制成0.1mmol/L的DPPH溶液,取此溶液2mL分别与1mL乳酸菌菌悬液或发酵上清液混合均匀,室温避光反应30min,用分光光度计在517nm处测量吸光值。测3次平行,取平均值。计算公式如下:
Figure BDA0002641669750000093
其中A1为样品组吸光值,A2为对照组吸光值(用超纯水取代样品)。
(2)清除羟自由基的能力的测定
配制2.5mmol/L的邻菲罗琳,pH 7.4的PBS,2.5mmol/L的FeS04和0.12%的H2O2,将1mL邻菲罗琳、2mL PBS和1mL FeS04充分混合均匀,再加入1mL H2O2后分别加入乳酸菌菌悬液或发酵上清液,混合均匀后37℃水浴90min,用分光光度计在536nm处测量吸光值,测3次平行,取平均值。计算公式如下:
Figure BDA0002641669750000094
其中AS为样品组吸光值;AC为对照组吸光值(包括邻菲罗琳、PBS、FeS04和H2O2);Ab为空白组吸光值(包括邻菲罗琳、PBS、FeS04);
(3)还原力的测定
取0.5mL乳酸菌菌悬液或上清液,0.5mL pH 6.6的PBS溶液及0.5mL 1%铁氰化钾,均匀混合后,50℃水浴20min,急速放入冰中冷却。再加入0.5mL 10%三氯乙酸,6000r/min离心10min后取上清液1mL,加入1mL超纯水及1mL 0.1%三氯化铁,混合均匀。10min后,用分光光度计在700nm波长处测定其吸光度。吸光度越大表示待测样品的还原能力越强。测3次平行,取平均值。
乳酸菌抑制幽门螺杆菌尿素酶活性的测定
将幽门螺杆菌按照2.2.5.1中的方法进行活化和培养,用磷酸盐缓冲液清洗2次,用BHI调节H.pylori浓度为1×108CFU/mL。在96孔板中,取40μL H.pylori和10μL乳酸菌菌悬液或发酵上清液混匀后,放入微需养环境中(85%N2、10%CO2、5%O2)共培养48h,然后加入150μL尿素酶测试液(配方:0.9%NaC1,20mmo1/L尿素,14μg/mL苯酚红。用HC1调pH至6.8变色),振荡后用酶标仪在550nm处测定其吸光值。空白组是仅用尿素酶试剂液测定的结果;对照组是用BHI培养基代替上清液测定的结果。
乳酸菌对幽门螺杆菌超微结构的影响
(1)扫描电镜(Scanning Electron Microscopy,SEM)观察
1)指示菌准备:将平板中已经活化幽门螺杆菌刮取接种至10mL BHI液体培养基中,调节菌液浓度为OD600=0.5。
2)加样:取之前培养的乳酸菌,加入到幽门螺杆菌菌液中,调节幽门螺杆菌和乳酸菌菌液浓度比为1:1,以未经处理的幽门螺杆菌作为对照,微需养环境中静置培养10h。
3)固定:将经过静置培养10h的菌液用离心机在4℃,速度为8000r/min的条件下离心10min,弃去上清,只留菌体,用PBS缓冲液充分洗涤菌体3遍。加入1mL浓度为2.5%戊二醛溶液至洗涤后的菌体中,4℃固定过夜。
4)清洗:固定后的菌体,离心,弃上清液,只留菌体,用PBS缓冲液同样的方法清洗菌体3次,每次静置15min后离心,弃上清液。(用足够的缓冲液充分漂洗)。
5)双固定:用1%的饿酸溶液加入样品中静置1-2h,之后用移液枪吸取饿酸废液弃去,用PBS缓冲液漂洗样品3次,每次15min
6)脱水:依次用30%、50%、70%、80%、90%的乙醇溶液梯度脱水,静置15min后,离心,弃上清。然后用100%无水乙醇脱水3次,每次15min,离心,弃上清。
7)干燥:充分干燥用冷冻干燥仪将脱水后的样品。
8)粘样:用特定导电胶带将样品依次粘到样品台上。
9)镀膜:用离子溅射仪给样品镀上10nm的金膜。
10)在扫描电镜中观察样品。
(2)透射电镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)观察
1)幽门螺杆菌的准备和菌体固定及清洗参考上述的方法操作。
