CN109722437B

CN109722437B - 一种通用型car-t细胞及其制备方法和用途

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Publication number: CN109722437B
Application number: CN201811633907.6A
Authority: CN
Inventors: 李光超; 罗敏; 莫文俊; 周兆; 邱玉信; 丁雯
Original assignee: Guangzhou Bio Gene Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Bio Gene Technology Co Ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2020-01-07
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109722437A

Abstract

本发明提供了一种sgRNA或PTG(Polycistronic tRNA‑gRNA)，结合CRISPR‑Cas9技术可以敲除T细胞抗原受体(TCR)，或者主要组织相容性复合体(MHCⅠ)及免疫抑制分子相关基因中的一个或多个。本发明还提供了一种表达嵌合抗原受体(CAR)，且不表达TCR的通用型CAR‑T细胞及其制备方法。本发明制备得到的通用型CAR‑T细胞适用异种受体，具有通用性，同时具有更强的杀伤力。

Description

一种通用型CAR-T细胞及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药、生物细胞学和分子生物学领域，涉及免疫治疗领域。具体地，涉及采用sgRNA或PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)敲除T细胞的一个或多个基因，并引入嵌合抗原受体(CAR)，以获得功能增强的通用型CAR-T细胞。

背景技术

近几年，肿瘤免疫治疗进入了快速发展阶段，CAR-T疗法作为其中一种重要的方法在血液学恶性肿瘤治疗中取得了非常令人鼓舞的结果。目前，国内越来越的企业、医院及学术机构加入到这一研究领域中，共同推进CAR-T疗法的发展，探索更为广泛的潜在应用价值。

目前，在嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗领域，主要是采用自体的CAR-T细胞进行治疗，基本过程是采集患者自己的外周血，分离T细胞，并完成CAR-T细胞的制备和回输。因受限于免疫系统自身的某些限制性因素，如CAR-T异体回输时由于免疫原性等原因导致的免疫排斥、移植物抗宿主反应(GVHD)等，这将限制CAR-T细胞治疗技术广泛性和便捷性应用，同时也在一定程度上提高了该技术的成本，另外，对于婴儿患者、或者70岁以上的老年患者，或者一些经过多次放化疗而摧毁免疫系统或者使T细胞功能弱化的肿瘤患者，其自体的T细胞的质量和数量达不到要求，是不适合制备CAR-T进行肿瘤治疗的。所以，通用型CAR-T技术将是今后的一个方向，在基因编辑技术如ZFN(zinc-finger nucleases)、TALEN(transcription activator-like effector nucleases)和CRISPER-Cas9等的进步下，如果能够实现对健康供体来源的T细胞TCR及其他导致不同个体间免疫原性的基因的敲除，将会使CAR-T这一技术真正成为一种活的药物，进而能够广泛而方便的供合适的患者使用，实现CAR-T细胞治疗的产业化，并极大地降低成本。

目前，已研究出通用型的CAR-T(universal-CAR-T,uCAR-T)细胞。如Cellectis的UCART19也是一种同种异体CAR-T细胞疗法，基于Talen基因编辑TCR-α链的表达，不需要依据患者进行相应修饰，而是直接将来源于非患者(non-patient)供体的T细胞进行工程化，用于多个患者的治疗。通用型的CAR-T细胞也并非完美无缺，如存在供体隐匿性感染问题；基因的敲除并不能完全消除双相排斥作用；uCAR-T细胞库的数量、复苏和代次问题，对临床应用和治疗效果会有一定的影响；基因的“脱靶”效应可能会影响一些潜在的安全性问题。面对这些可能存在的问题，许中伟、黄晓军等人则没有采用基因编辑，而是采集患者的亲属的健康T细胞，该种方法无需细胞的冷冻复苏，无需抽患者血液，同时适度的GLV的存在也可以增强T细胞的杀伤力。

T细胞(抗原)受体(T cell receptor,TCR)为所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR的作用是识别抗原。TCR是由两条不同肽链构成的异二聚体，由α、β两条肽链组成，分别由TRAC和TRBC基因表达。TCR敲除的T淋巴细胞在回输入同种异体病人时不会引起移植物抗宿主病(GVHD)。

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)是一组编码哺乳动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。人类的MHC也叫做HLA(human leukocyteantigen,HLA)复合体。由于MHC的多基因特性，依据其编码分子的结构、组织分布与功能差异，可分为MHC-I类、MHC-II类、MHC-III类基因，分别编码MHC I类分子、MHC II类分子、MHCIII类分子。MHC-I类分子的功能是递程非己蛋白的肽片段给细胞毒T细胞，然后立即触发机体的免疫反应以杀死外来入侵物质。而正常供体T细胞上也表达有MHC-I类分子，受体T细胞表面的TCR受体可识别正常供体T细胞上的MHC-I类分子进而将供体T细胞杀死。B2M分子是MHC-I类分子的组成部分，敲掉供体T细胞上的B2M基因可避免受体的TCR对供体T细胞上的MHC-I类分子的免疫反应。

T细胞免疫抑制受体主要包含了PD1(程序性死亡分子-1)、CTLA-4(细胞毒性淋巴细胞相关抗原4)、TIM-3(T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3),LAG-3(淋巴细胞活化基因-3)和BTLA(B和T淋巴细胞弱化子)等。具体地，PD1分子一旦接触肿瘤细胞就会与PD-L1结合，而PD-L1会传递一种抑制信号给T细胞，抑制T细胞的活化和杀伤能力。CTLA-4(细胞毒T淋巴细胞相关抗原4，又名CD152)是一种白细胞分化抗原，是T细胞上的一种跨膜受体，与CD28共同享有B7分子配体，而CTLA-4与B7分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。TIM-3，LAG-3和BTLA也通过多种方式抑制T细胞的免疫应答。T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)后，其免疫抑制受体(PD1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3和BTLA等)表达升高。T细胞由于免疫抑制受体的存在，杀伤力有限，而敲除免疫抑制相关基因，可打破这种免疫抑制效应，增强CAR-T细胞功能。

