CN1117155C

CN1117155C - 新型化合物

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Publication number: CN1117155C
Application number: CN95195305A
Authority: CN
Inventors: M·J·布朗克; K·E·墨菲; C·G·查普曼; H·E·克林肯比得; P·R·杨; A·R·沙兹曼
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd; SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd; SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1994-07-29
Filing date: 1995-07-28
Publication date: 2003-08-06
Anticipated expiration: 2015-07-28
Also published as: PL182665B1; NO970374L; NO970374D0; JPH10503371A; MX9700764A; CZ25697A3; CA2196200A1; EP0770135A1; NZ292124A; WO1996004388A1; HUT76369A; BR9508469A; CN1164872A; PL318380A1; AU3382595A

Abstract

一种具有IL4和/或IL13拮抗剂或部分拮抗剂活性的可溶蛋白，该蛋白包含与至少一个人类免疫球蛋白恒定区或其片段融合的IL4突变体或变异体。

Description

新型化合物

本发明涉及人白细胞介素4(IL4)和/或人白细胞介素13(IL13)的拮抗剂，它可用于治疗IL4和/或IL13的不良作用导致的病症，例如某些IgE介导的过敏性疾病、T细胞介导的自身免疫病症以及对感染原的不当免疫应答。

白细胞介素是分泌型肽类免疫应答介质。各种已知的白细胞介素对于免疫系统细胞的发育、活化、增殖和分化具有多种作用。IL4在这样的功能中具有生理功用，但是也会导致疾病的形成。具体地说，IL4与B淋巴细胞的发育途径相关联，从而导致IgE抗体的产生，该抗体是过敏性疾病的标志，如外源性哮喘、鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性皮炎和过敏反应。IL4也可用作T淋巴细胞通用的生长和分化因子，在一些自身免疫疾病中可能造成组织损伤，例如胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化以及风湿性关节炎，以及移植排斥。IL4还抑制细胞介导的应答的产生，该应答是控制感染性疾病所需的。因此，对于IL4对T或B淋巴细胞的作用，对该作用的拮抗作用对这些疾病可能有有益的效果。IL13是最近被分离出的，在许多生物特性方面与IL4相似(Minty，A.等，(1993)，自然，卷362，248-250页)，包括一些受体结构/功能的方面(Aversa，G.等，(1993)，实验医学杂志，第178卷，2213-2218页)。

人的IL4由一个129个氨基酸的，具有2个可能的N-糖基化位点和组成3个二硫键的6个半胱氨酸的单肽链组成(Le，H.V.等，(1988)，生物化学杂志，第263卷，10817-10823页)。IL4的氨基酸序列和这些二硫键的位置是已知的(Carr，C.等，(1991)，生物化学，第30卷，1515-1523页)。

10

HIS-LYS-CYS-ASP-ILE-THR-LEU-GLN-GLU-ILE-ILE-LYS-THR-LEU-ASN-

20 30

SER-LEU-THR-GLU-GLN-LYS-THR-LEU-CYS-THR-GLU-LEU-THR-VAL-THR-

40

ASP-ILE-PHE-ALA-ALA-SER-LYS-ASN-THR-THR-GLU-LYS-GLU-THR-PHE-

50 60

CYS-ARG-ALA-ALA-THR-VAL-LEU-ARG-GLN-PHE-TYR-SER-HIS-HIS-GLU-

70

LYS-ASP-THR-ARG-CYS-LEU-GLY-ALA-THR-ALA-GLN-GLN-PHE-HIS-ARG-

80 90

HIS-LYS-GLN-LEU-ILE-ARG-PHE-LEU-LYS-ARG-LEU-ASP-ARG-ASN-LEU-

100

TRP-GLY-LEU-ALA-GLY-LEU-ASN-SER-CYS-PRO-VAL-LYS-GLU-ALA-ASN-

110 120

GLN-SER-THR-LEU-GLU-ASN-PHE-LEU-GLU-ARG-LEU-LYS-THR-ILE-MET-

129

ARG-GLU-LYS-TYR-SER-LYS-CYS-SER-SER

二硫键位于第3和127位、第24和65位、以及第46和99位残基之间。随糖基化程度的不同，IL4的分子量从15KDa(无糖基化)到60KDa或更多(过糖基化的IL4)不等。

人的IL4的DNA序列也被描述于Yokota，T.等，P.N.A.S.，1986年第83卷5894-5898页。

WO93/10235描述了IL4的一些突变体，它们是IL4的拮抗剂或部分拮抗剂。

EP-A-0 464 533公开的融合蛋白包含免疫球蛋白分子的恒定区的不同部分和另一个人类蛋白或其一部分。

本发明提供了一种可溶蛋白，它具有IL4和/或IL13拮抗剂或部分拮抗剂活性，包含一个与至少一个人类免疫球蛋白恒定区或其片段融合的IL4突变体或变异体。

术语“突变体或变异体”包括了任何在施用到人体内部以后保持拮抗IL4和/或IL13的能力的分子，如IL4蛋白截短的或其它的衍生物。这样的其它的衍生物可以通过氨基酸的添加、删除、替代或重排或对其进行化学修饰来制备。

编码IL4突变体或变异体的DNA聚合体可以通过常规的方法来制备，如对编码IL4的cDNA进行定点突变，例如G.Winter等，自然，1982年第299卷756-758页或Zoller和Smith，1982年，核酸研究，第10卷，6487-6500页；或缺失突变，例如Chan和Smith，核酸研究，1984年第12卷2407-2419页或G.Winter等，Biochem.Soc.Trans.1984年第12卷224-225页；或聚合酶链式反应，例如Mikaelian和Sergeant，核酸研究，1992年第20卷376页。

此处所使用的“具有IL4和/或IL13拮抗剂或部分拮抗剂活性”意思是在Spits等所描述的检测方法中(免疫杂志，第139卷1142页(1987))，IL4刺激的T细胞增殖以剂量依赖性方式被抑制。

适合的IL4突变体在WO93/10235中公开，其中天然存在于野生型IL4第120至128位任一位置的至少一个氨基酸被一个不同的天然氨基酸替换。具体地说，天然存在于第124位的酪氨酸被一个不同的天然氨基酸替换，例如甘氨酸或更优选的天门冬氨酸。

免疫球蛋白可以是任何亚类(IgG，IgM，IgA，IgE)，但优选的是IgG，例如IgG1、IgG3或IgG4。所述恒定区或其片段可以来自于重链或轻链，或同时来自于这两种链。本发明包括免疫球蛋白组分中的突变，该突变删除了天然免疫球蛋白中不需要的特性，例如Fc受体结合特性，和/或导入了需要的特性，例如稳定性。举例来说，Angal S.，King D.J.，Bodmer M.W.，Turner A.，Lawson A.D.G.，Roberts G.，Pedley B.和Adair R.在《分子免疫学》1993年第30卷105-108页中描述了一种IgG4分子，其中残基241(Kabat编号)从丝氨酸变为脯氨酸。这一变化增加了IgG4分子的血清半衰期。Canfield S.M.和Morrison S.L.在《实验医学杂志》第173卷1483-1491页中描述了残基248(Kabat编号)在IgG3中从亮氨酸到谷氨酸和在小鼠IgG2b中从谷氨酸到亮氨酸的变化。前者中谷氨酸对亮氨酸的替代降低了免疫球蛋白与FcγRI受体有关的亲和性，后者中亮氨酸对谷氨酸的替代增加了亲和性。EP0307434公开了IgG中不同的突变，包括残基248(Kabat编号)L到E的突变。

