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CN118303634B - 具有增强免疫力功能的后生元及其制备方法和应用 - Google Patents

具有增强免疫力功能的后生元及其制备方法和应用 Download PDF

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CN118303634B
CN118303634B CN202410305642.6A CN202410305642A CN118303634B CN 118303634 B CN118303634 B CN 118303634B CN 202410305642 A CN202410305642 A CN 202410305642A CN 118303634 B CN118303634 B CN 118303634B
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闵祥博
惠美星
徐长隆
苏美玲
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Renren Microbial Technology Research Shenyang Co ltd
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Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及具有增强免疫力功能的后生元及其制备方法和应用。本发明的后生元包括副干酪乳酪杆菌RH1729、乳酸片球菌RH2712、植物乳植杆菌HCS03‑001、发酵粘液乳杆菌HCS08‑005和鼠李糖乳酪杆菌RH0131。所述的制备方法是分别对5种菌株活化后，混合进行一次发酵和二次发酵，对最终的发酵液进行杀菌、干燥、收集和包装即得后生元产品。本发明的后生元乳酸菌胞外多糖含量高，并能显著促进巨噬细胞吞噬功效，为提高免疫力提供技术支持。

Description

具有增强免疫力功能的后生元及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及具有增强免疫力功能的后生元及其制备方法和应用。
背景技术
后生元是益生菌经由热处理、物理性处理、高静水压处理、冷冻干燥、超声波震荡等加工方式处理后，仍保有与活菌相同活性成分的菌体成分的统称，包括菌体成分和代谢产物。
乳酸菌胞外多糖(Exopoly Saccharides，EPS)是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外常渗于培养基的一类糖类化合物，有的依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖；有的进入培养基形成粘液，称为粘液多糖，它们都是微生物适应环境的产物。乳酸菌胞外多糖可赋予发酵乳制品特殊的质构和风味，起到安全的食品添加剂的作用，它还有可能成为食品级多糖的一个良好来源而广泛用于各种食品的增稠、稳定、乳化、胶凝及持水。同时，乳酸菌EPS具有多种生理功能，包括增强人体免疫力、抑制有害菌黏附、降血压、抗氧化、抗肿瘤、抗溃疡、抗病毒和改善肠道微生态环境等。由于乳酸菌EPS具有独特的理化及流变学特性，因此可作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、胶凝剂、填充剂和持水剂应用到食品、医药、石油化工以及生化产品等领域。尤其在食品领域中，乳酸菌EPS可作为新型天然的食品添加剂应用到发酵食品中，从而改善食品的质构、口感、流变学特性和风味等指标，同时赋予产品一定的营养保健功效。乳酸菌EPS作为天然的大分子活性物质，在调节机体免疫过程中具有很好的免疫原性。更加值得注意的是乳酸菌EPS的来源具有可追溯性，同时不会产生毒副作用，是理想的天然免疫佐剂。
微生物胞外多糖在产品结构、性能及生产方面所具有的特别优势，如胞外多糖具有产生量大、易于与菌体分离、可通过深层发酵实现工业化生产。由于乳酸菌是食品级工业生产菌，与其他菌相比安全性高，实用性更强。
虽然乳酸菌产生的胞外多糖的功能及应用广泛，但是现有的方法产量低，如何提高乳酸菌胞外多糖的产量是现在面临的主要问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种混合菌发酵的方法，包括副干酪乳酪杆菌RH1729、乳酸片球菌RH2712、植物乳植杆菌HCS03-001、发酵粘液乳杆菌HCS08-005和鼠李糖乳酪杆菌RH0131，该方法能够有效提高乳酸菌EPS的产量。
