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CN100488984C - 降低融合蛋白的免疫原性 - Google Patents

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CN100488984C CNB028075056A CN02807505A CN100488984C CN 100488984 C CN100488984 C CN 100488984C CN B028075056 A CNB028075056 A CN B028075056A CN 02807505 A CN02807505 A CN 02807505A CN 100488984 C CN100488984 C CN 100488984C
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Abstract

本发明公开了制备具有降低的免疫原性的融合蛋白的组合物和方法。本发明的融合蛋白包括具有氨基酸改变的连接区，此氨基酸改变降低了连接处表位和MHC II类结合的能力，因此降低了它和T-细胞受体的相互作用。本发明的方法涉及对融合蛋白连接区中一处或多处氨基酸的分析、改变或修饰，目的是鉴定出T-细胞表位并降低它和T-细胞受体相互作用的能力。本发明的组合物和方法在治疗中有用。

Description

降低融合蛋白的免疫原性
相关申请
本申请要求系列号60/280,625(2001年3月30日提交)的美国临时专利申请的优先权和利益，此临时专利申请的所有公开内容都在此通过参考方式并入。
发明领域
本发明一般地涉及用于制造和使用作为治疗剂的具有降低的或没有免疫原性的经修饰融合蛋白的方法和组合物。更具体的，本发明涉及融合蛋白，通过鉴定候选T-细胞表位和修饰氨基酸序列消除此表位，该融合蛋白具有降低的免疫原性。
发明背景
很多治疗性蛋白是正常的人体蛋白。例如，白细胞介素-2，促红细胞生成素，和生长激素均是人体蛋白，它们被施用给通常已有内源水平的这些蛋白的人。通常将完全正常的人体蛋白作为治疗剂使用时极少有针对这种蛋白的免疫应答。
最近显示很多有人工活性的融合蛋白可用作治疗性蛋白。例如，Enbrel是TNF受体的细胞外结构域和IgG1 Fc区域的融合物。Enbrel用于治疗类风湿性关节炎，而且被认为通过滴定TNF和阻止TNF活性来作用。但是，已注意到在用Enbrel治疗的患者中有显著的抗Enbrel抗体发生率。
另一个治疗上有用的融合蛋白类型的例子是免疫细胞因子。这些蛋白包括一个抗体部分和一个细胞因子部分，可用于使细胞因子靶向疾病细胞，如癌细胞。
但是，这些融合蛋白中的很多蛋白在治疗上的应用因为它们在哺乳动物中，尤其在人类中的免疫原性而受到了限制。
因此，为了在治疗中使用这些蛋白，需要制备具有降低的免疫原性的融合蛋白。
发明概述
本发明的特征在于用于制备治疗中使用的具有降低免疫原性的融合蛋白的方法和组合物。例如，本发明涉及具有降低的免疫原性的免疫细胞因子，免疫融合素(immunofusin)，免疫配体，其它抗体和Fc融合蛋白，细胞因子-细胞因子融合蛋白，以及清蛋白融合蛋白。
本发明部分涉及融合蛋白含有“异己”序列的认识。例如，即使在两个人体蛋白之间的融合中，围绕融合连接处的区域也含有一段通常不在人体中出现的肽序列。例如，蛋白质药物，如Enbrel来源于两种正常的人体蛋白：TNF受体和IgG1。但是，在TNF受体和IgG1之间的连接处是一段通常在人体中不出现的肽序列。
本发明优选的方法涉及通过降低连接处表位(连接肽)和T-细胞受体相互作用的能力来降低融合蛋白的免疫原性，其中降低连接处表位和T细胞受体相互作用的能力是通过降低该表位和MHC分子结合的能力(其结合亲和力)实现的。根据本发明，连接处表位或肽优选为“非己”的。通常蛋白质，包括治疗性蛋白，都具有免疫原性，这部分是因为蛋白质通过抗原提呈细胞内吞和蛋白水解后产物肽结合到称为主要组织相容性复合体(MHC)的分子上然后这些分子把肽提呈给T细胞。抗原提呈细胞(APC)表面的抗原肽-MHC复合体刺激T细胞增殖，分化并释放细胞因子。同时，B-细胞分化和抗体产生被诱导，这可以进一步通过清除治疗性蛋白而限制治疗性蛋白的效用。这样，来源于治疗性蛋白的抗原肽能够引起一系列不想要的免疫应答。治疗性蛋白的效用由于抗体的中和而受限，而且因为T-细胞和B-细胞应答会在患者中引起炎性和变态反应，其诱导经常是有害的。
本发明涉及(1)鉴别具有一个或多个候选T-细胞表位的免疫球蛋白-靶蛋白连接区域中的新氨基酸序列；(2)对这些氨基酸序列进行修饰以减少或消除来源于连接处序列的具有T-细胞表位功能的肽。
本发明提供两大类与降低免疫原性有关的组合物和方法。根据本发明的一个实施方案，在跨融合连接处的序列中鉴定潜在的非己T-细胞表位。例如，可通过计算机方法基于对与MHC II类分子结合的肽的模建鉴定出潜在的非己T-细胞表位。然后进行替代以降低或消除来自连接区的肽与MHC II类结合的能力。用于鉴定和修饰与MHCII类分子结合的肽的该方法被命名为“去免疫化”而且所获修饰蛋白分子被称作“去免疫化的”。
根据本发明的另一个实施方案，在融合连接处引入一个或多个糖基化位点。虽然可以使用O-连接的糖基化位点，但优选使用N-连接的糖基化位点。根据一个优选的实施方案，对围绕融合连接处的连接区域中野生型序列的氨基酸进行突变，使N端融合部分的最后一个氨基酸突变成精氨酸，而第二个融合部分的头两个氨基酸突变成甘氨酸及之后的丝氨酸或苏氨酸。
根据本发明，MHC II类结合的去除在以下情况下是优选的，即当蛋白质在细菌或者不产生哺乳动物糖基化模式的生物，如酵母或昆虫细胞内产生时。
当蛋白质在哺乳动物细胞系内或者在产生对哺乳动物无害的糖基化模式的细胞系内制备时，可能优选引入糖基化位点。
在一个优选的实施方案中，融合蛋白的一个组分是细胞因子。术语“细胞因子”此处用于描述天然的或重组的蛋白质、其类似物及其片段，它们可以在具有所述细胞因子的受体的细胞中引起特异性反应。优选地，细胞因子是可由细胞产生和分泌的蛋白质。优选地，细胞因子包括白细胞介素如白细胞介素2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16和IL-18，造血细胞因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、G-CSF和促红细胞生成素，肿瘤坏死因子(TNF)如TNFα、淋巴因子如淋巴毒素，代谢过程调节物如leptin以及干扰素如干扰素α、干扰素β和干扰素γ和趋化因子。优选地，本发明的抗体-细胞因子融合蛋白显示出细胞因子特异性的生物活性。
在另一个优选的实施方案中，融合蛋白的一个组分是抗肥胖细胞因子。例如，组分为leptin，CNTF，或Acrp30的一部分。
在一个备选的优选实施方案中，融合蛋白的一个组分是激素。例如，组分可以是胰岛素，生长因子或胰高血糖素样肽(GLP-1)。
在再一个备选的实施方案中，融合蛋白的一个组分是具有生物学活性的配体结合蛋白。在一个优选实施方案中，使用TNF受体的细胞外结构域。
根据一系列的实施方案，本发明的融合蛋白包含非抗体部分的N端与抗体部分的C端的融合。根据另一系列的实施方案，本发明的融合蛋白包含非抗体部分的C端与抗体部分的N端的融合。本发明中，抗体部分可以是完整的免疫球蛋白或完整免疫球蛋白的一部分。免疫球蛋白的一部分可以包括可变区或恒定区或两者都包括。优选的免疫球蛋白包括Fc区或其部分。本发明一个优选的实施方案包括经修饰具有降低的免疫原性和/或更长的血清半衰期的IgG1免疫球蛋白同种型，或其一部分。例如，优选在CH3-细胞因子连接处附近具有氨基酸残基修饰的IgG1。对特定的应用，优选来自IgG2或IgG4同种型的抗体部分。
免疫细胞因子仅仅是靶向肿瘤的融合蛋白疗法的一个例子。其他肿瘤-毒性分子也可以通过融合到肿瘤特异性的抗体上而靶向肿瘤。另外，抗体融合蛋白可以攻击其他类型的疾病细胞，如感染病毒的细胞。另一个改造靶向融合蛋白的方法是使用Fc-X和X-Fc技术，此处的X是多肽。这些技术运用了如下知识，即如果目的多肽连接到免疫球蛋白的Fc部分上，则靶蛋白的制备和收集将得以改善。对于Fc-X融合蛋白，信号肽及后面的免疫球蛋白基因的Fc部分是靶蛋白的N端融合部分。在一些情况下，以X-Fc取向构建融合蛋白是特别有利的。在这样的结构中靶蛋白是N端融合部分，Fc片段位于其后。对一些蛋白，如淋巴细胞表面糖蛋白(LHR)(US专利5,428,130)和胰高血糖素样肽(GLP-1)，这样的方法是有用的。
因此，本发明的方法和组合物提供具有降低的免疫原性的Fc-X和X-Fc形式融合蛋白。根据本发明，融合蛋白的免疫原性可根据本领域内公知的或此处公开的方法测定。
本发明的方法和组合物还提供了具有降低的免疫原性的清蛋白融合蛋白。人血清清蛋白(HAS)因为具有非常长的半衰期、在体内分布广泛以及缺少酶学和免疫学功能而被用作治疗性肽/蛋白的载体(Yeh等，PNAS89：1904-1908，1992)。生物活性肽与HAS的遗传融合对分泌的治疗性HAS衍生物的回收是有用的。但是，根据本发明，清蛋白融合蛋白如HAS-CD4具有一个新的连接处，其中一般含有一个或多个可被MHC II类分子提呈的T细胞表位。本发明提供具有降低的免疫原性的清蛋白融合蛋白，以及用于降低清蛋白融合蛋白的免疫原性的一般方法。本发明中有用的清蛋白包括各种清蛋白，其等位变体和突变体，亦包括它们的片段。优选的清蛋白保留野生型清蛋白如HAS的结构和功能特性。
另一方面，本发明提供包含有用突变的去免疫化的抗体融合蛋白，该蛋白具有正常的、突变的或杂合的同种型。这些突变可能位于连接处附近或位于连接区域之外的位置。
例如，本发明提供在连接处有修饰的去免疫化的免疫细胞因子，其在IgG与非IgG部分之间的连接处有点突变。细胞因子部分包括任何细胞因子，但是优选IL-2或IL-12。在一个实施方案中，氨基酸的改变涉及到抗体部分C末端赖氨酸变成疏水氨基酸如丙氨酸或亮氨酸。将这种突变和本发明的去免疫化修饰相结合的一个关键优点是这些突变可共同作用以增加血清半衰期及降低免疫原性。此处描述的把融合连接处的去免疫化与改变血清半衰期的突变相结合的方法可用于显著改进这些融合蛋白的临床效用。
另一方面，本发明提供含有杂合抗体部分以及在融合连接处进行了去免疫化修饰的免疫细胞因子，其中所述杂合抗体部分包括不同Ig同种型来源的结构域，优选IgG1和IgG2同种型来源的结构域。例如，本发明提供去免疫化的免疫细胞因子，其使用IgG2和IgG2h杂合体并在连接处具有修饰(所述IgG2h为铰链区修饰成IgG1的IgG2)。在一个优选的实施方案中，杂合融合蛋白由去免疫化的IgG免疫球蛋白部分(由(γ1：CHI-H)(γ2：CH2-CH3)构成)和细胞因子部分组成。