优选的恒定区或其片段是人的IgG重链恒定区的全部的或基本的部分，更优选的是IgG4。一方面，IgG组分由IgG1的CH2和CH3结构域以及铰链区组成，铰链区包括参与重链间二硫键结合的半胱氨酸残基，例如IgG1铰链区残基11和14(Frangione B.和Milstein C.，自然，第121卷939-941页，1967)。优选地，IgG1组分由相应于IgG1的铰链区中1至4和6至15位残基、CH2的1至110和CH3的1至107位残基组成，见Ellison J.，Berson B.和Hood L.E.在《核酸研究》1982年第10卷4071至4079页中的描述。铰链区中的残基5通过将核酸序列中的TGT变成GCC而将公开的IgG1序列中的半胱氨酸变为丙氨酸。另一方面，IgG组分来自于IgG4，它包括CH2和CH3结构域以及铰链区，铰链区含有参与重链间二硫键结合的半胱氨酸残基，例如IgG4铰链区的残基8和11(Pinck J.R.和Milstein C.，自然，1967年第216卷941-942页)。优选地，该IgG4组分由相应于IgG4的铰链区中1至12位残基、CH2的1至110和CH3的1至107位残基组成，见Ellison J.，Buxbaum J..和Hood L.在《DNA》1981年第1卷11至18页的描述。在IgG4中的一种合适的突变的实施例中，铰链区的残基10(残基241，Kabat编号)从野生型的丝氨酸(S)变为脯氨酸(P)，并且CH2的残基5(残基248，Kabat编号)从野生型的亮氨酸(L)变为谷氨酸(E)。

IL4突变体或变异体与Ig恒定区或其片段的融合是通过一个组分的C末端连接到另一个组分的N末端实现的。优选地，IL4突变体或变异体是通过其C末端与Ig恒定区或其片段的N末端融合的。

在一个优选的方面，本发明的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：4，SEQ ID No：7或SEQ ID No：10所示。

另一方面，本发明提供了一种制备本发明化合物的方法，该方法包括在重组宿主细胞中表达编码该化合物的DNA的以及回收产物。

包含编码该化合物的核酸序列的DNA聚合体也形成本发明的一部分。

在一个优选的方面，DNA聚合体包含SEQ ID No：3，SEQ ID No：6，SEQ ID No：9，或由其组成。

本发明的方法可以用常规的重组技术完成，如《分子克隆-实验室手册》(Maniatis等，冷泉港1982年出版)和《DNA克隆》I、II、III卷(D.M.Glover编，IRL出版公司)所述。

具体地说，该方法可以包括如下步骤：

i)制备一种可复制的表达载体，可以在宿主细胞中表达包含编码该化合物的核酸序列的DNA聚合体；

ii)用该载体转化宿主细胞；

iii)在允许表达该DNA聚合体以生产该化合物的条件下培养上述转化的宿主细胞；并

iv)回收该化合物。

本发明还提供了一种通过缩合适当的单聚、二聚或寡聚核苷酸单元来制备DNA聚合体的方法。

制备过程可以通过化学的、酶促的或两者结合的方法在体内或体外进行。于是，DNA聚合体可以用常规的方法通过酶促连接适当的DNA片段来制备，方法的描述见D.M.Roberts等，生物化学，1985年第24卷5090-5098页。

DNA片段可以如下获得：用适当的限制性酶切割包含所需核苷酸序列的DNA，化学合成，在DNA或RNA模板上酶促聚合，或结合使用上述方法。

限制性酶的切割反应在适当的缓冲液中，在20℃-70℃的温度下进行，一般体积为50μl或更少，含有DNA 0.1-10μg。

体外的DNA酶促聚合反应可以使用例如DNA聚合酶I(Klenow片段)的DNA聚合酶，在根据需要包含三磷酸核苷dATP、dCTP、dGTP和dTTP的适当的缓冲液中，在10℃-37℃的温度下进行，体积一般为50μl或更少。

DNA片段的酶促连接反应可以使用例如T4 DNA连接酶的DNA连接酶，在适当的缓冲液中，在4℃至环境温度下进行，体积一般为50μl或更少。

DNA聚合体或其片段的化学合成可以通过常规的磷酸三酯、亚磷酸酯或氨基磷酸酯化学法，使用固相技术进行，例如在以下文献中所述：《基因片段的化学和酶促合成实验室手册》(H.G.Gassen和A.Lang编著)，Verlag Chemie，Weinheim(1982)，或其它科学出版物，例如M.J.Gait，H.W.D.Matthes，M.Singh，B.S.Sproat和R.C.Titmas，核酸研究，1982年第10卷6243页，B.S.Sproat和W.Bannwarth，四面体通讯，1983年第24卷5771页，M.D.Matteucci和M.H.Caruthers，四面体通讯，1980年第21卷719页，M.D.Matteucci和M.H.Caruthers，美国化学协会杂志，1981年第103卷3185页，S.P.Adams等，美国化学协会杂志，1983年第105卷661页中、N.D.Sinha、J.Biernat、J.McMannus和H.Koester，核酸研究，1984年第12卷4539页，以及H.W.D.Matthes等，EMBO杂志，1984年第3卷801页。优选地使用自动DNA合成仪。

DNA聚合体优选地通过连接两个或更多DNA分子来制备，这些DNA分子的总和包含有编码该化合物的DNA序列。一个根据本发明的具体方法包括连接编码IL4突变体或变异体的第一DNA分子和编码免疫球蛋白结构域或其片段的第二DNA分子。

DNA分子可以通过使用适当的限制性酶切割带有所需密码序列的载体或通过使用聚合酶链式反应技术来获得。

DNA分子的精确结构和其获得的方法依赖于所需产物的结构。设计编码该化合物的DNA分子的适当的构建方案对于本领域的技术人员来说是常规工作。

编码该化合物的DNA聚合体在重组宿主细胞中的表达可以通过使用在宿主细胞中能够表达DNA聚合体的可复制表达载体来进行。该表达载体是新的，也构成本发明的一部分。

可复制表达载体可以根据本发明的方法制备，通过切开与宿主细胞相容的载体以提供具有完整的复制子的线性DNA片段，并在连接条件下将该线性片段与一个或多个DNA分子结合，这些DNA分子与该线性片段共同编码该化合物。

线性片段与多于一个DNA分子的连接根据需要可以同时进行或顺序进行。

于是，该DNA聚合体可以根据需要预先形成或在构建载体的过程中形成。

载体的选择部分地决定于宿主细胞，它可以是原核的，如大肠杆菌，或真核的，如鼠C127细胞、鼠骨髓瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞或海拉细胞，真菌，如丝状真菌或单细胞酵母，或昆虫细胞，如果蝇细胞。宿主细胞也可以是转基因动物细胞。适合的载体包括质粒、噬菌体、粘粒和得自如棒状病毒、牛痘或Semliki Forest重组病毒。

可复制表达载体的制备可以通过常规方法用适当的酶限制性切割、聚合、连接DNA来进行，其过程描述于，例如Maniatis等，引文同上。聚合和连接可以按照上述DNA聚合体的制备方法进行。限制性切割可以在适合的缓冲液中，在20℃-70℃的温度范围内进行，一般体积为50μl或更少，含有0.1-10μg DNA。

根据本发明，重组宿主细胞可以在转化条件下，通过用本发明的可复制表达载体转化宿主细胞来制备。适合的转化条件是常规的，描述于，例如，Maniatis等，引文同上，或《DNA克隆》第II卷，D.M.Glover编著，IRL出版公司1985年出版。

转化条件的选择由宿主细胞确定。因此，细菌宿主如大肠杆菌可以用氯化钙溶液处理(Cohen等，美国国家科学院院刊，1973年第69卷2110页)或用包含RbCl、MnCl₂、乙酸钾和甘油的混合物的溶液处理，然后用3-[N-吗啉代]-丙烷-磺酸、RbCl和甘油处理。培养的哺乳动物细胞可以通过DNA载体与钙在细胞上共沉淀来转化。

本发明还涉及用本发明的可复制表达载体转化的宿主细胞。

在允许DNA聚合体表达的条件下培养转化的宿主细胞是按常规进行的，其描述见如Maniatis等和《DNA克隆》，引文同上。于是，优选地，向细胞提供营养物，并在低于45℃的条件下培养。

表达产物根据宿主细胞用常规方法回收。因此，当宿主细胞是细菌(如大肠杆菌)时，可用物理的、化学的或酶促方法裂解，蛋白产物从所得的裂解物中分离。如果产物从细菌细胞中分泌出来，则可以从胞质间或培养基中回收。如果宿主细胞是哺乳动物的，产物一般从培养基中分离。

