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CN118369418A - 工程nk细胞、它们的生产方法及其用途 - Google Patents

工程nk细胞、它们的生产方法及其用途 Download PDF

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CN118369418A
CN118369418A CN202280068292.5A CN202280068292A CN118369418A CN 118369418 A CN118369418 A CN 118369418A CN 202280068292 A CN202280068292 A CN 202280068292A CN 118369418 A CN118369418 A CN 118369418A
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cells
population
cell
gene
cell population
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CN202280068292.5A
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约娜·格芬
阿维亚德·帕托
朱莉娅·里夫曼
阿斯塔尔·海璐
阿亚尔·亨德尔
尼姆罗德·本·海
努里特·布里克曼
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Gamida Cell Ltd
Original Assignee
Gamida Cell Ltd
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Abstract

公开了一种离体生产经遗传修饰的自然杀伤(NK)细胞的组合物和方法。该方法包括：(a)下调NK细胞群中感兴趣基因的表达，以获得经遗传修饰以下调感兴趣基因的NK细胞群；(b)扩增经遗传修饰以下调感兴趣基因的所述NK细胞群，从而获得离体扩增的NK细胞群；和(c)上调所述离体扩增的NK细胞群中至少一种膜结合蛋白的表达。还公开了一种离体生产表达至少一种膜结合蛋白的自然杀伤(NK)细胞的方法。还公开了药物组合物和治疗方法。

Description

工程NK细胞、它们的生产方法及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年8月10日提交的美国临时申请63/231,372号的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
发明的领域和背景
本发明，在其一些实施方式中，涉及工程自然杀伤(NK)细胞，更具体地，但不排他地，涉及经修饰以使感兴趣基因不表达并使感兴趣膜结合蛋白表达的NK细胞。
NK细胞是构成固有免疫系统的重要组分的细胞毒性淋巴细胞。这些细胞具有多种功能，特别是杀伤活体中的肿瘤细胞、病毒感染的细胞、正在进行致癌转化的细胞和其它异常细胞。与T细胞不同，NK细胞对靶细胞的杀伤对于特定抗原是非特异性的，相反，它们对靶细胞的识别通过激活(activate)和抑制信号之间的平衡来调节。靶向细胞的杀伤通常由细胞溶解蛋白介导，包括穿孔素、颗粒酶B和/或颗粒溶素。
近年来，NK细胞作为各种难治性血液恶性肿瘤(hematological malignancy)和实体瘤患者的免疫治疗的有前途的工具引起了相当大的关注，然而，基于NK细胞的免疫治疗的全部治疗潜力尚未实现。迄今为止，实验方案的结果主要限于部分反应，边际疗效主要归因于输注的NK细胞数量相对较低、其体内持久性较短和/或其体内功能性(functionality)较差。因此，开发既有效地扩增NK细胞群又提高体内过继性输注的NK细胞功能性的离体NK培养方法是提高NK细胞免疫疗法临床适用性的基础。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种离体生产经遗传修饰的(genetically modified)自然杀伤(NK)细胞的方法，所述方法包括：(a)下调NK细胞群中感兴趣基因的表达，以获得经遗传修饰以下调感兴趣基因的NK细胞群；(b)扩增经遗传修饰的所述NK细胞群以下调感兴趣基因，从而获得离体扩增的NK细胞群；和(c)上调所述离体扩增的NK细胞群中至少一种膜结合蛋白的表达，从而产生经遗传修饰的NK细胞。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种离体生产表达至少一种膜结合蛋白的自然杀伤(NK)细胞的方法，所述方法包括：(a)通过包括以下步骤的方法扩增NK细胞群：(i)在允许细胞增殖的条件下培养所述NK细胞群，其中所述条件包括提供有效量的营养素、血清、IL-15和烟酰胺；和(ii)在步骤(i)后5至10天，用有效量的新鲜营养素、血清、IL-15和烟酰胺补充所述NK细胞群，以产生扩增的NK细胞；从而获得离体扩增的NK细胞群；和(b)上调所述离体扩增的NK细胞群中至少一种膜结合蛋白的表达，从而产生表达所述至少一种膜结合蛋白的NK细胞。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了可根据本发明的一些实施方式的方法获得的分离的NK细胞群。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种药物组合物，其包含本发明的一些实施方式的分离的NK细胞群和药学活性载体。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种治疗有需要的对象的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的本发明的一些实施方式的分离的NK细胞群，从而治疗所述对象。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了治疗有效量的本发明的一些实施方式的分离的NK细胞群，用于治疗有需要的对象的疾病。
根据本发明的一些实施方式，所述NK细胞群来自脐带血、外周血、骨髓、CD34+细胞或iPSC。
根据本发明的一些实施方式，所述NK细胞群不含CD3+细胞。
根据本发明的一些实施方式，所述NK细胞群包括CD3-CD56+细胞。
根据本发明的一些实施方式，所述下调通过基因编辑系统实现。
根据本发明的一些实施方式，所述NK细胞在培养中。根据本发明的一些实施方式，所述下调从所述培养开始后24至72小时进行。
根据本发明的一些实施方式，所述感兴趣基因包括其产物影响所述NK细胞增殖和/或存活率(survival)的基因。
根据本发明的一些实施方式，所述感兴趣基因选自由CISH、TGFβ受体和CD38所组成的组。
根据本发明的一些实施方式，在允许细胞增殖的条件下进行所述NK细胞群的扩增，其中所述条件包括有效量的营养素、血清、生长因子和烟酰胺。
根据本发明的一些实施方式，所述生长因子包括至少一种选自由IL-15、IL-2、IL-7、IL-12、IL-21、SCF和FLT3所组成的组的生长因子。
根据本发明的一些实施方式，所述烟酰胺的所述有效量包括1.0mM至10mM的量。
根据本发明的一些实施方式，扩增所述NK细胞群在饲养细胞或饲养层的存在下进行。
根据本发明的一些实施方式，所述饲养细胞包括经辐射的细胞。
根据本发明的一些实施方式，所述饲养细胞包括T细胞或PBMC。
根据本发明的一些实施方式，允许细胞增殖的条件还包括CD3激动剂。
根据本发明的一些实施方式，所述扩增所述NK细胞群进行14至16天。
根据本发明的一些实施方式，所述上调所述至少一种膜结合蛋白的表达在培养开始的第12至14天进行。
根据本发明的一些实施方式，所述上调所述至少一种膜结合蛋白的表达通过mRNA电穿孔进行。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种膜结合蛋白是瞬时表达的。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种膜结合蛋白包含在体内影响NK细胞抗疾病功能或存活率的蛋白质。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种膜结合蛋白选自由IL-15、IL-15R、受体连接蛋白IL-15(Receptor Linker IL-15，RLI)和TLR所组成的组。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种膜结合蛋白包含嵌合抗原受体(CAR)或转基因T细胞受体(tg-TCR)。
