[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

DK173067B1 - Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa - Google Patents

Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa Download PDF

Info

Publication number
DK173067B1
DK173067B1 DK198703093A DK309387A DK173067B1 DK 173067 B1 DK173067 B1 DK 173067B1 DK 198703093 A DK198703093 A DK 198703093A DK 309387 A DK309387 A DK 309387A DK 173067 B1 DK173067 B1 DK 173067B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
cells
erythropoietin
cell line
dna
rna
Prior art date
Application number
DK198703093A
Other languages
English (en)
Other versions
DK309387A (da
DK309387D0 (da
Inventor
Jerry S Powell
Original Assignee
Univ Washington
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25374134&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DK173067(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ Washington filed Critical Univ Washington
Publication of DK309387D0 publication Critical patent/DK309387D0/da
Publication of DK309387A publication Critical patent/DK309387A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK173067B1 publication Critical patent/DK173067B1/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2795/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

DK 173067 Bt i
Den foreliggende opfindelse angår ekspression i høje niveauer af biologisk aktivt humant erythropoietin fra stabilt transficerede celler.
Sirligt angår opfindelsen et i alt væsentligt rent, rekombinant DNA eller RNA bestående af en nukleotidsekvens svarende til Apa I-restrik-5 tionsfragmentet på 2426 bp af et humant erythropoietingen samt en cellelinie omfattende det pågældende DNA eller RNA ifølge opfindelsen operativt bundet til en anden nukleotidsekvens, der er i stand til at fremkalde ekspression deraf.
Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til ekspression af re-10 kombinant, biologisk aktivt humant erythropoietin omfattende de trin, at man transficerer en værtscellelinie med DNA, RNA eller en nukleotidsekvens bestående af Apa I-restriktionsfragmentet af et humant erythropoietingen, operativt bundet til en anden nukleinsyresekvens, der er i stand til at fremkalde ekspression deraf, bringer de transficerede 15 celler i kontakt med et dyrkningsmedium og ved ekspression lader cellerne producere erythropoietin, og udvinder det producerede erythropoietin.
Opfindelsen angår yderligere en fremgangsmåde til ekspression af rekombinant, biologisk aktivt humant erythropoietin fra en cellelinie, der er i kontakt med et inkubationsmedium, omfattende.de trin, at man 20 Inkorporerer en cellelinie, der er i stand til at give et udbytte af erythropoietin 1 inkubationsmediet, hvilken cellelinie er produceret ved transficering af en værtscelle!inie med DNA, RNA eller nukleotidsekven-ser bestående af Apa I-restriktionsfragmentet af et humant erythropoietingen, operativt bundet til en anden nukleinsyresekvens, der er i stand 25 til at fremkalde ekspression deraf.
Endvidere angår opfindelsen hidtil ukendt humant erythropoietin, som er produceret ved ekspression 1 en cellelinie ifølge opfindelsen eller ved en fremgangsmåde Ifølge opfindelsen.
Det har overraskende og uventet vist sig, at biologisk aktivt hu-30 mant erythropoietin ifølge den foreliggende opfindelse har en højere specifik aktivitet samt en række andre egenskaber, der væsentligt adskiller erythropoietin ifølge den foreliggende opfindelse fra erythropoietin ifølge den kendte teknik. Erythropoietin ifølge den foreliggende opfindelse har en ændret glykosyleringsprofil i forhold til erythropoie-35 tin ifølge den kendte teknik. Den ændrede glykosyleringsprofil opstår sandsynligvis som følge af en sekventiel foldning in vivo af erythropoietin ifølge opfindelsen, som er forskellig fra den opfoldning, der karakteriserer erythropoietin ifølge den kendte teknik. Den ændrede opfoldning af erythropoietin Ifølge opfindelsen bevirker, at dette DK 173067 B1 2 erythropoietin foreligger i flere forskellige isoformer, typisk fra fire til syv, hvilke isoformer reflekterer både forskellige grader af glyco-sylering og typen af den pågældende form for glykosylering, særligt sia-linering af tilgængelige steder i erythropoietinet.
5 Erythropoietin ifølge den foreliggende opfindelse har et O-forbun det oligosaccharidindhold, som er væsentligt mindre end ét mol per mol erythropoietin, samt en specifik biologisk aktivitet, som er væsentligt højere en den specifikke biologiske aktivitet, som kendetegner erythropoietin ifølge den kendte teknik, som er beskrevet i WO 85/02610 og WO 10 86/03520.
Hormonet erythropoietin spiller en vigtig rolle ved regulering af erythropoiesis, dannelsen af røde blodlegemer, og mangel på erythropoietin resulterer i anæmi. Detaljerede undersøgelser af hormonet og forsøg på erstatningsterapi har været vanskelige på grund af knapheden på ren-15 set materiale.
Normal produktion af humane røde blodlegemer kræver sekretion af erythropoietin fra nyrerne, tilsyneladende som udviklet glycoprotein.
Under ligevægt cirkulerer dette hormon i blodet i en koncentration på 10-18 millienheder (128-230 picog) pr. ml, og ved stimulering 1 form af 20 alvorlig vævshypoxia (oxygenmangel) kan niveauet stige så meget som 1000 gange. Det forøgede hormonniveau udløser proliferation og differentiering af en population af receptive stammeceller i knoglemarven, stimulerer hæmoglubinsyntese i under udvikling værende erythroidceller, og fremskynder frigivelse af røde blodlegemer fra marven til kredsløbet, 25 hvorved mængden af røde blodlegemer forøges og de hypotoksiske tilstande forbedres. Patienter med mangel på erythropoietin, f.eks. patienter med kronisk nyresvigt, lider ofte af alvorlig anæmi.
Eryhtropoietin er et 34-38 kd glycoprotein, hvor ca. 40% af dets molekylvægt udgøres af carbonhydrat.Der kræves mindst én disulfidbro af 30 mængden til aktiviteten. Der kendes kun lidt til strukturen af dette hormon og detaljerne ved syntesen deraf er ikke helt forstået. Nylig isolering af cDNA og genome kloner giver mulighed for at analysere kontrollen med erythropoletinproduktion, men ekspression af biologisk aktivt humant erythropoietin i tilstrækkelige mængder til erstatningstera-35 pi er endnu ikke blevet opnået.