DNA聚合体可以整合到载体中，该载体是为分离稳定地表达产物的转化的哺乳动物细胞系而设计的；例如，牛乳头瘤病毒载体或在中国仓鼠卵巢细胞中扩增的载体(《DNA克隆》第II卷，D.M.Glover编著，IRL出版公司1985年；Kaufman R.J.等，分子和细胞生物学，1985年第5卷1750-1759页；Pavlakis G.N.和Hamer D.H.，美国国家科学院院刊，1983年第80卷397-401页；Goeddel D.V.等，欧洲专利申请0093619号，1983)。

本发明的化合物具有IL4和/或IL13拮抗剂活性，并因此在治疗由IL4和/或IL13不良作用引起的病症方面具有潜在的用途，这些病症例如IgE介导的过敏性疾病和T细胞介导的自身免疫疾病或慢性微生物感染。

本发明于是进一步提供了一种药物组合物，它包含本发明的化合物和药用载体。

在使用时，虽然确切的组合物剂型将依赖于给药方式，但该化合物一般以药用组合物的形式，与人的药用载体、稀释剂和/或赋形剂一起使用。例如，该化合物可以以用于吸入的气溶胶或可雾化溶液形式或以非肠道给药的无菌溶液的形式使用。

本发明的化合物的施用剂量范围是对IL4和/或IL13介导的病症产生所需效果(例如，IgE介导的病症被减轻或自身免疫疾病的恶化停止或好转)的剂量范围，。剂量一般随年龄、程度或病症的严重性以及禁忌症(如果有的话)而不同。单位剂量可以从不到1mg到300mg，但是典型的是在每次1到20mg的范围内，每天一次或多次，例如一至六次，这样每天的剂量达到0.02-40mg/kg的范围。

适合于注射的化合物的存在形式可以是溶液、悬液或乳液或干粉，后者在使用前被溶于或悬于适当的介质中。

液体单位剂量形式用该化合物和无热源物质的无菌介质制备。根据使用的介质和浓度，该化合物既可以溶于也可以悬于该介质中。溶液可用于所有形式的非肠道给药，尤其是用于静脉注射。在制备溶液时，化合物可以溶于介质中，如果需要，溶液可以通过加入氯化钠制成等渗的，并且在注入适合的无菌的小瓶或安瓿中和封口之前，使用消毒技术通过灭菌过滤器过滤灭菌。或者，如果溶液有足够的稳定性，可将其在封装的容器中高压灭菌。可在介质中溶入有益的添加剂，如缓冲液、助溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、悬浊剂或乳化剂和/或局部麻醉剂。

使用前溶于或悬于适合的介质的干粉的制备是在无菌区域，通过使用消毒技术将预灭菌的药物物质和其它成分充入灭菌的容器中来完成的。或者药物和其它成分溶于水性介质中，溶液用过滤法除菌，然后在无菌区域使用消毒技术将其分装到适合的容器中。然后将产品冰冻干燥，容器消毒封口。

适合于肌肉、皮下或皮内注射的非肠道悬剂基本上用相同的方式制备，不同的是灭菌的化合物被悬于灭菌的介质而不是溶于其中，并且灭菌不能用过滤完成。该化合物可以在无菌的状态下被分离，或者也可以在分离后灭菌，例如伽玛照射。最好将悬浊剂如聚乙烯吡咯烷酮包含于组合物中以使化合物的分装变得容易。

适合于从呼吸道施用的组合物包括用于吸入的气溶胶、可雾化溶液或微细粉末。对于后者，小于50微米，特别是小于10微米的颗粒是优选的。这样的组合物可以用常规的方式制成，并且与常规的施用设备一起使用。

另一方面，本发明提供了一种治疗由IL4和/或IL13的不良作用引起的病症的方法，它包括给患者施用有效量的本发明的化合物。

本发明还提供了用作活性治疗物质的本发明的化合物，具体地说，是用于治疗由IL4和/或IL13的不良作用引起的病症。

本发明也提供了本发明的化合物在生产治疗由IL4和/或IL13的不良作用引起的病症的药剂方面的应用。

当本发明的化合物按照本发明施用时，预计没有未预料到的毒性。

下述实施例说明本发明。

实施例1 IL4.Y124D/IgG1融合蛋白

所描述的是IL4.Y124D/IgG1嵌合cDNA的构建，相应蛋白在哺乳动物表达系统中的表达及其活性。

1.编码融合蛋白的DNA的构建

(a)IL4.Y124D编码区的构建

用PCR诱变人的IL4cDNA(购自英国生物技术公司)，生产一种人的IL4基因变异体，该突变体已被描述(Kruse，N，Tony，H-P和Sebald，W.EMBO杂志，第11卷3237页[1992])，其中蛋白中的残基124从野生型的酪氨酸突变为天门冬氨酸。该IL4.Y124D cDNA被插入表达载体pTR312中，使用HindIII和BglII位点，(M.J.Browne，J.E.Carey，C.G.Chapman，A.W.R.Tyrrell，C.Entwisle，G.M.P.Lawrence，B.Reavy，I.Dodd，A.Esmail & J.H.Robinson，生物化学杂志，第263卷1599页[1988])以形成质粒pDB906。

为扩增IL4.Y124D分子以及在亚克隆的每个末端加入适宜的限制性位点，用20ng pDB906质粒作为底物进行PCR反应。PCR引物的设计包括了限制性酶切位点，通过侧面连接10-15个碱基对将引物“锚定”在每个末端。引物的序列如下：

1)5’CGA ACC ACT GAA TTC CGC ATT GCA GAG ATA 3’

(包括一个EcoRI限制性位点，GAATTC)

2)5’CAC AAA GAT CCT TAG GTA CCG CTC GAA CAC TTT GA 3’

(包括一个KpnI限制性位点，GGTACC)

使用的引物最终浓度是5ng/μl，加入的dNTP的最终浓度是0.2mM，总反应体积是100μl。进行31个PCR循环。循环由一个94℃1分钟的变性步骤、一个50℃1分30秒的退火步骤，以及一个72℃1分30秒的延长步骤组成。第1循环中变性延长至5分钟，终循环延长步骤延长至7分钟。PCR反应中使用购自先进生物技术公司(Advanced Bjotechnologies)的2.5单位的Taq聚合酶。生产出587bp的PCR产物。使用Promega公司的“Magic PCR cleanup”试剂盒纯化产物，然后在反应缓冲液4中用EcoRI和KpnI切割(所有的限制性酶从GibcoBRL公司获得)，以产生“粘性末端”。于37℃4小时30分钟后，反应加热至70℃保持10分钟，然后用乙醇沉淀。通过琼脂糖凝胶电泳分析所得DNA的结果显示有大约570bp，463bp和100bp的三个带。570bp的片段代表IL4的全长的变异体IL4.Y124D，其存在是因为切割不完全。产生两个较小片段是因为在IL4.Y124D cDNA中存在EcoRI位点。570bp的带用Geneclean^TM方法纯化，并连接到Bluescript KS^+TM上，后者是用EcoRI和KpnI切割然后用Geneclean^TM制备的。于是得到了Bluescript KS^+TM/IL4.Y124D重组体。用Promega公司的“Magic Maxiprep”的方法大量制备该重组DNA。用SmaI和KpnI将IL4.Y124D插入物从Bluescript重组体中切除。20μg的重组DNA与25单位的SmaI在反应缓冲液4中于30℃温育过夜。然后加入25单位的KpnI切割，于37℃温育5小时。所得的大约580bp的片段用Geneclean^TM纯化以产生IL4.Y124D/SmaI/KpnI片段。

(b)IgG1编码区域的构建

COSFcLink载体(表1)包含编码铰链区的氨基酸1-4和6-15、CH2的1-110和CH3的1-108的人的IgG1 cDNA，见Ellison J.，Berson B.和Hood L.E.，核酸研究，1982年第10卷4071-4079页。通过将核酸序列中的TGT变为GCC，铰链区的残基5从发表的IgG1序列的半胱氨酸变为丙氨酸。它是从人的IgG浆细胞白血病ARH-77(美国典型组织保藏中心)中克隆的，使用RT-PCR和全序列测序来确认其一致性[专利申请出版物WO92/00985]。

