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CN106244509A - 鼠李糖乳杆菌培养基及培养方法 - Google Patents

鼠李糖乳杆菌培养基及培养方法 Download PDF

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CN106244509A
CN106244509A CN201610888771.8A CN201610888771A CN106244509A CN 106244509 A CN106244509 A CN 106244509A CN 201610888771 A CN201610888771 A CN 201610888771A CN 106244509 A CN106244509 A CN 106244509A
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张春宇
闵祥博
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Han's (shenyang) Children's Products Co Ltd
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Abstract

本发明公开一种鼠李糖乳杆菌培养基，具有基础培养基和优化培养基，基础培养基包括组分：酵母蛋白胨、葡萄糖、酵母浸出物、乙酸钠、硫酸镁、吐温80、低聚异麦芽糖、磷酸二氢钾、余量为无菌水，pH值6.20～6.80；优化培养基包括组分：酵母蛋白胨、葡萄糖、酵母浸出物、乙酸钠、硫酸镁、吐温80、低聚异麦芽糖、磷酸二氢钾、余量为无菌水，pH值6.20～6.80。该培养基适于鼠李糖乳杆菌的繁殖培养，以及利用该培养基培养鼠李糖乳杆菌的方法，不仅能够有效增殖培养鼠李糖乳杆菌，还有利于实现大规模工业化生产。

Description

鼠李糖乳杆菌培养基及培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌培养基及培养方法。
背景技术
鼠李糖乳杆菌从属于乳杆菌属，为革兰氏阳性兼性厌氧菌，无质粒；不能利用乳糖，但可代谢单糖；在厌氧情况下能很好生长，在有CO2存在的情况下也能生长。
鼠李糖乳杆菌是人体正常菌群之一，肠道黏着率高，定植能力强，是人类研究最广泛的益生菌之一，具有平衡和改善胃肠道功能、增强人体自身免疫能力、促进双歧杆菌和嗜酸乳杆菌生长和作用、预防和帮助治疗腹泻、预防呼吸道感染、排出毒素、预防龋齿、预防过敏等作用。
目前对鼠李糖乳杆菌的研究大多集中在其功能特性上，关于该菌株增殖培养方面的研究不多。现在应用于鼠李糖乳杆菌培养的培养基最多的是MRS培养基，主要用途是利用鼠李糖乳杆菌生产乳酸。而本发明是为达到鼠李糖乳杆菌大量生长的目的，寻找适于鼠李糖乳杆菌增殖的培养基为前提，从而实现鼠李糖乳杆菌冻干粉的大规模工业化生产。
发明内容
本发明提供一种鼠李糖乳杆菌培养基及培养方法，适于鼠李糖乳杆菌的繁殖培养，以及利用该培养基培养鼠李糖乳杆菌的方法，不仅能够有效增殖培养鼠李糖乳杆菌，还有利于实现大规模工业化生产，从而使得作为食品添加剂的鼠李糖乳杆菌冻干粉的生产规模工业化。
本发明采用的技术方案为：
鼠李糖乳杆菌培养基，具有基础培养基和优化培养基，
所述基础培养基包括如下组分：酵母蛋白胨6.0～10.0g/L、葡萄糖19.0～25.0g/L、酵母浸出物2.0～4.0g/L、乙酸钠4.5～6.0g/L、硫酸镁0.4～0.6g/L、吐温80 0.5～0.75g/L、低聚异麦芽糖1.0～2.5g/L、磷酸二氢钾1.5～3.0g/L、余量为无菌水，pH值6.20～6.80；
所述优化培养基包括如下组分：酵母蛋白胨11.0～15.0g/L、葡萄糖25.0～30.0g/L、酵母浸出物6.0～8.0g/L、乙酸钠2.0～3.0g/L、硫酸镁0.10～0.15g/L、吐温80 0.5～0.75g/L、低聚异麦芽糖1.0～2.5g/L、磷酸二氢钾1.5～3.0g/L、余量为无菌水，pH值6.20～6.80。
