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CN103993082B - 用于肺癌的诊断、预后和治疗的基于微小rna 的方法和组合物 - Google Patents

用于肺癌的诊断、预后和治疗的基于微小rna 的方法和组合物 Download PDF

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CN103993082B CN201410210166.6A CN201410210166A CN103993082B CN 103993082 B CN103993082 B CN 103993082B CN 201410210166 A CN201410210166 A CN 201410210166A CN 103993082 B CN103993082 B CN 103993082B
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Abstract

本发明提供了用于肺癌的诊断、预后和治疗的新的方法和组合物。本发明还提供了鉴定抗肺癌剂的方法。

Description

用于肺癌的诊断、预后和治疗的基于微小RNA的方法和组合物
发明人:Carlo M.Croce，Nozomu Yanaihara和Curtis C.Harris
本申请是申请日为2007年1月3日、申请号为200780006750.8、发明名称为“用于肺癌的诊断、预后和治疗的基于微小RNA的方法和组合物”的申请的分案申请。
政府资助
本发明全部或部分由来自CCR/NCI/NIH的基金CA76259和校内基金资助，也依照合同号NO1-CO-12400由来自NCI/NIH的联邦基金资助。政府具有本发明的某些权利。
发明背景
在世界范围内，肺癌造成比任何其它形式的癌症更多的死亡(Goodman，G.E.，Thorax57:994-999(2002))。在美国，肺癌是男性和女性癌症死亡的主要原因。在2002年，肺癌死亡率估计是134,900例。肺癌也是所有欧洲国家癌症死亡的主要原因，肺癌-相关死亡的数目在发展中国家也快速增加。
无论在诊断时的疾病阶段，所有肺癌患者的五年生存率仅是约13％。这与在该疾病仍然在局部时检测出的病例的46％的五年生存率形成对比。但是，在该疾病已经扩散之前，仅16％的肺癌被发现。早期检测是困难的，因为在该疾病已经达到晚期之前经常观察不到临床症状。目前，使用胸部X线、痰中含有的细胞类型的分析和支气管气道的纤维光学检查来辅助诊断。治疗方案由癌症的类型和阶段决定，包括手术、放疗和/或化疗。尽管对该癌症和其它癌症的治疗进行了大量研究，肺癌仍然难以有效地诊断和治疗。因此，非常需要改进的检测和治疗这些癌症的方法。
Carbone,J.Clin.Oncol.23:3219-3226(2005)；Granville和Dennis,CellMol.Biol.32:169-176(2005))。例如，p53和RB/p16途径中的缺陷是肺癌中常见的。几个其它的基因，例如K-ras,PTEN,FHIT和MYO18B，在肺癌中发生遗传改变，尽管频率更低(Minna等人,Cancer Cell1:49-52(2002)；Sekido等人,Annu.Rev.Med.54:73-87(2003)；Yokota和Kohno,Cancer Sci.95:197-204(2004))。尽管对已知的基因和蛋白的关注已经产生了有用的信息，以前未知的肺癌标记也可以导致对肺癌生物学的洞察。
微小RNA(miRNA)是通过与信使RNA(mRNA)靶杂交并引发对它的翻译抑制或较不常见地引起其降解来控制基因表达的一类小的非编码RNA。miRNA的发现和研究已揭示在生物发育和各种细胞过程例如细胞分化、细胞生长和细胞死亡中发挥重要作用的miRNA介导的基因调控机制(Cheng，A.M.，等人，Nucleic Acids Res.33:1290-1297(2005))。近年来的研究表明，特定miRNA的异常表达可参与人的疾病，例如神经障碍(Ishizuka，A.，等人，GenesDev.16:2497-2508(2002))和癌症。具体地，已在人慢性淋巴细胞性白血病中发现miR-16-1和/或miR-15a的不当表达(Calin，G.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:15524-15529(2002))。
含有所有已知的人微小RNA的微阵列的开发和应用，已经允许同时分析样品中每种miRNA的表达(Liu,C.G.等人,Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:9740-9744(2004))。这些微小RNA微阵列不仅已经用于证实miR-16-1在人CLL细胞中失调，而且用于产生与明确定义的人CLL的临床病理学特征有关的miRNA表达特征(Calin,G.A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:1175-11760(2004))。
对在肺癌细胞中差异表达的微小RNA的鉴定，会辅助诊断、预测和治疗肺癌。此外，对这些miRNA的推定靶的鉴定，会辅助解释它们的致病作用。本发明提供了用于肺癌的诊断、预后和治疗的新的方法和组合物。
发明内容
本发明部分地基于与肺癌细胞中改变的表达水平有关的特定miRNA的鉴定。
因此，本发明包括诊断受试者是否患有肺癌或处于发生肺癌的风险中的方法。根据本发明的方法，将受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平与对照样品中的相应的miR基因产物的水平相比较。与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中所述miR基因产物的水平的改变(例如增加,降低)，指示着受试者患有肺癌或处于发生肺癌的风险中。在某些实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自：miR-21,miR-191,miR-126*,miR-210,miR-155,miR-143,miR-205,miR-192-prec,miR-224,miR-126,miR-24-2,miR-30a-5p,miR-212,miR-140,miR-9,miR-214,miR-17-3p,miR-124a-1,miR-218-2,miR-95,miR-145,miR-198,miR-216-prec,miR-219-1,miR-106a,miR-197,miR-192,miR-125a-prec,miR-26a-1-prec,miR-146,miR-203,miR-199b-prec,let-7a-2-prec,miR-27b,miR-32,miR-29b-2,miR-220,miR-33,miR-181c-prec,miR-150,miR-101-1,miR-124a-3,miR-125a和let-7f-1。在一个特定的实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自：miR-21,miR-191,miR-155,miR-210,miR-126*和miR-224。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自：miR-21,miR-205和miR-216。在另一个实施方案中，所述肺癌是肺腺癌，且所述至少一种miR基因产物选自：miR-21,miR-191,miR-155,miR-210,miR-126*,miR-126,miR-24-2,miR-219-1,miR-95,miR-192-prec,miR-220,miR-216-prec,miR-204-prec,miR-188,miR-198,miR-145和miR-224。
使用本领域技术人员众所周知的众多技术(例如，定量或半定量RT-PCR,RNA印迹分析,溶液杂交检测)，可以测量至少一种miR基因产物的水平。在一个具体的实施方案中，如下测量至少一种miR基因产物的水平：从获自受试者的测试样品逆转录RNA，以提供一组靶寡脱氧核苷酸，使所述靶寡脱氧核苷酸与一种或多种miRNA-特异性探针寡核苷酸(例如，包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列)杂交，以提供测试样品的杂交谱，并对比测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱。测试样品中至少一种miRNA的信号相对于对照样品的变化指示着受试者患有肺癌或处于发生肺癌的风险中。在一个特定的实施方案中，所述微阵列包含针对所有已知人miRNA的实质部分的miRNA-特异性探针寡核苷酸。在另一个实施方案中，所述微阵列包含针对选自下述的一种或多种miRNA的miRNA-特异性探针寡核苷酸：miR-21,miR-191,miR-126*,miR-210,miR-155,miR-143,miR-205,miR-192-prec,miR-224,miR-126,miR-24-2,miR-30a-5p,miR-212,miR-140,miR-9,miR-214,miR-17-3p,miR-124a-1,miR-218-2,miR-95,miR-145,miR-198,miR-216-prec,miR-219-1,miR-106a,miR-197,miR-192,miR-125a-prec,miR-26a-1-prec,miR-146,miR-203,miR-199b-prec,let-7a-2-prec,miR-27b,miR-32,miR-29b-2,miR-220,miR-33,miR-181c-prec,miR-150,miR-101-1,miR-124a-3,miR-125a和let-7f-1。
本发明也提供了确定患有肺癌的受试者的预后的方法，其包括测量在来自受试者的测试样品中与肺癌不良预后有关的至少一种miR基因产物的水平。根据这些方法，与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中与不良预后有关的miR基因产物的水平的改变，指示着不良预后。在某些实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自：miR-155,miR-17-3p,miR-106a,miR-93,let-7a-2,miR-145,let-7b,miR-20和miR-21。在一个特定的实施方案中，所述肺癌是肺腺癌，且所述至少一种miR基因产物选自：miR-155和let-7a-2。
可以如本文所述(例如定量或半-定量RT-PCR,RNA印迹分析,溶液杂交检测,微阵列分析)，测量所述至少一种miR基因产物的水平。与对照样品相比，测试样品中至少一种miRNA的信号的改变，指示着受试者患有不良预后的肺癌或处于发生不良预后的肺癌的风险中。在一个特定的实施方案中，miR-125a、miR-125b-1、miR-224和/或miR-21的信号的改变，指示着受试者患有不良预后的肺癌或处于发生不良预后的肺癌的风险中。在另一个实施方案中，来自患有肺腺癌的受试者的样品中miR-155和/或let-7a-2信号的改变，指示着不良预后。在一个特定实施方案中，所述微阵列包含针对选自下述的一种或多种miRNA的miRNA-特异性探针寡核苷酸：miR-21,miR-191,miR-126*,miR-210,miR-155,miR-143,miR-205,miR-192-prec,miR-224,miR-126,miR-24-2,miR-30a-5p,miR-212,miR-140,miR-9,miR-214,miR-17-3p,miR-124a-1,miR-218-2,miR-95,miR-145,miR-198,miR-216-prec,miR-219-1,miR-106a,miR-197,miR-192,miR-125a-prec,miR-26a-1-prec,miR-146,miR-203,miR-199b-prec,let-7a-2-prec,miR-27b,miR-32,miR-29b-2,miR-220,miR-33,miR-181c-prec,miR-150,miR-101-1,miR-124a-3,miR-125a和let-7f-1。
本发明也包括治疗受试者的肺癌的方法,其中受试者的癌细胞中至少一种miR基因产物失调(例如，减量调节，增量调节)。当至少一种分离的miR基因产物在肺癌细胞中减量调节时，该方法包括，施用有效量的分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段，从而抑制受试者中癌细胞的增殖。当至少一种分离的miR基因产物在癌细胞中增量调节时，该方法包括，给受试者施用有效量的至少一种用于抑制所述至少一种miR基因产物的表达的化合物,从而抑制肺癌细胞的增殖。
在一个相关实施方案中，治疗受试者的肺癌的方法另外包括下述步骤：首先测定受试者肺癌细胞中至少一种miR基因产物的量，并将所述miR基因产物的水平与对照细胞中相应的miR基因产物的水平相对比。如果肺癌细胞中miR基因产物的表达失调(例如，减量调节，增量调节)，该方法另外包括，改变在肺癌细胞中表达的所述至少一种miR基因产物的量。在一个实施方案中，在癌细胞中表达的miR基因产物的量小于在对照细胞中表达的miR基因产物的量，并将有效量的所述miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段施用给受试者。在另一个实施方案中，在癌细胞中表达的miR基因产物的量大于在对照细胞中表达的miR基因产物的量，并将有效量的至少一种用于抑制所述至少一种miR基因的表达的化合物施用给受试者。
本发明另外提供了用于治疗肺癌的药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一种分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段,和药学上可接受的载体。在一个特定的实施方案中，所述至少一种miR基因产物对应于相对于合适的对照细胞在肺癌细胞中具有降低的表达水平的miR基因产物。在某些实施方案中，所述分离的miR基因产物选自：miR-126*,miR-143,miR-192,miR-224,miR-126,miR-30a-5p,miR-140,miR-9,miR-124a-1,miR-218-2,miR-95,miR-145,miR-198,miR-216,miR-219-1,miR-125a,miR-26a-1,miR-199b,let-7a-2,miR-27b,miR-32,miR-29b-2,miR-220,miR-33,miR-181c,miR-101-1,miR-124a-3,let-7f-1和其组合。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种抑制miR表达的化合物。在一个特定的实施方案中，所述至少一种抑制miR表达的化合物对在肺癌细胞中的表达大于对照细胞的miR基因产物是特异性的。在某些实施方案中，所述抑制miR表达的化合物对一种或多种选自下述的miR基因产物是特异性的：miR-21,miR-191,miR-210,miR-155,miR-205,miR-24-2,miR-212,miR-214,miR-17-3p,miR-106a,miR-197,miR-192,miR-146,miR-203,miR-150和其组合。