另一方面，本发明提供编码具有降低的免疫原性的融合蛋白或有助于具有降低的免疫原性的融合蛋白表达、制备和分泌的新核酸序列。此核酸序列根据标准的重组DNA技术产生。
在一个优选实施方案中，核酸分子编码免疫细胞因子融合蛋白。优选的免疫细胞因子包括细胞因子(如白细胞介素2)和肿瘤特异性的单克隆抗体(如抗人上皮细胞粘附分子KSA(EP-CAM)(huKS)的抗体)。
在另一个优选的实施方案中，核酸分子编码各种构型的Fc融合蛋白。核酸分子按5’至3’方向顺次编码(i)信号序列、免疫球蛋白Fc区和靶蛋白序列或(ii)信号序列、靶蛋白和免疫球蛋白Fc区，或(iii)信号序列、第一靶蛋白、免疫球蛋白Fc区及第二靶蛋白。产生的核酸分子因此编码Fc-X、X-Fc或X-Fc-Y结构，此处X和Y是靶蛋白。在一个备择实施方案中，核酸分子编码不带信号序列的Fc-X、X-Fc或X-Fc-Y蛋白。
在另一个优选实施方案中，本发明的核酸编码具有突变或杂合同种型的Ig融合蛋白。具体地，该核酸提供具有杂合同种型或者备择性地具有经修改的铰链区的抗体部分。例如，融合蛋白由在铰链区含有较少二硫键的修饰IgG2组成，或者由铰链区来源于其他抗体(优选正常的或突变的IgG1铰链区)的IgG2CH2和CH3区组成。
本发明的核酸优选以可操作连接方式整合进可复制的表达载体中，然后此载体导入能产生此融合蛋白的哺乳动物宿主细胞中。所得融合蛋白将从哺乳动物宿主细胞中高效地产生并分泌。接着无需裂解哺乳动物宿主细胞可从培养基中收集分泌的融合蛋白。对蛋白产物测定活性和/或按需要用普通试剂进行纯化，和/或与融合部分切离，这些均可使用常规技术实现。
因此，本发明还提供具有降低的免疫原性的融合蛋白的制备方法。
本发明的方法和组合物还可用于提供使用经修饰具有较小免疫原性的融合蛋白的治疗方法。本发明的总目的是提供既有效又廉价的方法以及有更小免疫原性的蛋白。本发明优选的治疗组合物包括治疗有效量的去免疫化的融合蛋白。优选地，去免疫化的融合蛋白和药物学上可接受的载体一起施用。
从下面的详细说明、附图和权利要求中，本发明上述的和其他的方面、特性和优点将更加清晰。
发明详述
包括抗体在内的所有蛋白在治疗性施用给患者时都有可能在受体宿主内诱导免疫应答。此免疫应答由T-淋巴细胞(T-细胞)介导，然后触发B-淋巴细胞(B-细胞)产生抗体。针对治疗药物的抗体产生是有害的，因为这导致治疗药物更快的清除而且可能导致变态反应。
本发明提供降低融合蛋白免疫原性的方法。根据本发明的一个方法，鉴定融合蛋白中融合连接处的连接区域内的潜在T-细胞表位。T-细胞表位可以通过多种计算机和非计算机方法进行鉴定，包括基于以结构为基础的计算机模建进行预测或通过合成肽和检验与特定MHC II类分子的结合进行鉴定，或通过免疫原性实验进行鉴定。
依据本发明，融合连接处(junction)定义为融合蛋白中在第一蛋白或肽的最末(C端)氨基酸与第二蛋白或肽的第一个(N端)氨基酸之间的位置。因此，融合连接处包括位于一个蛋白的最末氨基酸与第二蛋白的第一个氨基酸之间的任何氨基酸。在一个实施方案中，融合连接处包括接头(linker)。
依据本发明，连接区域(junction region)是融合蛋白中围绕和涵盖两个蛋白之间的融合连接处的区域。连接区域优选包括1到约100个氨基酸，更优选1到约50个氨基酸，或1到约25个氨基酸，甚至更优选1到约15个氨基酸，或1到9个氨基酸。在一个实施方案中，连接区域包含插在两个蛋白之间的连接点上的间隔肽或接头肽。依据本发明，含有间隔肽或接头肽的连接区域也可被去免疫化以使患者对含有间隔肽或接头肽的融合蛋白的反应最小化。
依据本发明，连接处的T-细胞表位定义为能够与MHC II类分子结合的肽序列，其含有来源于融合蛋白的至少2个不同融合部分之每一个的各至少一个氨基酸。例如，Paul(基础免疫学(Fundamental Immunology)，第8章，表8，p.276[2000]第4版)阐述了能够与MHC II类分子结合的10个氨基酸的片段。在连接处的T-细胞表位中，这种10个氨基酸的肽来源于不同的融合部分。依据本发明，跨融合连接处的潜在的或候选的T-细胞表位(连接处的候选T-细胞表位)优选包括连接处两侧每一侧的各1到8个氨基酸，或更优选连接处两侧每一侧的各1到10个或1到11个氨基酸。候选表位优选为9，11或12个氨基酸长。这样，因为本发明的连接处T-细胞表位包括连接处两侧之每一侧的各至少一个氨基酸，故优选的候选T-细胞表位为这样的连接处表位，其含有1-8(或1-10，或11)个源于连接处一侧的氨基酸，而且它还包括互补数目的源于连接处另一侧的氨基酸，结果产生具有9-12个氨基酸，最优选9个氨基酸的表位。
依据本发明，然后突变连接处T-细胞表位内的锚(anchor)残基以防止其与MHC II类分子的结合。通常，应小心不要引入另外的潜在T-细胞表位，而且保留每个融合部分的功能。
依据本发明，野生型序列的融合是指融合连接处N端侧和C端侧的序列直接来源于天然序列的融合。
依据本发明，去免疫化的融合连接处是与野生型序列的连接处相对而言，在一处或多处引入了替换突变的连接处序列。在最优选的实施方案中，融合连接处的去免疫化不涉及接头，如‘非免疫原性’甘氨酸-丝氨酸接头的引入，而且融合部分之间的空间相互关系在去免疫化的融合蛋白中不发生变化。根据本发明，可对连接区域中的一个或多个氨基酸进行替换或改变，这些氨基酸可位于融合连接处的N端、融合连接处的C端或者融合连接处的N端和C端。
依据本发明，潜在T-细胞表位是一种序列，当其作为分离的肽被考虑时，预计可以与MHC II类分子或非人物种内的等价物结合。对潜在T-细胞表位的定义不考虑抗原加工的其他方面，如蛋白被摄入抗原提呈细胞的效率、在完整蛋白的位点上断裂产生可与MHC II类结合的肽的效率等等。因此，在蛋白施用给动物之后在MHC II上实际提呈的T-细胞表位组是潜在T-细胞表位的亚组。
依据本发明，T-细胞表位是蛋白上与MHC II类分子相互作用的表位。在不希望被理论束缚的情况下，T-细胞表位被理解为蛋白质或融合蛋白中的一段氨基酸序列，其在T-细胞发育过程中未能经历T-细胞负选择过程因此预期将被MHC II类分子提呈并被T-细胞受体识别。在本发明的一个优选实施方案中，非己T-细胞表位出现在形成融合蛋白的两个蛋白的融合连接处的连接区域中。
本发明提供用于降低或消除融合蛋白连接处中T-细胞表位数目的非计算机方法，其不需要复杂的计算机模拟或蛋白质三维结构。在一个实施方案中，本发明的方法利用在抗原提呈时9氨基酸的核心片段既与MHC II类分子又与T-细胞受体相互作用的事实。最N端的氨基酸被称为“锚”位置残基，其与MHC II类分子内的一个深口袋结合。下面氨基酸中的一个通常出现在对与MHC II类分子的结合重要的锚位置处：亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。依据本发明，核心9氨基酸邻近的另外2至3个氨基酸也影响与MHC分子的相互作用。而且，在融合蛋白中第一蛋白的最C端氨基酸通常被替换。当已知具有活性的N端融合部分或第一蛋白与C端融合部分或第一蛋白C端的第二蛋白融合时，这特别有用。
本发明的一个一般方法包括对融合蛋白的N端融合部分的最C端8个氨基酸中出现的亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸进行突变。在一个实施方案中，连接处的候选T-细胞表位氨基酸中的一个或多个氨基酸优先突变成苏氨酸、丙氨酸或脯氨酸。这保留了被替换氨基酸的一些疏水性质。在本发明的另外实施方案中，上面提到的一个或多个氨基酸从候选的或潜在的连接处T-细胞表位中删除，或被合适的氨基酸类似物替换。依据本发明，如果删除氨基酸来破坏潜在的T-细胞表位，则小心不要产生包括删除位置附近的氨基酸的新T-细胞表位。
依据本发明，构建一个通用表达质粒构建中间体常常是有用的，此中间体包含在最后8个氨基酸中一个或多个疏水残基发生突变的N-端融合部分的编码序列。通常，此质粒在N端融合部分的C端编码DNA之上或附近有一个或多个方便的限制性酶切位点。
质粒构建中间体的目的是为了构建编码融合蛋白的表达质粒，此融合蛋白的一个或多个N端融合部分在8个C端氨基酸中具有一个或多个亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸向另一氨基酸的替换。此最终表达质粒的构建可用本领域内熟知的各种其他方法进行，如产生PCR片段或合成核酸，然后将片段连接入适当的载体或通过熟知的PCR技术与其它序列连接。
特别优选的实施方案包括Fc-X融合质粒，清蛋白-X融合质粒，scFv-X融合质粒以及Fab-X融合质粒。对于Fc(γ)-X，在编码序列中引入突变以引起IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子的Fc区C端附近的亮氨酸-丝氨酸-亮氨酸-丝氨酸片段的氨基酸替换是有用的，如此处对于IgG1的说明：源于IgG1，IgG2，IgG3和IgG4的人Fc区的氨基酸序列分别在SEQ IDNO：1，2，3和4中描述。
在一个实例中，KSLSLSPGK(SEQ ID NO：5)改变成KSATATPGK(SEQ ID NO：6)。此突变的目的是消除潜在的连接处T-细胞表位和去掉上游苯丙氨酸或酪氨酸作为位置1锚残基的T-细胞表位。
备择地，有时把去掉候选连接处T-细胞表位的突变和延长血清半衰期的突变结合起来是有用的。例如，把KSLSLSPGK(SEQ ID NO：5)改变成KSATATPGA(SEQ ID NO：7)。
其他实施方案包括在LSLS片段中用其他氨基酸残基如甘氨酸或脯氨酸进行替换。
对于用于制备IgA融合蛋白的表达载体，删除一些C末端氨基酸使C末端附近参与IgA寡聚化的半胱氨酸缺失是有用的。例如，可以删除15个氨基酸，这样在被融合到第二蛋白上之前IgA重链序列末端为脯氨酸-苏氨酸-组氨酸。而且，在IgA Fc区域的CH3结构域的C末端附近引入下面的改变也是有用的：
QKTIDRLAGKPTH(SEQ ID NO：8)改变成QKTADRTAGKPTH(SEQ ID NO：9)
IgA-X融合蛋白中的其他去免疫化序列为：
QKTPTRTAGKPTH(SEQ IDNO：10)
QKTPTRPAGKPTH(SEQ IDNO：11)
QKTATRPAGKPTH(SEQ IDNO：12).