CAR-T细胞是目前过继免疫治疗令人振奋的成就之一，在临床治疗上取得了显著成功。目前，通常因为之前的化疗或造血干细胞移植而T细胞缺损，许多患者可能遇到疗效降低的情况。利用同种异体供体来源的T细胞发展通用型产品，用来提供给那些因淋巴细胞数量较低或质量较差(以及体外扩增能力低)而没有机会进行自体细胞输注的患者。同时，由于CAR-T疗法是针对每位患者进行个性化治疗，可能会产生昂贵的成本，因此价格高昂。在理想情况下，通用的现成的产品可抵消如今临床试验进行单个细胞制剂所需成本。

因此，实现CAR-T细胞的异体治疗，增强其通用性和杀伤力是目前CAR-T细胞疗法亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以高效敲除目的基因的sgRNA。

本发明的目的还在于提供一种可以同时高效敲除多个目的基因的PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)。

本发明的目的在于提供一种通用型的CAR-T细胞。

本发明的进一步目的在于提供一种杀伤力强的通用型CAR-T细胞。以使更多患者获得更好的治疗效果。

本发明的上述目的通过以下技术手段实现：

一方面，本发明提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向TCR基因，其选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4中的任意一条；优选地，其选自SEQ ID NO:4所示的序列。

或者，所述的sgRNA靶向B2M基因，其选自SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:7中的任意一条；优选地，其选自SEQ ID NO:6所示的序列。

或者，所述的sgRNA靶向PD1基因，其选自SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:11中的任意一条；优选地，其选自SEQ ID NO:11所示的序列。

sgRNA(small guide RNA简称)，是CRISPR基因敲除或敲入系统中重要的组成部分，早先发现的guide RNA，由tracRNA和crRNA两部分组成，两部分融合表达后的sgRNA也能很好的行使guide RNA的功能，通过与cas9酶结合，引导cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。

另一方面，本发明提供了一种多位点编辑的PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)，其含有上述的sgRNA中的至少任意一条。

应用内源性tRNA的加工原理，PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)可实现同时生成多个gRNA，结合Cas9/gRNA达到多基因编辑的目的。

为了从一个初级转录本里同时获得多个gRNA，发明人间隔串联多个gRNA形成一个PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)序列结构，通过内源性RNA酶识别，将这个转录本切割生成单个gRNA，同时生成多个gRNA。通过图11所示的结构，将多个基因的gRNA插入到tRNA之间，可实现同时转录产生特异性靶向多个基因座的gRNA序列，引导cas9蛋白实现多个基因的定点切割，达到同时敲除多个基因的目的。

PTG作用机制具体可参考文献：Xie K,Minkenberg B,Yang Y.Boosting CRISPR/Cas9mμLtiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2015,112(11):3570-3575.

目前，PTG技术已被用于敲除水稻的MAPKs基因(丝裂原活化蛋白激酶基因)和PDS基因(八氢番茄红素脱氢酶基因)等，在人T细胞上面暂未有发现针对本发明的基因进行应用。如何实现多个目标基因同时有效地敲除，以及提高T细胞的敲除效率为最大的技术难题之一。

作为一优选的实施方式，所述的PTG含有SEQ ID NO:4所示的序列，其可以编辑TRBC基因。

作为另一优选的实施方式，所述的PTG含有SEQ ID NO:6所示的序列，其可以编辑B2M基因。

作为另一优选的实施方式，所述的PTG含有SEQ ID NO:11所示的序列，其可以编辑PD1基因。

作为另一优选的实施方式，所述的PTG含有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6所示的序列，其可以同时编辑TRBC和BM2基因。

作为另一优选的实施方式，所述的PTG含有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11所示的序列，其可以同时编辑TRBC和PD1基因。

作为另一优选的实施方式，所述的PTG含有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:11所示的序列，其可以同时编辑TRBC、BM2和PD1基因。

作为另一优选的实施方式，所述的PTG含有SEQ ID NO:12所示的序列，其可以编辑TRBC基因。

作为另一优选的实施方式，所述的PTG含有SEQ ID NO:13所示的序列，其可以同时编辑TRBC和BM2基因。

作为另一优选的实施方式，所述的PTG含有SEQ ID NO:14所示的序列，其可以同时编辑TRBC和PD1基因。

作为另一优选的实施方式，所述的PTG含有SEQ ID NO:15所示的序列，其可以同时编辑TRBC、BM2和PD1基因。

经实验证实，上述的PTG可以高效敲除目的基因。

除了上述的序列或者sgRNA，本发明的PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)还可以包含靶向其他目的基因的一个或多个sgRNA，用于同时编辑更多的基因。

另一方面，本发明还提供了包含上述sgRNA或PTG(PolycistronictRNA-gRNA)的载体。作为可实施的方式，所述的载体选自逆转录病毒、慢病毒或仙台病毒。在本发明示范性的实施例中，所述的载体选自慢病毒。

另一方面，本发明还提供了包含上述sgRNA/PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)/载体的试剂盒。

另一方面，本发明还提供了上述的sgRNA/PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)/载体/试剂盒制备的细胞。所述的细胞为人细胞。

所有人细胞的基因组上均同时含有这三个基因。T细胞(抗原)受体(T cellreceptor,TCR)为所有T细胞表面的特征性标志；PD1分子持续性表达于T、B淋巴细胞、骨髓细胞并上调于活化的T细胞表面；B2M分子是所有有核细胞的MHC-I类分子的组成部分。因此，作为优选的实施方式，所述的细胞为T细胞。

另一方面，本发明还提供了上述的sgRNA/PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)/载体/试剂盒在构建通用型CAR-T细胞中的应用。其中，所述的通用型CAR-T细胞敲除TCR，B2M，PD1中任意一个或多个基因；作为优选的实施方式之一，所述的通用型CAR-T细胞敲除TCR基因；作为另一优选的实施方式，所述的通用型CAR-T细胞敲除TCR和B2M基因，或者TCR和PD1基因；作为另一优选的实施方式，所述的通用型CAR-T细胞同时敲除TCR，B2M和PD1基因。