本发明也包括鉴定抗肺癌剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂，和测量细胞中至少一种miR基因产物的水平。在一个实施方案中，该方法包括，给细胞提供测试试剂，和测量与肺癌细胞中降低的表达水平有关的至少一种miR基因产物的水平。与合适的对照细胞相比，所述细胞中所述miR基因产物的水平的增加，指示着测试试剂是抗肺癌剂。在一个特定的实施方案中，与肺癌细胞中降低的表达水平有关的至少一种miR基因产物选自：miR-126*,miR-143,miR-192,miR-224,miR-126,miR-30a-5p,miR-140,miR-9,miR-124a-1,miR-218-2,miR-95,miR-145,miR-198,miR-216,miR-219-1,miR-125a,miR-26a-1,miR-199b,let-7a-2,miR-27b,miR-32,miR-29b-2,miR-220,miR-33,miR-181c,miR-101-1,miR-124a-3,let-7f-1和其组合。
在其它实施方案中，该方法包括，给细胞提供测试试剂，和测量与肺癌细胞中增加的表达水平有关的至少一种miR基因产物的水平。与合适的对照细胞相比，与肺癌细胞中增加的表达水平有关的miR基因产物的水平的降低，指示着测试试剂是抗肺癌剂。在一个特定的实施方案中，与肺癌细胞中增加的表达水平有关的至少一种miR基因产物选自：miR-21,miR-191,miR-210,miR-155,miR-205,miR-24-2,miR-212,miR-214,miR-17-3p,miR-106a,miR-197,miR-192,miR-146,miR-203,miR-150和其组合。
附图简述
本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。含有彩色附图的本专利或专利申请公开的拷贝将在提出请求并支付必要的费用后由官方提供。
图1显示的图描绘了通过实时RT-PCR分析测得的肺癌(Ca)和非癌(N)组织中人miR-21前体(hsa-mir-21；上图)、人miR-126*前体(hsa-mir-126*；中图)和人miR-205前体(hsa-mir-205；下图)的相对表达水平。癌样品是腺癌或鳞状细胞癌(SCC)。进行配对t检验，以确定肺癌组织和非癌肺组织中的表达水平之间的统计学显著性。
图2描述了通过溶液杂交测得的肺癌样品(即，腺癌(Adeno)和鳞状细胞癌(SCC))中miR-21(hsa-mir-21)、miR-126*(hsa-mir-126*)和miR-205(hsa-mir-205)的成熟miRNA的表达。Ca代表癌性的肺组织，N代表非癌肺组织。5S rRNA用作加样对照。
图3A的树状图描绘了基于代表小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)的13个肺癌细胞系的微小RNA表达谱的分级聚类。
图3B描述了与图3A所列出的那些相对应的13个肺癌细胞系(顶部)的miRNA表达簇视图。根据颜色指示在图右侧列出的不同miRNA的表达水平。蓝色指示低于中值的表达水平，黑色指示大约与中值相等的表达水平，橙色指示大于中值的表达水平。灰色指示缺少的数据点。
图4是腺癌患者的Kaplan-Meier存活曲线。根据hsa-mir-155表达，将其中杂交强度不同于背景的腺癌病例(参见实施例4)分类，并使用时序检验对比存活数据。将平均表达比定义为，平均表达比＝肿瘤表达的平均值/非癌组织表达的平均值。将hsa-mir-155高表达组(即，表达比≥平均表达比(1.42)的组；n＝27)与相应的非癌肺组织相对比。将hsa-mir-155低表达组(即，表达比<平均表达比(1.42)的组；n＝28)与相应的非癌肺组织相对比。所述比例代表相对于非癌对照的肺癌样品中的杂交信号强度。
图5是腺癌患者的Kaplan-Meier存活曲线。根据hsa-let-7a-2表达，将其中杂交强度不同于背景的腺癌病例(参见实施例4)分类，并使用时序检验对比存活数据。将平均表达比定义为，平均表达比＝肿瘤表达的平均值/非癌组织表达的平均值。将hsa-let-7a-2高表达组(即，表达比≥平均表达比(0.95)的组；n＝34)与相应的非癌肺组织相对比。将hsa-let-7a-2低表达组(即，表达比<平均表达比(0.95)的组；n＝18)与相应的非癌肺组织相对比。
图6是腺癌患者的Kaplan-Meier存活曲线。根据前体hsa-miR-155表达，将来自一个原始组群的32个腺癌病例分类，并使用时序检验对比存活数据。将平均表达比定义为，平均表达比＝肿瘤表达的平均值/非癌组织表达的平均值。将前体hsa-miR-155高表达组(即，表达比≥平均表达比(1.19)的组；n＝13)与相应的非癌肺组织相对比。将前体hsa-miR-155低表达组(即，表达比<平均表达比(1.19)的组；n＝19)与相应的非癌肺组织相对比。
图7是腺癌患者的Kaplan-Meier存活曲线。根据前体hsa-let-7a-2表达，将来自一个原始组群的32个腺癌病例分类，并使用时序检验对比存活数据。将平均表达比定义为，平均表达比＝肿瘤表达的平均值/非癌组织表达的平均值。将前体hsa-let-7a-2高表达组(即，表达比≥平均表达比(0.92)的组；n＝18)与相应的非癌肺组织相对比。将前体hsa-let-7a-2低表达组(即，表达比<平均表达比(0.92)的组；n＝14)与相应的非癌肺组织相对比。
图8是腺癌患者的Kaplan-Meier存活曲线。根据前体hsa-let-7a-2表达，将来自一个独立的额外组群的32个腺癌病例分类，并使用时序检验对比存活数据。前体hsa-mir-155高表达组(n＝14)；前体hsa-mir-155低表达组(n＝18)。
图9是腺癌患者的Kaplan-Meier存活曲线。根据前体hsa-let-7a-2表达，将来自一个独立的额外组群的32个腺癌病例分类，并使用时序检验对比存活数据。前体hsa-let-7a-2高表达组(n＝15)；前体hsa-let-7a-2低表达组(n＝17)。
图10是腺癌患者的Kaplan-Meier存活曲线。根据如通过实时RT-PCR分析所估计的前体hsa-mir-155表达，将来自2个独立组群组合的64个腺癌病例分类。使用时序检验对比存活数据。将平均表达比定义为，平均表达比＝肿瘤表达的平均值/非癌组织表达的平均值。将前体hsa-miR-155高表达组(即，表达比≥平均表达比(1.19)的组；n＝27)与相应的非癌肺组织相对比。将前体hsa-miR-155低表达组(即，表达比<平均表达比(1.19)的组；n＝37)与相应的非癌肺组织相对比。
图11是腺癌患者的Kaplan-Meier存活曲线。根据如通过实时RT-PCR分析所估计的前体hsa-let-7a-2表达，将来自2个独立组群组合的64个腺癌病例分类。使用时序检验对比存活数据。将平均表达比定义为，平均表达比＝肿瘤表达的平均值/非癌组织表达的平均值。将前体hsa-let-7a-2高表达组(即，表达比≥平均表达比(0.92)的组；n＝33)与相应的非癌肺组织相对比。将前体hsa-let-7a-2低表达组(即，表达比<平均表达比(0.92)的组；n＝31)与相应的非癌肺组织相对比。
图12描述了在2个肺癌细胞系(H157,A549)中用5-氮杂-dC和/或TSA处理后MYO18BmRNA的表达，如通过RT-PCR分析所测得的。泳道1,无处理；泳道2,用1.0μM5-氮杂-dC处理72小时；泳道3,用1.0μM TSA处理24小时；泳道4,用1.0μM5-氮杂-dC处理72小时，随后用1.0μMTSA处理24小时。GAPDH表达用作加样对照。
发明详述
本发明部分地基于，与正常的对照细胞相比，在肺癌细胞中具有改变的表达的特定miRNA的鉴定，也基于这些微小RNA与特定诊断、预后和治疗特征的关联。
如本文中互换使用的，"miR基因产物,""微小RNA,""miR,"或"miRNA"是指来自miR基因的未加工的或加工过的RNA转录物。由于miR基因产物不翻译成蛋白，术语"miR基因产物"不包括蛋白。未加工的miR基因转录物也称作"miR前体"，通常包含长度为约70-100个核苷酸的RNA转录物。miR前体可以用RNA酶(例如，Dicer,Argonaut,或RNA酶III(例如，大肠杆菌RNA酶III))消化加工成有活性的19-25个核苷酸的RNA分子。该有活性的19-25个核苷酸的RNA分子也称作"加工过的"miR基因转录物或"成熟的"miRNA。
所述有活性的19-25个核苷酸的RNA分子可以通过天然加工途径(例如，使用完整细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(例如，使用分离的加工酶，例如分离的Dicer,Argonaut,或RNA酶III)从miR前体得到。应当理解，所述有活性的19-25个核苷酸的RNA分子也可以通过生物或化学合成直接生成，不必从miR前体加工。当在本文中用名称提及微小RNA时，该名称对应着前体和成熟形式两者，除非另有说明。
本发明包括诊断受试者是否患有肺癌或处于发生肺癌的风险中的方法，其包括测量来自受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，并将测试样品中所述miR基因产物的水平与对照样品中相应的miR基因产物的水平相对比。如本文所用的，“受试者”可以是患有或被怀疑患有肺癌的任意哺乳动物。在一个优选的实施方案中，受试者是患有或被怀疑患有肺癌的人。
所述肺癌可以是任意形式的肺癌，例如，不同组织学的肺癌(例如腺癌,鳞状细胞癌)。此外，所述肺癌可以伴随特定预后(例如低生存率,快速进展)。
表1a和1b描述了特定的前体和成熟人微小RNA的核苷酸序列。
表1a-人微小RNA前体序列。
*前体序列中加下划线的序列对应于成熟的加工过的miR转录物(参见表1b)。有些前体序列具有2个加下划线的序列，它们表示源自相同前体的2种不同的成熟miR。所有序列都是人的。
表1b-人成熟微小RNA序列。
可以测量从受试者得到的生物样品的细胞中的至少一种miR基因产物的水平。例如，通过常规活检技术，可以从被怀疑患有肺癌的受试者取出组织样品。在另一个实施方案中，可以从受试者取出血液样品，并通过标准技术，分离白细胞用于DNA提取。优选地，在放疗、化疗或其它治疗性处理之前，从受试者得到血液或组织样品。相应的对照组织或血液样品或对照参照样品，可以从受试者的未受影响的组织、从正常人个体或正常个体的群体、或从与受试者样品中大多数细胞相对应的培养细胞得到。然后与来自受试者的样品一起，加工处理对照组织或血液样品，从而可以将来自受试者样品的细胞中从给定miR基因产生的miR基因产物的水平与来自对照样品的细胞的相应miR基因产物水平相对比。或者，可以与测试样品单独分开地得到和加工处理参照样品(例如在不同时间)，并将来自测试样品的细胞中从给定miR基因产生的miR基因产物的水平与来自参照样品的相应的miR基因产物水平相对比。
在一个实施方案中，测试样品中至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平(即，miR基因产物的表达被“增量调节”)。如本文使用的，当来自受试者的细胞或组织样品中miR基因产物的量大于对照细胞或组织样品中相同基因产物的量时，该miR基因产物的表达被"增量调节"。在另一个实施方案中，测试样品中至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中的相应的miR基因产物的水平(即，miR基因产物的表达被"减量调节")。如本文使用的，当从来自受试者的细胞或组织样品的基因产生的miR基因产物的量小于从对照细胞或组织样品中相同基因产生的量时，该miR基因产物的表达被"减量调节"。可以相对于一种或多种RNA表达标准，测定对照和正常样品中的相对miR基因表达。所述标准可包括，例如，零miR基因表达水平,标准细胞系中的miR基因表达水平，受试者的未受影响的组织中的miR基因表达水平，或以前对正常人对照群体得到的miR基因表达的平均水平。
与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，从受试者得到的样品中miR基因产物水平的改变(即，增加或降低)，指示着受试者中存在肺癌。在一个实施方案中，测试样品中至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，测试样品中至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中相应的miR基因产物的水平。在一个特定实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自：miR-21,miR-191,miR-126*,miR-210,miR-155,miR-143,miR-205,miR-192-prec,miR-224,miR-126,miR-24-2,miR-30a-5p,miR-212,miR-140,miR-9,miR-214,miR-17-3p,miR-124a-1,miR-218-2,miR-95,miR-145,miR-198,miR-216-prec,miR-219-1,miR-106a,miR-197,miR-192,miR-125a-prec,miR-26a-1-prec,miR-146,miR-203,miR-199b-prec,let-7a-2-prec,miR-27b,miR-32,miR-29b-2,miR-220,miR-33,miR-181c-prec,miR-150,miR-101-1,miR-124a-3,miR-125a和let-7f-1。在一个特定的实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自：miR-21,miR-205和miR-216。在另一个实施方案中，所述肺癌是肺腺癌，且所述至少一种miR基因产物选自：miR-21,miR-191,miR-155,miR-210,miR-126*和miR-224.