COSFc的构建从一个包含上述人的IgG1 cDNA的pUC18载体(pUC18-Fc)开始，它用KpnI和SacII切割，删除CH1、铰链区和CH2的一部分。删除的区域用包含如下铰链-CH2区的PCR扩增的片段来替代。使用如下的引物：

5’TCG AGC TCG GTA CCG AGC CCA AAT CGG CCG ACA AAA CTC ACA C3’

和

5’GTACTGCTCCTCCCGCGGCTTTGTCTTG3’

一个包含铰链-CH2区的DNA片段从pUC18-Fc扩增，用KpnI和SacII切割，凝胶纯化并克隆进KpnI/SacII切割的pUC18-Fc载体。通过将核酸序列中的TGT变为GCC，存在于IgG1重链位置230(Kabat编号；Kabat等，《与免疫学有关的蛋白序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)第5版，美国健康和人类服务部，NIH出版号91-3242(1991))的半胱氨酸变为丙氨酸。PCR引物中的一个改变的DNA序列在铰链区的5’末端引入了单一的KpnI位点。所得的质粒被称为pUC18Fcmod，对结合点和PCR扩增的区域进行测序以进行确认。

pUC18-Fcmod中的全部铰链-CH2-CH3插入区作为一个单独的片段被KpnI和XbaI切下，然后凝胶纯化，连接到用KpnI和XbaI切割的SFcR1Cos4上生成COSFc。

SFcR1Cos4是pST4DHFR的衍生物(Deen K，McDougal JS，Inacker R，Folena-Wasserman G，Arthos J，Rosenberg J，Maddon PJ，Axel R和SweetRW.自然，第331卷82页[1988])，并且包含插入到巨细胞病毒(CMV)启动子和牛生长激素(BGH)的多聚核苷酸区域之间的可溶的I型Fc受体(sFcR1)，还包含插入β球蛋白启动子和SV40的多聚核苷酸区域之间的二氢胎还原酶cDNA，一个SV40的复制启始区、和一个氨苄青霉素抗性基因，以在细菌中生长。用KpnI和XbaI切割载体，除去sFcR1编码区，这样COSFc载体就包含了插入CMV启动子和BGH polyA区域之间的铰链-CH2-CH3区。

通过在载体的单一EcoRI位点插入一个寡聚核苷酸连结子而从COSFc制备出COSFcLink载体，它重建了EcoRI位点，并且还引入了BstEII、PstI和EcoRV克隆位点。使用的寡聚核苷酸是：

5’AATTCGGTTACCTGCAGATATCAAGCT3’

3’GCCAATGGACGTCTATAGTTCGATTAA5’

对结合区测序以确定载体中的方向。最终载体的大小是6.37kb。

(c)编码融合蛋白的DNA的构建

为了插入IL4.Y124D cDNA，COSFc连接载体通过用EcoRV和KpnI按如下步骤切割来制备：5μg DNA与15单位的反应缓冲液2中的EcoRV在37℃下温育5小时，然后用乙醇沉淀。所得的DNA用反应缓冲液4中的KpnI在37℃下切割3小时，然后用乙醇沉淀。将IL4.Y124D/SmaI/KpnI和COSFcLink/EcoRV/KpnI片段连接到一起以生成质粒pDB951，它编码IL4.Y124D/IgG1融合蛋白。连接是使用AmershamDNA连接试剂盒来实现的，产品编号RPN1507，反应于16℃温育过夜。连接反应产物被转化到Promega JM109感受态细胞(高效)中，并将其涂覆到包含50μg/ml氨苄青霉素的Luria Broth琼脂平板上。转化产物在Luria Broth(包含氨苄青霉素50μg/ml)中培养，并使用Promega“MagicMinipreps”制备DNA。IL4.Y124D/COSFcLink重组DNA的产生通过限制性切割和DNA测序来确定。通过DNA测序来确定IL4.Y124D的全序列和与COSFcLink DNA的结合区(表2)。重组IL4.Y124D/IgG1 DNA的编码序列示于图3，融合蛋白的氨基酸序列示于图4。IL4.Y124D/COSFcLink重组DNA用氯化铯梯度制备和纯化，该DNA用于瞬时转染海拉细胞。

2.融合蛋白的表达

海拉细胞在含有10％胎牛血清和1％谷氨酰胺的MEMα培养基(Gibco)中生长。为进行该检测，将1×10⁶个海拉细胞接种于15ml的含有10％新生牛血清、1％谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中(“种子培养基”)，转染前放于75cm²的烧瓶中四天。转染前一天，将另外12.5ml的种子培养基加入每个烧瓶。转染当天，培养基在零时刻换为15ml的“转染培养基”(含有10％新生牛血清和1％非必需氨基酸的，加Earle盐的MEM培养基)。在+3小时时，存在于0.125M氯化钙、1×HBS(HEPES缓冲液)中的25μg的适当DNA加入细胞中。在+7小时时，对细胞进行甘油休克(glycerol shock，15％v/v)，然后转入12.5ml的含有5mM丁酸钠的种子培养基中温育过夜。第二天，用BPS(Dulbecco磷酸缓冲液)清洗细胞，然后加入12.5ml的“收获培养基”(包含2％的7.5％重碳酸钠贮液的RPMI-1640)。再经过24小时温育后，转移上清，在1000rpm离心5分钟以除去细胞碎片，并保存于4℃或-20℃。

3.生物学活性

为检测上清液的IL4拮抗剂活性：使用Spits等，免疫学杂志，第139卷1142页(1987年)中所描述的方法，将人的外周血液淋巴细胞与植物凝血素(一种T细胞分裂素)一起温育三天以上调(upregulate)IL4受体。所得的母细胞再用IL4刺激三天。用3H胸腺嘧啶的摄入检测其增殖。

IL4.Y124D/IgG1嵌合体以剂量依赖方式抑制用133pM IL4刺激的人的外周血液T淋巴细胞对³H胸腺嘧啶的摄入。

实施例2 IL4.Y124D/IgG4融合蛋白

1.编码融合蛋白的DNA的构建

进行PCR来扩增IL4.Y124D编码区，并在3’末端引入一个静止(silent)核苷酸替代，该替代产生了一个XhoI位点。作为PCR反应的底物，使用20ng的线性化的pDB951质粒(实施例1.1(c))。使用的寡聚核苷酸引物如下：

1)5’CAC AAG TGC GAT ATC ACC TTA CAG GAG ATC3’

(包括一个EcoRV限制性位点：GATATC)

2)5’CTC GGT ACC GCT CGA GCA CTT TGA GTC TTT3’

(包括一个XhoI限制性位点：CTCGAG)。

进行第二个PCR反应以扩增人的IgG4重链的铰链-CH2-CH3区。其底物是一个合成的人的IgG4重链cDNA，其序列描述于表5，并且基于Genbank序列GB：HUMIGCD2(Ellison J.，Buxbaum J.和Hood L.E.，DNA，1981年第1卷11-18页)。对公开的核苷酸序列进行大量的静止替代(silent substitution)。通过将两个0.5kb的合成DNA片段结合而组装该基因。每个0.5kb的片段通过将一系列的重叠(overlapping)寡聚核苷酸退火，然后用PCR填充间隙而生成。这两个0.5kb的片段在SacII位点结合，并插入pCR2载体。然后分离出一个包含全部恒定区的1.0kb的ApaI-BglII片段，并连接到一个包含人化的IL4特异性可变区的表达载体pCD中。该构建体被用作PCR底物以扩增IgG4的铰链-CH2-CH3区。

用于扩增IgG4铰链-CH2-CH3区的寡聚核苷酸引物如下：

1)5’GGT GGA CAA CTC GAG CGA GTC CAA ATA TGG3’

(包括一个XhoI限制性位点，CTCGAG)

2)5’TTA CGT AGA TCT AGA CTA CAC TCA TTT ACC3’

(包括一个XbaI位点，TCTAGA)。

两个PCR反应的条件如在pDB951衍生物中所述。简而言之，使用的引物为5ng/μl，dNTP的终浓度为0.2mM，反应的总体积为100μl。使用购自先进生物技术公司的2.5单位的Taq聚合酶进行31个循环的PCR反应。每个循环由94℃1分钟的变性步骤、50℃1分30秒的退火步骤以及72℃1分30秒的延长步骤组成。第一循环的变性步骤延长到5分钟，最后一个循环的延长步骤延长到7分钟。