所述的鼠李糖乳杆菌培养基，所述基础培养基制备方法如下，按照配方比例称量各组分，混合，加热溶解，如果基础培养基的pH值低于6.20，则用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20～6.80，115℃下灭菌30min；
所述优化培养基的制备方法如下，按照配方比例称量各组分，混合，加热溶解，如果培养基的pH值低于6.20，则用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20～6.80，115℃下灭菌30min。
一种利用所述鼠李糖乳杆菌培养基的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备发酵用菌种；
1.1)划线培养：鼠李糖乳杆菌菌粉用无菌水稀释后，于MC培养基上分区划线，划线结束后，平皿倒置，37℃培养箱恒温培养48～72小时；
1.2)一级纯化培养：挑取平皿上的单菌落接种至装有MRS液体培养基的试管中，试管密封，于37℃培养箱恒温静置培养17～24小时，得一级菌悬液；
1.3)二级纯化培养：按3～5％接种量，将培养好的一级菌悬液接种至装有MRS液体培养基的三角瓶中，培养基装液体积占三角瓶容积的40％，三角瓶密封，于37℃培养箱恒温静置培养17～24小时，得二级菌悬液；
1.4)菌泥制备与保存：将二级纯化培养得到的二级菌悬液进行离心，12000rpm离心10分钟后得到菌泥，将菌泥溶解于MRS液体培养基与50％甘油溶液的组成混合溶液中，得菌泥混合液，然后将菌泥混合液分装在已灭菌的冻存管中，封口膜密封，冻存于-40～-80℃低温冰箱内，得鼠李糖乳杆菌菌泥冻存管，备用；
2)菌种发酵；
2.1)冻存菌泥复苏：取存于低温冰箱内的鼠李糖乳杆菌菌泥冻存管，立即放入37℃水浴锅内进行菌种复苏，至冻存管内液体全部融化；
2.2)菌种一级培养：将复苏好的菌泥混合液1～2ml直接接种至装有基础培养基的三角瓶中，三角瓶密封，37℃培养箱恒温静置培养17～24小时；
2.3)菌种二级培养：按照2～6％接种量，将一级培养结束的菌悬液接种至装有基础培养基的三角瓶中，三角瓶密封，37℃培养箱恒温静置培养17～24小时；
2.4)菌种三级培养：按照2～6％接种量，将二级培养结束的菌悬液接种至装有基础培养基的发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，37℃恒温培养8～15小时；
2.5)菌种四级发酵：按照2～6％接种量，将三级培养结束的菌悬液接种至装有优化培养基的发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，37℃恒温培养，在发酵开始3小时后，维持菌液的恒pH为5.50～6.00，培养周期8～15小时，直至监测到菌悬液OD600值停止增长，立即停止发酵，并对菌悬液做降温处理。
所述的的培养方法，步骤1.4)菌泥制备与保存中所述MRS液体培养基与50％甘油溶液的体积比为1:1～1.5；所述MRS液体培养基与50％甘油溶液组成的混合溶液与离心前二级菌悬液的体积比为1:10。
所述的培养方法，步骤2.3)基础培养基装液体积占三角瓶容积的40％；步骤2.4)基础培养基装液体积占发酵罐容积的60％；步骤2.5)优化培养基装液体积占发酵罐容积的60％。
所述的培养方法，步骤2.5)通过流加食品级NaOH溶液来维持菌液的恒pH为5.50～6.00。
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：
1、本发明中用于鼠李糖乳杆菌的培养基采用的组分原料均为食品级，适用于大规模工业化生产作为食品添加剂的鼠李糖乳杆菌冻干粉。
2、较于现在应用于鼠李糖乳杆菌培养最广泛的MRS培养基，本发明针对鼠李糖乳杆菌纯化培养和菌种发酵分别采用了不同的更适于菌体不同生长阶段的基础培养基和优化培养基，在培养基中添加促生长因子低聚异麦芽糖，不仅适合鼠李糖乳杆菌菌体生长，繁殖速度快，活菌数量大，而且降低了培养基的成本。
3、在本发明中，用于发酵的菌种采用离心菌泥冻存的保存方式，较于现在普遍应用的斜面和菌悬液直接冻存的方式，获得的菌悬液的收率和活菌数更高。
4、通过流加食品级NaOH溶液来控制发酵过程中pH恒定，更有利于富集鼠李糖乳杆菌菌体。
5、分级扩大培养能促使菌体数量快速增加，能在短时间里得到大量的菌体，活菌数能达到109CFU/ml以上，并且菌种稳定，变异、退化少。