对于清蛋白-X融合物，在清蛋白-X表达质粒中引入下面的改变使得清蛋白的C-末端被修饰是有用的：KKLVAASQAALGL(SEQ ID NO：13)改变成KKLVAASQAATTA(SEQID NO：14)
因此，本发明提供对构建较小免疫原性融合蛋白有用的核酸序列和蛋白质.具体地，本发明提供在最后8个氨基酸中具有任何亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸突变的蛋白。此蛋白优选为其序列通常对应于人体中发现的序列的人蛋白。本发明还提供编码此蛋白的核酸序列。本发明此方面的核酸序列可以为质粒、PCR产生的片段、或化学合成产生的核酸的形式。
本发明还提供编码融合蛋白的表达质粒，其中所述融合蛋白的一个或多个N-端融合部分在8个C末端氨基酸中有一个或多个亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸突变成其他氨基酸。
例如，本发明提供编码Fc区按如上所述突变的Fc-IL2或全抗体-IL2融合蛋白的质粒。另外，本发明还提供含有如上所述突变的Fc区域的与促红细胞生成素的正常或突变形式(例如WO01/36489中描述的促红细胞生成素形式)融合的融合物。
本发明还提供通过在融合连接处附近，或优选在融合连接处引入N-连接或O-连接糖基化位点来降低融合蛋白的免疫原性的方法。例如，按如下所述引入氨基酸残基天门冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸及第三残基。可以考虑如下序列，其中X代表N端融合部分的氨基酸而Z代表C-端融合部分的氨基酸。
X1X2X3X4X5X6Z1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8Z9
X1X2X3X4X5N G S Z3Z4Z5Z6Z7Z8Z9
依据本方法，连接肽的结合不一定必须通过引入糖基化位点进行阻断。但是，任何结合在MHC II类沟中的肽如果在最N端锚残基的C端具有糖基化天门冬酰胺，将不具有作为T-细胞表位的功能。巨大的糖基化部分的出现将在空间上阻碍对MHC II类/肽复合物的识别。优选的糖基化位点包括序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，此处X优选为为Gly，但也可以为任意氨基酸。
另外，引入甘氨酸和丝氨酸残基的突变不会产生新的T-细胞表位。甘氨酸和丝氨酸都不能作为锚残基。在抗原加工过程中，原则上融合蛋白在糖基化天门冬酰胺和甘氨酸之间或在甘氨酸和丝氨酸之间断裂。每一种情况下，产物肽都在锚残基N端具有突变的甘氨酸和/或丝氨酸，因此突变的甘氨酸和/或丝氨酸不能被T细胞受体识别，因为锚残基N端的残基处于TCR识别区域之外。
本方法的一个变体中，融合连接区域已经含有丝氨酸或苏氨酸，且其前面为氨基酸残基如甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸等。当连接区域具柔性且被排除在每个融合部分的疏水核心之外的时候优选使用此第二种方法，以使新的N-连接糖基化不影响每个融合部分的折叠或功能。
对蛋白质工程领域内的技术人员来说判断何时引入糖基化位点是可行的是件简单的事。例如，各融合部分或融合部分的近同系物的三维结构可能是已知的。通常，蛋白质的N-末端或C末端几个氨基酸在X射线结构中不能被解析，或在NMR结构中显示出许多可能的构象。当在糖基化位点任何一侧有3个或更多个氨基酸处于无序态时，可在某种程度上确信得到的融合蛋白将能正确折叠而且每个部分都有活性。对于确定是否给定的融合蛋白结构具有功能，有些常规的实验是必需的。
在本发明的优选实施方案中，融合蛋白的N端和C端部分都是人蛋白。在这种融合蛋白中潜在的T细胞表位产生于N端部分(第一蛋白)的最后8个氨基酸和C端部分(第二蛋白)的首8个氨基酸的组合。这提供了一系列8个由第一蛋白和第二蛋白产生的杂合9聚体。在第一蛋白最后8个氨基酸中任何脂肪族的或芳香族的残基(亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)都有产生如下MHC结合肽的高风险性，在此MHC结合肽中此氨基酸位于第一个位置(锚位置)与MHC分子的口袋结合。因此，用非上面提到的任何一个氨基酸，且优选用丙氨酸、脯氨酸或苏氨酸替换上述任一氨基酸，将除去候选T细胞表位。
例如，当Fc融合蛋白含有下面序列时：
ENHYTQKSLSLSPGKKGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No：15)，
亮氨酸残基产生两个潜在表位。因此，可以通过将L变成A和S变成T使序列去免疫化成为：
HNHYTQKSATATPGKGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：16)，
此改变分别去除了在MHC结合口袋中作为首位氨基酸的亮氨酸和在MHC结合口袋中作为首位氨基酸的酪氨酸。
对于人类而言，这些用于去免疫化的替换对所有Fc融合蛋白，不论有无接头序列都可行，并优选在如下时候实施：1)融合蛋白中的两个蛋白都是人蛋白；2)两个蛋白的天然序列中的MHC结合肽可被忽略；以及3)和这些最初序列相同的9聚体也可被忽略。
本发明的方法一般适用于所有的脊椎动物，优选哺乳动物而且最优选人类。本发明通过下面非限定性的实施例作进一步解释。
实施例
实施例1：对huKS-IL2免疫细胞因子中免疫原反应性表位的推导huKS-IL2由人源化的VH和VL区域结合人H链和L链恒定区组成。H链如以前所述在其羧基末端融合人IL-2的成熟序列。此H链是γ1同种型，对Fc受体具有高亲和性。此高亲和性使huKS-IL2从循环中被迅速清除掉。不被理论所束缚，推测huKS-IL2的清除通过肝脏(枯否细胞)和脾脏(抗原提呈细胞)中的FcR-携带细胞进行。
以前已经知道某些患者对huKS-IL2分子的一些部分产生免疫应答，但是，抗体所识别的表位仍未知。为了推导出反应性表位，将患者血清与huKS-IL2的相对反应性与其他相关蛋白作比较：
(1)Hu14.18-IL2，一种具有完全不同的人源化V区但有完全相同的C区和与IL-2的融合连接处的分子。
(2)VH1，在VH和VL区域无T细胞表位的huKS-IL2的去免疫化形式，其源于表面暴露的小鼠B细胞表位被贴面化(veneer)处理为人残基的小鼠V区。
(3)VH2，在CDR3中剩余一个T细胞表位的huKS-IL2的去免疫化形式，其源于表面暴露的小鼠B细胞表位被贴面化处理为人残基的小鼠V区，其中VH含有一个T细胞表位。
(4)用KOL或EU Cγ1区(而不是KS)构建的425-IL2(为了比较同种异型反应性)；
(5)huKS-mIL2，具有融合到小鼠C区和小鼠IL2上的huKSV区的分子；
(6)人Fc-IL2；
(7)仅人Fc；
(8)仅人IL2。
免疫球蛋白融合蛋白和片段通过蛋白A琼脂糖层析纯化，在重碳酸盐缓冲液中包被96孔平板然后用含有1％BSA的1％山羊血清封闭。对患者血清稀释液进行孵育，然后用PBS-吐温三次洗涤，去除不结合的材料。根据结合蛋白采用不同的HRP偶联抗体检测患者血清中的结合的人抗体。通常，使用山羊抗人λ链HRP偶联物，因为大多数与平板结合的蛋白由人Fc和人κ链构成。
某些患者的血清显示出对huKS-IL2清楚的反应性，而这在来自同一患者的注射前血清中没有检测到。使用免疫前抗血清来建立基线非免疫对照。在患者血清中观察到的反应性可归因于(1)抗IL2反应性，(2)抗Fc(同种异型)反应性，(3)对新的连接序列的反应性，或(4)对KS独特型的抗独特型反应性，或这些反应性的组合。
没有对重组IL2或对Fc区(上面的1和2)有显著反应的患者血清。有些患者显示出对KS V区的抗独特型反应性。所有的患者血清都显示有对Fc-IL2的反应性。四名患者中有三名显示对Fc-IL2的反应性。存在针对Fc-IL2的反应性而不存在针对Fc及IL2的反应性的现象提示Fc和IL2之间的连接处被患者的抗血清识别。
实施例2：修饰抗体-细胞因子融合蛋白连接处的氨基酸残基以通过消除MHC II类结合基序来降低免疫原性
肽穿线分析(peptide threading analysis)法在免疫细胞因子的Fc部分和IL2部分之间的连接处鉴定出两个交叠的具有强MHC结合潜力的肽。肽穿线法和潜在的T细胞表位鉴定按Carr(WO00/34317)所公开的进行。引入氨基酸改变以消除已存在的潜在的MHC II类结合表位，但不引入新的潜在的MHC II类表位。
连接序列LSLSPGK-AP(SEQ ID NO：17)修饰成ATATPGA-AP(SEQID NO：18)(“LSLS变成ATAT”)，此处的连字符是指免疫细胞因子huKS-IL2的连接处，此修饰使连接处来源的肽序列不能够与任何人类MHC II类以足够引起免疫原性的高亲合力结合。
实施例3：在免疫细胞因子融合蛋白的连接处对氨基酸残基进行修饰以降低免疫原性
连接序列LSLSPGK-AP(SEQ ID NO：17)修饰成LNLSPGA-AP(SEQID NO：19)(“LSLS变成LNLS”)，此处的连字符是指免疫细胞因子huKS-IL2的连接处，经此修饰后连接处来源的肽序列仍能与某些MHC II类分子结合。但是，当KS-IL2蛋白在哺乳动物细胞中表达并被分泌时，蛋白将因为NXS/T序列而在连接处附近被N-糖基化。
由此得到的连接处来源的肽不能有效地作为T细胞表位，因为当连接处来源的肽通过MHCII类提呈给T细胞时，巨大的N-糖基化部分将阻止T细胞-受体与MHC II类之间的特异性对接(dock)。
实施例4：通过对比以表征抗原提呈细胞对免疫细胞因子huKS-IL2和去免疫化的huKS-IL2免疫细胞因子的免疫反应性