得到了大约700bp(IgG4的铰链-CH2-CH3区)和400bp(IL4.Y124D)的PCR产物，并用Promega“Magic PCR cleanup”试剂盒纯化。纯化的PCR反应用下列酶切割以生成“粘性末端”：IgG4用XhoI和XbaI、IL4.Y124D用EcoRV和XhoI。切割物在37℃温育3小时，然后用乙醇沉淀。所得的DNA用凝胶电泳分析，大小约为690bp(IgG4的铰链-CH2-CH3区)和370bp(IL4.Y124D)。

制备一个载体，通过用EcoRV和XbaI切割pDB951(COSFcLink的IL4.Y124D)除去大部分IL4.Y124D/IgG1融合分子而将IgG4的铰链-CH2-CH3区和IL4.Y124D PCR片段连接于其上。唯一保留的部分是大约75bp的IL4的5’末端，它不存在于通过PCR扩增生成的IL4.Y124DEcoRV/XhoI片段中。5μg的pDB951 DNA在总体积为30μl的反应缓冲液2(GibcoBRL)中被切割。所得的5.8kb的DNA片段用GenecleanTM方法纯化。

所描述的三个片段(IL4.Y124D EcoRV/XhoI、IgG4 XhoI/XbaI的铰链-CH2-CH3区以及5.8kb的用EcoRV/XbAI切割pDB951所得的片段)被连接到一起以生成质粒pDB952，它编码IL4.Y124D/IgG4融合蛋白。连接反应是用购自Amersham(产品编号RPN 1507)的DNA连接试剂盒进行的，反应物于16℃温育过夜。连接反应的产物转化进PromegaJM109感受态细胞(高效)中，并涂覆到包含50μg/ml的氨苄青霉素的Luria Broth琼脂平板上。转化细胞在Luria Broth培养基(包含50μg/ml的氨苄青霉素)中培养，并使用Promega“Magic Minipreps”制备DNA。IL4.Y124D/IgG4重组DNA的产生用限制性切割来确定，并用DNA测序确定IL4.Y124D的全序列和铰链-CH2-CH3区。表6描述的只是IL4.Y124D/IgG4融合分子编码区的序列，表7包括了该融合蛋白的氨基酸序列。用氯化铯梯度法制备和纯化IL4.Y124D/IgG4重组DNA，该DNA用于瞬时转染海拉细胞。

2.融合蛋白的表达

海拉细胞在含有10％胎牛血清和1％谷氨酰胺的MEMα培养基(Gibco)中生长。为进行该检测，将1×10⁶的海拉细胞接种于15ml的含有10％新生牛血清、1％谷氨酰胺的RPMI-1640培养基(“种子培养基”)中，转染前放于75cm²的烧瓶中四天。转染前一天，将另外12.5ml的种子培养基加入每个烧瓶。转染当天，培养基在零时刻换为15ml的“转染培养基”(含有10％新生牛血清和1％非必需氨基酸的、加Earle盐的MEM培养基)。在+3小时时，将存在于0.125M氯化钙、1×HBS(HEPES缓冲液)中的25μg的适当DNA加入细胞中。在+7小时时，对细胞进行甘油休克(15％v/v)，然后转入12.5ml的含有5mM丁酸钠的种子培养基中温育过夜。第二天，用BPS(Dulbecco磷酸缓冲液)清洗细胞，然后加入12.5ml的“收获培养基”(包含2％的7.5％重碳酸钠贮液的RPMI-1640)。再经过24小时温育后，转移上清液，在1000rpm离心5分钟以除去细胞碎片，并保存于4℃或-20℃。

3.生物学活性

为检测上清液的IL4拮抗剂活性：使用Spits等，免疫学杂志，第139卷1142页(1987)中所描述的方法，将人的外周血液淋巴细胞与植物凝血素、T细胞分裂素一起温育三天以上调IL4受体。所得的母细胞再用IL4刺激三天。用³H胸腺嘧啶的摄入检测其增殖。

IL4.Y124D/IgG4嵌合体以剂量依赖方式抑制用133pM IL4刺激的人的外周血液T淋巴细胞对³H胸腺嘧啶的摄入。

实施例3 IL4.Y124D/IgG4 PE融合蛋白

1.编码融合蛋白的DNA的构建

如实施例2进行PCR来扩增IL4.Y124D编码区，并在3’末端引入一个静止核苷酸替代，产生一个XhoI位点。

进行第二PCR反应来扩增人的IgG4重链PE变异体的铰链-CH2-CH3片段。在IgG4 PE中，铰链的残基10(残基241，Kabat编号)从野生型的丝氨酸(S)改变为脯氨酸(P)，并且CH2的残基5(残基248，Kabat编号)从野生型的亮氨酸(L)改变为谷氨酸(E)。Angal S.，KingD.J.，Bodmer M.W.，Turner A.，Lawson A.D.G.，Roberts G.，Pedley B.和Adair R.，M.在《分子免疫学》1993年第30卷105-108页中描述了一种IgG4分子，其残基241(Kabat编号)从丝氨酸变为脯氨酸。该变化延长了IgG4分子的血清半衰期。

IgG4 PE突变体是用PCR诱变表5中所描述的合成的人的IgG4重链cDNA来产生的，然后被连接到pCD表达载体上。是该质粒被用作PCR反应的底物以扩增IgG4 PE的铰链-CH2-CH3片段。IgG4 PE变异体的序列描述于表8。IgG4核苷酸序列中产生PE变异的改变的残基如下所示：

参考表8：

残基322从野生型的“T”改变为PE变异体中的“C”；

残基333从野生型的“A”改变为PE变异体中的“G”；以及

残基343-344从野生型的“CT”改变为PE变异体中的“GA”。

寡聚核苷酸引物被用于扩增IgG4 PE变异体的铰链-CH2-CH3区，如制备pDB952时所描述的。

获得大约700bp(IgG4 PE突变体的铰链-CH2-CH3)和400bp(IL4.Y124D)的PCR产物，并用Promega“Magic PCR cleanup”试剂盒纯化。纯化的PCR反应物用下述酶切割以形成“粘性末端”：IgG4PE用XhoI和XbaI、IL4.Y124D用EcoRV和XhoI。切割物于37℃温育3小时，然后乙醇沉淀。所得的DNA的大小约为690bp(IgG4 PE的铰链-CH2-CH3)和370bp(IL4.Y124D)。

为了获得大量的IgG4 PE变异体的铰链-CH2-CH3片段和IL4.Y124D片段，将纯化并切割后的PCR产物与BIuescript KS^+TM连接，后者是用XhoI和XbaI(对IgG4 PE的铰链-CH2-CH3片段)或EcoRV和XhoI(对IL4.Y124D片段)切割而制备的，然后用Geneclean^TM处理。于是生成了Bluescript KS⁺/IgG4 PE的铰链-CH2-CH3重组体和Bluescript KS⁺/IL4.Y124D重组体。使用Promega的“Magic Maxiprep”方法生产大量的该DNA。用XhoI和XbaI将IgG4 PE的铰链-CH2-CH3片段从Bluescript重组体中切除。所得的大约690bp的片段用Geneclean^TM纯化以产生大量的IgG4 PE的铰链-CH2-CH3 XhoI/XbaI片段。用EcoRV和XhoI将IL4.Y124D片段从Bluescript重组体中切除，所得的大约370bp的片段用Geneclean^TM纯化。

制备一个载体，通过用EcoRV和XbaI切割pDB951而将IgG4 PE的铰链-CH2-CH3区和IL4.Y124D PCR片段连接于其上，如制备pDB952时所描述的。