在一个特定的实施方案中，所述miR基因产物不是下述的一种或多种：let7a-2,let-7c,let-7g,let-7i,miR-7-2,miR-7-3,miR-9,miR-9-1,miR-10a,miR-15a,miR-15b,miR-16-1,miR-16-2,miR-17-5p,miR-20a,miR-21,miR-24-1,miR-24-2,miR-25,miR-29b-2,miR-30,miR-30a-5p,miR-30c,miR-30d,miR-31,miR-32,miR-34,miR-34a,miR-34aprec,miR-34a-1,miR-34a-2,miR-92-2,miR-96,miR-99a,miR-99b prec,miR-100,miR-103,miR-106a,miR-107,miR-123,miR-124a-1,miR-125b-1,miR-125b-2,miR-126*,miR-127,miR-128b,miR-129,miR-129-1/2prec,miR-132,miR-135-1,miR-136,miR-137,miR-141,miR-142-as,miR-143,miR-146,miR-148,miR-149,miR-153,miR-155,miR159-1,miR-181,miR-181b-1,miR-182,miR-186,miR-191,miR-192,miR-195,miR-196-1,miR-196-1prec,miR-196-2,miR-199a-1,miR-199a-2,miR-199b,miR-200b,miR-202,miR-203,miR-204,miR-205,miR-210,miR-211,miR-212,miR-214,miR-215,miR-217,miR-221和/或miR-223。
使用适用于检测生物样品中的RNA表达水平的任意技术，可以测量样品中miR基因产物的水平。用于测定生物样品(例如，细胞，组织)中RNA表达水平的合适技术(例如，RNA印迹分析，RT-PCR，原位杂交)是本领域技术人员众所周知的。在一个具体的实施方案中，使用RNA印迹分析，检测至少一种miR基因产物的水平。例如，可以如下从细胞纯化总细胞RNA：在有核酸提取缓冲液存在下匀浆，随后离心。沉淀核酸，通过用DNA酶处理和沉淀，去除DNA。然后根据标准技术，通过琼脂糖凝胶上的凝胶电泳分离RNA分子，并转移至硝酸纤维素滤膜。然后通过加热，将RNA固定化在滤膜上。使用与目标RNA互补的适当标记的DNA或RNA探针，进行对特定RNA的检测和定量。参见，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，J.Sambrook等人编，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，Chapter7，其所有公开内容通过参考引用并入本文。
从表1a和表1b中提供的核酸序列，可以生成适用于给定miR基因产物的RNA印迹杂交的探针(例如DNA探针,RNA探针)，包括、但不限于，与目标miR基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％互补性的探针，以及与目标miR基因产物具有完全互补性的探针。标记的DNA和RNA探针的制备方法，和其与靶核苷酸序列的杂交的条件，描述在Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook等人,编.,第2版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989,Chapters10和11,其所有公开内容都通过参考引用并入本文。
例如，核酸探针用下述物质标记，例如，放射性核素，例如3H，32P，33P，14C,或35S；重金属；能起到标记配体的特异性结合对成员功能的配体(例如，生物素，抗生物素蛋白或抗体)；荧光分子；化学发光分子；酶等。
通过Rigby等人(1977)，J.Mol.Biol.113:237-251的切口平移方法，或通过Fienberg等人(1983)，Anal.Biochem.132:6-13的随机引物法，可以将探针标记成高比放射性，所述文献的所有公开内容都通过参考引用并入本文。后者是从单链DNA或从RNA模板合成高比放射性的32P-标记的探针的选择方法。例如，通过根据切口平移方法用高放射性的核苷酸替换现有的核苷酸，可以制备比放射性大大超过108cpm/微克的32P-标记的核酸探针。然后通过使杂交的滤膜曝光于照相胶片，可以进行杂交的放射自显影检测。对杂交的滤膜曝光的照相胶片的光密度扫描，会提供miR基因转录物水平的精确测量。使用另一个方案，通过计算机化成像系统，例如可从Amersham Biosciences，Piscataway，NJ得到的Molecular Dynamics400-B2D磷光计，可以定量miR基因转录物水平。
当DNA或RNA探针的放射性核素标记不可行时，随机-引物方法可以用于将类似物例如dTTP类似物5-(N-(N-生物素基-ε-氨基己酰基)-3-氨基烯丙基)脱氧尿苷三磷酸掺入探针分子中。通过与生物素-结合蛋白(例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素和抗体(例如，抗-生物素抗体)，其偶联到荧光染料或产生颜色反应的酶上)的反应，可以检测生物素化的探针寡核苷酸。
除了RNA印迹和其它RNA杂交技术以外，使用原位杂交技术，可以测定RNA转录物的水平。该技术需要比RNA印迹技术更少的细胞，包括将整个细胞放置在显微镜盖玻片上，用含有放射性的或其它标记的核酸(例如，cDNA或RNA)探针的溶液探测细胞的核酸内容物。该技术特别适用于分析来自受试者的组织活检样品。原位杂交技术的实践更详细地描述在美国专利号5,427,916，其全部公开内容通过参考引用并入本文。从表1a和表1b中提供的核酸序列，可以生成适用于给定miR基因产物的原位杂交的探针，包括、但不限于，与目标miR基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％互补性的探针，以及与目标miR基因产物具有完全互补性的探针，如上所述。
通过逆转录miR基因转录物，随后通过聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增逆转录的转录物，也可以测定细胞中miR基因转录物的相对数目。可通过与内部标准例如来自存在于相同样品中的“管家”基因的mRNA的水平比较，来定量miR基因转录物的水平。用作内部标准的合适的“管家”基因包括例如肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)。用于定量和半-定量RT-PCR的方法和其变化形式，是本领域技术人员众所周知的。
在一些情况下，可能希望同时测定样品中许多不同miR基因产物的表达水平。在其它情况下，可能希望测定所有已知的与癌症相关的miR基因的转录物的表达水平。评估数百个miR基因或基因产物的癌症特异性表达水平是非常耗时的，并且需要大量总RNA(对于每个RNA印迹至少20μg)和需要放射性同位素的放射自显影技术。
为克服这些限制，可构建微芯片形式(即，微阵列)的寡物文库，其包含对于一组miR基因特异性的一组寡核苷酸(例如，寡脱氧核苷酸)探针。通过使用该微阵列，可通过逆转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸，然后使其与微阵列上的探针寡脱氧核苷酸杂交，从而产生杂交或表达谱，来测定生物样品中多种微小RNA的表达水平。然后科将测试样品的杂交谱与对照样品进行比较，以确定在实体癌细胞中具有改变的表达水平的微小RNA。如本文所用的，“探针寡核苷酸”或“探针寡脱氧核苷酸”是指能够与靶寡核苷酸杂交的寡核苷酸。“靶寡核苷酸”或“靶寡脱氧核苷酸”是指待检测(例如通过杂交)的分子。“miR-特异性的探针寡核苷酸”或“对miR特异性的探针寡核苷酸”是指具有经选择与特定miR基因产物杂交或与该特定miR基因产物的逆转录物杂交的序列的探针寡核苷酸。
特定样品的“表达谱”(expression profile)或“杂交谱”(hybridizationprofile)基本上是样品的状态的指纹图谱；尽管两种状态可具有相似表达的任何特定基因，但同时评估许多基因可允许产生对于细胞状态独特的基因表达谱。即，正常组织可与肺癌组织区分，并且在肺癌组织内，可确定不同的预后状态(例如，好的或差的长期存活希望)。通过比较不同状态中的肺癌组织的表达谱，可获得关于那些基因在这些状态每一种中是重要的(包括基因的增量调节和减量调节)信息。在肺癌组织或正常肺组织中差异表达的序列的鉴定以及导致不同的预后结果的差异表达的鉴定，允许以许多方式使用该信息。例如，可评价特定的治疗方案(例如，以确定化疗药物是否起着改善特定患者的长期预后的作用)。类似地，可通过将患者的样品与已知的表达谱比较来进行或确认诊断。此外，这些基因表达谱(或个别基因)允许筛选抑制肺癌表达谱或将差预后谱转变成较好的预后谱的药物候选品。
因此，本发明提供了诊断受试者是否患有肺癌或处于发生肺癌的风险中的方法，其包括从获自受试者的测试样品逆转录RNA，以提供一组靶寡脱氧核苷酸,使所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，以提供测试样品的杂交谱，并对比测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱，其中至少一种miRNA的信号的改变指示着受试者患有肺癌或处于发生肺癌的风险中。在一个实施方案中，所述微阵列包含针对所有已知人miRNA的实质部分的miRNA-特异性探针寡核苷酸。在一个特定的实施方案中，所述微阵列包含针对选自下述的一种或多种miRNA的miRNA-特异性探针寡核苷酸：miR-21,miR-191,miR-126*,miR-210,miR-155,miR-143,miR-205,miR-192-prec,miR-224,miR-126,miR-24-2,miR-30a-5p,miR-212,miR-140,miR-9,miR-214,miR-17-3p,miR-124a-1,miR-218-2,miR-95,miR-145,miR-198,miR-216-prec,miR-219-1,miR-106a,miR-197,miR-192,miR-125a-prec,miR-26a-1-prec,miR-146,miR-203,miR-199b-prec,let-7a-2-prec,miR-27b,miR-32,miR-29b-2,miR-220,miR-33,miR-181c-prec,miR-150,miR-101-1,miR-124a-3,miR-125a,let-7f-1和其组合。
可以从由已知的miRNA序列产生的基因特异性寡核苷酸探针制备微阵列。微阵列可包含对于每种miRNA的两种不同的寡核苷酸探针，一种包含活性的成熟序列，另一种对于该miRNA的前体是特异性的。微阵列还可以包含对照，例如一个或多个与人直系同源物相异仅少数碱基的小鼠序列，该序列可用作杂交严格性条件的对照。还可将来自两个物种的tRNA和其它RNA(例如，rRNA，mRNA)印在微芯片上，为特异性杂交提供内部的、相对稳定的阳性对照。还可在微芯片上包含非特异性杂交的一个或多个合适的对照。为此，基于与任何已知的miRNA不存在任何同源性来选择序列。
可使用本领域内已知的技术制造微阵列。例如，在位置C6上对合适长度例如40个核苷酸的探针寡核苷酸进行5’-胺修饰，然后使用可商购获得的微阵列系统例如GeneMachine OmniGridTM100Microarrayer和Amersham CodeLinkTM活化载玻片进行印制。通过用标记的引物逆转录靶RNA来制备相应于靶RNA的标记的cDNA寡物。在第一链合成后，使RNA/DNA杂交体变性以降解RNA模板。然后将所制备的标记的靶cDNA在杂交条件下与微阵列芯片杂交，所述条件是例如在25℃下在6X SSPE/30％甲酰胺中进行18小时，然后在37℃下在0.75X TNT中洗涤40分钟。杂交在阵列上在固定的探针DNA识别样品中的互补靶cDNA的位置上发生。标记的靶cDNA标记了阵列上发生结合的确切位置，从而允许自动检测和定量。输出由一列杂交事件组成，其显示了特定cDNA序列的相对丰度，从而显示患者样品中相应的互补miR的相对丰度。根据一个实施方案，标记的cDNA寡物是从生物素标记的引物制备的生物素标记的cDNA。然后通过使用例如链霉抗生物素-Alexa647缀合物直接检测含生物素的转录物来处理微阵列和使用常规的扫描方法扫描微阵列。阵列上各点的图像强度与患者样品中相应的miR的丰度成比例。
阵列的使用对于miRNA表达检测具有几个有利方面。第一，可在一个时间点在相同的样品中鉴定数百个基因的整体表达。第二，通过对寡核苷酸探针的仔细设计，可鉴定成熟和前体分子的表达。第三，与RNA印迹分析相比，芯片需要少量的RNA，并且使用2.5μg的总RNA可提供可重复的结果。相对有限数量的miRNA(每个物种数百个)允许构建几个物种的共同微阵列，对于各物种具有不同的寡核苷酸探针。该工具允许对多种不同条件下各已知miR的跨物种表达进行分析。
除了用于特定miR的定量表达水平测定外，包含相应于相当大部分的miRNome(优选整个miRNome)的miRNA特异性探针寡核苷酸的微芯片可用于确定miR基因表达谱，从而进行miR表达模式的分析。不同的miR特征谱可与已建立的疾病标记或直接与疾病状态相关联。
根据本文描述的表达谱确定分析法，定量逆转录来自获自怀疑患有癌症(例如，肺癌)的受试者的样品的总RNA，以提供一组与样品中的RNA互补的标记的靶寡脱氧核苷酸。然后使所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，从而提供样品的杂交谱。结果是展示样品中miRNA的表达模式的样品的杂交谱。杂交谱包含来自样品的靶寡脱氧核苷酸与微阵列中的miRNA特异性探针寡核苷酸结合产生的信号。该谱可记录为结合的存在或不存在(信号相对于零信号)。更优选，记录的谱包括来自各杂交的信号的强度。将所述谱与从正常例如非癌性的对照样品产生的杂交谱进行比较。信号的改变指示着受试者中存在癌症或发生癌症的倾向。
用于测量miR基因表达的其它技术也在本领域技术人员的技能范围之内，并且包括用于测量RNA转录和降解的速率的各种技术。
本发明也提供了确定患有肺癌的受试者的预后的方法，其包括测量来自受试者的测试样品中与肺癌的特定预后(例如，好的或积极的预后,差的或不良的预后)有关的至少一种miR基因产物的水平。根据这些方法，与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中与特定预后有关的miR基因产物的水平的改变,指示着受试者患有具有特定预后的肺癌。在一个实施方案中，所述miR基因产物与不良(即，差)预后有关。不良预后的实例包括、但不限于，低生存率和快速疾病进展。在某些实施方案中，与特定预后有关的至少一种miR基因产物选自：miR-155,miR-17-3p,miR-106a,miR-93,let-7a-2,miR-145,let-7b,miR-20和miR-21。在一个特定的实施方案中，所述肺癌是肺腺癌，且与特定预后有关的至少一种miR基因产物选自：miR-155和let-7a-2。在某些实施方案中，如下测量至少一种miR基因产物的水平：从获自受试者的测试样品逆转录RNA，以提供一组靶寡脱氧核苷酸,使所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，以提供测试样品的杂交谱，并对比测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱。
不希望受任何一种理论的束缚，认为细胞中一种或多种miR基因产物的水平的变化可导致这些miR的一个或多个目标靶失调，这可导致肺癌的形成。因此，改变miR基因产物的水平(例如，通过降低在肺癌细胞中被增量调节的miR的水平，通过增加在肺癌细胞中被减量调节的miR的水平)可成功地治疗肺癌。
因此，本发明包括治疗受试者的肺癌的方法,其中受试者细胞(例如肺癌细胞)中的至少一种miR基因产物失调(例如，减量调节，增量调节)。在一个实施方案中，测试样品(例如肺癌样品)中至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，测试样品(例如肺癌样品)中至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中相应的miR基因产物的水平。当肺癌细胞中至少一种分离的miR基因产物被减量调节时，该方法包括，施用有效量的所述至少一种分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段，从而抑制受试者中癌细胞的增殖。例如，当受试者癌细胞中miR基因产物被减量调节时，给受试者施用有效量的分离的miR基因产物可以抑制癌细胞的增殖。施用给受试者的分离的miR基因产物可以与在癌症细胞中减量调节的内源野生型miR基因产物(例如在表1a或表1b中所示的miR基因产物)相同，或可以是其变体或生物活性片段。如本文所定义的，miR基因产物的"变体"是指与相应的野生型miR基因产物具有小于100％同一性、且具有相应的野生型miR基因产物的一种或多种生物活性的miRNA。这样的生物活性的实例包括、但不限于，抑制靶RNA分子的表达(例如，抑制靶RNA分子的翻译,调控靶RNA分子的稳定性,抑制靶RNA分子的加工)和抑制与肺癌有关的细胞过程(例如，细胞分化,细胞生长,细胞死亡)。这些变体包括物种变体和作为miR基因中的一个或多个突变(例如，置换，缺失，插入)的结果的变体。在某些实施方案中，所述变体与相应的野生型miR基因产物至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。