通过LSLS突变成ATAT对反应性表位进行修饰，由此导致的免疫原性的降低按下面所述直接测定。模拟此序列的合成肽改变了经典的抗原提呈细胞如树突细胞(DC)的免疫应答。下面的合成肽
KSLSLSPGK-APTS(SEQ ID NO：20)和
KSATATPGK-APTS(SEQ ID NO：21)，
被用于刺激DC-介导的向自体T细胞的抗原提呈，此处连字符是KS-IL2的连接处。将这些T细胞响应随后此肽抗原攻击而增殖的能力用作此肽的免疫原性的测定结果。
具体地，外周血单核细胞(PBMC)通过标准密度梯度技术从leukopacks中分离。单核细胞被重悬在无血清的Aim V培养基中，使之贴壁。37℃，2h后去除未贴壁的细胞。贴壁细胞在含有人GM-CSF(50ng/ml)和IL-4(20ng/ml)的培养质中培养7天以产生未成熟的树突细胞(DC)。7天以后，收获细胞，用适当的FITC标记的针对MHC I类、MHC II类、CD80和CD40的抗体通过流式细胞计对细胞进行表型分析以确定未成熟的DC表型。
用IL2和IL7培养未贴壁细胞以获得自体效应细胞(T细胞)用于其后的功能研究。为了进行功能研究，将T细胞加入未成熟树突细胞(10:1比率)中并与huKS、去免疫化的huKS、13聚体肽连接处(KSLSLSPGK-APTS)(SEQ ID NO：20)以及经修饰的去免疫化13聚体肽(KSATATPGK-APTS)(SEQ ID NO：21)共同培养。暴露于各免疫细胞因子或免疫原性肽和经修饰去免疫化的肽之后，通过测定掺入的氚化胸苷比较增殖指数，以证明各分子的免疫原性强度。即，放射活性掺入量的增加大致与各肽与DC上的MHC II类分子结合的能力以及被提呈给T细胞的能力成比例。
实施例5：对清蛋白融合蛋白中的免疫原性反应性表位的推导和为了降低免疫原性在融合连接处对氨基酸残基的修饰
人血清清蛋白(HAS)因为具有异常长的半衰期、在体内广泛分布。且没有酶学或免疫学的功能，已被用作治疗性肽/蛋白的载体。遗传工程化的HAS-CD4杂合体已经显示可阻断人类免疫缺陷病毒进入CD4+细胞，同时展示出类似于可溶性CD4的体外抗病毒特性(Yeh等，PNSA 89：1904-1908，1992)。因此，生物活性肽与HSA的遗传融合对于设计和回收分泌的治疗性HSA衍生物是有用的。但是，同所有融合蛋白一样，HAS-CD4具有一个新的连接处，此连接处可能具有免疫原性而且包含能在MHC II类分子上被提呈的T细胞表位。用实施例1，2，3和4中的方法分析HAS和CD4之间的连接处，鉴定具有MHC结合可能性的肽。修饰这些潜在免疫原性序列来降低或消除潜在的T和B细胞表位从而降低免疫原性。类似地，可在连接区引入新的糖基化位点以降低免疫原性。
清蛋白序列       CD4序列
TCFAEEGKKLVAASQAALGL-KKVVLGKKGDTVELTCTAS(SEQ ID NO：22).
据本发明，预计HSA-IFNα融合蛋白连接区域含有3个候选T细胞表位，
KKLVAASQAALGL(SEQ ID NO：13)；
KLVAASQAALGLC(SEQ ID NO：23)；和
LGLCDLPQTHSLG(SEQ ID NO：24).
SEQ ID NO：13和23中所述的T细胞表位相互重叠，并可通过将LV(粗体)改变成除F、I、L、M、V、W和Y以外的任何氨基酸来进行去免疫化。备择地，可通过将LG变成TT而显著地降低肽穿线分值。SEQ IDNO：24中的T细胞表位可通过将第二个L(粗体)变成A来去免疫化。
而且，预计对于HAS-X融合物，此处的X可以为任意蛋白质，可通过将氨基酸序列AALGL(SEQ ID NO：25)改变成TATTA(SEQ ID NO：26)实现融合连接处的去免疫化。
CFAEEGKKLVAASQTATTA(SEQ ID NO：27).
实施例6：X-Fc融合蛋白以及在融合连接处旨在降低免疫原性的氨基酸残基修饰
有时采用X-Fc取向构建融合蛋白具有特别的优越性。在这种结构中，靶蛋白是N端融合蛋白，其后为Fc片段。例如，胰高血糖素样肽(GLP-1)的活性需要游离的N末端，因此GLP-1-Fc融合是有用的。
GLP-1-Fc融合蛋白按照本领域所述的标准技术构建。此融合蛋白具有与γ1重链的铰链连接的GLP-1的C末端。所用的γ1铰链序列含有Cys到Ser的突变(残基5)，这消除了与IgG1轻链形成二硫键的Cys残基(Lo等，(1998)蛋白质工程11：495-500)。未突变的Fc序列是
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：28)
其铰链区域以下划线显示，其后为CH2结构域序列的起始。
GLP-1(7-37)与突变Fc之间的融合连接处是：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG-EPKSSDKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：29).
GLP-1(7-37)与正常Fc之间的融合连接处是：
SYLEGQAAKEFLAWLVKGRG-EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：30)
肽穿线分析在GLP-1-Fc融合连接处鉴定出3个潜在表位。
KEFIAWLVKGRGE(SEQ ID NO：31)
EFIAWLVKGRGEP(SEQ ID NO：32)
AWLVKGRGEPKSS(SEQ ID NO：33).
按实施例1-3进行GLP-1(粗体)和Fc(无加粗)之间的融合连接处的分析，鉴定出具有MHC结合潜力的肽。在通过肽穿线分析进行潜在位点的鉴定之后，通过氨基酸替换修饰这些潜在的免疫原性序列以降低或消除潜在T和B细胞结合表位并降低免疫原性。
上面在SEQ ID NOs：31、32和33中提到的潜在T细胞表位可通过单氨基酸替换进行去免疫化。例如，SEQ ID NO：31所示的肽通过将赖氨酸(加粗显示)改变成苏氨酸以及将精氨酸(加粗显示)改变成苏氨酸进行去免疫化。SEQ ID NO：32所示的肽通过将异亮氨酸(加粗显示)替换成丙氨酸或脯氨酸进行去免疫化，SEQ ID NO：33所示的肽通过用丙氨酸或脯氨酸替换亮氨酸进行去免疫化。得到的去免疫化的连接处为：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFAAWAVTGTG-EPKSSDKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：34).
根据用于在融合连接处引入糖基化位点的典型方法引入下面的变化：
SYLEGQAAKEFIAWLVKGRN-GSKSSDKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：35).
实施例7：TNFR-Fc融合蛋白Enbrel的免疫原性反应性表位的推断及在融合连接处旨在降低免疫原性的氨基酸残基修饰
ENBREL或etanercept是FDA批准的X-Fc融合蛋白，其是用于治疗类风湿性关节炎的一种肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂。ENBREL是一个二聚体融合蛋白，由TNF受体的细胞外配体结合结构域连接人IgG1的Fc蛋白构成。TNFR-Fc竞争性抑制TNF对其受体的结合使得结合的TNF丧失生物学活性，导致炎性活性显著降低。如以上对GLP-1-Fc的描述，TNF-Fc也具有一个含有潜在T细胞表位的新连接处。
当TNF-R的C端部分(粗体)直接融合g1铰链的N端(带下划线的未加粗字母为铰链区)时，两者之间的连接处为
STSFLLPMGPSPPAEGSTGD-EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：36)
按实施例1-4进行TNF-R与Fc之间的连接处的分析，鉴定出具有MHC结合潜力的肽。在通过肽穿线分析进行潜在位点的鉴定之后，通过氨基酸替换修饰潜在的免疫原性序列以降低或消除潜在T和B细胞结合表位并降低免疫原性。
根据用于在融合连接处引入糖基化位点的典型方法引入下面的变化：
STSFLLPMGPSPPAEGSTGN-GSKSCDKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：37).
实施例8：Fc-X-Y融合蛋白如Fc-IL12-IL2的免疫原性反应性表位的推断及在融合连接处旨在降低免疫原性的氨基酸残基修饰
Fc-X-Y取向的融合蛋白如Fc-IL12-IL2具有多个有潜在免疫原性的融合连接处。例如Fc-IL12具有类似其他Fc-X融合蛋白或免疫细胞因子(实施例1)的融合连接处，但是因为细胞因子IL12的使用，此连接处为新的。因此对融合连接处进行免疫原性结合位点的分析和修饰。其次，由两个不同的细胞因子构成的融合蛋白X-Y的融合连接处类似实施例5中的描述。对每个融合连接处作肽穿线分析。
对位于Fc的C末端(加粗)与IL12p35的N末端(未加粗)之间的连接处：
(1)MHEALHNHYTQKSLSLSPGK-RNLPVATPDPGMFPCLHHSQ(SEQ ID NO：38)
以及位于IL12p40的C末端(加粗)与IL2的N末端(未加粗)之间的连接处
(2)RAQDRYYSSSWSEWASVPCS-APTSSSTKKTQLQLEHLLLD(SEQ ID NO：39)
用肽穿线法分析鉴定出具有MHC结合潜力的肽。修饰潜在的免疫原性序列以降低或消除T细胞表位。
例如，在上面的序列(1)中，进行下面的改变：
MHEALHNHYTQKSATATPGK-RNLPVATPDPGMFPCLHHSQ(SEQ ID NO：40).