I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse kan biologisk aktivt humant erythropoietin ved ekspression produceres i høje koncen- DK 173067 B1 3 trationer (med nominelle titere, der overstiger 2 millioner enheder pr. liter supernatant) ud fra stabilt transficerede cellelinier fra pattedyr. Således tilvejebringes en rig kilde for renset humant erythropoietin til kliniske anvendelser. Overraskende høj ekspression af erythro-5 poi et i n opnås ved transfektion af værtscellelinier med et Apa I-restrik- tionsfragment af det humane erythropoietingen. Sense-strengen af Apa I-restriktionsfragmentet har en nukleotidsekvens svarende til den, der er vist i figur 1.
Figur 1 er en skematisk angivelse af det her omhandlede 2426 bp Apa 10 I-restriktionsfragment, der indeholder de humane erythropoietingen-sekvenser, figur 2 afbilder en repræsentativ plasmidekspressionsvektor (pDll-Ep), der indeholder 2426 bp Apa I-restriktionsfragmentet, og figur 3 afbilder en anden ekspressionsvektor (pBD-EP), der bærer 15 omhandlede Apa I-restriktionsfragment.
I en foretrukket udførelsesform indsættes et genetisk manipuleret Apa I-restriktionsfragment som vist i figur 1, i en ekspressionsvektor fra et pattedyr, såsom de vektorer, der er vist i figur 2 og 3, og indføres i cellelinier fra pattedyr til udvikling af stabilt transficerede 20 celler, der producerer store mængder biologisk aktivt humant erythropoietin. Apa I-restriktionsfragmentet af det humane erythropoietingen udvælges således, at der opnås den bedst mulige transskription af erythropoietin budbringer-RNA og bedst mulige translation og post-tran-slationel modifikation af RNA til udviklet biologisk aktivt erythropoie-25 tin-glycoprotein. Især i 5'-delen af erythropoietingenet var det vigtigt at fjerne interfererende sekvenser, men bibeholde forstærkende sekvenser. Introner bibeholdtes i Apa I-restriktionsfragmentet for at inkludere potentielt signifikant forstærkende sekvenser. I 3'-delen af genet bibeholdes nogle ikke-translaterede 3'-sekvenser for at opnå de formode-30 de optimalt regulerende sekvenser. Den forøgede ekspression, der tilvejebringes af Apa I-fragmentet demonstreres ved de vedvarende høje niveauer for erythropoietinekspression, der er beskrevet i de følgende udførelseseksempler under anvendelse af dette fragment sammen med to promotorer og to cellelinier.
35 De følgende eksempler tjener til belysning af den foreliggende op findelse.
DK 173067 B1 4
Eksempel I
Isolering af genome kloner
Et humant genom-bibliotek i bakteriofag (Cell 15, 1157-1174, 1978) screenedes under anvendelse af lavstringente hybridiseringsbetingelser 5 og blandinger af oligonukleotidprober som beskrevet i Cell 38, 287-297, (1984), hvortil der henvises i det foreliggende.
01igonukleotide blandinger fremstilledes under anvendelse af et "Applied Biosystems"-syntetiseringsapparat og mærkedes i enden under an-32 vendelse af p-ATP og T4-nukleotid-kinase. De syntetiske oligo-10 nukleotider udformedes således, at de svarede til dele af den N-terminale aminosyresekvens:
HgN-Ala-Pro-T-Arg-Leu-Ile-Leu-Asp-Ser-Arg-Val -Leu-Glu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-Glu-Ala-Glu-?-Ile-Thr-Asp-Gly-Gly-Ala 15 24 tilvejebragt af Yanagawa er al., J. Biol. Chem. 259, 2707-2710, 1984, fra humant protein oprenset fra urin fra patienter med aplastisk anæmi.
For at mindske degenerationen af kodonerne for aminosyresekvensen i det-20 te område anvendtes kodonanvendelsesregi erne ifølge Grantham et al.,
Nucleic Acids Research 8, 43-59, 1981, og Jaye et al., Nucleic Acids Research 11, 2325-2335, 1983. Disse regler tager hensyn til den relativt sjældne forekomst af CpG-dinukleotider 1 DNA fra hvirveldyr, og undgår, hvor det hensigtsmæssigt, potentielle fejltilpassede A:G pardannelser. I 25 aminosyrestilling 24 anbragtes asparagin som det mest sandsynlige, J.
Biol. Chem. 259, 2707-2710, 1984. For aminosyrerne Glu-Ala-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn, syntetiseredes 2 puljer med hver 72 sekvenser svarende til de forudsete kodoner. Én pulje var således TT(c/t)TC(a/g/t)GC(c/t)TC(c/t)TT(a/g/t)-GCTTC med hensyn til 20-nukleo-30 tid-proban, og i den anden pulje erstattedes T med C i stilling 18. For aminosyrerne Glu-Asn-Ile-Thr-Asp-Gly konstrueredes én pulje af sekvenser (AGC TCC TCC ATC AGT ATT ATT T[c/t]) til en 23-nukleotid-probe.
Plaque'r, der hybridiserede med de oligonukleotide prober rescree-nedes ved lavere tæthed, indtil de var rene. Efter plaquerensning af 35 indledningsvist positive fagkloner, offentliggjordes yderligere sekvensinformation vedrørende erythropoletingenet i artiklen af Jacobs et al.,
Nature 313, 806-310, 1985. 01igonukleotider konstrueredes ud fra denne DK 173067 B1 5 information og anvendtes til bekræftelse af identiteten af de positive kloner. Efter Eco RI-restriktionsenzymnedbrydn1ng af de positive kloner, gelrensedes indføjelses-DNA og ligeredes ved hjælp af standardteknik i pUC 13-plasmid, der forud var blevet restriktions-nedbrudt med Eco RI.
5 DNA-sekvensen bestemtes ved dideoxynukleotidkæde-forminering (Proc.
Natl. Acad. Sci, USA, 74, 5463-5467, 1977) under anvendelse af dATP
(er S) og den 17-mer universelle primer eller, i udvalgte områder, spe- 32 dfikke olIgonukleotide primere. p-ATP stammede fra ICN og enzymerne stammede fra New England Biolabs eller Bethesda Research Laboratories.
10 Ca. 4,8 x 10® bakteriofag'er screenedes ved hybridisering på nl- trocellulose-replikatfiltre. 3 forskellige kloner forblev positive under plaquerensningen, og ONA-indføjelsen karakteriseredes ved restriktions-kortlægning og delvis dideoxynukleotid-sekvensering. To af de tre kloner indeholdt tilsyneladende komplet information for erythropoietingenet.