一方面，本发明提供了一种增强免疫力的益生菌组合物，所述的益生菌组合物包括副干酪乳酪杆菌RH1729、乳酸片球菌RH2712、植物乳植杆菌HCS03-001、发酵粘液乳杆菌HCS08-005和鼠李糖乳酪杆菌RH0131；
所述的副干酪乳酪杆菌RH1729的保藏编号为CGMCC No.28243；
所述的乳酸片球菌RH2712的保藏编号为CGMCC No.25165；
所述的植物乳植杆菌HCS03-001的保藏号为CGMCC No.16258；
所述的发酵粘液乳杆菌HCS08-005的保藏编号号为CGMCC No.16259；
所述的鼠李糖乳酪杆菌RH0131的保藏编号为CGMCC No.28242。
又一方面，本发明提供了前述益生菌组合物后生元的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
S1、将菌株分别进行活化培养；
S2、将步骤S1的发酵液接种于发酵罐进行混合菌株的一级发酵；
S3、将步骤S2的发酵液接种于发酵罐进行混合菌株的二级发酵；
S4、杀菌；
S5、干燥；
S6、粉体收集。
具体地，步骤S1所述活化培养的接种量按体积比为3-8％；所述活化培养的条件为：32-35℃，静置培养。
进一步具体地，所述的活化培养的终点OD600为8.0-17.0。
优选地，步骤S1所述活化培养的接种量按体积比为5％；所述活化培养的条件为：33±0.5℃，静置培养，副干酪乳酪杆菌RH1729、乳酸片球菌RH2712、植物乳植杆菌HCS03-001、发酵粘液乳杆菌HCS08-005、鼠李糖乳酪杆菌RH0131活化培养的终点OD600分别为12.0-16.0、12.0-16.0、10.0-14.0、6.0-10.0、6.0-10.0。
进一步优选地，副干酪乳酪杆菌RH1729、乳酸片球菌RH2712、植物乳植杆菌HCS03-001、发酵粘液乳杆菌HCS08-005、鼠李糖乳酪杆菌RH0131活化培养的终点OD600分别为14.0、14.0、12.0、8.0、8.0。
具体地，S2所述混合菌株的体积比为：副干酪乳酪杆菌RH1729：乳酸片球菌RH2712：植物乳植杆菌HCS03-001：发酵粘液乳杆菌HCS08-005：鼠李糖乳酪杆菌RH0131＝3-5:2-3:2-3:2-3:1-2。
优选地，S2所述混合菌株的体积比为：副干酪乳酪杆菌RH1729：乳酸片球菌RH2712：植物乳植杆菌HCS03-001：发酵粘液乳杆菌HCS08-005：鼠李糖乳酪杆菌RH0131＝3:2:2:2:1。
具体地，S2所述一级发酵中混合菌株的接种量按体积比为3-8％；所述发酵罐的装液量按体积计为40-80％；所述发酵的条件可以是：32-35℃搅拌发酵。
优选地，S2所述一级发酵的接种量按体积比为5％；所述发酵罐的装液量按体积计为40-80％；所述发酵的条件为：33±0.2℃搅拌发酵。
具体地，S3所述二级发酵的接种量按体积比为3-5％；所述发酵罐的装液量按体积计为40-80％；所述发酵的条件可以是：32-35℃搅拌发酵。
优选地，S3所述二级发酵的接种量按体积比为5％；所述发酵罐的装液量按体积计为40-80％；所述发酵的条件为：33±0.2℃搅拌发酵，
进一步具体地，步骤S3所述的二级发酵终点OD600为9.5-12.0
优选地，步骤S3所述的二级发酵终点OD600为11.0。
具体地，步骤S4所述杀菌的条件可以是：90-100℃，30-40minn。
优选地，步骤S4所述杀菌的条件为：95℃，30min。
具体地，步骤S5所述干燥为喷雾干燥。
进一步具体地，所述喷雾干燥的温度可以是195±5℃。
优选地，所述喷雾干燥的温度为195℃。
又一方面，本发明提供了前述的益生菌组合物或制备方法在制备增强免疫力的后生元中的应用。
具体地，所述的增强免疫力包括担保不限于促进巨噬细胞吞噬功效。
又一方面，本发明提供了一种后生元，所述的后生元是利用前述的益生菌组合物或制备方法获得的。
本发明所取得的技术效果：
(1)本发明制备的后生元乳酸菌EPS的含量高，高达2303.18μg/mL。
(2)本发明制备的后生元能够显著促进巨噬细胞吞噬功效。
保藏说明1：
菌株名称：RH1729；
保藏编号：CGMCC No.28243；
分类命名：副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)；
保藏日期：2023年08月24日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
保藏说明2：
菌株名称：RH0131；
保藏编号：CGMCC No.28242；
分类命名：鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)；