这些变化降低或消除了位于Fc与IL12的p35亚基的连接处的几个T细胞表位的MHC II类结合潜力。
在另一个实例中，通过在IL2内头两个位置处引入天门冬酰胺和甘氨酸修饰上面的序列(2)，引入糖基化位点.此策略使用了在成熟IL2中第3位的天然苏氨酸。而且，重要的是不打断在p40部分内的二硫键形成，这样用至少一个或两个氨基酸将p40内的半胱氨酸与糖基化位点分隔开是有用的。
RAQDRYYSSSWSEWASVPCS-NGTSSSTKKTQLQLEHLLLD(SEQ ID NO：41).
对于IL12p40-IL2融合，按如上所讨论的引入糖基化位点产生如下潜在的T细胞表位：
SEWASVPCSNGTS(SEQ ID NO：42)
ASVPCSNGTSSST(SEQ ID NO：43)
但是，T细胞表位的糖基化防止了MHC II类结合，由此降低了免疫原性。
实施例9：X-Fc-Y融合蛋白连接处的免疫原性反应性表位的推断及在融合连接处旨在降低MHC II类结合的氨基酸残基修饰
X-Fc-Y构型的融合蛋白，如IL4-Fc-GMCSF具有多个含有潜在T细胞表位的新融合连接处。IL4-Fc具有与其他X-Fc融合蛋白(实施例6和7)类似的连接处，但因为细胞因子IL4的使用其为新的。例如，采用包含源于人γ1的铰链区、CH2和CH3结构域的Fc形式。如上所述，pdCs-huFcγ1中的γ1铰链序列可以含有Cys向Ser的突变(下划线)以消除与IgG1轻链形成二硫键的Cys残基(Lo等，(1998)蛋白质工程11：495-500)，由此产生了用于分析的第三潜在免疫原性融合连接处。依据实施例1-4的方法分析融合连接处的潜在T细胞表位并修饰。
Fc-Y融合连接处与实施例1中对免疫细胞因子huKS-IL2的描述相类似，只是由不同的细胞因子GMCSF构成融合蛋白。此融合连接处也按照实施例1-4的方法进行潜在T细胞表位分析及修饰。
具体地，对位于IL4的C末端(加粗)与Fc的N末端(未加粗)之间的连接处：
(1)ENFLERLKTIMREKYSKCSS-epkscdkthtcppcpapellg(SEQ ID NO：44)
以及位于Fc的C末端(加粗)与GMCSF的N末端(未加粗)之间的连接处
(2)MHEALHNHYTQKSLSLSPGK-parspspstqpwehvnaiqe(SEQ ID NO：45)
用肽穿线法分析鉴定出具有MHC结合潜力的肽。修饰潜在的T细胞表位以减少或消除潜在T细胞表位从而降低免疫原性。
IL4-Fc融合蛋白的连接处的候选T细胞表位是，
EKYSKCSSEPKSC(SEQ ID NO：46)，
此处将E(粗体)改变成T显著地降低了肽穿线分值或MHC II类结合潜力。修饰后IL4-Fc融合序列如下：
ENFLERLKTTMREKYSKCSS-tpkscdkthtcppcpapellg(SEQ ID NO：47).
如下所示，将序列LSLS改变成ATAT使Fc-GMCSF的融合连接处去免疫化。
MHEALHNHYTQKSATATPGK-parspspstqpwehvnaiqe(SEQ ID NO：48).
实施例10：用杂合同种型制备的免疫融合素和免疫细胞因子的融合连接处的氨基酸残基修饰以去除T细胞表位
构建具杂合同种型的抗体或者基于抗体的融合蛋白常常是有用的，这样可将不同同种型的有用特性组合到单个分子中。带有杂合同种型的融合蛋白可根据本发明进行修饰以降低免疫原性。
具有下面组分的抗体融合蛋白可用标准重组DNA技术进行构建：轻链和重链及识别肿瘤特异性抗原的V区，其中轻链是典型轻链，而重链包含源于IgG2的CH1、CH2和CH3结构域和源于IgG1的铰链区，细胞因子通过上述融合连接处融合到重链C末端。
此蛋白含有位于CH1g2与铰链-g1以及铰链-g1与CH2g2之间的新连接处。按下面所述对这些连接处进行潜在的T细胞表位的鉴定和修饰。对于用IgG2或IgG2h同种型制备的免疫细胞因子和Fc-X融合蛋白，这些修饰与上面实施例1，2，3和8中给出的一样。对于X-Fc IgG2h免疫融合素，其也具有相同的新连接处，因为Fc的N木端位于已经修饰成IgG1型的IgG2h蛋白的铰链区内。但是，由IgG1铰链插入IgG2免疫球蛋白中产生两个新的融合连接处，这两个新的连接处位于IgG2 CH1与IgG1铰链之间和IgG1铰链与IgG2 CH2之间。
IgG2 CHI-IgG1铰链-IgG2 CH2-IgG2 CH3-靶蛋白
因此，对位于IgG2 CH1的C末端(加粗)与IgG1铰链的N末端(未加粗)之间的连接处，
qtytcnvdhkpsntkvdktv-epkscdkthtcppcp(SEQ ID NO：49)
以及位于IgG1铰链C末端(加粗)与IgG2 CH2 F的N末端(未加粗)之间的连接处
epkscdkthtcppcp-appvagpsvflfppkpkdtl(SEQ IDNO：50)
通过肽穿线法进行分析，应能鉴定出有MHC结合潜力的肽。对潜在的免疫原性序列进行修饰来降低或消除潜在的T和B细胞表位，以此降低免疫原性。
位于IgG2CH1-IgG1铰链融合连接处的两个潜在的T细胞表位为：
TKVDKTVEPKSCD(SEQ ID NO：51)和KTVEPKSCDKTHT(SEQ ID NO：52).
IgG2CH1-IgG1铰链融合连接处通过将V(加粗)改变成A、T或P而去免疫化。修饰的融合连接处的序列描述在SEQ ID NO：53中。
qtytcnvdhkpsntkadkta-epkscdkthtcppcp(SEQ ID NO：53).
如上所述，pdCs-huFcγ1中的γ1铰链序列可以含有Cys向Ser的突变(下划线)，此突变消除了与IgG1轻链形成二硫键的Cys残基(Lo等，(1998)蛋白质工程11：495-500)，由此产生2个额外的潜在免疫原性融合连接处供分析和修饰：
(3)qtytcnvdhkpsntkvdktv-epksSdkthtcppcp(SEQ ID NO：54)
(4)epksSdkthtcppcp-appvagpsvflfppkpkdtl(SEQ ID NO：55).
实施例11：使用来自IgG1和IgG4的杂合同种型Fc组分制备Fc-EPO融合蛋白
为了制备Fc-促红细胞生成素融合蛋白，用标准分子生物学技术构建了下列的表达质粒。使用含有WO01/36489中公开的人促红细胞生成素编码序列的XmaI-XhoI DNA片段，此编码序列中有导致氨基酸替换His32Gly、Cys33Pro、Trp88Cys以及Pro90Ala的突变。相应的蛋白质序列如SEQ ID NO：56所示。
APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENTTTGCAEGPSLNENTTNPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPCEGLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADSNFTFRKLFRVYLRGKLKLYTGEACRTGDR
将此XmaI-XhoI DNA片段插入编码源于IgG1的铰链区以及源于IgG2的CH2和CH3区的质粒载体中，其中在CH3的C末端区域中有导致氨基酸替换的两组突变，因而在CH3C末端与Epo N末端的连接处的序列为：
....TQKSATATPGA-APPRLI....(SEQ ID NO：57)
第一组突变将IgG2 CH3区中的序列KSLSLSPG(SEQ ID NO：58)变成KSATATPG(SEQ ID NO：59)，其在系列号为60/280,625的U.S.专利申请中公开。以Ala-Thr-Ala-Thr(SEQ ID NO：59中位置3至位置6)替换Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO：58中位置3至位置6)的效果是除去可能因为人Fc与人促红细胞生成素之间的连接处含有非己肽序列而产生的潜在人非己T细胞表位。第二组突变由CH3区C末端氨基酸处的K至A单氨基酸替换组成，其在系列号为09/780,668的U.S.专利申请中公开。
将得到的质粒转染进NS/O细胞，对Fc-Epo融合蛋白按照本领域公知的方法进行表达和纯化。在基于与蛋白质A的结合进行纯化之后，将含有如上所述的IgG2 CH3和促红细胞生成素替换的huFcγ 2h-huEpo蛋白用大小排阻层析进行表征，发现其在两个独立制备物中由97％单体和90％单体组成。含有如上所述的IgG2 CH3以及促红细胞生成素替换的huFcγ2h-huEpo蛋白被发现在基于细胞的实验中在摩尔基础上具有与人促红细胞生成素大约一样的活性，其中所述基于细胞的实验为测定促红细胞生成素蛋白刺激TF-1细胞分裂的能力。实验按照WO01/36489所述进行。
另外，还对非突变的人促红细胞生成素与由IgG1(铰链-CH2-CH3)、IgG2(铰链-CH2-CH3)或IgG1(铰链)-IgG2(CH2-CH3)组成的Fc区的C末端的融合物进行了表征。含有非突变的人Fc序列和非突变的促红细胞生成素序列的表达质粒类似于上述质粒进行构建。NS/O细胞用Fcγ1-Epo，Fcγ2-Epo，以及Fcγ2h-Epo表达质粒进行转染，在对每种质粒进行大致相等克隆数目的筛选之后，分离出稳定的克隆。最佳生产克隆产出50μg/ml的Fcγ1-Ep0，20μg/ml的Fcγ2-Epo，以及120μg/ml的Fcγ2h-Epo。
下面的实施例详细地描述了在本发明公开的融合蛋白的序列中鉴定免疫原性序列区域(T细胞表位)的一种优选方法。但是，应当指出所述的分子可用其他已知的方法获得。
实施例12 计算机方法对T细胞表位的鉴定
依据本发明，融合蛋白连接区域中的表位可通过向蛋白内引入突变以调节它们同免疫系统的相互作用的方法进行修饰。根据本发明，可适用于本发明的本领域内公知的方法包括现有技术中描述的那些(WO92/10755和WO96/40792(Novo Nordisk)，EP 0519 596(M erck & Co.)，EP0699755(Centro de Immuhologia Moelcular)，WO 98/52976和WO98/59244(Biovation Ltd.)或相关方法。
但是，如果所述表位的鉴定是通过以下详细描述的新方法实施的并应用于本发明融合蛋白的连接区域，则可获得有利的突变蛋白。
有多种因素对决定蛋白或多肽的总体结构起重要作用。首先是肽键，即将氨基酸连接在一起形成链的键，它是一种共价键。这种键是平面结构的，实质上是一种取代的酰胺。“酰胺”指含-CONH-基团的一组有机化合物中的任何一个化合物。
连接相邻氨基酸的Cα的平面肽键如下所示：
Figure C02807505D00291
由于O＝C和C-N原子位于一个相对刚性的平面中，所以不会发生沿这些轴的自由旋转。因此，图中虚线所示的平面有时被称作“酰胺”平面或“肽平面”，肽主链中的氧(O)、碳(C)、氮(N)和氢(H)原子位于其中。Cα原子位于酰胺平面中相对的角上。由于肽或酰胺平面中的O＝C和C-N原子基本上不发生旋转，所以多肽链包含一系列连接Cα原子的平面肽键。
第二个对决定多肽或蛋白的整体结构或构象起重要作用的因素是每一酰胺平面绕共有Cα键的转角。此后术语＂转角＂和＂扭转角＂是等同的术语。假定O、C、N和H原子保留在酰胺平面中(这通常是一种正确的假设，尽管在一些构象中这些原子会轻微的偏移平面)，这些转角确定了N和R多肽主链构象，即相邻残基之间的结构。这两个转角称为φ和Ψ。因此，一套φi和Ψi角(其中，脚标i代表多肽链中的特定残基)有效地规定了多肽链的二级结构。在文献中定义了用于确定φ和Ψ角的惯例，即在给定的多肽中酰胺平面形成0度角的参考点，以及哪个角是φ角，哪个角是Ψ角的定义。参见Ramachandran等，Adv.Prot.Chem.23：283-437(1968)，285-94页，这些页中的内容在此引入作为参考。