另一方面，本发明尤其提供了一种通用型CAR-T细胞，所述的细胞采用SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12任一所示的序列敲除TCR基因；作为优选地，采用SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:12所示的序列敲除TCR基因。

作为优选的实施方式，所述的通用型CAR-T细胞还敲除了B2M和/或PD1基因。具体地，可采用SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:7任一所示的序列敲除B2M基因，采用SEQ ID NO:8-SEQID NO:11任一所示的序列敲除PD1基因。

或者，作为优选的实施方式，采用SEQ ID NO:13所示的序列敲除TCR和B2M基因。

或者，作为优选的实施方式，采用SEQ ID NO:14所示的序列敲除TCR和PD1基因。

作为更优选的实施方式，采用SEQ ID NO:15所示的序列敲除TCR、B2M和PD1基因。

上述的CAR-T细胞，其嵌合抗原受体(CAR)的作用靶点无特别限制，现有技术中的作用靶点中的一种或几种即可。作为示范性的实施方式，所述的CAR-T细胞的嵌合抗原受体(CAR)靶向分子包括但不限于以下群组：CD19、CD20、CD22、ROR1、BCMA、MUC-1、CLDN18.2、GPC3、CD174、HER2、GD2、CD33、CD38、CD138、CD123、CD30、EGFR、EGFRvIII、PSMA、Mesothelin、FAP、CEA、CD171、Glypican 3、IL-13R、PSCA、CD123、CD133、CA125、EphA2、C-met、L1CAM、VEGFR、CS1、ROR1、EC、NY-ESO-1、MUC16、LewisY、EPG、DLL3、CD99、5T4、CAIX。

作为本发明中一种优选的实施方式，所述CAR靶向CD19。

作为更优选的实施方式，所述的CAR具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:17所示的核酸序列。

另一方面，本发明还提供了上述的通用型CAR-T细胞的制备方法，其包括以下步骤：

1)得到活化的T细胞；

2)用编码靶向不同疾病分子的CAR的慢病毒载体来转染步骤1)的T细胞，获得靶向不同疾病分子的CAR-T细胞；

3)将步骤2)获得的CAR-T细胞通过CRISPR/Cas9系统的方法进行包括TCR基因，TCR和B2M基因，TCR和PD1基因，或者TCR、B2M和PD1基因的敲除获得通用型CAR-T细胞；

其中，步骤2)CAR的引入和步骤3)基因敲除顺序可互换或同时进行。

另一方面，本发明还提供了上述的sgRNA/PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)/载体/试剂盒/细胞/方法在制备治疗肿瘤和自身免疫性疾病的药物中的应用，尤其是在制备异体治疗药物中的应用。

作为优选的实施方式，所述的肿瘤选自CD19阳性的肿瘤。

或者优选地，所述的肿瘤选自B细胞系恶性肿瘤；更优选地，B细胞系恶性肿瘤包括但不限于以下群组：非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤；

优选地，所述的自身免疫疾病包括但不限于以下群组：急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham′s chorea)、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺体综合症、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨诺-许兰二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感染后肾炎(post-streptococcal nephritis)、结节性红斑、高安氏动脉炎、艾迪生氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、肉状瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture′s syndrome)、血栓闭塞性脉管炎(thromboangitisubiterans)、斯耶格伦综合征(Sjogren′s syndrome)、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′s granμLomatosis)、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、银屑病和纤维性肺泡炎。

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含上述的通用型CAR-T细胞。作为优选的实施方式，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明的有益效果：

1.本发明提供了的sgRNA，能高效地敲除TCR，B2M和PD1基因，其敲除率最高可分别达到97.89％，98.52％和97.81％。

2.本发明提供PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)，其可以同时高效地敲除TCR，以及B2M和/或PD1基因，不但不影响CAR的表达，非显而易见地，增加CAR的表达量，且同时增加CAR-T的杀伤力。

3.本发明的通用型CAR-T细胞：1)避免了转导的T细胞出现GVHD以及潜在的TCR受体信号干扰。2)敲除了免疫抑制分子，增强了CAR-T细胞的活性和杀伤功能；3)敲除了MHC分子的表达，避免了被受体免疫系统清除；CAR-T相对其他细胞免疫疗法具有显著优势，但费用高、自体供给难以量产是限制CAR-T应用的关键性瓶颈。本发明可利用健康供体来源的T细胞开发通用型CAR-T，无需患者本身的T细胞，其有以下特点：

第一，使用CRISPRcas9定向敲除免疫排斥反应的相关基因(TCR和MHC)，避免了输入同种异体的T细胞出现的GVHD以及潜在的TCR受体信号干扰，从而实现异体治疗。用同种异体供体来源的CAR-T细胞用来发展通用型产品，用来提供给那些因淋巴细胞数量较低或质量较差(以及体外扩增能力低)而没有机会进行自体细胞输注的患者。

第二，利用CRISPR高效敲除PD1等免疫抑制基因，有望克制抑制信号，提高CAR-T细胞功能，进一步清除残留的肿瘤细胞。

第三，本发明可适用于治疗移植后复发的患者。对于移植后复发的患者，国内外尚无有效的治疗手段。本发明基于健康供体T细胞的“通用型嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)免疫疗法首次提出对移植后复发的患者进行CAR-T细胞治疗。由于患者接受了供体的骨髓造血干细胞移植，这部分患者复发后，我们直接用健康供体的T细胞进行修饰后的细胞治疗：1)使用CRISPR-cas9定向敲除免疫排斥反应的相关基因，降低免疫排斥，实现异体细胞治疗；2)敲除PD1基因，克服T细胞抑制信号，提高疗效；3)转入嵌合抗原受体(CAR)，从而实现靶向治疗。