2)琼脂包埋:在菌体中加入加热融化的琼脂,4℃静置2-3min使之凝固。用刀片切下包埋的菌体,放置于1.5mL离心管中。
3)清洗:用PBS缓冲液清洗固定的菌体3次,每次静置15min,弃去上清。
4)锇酸固定:用1%锇酸溶液加入到样品中静置固定1-2h,室温条件下。
5)清洗:用移液枪小心吸取饿酸废液弃去,用PBS缓冲液充分漂洗固定后的菌体3次,每次15min。
6)脱水:依次用30%、50%、70%、80%、90%和95%的六种浓度乙醇溶液梯度脱水,静置15min后弃上清,再用100%乙醇处理20min,最后过度到纯丙酮处理20min。
7)包埋:
用Spurr包埋剂与丙酮的混合液(V/V=1:1)处理样品1h;
用Spurr包埋剂与丙酮的混合液(V/V=3:1)处理样品3h;
用纯包埋剂将样品室温下处理过夜。
8)将经过渗透处理的样品包埋起来,70℃加热过夜。
9)样品在LEICA EM UC7型超薄切片机中切成70mm-90mm的薄片,并在柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液中各染色5-10min。
10)在透射电镜中观察样品。
结果分析与讨论
抑制幽门螺杆菌生长的乳酸菌的筛选
通过牛津杯法体外抑菌实验,测量抑菌圈直径的大小,筛选抑制H.pylori效果最为明显的乳酸菌,分别以MRS(pH4.6)作为阴性对照,以甲硝唑作为阳性对照。从表2可以看出,新鲜的MRS培养基pH分别为4.6,6.0时,均不能抑制H.pylori的生长,13株乳酸菌的抑菌圈直径大小为8-15mm范围内,其中阳性对照甲硝唑浓度分别为0.05g/mL、0.01g/mL时抑菌圈直径为24.00mm、16.80mm。由于13株乳酸菌的发酵液的pH范围为3.9-5.74,MRS的pH值为4.6时在乳酸菌发酵液的pH范围内,而没有抑菌效果,因此可以推断在抑制H.pylori作用机制中,酸不是唯一的作用因子,很有可能是除了酸之外的其他代谢产物发挥作用或者是在酸的促进下加强了作用效果。国内外也有很多关于通过体外抑菌实验筛选乳酸菌的研究,如Shymaa Enany等研究了Lactobacillus casei通过琼脂扩散法测定了对107株H.pylori的体外抑菌活性,其中包括耐药菌株。Chen等通过一系列体外实验从38株乳酸菌中筛选到2株具有潜在抑制H.pylori作用的乳酸菌。本实验中植物乳杆菌L.plantarum ZJ316抑菌效果最为明显,抑菌圈直径为14.60mm,其次是鼠李糖乳杆菌L.rhamnosus GG,抑菌圈直径为12.60mm。故在之后的实验中,选择L.plantarum ZJ316作用重点研究对象,以L.rhamnosusLGG作为阳性对照进行研究。鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LGG是从人粪便中分离得到具有良好的拮抗幽门螺杆菌活力的益生菌。有大量研究报道认为其抑菌机制可能与降低幽门螺杆菌脲酶活性和其黏附能力有关;能够产生乳酸、复合乳酸、细菌素、自溶素和蛋白质化合物;抑制促炎因子IL-8的分泌,促进抑炎因子IL-10的产生。本实验所用为乳酸菌菌悬液和发酵上清液,菌悬液的抑菌效果明显好于上清液,但究竟是哪些代谢产物发挥抑菌作用,目前还需进一步实验研究。
表2乳酸菌抑制幽门螺杆菌生长
Tab.2 Abilities of 13 lactobacillus strain to inhibit growth ofHelicobacter pylori
Figure BDA0002641669750000121
Figure BDA0002641669750000131
注:牛津杯直径为8.00mm
乳酸菌耐受人工胃液和胆盐能力分析