根据本发明的一些实施方式，CAR包含至少一个共刺激结构域。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一个共刺激结构域选自由CD28、2B4、CD137/4-1BB、CD134/OX40、Lsk、ICOS和DAP10所组成的组。
根据本发明的一些实施方式，CAR包含至少一个激活结构域。
根据本发明的一些实施方式，所述激活结构域包含CD3ζ或～FcR-γ。
根据本发明的一些实施方式，CAR包括跨膜结构域和铰链结构域中的至少一个。
根据本发明的一些实施方式，所述跨膜结构域选自CD8、CD28和NKG2D。
根据本发明的一些实施方式，所述铰链结构域选自CD8和CD28。
根据本发明的一些实施方式，CAR包含抗原结合结构域，其是抗体或抗原结合片段。
根据本发明的一些实施方式，抗原结合片段是Fab或scFv。
根据本发明的一些实施方式，CAR或tg-TCR对选自由肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原和寄生虫抗原所组成的组的抗原具有抗原特异性。
根据本发明的一些实施方式，肿瘤抗原与实体瘤相关。
根据本发明的一些实施方式，肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。
根据本发明的一些实施方式，CAR或tg-TCR对抗原具有抗原特异性，所述抗原选自由以下所组成的组：HER2/Neu、CD38、CD19、CD319/CS1、ROR1、CD20、CD5、CD7、CD22、CD70、CD30、BCMA、CD25、NKG2D配体、MICA/MICB、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、黑素瘤相关抗原、突变p53、突变ras、ERBB2、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Ralpha、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、WT-1、EGFRvIII、TRAIL/DR4和/或VEGFR2。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种膜结合蛋白包含以下的共表达：
(i)CAR或TG-TCR，和
(ii)影响体内NK细胞存活率的细胞因子或受体。
根据本发明的一些实施方式，当感兴趣基因是CISH时，所述至少一种膜结合蛋白包含IL-15。
根据本发明的一些实施方式，当感兴趣基因是CD38时，所述至少一种膜结合蛋白包含抗-CD38 CAR。
根据本发明的一些实施方式，所述疾病选自由恶性疾病、病毒性疾病、细菌性疾病、真菌疾病、原生动物疾病和寄生虫疾病所组成的组。
根据本发明的一些实施方式，所述恶性疾病是实体瘤或肿瘤转移。
根据本发明的一些实施方式，所述恶性疾病选自由以下所组成的组：乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、黑素瘤、肉瘤、成神经细胞瘤、结肠癌、结直肠癌、食管癌、滑膜细胞癌、子宫癌、神经胶质瘤与宫颈癌。
根据本发明的一些实施方式，所述恶性疾病是血液恶性肿瘤。
根据本发明的一些实施方式，所述血液恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
根据本发明的一些实施方式，所述对象是人类对象。
除非另有限定，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以在本发明的实施方式的实践或测试中使用与本文描述的那些类似或等同的方法和材料，但是下文描述了示例性方法和/或材料。如有冲突，以专利说明书(包括限定)为准。此外，这些材料、方法和实施例仅是说明性的，并不意味着必须是限制性的。
附图简要说明
通过下面结合附图的详细描述，可以更清楚地理解上文和进一步的特征。
图1A是显示IL-15刺激NK细胞后CIS的调节作用的示意图。摘自Bottino等人，Transl Cancer Res(2016)5(Suppl 4):S875-S877。
图1B是显示NK细胞调节检查点的示意图：IL-15信号传导通过产生CIS调节剂的CISH驱动负反馈环。摘自Riggan等人，Clinical&Translational Immunology(202 1)e1238。
图2A-C说明了CISH敲除(KO)测序结果。(图2A-C)用靶向CISH的4μM RNP复合物电穿孔人原代NK细胞。培养7天后从细胞中提取DNA。进行桑格测序(Sanger sequencing)，并通过TIDE工具分析插入-缺失(INDEL)频率。(图2A)“旧向导”(CISH1)是指取自公共结构域(public domain)的gRNA序列(参见Palmer等人，BioRxiv，2020年9月25)。(图2B)向导4(CISH2)和(图2C)向导10(CISH3)是发明人开发的独特的gRNA。值得注意的是，在三种gRNA中，向导4和向导10产生高编辑速率(editing rate)(分别为85％和82％ INDEL频率)，而“旧向导”产生30％ INDEL频率。
图3A-B说明了NK细胞中CISH基因的CRISPR KO通过上调与NK细胞激活相关的细胞因子产生来增强效力(potency)。(图3A-B)使用细胞内染色测量的促炎细胞因子(INFK和GM-CSF)的效力测定，显示了对照NK细胞、模拟(mock)(电)对照或Cish缺失的NK细胞的共培养的细胞因子表达(使用三种不同的RNA-向导，如图2A-C中所述)。在有或没有抗-CD20(利妥昔单抗,RTX)的情况下，将每种类型的NK细胞与K562(人红白血病细胞系)和Raji(B细胞淋巴瘤细胞系)共培养，增强了NK细胞的CD16-介导的ADCC细胞毒性活性。所有这些均与单独培养的NK细胞进行比较。流式细胞术用于量化CD56+NK细胞上门控的(gated)细胞因子表达。(图3A)IFNγ的表达和(图3B)GM-CSF的表达，均通过细胞内染色(ICS)检测。
图4A-C说明了NK细胞中CISH基因的CRISPR KO增强了它们的细胞毒性和ADCC功能。(图4A-C)细胞毒性杀伤试验通过活细胞成像系统IncuCyte S3进行，允许收集有关NK活性的实时数据。肿瘤靶细胞用CFSE染料标记，并在培养基中存在PI(碘化丙啶)的情况下与NK细胞共培养20小时。存活细胞保持未染色，而死亡细胞通过CFSE荧光染色和PI的重叠进行检测。靶死亡细胞的百分比显示在对照NK细胞、模拟(电)对照细胞和CISH缺失的NK细胞(使用三种不同的RNA-向导，如图2A-C中所述)的曲线上，每种细胞与(图4A)K562细胞系、(图4B)Raji细胞系以及(图4C)Raji细胞系和利妥昔单抗共培养，增强了ADCC杀伤活性。值得注意的是，与测试的其他CISH KO相比，RNA向导4(CISH2)显示出更好的杀伤和ADCC。
图5A-D是显示开发基于IL-15的融合蛋白构型以改善IL-15稳定性和免疫治疗活性的持久性的示意图。(图5A-B)在膜结合复合物IL-15-IL-15Rα的结合和组装之后的信号传导(图5A)的示意图，该膜结合复合物IL-15-IL-15Rα以反式呈现给表达IL-15Rβγ复合物的细胞(图5B)(摘自Carroll等人，Rheumatology(2008)47(9):1269-1277和Wikiwand，白介素-15)。(图5C)提高免疫活性的IL-15-IL-15-IL15Rα复合物的设计形式(摘自Hu等人，Scientific Reports(2018)8:7675)。(图5D)另一种设计的IL-15剂，其与IL15Rα组合，在临床癌症治疗中得到证实(摘自Waldmann等人，Front.Immunol.(2020)11:868)。
图6A-F说明了遗传构建体301.A(图6A)和301.B(图6C)，以及膜结合R1-301.A(图6B)和301.B(图6D)的多肽产物的示意图。呈现了膜结合N72D-RLI GDA-301A(图6E)和N72D-RLI GDA-301B(图6F)的全长序列。对于图6E-F，蓝色代表sushi结构域的序列，深蓝色代表外显子3起始的序列，绿色代表前导肽的序列，深绿色代表连接子序列的序列，红色代表胞外结构域的序列，橙色代表跨膜结构域的序列，黄色代表细胞质结构域的序列。