附图说明

图1为通用型CAR-T治疗过程示意图。

图2为Lenti-PTG-4慢病毒载体图谱和元件。

图3为抗CD19CAR慢病毒载体图谱。

图4为基因敲除实验流程图。

图5为通用型CAR-T杀伤试验流程图。

图6为TCR单基因敲除效率分析。

图7为B2M单基因敲除效率分析。

图8为PD1单基因敲除效率分析。

图9为感染Lenti-PTG-4的通用型CAR-T的表达检测。

图10为LDH法检测CAR-T细胞的杀伤能力。

图11为LISA检测CAR-T细胞的分泌IFN-gama能力。

图12为TG结构和作用机制；

注：PTG结构：箭头代表LentiCRISPRv2载体上RNA聚合酶III的启动子；tRNA基因上的“A box”和“B box”代表tRNA基因的内源性转录元件，是转录因子IIIC的结合位点，负责招募TFIIIB和Pol III酶进行起始转录，它们广泛存在于各种植物和动物细胞中；各gRNA基因序列包含两部分，正方块形代表不同的特异性靶向序列sgRNA(20bp)，长方形代表着保守的gRNA骨架区；“TTTTTTT”代表RNA聚合酶III的转录终止信号。

实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

在本发明中，sgRNA和gRNA表示同样的意思。

实施例1单基因敲除慢病毒载体的构建

a.设计Oligo DNA引物：针对T细胞受体TRAC(α链)和TRBC(β链)基因的第一个外显子序列，PD1受体基因信号肽区域和Ig-like V-Type区域，B2M基因第2个外显子分别设计Oligo DNA引物，引物序列如下表2：

表1单基因敲除的sgRNA序列表

表2 Oligo DNA引物

b.分别将Oligo1和Oligo2退火和磷酸化形成双链DNA，退火和磷酸化体系如下：

逐步冷却退火(step down)程序设定：37℃30min，95℃5min，90℃1min，85℃1min，80℃1min，75℃1min，70℃1min，65℃1min，60℃1min，55℃1min，50℃1min，45℃1min，40℃1min，35℃1min，30℃1min，25℃1min。

c.反应体系稀释200倍后与LentiCRISPRv2载体(LentiCRISPRv2质粒经BsmBI内切酶酶切后回收的大片段)连接，连接体系如下：

d.转化感受态stbl3后挑取单克隆验证，随机挑选一个阳性克隆送样测序使用通用引物U6进行测序(广州艾基生物技术有限公司)。将正确插入的克隆摇菌提取质粒获得单基因敲除慢病毒载体。

表3单基因敲除慢病毒载体

TCR基因敲除载体	B2M基因敲除载体	PD1基因敲除载体
			Lenti-sg-TRAC-1	Lenti-sg-B2M-1	Lenti-sg-PD1-1
Lenti-sg-TRAC-2	Lenti-sg-B2M-2	Lenti-sg-PD1-2
			Lenti-sg-TRBC-1	Lenti-sg-B2M-3	Lenti-sg-PD1-3
Lenti-sg-TRBC-2		Lenti-sg-PD1-4

实施例2多基因敲除慢病毒载体的构建

PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)结构是间隔串联多个gRNA的序列结构，PTG结构可插入LentiCRISPRv2载体中U6启动子的下游。两个sgRNA串联和三个sgRNA串联的PTG序列插入到基因敲除慢病毒载体LentiCRISPRv2，从而得到同时表达多个sgRNA的基因敲除载体，从而实现同时敲除多个基因的目的。图2为Lenti-PTG-4慢病毒载体图谱和元件。

表4多基因敲除的PTG包含的sgRNA序列信息表

表5多基因敲除的PTG序列表

表6多基因敲除慢病毒载体

实施例3抗CD19CAR慢病毒载体构建

抗CD19嵌合抗原受体(CAR)结构包括一个CD19抗原结合区(来源于鼠源单克隆CD19抗体FMC63的单链可变区scFv)，一个CD8α胞外铰链区，一个CD8α跨膜区，一个4-1BB胞内共刺激域和一个CD3ζ激活信号域，其氨基酸序列见SEQ ID NO:16，核酸序列见SEQ IDNO:17。序列全长1458bp，共486个氨基酸。CAR融合蛋白的氨基酸序列通过人种属的密码子优化，得到核酸序列，包含N端的kozak序列(GCCGCCACC)和C端的TAA终止密码子。该CAR融合基因序列位于限制性内切酶EcoRI和BamHI之间，得到慢病毒表达载体pCDH-CAR19的全质粒核酸序列(7905bp)。见图3：抗CD19CAR慢病毒载体图谱。

SEQ ID NO:16抗CD19CAR的氨基酸序列

MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO:17抗CD19CAR的核酸序列

ATGGCACTGCCAGTGACAGCCCTGCTGCTGCCACTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCACGCCCTGACATCCAGATGACACAGACCACAAGCTCCCTGTCCGCCTCTCTGGGCGACAGAGTGACCATCTCTTGCAGGGCCAGCCAGGATATCTCCAAGTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGATGGCACAGTGAAGCTGCTGATCTATCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCTTCCAGGTTCAGCGGCTCCGGCTCTGGCACAGACTACTCTCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGATATCGCCACCTATTTCTGCCAGCAGGGCAATACACTGCCTTACACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTtGAGATCACCGGCGGCGGCGGCTCTGGAGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCTCCGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCTGGACTGGTGGCACCAAGCCAGTCCCTGTCTGTGACATGTACCGTGTCCGGCGTGTCTCTGCCAGACTACGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCACCTAGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCTCTGAGACCACATACTATAATTCCGCCCTGAAGTCTCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGTCCCAGGTGTTTCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACAGACGATACCGCCATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTATTACGGCGGCTCTTATGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACCGTGTCTAGCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAGAGAGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGCCCCGTGCAGACAACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGTCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAGGGAGGATGTGAGCTGAGGGTGAAGTTTTCTCGGAGCGCCGATGCACCAGCATATcAGCAGGGACAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGCAGGCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGATAAGCGGAGAGGCAGAGATCCCGAGATGGGAGGCAAGCCAAGGAGGAAGAACCCTCAGGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCTGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGGAGAAGGGGCAAGGGACACGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACAGCCACCAAGGACACCTACGATGCACTGCACATGCAGGCCCTGCCACCTAGGTAGTA