所描述的三个片段(IL4.Y124D EcoRV/XhoI、IgG4 PE变异体的XhoI/XbaI的铰链-CH2-CH3以及用EcoRV/XbaI切割pDB951所得的5.8kb片段)用购自Amersham(产品编号RPN 1507)的DNA连接试剂盒连接到一起以生成质粒pDB953，反应于16℃温育过夜。将连接反应的产物转化进Promega JM109感受态细胞(高效)中，并涂覆到包含50μg/ml的氨苄青霉素的Luria Broth琼脂平板上。转化细胞在Luria Broth培养基(包含50μg/ml的氨苄青霉素)中培养，并使用Promega“MagicMinipres”制备DNA。IL4.Y124D/IgG4 PE变异体重组DNA的产生用限制性切割来确定，并用DNA测序确定IL4.Y124D的全序列和铰链-CH2-CH3 IgG4 PE变异区。表9描述的只是IL4.Y124D/IgG4 PE融合分子编码区的序列，表10包括了该融合蛋白的氨基酸序列。用氯化铯梯度法制备和纯化IL4.Y124D/IgG4 PE重组DNA，该DNA用于瞬时转染海拉细胞。

2.融合蛋白的表达

海拉细胞在含有10％胎牛血清和1％谷氨酰胺的MEMα培养基(Gibco)中生长。为进行该检测，将1×10⁶的海拉细胞接种于15ml的含有10％新生牛血清、1％谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中(“种子培养基”)，转染前放于75cm²的烧瓶中四天。转染前一天，将另外12.5ml的种子培养基加入每个烧瓶。转染当天，将培养基在零时刻换为15ml的“转染培养基”(含有10％新生牛血清和1％非必需氨基酸的、加Earle盐的MEM培养基)。在+3小时时，存在于0.125M氯化钙、1×HBS(HEPES缓冲液)中的25μg的适当DNA加入细胞中。在+7小时时，对细胞进行甘油休克(15％v/v)，然后转入12.5ml的含有5mM丁酸钠的种子培养基中温育过夜。第二天，用BPS(Dulbecco磷酸缓冲液)清洗细胞，然后加入12.5ml的“收获培养基”(包含2％的7.5％重碳酸钠贮液的RPMI-1640)。再经过24小时温育后，转移上清液，在1000rpm离心5分钟以除去细胞碎片，并保存于4℃或-20℃。

3.生物学活性

IL4.Y124D/IgG4 PE嵌合体以剂量依赖方式抑制用133pM IL4刺激的人的外周血液T淋巴细胞对³H胸腺嘧啶的摄入。

实施例4包含编码IL4.Y124D/IgG4 PE的DNA的哺乳动物表达载体

1.DNA的构建

pCDN载体(Aiyar N.，Baker E.，Wu H-L.，Nambi P.，Edwards R.M.，Trill J.J.，Ellis C.，Bergsma D.，分子和细胞生物化学，第131卷75-86页1994年)包含CMV启动子、一个多聚连结子克隆区，以及BGH多聚核苷酸区。该载体还包含用于Geneticin^TM筛选的插入β-球蛋白启动子和SV40多聚腺苷酸区之间的细菌新霉素磷酸转移酶基因(NEO)，用于氨甲蝶呤(MTX)扩增的插入β-球蛋白启动子和BGH多聚腺苷酸区之间的DHFR筛选盒，用于在细菌中生长的氨苄青霉素抗性基因，以及SV40复制启始区。

为了插入IL4.Y124D/IgG4 PE cDNA，用Nde1和BstX1切割pCDN载体，方法如下：15μg的DNA与30单位的反应缓冲液2中的BstX1(Gibco-BRL)一起于55℃温育1小时，然后乙醇沉淀。所得的DNA与反应缓冲液2中的Nde1于37℃温育1小时，然后乙醇沉淀。按如下方法用Nde1和BstX1切割以从pDB953(实施例3.1)制备IL4.Y124D/IgG4PE片段：15μg的DNA与30单位的反应缓冲液2中的BstX1一起于55℃温育1小时，然后乙醇沉淀。所得的DNA与反应缓冲液2中的Nde1于37℃温育1小时，然后乙醇沉淀。

将IL4.Y124D/IgG4 PE Nde1/BstX1和pCDN Nde1/BstX1片段连接到一起以生成质粒pCDN-IL4.Y124D/IgG4 PE。连接是通过使用2单位的T4 DNA连接酶(Gibco BRL)和T4 DNA连接酶缓冲液实现的。该反应在16℃温育过夜。连接反应产物转化进Gibco-BRL DH5a感受态细胞(亚克隆效果)中，并涂覆到包含75μg/ml的氨苄青霉素的Luria Broth琼脂平板上。转化细胞在Luria Broth培养基(包含50μg/ml的氨苄青霉素)中培养，并使用碱裂解法制备DNA。pCDN-IL4.Y124D/IgG4 PE DNA的产生用限制性切割来确定。并用DNA测序确定IL4.Y124D/IgG4 PE DNA的全序列。使用Qiagen柱来制备和纯化pCDN-IL4.Y124D/IgG4 PE重组DNA，该DNA用于瞬时感染COS细胞并电穿孔至CHO细胞中以产生稳定克隆。

2.融合蛋白的表达

a)在COS中的瞬时表达

COS-1细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中生长。在转化前24小时，2×10⁵的细胞接种于35mm的组织培养皿。将100μl无血清的DMEM中含1μg DNA的溶液加入100μl无血清的DMEM中含6μlLIPOFECTAMINE试剂(Gibco-BRL)的溶液中，小心搅拌，并在室温温育45分钟。细胞用无血清的DMEM洗涤一次。在DNA-LIPOFECTAMINE溶液中加入0.8ml的无血清的DMEM，小心混合，然后将稀释的溶液覆盖于细胞上。细胞在37℃温育5小时，然后加入1ml包含20％胎牛血清的DMEM。48-72小时后检测细胞以确定表达水平。