15 Restriktionskortet og sekvensen for 2426 bp Apa I-fragmentet af disse kloner er vist i figur 1, og er praktisk taget det samme, som det nyligt offentliggjortes i artiklen af Jacobs et al., Nature 313, 806-810, 1985) for genet for humant erythropoietin. Den ringe forekomst af fagi sol ater Indeholdende erythropoietingenet i dette udvidede bibliotek, én ud af 20 ca. 2 x 10® bakteriofag'er, er 1 overensstemmelse med den antagelse, at erythropoietin eksisterer som en enkelt kopi af det humane genom. Sou-thern-blothybridisering af det totale humane DNA-genom med Apa I-frag-mentet eller andre restriktionsfragmenter af erythropoietingenet antyder kun et enkelt hybridiseringsbånd uden yderligere regioner med stærkt 25 homologt DNA.
Eksempel 2
Udvælgelse af Apa I-restriktionsfraomentet
Til konstruktion af ekspressionsvektorer tilvejebragtes Apa I-re-30 strikti onsfragmentet af erythropoietingenet under anvendelse af teknikken beskrevet i Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467, 1967,hvortil der henvises i det foreliggende. I korthed blev isoleret fag-DNA nedbrudt med restriktionsenzymet Apa I (Bethesda Research Laboratories) efterfulgt af separation på en 1% agarosegel og isolering ved 35 elektroeluerlng, phenolekstraktion og ethanol udfældning. Fragmentet bekræftedes ved delvis sekvensering som i eksempel 1.
Under henvisning til figur 1 indeholdt det indføjede Apa I-re- DK 173067 B1 6 strikti onsfragment 58 bp af ikke-translaterede 5'-sekven$er (nukleotider 0001-0058) efterfulgt af sekvenser, der koder for et putativt 27-amino-syre-signal-peptid, det udviklede protein, fire putativt mellemliggende sekvenser, og 222 bp af en ikke-kodende 3'-DNA-sekvens. I 5'-delen af 5 genet findes Apa I-stedet anbragt 58 basepar opstrøms fra ATG-starts-kodonen (0058) for proteinsekvensen. Denne 5'-plads (0001) udvalgtes for at undgå en falsk startplads umiddelbart opstrøms fra Apa I-restrik-tionsstedet, medens inkludering af putativt regulerende sekvenser blev anset for at være vigtig af hensyn til effektiv ribosomal binding og be-10 arbejdelse. Apa I-stedet i 3'-enden (2426) udvalgtes for at inkludere putative bearbejdelsessignaler i de fleste af de ikke-translaterede 3'-sekvenser, medens yderligere nedenstrøms sekvenser fjernedes. Det fuldstændige erythropoletingen, herunder intronsekvenser, anvendtes for at inkludere potentielt regulerende eller forstærkende sekvenser i intro-15 ner, som kan medvirke til erythropoietingenekspression eller proteinmodifikation og -sekretion.
Eksempel 3
Konstruktion af ekspressionsplasmider indeholdende Apa I-restriktions-20 fragment 2426 bp Apa I-restriktionsfragmentet indeholdende det intakte humane erythropoietingen indføjedes i 2 ekspressionsvektorer, pD-11 og pBD-opbygn1ngerne, som hver især er baseret på en individuel mammalpro-motor.
25 PIasmid-ekspresslonsvektoren pD-11 stammede fra et tidligere be skrevet plasmid (Nucleic Acids Research 13, 841-857, 1985, hvortil der specielt henvises 1 det foreliggende, og Indeholdt de forstærkende sekvenser og replikationsoprindelsen fra Simian-virus 40 (SV-40) samt den sene adenovirus-2 -hovedpromotor og tredelte ledersekvenser. Apa I-frag-30 mentet af humane erythropoietingenome-sekvenser (figur 1) gelrensedes og enkelt-strengende ender udfyldtes ved behandling med T4 DNA polymerase.
Barn HI linkere ligeredes til begge stumpe ender og opbygningen indføjedes på en unik B-Bam HI-restriktionsplads i pD-11 for at lede transskription af erythropoietingenet fra en stærk promotor.
35 Strukturen af det resulterende ekspressionsplasmid pD-ll-Ep, der Indeholder Apa I-fragmentet (Ep), er afbildet i figur 2. Plasmid pD-11 indeholder 350 bp af den terminale venstre del (0-1) af adenovirus, op- DK 173067 B1 7 rindelses- og forstærkel sessekvenser fra SV-40 (E), den sene hovedpromotor fra adenovirus (MLP), den tredelte ledesekvens på adenovirus-2 (Ll- 3) og 5'-splejsningsstedet for den tredie ledesekvens (5'ss), et imrnuno-glubin-3'-splejsningssted (3'ss) og det sene SV-40-polyadenylerlngssig-5 nal (pA) på Eco RI (RI) restriktionspladsen 1 pML. Rekombinantplasmider klonedes i E coli HB 101 og rensedes ved isopyknisk centrifugering i cæsiurnehi orid. Ekspressionsplasmidet pO-ll-EP har en længde på ca. 6500 bp. Opbygningen bekræftedes ved restriktionskortlægning og delvis dide-oxynukleotid-sekvenser1ng.
10 pBD indeholder MT-I-promotorsekvensen (Glanville, Durham & Palmi- ter, Nature 292, 267-269, 1981, hvortil der specielt henvises til i det foreliggende) og en selekterbar DHFR-markørsekvens båret i pUC-plasmid.
Under henvisning til figur 3 indføjedes 2426 bp Apa I-restrik-tionsfragmentet (EP) på en unik Sma I-restriktionsplads i pBD til frem-15 stilling af ekspresslonsplasmld pBD-EP. DHFR-sekvensen i pBD-EP var associeret med oprindelses- og forstærkelsessekvenser fra SV 40 og med Hepatitis B-overfladeant1gen-polyadenyler1ngssekvenser. pBD-EP tilvejebragtes i det væsentlige som beskrevet ovenfor for pD-ll-EP.
Medens plasmidvektorer anvendtes ved disse bekræftende eksperlmen-20 ter tilsigtedes det, at virale eller retrovirale ekspressionsvektorer ligeledes kan anvendes til at Indføre Apa I-erythropoi eti ngenfragmentet i værtscelle!inler. Passende DNA-v1rus til dette formål omfatter adenovirus eller BPV (kvæg-papilloma-vlrus). Passende retrovirale vektorer er også kendte og tilgængelige. Det er åbenbart, at en sådan retroviral 25 (RNA) vektor vil bære antl-sense-strengen af Apa I-restriktionsfragmentet, dvs. én streng med en sekvens svarende til RNA transskriberet fra sense-strengen vist i figur 1 eller til en allel deraf. Den retrovirale vektor vil også omfatte sekvenser for trans-virkende faktorer, der er nødvendige for revers transskription af det virale genom og integration 30 af DNA formen af pågældende virus 1 værtsgenomet.
Eksempel 4
Transficerinq af mammalceller
Hver af to mammalcellelinier transficeredes »ed hver af pD-ll-EP-35 og pBD-EP-opbygningerne. Hamealcellelinier, C0S-7 (abenyrer) og BHK (nyrer fra babyhamster) opbevaredes 1 Dulbecco's modificerede essentielle medium indeholdende 10% føtalt kalveserum. Cellerne overførtes og trans- DK 173067 B1 8 ficeredes ved hjælp af calciumphosphatmetoden (Virology 52:456-467, 1973) ved en sammenflydningsgrad på 50-70%. BHK stammer fra nyreepitel -celler, der almindeligvis antages at være den mest sandsynlige celle som producerer erythropoietin i naturlig tilstand, hvis et pattedyr er anæ-5 m1sk eller hypoksisk. Disse celler kan således genkende kritiske regulerende sekvenser 1 Apa I-fragmentet fra erythropoietingenet, og derefter virksomt oparbejde og fremstille erythropoietin-glycoproteinet.