实施例4慢病毒包装

a.293T细胞接种密度为4×10^5/mL，转染前1h将细胞培养基更换为无血清的DMEM培养基。

b.质粒PEI混合物制备和转染：在无菌EP管中，用无血清的Opti-MEM培养基稀释质粒DNA。病毒包装体(psPAX2)：病毒包膜(pMD2G):重组质粒DNA(基因敲除载体或者抗CD19CAR慢病毒载体)＝2:1:2，转染试剂PEI与DNA(ug)的混合比例为3:1。将PEI加入到已稀释的总DNA中，室温孵育20min后加入到T75瓶的细胞中，4h后换成含2％血清的DMEM培养基中继续培养。

c.病毒上清的收集和浓缩：转染48小时后收获含病毒的上清液，3500rmp离心20min后收集病毒上清，使用0.45μm的滤膜过滤病毒上清到15mL的AmiconUltra-100kDa(Millipore)超滤管中，4000rmp离心10min后收集病毒浓缩液冻存于-80℃冰箱中备用。

d.慢病毒滴度检测：慢病毒滴度用慢病毒滴度ELISA检测试剂盒(HIV p24)按照说明书检测。慢病毒滴度计算方法：p24蛋白是慢病毒外壳中含量最大的标志性蛋白，一个慢病毒颗粒(Lentiviral Particle,LP)中约有2000个p24蛋白分子，用以下公式可以计算慢病毒载体的颗粒数(LP)：一个LP相当于：2000×24×10e3/(6×10e23)g of p24＝8×10e-5pg of p24；或者说，1ng p24＝1.25×10e7LPs(≈1.25×10e4-5TU)，正常情况下，每100-1000LPs中会有1个具有感染活性的病毒载体，即1TU。我们设定比值为500，即500LPs中会有1个具有感染活性的病毒载体(1TU)。注意：上述公式计算得到的LP值是理论值，检测样品中可能含有的游离的p24蛋白可能会使该值偏高。

表7慢病毒包装及其滴度情况

慢病毒名称	载体	滴度(TU)	保存
				LV-TRAC-1	Lenti-sg-TRAC-1	3.31×10^7/mL	-80℃
LV-TRAC-2	Lenti-sg-TRAC-2	2.45×10^7/mL	-80℃
				LV-TRBC-1	Lenti-sg-TRBC-1	4.24×10^7/mL	-80℃
LV-TRBC-2	Lenti-sg-TRBC-2	3.68×10^7/mL	-80℃
				LV-B2M-1	Lenti-sg-B2M-1	2.69×10^7/mL	-80℃
LV-B2M-2	Lenti-sg-B2M-2	2.10×10^7/mL	-80℃
				LV-B2M-3	Lenti-sg-B2M-3	2.83×10^7/mL	-80℃
LV-PD1-1	Lenti-sg-PD1-1	3.84×10^7/mL	-80℃
				LV-PD1-2	Lenti-sg-PD1-2	3.32×10^7/mL	-80℃
LV-PD1-3	Lenti-sg-PD1-3	3.16×10^7/mL	-80℃
				LV-PD1-4	Lenti-sg-PD1-4	2.98×10^7/mL	-80℃
LV-PTG-1	Lenti-PTG-1	2.33×10^7/mL	-80℃
				LV-PTG-2	Lenti-PTG-2	3.42×10^7/mL	-80℃
LV-PTG-3	Lenti-PTG-3	2.13×10^7/mL	-80℃
				LV-PTG-4	Lenti-PTG-4	2.82×10^7/mL	-80℃
LV--CAR19	pCDH-CAR19	2.65×10^7/mL	-80℃

实施例5单基因敲除效率

为了选取最优sgRNA用于制备通用型CAR-T细胞，我们用慢病毒感染Jurkat细胞，进而比较单个基因候选sgRNA的敲除效率。1×10^6个Jurkat细胞先于polybrene(8μg/ml)混合后，接种于24孔板，用上述慢病毒颗粒感染将病毒加入细胞，病毒感染复数(MOI)为20。24h之后更换不含polybrene的新鲜细胞培养基。为了验证PD1基因的敲除效率，Jurkat细胞在病毒感染后(第3天)，用10μg/mL植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)刺激，于第10天检测基因敲除的效率。敲除效率＝(A-B)/A×100％；A为对照组表达阳性率；B为敲除组表达阳性率。结果显示，sg-TRBC-2(SEQ ID NO:4)敲除TCR基因效率最高，敲除效率达到97.89％，见图6；sg-B2M-2(SEQ ID NO:6)敲除B2M基因效率最高，敲除效率达到98.52％，见图7；sg-PD1-4(SEQ ID NO:11)敲除PD1基因效率最高，敲除效率达到97.81％，见图8。

表8单基因敲除效率

实施例6多基因敲除效率检测

我们选取单基因敲除效率最高的sgRNA，构建多基因敲除的PTG载体，包装慢病毒，感染Jurkat细胞，检测各个基因的敲除效率。用于多基因敲除的PTG慢病毒载体的基因敲除情况如下：