如本文所定义的，miR基因产物的"生物活性片段"是指具有相应的野生型miR基因产物的一种或多种生物活性的的miR基因产物的RNA片段。如上所述，这样的生物活性的实例包括、但不限于，抑制靶RNA分子的表达和抑制与肺癌有关的细胞过程。在某些实施方案中，所述生物活性片段的长度是至少约5,7,10,12,15,或17个核苷酸。在一个具体的实施方案中，可以与一种或多种其它的抗癌治疗相组合，将分离的miR基因产物施用给受试者。合适的抗癌治疗包括、但不限于，化疗,放疗和其组合(例如，放化疗)。
当至少一种分离的miR基因产物在癌细胞中增量调节时，该方法包括，给受试者施用有效量的抑制所述至少一种miR基因产物的表达的化合物，从而抑制肺癌细胞的增殖。这样的化合物在本文中称作抑制miR基因表达的化合物。合适的抑制miR基因表达的化合物的实例包括、但不限于，本文所述的那些(例如双链RNA,反义核酸和酶RNA分子)。在一个特定的实施方案中，抑制miR基因表达的化合物可以与一种或多种其它抗癌治疗组合施用给受试者。合适的抗癌治疗包括、但不限于，化疗,放疗和其组合(例如，放化疗)。
在一个特定实施方案中，在肺癌中失调的分离的miR基因产物选自：miR-21,miR-191,miR-126*,miR-210,miR-155,miR-143,miR-205,miR-192-prec,miR-224,miR-126,miR-24-2,miR-30a-5p,miR-212,miR-140,miR-9,miR-214,miR-17-3p,miR-124a-1,miR-218-2,miR-95,miR-145,miR-198,miR-216-prec,miR-219-1,miR-106a,miR-197,miR-192,miR-125a-prec,miR-26a-1-prec,miR-146,miR-203,miR-199b-prec,let-7a-2-prec,miR-27b,miR-32,miR-29b-2,miR-220,miR-33,miR-181c-prec,miR-150,miR-101-1,miR-124a-3,miR-125a和let-7f-1。在一个特定的实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自：miR-21,miR-205和miR-216。在另一个实施方案中，所述肺癌是肺腺癌，且所述至少一种miR基因产物选自：miR-21,miR-191,miR-155,miR-210,miR-126*和miR-224。
在一个特定的实施方案中，所述miR基因产物不是下述的一种或多种：let7a-2,let-7c,let-7g,let-7i,miR-7-2,miR-7-3,miR-9,miR-9-1,miR-10a,miR-15a,miR-15b,miR-16-1,miR-16-2,miR-17-5p,miR-20a,miR-21,miR-24-1,miR-24-2,miR-25,miR-29b-2,miR-30,miR-30a-5p,miR-30c,miR-30d,miR-31,miR-32,miR-34,miR-34a,miR-34aprec,miR-34a-1,miR-34a-2,miR-92-2,miR-96,miR-99a,miR-99b prec,miR-100,miR-103,miR-106a,miR-107,miR-123,miR-124a-1,miR-125b-1,miR-125b-2,miR-126*,miR-127,miR-128b,miR-129,miR-129-1/2prec,miR-132,miR-135-1,miR-136,miR-137,miR-141,miR-142-as,miR-143,miR-146,miR-148,miR-149,miR-153,miR-155,miR159-1,miR-181,miR-181b-1,miR-182,miR-186,miR-191,miR-192,miR-195,miR-196-1,miR-196-1prec,miR-196-2,miR-199a-1,miR-199a-2,miR-199b,miR-200b,miR-202,miR-203,miR-204,miR-205,miR-210,miR-211,miR-212,miR-214,miR-215,miR-217,miR-221和/或miR-223。
如本文所用的，术语“治疗”、“医治”和“医疗”是指改善与疾病或病症例如实体癌相关的症状，包括阻止或延迟疾病症状的发作和/或减少疾病或病症的症状的严重度或频率。术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文定义为包括动物例如哺乳动物，包括但不限于，灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛族动物、羊科动物、马科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物或鼠类物种。在优选实施方案中，动物是人。
如本文所用的，分离的miR基因产物的“有效量”是足以抑制遭受肺癌的受试者中癌细胞增殖的量。通过考虑诸如受试者的身材大小和体重、疾病侵入的程度、受试者的年龄、健康和性别、给药途径以及给药是局部的还是全身性的等因素，本领域技术人员可容易地确定对给定受试者施用的miR基因产物的有效量。
例如，分离的miR基因产物的有效量可基于被治疗的肿瘤块的近似重量。可通过计算团块的近似体积确定肿瘤块的近似重量，其中1立方厘米的体积大致相当于1克。基于肿瘤块的重量的分离的miR基因产物的有效量可以在约10-500微克/克的肿瘤块的范围内。在某些实施方案中，肿癌块可以是至少约10微克/克的肿瘤块，至少约60微克/克的肿瘤块或至少约100微克/克的肿瘤块。
分离的miR基因产物的有效量还可基于被治疗的受试者的近似或估计的体重。优选，如本文所描述的，通过胃肠外或肠内给药施用该有效量。例如，对受试者施用的分离的miR基因产物的有效量可在约5至3000微克/kg的体重，约700至1000微克/kg的体重的范围内变动，或大于约1000微克/kg的体重。
本领域技术人员也可容易地确定对给定的受试者施用分离的miR基因产物的合适的给药方案。例如，可对受试者施用miR基因产物一次(例如,作为单次注射或沉积(deposition))。或者，可每天对受试者施用miR基因产物1次或2次，进行约3至约28天，更特别地约7至约10天的时期。在特定的给药方案中，每天1次施用miR基因产物，进行7天。当给药方案包括多次施用时，要理解对受试者施用的miR基因产物的有效量可包括在整个给药方案中施用的基因产物的总量。
如本文所用的，“分离的”miR基因产物是合成的或通过人干预从天然状态改变的或取出的产物。例如，合成的miR基因产物或部分地或完全地从与其天然状态的共存材料分离的miR基因产物被认为是“分离的”。分离的miR基因产物可以基本上纯化的形式存在，或可存在于已递送了该miR基因产物的细胞中。因此，有意递送至细胞或有意在细胞中表达的miR基因产物被认为是“分离的”miR基因产物。在细胞内从miR前体分子产生的miR基因产物也被认为是“分离的”分子。根据本发明,本文所述的分离的miR基因产物可以用于生产治疗受试者(例如，人)的肺癌的药物。
可使用许多标准技术获得分离的miR基因产物。例如，可使用本领域内已知的方法化学合成或重组产生miR基因产物。在一个实施方案中，使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪,化学合成miR基因产物。合成的RNA分子或合成试剂的商业提供商包括例如Proligo(Hamburg,Germany)、Dharmacon Research(Lafayette,CO,U.S.A.)、Pierce Chemical(part of Perbio Science,Rockford,IL,U.S.A.)、Glen Research(Sterling,VA,U.S.A.)、ChemGenes(Ashland,MA,U.S.A.)和Cruachem(Glasgow,UK)。
或者，可使用任何合适的启动子从重组环状或线性DNA质粒表达miR基因产物。用于从质粒表达RNA的合适的启动子包括例如U6或H1RNA pol III启动子序列或巨细胞病毒启动子。其它合适的启动子的选择在本领域技术人员的技能范围之内。本发明的重组质粒还可包含用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或调控型启动子。
可通过标准技术从培养细胞表达系统分离从重组质粒表达的miR基因产物。也可将从重组质粒表达的miR基因产物递送至和直接在癌细胞中表达。下面更详细地讨论重组质粒用于将miR基因产物递送至癌细胞的用途。
可从分开的重组质粒表达miR基因产物，或可从相同的重组质粒表达它们。在一个实施方案中，miR基因产物从单个质粒表达为RNA前体分子，然后前体分子通过合适的加工系统(包括但不限于存在于癌细胞内的加工系统)加工成功能性miR基因产物。其它合适的加工系统包括，例如，体外果蝇细胞裂解物系统(lysate system)(例如，如属于Tuschl等人的美国公开专利申请号2002/0086356中描述的，其全部公开内容通过参考引用并入本文)和大肠杆菌RNA酶III系统(例如，如属于Yang等人的美国公开专利申请号2004/0014113中描述的，其全部公开内容通过参考引用并入本文)。
适合用于表达miR基因产物的质粒的选择，用于将核酸序列插入质粒以表达基因产物的方法和将重组质粒递送入目的细胞的方法在本领域技术人员的技能范围之内。参见，例如，Zeng等人(2002),Molecular Cell 9:1327-1333；Tuschl(2002),Nat.Biotechnol,20:446-448；Brummelkamp等人(2002),Science296:550-553；Miyagishi等人(2002),Nat.Biotechnol.20:497-500；Paddison等人(2002),Genes Dev.16:948-958；Lee等人(2002),Nat.Biotechnol.20:500-505；和Paul等人(2002),Nat.Biotechnol.20:505-508,其全部公开内容通过参考引用并入本文。
在一个实施方案中，表达miR基因产物的质粒包含在CMV即早期启动子控制之下的编码miR前体RNA的序列。如本文所用的，“在启动子控制之下”意指编码miR基因产物的核酸序列位于启动子的3’，这样启动子可起始编码miR基因产物的序列的转录。
也可从重组病毒载体表达miR基因产物。可从两个分开的重组病毒载体或从相同的病毒载体表达miR基因产物。可通过标准技术从培养细胞表达系统分离从重组病毒载体表达的RNA，或可在癌细胞中直接表达它。下面更详细地描述重组病毒载体将miR基因产物递送至癌细胞的用途。
本发明的重组病毒载体包含编码miR基因产物的序列和用于表达RNA序列的任何合适的启动子。合适的启动子包括、但不限于例如U6或H1RNA pol III启动子序列或巨细胞病毒启动子。其它合适的启动子的选择在本领域技术人员的技能范围之内。本发明的重组病毒载体还可包含用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或调控型启动子。
可使用能够接受miR基因产物的编码序列的任何病毒载体；例如来源于腺病毒(AV)、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒(例如，慢病毒(LV)、杆状病毒、鼠白血病病毒)、疱疹病毒等的载体。适当时，可通过用包膜蛋白和来自其它病毒的其它表面蛋白假型化载体或通过置换不同的病毒衣壳蛋白来改变病毒载体的向性。
例如，可用来自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病毒病毒、埃博拉病毒、莫科拉病等的表面蛋白假型化本发明的慢病毒载体。通过对载体进行基因工程改造以表达不同的衣壳蛋白血清型来产生本发明的AAV载体，从而使其靶向不同的细胞。例如，在血清2型基因组上表达血清2型衣壳的AAV载体称为AAV2/2。可用血清5型衣壳蛋白基因取代AAV2/2载体中的该血清2型衣壳蛋白基因以产生AAV2/5载体。用于构建表达不同的衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术在本领域技术人员的技能范围之内；参见，例如，Rabinowitz,J.E.,等人(2002),J.Virol.76:791-801,其全部公开内容通过参考引用并入本文。
适合用于本发明的重组病毒载体的选择、用于将表达RNA的核酸序列插入载体的方法、将病毒载体递送至目的细胞的方法以及表达的RNA产物的回收在本领域技术人员的技能范围之内。参见，例如，Dornburg(1995),Gene Therap.2:301-310；Eglitis(1988),Biotechniques6:608-614；Miller(1990),Hum.Gene Therap.1:5-14；和Anderson(1998),Nature392:25-30,其全部公开内容通过参考引用并入本文。
特别合适的病毒载体是来源于AV和AAV的载体。用于表达本发明的miR基因产物的合适的AV载体、用于构建重组AV载体的方法以及将载体递送入靶细胞的方法描述于Xia等人(2002),Nat.Biotech.20:1006-1010中,其全部公开内容通过参考引用并入本文。用于表达miR基因产物的合适的AAV载体、用于构建重组AAV载体的方法以及将载体递送入靶细胞的方法描述于Samulski等人(1987),J.Virol.61:3096-3101；Fisher等人(1996),J.Virol.,70:520-532；Samulski等人(1989),J.Virol.63:3822-3826；美国专利号5,252,479；美国专利号5,139,941；国际专利申请号WO94/13788；和国际专利申请号WO93/24641,其全部公开内容通过参考引用并入本文。在一个实施方案中，从包含CMV立即早期启动子的单个重组AAV载体表达miR基因产物。
在某一实施方案中，本发明的重组AAV病毒载体包含在人U6RNA的控制下、与polyT终止序列有效连接的编码miR前体RNA的核酸序列。如本文所用的，“与polyT终止序列有效连接”是指编码有义或反义链的核酸序列以5’方向与polyT终止信号直接相邻。在从载体转录miR序列的过程中，polyT终止信号起着终止转录的作用。
在本发明的治疗方法的其它实施方案中，可对受试者施用有效量的至少一种抑制miR表达的化合物。如本文所用的，“抑制miR表达”是指在治疗后miR基因产物的前体和/或活性成熟形式的产量比治疗前产生的量低。通过使用例如本文讨论的确定miR转录物水平的技术，本领域技术人员可容易地确定miR的表达在癌细胞中是否已被抑制。抑制可在基因表达的水平上发生(即，通过抑制编码miR基因产物的miR基因的转录)或在加工水平上发生(例如，通过抑制miR前体加工成成熟的活性miR)。
如本文所用的，抑制miR表达的化合物的“有效量”是足以在罹患癌症(例如，肺癌)的受试者中抑制癌细胞的增殖的量。通过考虑诸如受试者的身材大小和体重、疾病侵入的程度、受试者的年龄、健康和性别、给药途径和给药是局部的还是全身性的等因素，本领域技术人员可容易地确定抑制miR表达的化合物的有效量。
例如，表达抑制化合物的有效量可基于待治疗的肿瘤块的近似重量,如本文所述。抑制miR表达的化合物的有效量也可基于待治疗的受试者的近似或估计重量,如本文所述。
本领域技术人员也可容易地确定对给定的受试者施用抑制miR表达的化合物的合适的给药方案，如本文所述。用于抑制miR基因表达的合适的化合物包括双链RNA(例如短的或小的干扰RNA或“siRNA”)、反义核酸和酶RNA分子例如核酶。此类化合物中的各化合物可靶向给定的miR基因产物和干扰靶miR基因产物的表达(例如，通过抑制翻译，通过诱导切割和/或降解)。
例如，通过用与miR基因产物的至少一部分具有至少90％、例如至少95％、至少98％、至少99％、或100％序列同源性的分离的双链RNA("dsRNA")分子诱导miR基因的RNA干扰，可以抑制给定miR基因的表达。在一个具体的实施方案中，dsRNA分子是"短的或小的干扰RNA"或"siRNA"。