附图说明
图1为实施例4中采用4种不同种类蛋白胨发酵菌悬液的活菌数对比图。
图2为实施例5中采用6种不同种类促生长因子发酵菌悬液的活菌数对比图。
图3为实施例5中低聚异麦芽糖的用量对活菌数的影响
图4为鼠李糖乳杆菌培养工艺流程图。
具体实施方式
一种鼠李糖乳杆菌培养基
基础培养基配方及制备方法：酵母蛋白胨6.0～10.0g/L、葡萄糖19.0～25.0g/L、酵母浸出物2.0～4.0g/L、乙酸钠4.5～6.0g/L、硫酸镁0.4～0.6g/L、吐温80 0.5～0.75g/L、低聚异麦芽糖1.0～2.5g/L、磷酸二氢钾1.5～3.0g/L、余量为无菌水，pH值6.20～6.80；按照配方比例称量、加热溶解，如果培养基的pH值低于6.20，则用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20～6.80，115℃下灭菌30min；
优化培养基配方及制备方法：酵母蛋白胨11.0～15.0g/L、葡萄糖25.0～30.0g/L、酵母浸出物6.0～8.0g/L、乙酸钠2.0～3.0g/L、硫酸镁0.10～0.15g/L、吐温80 0.5～0.75g/L、低聚异麦芽糖1.0～2.5g/L、磷酸二氢钾1.5～3.0g/L、余量为无菌水，pH值6.20～6.80；按照配方比例称量、加热溶解，如果培养基的pH值低于6.20，则用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20～6.80，115℃下灭菌30min；
培养基组分原料均为食品级。
利用上述培养基培养鼠李糖乳杆菌的方法如图4所示：
1、发酵用菌种的制备
1)划线培养：鼠李糖乳杆菌菌粉用无菌水稀释后，于MC培养基上四区划线，划线结束后，平皿倒置，37℃培养箱恒温培养48～72小时；
2)一级纯化培养：挑取平皿上溶钙圈较大的单菌落接种至装有5ml MRS液体培养基的试管中，试管密封，37℃培养箱恒温静置培养17～24小时；
3)二级纯化培养：按3～5％接种量，将培养好的一级菌悬液接种至装有MRS液体培养基的三角瓶中，培养基装液体积占三角瓶容积的40％，三角瓶密封，37℃培养箱恒温静置培养17～24小时；
4)菌泥制备与保存：将二级纯化培养得到的菌悬液进行离心，12000rpm离心10分钟后得到菌泥，将菌泥溶解于由MRS液体培养基与50％甘油溶液(MRS液体培养基与50％甘油溶液的体积比为1:1～1.5)组成的混合溶液中，混合溶液与离心前菌悬液的体积比为1:10，将菌泥混合液分装在已灭菌的冻存管中，封口膜密封，冻存于-40～-80℃低温冰箱内，备用；
注：1)—4)操作均必需在无菌操作台和无菌间内执行；
2、菌种发酵
5)冻存菌泥复苏：取存于低温冰箱内的鼠李糖乳杆菌菌泥冻存管，立即放入37℃水浴锅内进行菌种复苏，30～45s，至冻存管内液体全部融化；
6)菌种一级培养：将复苏好的菌泥混合液1～2ml直接接种至装有10ml基础培养基的50ml三角瓶中，三角瓶密封，37℃培养箱恒温静置培养17～24小时；
7)菌种二级培养：按照2～6％接种量，将一级培养结束的菌悬液接种至装有基础培养基的三角瓶中，基础培养基装液体积占三角瓶容积的40％，三角瓶密封，37℃培养箱恒温静置培养17～24小时；
8)菌种三级培养：按照2～6％接种量，将二级培养结束的菌悬液接种至装有基础培养基的发酵罐中，基础培养基装液体积占发酵罐容积的60％，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，37℃恒温培养8～15小时；
9)菌种四级发酵：按照2～6％接种量，将三级培养结束的菌悬液接种至装有优化培养基的发酵罐中，优化培养基装液体积占发酵罐容积的60％，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，37℃恒温培养，在发酵开始3小时后，通过流加食品级NaOH溶液来维持菌液的恒pH为5.50～6.00，培养周期8～15小时，直至监测到菌悬液OD600值停止增长，立即停止发酵，并对菌悬液做降温处理。
采用上述培养基和培养方法培养鼠李糖乳杆菌，菌悬液的活菌数达到109CFU/ml以上。
注：5)—9)操作均需在10万级净化车间内进行。