保藏日期：2023年08月24日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1为样品处理后斑马鱼体内荧光颗粒典型图；其中，红色荧光颗粒为荧光微球。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1.1培养基和菌株
培养基(g/L)：无水葡萄糖20.0；酵母蛋白胨10.0；酵母浸出物5.0；乙酸钠5.0；一水柠檬酸2.0；磷酸二氢钾2.0；硫酸镁0.6；硫酸锰0.25。
菌株：
副干酪乳酪杆菌RH1729，保藏编号为CGMCC No.28243；
乳酸片球菌RH2712，保藏编号为CGMCC No.25165；
植物乳植杆菌HCS03-001保藏号为CGMCC No.16258；
发酵粘液乳杆菌HCS08-005，保藏编号为CGMCC No.16259；
鼠李糖乳酪杆菌RH0131，保藏编号为CGMCC No.28242；
副干酪乳酪杆菌HCS17-040，保藏编号为CGMCCNo.19747；
鼠李糖乳酪杆菌RH0121，保藏编号为CGMCC NO.26429。
其中，乳酸片球菌RH2712、植物乳植杆菌HCS03-001、发酵粘液乳杆菌HCS08-005、副干酪乳酪杆菌HCS17-040和鼠李糖乳酪杆菌RH0121均为公开菌株，不涉及保藏证明。
1.2菌种活化
将副干酪乳酪杆菌RH1729、乳酸片球菌RH2712、植物乳植杆菌HCS03-001、发酵粘液乳杆菌HCS08-005、鼠李糖乳酪杆菌RH0131以纯菌种培养的方式分别按5％(v/v)接种量接种至含10mL培养基的三角瓶中，33±0.5℃静置培养17.0±0.5h，得到菌悬液，其中副干酪乳酪杆菌RH1729、乳酸片球菌RH2712、植物乳植杆菌HCS03-001、发酵粘液乳杆菌HCS08-005、鼠李糖乳酪杆菌RH0131发酵终点OD600分别为14.0、14.0、12.0、8.0、8.0。
1.3菌种培养
1.3.1一级发酵：
将活化后的菌种按照表1的添加比例混合，以5％(v/v)的接种量接种至一级发酵罐中，装液量为40-80％(v/v)，33±0.5℃、100±2r/min(优选为100r/min)搅拌发酵17.0±0.5h。
表1
菌株 添加比例(v/v)
副干酪乳酪杆菌RH1729 30.0％
乳酸片球菌RH2712 20.0％
植物乳植杆菌HCS03-001 20.0％
发酵粘液乳杆菌HCS08-005 20.0％
鼠李糖乳酪杆菌RH0131 10.0％
1.3.2二级发酵：
将一级发酵后的菌液以5％(v/v)的接种量接种至二级发酵罐中，装液量为40-80％(v/v)，33±0.5℃、100±2r/min(优选为100r/min)搅拌发酵48.0±0.5h，发酵终点OD600为11.0。
1.4杀菌
灭菌参数：95℃，30min。
1.6干燥
喷雾干燥，喷雾干燥温度195±5℃，优选195℃。
1.7粉体收集
1.8包装、入库
实施例2胞外多糖检测
取二级发酵后的菌液，采用苯酚-硫酸法测定乳酸菌EPS含量，反应体系：样品与5％苯酚、浓硫酸的比例为1:1:5，摇匀，室温下静置30min，使用酶标仪测OD490nm值。将OD490nm值带入标准曲线中即可算出乳酸菌EPS的含量。
结果：2303.18μg/mL
实施例3斑马鱼功能验证试验
3.1增强免疫力最大检测浓度(MTC)试验
斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450-550μS/cm；pH为6.5-8.5；硬度为50-100mg/L CaCO3)，由杭州环特生物科技股份有限公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2022-0004，饲养管理符合国际AAALAC认证(认证编号：001458)的要求，IACUC伦理审查号：IACUC-2023-7775-01。
野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后3天(3dpf)的斑马鱼用于样品增强免疫力功效MTC测定及其功效评价。
分组及处理方式如下：
随机选取3dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔均处理30尾斑马鱼。乳酸菌后生元组分别水溶给予浓度为125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL和2000μg/mL的乳酸菌后生元，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均静脉注射酒石酸长春瑞滨注射液建立斑马鱼免疫力低下模型。28℃处理96h后，测定乳酸菌后生元对增强免疫力功效斑马鱼的MTC。