用于本方法的siRNA包含长度为约17个核苷酸至约29个核苷酸，优选长度为约19至约25个核苷酸的短的双链RNA。siRNA包含根据标准的Watson-Crick碱基配对相互作用(以下称“碱基配对”)退火在一起的有义RNA链和互补反义RNA链。有义链包含基本上与靶miR基因产物内包含的核酸序列相同的核酸序列。
如本文所用的，siRNA中与靶mRNA中包含的靶序列“基本上相同”的核酸序列是与靶序列相同或与靶序列相异1个或2个核苷酸的核酸序列。siRNA的有义和反义链可包含两个互补的单链RNA分子，或可包含其中两个互补部分是碱基配对的并且通过单链“发夹”区域共价连接的单链分子。
siRNA可以是与天然存在的RNA不同在于一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变的改变的RNA。此类改变可包括非核苷酸材料的添加，例如添加至siRNA的末端或添加至siRNA的一个或多个内部核苷酸，或使siRNA对核酸酶降解具有抗性的修饰或用脱氧核糖核苷酸对siRNA中的一个或多个核苷酸的置换。
siRNA的一条或两条链还可包含3'突出端。如本文所用的，“3'突出端”是指从双链RNA链的3'末端延伸的至少一个未配对的核苷酸。因此，在某些实施方案中，siRNA包含长度为1个至约6个核苷酸(其包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)、长度为1至约5个核苷酸、长度为1至约4个核苷酸或长度为约2至约4个核苷酸的至少一个3'突出端。在一个具体的实施方案中，3'突出端存在于siRNA的两条链上，且长度为2个核苷酸。例如，siRNA的各链包含二胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dithymidylic acid)(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3'突出端。
siRNA可通过化学或生物学的方法产生，或如上面关于分离的miR基因产物所描述的，可从重组质粒或病毒载体表达。用于产生和检测dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于属于Gewirtz的美国公开专利申请号2002/0173478和属于Reich等人的美国公开专利申请号2004/0018176，其全部公开内容通过参考引用并入本文。
还可通过反义核酸来抑制给定的miR基因的表达。如本文所用的，“反义核酸”是指通过RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用结合至靶RNA的核酸分子，其可改变靶RNA的活性。适合用于本发明的方法的反义核酸是通常包含与miR基因产物中的连续核酸序列互补的核酸序列的单链核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA嵌合体、肽核酸(PNA))。反义核酸可包含与miR基因产物中的连续核酸序列50-100％互补、75-100％互补或95-100％互补的核酸序列。表1a和表1b中提供了特定人miR基因产物的核酸序列。不希望受限于任何理论，认为反义核酸激活RNA酶H或降解miR基因产物/反义核酸双链体的另一种细胞核酸酶。
反义核酸还可包含对核酸主链的修饰或对糖和碱基部分(或其等同物)的修饰,以增强靶特异性、对核酸酶的抗性、与分子的功效相关的递送或其它性质。此类修饰包括胆固醇部分、双链体插入剂(例如吖啶)或一种或多种抗核酸酶基团。
反义核酸可通过化学或生物学方法产生，或如上面关于分离的miR基因产物所描述的，可从重组质粒或病毒载体表达。用于产生和检测的示例性方法在本领域技术人员的技能范围之内；参见，例如，Stein和Cheng(1993),Science261:1004和Woolf等人的美国专利号5,849,902,其全部公开内容通过参考引用并入本文。
还可用酶核酸抑制给定的miR基因的表达。如本文所用的，“酶核酸”是指包含具有与miR基因产物的连续核酸序列的互补性的底物结合区的核酸，其能够特异性切割miR基因产物。酶核酸底物结合区可以与miR基因产物中的连续核酸序列具有例如50-100％的互补性、75-100％的互补性或95-100％的互补性。酶核酸还可包含在碱基、糖和/或磷酸基团上的修饰。用于本发明的方法的示例性酶核酸是核酶。
酶核酸可通过化学或生物学方法产生，或如上面关于分离的miR基因产物所描述的，可从重组质粒或病毒载体表达。用于产生和检测dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Werner和Uhlenbeck(1995),Nucleic Acids Res.23:2092-96；Hammann等人(1999),Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.9:25-31；和属于Cech等人的美国专利号4,987,071，其全部公开内容通过参考引用并入本文。
至少一种miR基因产物或至少一种抑制miR表达的化合物的施用，将抑制患有癌症(例如肺癌)的受试者中的癌细胞的增殖。如本文所用的，“抑制癌细胞的增殖”是指杀死细胞或永久性地或临时性地阻止或减缓细胞的生长。如果在施用miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物后，受试者中癌细胞的数目保持恒定或减少，那么可推断此类细胞的增殖被抑制。如果癌细胞的绝对数目增加但肿瘤生长速率减小也可推断癌细胞的增殖被抑制。
可通过直接测量或通过从原发性或转移肿瘤块的大小估计来确定受试者体内的癌细胞的数目。例如，可通过免疫组织学方法、流式细胞计量术或设计用于检测癌细胞的特征性表面标记的其它技术测量受试者中的癌细胞数目。
可通过直接目视观察或通过诊断性影像学方法例如X射线、磁共振显像、超声和闪烁照相术确定肿瘤块的大小。如本领域内已知的，可在存在或不存在造影剂的情况下使用用于确定肿瘤块的大小的诊断性影像法。还可使用物理方法例如组织块的触诊或使用测量仪器例如测径器测量组织块来确定肿瘤块的大小。
可通过适合将这些化合物递送至受试者的癌细胞的任何方法对受试者施用miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物。例如，可通过适合于用这些化合物或用包含编码这些化合物的序列的核酸转染受试者的细胞的方法来施用miR基因产物或抑制miR表达的化合物。在一个实施方案中，用包含编码至少一种miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物的序列的质粒或病毒载体转染细胞。
用于真核细胞的转染方法在本领域内是熟知，包括例如核酸至细胞的细胞核或前核的直接注射、电穿孔、脂质体转移或通过亲脂材料介导的转移、受体介导的核酸递送、bioballistic或粒子加速；磷酸钙沉淀和通过病毒载体介导的转染。
例如，可用脂质体转移化合物DOTAP(甲基硫酸N-[1-(2,3-二油酰氧)丙基]-N,N,N-三甲基-铵,Boehringer-Mannheim)或等同物例如LIPOFECTIN转染细胞。使用的核酸的量对于本发明的实践不是至关重要的；可用0.1-100微克的核酸/105个细胞获得可接受的结果。例如，可使用每105个细胞约0.5微克质粒于3微克DOTAP中的比率。
还可通过任何合适的肠内或胃肠外给药途径对受试者施用miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物。用于本方法的合适的肠内给药途径包括例如口服、直肠或鼻内递送。合适的胃肠外给药途径包括例如血管内给药(例如,至脉管系统的静脉内快速注射、静脉输注、动脉内快速浓注、动脉内输注和导管滴注)；组织外周和组织内注射(例如,瘤周和瘤内注射、视网膜内注射或视网膜下注射)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如通过渗透泵)；对目的组织的直接施用，例如通过导管或其它安置装置(例如，视网膜弹丸剂或栓剂或包含多孔、无孔或凝胶状材料的植入体)；以及吸入。特别适合的给药途径是注射、输注和直接注射至肿瘤中。
在本方法中，可将miR基因产物或抑制miR基因产物表达的化合物作为裸RNA与递送试剂一起或作为核酸(例如，重组质粒或病毒载体)给受试者施用，所述核酸包含表达miR基因产物或抑制miR基因产物表达的化合物的序列。合适的递送试剂包括例如MirusTransit TKO亲脂试剂、LIPOFECTIN、lipofectamine、cellfectin、聚阳离子(例如，多聚赖氨酸)和脂质体。
本文讨论了包含表达miR基因产物或抑制miR基因产物表达的化合物的序列的重组质粒和病毒载体以及用于递送此类质粒和载体至癌细胞的技术，且/或是本领域众所周知的。
在一个具体的实施方案中，脂质体用于将miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至受试者。脂质体也可以增加基因产物或核酸的血液半衰期。可从标准的形成小囊泡的脂质(其通常包含中性或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇)形成用于本发明的合适的脂质体。通常通过考虑诸如想要的脂质体大小和血流中脂质体的半衰期等因素，指导脂质的选择。用于制备脂质体的许多方法是已知的，例如，如在Szoka等人(1980),Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467；和美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369(其全部公开内容通过参考引用并入本文)中描述的方法。
用于本方法的脂质体可包含将脂质体靶向癌细胞的配体分子。结合癌细胞中普遍存在的受体的配体例如结合肿瘤细胞抗原的单克隆抗体是优选的。
还可对用于本方法的脂质体进行修饰,以避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)清除。此类经修饰的脂质体具有存在于表面上或整合入脂质体结构中的调理作用抑制部分。在特别优选实施方案中，本发明的脂质体可同时包含调理作用抑制部分和配体两者。
用于制备本发明的脂质体的调理作用抑制部分通常是结合至脂质体的膜的大的亲水聚合物。如本文所用的，当其例如通过脂溶性锚嵌入膜本身中或通过对膜脂质的活性基团直接结合而被化学地或物理地附着至膜时，调理作用抑制部分“结合”至脂质体膜。这些调理作用抑制性亲水聚合物形成了显著减少脂质体被MMS和RES吸收的保护表面层；例如，如美国专利号4,920,016中所描述的，其全部公开内容通过参考引用并入本文。
适合用于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选是具有约500至约40,000道尔顿和优选约2,000至约20,000道尔顿的数量平均分子量的水溶性聚合物。此类聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)或其衍生物；例如甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物，例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯酮；线性的、分支的或树状聚酰胺-胺(polyamidoamines)；聚丙烯酸；多元醇，例如羧基或氨基化学连接至其的聚乙烯醇和聚木糖醇,以及神经节苷脂例如神经节苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚物也是合适的。此外，调理作用抑制性聚合物可以是PEG与多聚氨基酸、多糖、聚酰胺-胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。调理作用抑制性聚合物也可以是包含氨基酸或羧酸例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉菜胶的天然多糖；氨化多糖或寡糖(线性或分支的)；或羧化多糖或低聚糖，例如与碳酸的衍生物反应，获得羧基的连接。优选，调理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化脂质体”。
可通过许多熟知的技术中的任一种将调理作用抑制部分与脂质体膜结合。例如，可将PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯结合至磷脂酰乙醇胺脂溶性锚，然后再将其结合至膜。类似地，可使用Na(CN)BH3和溶剂混合物(例如以30:12比例的四氢呋喃和水)在60℃下通过还原氨化作用用硬脂酰胺脂溶性锚衍生葡聚糖聚合物。
用调理作用抑制部分修饰的脂质体在循环中比未修饰的脂质体保持长得多的时间。因此，这样的脂质体有时称为“秘密(stealth)”脂质体。已知秘密脂质体在由多孔的或“渗漏的”微血管滋养的组织中积累。因此，特征在于该微血管缺陷的组织例如实体瘤(例如肺癌)将有效率地积累这些脂质体；参见Gabizon,等人(1988),Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,18:6949-53。此外，减少的由RES进行的吸收通过防止脂质体在肝和脾中大量积累而降低了秘密脂质体的毒性。因此，用调理作用抑制部分修饰的脂质体特别适合将miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至肿瘤细胞。
按照本领域内已知的技术在给受试者施用之前，可将miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物配制为药物组合物，有时称为“药物”。因此，本发明包括用于治疗肺癌的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段，和药学上可接受的载体。在一个具体实施方案中，至少一种miR基因产物对应于这样的miR基因产物，即相对于合适的对照细胞，该miR基因产物在肺癌细胞中具有减少的表达水平。在某些实施方案中，所述分离的miR基因产物选自：miR-126*,miR-192,miR-224,miR-126,miR-30a-5p,miR-140,miR-9,miR-124a-1,miR-218-2,miR-95,miR-145,miR-198,miR-216,miR-219-1,miR-125a,miR-26a-1,miR-199b,let-7a-2,miR-27b,miR-32,miR-29b-2,miR-220,miR-33,miR-181c,miR-101-1,miR-124a-3,miR-125b-1,let-7f-1和其组合。在一个实施方案中，分离的miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1。在另一个实施方案中，所述miR基因产物不是miR-210或miR-212。在另一个实施方案中，所述miR基因产物不是miR-21,miR-143,miR-205或miR-9。在另一个实施方案中，所述miR基因产物不是miR-21,miR-191,miR-126*,miR-210,miR-155,miR-143,miR-205,miR-126,miR-30a-5p,miR-140,miR-214,miR-218-2,miR-145,miR-106a,miR-192,miR-203,miR-150,miR-220,miR-212或miR-9。
在其它实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种抑制miR表达的化合物。在一个特定的实施方案中，所述至少一种抑制miR表达的化合物对在肺癌细胞中的表达大于对照细胞的miR基因是特异性的。在某些实施方案中，所述抑制miR表达的化合物对一种或多种选自下述的miR基因产物是特异性的：miR-21,miR-191,miR-210,miR-155,miR-205,miR-24-2,miR-212,miR-214,miR-17-3p,miR-106a,miR-197,miR-192,miR-146,miR-203,miR-150和其组合。在一个实施方案中，分离的miR基因产物不是对miR-15a或miR-16-1特异性的。在另一个实施方案中，所述miR基因产物不是对miR-210或miR-212特异性的。在另一个实施方案中，所述miR基因产物不是对miR-21、miR-143、miR-205或miR-9特异性的。在另一个实施方案中，所述miR基因产物不是对miR-21、miR-191、miR-126*、miR-210、miR-155、miR-143、miR-205、miR-126、miR-30a-5p、miR-140、miR-214、miR-218-2、miR-145、miR-106a、miR-192、miR-203、miR-150、miR-220、miR-212或miR-9特异性的。本发明的药物组合物的特征在于是至少无菌的和无热原的。如本文所用的，“药物组合物”包括用于人和兽医用途的制剂。用于制备本发明的药物组合物的方法在本领域技术人员的技能范围之内，例如，如Remington's Pharmaceutical Science,第17版,Mack Publishing Company,Easton,PA.(1985)中所描述的，其全部公开内容通过参考引用并入本文。