实施例1鼠李糖乳杆菌培养基及培养方法
一、鼠李糖乳杆菌培养基，包括基础培养基和优化培养基。
基础培养基的配方和制备：酵母蛋白胨8.0g/L、葡萄糖25.0g/L、酵母浸出物3.0g/L、乙酸钠6.0g/L、硫酸镁0.5g/L、吐温80 0.5g/L、低聚异麦芽糖1.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、余量为无菌水，pH值6.20；按照配方比例称量各组分、混合，加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20，115℃下灭菌30min。
优化培养基的配方和制备：酵母蛋白胨14.0g/L、葡萄糖30.0g/L、酵母浸出物6.0g/L、乙酸钠3.0g/L、硫酸镁0.10g/L、吐温80 0.5g/L、低聚异麦芽糖2.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、余量为无菌水，pH值6.80；按照配方比例称量各组分，混合，加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.80，115℃下灭菌30min。
二、利用上述鼠李糖乳杆菌培养基培养鼠李糖乳杆菌。
包括如下步骤：
1、发酵用菌种的制备
1)划线培养：鼠李糖乳杆菌菌粉用无菌水稀释后，于MC培养基上四区划线，划线结束后，平皿倒置，37℃培养箱恒温培养60小时；
2)一级纯化培养：挑取平皿上溶钙圈较大的单菌落接种至装有5ml MRS液体培养基的试管中，试管密封，37℃培养箱恒温静置培养20小时；
3)二级纯化培养：按3％接种量，将培养好的一级菌悬液接种至装有100ml MRS液体培养基的250ml三角瓶中，三角瓶密封，37℃培养箱恒温静置培养20小时；
4)菌泥制备与保存：将二级纯化培养得到的100ml菌悬液进行离心，12000rpm离心10分钟后得到菌泥，将菌泥溶解于10ml混合溶液(混合液由5ml MRS液体培养基与5ml50％甘油溶液混合均匀配制而成)中，将菌泥混合液分装在已灭菌的1ml冻存管中，封口膜密封，冻存于-80℃低温冰箱内，备用；
注：1)—4)操作均必需在无菌操作台和无菌间内执行；
2、菌种发酵
5)冻存菌泥复苏：取存于低温冰箱内的鼠李糖乳杆菌菌泥冻存管，立即放入37℃水浴锅内进行菌种复苏，30～45s，至冻存管内液体全部融化；
6)菌种一级培养：将复苏好的1ml菌泥混合液直接接种至装有10ml基础培养基的50ml三角瓶中，三角瓶密封，37℃培养箱恒温静置培养20小时；
7)菌种二级培养：按照2％接种量，将一级培养结束的菌悬液接种至装有100ml基础培养基的250ml三角瓶中，按此接种4瓶，三角瓶密封，37℃培养箱恒温静置培养20小时；
8)菌种三级培养：按照2％接种量，将二级培养结束的菌悬液接种至装有18L基础培养基的30L发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，37℃恒温培养12小时；
9)菌种四级发酵：按照5％接种量，将三级培养结束的菌悬液接种至装有300L优化培养基的500L发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，37℃恒温培养，在发酵开始3小时后，通过流加食品级NaOH溶液来维持恒定pH为5.60±0.1，培养至11小时时，监测到菌液OD600值停止增长，立即停止发酵，并对菌液做降温处理；
10)发酵结束后，取菌悬液采用平板计数法检测活菌数为7.9×109CFU/ml。
注：5)—9)操作均需在10万级净化车间内进行。
实施例2用于发酵的菌种保存方式的选择实验
鼠李糖乳杆菌经划线培养、一级、二级纯化培养后，菌悬液分别以斜面、菌悬液和采用实施例1中离心菌泥的保存方式进行冻存，然后分别以这三种保存方式冻存的菌种采用相同的培养条件进行发酵，发酵结束后分别测定菌悬液的活菌数和收率。
活菌数的测定方法：采用平板计数法；
收率的测定方法：
表1采用不同保存方式的菌种进行发酵对收率和活菌数的影响
保存方式 收率(％) 活菌数(CFU/ml)
斜面保存 1.33 1.09×109
菌悬液保存 1.22 1.14×109
离心菌泥保存 1.44 3.20×109