Til transient ekspression af celler i en 100 mm dyrkningsskål anvendtes ialt 20 /ig DNA: 10 μς pD-11 EP-plasmid indeholdende erythropoie-10 tingenet og 10 μq laksesperma-bærer-DNA. Efter 48 timer opsamledes su-pernatanten, centrifugeredes ved 400 G i 10 minutter til fjernelse af celler og rester, og blev nedfrosset ved -20°C. Cellerne høstedes separat. Resultaterne af transficeringer med pD-ll-EP alene med hensyn til transient ekspression er vist i tabel I. Data stammer fra 3 forsøg for 15 hver celletype.
Tab«?!. 1
Erythropoietin or. ml kultur 20 Hammal cel ler Protein ua Enheder (in vitro bioforsøol BHK 3,4 ± 0,2 270 ± 16 COS-7 3,2 1 0,4 255 t 32 25
De iagttagede niveauer af erythropoietin udskilt i supernatanten fra enten C0S-7 eller BHK marnmalcellelinierne var ca. 80 gange højere end de niveauer, der tidligere er noteret for transient ekspression af cDNA, der koder for erythropoietin eller for transient ekspression af 30 andre opbygninger under anvendelse af intakte erythropoiet ingener.
Til etablering af stabile cellelinier, der producerer høje niveauer af erythropoietin, co-transficeredes enten COS-7- eller BHK-celler med pD-ll-EP-plasmidet og pDHFR-la, et plasmid indeholdende et cDNA for de-hydrofolat-reduktase 1 en lignende mammalekspressionsvektor. Transfek-35 tionsmetoden modificeredes således, at 5pg af pDll-EP-plasmidet, 5 /jg af pDHFR-la-plasmidet og 10 jig bærer-DNA cotransficeredes. Efter yderligere inkubation 1 18-24 timer sattes forskellige koncentrationer af metho- DK 173067 B1 9 trexat (10 nM til 1 mM) til kulturerne. Celler, der inkorporerede DHFR-genet, var levedygtige 1 det selektive medium. Efter inkubation i flere dage Isoleredes levedygtige kolonier, der var resistente overfor metho-trexat, overførtes og screenedes for tilstedeværelsen af erythropoietin-5 bioaktivitet i supernatanten. Omtrent halvdelen af de methotrexat-resistente kolonier, der undersøgtes, udskilte påviselig erythropoietin-aktivitet.
For at etablere stabile cellelinier med ekspressionsvektor pBD-Ep transficeredes BHK-celler ved hjælp af calciumphosphatmetoden. Efter 18-10 24 timer udsattes disse kulturer for koncentrationer af methotrexat varierende fra 1 (M til 1 mM. Efter inkubation i flere dage, isoleredes levedygtige kolonier, der var resistente overfor disse relativt høje niveauer af methotrexat, overførtes og screenedes. Ved denne undersøgelse udviste alle de methotrexat-resistente kolonier, der undersøgtes, påv1-15 selig erythropoietin-aktivitet.
For at optimere ekspressionen af den transkriptionelle enhed indeholdende erythropoietingenet og DHFR-genet overførtes BHK-cellelinier Indeholdende enten pBD-Ep eller pDll-Ep og udskillende høje niveauer af erythropoietin flere gange til stigende koncentrationer af methotrexat 20 (Nature 316, 271-273, 1985). I stedet for en gradvis stigning 1 det selektive tryk på cellelinierne ved langsom trinvis forøgelse af koncentrationen af methotrexat, udsattes cellerne imidlertid omgående for meget høje koncentrationer af methotrexat (dvs. 1 mM). Kun få celler overlevede, men disse celler ville have inkorporeret plasmidopbygnlngen i et 25 DNA-område, der var særligt fordelagtigt til ekspression (et såkaldt "hot-spot") og/eller ville indeholde mange kopier af den opbyggede transskriptionelle enhed. De stærkest producerende cellelinier udvalgtes således i ét trin. Cellelinier (herunder F 7,2 og S 5,2 anført i tabel II) betragtedes som stabile, hvis erythropoietinproduktionen forblev høj 30 ved mere end 15 overførsler i fravær af selektivt methotrexattryk.
Erythropoletinaktivitetsmængden i cellepellets kunne ikke bestemmes på grund af nærvær af signifikante inhibitorer mod undersøgelsen i celleekstrakterne. Følgeligt omfatter de resultater, der fremgår af tabel II ikke analyseværdier for de intracellulære niveauer af erythro-35 poietlnprotein, men i stedet mængden af erythropoietinprotein dannet og udskilt af cellelinierne 1 supernatanten.
DK 173067 B1 10
Tabel II
Ekspression af rekombinant erythropoietin fra stabilt transficerede BHK-cellelinier 5 Erythropoietin or. ml supernatant
Cellelinie Protein uo Enheder fin vitro bioforsøol
dBD-EP
> 1,1 12,4 970 F 3,4 32,0 2500 10 F 6,1 79,6 6210 F 7,2 84,1 6728
pDll:EP
S 1,2 6,4 500 15 S 2,4 64,2 5000 S 5,2 82,1 6400
De iagttagede mængder erythopoietinudskillelse svarer til en nom1-20 nel mængde pi op til næsten 7 mill, enheder pr. liter. Sidanne nominelle mængder bestemtes ved multipllcerlng af det iagttagede udbytte pr. ml med 1000 til opnåelse af et forventet produktionsudbytte pr. liter.
De Iagttagede mængder erythropoletinudskillelse under anvendelse af Apa I-fragment var af størrelsesordenen 300 gange større end de mængder, 25 der tidligere er angivet, L1n et al., Proc. Natl. Acad. ScI. USA, 82, 7580-7584, nov. 1985, for en stabilt transformeret CHO-cellelinie Indeholdende et andet genomfragment af det humane erythropoietlngen.
Kontrolforsøg 1 forbindelse med disse transfektionsforsøg omfattede supernatanter fra ikke-transficerede celler og parallelle kulturer af 30 celler transficeret med plasmlder Indeholdende DNA, der koder for andre proteiner, herunder bakteriel chloramphenicol-acetyl-transferase og humant koagulationssproteln, faktor IX. Ingen af kontrol kul turerne, de-fingerede transfektioner, eller dyrkede celler transficeret med andre gener, havde påviselig erythropo1etinakt1v1tet. Under ovennævnte række 35 forsøg med erythropoietlngenet blev der også bemærket, at de niveauer af ekspression, der opnåedes for udvalgte cellelinier, Ikke havde relation til, om den selektive markør cotransficeredes sammen med erythropoietin- DK 173067 B1 11 genet eller Indføjedes i det Apa I-fragmentholdige plasmid, forud for transfektion (data Ikke vist).
Andre repræsentative transfektionsmetoder, der er egnede til udøvelse af den foreliggende opfindelse, omfatter DEAE-dextran-medierede 5 transfektionsmetoder, lysozymfusion eller erythrocytfuslon, skrabnlng, direkte optagelse, osmose- eller sakkarose-chok, direkte mikroinjektion,