图7说明了使用CD107a NK细胞脱粒标记(degranulation marker)测试的膜结合IL-15mRNA表达增加了效力。在对照NK细胞、模拟(电)对照，或用mRNA IL-15301.A(IL-15.1A)或301.B(IL-15.1B)电穿孔的那些细胞培养6小时后，通过流式细胞术分析测定CD107a表达的增加。将每种类型的NK细胞单独培养或与K562细胞系或Raji(有或没有利妥昔单抗)共培养。
图8A-C说明了膜结合的IL-15增强了NK细胞的效力，如促炎细胞因子的升高所示。对照、IL-15.1A或IL-15.1B mRNA电穿孔细胞共温育6小时后，进行细胞因子的细胞内染色，显示了IFNγ(图8A)、GM-CSF(图8B)和TNFα(图8C)的表达，所有这些都通过流式细胞术分析检测。值得注意的是，两者IL15.1A和IL15.1B都显示促炎细胞因子INFg、TNFα和GM-CSF的表达增加，与mbIL-15.1B相比具有优势。
图9A-C说明了膜结合的IL-15提高了NK细胞中的细胞毒性功能和ADCC杀伤。检测了IL15.1A或IL-15.1B mRNA电穿孔NK细胞的增强的杀伤活性。(图9A-B)细胞毒性杀伤试验通过活细胞成像系统IncuCyte S3进行。用CFSE染料标记肿瘤靶细胞，并在培养基中存在PI的情况下与NK细胞共培养20小时。存活细胞保持未染色，而死亡细胞通过CFSE荧光染色和PI的重叠进行检测。靶死亡细胞的百分比显示在对照NK细胞、模拟(电)对照细胞、IL15.1A或IL15.1B NK细胞，以及用可溶性IL-15细胞因子处理的对照NK细胞(试验的阳性对照，允许测定细胞在施用IL-15后经历激活的最大能力)的曲线上。每种类型的NK细胞与(图9A)K562细胞系共培养24小时，以及与(图9B)B细胞淋巴瘤(BL-2)细胞系和利妥昔单抗共培养48小时。或者，通过流式细胞术进行杀伤试验，以检测与RPMI-8226骨髓瘤细胞系共培养的不同NK细胞的细胞毒性活性(图9C)。
图10说明了NK CD38自相残杀问题(fratricide problem)和CRISPR方案。
图11A-H说明了CD38 KO NK细胞在达妥木单抗(daratumumab)存在下能够抵抗自相残杀。(图11A-B)-流式细胞术门控策略。(图11C-E)CD38分别在NK、Mock和KO细胞上表达。(图11F)NK自相残杀的概述。(图11G-H)具有或没有DARA(达妥木单抗)的NK(图11G)和CD38KO NK(图11H)的自相残杀流式细胞术分析。
图12A-B说明了抗-CD38 NK CAR的基因构建体和蛋白质结构(图12A)和抗CD38CAR的全长序列(图12B)。对于图12B，红色代表铰链结构域的序列，蓝色代表跨膜结构域的序列，褐色代表细胞质结构域的序列。图13是显示组合基因编辑技术的示意图。
图14说明了具有或没有DARA(达妥木单抗)时的非NK细胞和操纵的-NK细胞对多种细胞系的流式细胞术杀伤分析。
图15是抗-HER2 CAR遗传构建体的示意图。
图16A-D是显示经工程以表达抗-HER2 CAR的不同构建体的示意图。
图17是表明细胞外观的构建体的示意图。
图18A-G说明了测定NK细胞上CAR表达的夹层流式细胞术(sandwich flowcytometry)方法。(图18A)由特异性抗-Her2抗体检测的表达抗-HER2 CAR并结合Her2蛋白的NK的示意图。(图18B-G)流式细胞术图表示仅在电穿孔细胞上表达的抗-HER2 CAR的特异性测定。根据图17，使用活细胞上尺寸门控(图18B)进行染色的门控策略，然后通过抗-Her2抗体对对照NK细胞(图18C)、电(模拟)对照(图18D)以及用CAR-B(图18E)、CAR-C(图18F)和CAR-D(图18G)电穿孔的NK进行染色。
图19是NK细胞调节检查点的图示，强调了经由TGFb信号传导介导的抑制性反馈环。摘自Riggan等人，Clinical&Translational Immunology(2021)e1238。
图20说明了NKp30表面表达。
图21说明了CISH KO NK和CISH KO/mb-IL-15NK中的细胞毒性效力。
图22说明了CISH KO NK和CISH KO/mb-IL-15NK中的细胞毒性效力。
图23说明了CISH KO NK和CISH KO/mb-IL-15NK中的细胞毒性效力。
图24说明了CISH KO NK和CISH KO/mb-IL-15NK的杀伤百分比和效力。
图25说明了CD122和NKG2A表面表达CISH KO/mb-IL-15NK。
图26说明了TIGIT和LAG3表面表达CISH KO/mb-IL-15NK。
图27说明了CD38 KO和CD38 KO/CD38 CAR(GDA601)CD38表面表达的流动分析。
图28说明了CISH向导KO策略和一般的CISH KO/mb-IL-15电穿孔工作流程。
图29说明了mb-IL-15靶细胞杀伤(K562)和非靶细胞杀伤(PBMC)。
图30说明了CD38 KO和CD38 KO/CD38 CAR效力分析。
图31说明了CD38 KO和CD38 KO/CD38 CAR效力分析。
图32说明了CD38 KO和CD38 KO/CD38 CAR杀伤和自相残杀分析。
具体实施方式
本发明，在其一些实施方式中，涉及工程自然杀伤(NK)细胞，更具体地，但不排他地，涉及经修饰以使感兴趣基因不表达并使感兴趣膜结合蛋白表达的NK细胞。
本发明的原理和操作可以参考附图和所附的描述来更好地理解。
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应当理解，本发明在其应用中不必限于在下文中阐述的细节或由实施例举例说明的细节。本发明能够具有其它实施方式或者能够以各种方式实践或实现。而且，应当理解，本文使用的措辞和术语是为了描述的目的，而不应当被认为是限制性的。
将本发明付诸实践的同时，本发明人已经说明了可以定制NK细胞以靶向感兴趣的具体疾病细胞，同时具有用于有效免疫治疗的改进的特性。
如下文和随后的实施例部分所示，本发明人已经通过在包括营养素、血清、IL-15和烟酰胺的培养条件下离体扩增NK细胞群，生产了具有改进特性的NK细胞(参见下文的一般材料和实验方法部分)。为了进一步改善NK细胞的功能性、存活率和/或增殖，在其扩增之前使用CRISPR-Cas9基因编辑系统对细胞进行遗传修饰，以下调基因的表达，这些基因的产物负调节NK细胞(例如检查点如CISH或CD38或TGFβ受体2，分别参见实施例1、3和5)的功能性、存活率或增殖。此外，为了提高NK细胞的抗疾病功能或存活率，通过mRNA电穿孔对扩增的NK细胞进行修饰，以瞬时表达膜结合蛋白，如受体连接蛋白IL-15(RLI，参见实施例2)或Toll-样受体4(TLR4，参见实施例6)，或嵌合抗原受体(CAR)如抗-CD38 CAR(参见实施例3)或抗-HER2 CAR(参见实施例4)。
总之，本发明的离体生产的NK细胞提供了一种方案，其包含高数量、在体内具有高存活率和高功能性(例如高细胞毒性)，并且被工程化以靶向任何感兴趣的疾病细胞(例如实体瘤或转移的细胞、血液肿瘤的细胞、病毒感染的细胞等)。此外，本发明的离体生产的NK细胞可以被工程化以用于与选择的任何药物共同施用，例如与抗-CD38抗体，如达妥木单抗(DARA)共同施用，否则其会杀伤NK细胞。
本公开的NK细胞部分(fraction)
本公开提供了包含NK细胞部分的组合物，所述NK细胞部分包含有核细胞群。
在一些方面，有核细胞群可包含如下数量的有核细胞：至少约1.0×106，或至少约5.0×106，或至少约1.0×107，或至少约5.0×107，或至少约1.0×108，或至少约5.0×108，或至少约1.0×109，或至少约5.0×109，或至少约1.0×1010，或至少约5.0×1010，或至少约1.0×1011，或至少约5.0×1011，或至少约1.0×1012，或至少约5.0×1012。在一些方面，有核细胞群可包含至少约1.0×106个细胞。在一些方面，有核细胞群可包含至少约17.5×108个细胞。在一些方面，有核细胞群可包含至少约35×108个细胞。在一些方面，有核细胞群可包含至少约2.5×109个细胞。在一些方面，有核细胞群可包含至少约5×109个细胞。
在一些方面，有核细胞群中，至少约60％、或至少约65％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％的细胞是存活的。在一些方面，有核细胞群中至少约70％的细胞是存活的。