b)电穿孔至CHO细胞中

CHO细胞，ACC-098(一种从CHO DG-44衍生的悬浮细胞系，Urlaub G.，Kas E.，Carothers A.M.和Chasin L.A.，细胞，第33卷405-412页，1983年)在无血清的生长培养基WO92/05246中培养。15μg的pCDN-IL4.Y124D/IgG4 PE质粒用30单位的Not1在37℃下切割3小时以使质粒线性化，并用乙醇沉淀。所得的DNA重悬于50μl的1×TE(10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA)中。该DNA用Bio Rad基因脉冲仪于380V和25μFd电穿孔至1×10⁷ACC-098细胞中。该细胞重悬于生长培养基，浓度为2.5×10⁴细胞/ml，并将200μl的该悬液涂覆于96孔板的每个孔中。48小时后，培养基换为包含400μg/ml G418(Geneticin)的生长培养基。筛选后21天，出现菌落的条件培养基用Elisa法筛选。最高表达菌落被转移到24孔板中以按比例扩增(scaled up)。表1.COSFcLink载体的DNA序列，6367bpSEQ ID No：1GACGTCGACGGATCGGGAGATCGGGGATCGATCCGTCGACGTACGACTAGTTATTAATAG 60TAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTT 120ACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATG 180ACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTAT 240TTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCT 300ATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGG 360GACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGG 420TTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTC 480CACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAA 540TGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTC 600TATATAAGCAGAGCTGGGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCGAATTCGG 660TTACCTGCAGATATCAAGCTAATTCGGTACCGAGCCCAAATCGGCCGACAAAACTCACAC 720ATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC 780AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGA 840CGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA 900TAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGT 960CCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAA 1020CAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA 1080ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCT 1140GACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG 1200GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT 1260CCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG 1320CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCC 1380GGGTAAATGAGTGTAGTCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCA 1440GCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCAC 1500TGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTAT 1560TCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCA 1620TGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAACCAGCTGGGGCTCGAGGGGGGATCTCCCGATC 1680CCCAGCTTTGCTTCTCAATTTCTTATTTGCATAATGAGAAAAAAAGGAAAATTAATTTTA 1740ACACCAATTCAGTAGTTGATTGAGCAAATGCGTTGCCAAAAAGGATGCTTTAGAGACAGT 1800GTTCTCTGCACAGATAAGGACAAACATTATTCAGAGGGAGTACCCAGAGCTGAGACTCCT 1860AAGCCAGTGAGTGGCACAGCATTCTAGGGAGAAATATGCTTGTCATCACCGAAGCCTGAT 1920TCCGTAGAGCCACACCTTGGTAAGGGCCAATCTGCTCACACAGGATAGAGAGGGCAGGAG 1980CCAGGGCAGAGCATATAAGGTGAGGTAGGATCAGTTGCTCCTCACATTTGCTTCTGACAT 2040AGTTGTGTTGGGAGCTTGGATAGCTTGGACAGCTCAGGGCTGCGATTTCGCGCCAAACTT 2100GACGGCAATCCTAGCGTGAAGGCTGGTAGGATTTTATCCCCGCTGCCATCATGGTTCGAC 2160CATTGAACTGCATCGTCGCCGTGTCCCAAAATATGGGGATTGGCAAGAACGGAGACCTAC 2220CCTGGCCTCCGCTCAGGAACGAGTTCAAGTACTTCCAAAGAATGACCACAACCTCTTCAG 2280TGGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAGGAAAACCTGGTTCTCCATTCCTGAGA 2340AGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAATATAGTTCTCAGTAGAGAACTCAAAGAACCAC 2400CACGAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTTTGGATGATGCCTTAAGACTTATTGAACAAC 2460CGGAATTGGCAAGTAAAGTAGACATGGTTTGGATAGTCGGAGGCAGTTCTGTTTACCAGG 2520AAGCCATGAATCAACCAGGCCACCTTAGACTCTTTGTGACAAGGATCATGCAGGAATTTG 2580AAAGTGACACGTTTTTCCCAGAAATTGATTTGGGGAAATATAAACTTCTCCCAGAATACC 2640CAGGCGTCCTCTCTGAGGTCCAGGAGGAAAAAGGCATCAAGTATAAGTTTGAAGTCTACG 2700AGAAGAAAGACTAACAGGAAGATGCTTTCAAGTTCTCTGCTCCCCTCCTAAAGCTATGCA 2760TTTTTATAAGACCATGCTAGCTTGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAA 2820AGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGT 2880TTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCAACGATAGCTTATCTGTGGGC 2940GATGCCAAGCACCTGGATGCTGTTGGTTTCCTGCTACTGATTTAGAAGCCATTTGCCCCC 3000TGAGTGGGGCTTGGGAGCACTAACTTTCTCTTTCAAAGGAAGCAATGCAGAAAGAAAAGC 3060ATACAAAGTATAAGCTGCCATGTAATAATGGAAGAAGATAAGGTTGTATGAATTAGATTT 3120ACATACTTCTGAATTGAAACTAAACACCTTTAAATTCTTAAATATATAACACATTTCATA 3180TGAAAGTATTTTACATAAGTAACTCAGATACATAGAAAACAAAGCTAATGATAGGTGTCC 3240CTAAAAGTTCATTTATTAATTCTACAAATGATGAGCTGGCCATCAAAATTCCAGCTCAAT 3300TCTTCAACGAATTAGAAAGAGCAATCTGCAAACTCATCTGGAATAACAAAAAACCTAGGA 3360TAGCAAAAACTCTTCTCAAGGATAAAAGAACCTCTGGTGGAATCACCATGCCTGACCTAA 3420AGCTGTACTACAGAGCAATTGTGATAAAAACTGCATGGTACTGATATAGAAACGGACAAG 3480TAGACCAATGGAATAGAACCCACACACCTATGGTCACTTGATCTTCAACAAGAGAGCTAA 3540AACCATCCACTGGAAAAAAGACAGCATTTTCAACAAATGGTGCTGGCACAACTGGTGGTT 3600ATCATGGAGAAGAATGTGAATTGATCCATTCCAATCTCCTTGTACTAAGGTCAAATCTAA 3660GTGGATCAAGGAACTCCACATAAAACCAGAGACACTGAAACTTATAGAGGAGAAAGTGGG 3720GAAAAGCCTCGAAGATATGGGCACAGGGGAAAAATTCCTGAATAGAACAGCAATGGCTTG 3780TGCTGTAAGATCGAGAATTGACAAATGGGACCTCATGAAACTCCAAAGCTATCGGATCAA 3840TTCCTCCAAAAAAGCCTCCTCACTACTTCTGGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGG 3900CCTCTGCATAAATAAAAAAAATTAGTCAGCCATGCATGGGGCGGAGAATGGGCGGAACTG 3960GGCGGAGTTAGGGGCGGGATGGGCGGAGTTAGGGGCGGGACTATGGTTGCTGACTAATTG 4020AGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCTGGTT 4080GCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTT 4140CCACACCCTAACTGACACACATTCCACAGAATTAATTCCCGATCCCGTCGACCTCGAGAG 4200CTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCC 4260ACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTA 4320ACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCA 4380GCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTC 4440CGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGC 4500TCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACAT 4560GTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTT 4620CCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCG 4680AAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTC 4740TCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGT 4800GGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAA 4860GCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTA 4920TCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAA 4980CAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAA 5040CTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTT 5100CGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTT 5160TTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGAT 5220CTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCAT 5280GAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATC 5340AATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC 5400ACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTA 5460GATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGA 5520CCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCG 5580CAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGC 5640TAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCAT 5700CGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAG 5760GCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGAT 5820CGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAA 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360GACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGG 420TTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTC 480CACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAA 540TGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTC 600TATATAAGCAGAGCTGGGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCGAATTCGG 660TTACCTGCAGATGGGCTGCAGGAATTCCGCATTGCAGAGATAATTGTATTTAAGTGCCTA 720GCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCAAGCTTAC 780CTGCCATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCG 840GCAACTTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGA 900ACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTG 960CCTCCAAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGT 1020TCTACAGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACA 1080GGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGG 1140GCTTGAATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAA 1200GGCTAAAGACGATCATGAGAGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCGGTACCGAGCCCAAAT 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2160GGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAACCAGCTGGGGCTC 2220GAGGGGGGATCTCCCGATCCCCAGCTTTGCTTCTCAATTTCTTATTTGCATAATGAGAAA 2280AAAAGGAAAATTAATTTTAACACCAATTCAGTAGTTGATTGAGCAAATGCGTTGCCAAAA 2340AGGATGCTTTAGAGACAGTGTTCTCTGCACAGATAAGGACAAACATTATTCAGAGGGAGT 2400ACCCAGAGCTGAGACTCCTAAGCCAGTGAGTGGCACAGCATTCTAGGGAGAAATATGCTT 2460GTCATCACCGAAGCCTGATTCCGTAGAGCCACACCTTGGTAAGGGCCAATCTGCTCACAC 2520AGGATAGAGAGGGCAGGAGCCAGGGCAGAGCATATAAGGTGAGGTAGGATCAGTTGCTCC 2580TCACATTTGCTTCTGACATAGTTGTGTTGGGAGCTTGGATAGCTTGGACAGCTCAGGGCT 2640GCGATTTCGCGCCAAACTTGACGGCAATCCTAGCGTGAAGGCTGGTAGGATTTTATCCCC 2700GCTGCCATCATGGTTCGACCATTGAACTGCATCGTCGCCGTGTCCCAAAATATGGGGATT 2760GGCAAGAACGGAGACCTACCCTGGCCTCCGCTCAGGAACGAGTTCAAGTACTTCCAAAGA 2820ATGACCACAACCTCTTCAGTGGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAGGAAAACC 2880TGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAATATAGTTCTCAGT 2940AGAGAACTCAAAGAACCACCACGAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTTTGGATGATGCC 3000TTAAGACTTATTGAACAACCGGAATTGGCAAGTAAAGTAGACATGGTTTGGATAGTCGGA 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3960ATCACCATGCCTGACCTAAAGCTGTACTACAGAGCAATTGTGATAAAAACTGCATGGTAC 4020TGATATAGAAACGGACAAGTAGACCAATGGAATAGAACCCACACACCTATGGTCACTTGA 4080TCTTCAACAAGAGAGCTAAAACCATCCACTGGAAAAAAGACAGCATTTTCAACAAATGGT 4140GCTGGCACAACTGGTGGTTATCATGGAGAAGAATGTGAATTGATCCATTCCAATCTCCTT 4200GTACTAAGGTCAAATCTAAGTGGATCAAGGAACTCCACATAAAACCAGAGACACTGAAAC 4260TTATAGAGGAGAAAGTGGGGAAAAGCCTCGAAGATATGGGCACAGGGGAAAAATTCCTGA 4320ATAGAACAGCAATGGCTTGTGCTGTAAGATCGAGAATTGACAAATGGGACCTCATGAAAC 4380TCCAAAGCTATCGGATCAATTCCTCCAAAAAAGCCTCCTCACTACTTCTGGAATAGCTCA 4440GAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTGCATAAATAAAAAAAATTAGTCAGCCATGCATGGGG 4500CGGAGAATGGGCGGAACTGGGCGGAGTTAGGGGCGGGATGGGCGGAGTTAGGGGCGGGAC 4560TATGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGG 4620GGACTTTCCACACCTGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGC 4680TGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCCTAACTGACACACATTCCACAGAATTAATTCCCG 4740ATCCCGTCGACCTCGAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATT 4800GTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGG 4860GTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGT 4920CGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTT 4980TGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGC 5040TGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGG 5100ATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGG 5160CCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGAC 5220GCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTG 5280GAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCT 5340TTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGG 5400TGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCT 5460GCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCAC 5520TGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGT 5580TCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTC 5640TGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCA 5700CCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGAT 5760CTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCAC 5820GTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATT 5880AAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACC 5940AATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTG 6000CCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTG 6060CTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGC 6120CAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTA 6180TTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTG 6240TTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCT 6300CCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTA 6360GCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGG 6420TTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGA 6480CTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTT 6540GCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCA 6600TTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTT 6660CGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTT 6720CTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGA 6780AATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATT 6840GTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGC 6900GCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCT 6926表3.IL4.Y124D/IgG1融合分子编码区的DNA序列，1164bpSEQ ID No：3ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCGGCAAC 60TTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGC 120CTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCC 180AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTAC 240AGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCAC 300AAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTG 360AATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTA 420AAGACGATCATGAGAGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCGGTACCGAGCCCAAATCGGCC 480GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTC 540TTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACA 600TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGAC 660GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC 720CGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAG 780TGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA 840GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAG 900AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG 960TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC 1020GACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGG 1080AACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGC 1140CTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA 1164表4.被编码的IL4.Y124D/IgG1融合蛋白的序列，387aaSEQ ID No：4