本发明的方法可应用于任何蛋白，并部分基于下述发现，即人MHCII类分子结合沟的主要口袋1锚定位点对特定氨基酸侧链具有设计好的特异性。这一口袋的特异性由MHC II类分子β链第86位的氨基酸的身份来确定。这一位点位于口袋1的底部并决定可容纳于这一口袋中的氨基酸侧链的大小。Marshall，K.W.，J.Immunol.，152：4946-4956(1994)。如果这一残基是甘氨酸，则所有的疏水性脂肪族和芳香族氨基酸(疏水性脂肪族氨基酸是：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸，芳香族氨基酸是：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)均可容纳于所述的口袋中，优选芳香族侧链。如果这一口袋残基是缬氨酸，则该氨基酸的侧链伸到口袋中并限制了可容纳的肽侧链的大小，所以只有疏水性脂肪族侧链可容纳进去。因此在氨基酸残基序列中，无论哪里发现了带有疏水性脂肪族或芳香族侧链的氨基酸，即有存在MHC II类限制性T-细胞表位的可能性。但是，如果所述的侧链是疏水性脂肪族侧链，其与T-细胞表位相关的可能性约是芳香族侧链的两倍(假定1型口袋近似平均地分布于全球种群中)。
将本发明具体化的计算机方法描绘出肽区域包含T-细胞表位的可能性，该方法如下：(1)扫描预定长度肽片段的一级序列，并鉴定存在的所有疏水性脂肪族和芳香族侧链。(2)对疏水性脂肪族侧链赋予比芳香族侧链高的值；优选约两倍于赋予芳香族侧链的值，例如，给疏水性脂肪族侧链赋值为2，给芳香族侧链赋值为1。(3)将所述肽中的预定统一长度的每一重叠氨基酸残基片段(窗口)中确定存在的值总和起来，再将某一特定片段(窗口)的总值赋予该片段(窗口)中间位置的某个单个氨基酸残基，优选赋予大约处于抽样片段(窗口)中间点的氨基酸。将这一过程对每一抽样的重叠氨基酸残基片段(窗口)重复进行。因此，所述肽的每一氨基酸残基均被赋予了一个值，该值与T-细胞表位存在于此特定片段(窗口)中的可能性相关。(4)用按照上述步骤3中的描述计算、赋予的值对被评估的整个氨基酸残基序列的氨基酸坐标作图。(5)序列中具有预定值(例如该值为1)的所有部分均被认为可能包含T细胞表位，并且在需要时可进行修饰。在这一方面本发明提供了通用的方法，由此可描述可能包含T-细胞表位的肽区域。在这些区域中对所述的肽进行修饰有可能改变MHC II类的结合特性。
依照本发明的另一方面，可利用考虑了肽与MHC II等位基因模型之间的相互作用的更复杂计算方法来更精确地预测T-细胞表位。根据这一方面，对肽中存在的T细胞表位的计算预测考虑到：基于所有已知MHCII类分子的结构构建至少42个MHC II类等位基因模型；使用这些模型计算鉴定T细胞表位的方法；对每一模型构建肽主链文库以允许在相关肽主链α碳(Cα)位置具有已知的变异性；在肽和MHC II类分子间相互作用关键的位置处，对与每一模型对接(dock)的每一主链，相对于20种氨基酸选项中每一种构建氨基酸侧链构象文库；以及将这些主链和侧链构象文库与评分函数结合用于选择与特定MHC II类分子对接的特定肽的最佳主链和侧链构象并得出该相互作用的结合分值。
MHC II类分子模型可从Brookhaven蛋白数据库(＂PDB＂)中的许多类似的结构出发通过同源建模推导得出。它们可通过使用引入了模拟退火算法的半自动同源建模软件(Modeller，Sali A.&Blundell TL.，1993.J.Mol Biol 234：779-815)并结合用于能量最小化的CHARMm力场(购自Molecular Simulations Inc.，San Diego，Ca.)来制备。也可以应用其他的建模方法。
本发明的方法与下述的其他计算方法有着显著的不同，这些方法在于：利用从实验中得来的关于一小组MHC II类分子结合沟中每一位点的每一种氨基酸选项的结合数据文库(Marshall，K.W.等，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids，1(3)：157-162)(1995)；或利用类似的实验结合数据以定义所述的沟中特定结合口袋类型的结合特性(同样利用相对小的MHC II类分子亚组)然后将这一口袋文库中的口袋类型进行‘混合和匹配’以人工构建更“实际的”MHC II类分子(Sturniolo T.等，Nat.Biotech，17(6)：555-561(1999)。这两种现有方法的主要缺陷在于实验的复杂性和需要合成大量的肽变体造成仅有少量的MHC II类分子可通过实验扫描。因此第一种已知的方法仅能预测少量的MHC II类分子。第二种已知的方法还假设在不同II类等位基因的背景下在一个分子中衬有类似氨基酸的口袋将具有相同的结合特性，故其另外的缺陷在于，仅仅可“实际地”地构建出那些包含口袋文库中所包含的口袋的MHC II类分子。利用本发明的建模方法可推导出任意数量和类型的MHC II类分子的结构，因此可特异性地选择等位基因以代表全球种群的特征。此外，扫描的MHC II类分子的数量可通过构建更多的模型而增加而无需通过复杂的实验获得额外的数据。利用主链文库使得被扫描的各种肽在与特定的MHC II类分子结合时其Cα原子位置处可进行变化。这也与上述现有技术中的计算机方法不同，在那些方法中依赖于利用简化的肽主链来扫描结合在特定口袋中的氨基酸。这些简化的主链不可能代表在“真正的”肽中存在的主链构象，从而导致对肽结合的预测不准确。本发明的主链文库是通过叠加蛋白数据库中所有与MHC II类分子结合的肽的主链，并考虑到位于结合沟内的11个氨基酸的每个氨基酸的Cα原子之间的均方根(RMS)差而构建的。尽管该文库可来自少量合适的可获得的小鼠和人的结构(当前为13种)，但为了允许存在甚至更大变异的可能性，将每一C＂-α位点的RMS数提高50％。然后确定每一氨基酸的平均Cα位置，围绕这一点划一个球，其半径等于在该位置的RMS差加50％。该球体代表所有可允许的Cα位置。
自具有最小RMS差的Cα(上述口袋1中氨基酸残基的Cα，等同于结合沟中11个残基的位置2)起运作，将所述的球三维网格化，网格内的每个顶点作为该氨基酸的Cα的可能位置。将后续的酰胺平面(相应于与后续氨基酸的肽键)移动到这些Cα的每一个上面，将φ和Ψ角以设定的间隔逐步地转动以便于安置后续的Cα。如果后续的Cα落入对这一Cα而言‘可被允许的位置球’中，则此二肽的方向即可被接受，如果其落入所述球之外则所得的二肽不能被接受。对每一后续Cα位置均重复这一过程，使肽从所述的口袋1Cα‘种子’开始生长，直到全部9个后续的Cα的位置均根据之前Cα的所有可能排列确定下来。然后对口袋1前的单个Cα重复上述步骤1次以上以构建定位于结合沟内的主链Cα位置文库。
生成的主链数目取决于几种因素：‘可被允许的位置球’的大小；对口袋1位点处′最初的球′网格化的细度；用于定位后续Cα的φ和Ψ角逐步旋转的细度。利用这一程序可以构建大的主链文库。主链文库越大越可能发现对MHC II类分子结合沟内的特定肽而言的最适主链。鉴于和结合结构域的氨基酸可能存在冲突，所以不是所有的主链均适合于与所有MHC II类分子模型‘对接’(docking)，故对每个等位基因建立亚文库以包含适合被该等位基因容纳的主链。利用所述的主链文库并结合MHC II类分子模型可以构建出由与每一容许主链对接的每一MHC II类分子结合沟的每一位点中的每一氨基酸的容许侧链构象所组成的详尽数据库。可以利用简单的立体重叠函数构建这一数据组，其中，主链与MHC II类分子对接，氨基酸侧链在所需位置被嫁接到主链上。将侧链上可旋转的键以设定的间隔逐步旋转，记录下依赖于该键的原子的最终定位。将所述原子与结合沟侧链原子间的相互作用记录下来，根据下述的标准确定是否接受这些位置：如此定位的所有原子的重叠总量不能超过预定值。因此，构象搜索的严谨度是在键的逐步旋转中所用的间隔及对总重叠的预定限度的函数。如果已知特定的口袋是刚性的，则后一值可较小，但若已知口袋侧链的位置相对灵活则严谨度可放松。这样便可以模拟结合沟口袋内灵活性的变化。针对与每一MHC II类分子对接后每一主链的所有位点上的所有氨基酸重复这种构象搜索以建立详尽的侧链构象数据库。
用适当的数学表达式评价MHCII类分子模型与肽配体构象的结合能量，所述的肽配体构象需通过扫描上述的主链/侧链构象大数据库根据经验获得。这样，通过对每一长度在9-20个氨基酸范围内变化(尽管对于每一次扫描长度是一定的)的可能肽进行下述计算，可以扫描蛋白以搜索潜在的T-细胞表位：选择MHC II类分子及适合于该分子的肽主链，将相应于所需肽序列的侧链移植到其上。对于氨基酸的每一容许构象(由上述数据库获得)，收集与主链上特定位点的特定侧链相关的原子身份和原子间距数据。沿主链对每一侧链重复此过程，利用评分函数推导肽得分。保留该主链的最佳得分，对所选模型的每一容许主链重复该过程。比较所有容许主链的得分，最高的得分被认为是该MHC II类模型中所需肽的得分。对每一模型用从扫描的蛋白得到的所有可能肽重复上述过程，列出肽相对于模型的得分。
在本发明中，用于结合亲和力计算的每种配体都是选自上述肽或蛋白的氨基酸片段。因此所述配体为来自已知序列的肽、多肽或蛋白的长度为约9到20个氨基酸的选定氨基酸链。此后术语“氨基酸”和“残基”视为等同的术语。将移植到选自上述主链文库的主链上的待检测肽中的连续氨基酸形式的配体，通过肽主链上C＂-α原子坐标定位到来自MHC II类分子模型库的MHC II类分子的结合裂缝中，并从容许构象的数据库中选择每一侧链的容许构象。相关的原子身份和原子间距也可以从这一数据库获得并用于计算肽结合分数。将对MHC II类结合口袋具有高亲和力的配体作为侯选者标记出来用于定点诱变。在标记的配体中(也由此在目的蛋白中)进行氨基酸替代，然后用评分函数重新测定以确定使结合亲和力降低到预定的阈值以下的变化。这些变化即可引入到目的蛋白中以去除T-细胞表位。
肽配体与MHC II类分子结合沟的结合涉及非共价键相互作用，其包括但不限于：氢键、静电相互作用、疏水(亲脂)相互作用和范德华相互作用。它们被包括在下面将详细描述的肽评分函数中。应当理解，氢键是非共价键，其可在极性或带电的基团之间形成，由被两个其他原子共享的氢原子构成。氢供体中的氢带正电荷，而氢受体带有部分负电荷。为肽/蛋白相互作用的目的，氢键供体可以是连接氢的氮，或连接在氧或氮上的氢。氢键受体原子可以是没有连接氢的氧、没有连接氢并具有一或两个连接的氮或仅有一个连接的硫。某些原子，如连接了氢的氧或亚胺氮(如C＝NH)，既可以是氢受体也可以是氢供体。氢键的能量在3-7Kcal/mol，大大强于范德化键，但弱于共价键。氢键具有高度的方向性，且当供体原子、氢原子和受体原子共线时最强。静电键是在带有相反电荷的离子对间形成的，根据库仑定律这种相互作用的强度与原子间距离的平方成反比。离子对间的最佳距离是约2.8
Figure C02807505D0035105643QIETU
。在肽/蛋白相互作用中，可在精氨酸、组氨酸或赖氨酸和天冬氨酸或谷氨酸之间形成静电键。该键的强度依赖于电离基团的pKa和介质的介电常数，尽管其与氢键的强度类似。
亲脂相互作用是蛋白和肽配体之间发生的有利疏水-疏水相互作用。这种相互作用通常出现在埋于结合沟口袋中的肽的疏水性氨基酸侧链间，以使它们不暴露在溶剂中。将疏水残基暴露于溶剂中是非常不利的，因为周围的溶剂分子将被迫在彼此间形成氢键而形成笼状结构。所致的熵值降低是非常不利的。亲脂性原子可以是既非极性又不是氢受体的硫和非极性的碳原子。
范德华键是相距的原子间的非特异性的力。它比氢键和静电键弱、特异性低.原子周围的电荷分布随时间变化，并且在任何瞬间电荷分布均是不对称的。这种瞬间的电荷不对称性诱导临近原子中的类似不对称性。在范德华接触距离中所导致的原子之间的吸引力达到最大，而在约1
Figure C02807505D0035105643QIETU
到2
Figure C02807505D0035105643QIETU
处迅速消失。相反，当原子间隔的距离小于此接触距离时，由于原子外部的电子云重叠使不断增强的斥力成为主导。尽管与静电和氢键相比，此吸引力相对较弱(约0.6Kcal/mol)，但所述斥力对于决定肽配体是否能与蛋白成功结合可能非常重要。
在一个实施方案中，利用
Figure C02807505D0035142224QIETU
评分函数(SCORE1方法)评估结合常数(
Figure C02807505D0035142224QIETU
，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8(3)：243-256(1994)，该文献在此全文引入作为参考)。在另一个实施方案中，用评分函数(SCORE2方法)评估结合亲和力作为配体含有T-细胞表位的指示物(
Figure C02807505D0035142224QIETU
，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，12(4)：309-323(1998)，该文献在此全文引入作为参考)。但是上述文献中描述的
Figure C02807505D0035142224QIETU