乳酸菌在非常低的pH条件下具有高存活率,才能保证其在胃中发挥益生菌特性。动物胃酸pH最低为1.5,当食物摄入后,胃中的pH会迅速增高,有时会超过6.0,但通常情况下都是介于2.5~3.5。乳酸菌在动物体内发挥其益生特性不仅仅是需要在胃中存活,更需要稳定存活于肠道消化道中,所以同时也需要具有抵抗胆盐的能力。通过表2.3耐受性结果表明,植物乳杆菌L.plantarum ZJ316在pH 2.0期间处理2h、4h存活率较低分别为52.0±1.0%和45.3±2.1%,而在pH3.0时处理2h、4h表现出了一定耐受性,存活率上升,分别为86.7±1.6%和83.0±1.0%。在分别添加0.3%和0.5%胆盐的培养基中,植物乳杆菌L.plantarum ZJ316均可以生长,但0.3%更趋近于动物体内的生长环境,存活率更高一些,分别为处理2h的79.0±3.6%和处理4h的70.3±1.5%。2h的存活率比4h的存活率均略高一些,证明随着时间的推移,存活率呈下降趋势。结果表明,植物乳杆菌L.plantarum ZJ316对酸性条件和胆盐有较强的耐受性,能在胃和肠道中长期存活。
表3植物乳杆菌ZJ316在不同pH浓度和胆盐浓度下的存活率
Tab.3 The survival rate of Lactobacillus plantarum ZJ316 underdifferent concentration of pH and bile salt
Figure BDA0002641669750000132
乳酸菌疏水性能力分析
乳酸菌在动物机体内发挥作用,必须要在胃肠道中定植,而定植的前提是其必须黏附于宿主细胞表面。Tuo等研究表明菌株的黏附能力与乳酸菌疏水性存在一定程度的正相关性。近几年来被广泛地作为评价乳酸菌黏附性能的重要指标。由图1可以看出,植物乳杆菌L.plantarum ZJ316的疏水性(65.56±1.88%)明显高于鼠李糖乳杆菌L.rhamnosusLGG(40.35±1.20%),推测L.plantarum ZJ316与胃上皮细胞的粘附作用应该也高于L.rhamnosus LGG。疏水性强的菌株表面有可能存在某种类蛋白物质,从而达到对细胞自身的保护作用。
乳酸菌凝集能力分析
菌株的凝集能力分为自凝集(Autoaggregation)和交互凝集(Coaggregation)两种形式。自凝集是同一菌株之间细胞自我聚集现象;交互凝集是不同菌株细胞间的凝集现象,菌株的凝集作用与其粘附性存在一定关系,故凝集能力在肠道中也发挥重要作用,乳酸菌拥有较强自凝集能力可以保持菌株活力,有效的促进阻碍病原菌在胃肠道中的粘附和定植,减少疾病的发生。而乳酸菌对致病菌的交互凝集可以使病原菌更易和乳酸菌结合最后从肠道中排出,从而达到减少胃肠道中致病菌的含量的目的。考察菌株的凝集能力也属于考察菌株益生特性之一。本发明测定植物乳杆菌L.plantarum ZJ316和鼠李糖乳杆菌L.rhamnosus LGG在48小时内自凝集能力和交互凝集能力。从表4和表5可以看出,随着培养时间的增加,自凝集能力和交互凝集能力也在不断增加。培养到48h,植物乳杆菌L.plantarum ZJ316的自凝集能力和交互凝集能力最高,分别为94.81±0.58%和68.18±0.67%,鼠李糖乳杆菌L.rhamnosus LGG的自凝集能力和交互凝集能力也最高,分别为82.18±0.61%和49.27±1.75%。综合来说,L.plantarum ZJ316的凝集能力强于L.rhamnosus LGG,有利于保持菌株活力,阻碍致病菌在胃肠中的粘附和定植。
表4乳酸菌自凝集作用
Tab.4 Rate of autoaggregation of lactobacilli
Figure BDA0002641669750000141
Figure BDA0002641669750000151
表5乳酸菌与幽门螺杆菌交互凝集作用
Tab.5 Rate of coaggregation of lactobacilli with Helicobacter pylori
Figure BDA0002641669750000152
乳酸菌抗氧化能力分析