表9多基因敲除效率

实施例7通用型CAR-T细胞制备

以制备通用型抗CD19的CAR-T细胞(UCAR-T19-PTG4)为例。

1.T细胞分离培养(第-2天)：

将血液从抽血管内移到15mL离心管中，室温700×g离心5min(离心机设置加速9，减速2)。抽取上层血清至新的15ml离心管，在56℃水浴灭活30分钟，配平离心，室温1200×g离心5min(离心机设置加速9，减速9)。将上清转移到另一新的15mL离心管，存放在4℃冰箱备用。用PBS缓冲液按照1:1稀释外周血，混匀。在新的15ml离心管中加入5～6mL室温的人淋巴细胞分离液，然后将15mL管倾斜约45度，用胶头滴管转移6mL稀释后的外周血至分离液面上，滴管开口应压在管壁、伸至分离液面上方约0.5cm处，沿管壁逐一滑落至分离液面上，注意不要冲破液面。配平离心，室温800×g离心20min(离心机设置加速9，减速1)。离心完后用1mL移液器在白膜层上直接吸取，共吸取3次(每管约3mL)，白膜层收集在50ml离心管中，加入3倍体积的PBS清洗细胞，室温300×g离心5min(离心机设置加速9，减速9)。去除上清，只保留沉到管底的细胞。用5mL PBS重悬细胞，用2ml PBS收集剩余细胞于管中，取20μL样品用于细胞计数。室温300×g离心5min(离心机设置加速9，减速9)。去除上清，只保留沉到管底的细胞。

2.PBMC刺激/培养(第-2天)：

细胞培养条件：恒温37℃，CO₂浓度为5％，相对饱和湿度为95％。将CompleteGT-T551H3细胞培养液提前放置至室温，根据上述细胞计数，稀释细胞密度至2×10^6/mL加入培养瓶中，添加IL-2(250U/mL)，OKT-3(5μg/mL OKT-3)，细胞混匀后在37℃，5％CO₂浓度的培养箱中培养。

3.观察(第-1天)：

显微镜下观察细胞状态，尽量不要摇晃，细胞放平：恒温37℃，5％CO₂浓度，相对饱和湿度95％继续培养。

4.慢病毒感染(第0-1天)：

T细胞吹匀后收集到15mL离心管，室温300×g离心5min(离心机设置加速9，减速9)。去除上清，只保留管底的细胞。每管用1mL Complete GT-T551H3细胞培养液重悬后汇集到一个新的15mL离心管中，取10μL稀释后计数，将细胞密度调整为5×10^6/mL，在24孔板中每孔加入200μL稀释后的细胞。冷藏病毒于37℃水浴中迅速解冻，用75％酒精清洁后放入安全柜。收集所有的慢病毒载体于15mL离心管中，混匀，根据预设的MOI值加入相应慢病毒的量，混匀后细胞平放，于37℃，5％CO₂浓度，95％相对饱和湿度的培养箱中培养过夜。为了抗CD19的通用型CAR-T细胞(UCAR-T19-PTG4)，第0天用lenti-PTG-4敲除载体的病毒感染T细胞，第1天再用抗CD19的CAR载体的病毒感染T细胞。为了制备未经基因敲除的抗CD19的CAR-T(CAR-T19)，只在第1天用抗CD19的CAR载体的病毒感染T细胞。未经转导的T细胞(T mock)为对照T细胞。

表10 CAR-T细胞列表

5.细胞扩培(第1-10天)：

收集细胞，300g室温离心5min，去除上清。加入1mL培养液重悬后，取10μL稀释10倍后计数。如细胞大于0.7×10^6/mL，添加培养液+IL-2稀释至0.5×10^6/mL。如细胞数小于0.7×10^6/mL，添加培养液+IL-2稀释至0.3×10^6/mL。细胞平放，恒温37℃，CO₂％浓度5％，相对饱和湿度95％中继续培养。

6.CAR-T细胞表型检测/冻存(第10天)：

将T细胞以300g/min，离心5min，弃尽上清以收集细胞；将细胞调整密度为1×10^6个/ml；将收集的细胞分别分装利用流式细胞术检测Protein-L阳性率以检测通用型CAR-T细胞CAR表达阳性率，PBS清洗2次洗去多余未结合Protein-L抗体后标记TCR，B2M，PD1抗体检测TCR，MHC-I类分子及PD1的表达水平，剩余细胞可以冻存。

检测结果如图9所示，未进行基因敲除的抗CD19的CAR-T(CAR-T19)分别表达CD3(98.75％)，B2M(96.30％)，PD1(76.80％)；而通用型抗CD19的CAR-T细胞(UCAR-T19-PTG4)细胞表面的TCR、B2M和PD1分子的表达得到有效抑制，只有51.40％的CD3的表达，60.72％的表面B2M分子的表达及32.15％比例的PD1的表达。

CD3阴性筛选出的细胞经FACS确定细胞的纯度，如图9所示，CD3表达率为0％，B2M表达率为9.59％，PD1的表达率为2.09％。

如图9所示，CAR-T19有42.50％的CAR19表达，CD3阴性筛选的UCAR-T19-PTG4有45.00％的CAR19表达，表明本发明所采用的方法同时敲除3个基因效率高不但不影响CAR表达，非显而易见地，CAR表达具有少量的增加。

实施例8 LDH法检测CAR-T细胞的杀伤能力(第7～10天)

A.T细胞(第10天)与靶细胞共培养

1)收获通用型抗CD19的CAR-T细胞(UCAR-T19-PTG4)，未进行基因敲除的抗CD19的CAR-T(CAR-T19)，以及未转导的T细胞(T mock)。将T细胞分别收集到15mL离心管，300×g离心，3min。靶细胞为K562和K562-CD19(表达CD19的K562稳转细胞系)。

2)T细胞用1mL GT-T551H3(无血清)重悬，靶细胞用1mL GT-T551H3(无血清)重悬。取10～30μL样品与用台盼蓝(Trypan Blue)溶液稀释10倍(视细胞浓度而定)混合，抽取样品至血球计数板，或COUNTSTAR计数器计数。

3)用无血清GT-T551H3，将靶细胞分别稀释至2×10^5cells/mL。在圆底96-孔板中，每孔加50μL＝10,000/每孔。每种条件做3个复孔。

4)用无血清GT-T551H3，分别将T细胞稀释至2×10^6cells/mL(如有4个细胞系+1个T单独细胞背景，每个条件3个复孔。

5)加入T细胞(50μL＝1×10^5/每孔)到靶细胞中，效靶比为10:1。每种条件做3个复孔。

6)细胞放回培养箱，37℃，5％CO₂，培养4小时。

7)注意：需提前1小时裂解total lysis样品。

B.LDH检测(具体测定方式参考：碧云天的乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(L D HCytotoxicity Assay Kit)，产品编号C0017)