由表1中的数据显示：采用实施例1中离心菌泥方式保存的菌种进行发酵，活菌数和收率均高于斜面和菌悬液保存方式。
实施例3培养基组分的单因素筛选实验
针对于目前应用于鼠李糖乳杆菌培养的培养基最多的是MRS培养基，主要用途是利用鼠李糖乳杆菌生产乳酸，我们为达到鼠李糖乳杆菌大量生长的目的，寻找适于鼠李糖乳杆菌增殖的培养基，应用于大规模工业化生产作为食品添加剂的鼠李糖乳杆菌冻干粉，对MRS培养基进行改良实验。
由于牛肉粉、磷酸氢二钾、柠檬酸三铵和硫酸锰不符合食品添加剂使用的相关国家标准和法规，因此不能用于发酵生产食品级鼠李糖乳杆菌。针对MRS培养基配方中的牛肉粉、柠檬酸三铵、磷酸氢二钾和硫酸锰组分，进行单因素实验，考察每个组分对培养鼠李糖乳杆菌的活菌数的影响，按照表2中的各组培养基配方配制培养基，并在相同的培养条件下培养鼠李糖乳杆菌，检测菌悬液的活菌数。
表2单因素实验培养基配方(单位：g/L)
表3单因素实验菌悬液的活菌数结果
表3的结果显示，A和C组的活菌数与MRS组无显著差异，从而得出牛肉粉和柠檬酸三铵作为培养基的组分对培养鼠李糖乳杆菌的活菌数无明显的影响；D组的活菌数与MRS组有差异，从而得出硫酸锰作为培养基的组分对培养鼠李糖乳杆菌的活菌数有影响，但是影响不是非常显著；B组的活菌数与MRS组有非常显著的差异，从而得出磷酸氢二钾作为培养基的组分对培养鼠李糖乳杆菌的活菌数有非常明显的影响，因此以食品级磷酸二氢钾来替代磷酸氢二钾。
实施例4培养基中蛋白胨种类的优选实验
培养基中的蛋白胨分别选用鱼蛋白胨、牛骨蛋白胨、酪蛋白胨和酵母蛋白胨这4种蛋白胨，采用相同的培养条件进行发酵，发酵结束后分别测定菌悬液的活菌数。由图1显示，采用酵母蛋白胨进行发酵，测得菌悬液的活菌数最高。
实施例5培养基配方中促生长因子种类及用量的优选实验
为达到鼠李糖乳杆菌增殖培养、提高菌悬液的活菌数的目的，在培养基中添加促生长因子，选用低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、水苏糖、维生素B2、维生素B5、维生素B12作为促生长因子，采用相同的培养条件进行发酵，发酵结束后分别测定菌悬液的活菌数。由图2显示，采用低聚异麦芽糖作为促生长因子进行发酵，测得菌悬液的活菌数最高，水苏糖仅次之，但是水苏糖的价格是低聚异麦芽糖价格的十倍以上，综合考虑成本因素，优选低聚异麦芽糖作为促生长因子。
选择低聚异麦芽糖作为促生长因子，低聚异麦芽糖的用量采用梯度浓度添加，培养基其他组分和添加量相同，在相同培养条件下考察对活菌数的影响。由图3可以看出，低聚异麦芽糖的添加量在1.0-3.0g/L之间时，得到的菌悬液活菌数均在7.0×109CFU/ml以上，但是在添加量为2.5g/L时，活菌数达到最高，之后就开始有下降的趋势，因此从成本和对活菌数的影响来综合考虑，选择低聚异麦芽糖的添加量为1.0-2.5g/L。
实施例6四级发酵过程中是否控制恒定的pH对发酵的影响实验
在四级发酵过程中，在其他培养条件均相同、分别通过流加食品级NaOH溶液来维持恒定pH和不流加任何酸碱在自然pH下，考察对菌悬液的OD600、活菌数和收率的影响，如表4。
表4四级发酵过程中自然pH和控制恒定pH对OD600、活菌数和收率的影响
pH控制方式 OD600 活菌数(CFU/ml) 收率(％)
自然pH 7.232 3.4×109 1.22
控制恒定pH 11.584 7.9×109 1.85
由表4中的数据显示，通过流加食品级NaOH溶液来维持恒定pH，发酵得到的菌悬液的OD600、活菌数和收率都比较高，这是因为在鼠李糖乳杆菌发酵过程中产生乳酸，导致自然pH是呈下降趋势，在发酵后期对菌体富集有不利的影响，通过流加食品级NaOH溶液来维持恒定pH更有利于菌体的富集。

Claims (6)

1.鼠李糖乳杆菌培养基，其特征在于，具有基础培养基和优化培养基，
所述基础培养基包括如下组分：酵母蛋白胨6.0～10.0g/L、葡萄糖19.0～25.0g/L、酵母浸出物2.0～4.0g/L、乙酸钠4.5～6.0g/L、硫酸镁0.4～0.6g/L、吐温80 0.5～0.75g/L、低聚异麦芽糖1.0～2.5g/L、磷酸二氢钾1.5～3.0g/L、余量为无菌水，pH值6.20～6.80；