本发明的药物组合物包含与药学上可接受的载体相混合的至少一种miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或至少一种包含编码miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物的序列的核酸)(例如，0.1-90％重量)或其生理上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的药物组合物另外包含一种或多种抗癌剂(例如，化疗剂)。本发明的药物制剂也可以包含由脂质体包封的至少一种miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或至少一种包含编码miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物的序列的核酸)，和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，药物组合物包含不是miR-15、miR-16、miR-143和/或miR-145的miR基因或基因产物。
特别合适的药学上可接受的载体是水、缓冲水溶液、生理盐水、0.4％的盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。
在一个具体实施方案中，本发明的药物组合物包含对核酸酶的降解具有抗性的至少一种miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或至少一种包含编码miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物的序列的核酸)。本领域技术人员可容易地合成对核酸酶具有抗性的核酸，例如通过将一个或多个在2’位置被修饰的核糖核苷酸掺入miR基因产物。合适的2’-修饰的核糖核苷酸包括在2’位置用氟、氨基、烷基、烷氧基和O-烯丙基修饰的核糖核苷酸。
本发明的药物组合物还可包含常规药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、缓冲剂和pH调节剂。合适的添加剂包括例如生理生物相容性缓冲剂(例如，盐酸氨丁三醇)、螯合剂(例如，DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合物(例如，DTPA钙、CaNaDTPA-双酰胺)的加入，或任意地,钙或钠盐(例如，氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)的加入。可包装本发明的药物组合物以使以液体形式使用或可将其冻干。
对于本发明的固体药物组合物，可使用常规的无毒性固体药学上可接受的载体例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
例如，用于口服给药的固体药物组合物可包含上列的任何载体和赋形剂和10-95％,优选25％-75％的至少一种miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)。用于气雾剂(吸入)给药的药物组合物可包含封装在上述脂质体中的按重量计算0.01-20％、优选按重量计算1％-10％的至少一种miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或至少一种包含编码miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物的序列的核酸)和喷射剂。当需要时也可包含载体；例如用于鼻内递送的卵磷脂。
本发明的药物组合物可以另外包含一种或多种抗癌剂。在一个具体的实施方案中，组合物包含至少一种miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或至少一种包含编码miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物的序列的核酸)和至少一种化疗剂。适用于本发明的方法的化疗剂，包括、但不限于，DNA-烷化剂,抗肿瘤抗生素剂,抗代谢剂,微管蛋白稳定剂,微管蛋白去稳定剂,激素拮抗剂,拓扑异构酶抑制剂,蛋白激酶抑制剂,HMG-CoA抑制剂,CDK抑制剂,细胞周期蛋白抑制剂,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂,金属蛋白酶抑制剂,反义核酸,三链螺旋DNA,核酸适体，和分子修饰的病毒、细菌和外毒素试剂。适用于本发明的组合物的试剂的实例包括、但不限于，阿糖胞苷,甲氨蝶呤,长春新碱,依托泊苷(VP-16),多柔比星(阿霉素),顺铂(CDDP),地塞米松,arglabin,环磷酰胺,沙可来新,甲基亚硝基脲,氟尿嘧啶,5-氟尿嘧啶(5FU),长春碱,喜树碱,放线菌素-D,丝裂霉素C,过氧化氢,奥沙利铂,伊立替康,托泊替康,亚叶酸,卡莫司汀,链佐星,CPT-1l,泰素,他莫昔芬,达卡巴嗪,利妥昔单抗,柔红霉素,1-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶,伊马替尼,氟达拉滨,多西他赛和FOLFOX4。
本发明也包括鉴定抗肺癌剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂，和测量细胞中至少一种miR基因产物的水平。在一个实施方案中，该方法包括，给细胞提供测试试剂，和测量与肺癌细胞中降低的表达水平有关的至少一种miR基因产物的水平。与合适的对照(例如对照细胞中所述miR基因产物的水平)相比，所述细胞中所述miR基因产物的水平的增加,指示着测试试剂是抗肺癌剂。在一个特定的实施方案中，与肺癌细胞中降低的表达水平有关的至少一种miR基因产物选自：miR-126*,miR-192,miR-224,miR-126,miR-30a-5p,miR-140,miR-9,miR-124a-1,miR-218-2,miR-95,miR-145,miR-198,miR-216,miR-219-1,miR-125a,miR-26a-1,miR-199b,let-7a-2,miR-27b,miR-32,miR-29b-2,miR-220,miR-33,miR-181c,miR-101-1,miR-124a-3,miR-125b-1,let-7f-1和其组合。在一个实施方案中，所述miR基因产物不是下述的一种或多种：let7a-2,let-7c,let-7g,let-7i,miR-7-2,miR-7-3,miR-9,miR-9-1,miR-10a,miR-15a,miR-15b,miR-16-1,miR-16-2,miR-17-5p,miR-20a,miR-21,miR-24-1,miR-24-2,miR-25,miR-29b-2,miR-30,miR-30a-5p,miR-30c,miR-30d,miR-31,miR-32,miR-34,miR-34a,miR-34a prec,miR-34a-1,miR-34a-2,miR-92-2,miR-96,miR-99a,miR-99b prec,miR-100,miR-103,miR-106a,miR-107,miR-123,miR-124a-1,miR-125b-1,miR-125b-2,miR-126*,miR-127,miR-128b,miR-129,miR-129-1/2prec,miR-132,miR-135-1,miR-136,miR-137,miR-141,miR-142-as,miR-143,miR-146,miR-148,miR-149,miR-153,miR-155,miR159-1,miR-181,miR-181b-1,miR-182,miR-186,miR-191,miR-192,miR-195,miR-196-1,miR-196-1prec,miR-196-2,miR-199a-1,miR-199a-2,miR-199b,miR-200b,miR-202,miR-203,miR-204,miR-205,miR-210,miR-211,miR-212,miR-214,miR-215,miR-217,miR-221和/或miR-223。
在其它实施方案中，该方法包括，给细胞提供测试试剂，和测量与肺癌细胞中增加的表达水平有关的至少一种miR基因产物的水平。与合适的对照(例如对照细胞中所述miR基因产物的水平)相比，所述细胞中所述miR基因产物的水平的降低,指示着测试试剂是抗肺癌剂。在一个特定的实施方案中，与肺癌细胞中增加的表达水平有关的至少一种miR基因产物选自：miR-21,miR-191,miR-210,miR-155,miR-205,miR-24-2,miR-212,miR-214,miR-17-3p,miR-106a,miR-197,miR-192,miR-146,miR-203,miR-150和其组合。在一个实施方案中，所述miR基因产物不是下述的一种或多种：let7a-2,let-7c,let-7g,let-7i,miR-7-2,miR-7-3,miR-9,miR-9-1,miR-10a,miR-15a,miR-15b,miR-16-1,miR-16-2,miR-17-5p,miR-20a,miR-21,miR-24-1,miR-24-2,miR-25,miR-29b-2,miR-30,miR-30a-5p,miR-30c,miR-30d,miR-31,miR-32,miR-34,miR-34a,miR-34a prec,miR-34a-1,miR-34a-2,miR-92-2,miR-96,miR-99a,miR-99b prec,miR-100,miR-103,miR-106a,miR-107,miR-123,miR-124a-1,miR-125b-1,miR-125b-2,miR-126*,miR-127,miR-128b,miR-129,miR-129-1/2prec,miR-132,miR-135-1,miR-136,miR-137,miR-141,miR-142-as,miR-143,miR-146,miR-148,miR-149,miR-153,miR-155,miR159-1,miR-181,miR-181b-1,miR-182,miR-186,miR-191,miR-192,miR-195,miR-196-1,miR-196-1prec,miR-196-2,miR-199a-1,miR-199a-2,miR-199b,miR-200b,miR-202,miR-203,miR-204,miR-205,miR-210,miR-211,miR-212,miR-214,miR-215,miR-217,miR-221和/或miR-223。
合适的试剂包括但不限于药物(例如，小分子、肽)，和生物大分子(例如，蛋白质、核酸)。可通过重组、合成方法产生该试剂，或其可从天然来源分离(即，纯化)。用于对细胞提此类试剂的各种方法(例如，转染)在本领域内是熟知的，上文中描述了几种这样的方法。用于检测至少一种miR基因产物的表达的方法(例如,RNA印迹法、原位杂交法、RT-PCR、表达谱确定分析)在本领域内也是熟知的。本文中也描述了这些方法中的几种方法。
现在通过下列非限制性实施例解释本发明。
实施例
实施例1:原发性肺癌中改变的miRNA表达
材料和方法
样品
在该研究中使用了104对原发性肺癌和相应的非癌肺组织。可随访长达5年的另外32例用于独立的验证数据组。在征得知情同意后且符合Institutional Review Board，这些组织在1990至1999年作为手术标本从Baltimore大都市市区患者获得。肺癌组织来自65位肺腺癌患者和39位肺鳞状细胞癌患者。中值年龄为65(38－84)岁的65位男性和39位女性患者构成该集合。65个肿瘤分类成I期，17个分类成II期,和22个分类成III或IV期肿瘤。对于大多数样品，可得到临床和生物学信息。根据生产商的说明书，通过Reagent(Invitrogen)，从组织分离总RNA。
微阵列分析
如前所述进行微阵列分析(Liu,C.G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:9740-9744(2004))。简而言之，使5μg总RNA与含有一式三份的352个的探针的miRNA微阵列芯片杂交。具体而言，这些芯片含有基因特异性的40-聚体寡核苷酸探针，它们通过接触技术来印制，并共价结合到聚合基质上，它们从161人miRNA、84个小鼠miRNA、来自3个其它物种的miRNA和tRNA产生。微阵列在25℃在6X SSPE(0.9M NaCl/60mM NaH2PO4·H2O/8mMEDTA,pH7.4)/30％甲酰胺中杂交18小时，在37℃在0.75X TNT(Tris·HCl/NaCl/吐温20)中洗涤40min，通过链霉抗生物素-Alexa647缀合物(Molecular Probes,Carlsbad,CA)，使用对含有生物素的转录物的直接检测方法进行处理。使用PerkinElmer ScanArray XL5K扫描仪扫描处理过的载玻片，激光设定在635nm，在功率80和PMT70设置，扫描分辨率是10μm。标准化每个miRNA的3个点重复的平均值，并在BRB-ArrayTools3.2.3版本中分析。排除杂交强度低于背景的负值后，使用每个芯片按照中位值标准化方法进行标准化，并相对于作为参照的中位值阵列标准化。最后，选择147个miRNA，它们在超过50％的样品中存在一致的log值。使用t-或F-检验，鉴定出在组之间差异表达的基因，如果它们的p值小于0.001，则认为该基因是统计学上显著的。通过置换与组相对应的阵列的标记，也进行组之间的表达谱是否存在差异的总体检验。对于每个置换，重新计算p值，并记录在0.001水平显著的基因的数目。产生至少象实际数据一样多的显著基因的置换的比例，是总体检验的显著性水平。
溶液杂交检测分析和实时RT-PCR分析
使用mirVanaTM miRNA检测试剂盒(Ambion Inc.,TX)，通过溶液杂交检测，测量成熟miRNA的表达水平。简而言之，将1μg总RNA与对应于这些miRNA的放射性标记的探针温育。消化以去除靶miRNA没有结合的任意探针后，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离放射性标记的产物。根据生产商的说明书，使用mirVanaTM探针&标记试剂盒(Ambion Inc.,TX)，通过用T4多核苷酸激酶进行5’末端标记，制备探针。如(Schmittgen等人,Nucl.Acids Res.32:e43(2004))所述，在Applied Biosystem的序列检测系统上进行定量实时PCR，所有反应一式三份地进行。简而言之，用基因特异性的引物和Thermoscript，将RNA逆转录成cDNA，并测定对于起始物蛋氨酸每种miRNA相对于tRNA的相对量，其中使用方程:2-dCT,其中dCT＝(CTmiRNA-CTU6)。
存活分析
鉴定出其表达与患者的存活显著相关的基因。基于BRB-ArrayTools3.2.3版本中的单变量Cox比例危险回归模型，计算每个基因的统计学显著性水平。然后将这些p值用于多变量置换检验，其中将存活时间和检查指示物在阵列间随机置换。如果它们的p值小于0.05，则认为基因是统计学上显著的。
通过Kaplan-Meier方法(SAS Institute,Cary,NC)估计存活曲线，使用时序检验对比得到的曲线。使用Cox比例危险回归模型，检查共变量的联合作用。使用StatMate(ATMSCo.Ltd.,Tokyo,Japan)进行统计学分析。
结果
分析104对原发性肺癌和相应的非癌肺组织中的miRNA表达，以研究miRNA在肺癌中的参与。在表2中对比了几个特定组对的miRNA表达。鉴定出在5个表型和组织学分类中差异表达的miRNA(表2)。
在对比肺癌组织和相应的非癌肺组织中的miRNA表达后，鉴定出表现出组间的表达的统计学上显著的差异的43种miRNA(表3)。在使用我们的微阵列分析工具的类别对比分析中，进行多变量置换检验，以控制多重对比。该检验提供了一个特定的置信水平，用于确保假发现的数目不超过靶水平，或用于确保代表假发现的基因列表的比例不超过靶水平。因而，通过多变量置换检验估计出，如果类别之间没有实际差异，则在<0.001水平偶然获得至少43个统计学显著的差异表达的miRNA的概率是0。此外，使用基于化合物共变量预测因子的剩下一个(leave-one-out)交叉验证的类别预测方法，104个肺癌中的91％得以正确地分类。基于2000个随机置换，p值<0.0005，所述p值定义为产生不大于真实数据的交叉验证误差率的交叉验证误差率的随机置换的比例。