在一些方面，有核细胞群中，至少约60％、或至少约65％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％的细胞是CD56+。在一些方面，有核细胞群中至少约70％的细胞是CD56+。
在一些方面，有核细胞群中，约80％至约99％、或约85％至约95％、或约90％至约95％的细胞是CD56+。在一些方面，有核细胞群中，约90％至约95％的细胞是CD56+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约0.1％、或不超过约0.2％、或不超过约0.3％、或不超过约0.4％、或不超过约0.5％、或不超过约0.6％、或不超过约0.7％、或不超过约0.8％、或不超过约0.9％、或不超过约1.0％的细胞是CD3+。在一些方面，有核细胞群中，不超过0.5％的细胞是CD3+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约0.1％、或约0.01％至约0.2％、或约0.01％至约0.3％、或约0.01％至约0.4％、或约0.01％至约0.5％、或约0.01％至约0.6％、或约0.01％至约0.7％、或约0.01％至约0.8％、或约0.01％至约0.9％、或约0.01％至约1.0％的细胞是CD3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约0.5％的细胞是CD3+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约0.5％、或约0.2％至约0.3％的细胞是CD3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.2％至约0.3％的细胞是CD3+。
在一些方面，有核细胞群中，至少约60％、或至少约65％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％的细胞是CD56+/CD3-。在一些方面，有核细胞群中，至少约70％的细胞是CD56+/CD3-。在一些方面，有核细胞群中，至少约99％的细胞是CD56+/CD3-。
在一些方面，有核细胞群中，约80％至约99％、或约85％至约95％、或约90％至约95％的细胞是CD56+/CD3-。在一些方面，有核细胞群中，约90％至约95％的细胞是CD56+/CD3-。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约0.1％、或不超过约0.2％、或不超过约0.3％、或不超过约0.4％、或不超过约0.5％、或不超过约0.6％、或不超过约0.7％、或不超过约0.8％、或不超过约0.9％、或不超过约1.0％的细胞是CD56-/CD3+。在一些方面，有核细胞群中，不超过0.5％的细胞是CD56-/CD3+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约0.1％、或约0.01％至约0.2％、或约0.01％至约0.3％、或约0.01％至约0.4％、或约0.01％至约0.5％、或约0.01％至约0.6％、或约0.01％至约0.7％、或约0.01％至约0.8％、或约0.01％至约0.9％、或约0.01％至约1.0％的细胞是CD56-/CD3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至0.5％的细胞是CD56-/CD3+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约0.5％、或约0.2％至约0.3％的细胞是CD56-/CD3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.2％至约0.3％的细胞是CD56-/CD3+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约5％、或不超过约10％、或不超过约15％、或不超过约20％、或不超过约25％的细胞是CD19+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约10％的细胞是CD19+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约0.7％的细胞是CD19+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约5％、或约0.01％至约10％、或约0.01％至约15％、或约0.01％至约20％、或约0.01％至约25％的细胞是CD19+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约10％的细胞是CD19+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约0.7％的细胞是CD19+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约5％、或约0.1％至约10％、或约0.1％至约15％、或约0.1％至约20％、或约0.1％至约25％的细胞是CD19+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约10％的细胞是CD19+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约0.7％的细胞是CD19+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约5％、或不超过约10％、或不超过约15％、或不超过约20％、或不超过约25％的细胞是CD14+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约10％的细胞是CD14+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约0.05％的细胞是CD14+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约5％、或约0.01％至约10％、或约0.01％至约15％、或约0.01％至约20％、或约0.01％至约25％的细胞是CD14+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约10％的细胞是CD14+。在一些方面，有核细胞群中，约0.01％至约0.05％的细胞是CD14+。
在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约5％、或约0.1％至约10％、或约0.1％至约15％、或约0.1％至约20％、或约0.1％至约25％的细胞是CD14+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约10％的细胞是CD14+。在一些方面，有核细胞群中，约0.1％至约0.05％的细胞是CD14+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约0.57％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约1％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约2％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约40％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约2.5％、或不超过约5％、或不超过约10％、或不超过约15％、或不超过约20％、或不超过约30％、或不超过约35％、或不超过约40％、或不超过约50％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约10％的细胞是LAG3+。在一些方面，有核细胞群中，约0.5％至约40％的细胞是LAG3+。