1.从-20℃解冻Assay Buffer和substrate mix(需用箔纸遮光)至室温(AssayBuffer可用37℃水浴)。如解冻后的Assay Buffer有沉积物，可将buffer离心，300×g,5min,升9降9，后只取上清。剩余buffer必须放回-20℃保存。

2.取12mL buffer稀释一管substrate mix，混合成LDH工作溶液(master mix)。

3.提前裂解的样品，假设每孔总体积为100μL，则每孔加入10μL 10×Lysissolution，后遮光继续在培养箱培养。

4.培养结束后，(条件允许的话)将96孔板离心，300×g,10min,升9降1。

5.避免吸取底部细胞，小心将50μL/孔上清转到另一个96孔平底板。

6.每个上清样品加入50μL/孔上述LDH混合成工作溶液(master mix)。

7.板用箔纸遮光，在室温孵育30min后，每孔再加入50μL Stop solution.如有气泡需用枪头刺穿。

8.在490nm或492nm波长区域检测。

LDH法检测CAR-T细胞对靶细胞的的杀伤能力见图10。通用型抗CD19的CAR-T细胞(UCAR-T19-PTG4)和未进行基因敲除的抗CD19的CAR-T(CAR-T19)细胞都能有效杀伤CD19阳性的细胞(K562-CD19)，杀伤效率分别为71.31％和60.23％。通用型抗CD19的CAR-T细胞(UCAR-T19-PTG4)表现出更高的杀伤效率，表明其具有比普通的未进行基因敲除的抗CD19的CAR-T具有更强的杀伤力。

实施例9 ELISA法检测CAR-T细胞分泌细胞因子IFN-gama的水平

分别将K562、K562-CD19(稳定表达CD19的K562细胞)按照5×10^5细胞/孔接种24孔板。按每孔5×10^5细胞分别加入通用型抗CD19的CAR-T细胞(UCAR-T19-PTG4)、未进行基因敲除的抗CD19的CAR-T(CAR-T19)以及未转导的T细胞(T mock)，补充培养液至1.5mL，于孵箱中共培养12小时后。采用人IFN-gama ELISA检测试剂盒(欣博盛生物)，对共培养上清进行检测(具体步骤见ELISA检测试剂盒说明书)。通用型抗CD19的CAR-T细胞(UCAR-T19-PTG4)和未进行基因敲除的抗CD19的CAR-T(CAR-T19)细胞与CD19阳性的细胞(K562-CD19)共培养上清中IFN-γ细胞因子水平均较未转导的T细胞(T mock)组有显著性升高。见图11。通用型抗CD19的CAR-T细胞(UCAR-T19-PTG4)表现出分泌更多的IFN-gama细胞因子，表明其具有比普通的未进行基因敲除的抗CD19的CAR-T具有更强的杀伤力。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

序列表

<110> 广州百暨基因科技有限公司

<120> 一种通用型CAR-T细胞及其制备方法和用途

<160> 39

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagaatcaaa atcggtgaat 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtctctcagc tggtacacgg c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaaaacgtg ttcccacccg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggctcaaaca cagcgacctc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aagtcaactt caatgtcgga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agtcacatgg ttcacacggc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgtgagtaaa cctgaatctt 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgtctgggc ggtgctacaa c 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatgtggaag tcacgcccgt t 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcgtgacttc cacatgagcg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccctgctcg tggtgaccga 20

<210> 12

<211> 184

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60

gattcccggc tggtgcaggc tcaaacacag cgacctcgtt ttagagctag aaatagcaag 120

ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt 180

tttt 184

<210> 13

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60

gattcccggc tggtgcaggc tcaaacacag cgacctcgtt ttagagctag aaatagcaag 120

ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcaacaaag 180

caccagtggt ctagtggtag aatagtaccc tgccacggta cagacccggg ttcgattccc 240

ggctggtgca agtcacatgg ttcacacggc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 300

aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttttttt 357

<210> 14

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60

gattcccggc tggtgcaggc tcaaacacag cgacctcgtt ttagagctag aaatagcaag 120

ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcaacaaag 180

caccagtggt ctagtggtag aatagtaccc tgccacggta cagacccggg ttcgattccc 240

ggctggtgca gccctgctcg tggtgaccga gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 300

aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttttttt 357

<210> 15

<211> 530

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60

gattcccggc tggtgcaggc tcaaacacag cgacctcgtt ttagagctag aaatagcaag 120

ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcaacaaag 180

caccagtggt ctagtggtag aatagtaccc tgccacggta cagacccggg ttcgattccc 240

ggctggtgca agtcacatgg ttcacacggc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 300

aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgcaaca aagcaccagt 360

ggtctagtgg tagaatagta ccctgccacg gtacagaccc gggttcgatt cccggctggt 420

gcagccctgc tcgtggtgac cgagttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta 480

gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct tttttttttt 530

<210> 16

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys

210 215 220

Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

325 330 335

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

340 345 350

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

355 360 365

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

370 375 380

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

385 390 395 400

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

405 410 415

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

420 425 430

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

435 440 445

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

450 455 460

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

465 470 475 480

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 17

<211> 1463

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atggcactgc cagtgacagc cctgctgctg ccactggccc tgctgctgca cgcagcacgc 60