这些miRNA中的几个与FRA有关(表3)。更具体地，3种miRNA位于脆性位点内(hsa-mir-21在FRA17B,hsa-mir-27b在FRA9D,和hsa-mir-32在FRA9E)。此外，这些鉴定出的miRNA中的许多位于在几种恶性肿瘤中频繁缺失或扩增的区域(表3)。例如，hsa-mir-21和hsa-mir-205位于在肺癌中扩增的区域，而hsa-mir-126*和hsa-mir-126是在9q34.3，该区域在肺癌中缺失。还在腺癌和鳞状细胞癌中发现了前体let-7a-2和let-7f-1的降低的表达，p值截止值为0.05。以相同的方式，肺腺癌相对于非癌组织之间、以及鳞状细胞癌相对于非癌组织之间的对比分析，分别揭示了具有统计学差异表达的17和16种miRNA(表4)。6种miRNA(hsa-mir-21,hsa-mir-191,hsa-mir-155,hsa-mir-210,hsa-mir-126*,和hsa-mir-224)在这两种组织学类型的非小细胞肺癌(NSCLC)中共有。
表2.临床病理学分类的的对比分析
a基因数,在0.001显著的基因的数目。
bFDR,假发现率，它是显著基因的偶然概率。
c正确分类％(p-值)。基于化合物共变量预测因子的剩下一个交叉验证的类别预测方法。p-值是产生不大于真实数据的交叉验证误差率的交叉验证误差率的随机置换的比例。
d腺,腺癌。
eSCC,鳞状细胞癌。
表3.相对于非癌肺组织，在肺癌组织中差异表达的43种miRNA。
a信息来自以前的报道(Calin,G.A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:2999-3004(2004))。
b信息来自以前的报道(Rodriguez,A.等人,Genome Res.14:1902-1910(2004))。
cAmp,扩增；dDel,缺失；eNSCLC,非小细胞肺癌；fHCC,肝细胞癌；gmlncRNA,mRNA样非编码RNA；hND,未确定；iMFHs,恶性纤维组织细胞瘤。
进行对选择前体miRNA的实时RT-PCR分析，以验证微阵列分析的结果。首先，使用hsa-mir-21、hsa-mir-126*、hsa-mir-205和U6(作为对照)的基因特异性引物，制备来自16对肺腺癌和16对肺鳞状细胞癌的cDNA。随后，进行实时RT-PCR分析，以测定这些miRNA在不同样品中的表达水平。当与这些miRNA在相应的非癌组织中的表达水平相比时，分别在32个病例的66％和56％中发现了hsa-mir-21和hsa-mir-205前体miRNA表达的至少2倍增量调节(图1)。通过配对的t-检验，差异在p<0.001是统计学显著的。相比之下，检查的32个肺癌病例中31％表现出前体hsa-mir-126*表达的大于50％减少，尽管这些结果不是统计上显著的(图1)。这些发现表明，特定前体miRNA在肺癌中频繁增量调节或减少，这与它们的成熟miRNA的表达模式相一致，如使用微阵列分析所测定的。
表4.相对于非癌肺组织，在腺癌组织/鳞状细胞肺癌组织中差异表达的miRNA。
另外，通过溶液杂交检测方法，对成熟miRNA证实了3种前体miRNA－hsa-mir-21、hsa-mir-126*和hsa-mir-205的微阵列数据。具体地，分析了7对原发性肺癌组织和相应的非癌肺组织，可以得到足够量的RNA。与相应的非癌肺组织相比，成熟形式的hsa-mir-21和hsa-mir-205在肺癌组织中明显地增量调节(图2)，而hsa-mir-126*在大多数检查的肺癌组织中减量调节。因此，象RT-PCR结果一样，这些分析证实了这3种miRNA的微阵列表达数据。
实施例2:人肺癌细胞系中不同的miRNA表达特征
材料和方法
样品
在该研究中使用了13种肺癌细胞系，它们由5种小细胞肺癌(SCLC)细胞系和8种非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系组成。5种SCLC细胞系是DMS92,NCI-H82,NCI-H146,NCI-H446和NCI-H417(美国组织培养物保藏中心)。8种NSCLC细胞系是NCI-H157,Calu-1,Calu-6,NCI-H292,NCI-H596,A-427,A549和A2182(美国组织培养物保藏中心,Manassas,VA)。根据生产商的说明书，用Reagent(Invitrogen,Carlsbad,CA)从组织和培养的细胞分离总RNA。
微阵列分析
如前所述进行微阵列分析(Liu,C.G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:9740-9744(2004),也参见,实施例1)。
统计学分析
如上文所述进行统计学分析(参见，例如实施例1)。
结果
通过微阵列分析，产生了5种小细胞肺癌(SCLC)细胞系和8种非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系的miRNA表达谱。对比NSCLC和SCLC的miRNA表达谱，揭示了3种miRNA(hsa-mir-24-1,hsa-mir-29a,和hsa-mir-29c)的表达水平的统计学显著的差异(t-检验，p<0.001)。此外，当将分级聚类分析应用于每种样品类型的18种最为差异表达的miRNA时，揭示了不同簇，所有NSCLC细胞系落入不同于SCLC细胞系的簇中(图3A,图3B)。这些结果指示，miRNA表达谱可以在不同的起源和/或类型的细胞中有差异，如在以前的研究中所发现的(参见，例如Liu,C.G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:9740-9744(2004)；Bhattacharjee,A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:13790-13795(2001)；Garber,M.E.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:13784-13789(2001))。
实施例3:与肺癌的临床病理学特征有关的miRNA的鉴定
材料和方法
微阵列分析
如前所述进行微阵列分析(Liu,C.G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:9740-9744(2004),也参见,实施例1)。
统计学分析
如上文所述进行统计学分析(参见，例如实施例1)。
结果
分析了微阵列数据是否揭示临床行为有差异的肺癌子集的特异性分子特征。对于该分析，检查了5类临床和病理学信息的关系(表2)。在组织学分类中，鉴定出在两种最常见组织学类型的NSCLC－腺癌和鳞状细胞癌中差异表达的6种miRNA(hsa-mir-205,hsa-mir-99b,hsa-mir-203,hsa-mir-202,hsa-mir-102,和hsa-mir-204-prec)。腺癌中hsa-mir-99b和hsa-mir-102的表达水平更高。对于通过年龄、性别或种族区分的组，没有鉴定出差异表达的miRNA。
实施例4:hsa-mir-155和hsa-let-7a-2表达与肺腺癌患者的预后之间的关联。
材料和方法
微阵列分析
如前所述进行微阵列分析(Liu,C.G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:9740-9744(2004),也参见,实施例1)。
统计学分析
如上文所述进行统计学分析(参见，例如实施例1)。
基因本体论分析
通过Lewis等人(Lewis,B.P.等人,Cell120:15-20(2005))和PicTar(Krek,A.等人,Nat.Genet.37:495-500(2005))的方法，确定hsa-mir-155和hsa-let-7a的预测靶，并就特定基因本体论(GO)生物群内的过度表示进行分析。对GO项目列进行使用Whole PathwayScope(WPS)应用的分析，并列出Fisher Exact scores小于0.005的那些项。
结果
评估了miRNA表达与患者存活的关联。BRB-ArrayTools中带总体置换检验的单变量Cox比例危险回归模型指示，8种miRNA(hsa-mir-155,hsa-mir-17-3p,hsa-mir-106a,hsa-mir-93,hsa-let-7a-2,hsa-mir-145,hsa-let-7b和hsa-mir-21)与腺癌患者存活相关。发现hsa-mir-155、hsa-mir-17-3p、hsa-mir-106a、hsa-mir-93或hsa-mir-21的高表达和hsa-let-7a-2、hsa-let-7b或hsa-mir-145的低表达具有显著更差的预后。另外，41位I期腺癌患者中的存活分析揭示，3种miRNA(hsa-mir-155,hsa-mir-17-3p,和hsa-mir-20)与患者结果有关。这些结果证实了miRNA表达谱与患者存活之间的重要关系，与疾病阶段无关。
因为这些miRNA中的5种(hsa-mir-155,hsa-mir-17-3p,hsa-let-7a-2,hsa-mir-145,和hsa-mir-21)相对于相应的非癌肺组织在肺癌组织中差异表达，将这些miRNA用于进一步的存活分析。为这5种miRNA中的每一种计算肺癌表达与相应的非癌肺组织表达的比例，并根据所述表达比将病例分类。使用对每种miRNA的这些分组，进行Kaplan-Meier存活分析。Kaplan-Meier存活估计表明，具有高hsa-mir-155表达或降低的hsa-let-7a-2表达的肺腺癌患者的存活前景比具有低hsa-mir-155或高hsa-let-7a-2表达的患者更差(图4和图5)。这2组的预后的差异，对于hsa-mir-155是非常显著的(p＝0.006；时序检验)，但是对于hsa-let-7a-2不太显著(p＝0.033；时序检验)。对临床病理学因素的存活分析表明，阶段与存活显著相关(p＝0.01；时序检验)，而年龄、种族、性别和吸烟史不能解释差的预后(表5A和5B)。为了调整进行多重对比，我们使用了Storey等人的方法(Storey,J.D.和Tibshirani,R.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100:9440-9445(2003))，将错误发现率限定到0.05。使用该比率，hsa-mir-155和疾病阶段仍然是统计学上显著的。随后，使用所有这些临床病理学和分子因素，进行多变量Cox比例危险回归分析。确定高hsa-mir-155表达是不利的预后因素，独立于其它临床病理学因素(p＝0.027；危险比率3.03；95％CI,1.13－8.14)以及疾病阶段(p＝0.013；危险比率3.27；95％CI,1.31-8.37；表5A)。
表5A.与分子和临床病理学特征和miRNA表达(通过微阵列分析进行分析)相关的肺腺癌患者的手术后存活。
a95％CI,95％置信区间。
b多变量分析,Cox比例危险回归模型。
c hsa-let-7a-2低/高不是统计学上显著的(p＝0.089)。
表5B.与临床病理学特征和前体miRNA表达(通过实时RT-PCR分析而分析的)相关的肺腺癌患者的手术后存活。
a95％CI,95％置信区间。
b多变量分析,Cox比例危险回归模型。
为了研究改变的hsa-mir-155和hsa-let-7a-2表达的生物学结果，进行生物信息分析，来根据基因本体论(GO)项分组这些miRNA的预测靶(表6)。除了与更一般的功能GO项的联系以外，对hsa-mir-155观察到与转录有关的靶的显著富集。hsa-let-7a显示出与蛋白激酶和细胞内信号传递级联相关联的基因靶的过度表示，该发现与报道的let-7与RAS之间的功能相互作用一致(Johnson,S.M.等人,Cell120:635-647(2005))。
表6.hsa-mir-155和hsa-let-7a的预测转录物靶的基因本体论分析(生物学过程)。
对hsa-mir-155和hsa-let-7a-2进行实时RT-PCR分析，以确定前体miRNA表达是否也对腺癌患者具有预后影响。首先，对32对来自原始集合的腺癌(其中可以得到RNA)进行实时RT-PCR分析。计算肺癌表达与相应的非癌肺组织表达的比例，并根据表达比将病例分类。Kaplan-Meier存活分析(图6,图7)证实了具有高前体hsa-mir-155表达(p＝0.047；时序检验)或降低的前体hsa-let-7a-2表达(p＝0.037；时序检验)的患者的显著更差的存活(表5B)。为了进一步验证本文所述的预后分类标准，使用实时RT-PCR分析，分析了另一个独立的32个腺癌的集合。Kaplan-Meier存活曲线(图8,图9)也显示出该组群中前体hsa-mir-155表达的明显关系(p＝0.033；时序检验)和hsa-let-7a-2表达的接近显著性(p＝0.084；时序检验)(表5B)。另外，通过多变量Cox比例危险回归分析，发现高前体hsa-mir-155表达是差预后的独立预测因子(表5B)。为了进一步证实原始集合(32个病例)和附加集合(32个病例)中是否存在任何分组偏倚，对所有64个病例进行单变量和多变量存活分析。与以前的结果相一致，这些分析显示出前体hsa-mir-155表达的显著性(表5B；图10)。注意到，降低的前体hsa-let-7a-2表达也对腺癌患者具有类似的预后影响(表5B；图11)，这与以前的报道(Takamizawa,J.等人,Cancer Res.64,3753-3756(2004))相一致。
实施例5:NSCLC细胞系中miRNA表达的外遗传调节的缺乏。
材料和方法
微阵列分析
如前所述进行微阵列分析(Liu,C.G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:9740-9744(2004),也参见,实施例1)。
统计学分析
如上文所述进行统计学分析(参见，例如实施例1)。
5-氮杂-dC和/或TSA处理
用含有1.0μM5-氮杂-dC(Sigma,St.Louis,MO)的培养基温育A549和NCI-H157肺癌细胞(来自美国组织培养物保藏中心)48小时，然后在有1.0μM TSA(Sigma,St.Louis,MO)存在下，再温育24小时。用Reagent(Invitrogen)分离总RNA，如上所述进行微阵列分析。每种处理进行一式三份。
结果
miRNA微阵列用于分析在2种肺癌细胞系(A549和NCI-H157)中用5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-氮杂-dC)(一种DNA甲基化抑制剂)和/或曲古抑菌素A(TSA)(一种有效的组蛋白去乙酰化酶抑制剂)处理后多种不同miRNA的表达。尽管在用5-氮杂-dC或TSA处理后证实了已知转录沉默的基因(MYO18B)的增强表达(图12)，来自微阵列的miRNA在任一种化合物处理后都没有表现出表达的统计学上显著的变化，提示超甲基化和组蛋白去乙酰化在至少这2种细胞系中不导致降低水平miRNA表达。
本申请还涉及下列实施方案：
1.诊断受试者是否患有肺癌或处于发生肺癌的风险中的方法，其包括，测量来自所述受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，其中与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中所述miR基因产物的水平的改变，指示着受试者患有肺癌或处于发生肺癌的风险中。
2.项目1的方法，其中所述至少一种miR基因产物选自：miR-21,miR-191,miR-126*,miR-210,miR-155,miR-143,miR-205,miR-192-prec,miR-224,miR-126,miR-24-2,miR-30a-5p,miR-212,miR-140,miR-9,miR-214,miR-17-3p,miR-124a-1,miR-218-2,miR-95,miR-145,miR-198,miR-216-prec,miR-219-1,miR-106a,miR-197,miR-192,miR-125a-prec,miR-26a-1-prec,miR-146,miR-203,miR-199b-prec,let-7a-2-prec,miR-27b,miR-32,miR-29b-2,miR-220,miR-33,miR-181c-prec,miR-150,miR-101-1,miR-124a-3,miR-125a和let-7f-1。
3.项目1的方法，其中所述至少一种miR基因产物选自：miR-21,miR-205和miR-216。
4.项目1的方法，其中所述至少一种miR基因产物选自：miR-21,miR-191,miR-155,miR-210,miR-126*和miR-224。
5.项目1的方法，其中所述肺癌是肺腺癌，且所述至少一种miR基因产物选自：miR-21,miR-191,miR-155,miR-210,miR-126*,miR-126,miR-24-2,miR-219-1,miR-95,miR-192-prec,miR-220,miR-216-prec,miR-204-prec,miR-188,miR-198,miR-145和miR-224。