在一些方面，有核细胞群中，至少约10％的细胞是CD122+。在一些方面，有核细胞群中，至少约15％、或至少约20％、或至少约25％、或至少约30％、或至少约35％、或至少约40％、或至少约45％、或至少约50％、或至少约55％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％的细胞是CD122+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约15％的细胞是NKG2A+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约10％的细胞是NKG2A+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约5％、或不超过约2.5％、或不超过1％的细胞是NKG2A+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约0.5％的细胞是NKG2A+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约60％的细胞是NKG2A+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约50％的细胞是NKG2A+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约45％、或不超过约35％、或不超过25％的细胞是NKG2A+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约10％的细胞是NKG2A+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约80％的细胞是NKG2A+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约75％的细胞是NKG2A+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约70％或不超过约65％的细胞是NKG2A+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约40％的细胞是TIGIT+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约30％或不超过约35％的细胞是TIGIT+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约20％的细胞是TIGIT+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约15％、或不超过约10％、或不超过约5％、或不超过约2.5％、或不超过约1％的细胞是TIGIT+。
在一些方面，有核细胞群中，至少约90％的细胞是NKp30+。在一些方面，有核细胞群中，至少约80％、或至少约70％、或至少约65％、或至少约60％、或至少约55％、或至少约50％的细胞是NKp30+。
在一些方面，有核细胞群中，至少约45％的细胞是NKp30+。在一些方面，有核细胞群中，至少约35％、或至少约25％、或至少约15％、或至少约10％、或至少约5％、或至少约2.5％的细胞是NKp30+。
在一些实施方式中，有核细胞群中的细胞包含膜结合受体或蛋白。在一些实施方式中，膜结合受体或蛋白是受体连接蛋白IL-15(mb-IL-15)、IL-15、IL-15R或TLR中的一种或多种。
在一些实施方式中，有核细胞群中的细胞包含膜结合受体或蛋白和上调、下调或敲除的感兴趣基因。在一些实施方式中，膜结合受体或蛋白是受体连接蛋白IL-15(mb-IL-15)中的一种或多种，并且感兴趣基因是CISH。在一些实施方式中，感兴趣基因是CISH并被敲除。在一些实施方式中，有核细胞群中的细胞包含mb-IL-15，其中不超过约50％的包含mb-IL-15的细胞表达CISH。在一些实施方式中，有核细胞群中的细胞包含mb-IL-15，其中不超过约45％、或不超过约40％、或不超过约35％、或不超过约30％、或不超过约25％的包含mb-IL-15的细胞表达CISH。在一些实施方式中，有核细胞群中的细胞包含mb-IL-15，其中不超过约20％、或不超过约15％、或不超过约10％、或不超过约5％、或不超过约2.5％的包含mb-IL-15的细胞表达CISH。
因此，在非限制性示例中，本公开提供了包含有核细胞群的NK细胞部分，其中所述群包含至少1.0×106个有核细胞，其中所述群中至少约70％的细胞是存活的并且表达受体连接蛋白IL-15，其中：
群中至少约70％的细胞是CD56+；
群中不超过约0.5％的细胞是CD3+；
群中不超过约10％的细胞是CD19+；
群中不超过约10％的细胞是CD14+；
群中不超过约40％的细胞是LAG3+；
群中至少约50％的细胞是CD122+；
群中不超过约60％的细胞是NKG2A+；
群中不超过约20％的细胞是TIGIT+；并且
群中至少50％的细胞是NKp30+。
在一些实施方式中，受体连接蛋白IL-15选自SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:28。
在一些实施方式中，不超过约25％的表达受体连接蛋白IL-15的细胞也表达CISH。在一些实施方式中，不超过约20％、或不超过约15％、或不超过约10％、或不超过约5％、或不超过约2.5％、或不超过约1％、或不超过约0.5％、或不超过约0.01％的表达受体连接蛋白IL-15的细胞也表达CISH。
在一些实施方式中，不超过约50％的表达受体连接蛋白IL-15的细胞也表达CISH。在一些实施方式中，不超过约45％、或不超过约40％、或不超过约35％、或不超过约30％、或不超过约28％的表达受体连接蛋白IL-15的细胞也表达CISH。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约15％的细胞是CD38+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约10％的细胞是CD38+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约5％、或不超过约2.5％、或不超过1％的细胞是CD38+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约0.5％的细胞是CD38+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约0.1％的细胞是CD38+。
在一些方面，有核细胞群中，不超过约30％的细胞是CD38+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约25％的细胞是CD38+。在一些方面，有核细胞群中，不超过约20％、或不超过约17％的细胞是CD38+。
在一些实施方式中，有核细胞群中的细胞包含抗-CD-38嵌合抗原受体。在一些实施方式中，有核细胞群中的细胞包含抗-CD-38嵌合抗原受体并包含CD-38敲除。
在一些实施方式中，不超过约10％的表达抗-CD-38嵌合抗原受体的细胞也表达CD38+。在一些实施方式中，不超过约5％、或不超过2.5％、或不超过1％、或不超过0.05％、或不超过0.01％的表达抗-CD-38嵌合抗原受体的细胞也表达CD38+。
在一些实施方式中，CAR包含抗-CD38 Fab或scFv。在一些实施方式中，CAR包含CD28或CD8铰链结构域中的一个或多个。在一些实施方式中，CAR包含CD28、CD8或NKG2D跨膜结构域中的一个或多个。在一些实施方式中，CAR包含CD28、4-1BB、2B4、CD3ζR、OX40、Lsk、ICOS、DAP10和IgE受体Ig的Fc片段共刺激结构域中的一种或多种。在一些实施方式中，CAR包含CD3ζ、FcR-γ和Fc-ε-R激活结构域中的一个或多个。在一些实施方式中，CAR还包含信号肽或前导肽。
在一些实施方式中，抗-CD-38CAR选自SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32。
在一些实施方式中，群中至少约70％的细胞是存活的并表达至少一种膜结合受体和至少一种CAR受体。
在一些实施方式中，有核细胞群中的细胞还包含趋化因子受体或突变趋化因子受体。在一些实施方式中，趋化因子受体是CXCR4或突变CXCR4。在一些实施方式中，所述突变CXCR4是CXCR4R334X突变体。在一些实施方式中，突变CXCR4是SEQ ID NO:69。