氧化作用是机体正常代谢过程中必要过程,但过多的氧化作用会导致机体的生物大分子的损伤。乳酸菌可以通过产生一些抗氧化物质如SOD酶、谷胱甘肽来清除羟自由基和过氧化氢等。抗氧化性强的乳酸菌在机体中的存活时间普遍高于无抗氧化活性的菌株。
乳酸菌清除DPPH能力分析
DPPH是一种被广泛应用于抗氧化能力实验的人工合成的自由基,其原理是DPPH自由基含有单电子,在517nm处有特征吸收,当有自由基清除物质存在时,自由基清除物质会提供H+与DPPH中单电子对配对,从而醇溶液达到褪色效果,吸光值也由此降低[87-89]。如图2所示,菌体DPPH自由基清除率为L.plantarum ZJ316(34.29%±0.016)>L.rhamnosus LGG(8.65%±0.027),发酵上清液DPPH自由基清除率为L.plantarum ZJ316(58.33%±0.018)>L.rhamnosus LGG(55.12%±0.027)。植物乳杆菌L.plantarum ZJ316和鼠李糖乳杆菌L.rhamnosus LGG菌体和发酵上清液均有清除DPPH能力,但清除活性方面乳酸菌发酵液上清液均大于菌体。
乳酸菌清除羟自由基能力分析
羟自由基身为自由基的一种,可以降解DNA,杀死红细胞,损伤细胞膜和多糖化合物,能够导致多种人体细胞损伤和脂质过氧化现象。如图3所示,菌体羟自由基清除率为L.plantarum ZJ316(75.70%±0.035)>L.rhamnosus LGG(52.85%±0.018),发酵上清液羟自由基清除率为L.plantarum ZJ316(34.82%±0.042)>L.rhamnosus LGG(11.56%±0.029)。植物乳杆菌L.plantarum ZJ316和鼠李糖乳杆菌L.rhamnosus LGG菌体和发酵上清液均有清除羟自由基,但清除活性方面乳酸菌菌体均大于发酵液上清液。
乳酸菌还原力分析
还原能力是以测定普鲁士蓝的生成量为指标。原理是铁氰化钾在PBS(pH=6.6)中还原生成黄血盐,其再与FeCl3提供的Fe3+作用生成普鲁士蓝。在700nm波长处测量吸光度大小来判断物质的还原能力大小。700nm处吸光值越大,说明其还原能力越大。如图4所示,菌体还原力为L.plantarum ZJ316(0.28±0.069)>L.rhamnosus LGG(0.24±0.081),发酵上清液还原率为L.plantarum ZJ316(2.08±0.078)>L.rhamnosus LGG(2.07±0.089)。植物乳杆菌L.plantarum ZJ316和鼠李糖乳杆菌L.rhamnosus LGG菌体和发酵上清液均一定的还原力且两个菌株还原效果相差不大,但乳酸菌发酵液上清液的还原力明显大于菌体。总的来说,通过测量3个抗氧化性指标,结果显示L.plantarum ZJ316和L.rhamnosus LGG都具有一定的抗氧化性,也证实了乳酸菌在生长和代谢过程中无论是菌体还是代谢产物中都存在着具有抗氧化活性的物质,但L.plantarum ZJ316效果更明显,抗氧化性更强。
乳酸菌抑制幽门螺杆菌尿素酶活性分析
H.pylori能在胃中高酸环境存活,是因为其可以产生尿素酶,将体内的尿素分解成氨气和二氧化碳,使周边环境的pH上升,起到中和胃酸作用,从而促进H.pylori的生长定植。乳酸菌若可以抑制尿素酶活力,就可以减少H.pylori在胃中的定植量,抑制H.pylori的生长。如表6所示,乳酸菌菌体抑制尿素酶的抑制率为L.plantarum ZJ316(67.47%±0.023)大于L.rhamnosus LGG(64.49%±0.044),且两株菌菌体的抑制率均小于发酵上清液,所以L.plantarum ZJ316具有作为潜在的抑制H.pylori的益生菌株的潜力。
表6乳酸菌及其上清液抑制幽门螺杆菌尿素酶活力
Tab.6 Urease activity of H.pylori coculture with lactobacilli or itssupernatant(Sn).