6.项目1的方法，其中所述肺癌是肺鳞状细胞癌，且所述至少一种miR基因产物选自：miR-205,miR-224,miR-191,miR-126*,miR-140,miR-210,miR-17-3p,miR-29b,miR-143,miR-203,miR-155,miR-21,miR-214,miR-212,miR-30a-5p和miR-197。
7.项目1的方法，其中测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中相应的miR基因产物的水平。
8.项目1的方法，其中测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中相应的miR基因产物的水平。
9.确定患有肺癌的受试者的预后的方法，其包括测量来自所述受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，其中:
所述miR基因产物与肺癌不良预后有关；且
与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，肺测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平的改变指示着不良预后。
10.项目9的方法，其中所述至少一种miR基因产物选自：miR-155,miR-17-3p,miR-106a,miR-93,let-7a-2,miR-145,let-7b,miR-20和miR-21。
11.项目9的方法，其中所述肺癌是肺腺癌，且所述至少一种miR基因产物选自：miR-155和let-7a-2。
12.诊断受试者是否患有肺癌或处于发生肺癌的风险中的方法，其包括:
(1)从获自受试者的测试样品逆转录RNA，以提供一组靶寡脱氧核苷酸；
(2)使所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，以提供测试样品的杂交谱；和
(3)对比测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱,
其中至少一种miRNA的信号的改变指示着受试者患有肺癌或处于发生肺癌的风险中。
13.项目12的方法，其中与从对照样品产生的信号相比，至少一种miRNA的信号被减量调节。
14.项目12的方法，其中与从对照样品产生的信号相比，至少一种miRNA的信号被增量调节。
15.项目12的方法，其中所述微阵列包含针对选自下述的一种或多种miRNA的miRNA-特异性探针寡核苷酸：miR-21,miR-191,miR-126*,miR-210,miR-155,miR-143,miR-205,miR-192-prec,miR-224,miR-126,miR-24-2,miR-30a-5p,miR-212,miR-140,miR-9,miR-214,miR-17-3p,miR-124a-1,miR-218-2,miR-95,miR-145,miR-198,miR-216-prec,miR-219-1,miR-106a,miR-197,miR-192,miR-125a-prec,miR-26a-1-prec,miR-146,miR-203,miR-199b-prec,let-7a-2-prec,miR-27b,miR-32,miR-29b-2,miR-220,miR-33,miR-181c-prec,miR-150,miR-101-1,miR-124a-3,miR-125a,let-7f-1和其组合。
16.诊断受试者是否患有不良预后的肺癌或处于发生不良预后的肺癌的风险中的方法，其包括:
(1)从获自受试者的测试样品逆转录RNA，以提供一组靶寡脱氧核苷酸；
(2)使所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，以提供所述测试样品的杂交谱；和
(3)对比测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱,
其中信号的改变指示着受试者患有不良预后的肺癌或处于发生不良预后的肺癌的风险中。
17.项目16的方法，其中选自miR-155,miR-17-3p,miR-106a,miR-93,let-7a-2,miR-145,let-7b,miR-20和miR-21的至少一种miR基因产物的信号的改变，指示着受试者患有不良预后的肺癌或处于发生不良预后的肺癌的风险中。
18.项目16的方法，其中所述肺癌是肺腺癌，且选自miR-155和let-7a-2的至少一种miR基因产物的信号的改变，指示着受试者患有不良预后的肺癌或处于发生不良预后的肺癌的风险中。
19.项目16的方法，其中所述微阵列包含至少一种针对选自下述的miRNA的miRNA-特异性探针寡核苷酸：miR-21,miR-191,miR-126*,miR-210,miR-155,miR-143,miR-205,miR-192-prec,miR-224,miR-126,miR-24-2,miR-30a-5p,miR-212,miR-140,miR-9,miR-214,miR-17-3p,miR-124a-1,miR-218-2,miR-95,miR-145,miR-198,miR-216-prec,miR-219-1,miR-106a,miR-197,miR-192,miR-125a-prec,miR-26a-1-prec,miR-146,miR-203,miR-199b-prec,let-7a-2-prec,miR-27b,miR-32,miR-29b-2,miR-220,miR-33,miR-181c-prec,miR-150,miR-101-1,miR-124a-3,miR-125a,let-7f-1和其组合。
20.治疗患有肺癌的受试者的肺癌的方法，其中与对照细胞相比，受试者癌细胞中的至少一种miR基因产物被减量调节或增量调节，该方法包括:
(1)当癌细胞中的至少一种miR基因产物被减量调节时，给受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段，条件是，所述miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1，从而抑制受试者中癌细胞的增殖；或
(2)当癌细胞中的至少一种miR基因产物被增量调节时，给受试者施用有效量的至少一种用于抑制所述至少一种miR基因产物的表达的化合物，从而抑制受试者中癌细胞的增殖。
21.项目20的方法，其中步骤(1)中的至少一种分离的miR基因产物选自：miR-126*,miR-143,miR-192,miR-224,miR-126,miR-30a-5p,miR-140,miR-9,miR-124a-1,miR-218-2,miR-95,miR-145,miR-198,miR-216,miR-219-1,miR-125a,miR-26a-1,miR-199b,let-7a-2,miR-27b,miR-32,miR-29b-2,miR-220,miR-33,miR-181c,miR-101-1,miR-124a-3,let-7f-1和其组合。
22.项目20的方法，其中步骤(2)中的至少一种miR基因产物选自：miR-21,miR-191,miR-210,miR-155,miR-205,miR-24-2,miR-212,miR-214,miR-17-3p,miR-106a,miR-197,miR-192,miR-146,miR-203,miR-150和其组合。
23.治疗受试者的肺癌的方法，其包括:
(1)测定与对照细胞相比，肺癌细胞中至少一种miR基因产物的量；和
(2)通过下述方式，改变在肺癌细胞中表达的miR基因产物的量：
(i)如果在癌细胞中表达的miR基因产物的量小于在对照细胞中表达的miR基因产物的量，给受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段，条件是，所述miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1；或
(ii)如果在癌细胞中表达的miR基因产物的量大于在对照细胞中表达的miR基因产物的量，给受试者施用有效量的至少一种用于抑制所述至少一种miR基因产物的表达的化合物。
24.项目23的方法，其中步骤(i)中的至少一种分离的miR基因产物选自：miR-126*,miR-143,miR-192,miR-224,miR-126,miR-30a-5p,miR-140,miR-9,miR-124a-1,miR-218-2,miR-95,miR-145,miR-198,miR-216,miR-219-1,miR-125a,miR-26a-1,miR-199b,let-7a-2,miR-27b,miR-32,miR-29b-2,miR-220,miR-33,miR-181c,miR-101-1,miR-124a-3,let-7f-1和其组合。
25.项目23的方法，其中步骤(ii)中的至少一种miR基因产物选自：miR-21,miR-191,miR-210,miR-155,miR-205,miR-24-2,miR-212,miR-214,miR-17-3p,miR-106a,miR-197,miR-192,miR-146,miR-203,miR-150和其组合。
26.用于治疗肺癌的药物组合物，其包含至少一种分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段,和药学上可接受的载体。
27.项目26的药物组合物，其中所述至少一种分离的miR基因产物对应于相对于对照细胞在肺癌细胞中减量调节的miR基因产物。
28.项目26的药物组合物，其中所述分离的miR基因产物选自：miR-126*,miR-192,miR-224,miR-126,miR-30a-5p,miR-140,miR-9,miR-124a-1,miR-218-2,miR-95,miR-145,miR-198,miR-216,miR-219-1,miR-125a,miR-26a-1,miR-199b,let-7a-2,miR-27b,miR-32,miR-29b-2,miR-220,miR-33,miR-181c,miR-101-1,miR-124a-3,miR-125b-1,let-7f-1和其组合。
29.用于治疗肺癌的药物组合物，其包含至少一种抑制miR表达的化合物和药学上可接受的载体。
30.项目29的药物组合物，其中所述至少一种抑制miR表达的化合物对相对于对照细胞在肺癌细胞中增量调节的miR基因产物是特异性的。
31.项目29的药物组合物，其中所述至少一种抑制miR表达的化合物对选自下述的miR基因产物是特异性的：miR-21,miR-191,miR-210,miR-155,miR-205,miR-24-2,miR-212,miR-214,miR-17-3p,miR-106a,miR-197,miR-192,miR-146,miR-203,miR-150和其组合。
32.鉴定抗肺癌剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂，和测量与肺癌细胞中降低的表达水平有关的至少一种miR基因产物的水平,其中与对照细胞相比，所述细胞中所述miR基因产物的水平的增加，指示着测试试剂是抗肺癌剂。
33.项目32的方法，其中所述miR基因产物选自：miR-126*,miR-143,miR-192,miR-224,miR-126,miR-30a-5p,miR-140,miR-9,miR-124a-1,miR-218-2,miR-95,miR-145,miR-198,miR-216,miR-219-1,miR-125a,miR-26a-1,miR-199b,let-7a-2,miR-27b,miR-32,miR-29b-2,miR-220,miR-33,miR-181c,miR-101-1,miR-124a-3,let-7f-1和其组合。
34.鉴定抗肺癌剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂，和测量与肺癌细胞中增加的表达水平有关的至少一种miR基因产物的水平,其中与对照细胞相比，所述细胞中所述miR基因产物的水平的降低，指示着测试试剂是抗肺癌剂。
35.项目34的方法，其中所述miR基因产物选自：miR-21,miR-191,miR-210,miR-155,miR-205,miR-24-2,miR-212,miR-214,miR-17-3p,miR-106a,miR-197,miR-192,miR-146,miR-203,miR-150和其组合。
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Claims (12)

1.miRNA-特异性探针寡核苷酸在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于诊断受试者是否患有鳞状细胞肺癌或处于发生鳞状细胞肺癌的风险中，所述诊断包括：测量来自所述受试者的测试样品中至少miR-17-3p基因产物的水平，其中与对照样品中miR-17-3p基因产物的水平相比，测试样品中所述miR-17-3p基因产物的水平的增量调节，指示着受试者患有鳞状细胞肺癌或处于发生鳞状细胞肺癌的风险中。
2.权利要求1的用途，其中所述诊断还包括，测量至少一种选自下列的另外的miR基因产物：miR-21,miR-191,miR-126*,miR-210,miR-155,miR-143,miR-205,miR-224,miR-30a-5p,miR-212,miR-140,miR-214,miR-197,miR-203和miR-29b-2。
3.权利要求1的用途，其中所述诊断还包括，测量至少一种选自下列的另外的miR基因产物：miR-21,miR-191,miR-155,miR-210,miR-126*和miR-224，其中miR-21,miR-191,miR-155,miR-210相对于对照是增量调节的，并且其中miR-126*和miR-224相对于对照是减量调节的。
4.权利要求1的用途，其中所述诊断包括，测量选自下列的特征miR基因产物：miR-17-3p，miR-21,miR-205和miR-216。
5.权利要求2的用途，其中miR-205,miR-191,miR-210,miR-203,miR-155,miR-21,miR-214,miR-212,和miR-197相对于对照是增量调节的。
6.miRNA-特异性探针寡核苷酸在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于确定患有鳞状细胞肺癌的受试者的预后，其中所述确定预后包括：测量来自所述受试者的测试样品中至少miR-17-3p基因产物的水平，其中:
与对照样品中miR-17-3p基因产物的水平相比，测试样品中所述miR-17-3p基因产物的水平的增加指示着不良预后。
7.权利要求6的用途，其中所述确定预后还包括，测量至少一种选自下列的另外的miR基因产物：miR-155和miR-21。
8.miRNA-特异性探针寡核苷酸在制备微阵列中的用途，所述微阵列通过下列步骤来诊断受试者是否患有鳞状细胞肺癌或处于发生鳞状细胞肺癌的风险中，所述步骤包括:
(1)从获自受试者的测试样品逆转录RNA，以提供一组靶寡脱氧核苷酸；
(2)使所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，以提供测试样品的杂交谱；和
(3)对比测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱,
其中至少miR-17-3p基因产物的增量调节指示着受试者患有鳞状细胞肺癌或处于发生鳞状细胞肺癌的风险中。
9.权利要求8的用途，其中所述微阵列还包含针对选自下述的一种或多种miRNA的miRNA-特异性探针寡核苷酸：miR-21,miR-191,miR-126*,miR-210,miR-155,miR-143,miR-205,miR-224,miR-30a-5p,miR-212,miR-140,miR-214,miR-197,miR-29b-2和其组合。
10.权利要求8的用途，其中所述微阵列还包含针对选自下述的一种或多种miRNA的miRNA-特异性探针寡核苷酸：miR-21,miR-191,miR-155,miR-210,miR-126*和miR-224，其中miR-21,miR-191,miR-155,miR-210相对于对照是增量调节的，并且miR-126*和miR-224相对于对照是减量调节的。
11.权利要求8的用途，其中所述微阵列包含针对选自下述的miRNA的miRNA-特异性探针寡核苷酸：miR-17-3p，miR-21,miR-205和miR-216。
12.权利要求8的用途，其中所述微阵列包含针对下述miRNA的特征的miRNA-特异性探针寡核苷酸：miR-17-3p，miR-205,miR-224,miR-191,miR-126*,miR-140,miR-210,miR-29b,miR-143,miR-203,miR-155,miR-21,miR-214,miR-212,miR-30a-5p和miR-197。
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