Indirekte mikroinjektion, såsom via erythrocyt-medierede metoder og/el-ler underkastelse af værtscellerne for elektrisk strøm. Ved transfektion menes overførsel af genetisk Information, og Især information, der ind-10 kodes af Apa I-restriktionsfragmentet af et humant erythropoietingen, til en celle under anvendelse af isoleret DNA, RNA eller en syntetisk nukleotidpolymer. Ovennævnte liste over transfektionsmetoder skal ikke betragtes som fuldstændig, idet andre metoder til indførelse af genetisk information 1 celler uden tvivl vil blive udviklet. Apa I-restriktions-15 fragmentet vil typisk være operativt bundet til (ligeret med) andre nu-kleinsyresekvenser, såsom promotorsekvenser, forstærkningssekvenser og polyadenyleringssekvenser, forud for transfektion. Skønt værtscellelinier af mammal oprindelse er beskrevet, og nyre-epitelceller betragtes som særligt foretrukne, er det åbenbart at andre eukaryotiske og pro-20 karyotiske (bakterie eller gær) værtscellen nier kan anvendes ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse. Nylige forsøg på indførelse mam-male gener i planteceller giver også mulighed for anvendelse af plante-eller algeceller.
25 Eksempel 5
Ervthropoletineksoression fra transficerede cellelinier
Det rekombinante erythropoietinprotein, der udskiltes i supernatan-ten af de transficerede cellelinier, var biologisk aktivt, og store mængder af hormonet udskiltes: op til 7000 enheder pr. ml.
30 In v1tro-afprøvningen af den biologisk aktivitet af erythropoietin var baseret på dannelsen af erytroide kolonier (fra CFU-E, erythroid-ko-lonldannede celler) i kulturer af knoglemarvceller fra mus 1 en plasmamasse (Blood Cells 4, 89-103, 1978). Sensitiviteten ved dette forsøg var ca. 5 mi 11 ienheder/ml. Det erythropoietin, der anvendtes som standard 35 ved afprøvningen, var et delvist renset præparat stammende fra plasma fra anæmiske får (Connaught, trin 3 Ep, Lot 3026). Supernatanter fra o-verførte cellelinier dyrket i 24 timer i frisk medium uden methotrexat DK 173067 B1 12 afprøvedes. Supernatanten fortyndedes 1:200 med medium, og der tilsattes mængder på mellem 1 og 10 øliter pr. ml forsøgskultur indeholdende 2 x c 10 marvceller, 10% citratholdigt kvægplasma, 20% føtalt kalveserum, 1% kvægserumalbumin og 1,6% okseembryoekstrakt fra (Gibco). Efter inku-5 bation i 36-48 timer anbragtes plasmamasserne på mikroskoppræparatglas, farvedes med benzidin til hæmoglobinpåvisning, og erythroidkolonierne optaltes. I fravær af tilsat erythropoietin, påvistes ingen CFU-E-af1 edte kolonier. Optimal erythroid-kolonivækst (100-150 CFU-E påvist pr. 2 x 4 10 marvceller) iagttoges rutinemæssigt med 50 mtl (0,64 nanog) erythro-10 poietin pr. ml kultur. Store mængder erythropoietinhormononer udskiltes i supernatanten af transficerede cellelinier, se tabel I og II, op til 7000 enheder pr. ml. Under antagelse af at rekombinanterythropoietinet havde en specifik aktivitet ækvivalent med aktiviteten af naturligt erythropoietin (78000 enheder pr. mg protein), svarede det biologiske 15 afprøvningsresultat til ca. 80 øg erythropoletinprotein pr. ml.
Derudover Afprøvedes supernatanter fra udvalgte cellelinier for immunologisk reaktivt erythropoietin ved konkurrerende radioimmunoafprøv-ning under anvendelse af et polyvalent anti-human-erythropoietin kanin-anti-serum (J. Cell. Physiol. 118, 87-96, 1984). Mængden af protein målt 20 ved radioimmunoprøven var ækvivalent med det ved den biologiske afprøvning anslåede proteinniveau. Disse data indikerer at de transficerede cellelinier ved ekspression producerede og udskilte erythropoletinprotein, der var mere end 98% aktivt.
Rekombinanterythropoietin produceret af de transficerede celler ka-25 rakteriseredes yderligere for at påvise, at disse celler udskilte autentisk hormon. Udvalgte cellelinier afprøvedes for in vivo erythro-poietinaktivitet i ekshypoksisk polycythemiske mus (Nature 191, 1069-1087, 1961). Supernatanter udskilt fra cellelinierne besad kraftig in vivo biologisk aktivitet ved afprøvning i de ekshypoksisk polycythemiske 30 mus. Ved forsøg, hvorved anvendtes delvist renset naturligt erythropoietin, var det tidligere konstateret, at neuramlnldase-behandling fuldstændigt ophævede erythropoietinaktivitet ved afprøvning i det intakte dyr (J. Biol. Chem. 247, 5159-5160, 1958). Tabet af aktivitet skyldtes formodentligt forøget bortfjernelse i leveren af det desialerede hormon, 35 idet neuraminidase-behandlet erythropoietin forblev fuldt aktivt in vitro. Iagttagelsen af kraftig biologisk aktivitet in vivo indikerede at de transficerede mammale cellelinier på passende måde tilføjer carbohy- DK 173067 B1 13 drat og terminale sialsyrer til erythropoietinproteinet under post-translationel modifikation.
Ved separate forsøg neutraliseredes aktiviteten af erythropoietin ved den biologiske afprøvning In vitro af et neutraliserende anti-human 5 erythropoietin-antistof, der sattes til kulturen.
Det erythropoietin, der udskiltes i supernatanten af reprssentati-ve, transficerede cellelinier afprøvedes også for proliferative virkninger på andre marvstamceller. Rekomblnant- erythropoietin afprøvedes for dets virkning på forskellige stamceller fra marv fra mus og mennesker, 10 herunder erythrold-kolonldannende celler (CFU-E), erythroid "burst"-dan-nede celler (BFU-E), granulocyt-makrofage forstadier (CFU-GM) og kolonidannende celler med blandede celler (CFU-Mix) (J. Cell. Physiol. Suppl.
1, 79-85, 1982, J. Cell. Physiol. 118, 87-95, 1984). Erythroide stamme-celler udviste et proli ferationsrespons på rekombinanterythropoietinet, 15 hvilket respons var magen til det dosls-responsforhold, der fremkom med naturligt erythropoietin. Hverken CFU-GM eller CFU-Mix udviste nogen proliferativ respons på rekombinant- erythropoietinet ved koncentrationer på op til 10 enheder pr. ml forsøgscellekultur.
Ved analyse med SDS-PAGE under reducerende eller ikke-reducerende 20 forhold, opnåedes samme elektroforesebiIlede med det rensede rekombi-nanterythropoietin som med erythropoietin oprenset fra urin fra patienter med aplastisk ansmi. Samme m1kroheterogenitet for proteinerne iagt-toges, og de prs-dominante typer havde identisk molekylvsgt på 34 kd.