1 MGLTSQLLPP LFFLLACAGN FVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKTLCTE

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251 QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPPEPQVYT LPPSRDELTK

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351 TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK^*表5.合成的IgG4 cDNA的DNA序列，1006bpSEQ ID No：5GCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAG 60AGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG 120TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA 180GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACC 240TACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCC 300AAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAATTTCTGGGGGGACCATCAGTC 360TTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACG 420TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGAT 480GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTAC 540CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAG 600TGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCATCGATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA 660GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCGTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAG 720AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAG 780TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC 840GACGGATCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGG 900AATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGC 960CTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGAGTGTAGTCTAGATCTACGTATG 1006表6.IL4.Y124D/IgG4融合分子编码区的DNA序列，1149bpSEQ ID No：6ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCGGCAAC 60TTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGC 120CTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCC 180AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTAC 240AGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCAC 300AAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTG 360AATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTA 420AAGACGATCATGAGAGAGAAAGACTCAAAGTGCTCGAGCGAGTCCAAATATGGTCCCCCA 480TGCCCATCATGCCCAGCACCTGAATTTCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCA 540AAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGAC 600GTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCAT 660AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC 720CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC 780AAAGGCCTCCCGTCATCGATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAG 840CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG 900ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG 960CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTC 1020CTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGC 1080TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTG 1140GGTAAATGA 1149表7.被编码的IL4.Y124D/IgG4融合蛋白的序列，382aaSEQ ID No：7

1 MGLTSQLLPP LFFLLACAGN FVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKTLCTE

51 LTVTDIFAAS KNTTEKETFC RAATVLRQFY SHHEKDTRCL GATAQQFHRH

101 KQLIRFLKRL DRNLWGLAGL NSCPVKEANQ STLENFLERL KTIMREKDSK

151 CSSESKYGPP CPSCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD

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251 GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL

301 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS

351 RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL GK^*表8.IgG4 PE变异体的DNA序列，984bpSEQ ID No：8GCTAGTACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAG 60AGCACgGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG 120TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA 180GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACC 240TACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCC 300AAATATGGTCCCCCATGCCCAcCATGCCCAGCgCCTGAaTTtgaGGGGGGACCATCAGTC 360TTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACG 420TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGAT 480GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTAC 540CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAG 600TGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCaTCgATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA 660GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAG 720AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAG 780TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC 840GACGGaTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGG 900AATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGC 960CTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA 984表9.IL4.Y124D/IgG4 PE融合分子编码区的DNA序列，1149bpSEQ ID No：9ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCGGCAAC 60TTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGC 120CTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCC 180AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTAC 240AGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCAC 300AAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTG 360AATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTA 420AAGACGATCATGAGAGAGAAAGACTCAAAGTGCTCGAGCGAGTCCAAATATGGTCCCCCA 480TGCCCACCATGCCCAGCgCCTGAATTTGAGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCA 540AAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGAC 600GTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCAT 660AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC 720CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC 780AAAGGCCTCCCGTCaTCgATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAG 840CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG 900ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG 960CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGaTCCTTCTTC 1020CTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGC 1080TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTG 1140GGTAAATGA 1149表10.被编码的IL4.Y124D/IgG4 PE变异体融合蛋白的序列，382aaSEQ ID No：10

1 MGLTSQLLPP LFFLLACAGN FVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKTLCTE

51 LTVTDIFAAS KNTTEKETFC RAATVLRQFY SHHEKDTRCL GATAQQFHRH

101 KQLIRFLKRL DRNLWGLAGL NSCPVKEANQ STLENFLERL KTIMREKDSK

151 CSSESKYGPP CPPCPAPEFE GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD

201 VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN

251 GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPPE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL

301 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS

351 RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL GK^*

Claims

1.一种具有IL4和/或IL13拮抗剂活性或部分拮抗剂活性的可溶性蛋白，它包含与至少一个人类免疫球蛋白的恒定区融合的IL4.Y124D，其中免疫球蛋白选自IgG、IgG1、IgG4和IgG4 PE。

2.根据权利要求1的可溶性蛋白，其中天然存在于野生型IL4中第120至128位中任一位置的至少一个氨基酸被不同的天然氨基酸替代。

3.根据权利要求2的可溶性蛋白，其中天然存在于第124位的酪氨酸被天门冬氨酸替代。

4.根据权利要求1的可溶性蛋白，其中恒定区来自人类IgG重链。

5.根据权利要求1的可溶性蛋白，其中恒定区来自人类IgG4重链。

6.根据权利要求1的可溶性蛋白，其中恒定区来自人类IgG4 PE重链。

7.根据权利要求1的可溶性蛋白，它具有SEQ ID No：4，SEQ IDNo：7或SEQ ID No：10所示的氨基酸序列。

8.一种制备上述权利要求中任一权项的可溶性蛋白的方法，该方法包括在重组宿主细胞中表达编码该可溶性蛋白的DNA及回收产物。

9.根据权利要求8的方法，它包括：

i)制备一种可复制表达载体，它能在宿主细胞中表达包含编码所述可溶性蛋白的核苷酸序列的DNA聚合体；

ii)用该载体转化宿主细胞；

iii)在允许表达DNA聚合体以生产所述可溶性蛋白的条件下培养转化的宿主细胞；以及

iv)回收所述可溶性蛋白。

10.一种DNA聚合体，它包含编码权利要求1至7中任一权项的可溶性蛋白的核苷酸序列。

11.根据权利要求10的DNA聚合体，它包含SEQ ID No：3，SEQ IDNo：6或SEQ ID No：9的序列或由其组成。

12.包含权利要求10的DNA聚合体的可复制表达载体。

13.用权利要求12的可复制表达载体转化的宿主细胞。

14.一种药物组合物，它包含权利要求1至7中任一权项的可溶性蛋白和药用载体。

15.根据权利要求1至7中任一权项的可溶性蛋白在生产一种药剂时的应用，该药剂被用于治疗由IL4和/或IL13的不良作用引起的疾病。