本公开还提供了冷冻保存的NK细胞部分，其包含本文所述的任何NK细胞部分和DMSO。在一些方面，DMSO的浓度可以是约1％v/v、或约2％v/v、或约3％v/v、或约4％v/v、或约5％v/v、或约6％v/v、或约7％v/v、或约8％v/v、或约9％v/v、或约10％v/v。或约11％v/v、或约12％v/v、或约13％v/v、或约14％v/v、或约15％v/v。在一些方面，DMSO的浓度可以是约10％v/v。
在一些方面，冷冻保存的NK细胞部分可以稳定至少约1个月、或至少约2个月、或至少约3个月、或至少约4个月、或至少约5个月、或至少约6个月、或至少约7个月、或至少约9个月、或至少约10个月。在一些方面，冷冻保存的NK细胞部分可以在约-80℃下稳定约1个月、或至少约2个月、或至少约3个月、或至少约4个月、或至少约5个月、或至少约6个月、或至少约7个月、或至少约9个月、或至少约10个月。
本公开的效力测定
本公开提供了第一效力测定，该测定包括以下步骤：
a)温育本公开的NK细胞部分和多个靶细胞，其中用至少一种增殖染色剂对所述多个靶细胞进行染色；
b)测定多个靶细胞中的细胞死亡百分比。
在第一效力测定的一些方面，步骤(a)的温育条件可进一步包括至少一种抗癌治疗性单克隆抗体(anti-cancer therapeutic monoclonal antibody)。
在第一效力测定的一些方面，靶细胞可以是K562细胞。
在第一效力测定的一些方面，靶细胞可以是Raji(CCL-86)细胞。
在第一效力测定的一些方面，靶细胞可以是Raji(CCL-86)细胞，并且步骤(a)的温育条件可以进一步包括利妥昔单抗。在一些方面，利妥昔单抗可以以约1μg/ml的浓度存在。
在第一效力测定的一些方面，靶细胞可以是RPMI细胞。在第一效力测定的一些方面，靶细胞可以是RPMI细胞，并且步骤(a)的温育条件还可以包括达妥木单抗。在一些方面，达妥木单抗可以以约1μg/ml的浓度存在。
如本领域技术人员所理解的，可以使用本领域已知的用于测定细胞死亡百分比的任何标准技术，来完成在第一效力测定的步骤(b)中测定多个靶细胞中的细胞死亡百分比。在非限制性示例中，测定多个靶细胞中的细胞死亡百分比可以包括：i)用至少一种生存力染色剂(viability stain)对步骤(a)中温育的NK细胞部分和多个靶细胞进行染色；ii)使用荧光激活细胞分选术(fluorescent activated cell sorting，FACS)将所述多个靶细胞与NK细胞部分分离；以及iii)使用生存力染色剂来测定在步骤(ii)中分选分离的多个靶细胞中的细胞死亡百分比。
在一些方面，所述至少一种增殖染色剂可以是羧基荧光素二乙酸酯(carboxyfluorescein diacetate)、琥珀酰亚胺基酯(succinimidyl ester，CFSE)。如本领域技术人员所理解的，本领域已知的任何增殖染色剂均可以用于本文所述的第一效力测定中。
在一些方面，所述至少一种生存力染色剂可以是Helix NPTM Blue(也称为SYTOXTMBlue)。如本领域技术人员所理解的，本领域已知的任何增殖染色剂均可以用于第一效力测定中。
在一些方面，第一效力测定的步骤(a)中的温育可以在约37℃下进行。
在一些方面，第一效力测定的步骤(a)中的温育可以进行至少约3小时。
在一些方面，第一效力测定的步骤(a)中，NK细胞部分中的细胞数量与多个靶细胞中的细胞数量的比率可以是约2.5:1，或约3:1，或约5:1，或约10:1。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是K562细胞，靶细胞中的细胞死亡百分比为至少30％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是K562细胞，靶细胞中的细胞死亡百分比为至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是RPMI细胞，在E:T比率为1:1时，靶细胞中的细胞死亡百分比为至少10％。在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是RPMI细胞，在E:T比率为5:1时，靶细胞中的细胞死亡百分比为至少25％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是RPMI细胞，在E:T比率为5:1时，靶细胞中的细胞死亡百分比为至少40％。在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是RPMI细胞，在E:T比率为2.5:1时，靶细胞中的细胞死亡百分比为至少40％。在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是RPMI细胞，在E:T比率为1.25:1时，靶细胞中的细胞死亡百分比为至少30％。
本公开提供了第二效力测定，该测定包括以下步骤：
a)温育本公开的NK细胞部分和多个靶细胞，其中用至少一种包含可检测标签(detectable label)的抗-CD107α抗体对所述NK细胞部分进行染色；
b)用一种或多种蛋白质运输抑制剂(protein trafficking inhibitor)处理在步骤(a)中温育的NK细胞部分和多个靶细胞，并进一步温育NK细胞部分和多个靶细胞；
c)用以下物质对NK细胞部分和多个靶细胞进行染色：
至少一种生存力染色剂；
至少一种包含可检测标签的抗-CD56抗体；
d)固定所述NK细胞部分和所述多个靶细胞；
e)使NK细胞部分和多个靶细胞透化(permeabilizing)；
f)用以下物质对NK细胞部分和多个靶细胞进行染色：
i)至少一种包含可检测标签的抗-IFNγ抗体；
ii)至少一种包含可检测标签的抗-TNFα抗体；
g)测定以下各项中的至少一项：
g1)用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-CD107α抗体染色的活细胞的百分比(即CD107a+/CD56+细胞的数量÷CD56+细胞的数量×100％)；
g2)用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-IFNγ抗体染色的活细胞的百分比(即IFNγ+/CD56+细胞的数量÷CD56+细胞的数量×100％)；和
g3)用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-TNFα抗体染色的活细胞的百分比(即TNFα+/CD56+细胞的数量÷CD56+细胞的数量×100％)。
在第二效力测定的一些方面，靶细胞可以是K562细胞、RPMI、Raji或K562细胞。
在一些方面，至少一种生存力染色剂可以是Zombie VioletTM生存力染色剂。如本领域技术人员所理解的，本领域已知的任何增殖染色剂均可以用于第一效力测定。
在一些方面，所述一种或多种蛋白质运输抑制剂可包含布雷菲德菌素(brefeldin)、GolgiStopTM蛋白质运输抑制剂(BD)、布雷菲德菌素和GolgiStopTM蛋白质运输抑制剂的组合或本领域已知的任何其它蛋白追踪抑制剂(protein trackinginhibitor)。
在第二效力测定的一些方面，步骤(b)中的进一步温育在约37℃下进行。
在第二效力测定的一些方面，步骤(b)中的进一步温育在至少约37℃下进行。
如本领域技术人员所理解的，可以使用本领域已知的用于测定用包含可检测标签的抗体标记的细胞的百分比的任何标准技术，包括但不限于荧光激活细胞分选(FACS)，来完成测定步骤(g)中(g1)至(g3)的至少一个。