Claims (19)

1. I alt væsentligt rent, rekombinant DNA eller RNA bestående af 5 en nukleotidsekvens svarende til Apa I-restriktionsfragmentet på 2426 bp af et humant erythropoietingen.
2. DNA eller RNA ifølge krav 1, hvori Apa I-restriktionsfragmentet omfatter nukleotidsekvensen af enten sense-strengen vist i 10 figur 1 eller den komplementære RNA-sekvens deraf.
3. DNA- eller RNA-sekvens ifølge krav 1, som er operativt bundet til en anden nukleinsyresekvens, der er i stand til at fremkalde ekspression deraf. 15
4. DNA eller RNA ifølge krav 3, hvori den anden nukleinsyresekvens er udvalgt blandt én eller flere af følgende: promotorsekvenser, forstærkende sekvenser, polyadenyleringssekvenser, selekterbare markørsekvenser, plasmider, virale og retrovirale 20 ekspressionsvektorer eller trans-virkende retrovirale fakto rer.
5. Cellelinie omfattende DNA eller RNA ifølge krav 3 eller 4.
6. Cellelinie, som er stabilt transficeret med DNA eller RNA ifølge krav 3 eller 4.
7. Cellelinie ifølge krav 5 eller 6, som er udvalgt fra gruppen bestående af eukaryotiske celler. 30
8. Cellelinie ifølge krav 7, hvori cellerne er mammale celler.
9. Cellelinie ifølge krav 8, hvori cellerne er af renal oprindelse. 35
10. Cellelinie ifølge krav 9, hvori cellerne er nyreceller DK 173067 B1
11. Cellelinie ifølge krav 10, hvori cellerne er epitelceller.
12. Cellelinie Ifølge krav 11, hvori cellerne er babyhamsternyre-celler (BHK-celler). 5
13. Fremgangsmåde til ekspression af rekombinant, biologisk aktivt humant erythropoietin omfattende de trin, at man transficerer en værtscellelinie med DNA, RNA eller en nukleotidsekvens bestående af Apa I-restriktionsfragmentet på 2426 bp af et hu- 10 mant erythropoietingen, bringer de transficerede celler 1 kon takt med et dyrkningsmedium og ved ekspression lader cellerne producere erythropoietin, og udvinder det producerede erythropoietin.
14. Fremgangsmåde til ekspression af rekombinant, biologisk aktivt humant erythropoietin fra en cellelinie, der er i kontakt med et inkubatlonsmedium, omfattende de trin, at man inkorporerer en cellelinie, der er 1 stand til at give et udbytte af erythropoietin 1 Inkubationsmediet, hvilken cellelinie er pro- 20 duceret ved transficerlng af en værtscellennie med DNA, RNA eller nukleotidsekvenser bestående af Apa I-restriktionsfragmentet på 2426 bp af et humant erythropoietingen.
15. Fremgangsmåde Ifølge krav 14, hvori cellelinien er i stand til 25 at tillade et nominelt udbytte på mindst 2 millioner enheder erythropoietin pr. liter inkubationsmedium.
16. Fremgangsmåde Ifølge et hvilket som helst af kravene 13, 14 og 15, hvori Apa I-restrlktionsfragmentet findes i et plasmid el- 30 ler en virus.
17. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 13, 14 og 15, hvori værtscellelinien er udvalgt fra gruppen bestående af eukaryotlske celler. 35
18. Humant erythropoietin, som er produceret ved ekspression af cellelinien ifølge et hvilket som helst af kravene 5, 6, 7, 8, 5 DK 173067 B1 9, 10, 11 og 12.
19. Humant erythropoietin, som er produceret ved fremgangsmåden ifølge et hvilet som helst af kravene 13, 14, 15, 16 og 17.
DK198703093A 1986-06-27 1987-06-17 Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa DK173067B1 (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US87942386A 1986-06-27 1986-06-27
US87942386 1986-06-27