Figure BDA0002641669750000161
Figure BDA0002641669750000171
乳酸菌对幽门螺杆菌超微结构的影响分析
为探究植物乳杆菌ZJ316对幽门螺杆菌生长的影响,进一步确定植物乳杆菌ZJ316抑制幽门螺杆菌机理,用扫描电镜、透射电镜分别观测了幽门螺杆菌在不同处理情况条件下的细胞形态。
扫描电镜观察结果
如图5A至5F所示为幽门螺杆菌经植物乳杆菌ZJ316共培养处理后的菌体细胞形态结构的扫描电镜图。幽门螺杆菌未经植物乳杆菌ZJ316处理时,幽门螺杆菌细胞形态结构清晰完整,均呈略带弯曲的杆状或短弧,如图5A、5B所示;植物乳杆菌ZJ316未经处理时,植物乳杆菌ZJ316细胞形态结构清晰,呈完整的杆状结构,细胞表面完整,细胞表面有明显纹理如图5C、5D所示;经植物乳杆菌ZJ316处理10h后,幽门螺杆菌的形态发生变化,部分杆状细胞变为球形,且可观察到大部分菌体细胞出现崩解现象,中心区域不完整或消失,细胞裂解,呈豆腐渣状如图5E、5F所示;
透射电镜观察结果
利用透射电镜观察处理前后的幽门螺杆菌细胞内部的精细结构。图6A、6B所示为幽门螺杆菌未经植物乳杆菌ZJ316处理时的细胞内部结构。图6C、6D所示为植物乳杆菌ZJ316的细胞内部结构。图6E、6F所示为经植物乳杆菌ZJ316处理10h后幽门螺杆菌的细胞内部结构。经透射电镜观察发现,未经处理过的幽门螺杆菌切面呈面多呈球形,大多数菌体细胞壁、细胞膜完整,细胞质分布比较均匀。而经乳酸菌处理过的幽门螺杆菌切面有球形、杆状甚至被完全裂解等多种形态,菌体大体轮廓清楚,可见细胞壁、细胞膜多处凹陷、打孔、变薄、不完整甚至破损、裂解至全部消失,细胞质分布不均匀或浓缩聚集成团状,电子密度降低。有些菌体严重变形、胞内中心类核区缺失。
据国内外有关报道,幽门螺杆菌在不利于其繁殖的高氧气、高pH、低温等条件下,易会发生球状变异,使其自身处于休眠体状态,有利于保护自身免受环境的侵害。所以幽门螺杆菌尚未完全变为球形之前,显微镜下可见呈出杆状、U型等多种形态的幽门螺杆菌。结合图5A至图5F、图6A至图6F扫描电镜和透射电镜中结果,说明植物乳杆菌ZJ316可通过其代谢产物影响或破坏幽门螺杆菌细胞形态和结构,使其细胞膜表面及其内部发生一定程度的破损或裂解,以达到抑制幽门螺杆菌生长繁殖的作用。
根据本发明的另一方面,本发明提供了用于抑制幽门螺旋杆菌的组合物,其中所述组合物包括所述乳酸菌和载剂,所述载剂用于负载所述乳酸菌,本领域技术人员可以根据需求选择所述载剂的种类。
所述乳酸菌是所述植物乳杆菌ZJ316,并且可以是活菌或者是死菌。
所述组合物是一可供口服投药的剂型。所述剂型是选自溶液、悬浮液、乳剂、粉末、锭剂、丸剂、糖浆、口含锭、片剂、口嚼胶、浓浆和胶囊所构成的群组所述组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂或者稀释剂。
本领域的技术人员应理解,上述描述及附图中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明,在没有背离所述原理下,本发明的实施方式可以有任何变形或修改。

Claims (20)

1.一种用于抑制幽门螺旋杆菌的乳酸菌,其特征在于,是植物乳杆菌ZJ316,寄存编号为CCTCC No:M208077。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌,其中所述乳酸菌来自于婴儿粪便。