所述优化培养基包括如下组分：酵母蛋白胨11.0～15.0g/L、葡萄糖25.0～30.0g/L、酵母浸出物6.0～8.0g/L、乙酸钠2.0～3.0g/L、硫酸镁0.10～0.15g/L、吐温80 0.5～0.75g/L、低聚异麦芽糖1.0～2.5g/L、磷酸二氢钾1.5～3.0g/L、余量为无菌水，pH值6.20～6.80。
2.如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌培养基，其特征在于，所述基础培养基制备方法如下，按照配方比例称量各组分，混合，加热溶解，如果基础培养基的pH值低于6.20，则用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20～6.80，115℃下灭菌30min；
所述优化培养基的制备方法如下，按照配方比例称量各组分，混合，加热溶解，如果培养基的pH值低于6.20，则用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20～6.80，115℃下灭菌30min。
3.一种利用如权利要求1-2所述鼠李糖乳杆菌培养基的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）制备发酵用菌种；
1.1）划线培养：鼠李糖乳杆菌菌粉用无菌水稀释后，于MC培养基上分区划线，划线结束后，平皿倒置，37℃培养箱恒温培养48～72小时；
1.2）一级纯化培养：挑取平皿上的单菌落接种至装有MRS液体培养基的试管中，试管密封，于37℃培养箱恒温静置培养17～24小时，得一级菌悬液；
1.3）二级纯化培养：按3～5%接种量，将培养好的一级菌悬液接种至装有MRS液体培养基的三角瓶中，培养基装液体积占三角瓶容积的40%，三角瓶密封，于37℃培养箱恒温静置培养17～24小时，得二级菌悬液；
1.4）菌泥制备与保存：将二级纯化培养得到的二级菌悬液进行离心，12000rpm离心10分钟后得到菌泥，将菌泥溶解于MRS液体培养基与50%甘油溶液的组成混合溶液中，得菌泥混合液，然后将菌泥混合液分装在已灭菌的冻存管中，封口膜密封，冻存于-40～-80℃低温冰箱内，得鼠李糖乳杆菌菌泥冻存管，备用；
2）菌种发酵；
2.1）冻存菌泥复苏：取存于低温冰箱内的鼠李糖乳杆菌菌泥冻存管，立即放入37℃水浴锅内进行菌种复苏，至冻存管内液体全部融化；
2.2）菌种一级培养：将复苏好的菌泥混合液1～2ml直接接种至装有基础培养基的三角瓶中，三角瓶密封，37℃培养箱恒温静置培养17～24小时；
2.3）菌种二级培养：按照2～6%接种量，将一级培养结束的菌悬液接种至装有基础培养基的三角瓶中，三角瓶密封，37℃培养箱恒温静置培养17～24小时；
2.4）菌种三级培养：按照2～6%接种量，将二级培养结束的菌悬液接种至装有基础培养基的发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，37℃恒温培养8～15小时；
2.5）菌种四级发酵：按照2～6%接种量，将三级培养结束的菌悬液接种至装有优化培养基的发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，37℃恒温培养，在发酵开始3小时后，维持菌液的恒pH为5.50～6.00，培养周期8～15小时，直至监测到菌悬液OD600值停止增长，立即停止发酵，并对菌悬液做降温处理。
4.如权利要求3所述的的培养方法，其特征在于，步骤1.4）菌泥制备与保存中所述MRS液体培养基与50%甘油溶液的体积比为1:1～1.5；所述MRS液体培养基与50%甘油溶液组成的混合溶液与离心前二级菌悬液的体积比为1:10。
5.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤2.3）基础培养基装液体积占三角瓶容积的40%；步骤2.4）基础培养基装液体积占发酵罐容积的60%；步骤2.5）优化培养基装液体积占发酵罐容积的60%。
6.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤2.5）通过流加食品级NaOH溶液来维持菌液的恒pH为5.50～6.00。
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