在第二效力测定的一些方面，步骤(g)可以包括测定(g1)至(g3)中的每一个。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第二效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是K562细胞，用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-CD107α抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少25％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是Raji细胞，用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-CD107α抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少2.5％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是RPMI细胞，用至少一种抗CD56抗体染色的活细胞也用至少一种抗CD107α抗体染色的百分比在3:1的E:T下为至少10％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以在于，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是RPMI细胞，用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-TNFα抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少10％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是K562细胞，用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-TNFα抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少25％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是Raji细胞，用至少一种抗CD56抗体染色并且也用至少一种抗TNFα抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少5％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是K562细胞，用至少一种抗CD56抗体染色并且也用至少一种抗IFNγ抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少25％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是Raji细胞，用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-IFNγ抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少20％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是RPMI细胞，用至少一种抗CD56抗体染色并且也用至少一种抗IFNγ抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少10％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是K562细胞，用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-GM-CSF抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少4％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是K562细胞，用所述至少一种抗CD56抗体染色并且也用至少一种抗MIP1α抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少50％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是RPMI细胞，用所述至少一种抗CD56抗体染色并且也用至少一种抗MIP1α抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少30％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是Raji细胞，用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-MIP1α抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少20％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是K562细胞，用所述至少一种抗CD56抗体染色并且也用至少一种抗MIP1β抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少50％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是RPMI细胞，用所述至少一种抗CD56抗体染色并且也用至少一种抗MIP1β抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少25％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是Raji细胞，用所述至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-MIP1β抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少20％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是RPMI细胞，用所述至少一种抗CD56抗体染色并且也用至少一种抗-CD107α抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少40％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是RPMI细胞，用所述至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗TNFα抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少50％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是RPMI细胞，用至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗IFNγ抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少5％。
在一些方面，本公开的NK细胞部分的特征可以是，当使用上述第一效力测定来测试NK细胞部分时，其中靶细胞是RPMI细胞，用所述至少一种抗-CD56抗体染色并且也用至少一种抗-CM-CSF抗体染色的活细胞的百分比在3:1的E:T下为至少15％。
因此，根据本发明的一个方面，提供了一种离体生产经遗传修饰的自然杀伤(NK)细胞的方法，所述方法包括：
(a)下调NK细胞群中感兴趣基因的表达，以获得经遗传修饰以下调感兴趣基因的NK细胞群；
(b)扩增经遗传修饰以下调感兴趣基因的所述NK细胞群，从而获得离体扩增的NK细胞群；和
(c)上调所述离体扩增的NK细胞群中至少一种膜结合蛋白的表达，从而产生经遗传修饰的NK细胞。
根据本发明的另一方面，提供了一种离体生产表达至少一种膜结合蛋白的自然杀伤(NK)细胞的方法，所述方法包括：
(a)通过包括以下步骤的方法扩增NK细胞群：
(i)在允许细胞增殖的条件下培养所述NK细胞群，其中所述条件包括提供有效量的营养素、血清、IL-15和烟酰胺；和
(ii)在步骤(i)后5至10天，用有效量的新鲜营养素、血清、IL-15和烟酰胺补充所述NK细胞群，以产生扩增的NK细胞；
从而获得离体扩增的NK细胞群；和
(b)上调所述离体扩增的NK细胞群中至少一种膜结合蛋白的表达，从而产生表达所述至少一种膜结合蛋白的NK细胞。
如本文所用，术语“自然杀伤细胞”或“NK细胞”是指参与固有免疫应答的大颗粒淋巴细胞。在功能上，NK细胞通过细胞质颗粒的胞吐作用表现出针对多种靶标的细胞溶解活性，所述细胞质颗粒含有多种蛋白质，包括穿孔素(perforin)、颗粒素和颗粒酶蛋白酶(granzyme proteases)。杀伤是在接触依赖的非吞噬过程中触发的，该过程不需要预先对抗原致敏。
人NK细胞的特征是存在细胞表面标记CD16和CD56，但不存在T细胞受体(CD3)。人骨髓衍生的NK细胞进一步具有CD2+CD16+CD56+CD3-表型特征，通常还含有T细胞受体ζ链[ζ-TCR]，并且通常以NKp46、NKp30或NKp44为特征。非NK细胞，如NKT细胞或CD8NKT，具有T细胞和NK细胞两者的特征和细胞表面标记(例如CD3的表达)。