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK309387D0 DK309387D0 (da) 1987-06-17
DK309387A DK309387A (da) 1987-12-28
DK173067B1 true DK173067B1 (da) 1999-12-13

Family

ID=25374134

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK198703093A DK173067B1 (da) 1986-06-27 1987-06-17 Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa

Country Status (17)

Country Link
US (3) US5688679A (da)
EP (1) EP0255231B1 (da)
JP (1) JPS63126488A (da)
KR (1) KR970009935B1 (da)
CN (2) CN101041819A (da)
AT (1) ATE76431T1 (da)
AU (1) AU611088B2 (da)
BR (1) BR8703269A (da)
CA (1) CA1341361C (da)
DE (1) DE3779206D1 (da)
DK (1) DK173067B1 (da)
ES (1) ES2037083T3 (da)
FI (1) FI95393C (da)
GR (1) GR3004707T3 (da)
NO (1) NO303398B1 (da)
PT (1) PT85193B (da)
WO (1) WO1988000241A1 (da)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK173067B1 (da) * 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
US6048729A (en) 1987-05-01 2000-04-11 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
US4974929A (en) * 1987-09-22 1990-12-04 Baxter International, Inc. Fiber optical probe connector for physiologic measurement devices
US6063630A (en) 1991-11-05 2000-05-16 Transkaryotic Therapies, Inc. Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy
US6692737B1 (en) 1991-11-05 2004-02-17 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
US6054288A (en) * 1991-11-05 2000-04-25 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
US5641670A (en) * 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
NZ245015A (en) 1991-11-05 1995-12-21 Transkaryotic Therapies Inc Delivery of human growth hormone through the administration of transfected cell lines encoding human growth hormone, which are physically protected from host immune response; the transfected cells and their production
US5968502A (en) * 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US6670178B1 (en) 1992-07-10 2003-12-30 Transkaryotic Therapies, Inc. In Vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
US6531124B1 (en) 1992-07-10 2003-03-11 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
US6153407A (en) * 1992-07-28 2000-11-28 Beth Israel Deaconess Medical Center Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics
WO1995013376A1 (en) * 1993-11-10 1995-05-18 Amgen Inc. Gene therapy vector for the treatment of low or defective red blood cell production
US5919758A (en) * 1994-03-22 1999-07-06 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with altered biological activity
US5888774A (en) * 1994-12-19 1999-03-30 Cangene Corporation Recombinant DNA molecules and expression vectors for erythropoietin
US5952226A (en) * 1996-11-05 1999-09-14 Modex Therapeutiques Hypoxia responsive EPO producing cells
US6187564B1 (en) 1997-07-10 2001-02-13 Beth Israel Deaconess Medical Center DNA encoding erythropoietin multimers having modified 5′ and 3′ sequences and its use to prepare EPO therapeutics
US20030161823A1 (en) * 1998-08-31 2003-08-28 Neta Ilan Therapeutic and cosmetic uses of heparanases
US20020088019A1 (en) * 1997-09-02 2002-07-04 Oron Yacoby-Zeevi Methods of and pharmaceutical compositions for improving implantation of embryos
US20040213789A1 (en) * 1997-09-02 2004-10-28 Oron Yacoby-Zeevi Heparanase activity neutralizing anti-heparanase monoclonal antibody and other anti-heparanase antibodies
US6699672B1 (en) 1997-09-02 2004-03-02 Insight Biopharmaceuticals Ltd. Heparanase specific molecular probes and their use research and medical applications
US6177545B1 (en) * 1997-09-02 2001-01-23 Insight Strategy & Marketing Ltd. Heparanase specific molecular probes and their use in research and medical applications
US6897066B1 (en) * 1997-09-26 2005-05-24 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
ATE267215T1 (de) * 1997-12-08 2004-06-15 Lexigen Pharm Corp Heterodimäre fusionsproteine zur verwendung für gezielte immuntherapie und allgemeine immunerregung
BR9905868A (pt) 1998-11-06 2001-01-23 Bio Sidus S A Procedimento de cultivo massivo de células de mamìfero para a obtenção de eritropoetina humana, recombinante e a eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento
US6777205B1 (en) 1998-11-06 2004-08-17 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Host cells expressing recombinant human erythropoietin
BR9917606A (pt) 1998-11-06 2002-12-31 Bio Sidus S A Procedimento para a purificação de eritropoetina humana recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo de células e eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento
EP1157118A4 (en) * 1999-03-01 2002-07-17 Insight Strategy & Marketing POLYNUCLEOTID ENCODING A POLYPEPTIDE WITH HEPARANASE ACTIVITY AND ITS EXPRESSION IN GENETICALLY MODIFIED CELLS
IL145816A0 (en) * 1999-04-09 2002-07-25 Ortho Mcneil Pharm Inc Pharmaceutical compositions of erythropoietin
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
KR100827757B1 (ko) 1999-08-09 2008-05-07 메르크 파텐트 게엠베하 복수의 시토킨-항체 복합체
JP2003514552A (ja) 1999-11-12 2003-04-22 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング 改善された性質を有するエリトロポエチンの形態
PT1252192E (pt) 2000-02-11 2007-01-31 Merck Patent Gmbh Melhoramento da semivida de circulação de proteínas de fusão à base de anticorpos
US7259146B2 (en) 2000-05-26 2007-08-21 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Neuroprotective peptides
BR0112111A (pt) 2000-06-29 2003-05-06 Merck Patent Gmbh Realce de respostas imunes mediadas por proteìna de fusão de anticorpo-citocina por tratamento combinado com agentes de realce de captação de imunocitocina
US7078376B1 (en) 2000-08-11 2006-07-18 Baxter Healthcare S.A. Therapeutic methods for treating subjects with a recombinant erythropoietin having high activity and reduced side effects
EP1326969B1 (en) 2000-09-25 2009-04-15 Genetronics, Inc. Improved system for regulation of transgene expression
DE60219961T8 (de) 2001-02-02 2008-04-17 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Behandlung von neurologischen funktionsstörungen mit fructopyranosesulfamaten und erythropoetin
CA2440221C (en) 2001-03-07 2013-02-05 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
ATE502053T1 (de) 2001-05-03 2011-04-15 Merck Patent Gmbh Rekombinanter, tumorspezifischer antikörper und dessen verwendung
US6818613B2 (en) 2001-11-07 2004-11-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Aqueous sustained-release formulations of proteins
US6671189B2 (en) * 2001-11-09 2003-12-30 Minebea Co., Ltd. Power converter having primary and secondary side switches
MXPA04005068A (es) * 2001-11-28 2004-08-19 Ortho Mcneil Pharm Inc Regimen de dosis de eritropoyetina para el tratamiento de la anemia.
HU229098B1 (hu) 2001-12-04 2013-07-29 Merck Patent Gmbh Megváltoztatott szelektivitású immuncitokinek
WO2003078959A2 (en) * 2002-03-11 2003-09-25 Ortho Mcneil Pharmaceutical, Inc Methods for shp1 mediated neuroprotection
DE10234192B4 (de) * 2002-07-26 2009-11-26 Epoplus Gmbh Co.Kg Verwendung von Erythropoetin
US7611700B2 (en) * 2002-09-09 2009-11-03 Hanall Pharmaceuticals, Co., Ltd. Protease resistant modified interferon alpha polypeptides
DK1572748T3 (da) 2002-12-17 2010-08-23 Merck Patent Gmbh Humaniseret antistof (H14.18) af muse-14.18-antistof der binder til GD2 og dets fusionsprotein med IL-2
US20070026485A1 (en) 2003-04-09 2007-02-01 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US20060269552A1 (en) * 2003-06-09 2006-11-30 Oron Yacoby-Zeevi Heparanase activity neutralizing anti-heparanase monclonal antibody and other anti-heparanase antibodies
US7141544B2 (en) * 2003-10-10 2006-11-28 Baxter International, Inc. Stabilization of pharmaceutical protein formulations with small peptides
JP2008504008A (ja) 2003-12-31 2008-02-14 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング 改良された薬物動態を有するＦｃ−エリスロポエチン融合タンパク質
US7423139B2 (en) * 2004-01-20 2008-09-09 Insight Biopharmaceuticals Ltd. High level expression of recombinant human erythropoietin having a modified 5′-UTR
US20050238628A1 (en) * 2004-04-08 2005-10-27 Blau Carl A Methods for treating cancer
US7588745B2 (en) * 2004-04-13 2009-09-15 Si Options, Llc Silicon-containing products
US7772182B2 (en) * 2004-08-05 2010-08-10 Alza Corporation Stable suspension formulations of erythropoietin receptor agonists
US7597884B2 (en) 2004-08-09 2009-10-06 Alios Biopharma, Inc. Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use
CN101062407A (zh) 2006-04-29 2007-10-31 中国科学院上海生命科学研究院 促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途
KR101248252B1 (ko) 2006-11-28 2013-03-27 한올바이오파마주식회사 변형된 에리스로포이에틴 폴리펩티드와 이의 치료용 용도
US20090143255A1 (en) * 2007-11-30 2009-06-04 Funkhouser Gary P Methods and Compositions for Improving Well Bore Stability in Subterranean Formations
EP3103880A1 (en) 2008-02-08 2016-12-14 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
CA2736141C (en) 2008-09-23 2018-03-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Purification of erythropoietin
US8278418B2 (en) 2008-09-26 2012-10-02 Ambrx, Inc. Modified animal erythropoietin polypeptides and their uses
CA2745329C (en) 2008-12-04 2022-07-12 Opko Curna, Llc Treatment of erythropoietin (epo) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to epo
WO2010108503A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Life & Brain Gmbh Promotion of neuronal integration in neural stem cell grafts
WO2013120500A1 (en) * 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded tumour antigen
EP2970420A4 (en) 2013-03-15 2016-08-17 Apotex Inc STABILITY OF THE ENHANCED LIQUID FORMULATION OF ERYTHROPOIETIN ALPHA VIA A PURIFICATION TREATMENT
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
JP6245299B2 (ja) * 2016-04-27 2017-12-13 バクスアルタ ゲーエムベーハー 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6045849B2 (ja) * 1980-08-25 1985-10-12 林原 健 ヒトエリトロポエチンの製造方法
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
IT1185503B (it) * 1984-01-11 1987-11-12 Univ New York Cloni di odna di eritropietina umana
IL77081A (en) * 1984-12-04 1999-10-28 Genetics Inst AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin
ATE89314T1 (de) * 1985-02-13 1993-05-15 Scios Nova Inc Menschlicher metallothionein ii-promotor in saeugetierexpressionssystemen.
US4751084A (en) * 1986-02-26 1988-06-14 Monsanto Company Tissue plasminogen activator from normal human colon cells
EP0236059B1 (en) * 1986-02-27 1994-04-27 Snow Brand Milk Products Co. Ltd. Preparation of erythropoietin-producing cells and production process of erythropoietin using same
DK173067B1 (da) 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
US4835260A (en) * 1987-03-20 1989-05-30 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin composition