3.根据权利要求1所述的乳酸菌,其中所述乳酸菌具有耐酸性。
4.根据权利要求1所述的乳酸菌,其中所述乳酸菌具有耐受胆盐性。
5.根据权利要求1所述的乳酸菌,其中所述乳酸菌抗氧化能力优于鼠李糖乳杆菌LGG。
6.根据权利要求1所述的乳酸菌,其中所述乳酸菌具有尿素酶活性抑制性。
7.根据权利要求1所述的乳酸菌,其中所述乳酸菌对于幽门螺旋杆菌的细菌菌体具有破坏性。
8.根据权利要求1所述的乳酸菌,其中所述乳酸菌适于被培养以获得发酵上清液,其中所述发酵上清液的DPPH自由基清除能力强于所述乳酸菌菌体本身。
9.根据权利要求1所述的乳酸菌,其中所述乳酸菌是指包含菌体表面物质或菌体分泌物质其中的一或全部组合的培养液。
10.根据权利要求1所述的乳酸菌,其中所述乳酸菌适于被培养以获得发酵上清液,其中所述发酵上清液的羟自由基清除能力强于所述乳酸菌菌体本身。
11.根据权利要求1所述的乳酸菌,其中所述乳酸菌的还原能力强于鼠李糖乳杆菌L.rhamnosus LGG。
12.根据权利要求1至11任一所述的用于抑制幽门螺旋杆菌的一乳酸菌,其特征在于,通过如下方式筛选:
培养多种乳酸菌和幽门螺旋杆菌以获得所述乳酸菌的上清液和菌悬液以及幽门螺旋杆菌的菌悬液,其中一种所述乳酸菌为植物乳杆菌ZJ316;
接种幽门螺旋杆菌的菌悬液于一琼脂培养基;以及
注入多种乳酸菌的上清液或者是菌悬液至所述琼脂培养基形成的圆孔至形成抑菌圈,以抑菌圈最大为筛选标准。
13.根据权利要求12所述的筛选方法,其中所述乳酸菌的菌悬液的抑菌作用强于上清液。
14.根据权利要求12所述的筛选方法,其中在上述方法中,以琼脂双层牛津杯方进行抑菌圈测定。
15.根据权利要求12所述的筛选方,其中所述筛选方法被实施为如下步骤:
活化和重悬乳酸菌、幽门螺旋杆菌,乳酸菌同时收集上清液和菌悬液,备用。
加热融化已灭菌的10mL的BHI固体培养基(1.5%琼脂),轻轻振荡混匀,倒平板,静置30分钟,等待凝固;
将灭过菌的牛津杯按照适宜间隔放置于刚倒的平板上;
将幽门螺旋杆菌菌悬液按照1%的接菌量接种于7mL BHI半固培养基(0.7%琼脂和7%小牛血清)中,充分混匀后倒入培养皿中,轻轻混匀,使培养基均匀覆盖培养皿表面无气泡;
待半固体培养基充分凝固后,用镊子将牛津杯拔出,形成的圆柱形孔洞;以及
注入100μL乳酸菌悬浮液或上清液至圆孔中,将平板放置于含有微需养袋的厌氧盒中37℃静置培养48h,直至出现明显的抑菌圈,测量抑制圈(mm)的大小,选择抑菌圈最大的乳酸菌。
16.一种用于抑制幽门螺旋杆菌的组合物,其特征在于,包括乳酸菌和载剂,其中所述乳酸菌是植物乳杆菌ZJ316,寄存编号为CCTCC No:M208077。
17.根据权利要求16所述的组合物,其中所述乳酸菌为死菌或者是活菌。
18.根据权利要求16所述的组合物,其中所述组合物是一可供口服投药的剂型。
19.根据权利要求16所述的组合物,其中所述剂型是选自溶液、悬浮液、乳剂、粉末、锭剂、丸剂、糖浆、口含锭、片剂、口嚼胶、浓浆和胶囊所构成的群组。
20.根据权利要求16所述的组合物,其中所述组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂或者稀释剂。
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