评分函数是用于评估下述情况中配体对蛋白的结合亲和力的，即已知所述的配体可成功地与所述蛋白结合，且蛋白/配体复合物的结构已解析，这一结构已列于蛋白数据库(＂PDB＂)中。因此，利用已知的阳性结合数据对评分函数作了发展。为了区分阳性和阴性的结合体，需向方程中加入排斥项。此外，可通过以成对的方式计算亲脂相互作用，而非利用上述
Figure C02807505D0035142224QIETU
函数中基于面积的能量项来进行更理想的结合能量评估。因此，在一个优选实施方案中，用经修饰的B
Figure C02807505D0035105808QIETU
hm评分函数评估结合能。在经修饰的
Figure C02807505D0035142224QIETU
评分函数中，在评估蛋白和配体之间的结合能(ΔGbind)时考虑了下述参数：由于配体的平移和转动熵的整体损失造成的结合能减低(ΔG0)；理想氢键的贡献(ΔGhb)，其中至少一个配对物是中性的；无扰离子相互作用的贡献(ΔGionic)；亲脂配体原子和亲脂受体原子之间的亲脂相互作用(ΔGlipo)；由于配体中内在自由度的冻结，即绕每一C-C键的旋转自由度降低而造成的结合能损失(ΔGrot)；蛋白和配体之间相互作用的能量(EVdW)。考虑到这些项给出等式1：
(ΔGbind)＝(ΔG0)+(ΔGhb×Nhb)+(ΔGionic×Nionic)+(ΔGlipo×Nlipo)+(ΔGrot+Nrot)+(EvdW)
其中N是对于特定项符合的相互作用的数目，在一个实施方案中，ΔG0、ΔGhb、ΔGionic、ΔGlipo和ΔGrot是常数，其值分别为：5.4、-4.7、-4.7、-0.17和1.4。
Nhb项依照等式2计算：
Nhb＝∑h-bondf(ΔR，Δα)×f(Nneighb)×fpcs
f(ΔR，Δα)是罚函数，其解决氢键自理想情况的巨大偏离，其依照等式3计算：
f(ΔR，Δ-α)＝f1(ΔR)×f2(Δα)
其中：
如果ΔR<＝TOL             则f1(ΔR)＝1，或者
如果ΔR<＝0.4+TOL         则f1(ΔR)＝1-(ΔR-TOL)/0.4，
                   或者
如果ΔR>0.4+TOL          则f1(ΔR)＝0
并且：
如果Δα<30°          则f2(Δα)＝1，或者
如果Δα<＝80°        则f2(Δα)＝1-(Δα-30)/50，或者
如果Δα>80°          则f2(Δα)＝0
TOL是氢键键长中所能允许的偏差＝0.25
Figure C02807505D0037110318QIETU
ΔR是H-O/N氢键键长与理想值＝1.9
Figure C02807505D0037110318QIETU
的偏差
Δα是氢键键角∠N/O-H..O/N与180°理想值的偏差
f(Nneighb)区分蛋白表面的凹凸部分，并因此赋予口袋中的极性相互作用比蛋白表面的极性相互作用更高的权重。这一函数根据下述等式4计算：
f(Nneighb)＝(Nneighb/Nneighb，0)α，其中α＝0.5
Nneighb为蛋白中与任意给定蛋白原子之间的距离小于5
Figure C02807505D0037110318QIETU
的非氢原子的数量。
Nneighb，0是常数＝25
fpcs是考虑到每氢键的极性接触表面面积的函数，由此可以区分强和弱的氢键，其值由下述的标准确定：
当时   fpcs＝β或
当
Figure C02807505D0037142529QIETU
时   fpcs＝1
Apolar是极性蛋白-配体接触面的大小
NHB是氢键的数目
β是常数＝1.2
由于假定了相同的几何相关性，在实施经修饰的
Figure C02807505D0037142547QIETU
评分函数时，离子相互作用的贡献ΔGionic用与上述有关氢键的类似方式计算。
Nlipo项按下述的等式5计算：
Nlipo＝∑ILf(rIL)
根据下述标准，对于所有亲脂配体原子l和所有亲脂蛋白原子L，计算f(rlL)：
当rlL<＝R1时             f(rlL)＝1
当R2<rlL>R1时        f(rlL)＝(rlL-R1)/(R2-R1)
当rIL>＝R2时         f(rlL)＝0
其中：RI＝rl vdw+rL vdw+0.5
R2＝R1+3.0
rl vdw是原子l的范德华半径
rL vdw是原子L的范德华半径
Nrot项是氨基酸侧链中可旋转的键的数目，其被视为无环的sp3-sp3及sp3-sp2键的数目。末端-CH3或-NH3的旋转未考虑进去。
最终，项Evdw依照如下等式6计算：
Evdw＝ε1ε2((r1 vdw+r2 vdw)12/r12-(r1 vdw+r2 vdw)6/r6)，
其中：ε1和ε2是取决于原子身份的常数
r1 vdw+r2 vdw是范德华原子半径
r是原子对间的距离。
关于式6，在一个实施方案中，ε1和ε2常数被赋予如下原子值，分别为：C：0.245，N：0.283，O：0.316，S：0.316(即分别对于碳、氮、氧和硫原子)。对于式5和6，给予范德华半径如下原子值，分别为C：1.85，N：1.75，O：1.60，S：2.00
Figure C02807505D0038111253QIETU
。
应当理解上述等式中所有预定的值和给定的常数都是在现有的对蛋白配体相互作用的理解局限内具体相对于此处所用的计算类型确定的。因此，随着这种评分函数的进一步精练，这些值和常数也会因此而改变，任何能在蛋白和配体结合能的评估方面给出所需结果的适宜数值均可使用，而且，其也落入本发明的保护范围内。
如上所述，所述的评分函数应用于由上述侧链构象、原子身份和原子间距数据库中提取的数据。为本说明书的目的，该数据库中包含的MHC II类分子数是42个模型加上4个已解析的结构。从上述描述中可清楚地了解到，本发明的计算构建方法的模块性质意味着，可简单地添加新的模型，并利用肽主链文库和侧链构象搜索功能进行扫描以创建其它的可通过上述的肽评分函数处理的数据集。这使得被扫描的MHC II类分子库可以很容易地增加，或者如果可以获得相关数据，则可以替换结构和相关数据以创建现有等位基因的更精确的模型。
本发明的预测方法可以相对于包含大量已通过实验确定了其对不同MHC II类分子的亲和力的肽的数据集进行校准。将计算值与实验数据相比较，可确定一截断值，已知该值之上所有经实验确定的T-细胞表位都得以正确的预测。
应当理解，尽管上述评分函数与现有的一些复杂方法相比相对简单，但计算进行得非常迅速。还应当理解的是，其目的并不在于计算出对接到所选择的MHC II类蛋白结合沟内的每种肽的真正结合能本身。根本的目的在于获得相对的结合能数据以助于根据所选蛋白的一级结构(即氨基酸序列)预测T-细胞表位的定位。相对高的结合能或结合能高于选定的阈值意味着在配体中存在T-细胞表位。然后可以将所述配体进行至少一轮氨基酸替代，并再次计算结合能。由于计算可迅速进行，对肽序列的这些操作可在现有成本划算的计算机硬件上于程序用户界面中互动进行。由此不需要对计算机硬件进行大量投资。
本领域的技术人员应当了解，也可使用其他软件达到相同的目的。特别是可以使用能将配体对接入蛋白结合位点的更复杂的软件，并与能量最小化相结合。对接软件的例子包括：DOCK(Kuntz等，J.Mol.Biol.，161：269-288(1982))，LUDI(
Figure C02807505D0039142746QIETU
H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8：623-632(1994))和FLEXX(Rarey M.等，ISMB，3：300-308(1995))。分子建模和操作软件的例子包括：AMBER(Tripos)和CHARMm(Molecular Simulations Inc.)。使用这些计算方法将严重限制本发明方法的信息吞吐量，这是由于进行必要的计算所需的处理时间导致的。但是可行的方式为，将这些方法作为‘二级筛选’以获得关于通过本发明的方法发现为‘阳性结合体’的肽的更精确的肽结合能计算值。用于复杂的分子机械或分子动力学计算的处理时间的限制性是由进行所述计算的软件设计和目前计算机硬件技术的限制共同确定的。可以预期在将来，随着编写更高效的代码和计算机处理器速度的不断提高，在更易控制的时间框架内进行上述计算是可行的。有关用于大分子的能量函数的其他信息和有关在折叠蛋白结构内发生的多种相互作用的考虑可参考下述文献：Brooks，B.R.，等.，J.Comput.Chem.，4：187-217(1983)，有关蛋白-配体一般相互作用的信息参见：Dauber-Osguthorpe等，Proteins 4(1)：31-47(1988)，这些文献均全文引入作为参考。其他有用的背景资料也可参见Fasman，G.D.编，Prediction of ProteinStructure and the Principles of Protein Conformation，Plenum Press，New York，ISBN：0-306 4313-9。
等同方案
本发明可以以没有偏离其精神或基本特征的其他特殊形式体现。因此前面的实施方案无论从哪一方面来看都只是举例说明而非对此处描述的本发明的限定。因此本发明由所附权利要求而非前面的描述指示范围，而且所有落入权利要求的等同含义和范围内的变化均被包含于其中。
参考文献的并入
上面提到的所有专利、专利申请和科学出版物均以参考文献的形式完整地在此并入本申请。
序列表
<110>默克专利有限公司
<120>降低融合蛋白的免疫原性
<130>LEX-017PC
<150>US 60/280,625
<151>2001-03-30
<160>59
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>330
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<223>人Igγ重链C区
<400>1
Figure C02807505D00411
<210>2
<211>326
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>misc_feature.
<223>人Igγ-2链C区
<400>2
Figure C02807505D00422
Figure C02807505D00431
<210>3
<211<362
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>人Ig3恒定区
<400>3
Figure C02807505D00432
Figure C02807505D00441
Figure C02807505D00451
<210>4
<211>327
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>Igγ-4链C区
<400>4
Figure C02807505D00452
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>潜在T细胞表位
<400>5
Figure C02807505D00462
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变的潜在T细胞表位
<400>6
Figure C02807505D00463
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变的潜在T细胞表位
<400>7
Figure C02807505D00471
<210>8
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IgA Fc区CH3结构域的C末端附近序列
<400>8
Figure C02807505D00472
<210>9
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变的IgA Fc区CH3结构域的C末端附近序列
<400>9
Figure C02807505D00473
<210>10
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IgA-x融合物中的去免疫化序列
<400>10
<210>11
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IgA-x融合物中的去免疫化序列