cctgacatcc agatgacaca gaccacaagc tccctgtccg cctctctggg cgacagagtg 120

accatctctt gcagggccag ccaggatatc tccaagtatc tgaactggta ccagcagaag 180

cccgatggca cagtgaagct gctgatctat cacaccagcc ggctgcacag cggagtgcct 240

tccaggttca gcggctccgg ctctggcaca gactactctc tgaccatcag caacctggag 300

caggaggata tcgccaccta tttctgccag cagggcaata cactgcctta cacctttggc 360

ggcggcacaa agcttgagat caccggcggc ggcggctctg gaggaggagg cagcggcgga 420

ggaggctccg aggtgaagct gcaggagtcc ggacctggac tggtggcacc aagccagtcc 480

ctgtctgtga catgtaccgt gtccggcgtg tctctgccag actacggcgt gtcctggatc 540

agacagccac ctaggaaggg cctggagtgg ctgggcgtga tctggggctc tgagaccaca 600

tactataatt ccgccctgaa gtctcggctg accatcatca aggacaacag caagtcccag 660

gtgtttctga agatgaatag cctgcagaca gacgataccg ccatctacta ttgcgccaag 720

cactactatt acggcggctc ttatgccatg gattactggg gccagggcac aagcgtgacc 780

gtgtctagca ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaga gaggcaggaa gaagctgctg 1020

tacatcttca agcagccctt catgcgcccc gtgcagacaa cccaggagga ggacggctgc 1080

agctgtcggt tcccagagga ggaggaggga ggatgtgagc tgagggtgaa gttttctcgg 1140

agcgccgatg caccagcata tcagcaggga cagaatcagc tgtacaacga gctgaatctg 1200

ggcaggcgcg aggagtacga cgtgctggat aagcggagag gcagagatcc cgagatggga 1260

ggcaagccaa ggaggaagaa ccctcaggag ggcctgtata atgagctgca gaaggacaag 1320

atggccgagg cctactctga gatcggcatg aagggagagc ggagaagggg caagggacac 1380

gatggcctgt atcagggcct gagcacagcc accaaggaca cctacgatgc actgcacatg 1440

caggccctgc cacctaggta gta 1463

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

caccgagaat caaaatcggt gaat 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aaacattcac cgattttgat tctc 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

accgtctctc agctggtaca cggc 24

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aaacgccgtg taccagctga gagac 25

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

caccgaaaaa cgtgttccca cccg 24

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aaaccgggtg ggaacacgtt tttc 24

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

caccggctca aacacagcga cctc 24

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aaacgaggtc gctgtgtttg agcc 24

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

caccaagtca acttcaatgt cgga 24

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aaactccgac attgaagttg actt 24

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

caccagtcac atggttcaca cggc 24

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aaacgccgtg tgaaccatgt gact 24

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cacccgtgag taaacctgaa tctt 24

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aaacaagatt caggtttact cacg 24

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

caccgcgtct gggcggtgct acaac 25

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

aacgttgtag caccgcccag acgc 24

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

caccgatgtg gaagtcacgc ccgtt 25

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

aaacaacggg cgtgacttcc acatc 25

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

caccgcgtga cttccacatg agcg 24

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

aaaccgctca tgtggaagtc acgc 24

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

caccgccctg ctcgtggtga ccga 24

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

aaactcggtc accacgagca gggc 24

Claims

1.一种sgRNA，所述的sgRNA是SEQ ID NO:11所示的序列。

2.根据权利要求1所述sgRNA，所述sgRNA靶向PD1基因。

3.含有权利要求1所述sgRNA的多位点编辑的PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)，所述的PTG含有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11所示的序列。

4.根据权利要求3所述PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)，所述的PTG含有SEQ ID NO:14所示的序列。

5.根据权利要求3所述PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)，所述的PTG还含有SEQ ID NO:6所示的序列。

6.根据权利要求5所述PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)，所述的PTG含有SEQ ID NO:15所示的序列。

7.包含权利要求1或2所述的sgRNA或权利要求3-6任一所述的PTG的载体。

8.根据权利要求7所述载体，所述的载体选自逆转录病毒、慢病毒或仙台病毒。

9.根据权利要求8所述载体，所述的载体选自慢病毒。

10.包含权利要求1-2任一所述的sgRNA、或者权利要求3-6任一所述PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)、或者权利要求7-9任一所述载体的试剂盒。

11.权利要求1-2任一所述的sgRNA、或者权利要求3-6任一所述PTG(PolycistronictRNA-gRNA)、或者权利要求7-9任一所述载体、或者权利要求10所述试剂盒，在构建通用型CAR-T细胞中的应用。

12.根据权利要求11所述应用，所述的通用型CAR-T细胞敲除PD1基因，以及TCR基因。

13.根据权利要求12所述应用，所述的通用型CAR-T细胞同时敲除TCR，B2M和PD1基因。

14.利用权利要求1-2任一所述的sgRNA、或者权利要求3-6任一所述PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)、或者权利要求7-9任一所述载体、或者权利要求10所述试剂盒制备的细胞。

15.一种CAR-T细胞，所述的细胞采用SEQ ID NO:15所示的序列敲除TCR 、B2M和PD1基因。

16.根据权利要求15所述的CAR-T细胞，所述CAR靶向CD19。

17.根据权利要求15所述的CAR-T细胞，所述的CAR具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列、或者SEQ ID NO:17所示的核酸序列。

18.权利要求15-17任一所述的CAR-T细胞制备方法，其包括以下步骤：

1)得到活化的T细胞；

2)用编码靶向CD19的CAR的慢病毒载体来转染步骤1)的T细胞，获得靶向CD19的CAR-T细胞；所述靶向CD19的CAR具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；

3)将步骤2)获得的CAR-T细胞采用SEQ ID NO:15所示的序列进行PD1基因， TCR和B2M基因的敲除；

其中，步骤2）和3）顺序可互换或同时进行。

19.权利要求1-2任一所述的sgRNA、或者权利要求3所述PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)、或者权利要求7-9任一所述载体、或者权利要求10所述试剂盒、或者权利要求14所述细胞、或者权利要求15-17任一所述CAR-T细胞、或者权利要求18所述方法，在制备治疗肿瘤和自身免疫性疾病的药物中的应用。

20.根据权利要求19所述应用，为在制备异体治疗药物中的应用。

21.根据权利要求19所述应用，所述的肿瘤选自CD19阳性的肿瘤。

22.一种药物组合物，所述的药物组合物包含权利要求15-17任一所述的CAR-T细胞。

23.根据权利要求22所述药物组合物，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。