如表2所示，在本实验条件下，乳酸菌后生元对增强免疫力功效斑马鱼MTC为500μg/mL。
表2样品增强免疫力功效最大检测浓度摸索实验结果(n＝30)
3.2增强免疫力功效试验
3.2.1试剂及材料
百令胶囊(以下简称百令胶囊)，批号2111064，杭州中美华东制药有限公司，阴凉干燥储存。用标准稀释水配制成15.0mg/mL母液，4℃储存。
酒石酸长春瑞滨注射液(批号190401，江苏豪森药业股份有限公司，China)；氯化钠注射液(批号S21091609，湖南科伦制药有限公司，China)；甲基纤维素(批号C2004046，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China)；荧光微球(批号MKCB2036V，SIGMA，USA)。
3.2.2实验方法
随机选取3dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔均处理30尾斑马鱼。乳酸菌后生元组分别水溶给予浓度为125μg/mL、250μg/mL和500μg/mL的乳酸菌后生元，阳性对照组给予15.0μg/mL浓度的百令胶囊，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均静脉注射酒石酸长春瑞滨注射液和荧光微球建立斑马鱼免疫力低下模型。正常对照组仅注射荧光微球。28℃处理96h后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用Image-J图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼体内剩余荧光颗粒数量，以该指标的统计学分析结果评价样品增强免疫力功效。
如表3和图1所示，在本实验条件下，乳酸菌后生元具有促进巨噬细胞吞噬功效。
表3.乳酸菌后生元增强免疫力功效评价实验结果(n＝10)
与模型对照组比较，**p<0.01，***p<0.001
对比例
与实施例1的区别见表4，其他同实施例1，并参照实施例2进行胞外多糖检测。
表4
实验结果见表5：
表5
由表5可知，将实施例中乳酸菌组成进行替换、删减、更改比例后，EPS均大幅度降低，表明本发明的技术方案具有协同增效作用。

Claims (7)

1.一种增强免疫力的后生元，其特征在于，所述的后生元是通过益生菌组合物制备而成的；所述的益生菌组合物包括副干酪乳酪杆菌RH1729、乳酸片球菌RH2712、植物乳植杆菌HCS03-001、发酵粘液乳杆菌HCS08-005和鼠李糖乳酪杆菌RH0131；
所述的副干酪乳酪杆菌RH1729的保藏编号为CGMCC No. 28243；
所述的乳酸片球菌RH2712的保藏编号为CGMCC No.25165；
所述的植物乳植杆菌HCS03-001的保藏号为CGMCC No.16258；
所述的发酵粘液乳杆菌HCS08-005的保藏编号号为CGMCC No.16259；
所述的鼠李糖乳酪杆菌RH0131的保藏编号为CGMCC No. 28242；
所述后生元的制备方法包括以下步骤：
S1、将菌株分别进行活化培养；
S2、将步骤S1的发酵液接种于发酵罐进行混合菌株的一级发酵；
S3、将步骤S2的发酵液接种于发酵罐进行混合菌株的二级发酵；
S4、杀菌；
S5、干燥；
S6、粉体收集；
步骤S2所述混合菌株的体积比为：副干酪乳酪杆菌RH1729：乳酸片球菌RH2712：植物乳植杆菌HCS03-001：发酵粘液乳杆菌HCS08-005：鼠李糖乳酪杆菌RH0131=3-5:2-3:2-3:2-3:1-2。
2.根据权利要求1所述的后生元，其特征在于，步骤S1所述活化培养的接种量按体积比为3-8%，活化培养的条件为：32-35℃，静置培养。
3.根据权利要求2所述的后生元，其特征在于，所述的活化培养的终点OD600为8.0-17.0。
4.根据权利要求1所述的后生元，其特征在于，步骤S2和S3中所述的一级发酵和二级发酵中混合菌株的接种量按体积比均为3-8%；所述发酵罐的装液量按体积计为40-80%；所述发酵的条件为：32-35℃搅拌发酵。
5.根据权利要求4所述的后生元，其特征在于，步骤S3所述的二级发酵终点OD600为9.5-12.0。
6.根据权利要求1-5任一项所述的后生元，其特征在于，步骤S4所述杀菌的条件为：90-100℃，30-40min；步骤S5所述干燥为喷雾干燥。
7.权利要求1中所述的益生菌组合物在制备增强免疫力的后生元中的应用。
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