<400>11
<210>12
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IgA-x融合物中的去免疫化序列
<400>12
Figure C02807505D00481
<210>13
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HSA-IFNα连接处中的潜在T细胞表位
<400>13
Figure C02807505D00482
<210>14
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的清蛋白C末端
<400>14
Figure C02807505D00483
<210>15
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Fc融合蛋白中的序列
<400>15
Figure C02807505D00484
<210>16
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的Fc融合蛋白中的序列
<400>16
Figure C02807505D00485
Figure C02807505D00491
<210>17
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>连接处序列
<400>17
Figure C02807505D00492
<210>18
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的连接处序列
<400>18
<210>19
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的连接处序列
<400>19
<210>20
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有反应性表位的合成肽
<400>20
Figure C02807505D00495
<210>21
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有反应性表位的修饰合成肽
<400>21
Figure C02807505D00501
<210>22
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>清蛋白-CD4连接处序列
<400>22
Figure C02807505D00502
<210>23
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HSA-IFNα融合物中的潜在T细胞表位
<400>23
Figure C02807505D00503
<210>24
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HSA-IFNα融合物中的潜在T细胞表位
<400>24
Figure C02807505D00504
<210>25
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>清蛋白C末端序列
<400>25
Figure C02807505D00511
<210>26
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变的清蛋白C末端序列
<400>26
Figure C02807505D00512
<210>27
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的清蛋白连接区
<400>27
Figure C02807505D00513
<210>28
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>非突变Fc序列
<400>28
<210>29
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>GLP-1-突变Fc融合连接处
<400>29
Figure C02807505D00521
<210>30
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>GLP-1-正常Fc融合连接处
<400>30
Figure C02807505D00522
<210>31
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>GLP-1-Fc融合处的潜在T细胞表位
<400>31
Figure C02807505D00523
<210>32
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>GLP-1-Fc融合连接处的潜在T细胞表位
<400>32
Figure C02807505D00524
<210>33
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>GLP-1-Fc融合连接处的潜在T细胞表位
<400>33
<210>34
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>去免疫化的GLP-1-Fc融合连接处
<400>34
<210>35
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>具有糖基化位点的GLP-1-Fc融合连接处
<400>35
<210>36
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>TNF-R-γ-1融合连接处
<400>36
<210>37
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>TNF-R-Fc融合连接处
<400>37
Figure C02807505D00542
<210>38
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Fc-IL12p35融合连接处
<400>38
Figure C02807505D00543
<210>39
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IL-12p40-IL2融合连接处
<400>39
<210>40
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的Fc-IL12p35融合连接处
<400>40
<210>41
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的IL12p40-IL2融合连接处
<400>41
<210>42
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IL12p40-IL融合物中的潜在T细胞表位
<400>42
Figure C02807505D00554
<210>43
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IL12p40-IL2融合连接处中的潜在T细胞表位
<400>43
<210>44
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IL4-Fc融合连接处
<400>44
Figure C02807505D00562
<210>45
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Fc-GMCSF融合连接处
<400>45
Figure C02807505D00563
<210>46
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IL4-Fc融合连接处的潜在T-细胞表位
<400>46
Figure C02807505D00571
<210>47
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的IL4-Fc融合物
<400>47
Figure C02807505D00572
<210>48
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>去免疫化的Fc-GMCSF融合连接处
<400>48
Figure C02807505D00573
<210>49
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IgG2CH1-IgG1铰链融合连接处
<400>49
Figure C02807505D00574
<210>50
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IgG1铰链-IgG2CH2融合连接处
<400>50
Figure C02807505D00581
<210>51
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IgG2CH1-IgG1铰链融合连接处中的潜在T细胞表位
<400>51
Figure C02807505D00582
<210>52
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IgG2CH1-IgG1铰链融合连接处中的潜在T细胞表位
<400>52
<210>53
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的IgG2CH1-IgG1铰链融合连接处
<400>53
Figure C02807505D00591
<210>54
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的IgG2CH1-IgG1铰链融合连接处
<400>54
Figure C02807505D00592
<210>55
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的IgG1铰链-IgG2CH2融合连接处
<400>55
Figure C02807505D00593
<210>56
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变EPO序列
<400>56
Figure C02807505D00594
Figure C02807505D00601
<210>57
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CH3-EPO融合连接处
<400>57
Figure C02807505D00602
<210>58
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IgG2CH3序列
<400>58
Figure C02807505D00603
<210>59
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的IgG2CH3序列
<400>59
Figure C02807505D00611

Claims (3)

1.具有降低的免疫原性的融合蛋白，其包含IgG分子或其片段，该IgG分子或其片段在其C端通过融合连接处与第二蛋白的N端融合；
该融合蛋白的特征在于：通过对包括融合连接处两侧各1到8个氨基酸的候选T细胞表位进行修饰以降低该候选T细胞表位与T细胞受体相互作用的能力，所述修饰为将IgG序列C端的候选T细胞表位SEQ ID NO：5中的氨基酸序列LSLS改变成ATAT；或者，
该融合蛋白的特征在于：融合连接处包含N-连接的或O-连接的糖基化位点。
2.权利要求1的融合蛋白，其中融合连接处包含间隔区或接头。
3.权利要求1或2-的融合蛋白，其中IgG分子片段是Fc片段。
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