Also Published As

Publication number Publication date
NO880863L (no) 1988-04-26
US5688679A (en) 1997-11-18
FI880899A0 (fi) 1988-02-26
GR3004707T3 (da) 1993-04-28
PT85193A (en) 1987-07-01
US6682910B2 (en) 2004-01-27
FI95393C (fi) 1996-01-25
WO1988000241A1 (en) 1988-01-14
ATE76431T1 (de) 1992-06-15
AU611088B2 (en) 1991-06-06
PT85193B (pt) 1990-08-31
CA1341361C (en) 2002-05-21
US20020137145A1 (en) 2002-09-26
EP0255231B1 (en) 1992-05-20
DK309387A (da) 1987-12-28
ES2037083T3 (es) 1993-06-16
BR8703269A (pt) 1988-03-15
US6867020B2 (en) 2005-03-15
NO303398B1 (no) 1998-07-06
AU7475787A (en) 1988-01-07
DE3779206D1 (de) 1992-06-25
CN1044133C (zh) 1999-07-14
DK309387D0 (da) 1987-06-17
FI880899A (fi) 1988-02-26
CN87104424A (zh) 1988-04-27
CN101041819A (zh) 2007-09-26
FI95393B (fi) 1995-10-13
JPS63126488A (ja) 1988-05-30
US20020045255A1 (en) 2002-04-18
KR970009935B1 (ko) 1997-06-19
NO880863D0 (no) 1988-02-26
EP0255231A1 (en) 1988-02-03
KR880007726A (ko) 1988-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK173067B1 (da) Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
KR101666228B1 (ko) 생물치료학적 분자를 발현시키기 위한 치료학적 유전자-스위치 작제물 및 생물반응기, 및 이의 용도
DE68927996T2 (de) Modifizierte hepatozyten und deren anwendung
AU692196B2 (en) Translational enhancer DNA
JP2619208B2 (ja) 組換え繊維芽細胞成長因子
KR100880509B1 (ko) 재조합 단백질의 대량 생산을 위한 신규한 벡터, 발현세포주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법
JPH08501703A (ja) 欠陥組換えアデノウイルスベクター及び遺伝子治療での使用
JPH09510601A (ja) ヒト遺伝子治療用のエピソーム発現ベクター
CN113396222A (zh) 腺相关病毒(aav)生产细胞系和相关方法
Papkoff Inducible overexpression and secretion of int-1 protein
WO2008143875A1 (en) Targeted delivery of glycine receptors to excitable cells
JP2003534775A (ja) タンパク質を不安定化する方法とその使用
KR20220121844A (ko) 유전자의 발현을 동시에 조절하기 위한 조성물 및 방법
DE3853139T2 (de) Rekombinanter, fremde gene enthaltender menschlicher cytomegalovirus und seine verwendung.
KR20230019063A (ko) C9orf72 연관 질환의 치료를 위한 삼중 기능 아데노-연관 바이러스 (aav) 벡터
CN101208425A (zh) 产生复制缺陷型腺病毒的细胞系
CN110582305A (zh) 用于治疗血红蛋白病的载体和组合物
JPH10507625A (ja) 宿主細胞における蛋白産生の改良
Morris-Vasios et al. Avian sarcoma-leukosis virus pol-endo proteins expressed independently in mammalian cells accumulate in the nucleus but can be directed to other cellular compartments
Levitt et al. Two integrated partial repeats of simian virus 40 together code for a super-T antigen
KR20240021906A (ko) 발현 벡터, 박테리아 서열-무함유 벡터, 및 이를 제조하고 사용하는 방법
KR20230117327A (ko) 가용성 알칼리성 포스파타제 작제물 및 가용성 알칼리성 포스파타제 작제물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터
CN117795066A (zh) 用于rna引导的效应器募集的系统、方法和组分
RU2823437C2 (ru) Лечение и/или профилактика заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией
US20020177544A1 (en) Adenoviral transfer vector for the gene transport of a dna sequence

Legal Events

Date Code Title Description
B1 Patent granted (law 1993)
PUP Patent expired