在一个实施方式中，NK细胞群包括成熟NK细胞。如本文所用，术语“成熟NK细胞”被定义为定向(committed)NK细胞，具有特征性表面标记和NK细胞功能，并且缺乏进一步分化的潜力。如本文所用，成熟的NK细胞包括但不限于可增殖并产生大量细胞因子的CD56bright细胞、表现出强大细胞毒性的CD56dim细胞、CD56brightCD94high和CD56dimCD94high细胞。CD56、CD3、CD94和其它标记的细胞表面表达可以例如通过FACS分析或免疫组织学染色技术来测定。
在另一个实施方式中，NK细胞群包括NK祖细胞，或NK祖细胞和成熟NK细胞的混合群。如本文所用，术语“祖细胞”是指能够分裂和/或经历分化成一种或多种成熟效应细胞的未成熟细胞。淋巴细胞祖细胞包括，例如，能够产生B细胞、T细胞和NK谱系的成熟细胞的多能造血干细胞。在B细胞谱系中(即，在产生成熟B细胞的发育途径中)，祖细胞还包括以免疫球蛋白基因重排和表达为特征的祖B细胞(pro-B cell)和前B细胞(pre-B cell)。在T和NK细胞谱系中，祖细胞还包括骨髓衍生的双能T/NK细胞祖细胞[例如，CD34(+)CD45RA(hi)CD7(+)和CD34(+)CD45RA(hi)Lin(-)CD10(+)细胞]，以及胸腺内祖细胞，包括双阴性(关于CD4和CD8)和双阳性胸腺细胞(T细胞谱系)和定向NK细胞祖细胞。
本发明一些实施方式的NK细胞是分离的细胞。
术语“分离的”是指至少部分地与自然环境分离，例如与组织分离，例如与人体分离。
术语“NK细胞群”是指NK细胞的异质混合物，例如在不同的成熟阶段、具有不同特征或具有不同的功能的NK细胞。
本发明一些实施方式的NK细胞可以来源于包含这种细胞的任何来源。NK细胞存在于许多组织中，并且可以从例如淋巴结、脾、肝、肺、肠、蜕膜(deciduous)获得，也可以从诱导的多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)获得。通常，含有异质淋巴细胞(heterogeneouslymphocyte cell)群的脐带血、外周血、动员的外周血(mobilized peripheral blood)和骨髓(例如CD34+细胞)，用于为研究和临床使用提供大量的NK细胞。
根据一个实施方式，NK细胞获自外周血。
根据本教导，可以采用任何血液采集方法。例如，用于采集血液部分的常用方法是单采术(apheresis)，其中通常通过离心将全供体血液(wholedonor blood)分离成血液成分(blood component)(例如血浆、白细胞和红细胞)，抽取选定的组分进行操作(例如白细胞部分的培养)，并将剩余部分返回供体。许多合适的血液分离装置是可商购的。通常，单采术适用于从所述供体的外周血中分离血液成分。
可以处理淋巴细胞部分，例如“血沉棕黄层(buffy coat)”或单采单元以富集或纯化或分离具体限定的细胞群。术语“纯化”和“分离”不需要绝对的纯度；相反，这些只是作为相对术语。因此，例如，纯化的淋巴细胞群是其中特定细胞比其源组织中的细胞更富集的细胞群。可以富集基本上纯的淋巴细胞的制备物，使得所需细胞(例如NK细胞)占制剂中存在的总细胞的至少10％、20％、30％、40％、50％或更多。用于富集、纯化和分离淋巴细胞的方法是本领域公知的，可以基于所需的群选择合适的方法。例如，淋巴细胞富集可以使用商业上可获得的用于负选择(negatively selecting)不需要的细胞的制剂进行，例如FICOLL-HYPAQUETM和配制用于富集全淋巴细胞、T细胞或NK细胞的其它密度梯度培养基。
从血液、骨髓、淋巴细胞制备物(例如单采单元)或组织样品中选择NK细胞的方法是本领域熟的(参见，例如，litwin等人的美国专利号5,770,387，其通过引用整体并入本文)。最常用的是基于CD56+细胞的分离和纯化的方案(通常在单核细胞分级分离之后)，以及非NK细胞(例如CD3+、CD19+、CD14+、CD34+和/或CD133+细胞等)的耗尽(depletion)。可以采用两种或多种方案的组合来提供具有更高纯度的非NK污染物的NK细胞群。NK细胞制备物的纯度对于临床应用具有重要意义，因为非NK细胞，如T细胞和NKT细胞，有助于抗原特异性反应，如移植物抗宿主病(GVHD)，从而损害了NK细胞移植的潜在优势。用于分离NK细胞的市售试剂盒包括一步法(例如，CD56微珠(microbead)和CD56+、CD56+、CD16+分离试剂盒，购自Miltenyi Biotec,Auburn CA)，和多步法，包括CD3+的耗尽或部分耗尽，或用识别和去除T细胞、B细胞、干细胞、树突状细胞、单核细胞、粒细胞和红细胞的非NK细胞抗体(例如，OKT-3)的耗尽。
根据表型选择NK细胞的方法包括但不限于免疫检测和FACS分析。在具体实施方式中，NK细胞群的CD3+细胞、CD14+细胞、CD19+细胞等被耗尽，或者通过免疫磁性选择，例如使用CliniMACS(LS Column,Miltenyi Biotec)针对CD56+细胞进行选择。
因此，在一些实施方式中，针对NK细胞来选择或富集NK细胞群，并且NK细胞群可以是CD3-耗尽的NK细胞部分。
根据另一个实施方式，针对NK细胞来选择或富集NK细胞群，并且NK细胞群可以是CD56+NK细胞部分。
根据一个实施方式，NK细胞群包含CD56+CD16+CD3-细胞和/或CD56+CD16-CD3-细胞。
在具体实施方式中，培养开始时(即在离体扩增前)，包含NK细胞的细胞群包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的CD3-/CD56+细胞。
在具体实施方式中，在培养开始时，包含NK细胞的细胞群包含至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的CD3-/CD56+细胞。
在一些实施方式中，在培养开始时，包含NK细胞的细胞群包含10％至30％CD3-/CD56+细胞，10％至50％ CD3-/CD56+细胞，20％至40％ CD3-/CD56+细胞，20％至60％CD3-/CD56+细胞，30％至50％ CD3-/CD56+细胞，30％至70％ CD3-/CD56+细胞，40％至60％CD3-/CD56+细胞，40％至80％ CD3-/CD56+细胞，50％至70％ CD3-/CD56+细胞，50％至90％CD3-/CD56+细胞，60％至80％ CD3-/CD56+细胞，60％至100％ CD3-/CD56+细胞，70％至90％ CD3-/CD56+细胞，或80％至100％ CD3-/CD56+细胞。
应当理解，在培养开始时，包含NK细胞的细胞群可以包含残余的单核细胞、B细胞、T细胞、树突状细胞等，然而，这些细胞在离体培养过程中被去除(ablate)。
在一些实施方式中，NK细胞群不含红细胞。因此，在一些实施方式中，在CD3+/CD14+/CD19+细胞耗尽或CD56+细胞选择之前或之后，NK细胞部分在培养前经历红细胞(RBC)裂解。在具体实施方式中，使用氯化铵钾(ACK)缓冲液(Gibco,Thermo Fischer Scientific)完成红细胞裂解。
根据一些实施方式，NK细胞可以从新鲜细胞群培养，而其它实施方式从储存的细胞群(如冷冻保存和解冻的细胞)或先前培养的细胞群培养NK细胞。
本发明一些实施方式的NK细胞是经遗传修饰的。
术语“经遗传修饰的”是指根据所需的应用(例如，根据待治疗的疾病)，被操纵以表达或不表达特定基因、标记或肽或分泌或不分泌特定肽(例如，细胞因子)的细胞。
遗传修饰可能导致细胞永久性或暂时性的遗传改变。
根据一个实施方式，遗传修饰在细胞基因组中。这种修饰通常是稳定的。
根据一个实施方式，通过下调NK细胞群中感兴趣基因的表达来对NK细胞进行遗传修饰，从而获得经遗传修饰以下调感兴趣基因的NK细胞群。
如本文所用，术语“感兴趣基因”是指编码所需mRNA或多肽的核苷酸序列。根据上下文，感兴趣基因是指脱氧核糖核酸，例如DNA模板中可转录成RNA转录物(transcript)的感兴趣基因，或核糖核酸，例如RNA转录物中可以在体外、体内或离体翻译产生编码的感兴趣的多肽的感兴趣基因。
根据一个实施方式，感兴趣基因编码转录因子(transcription factor)、转录阻遏物、招募蛋白(recruiting protein)、非编码RNA(例如tRNA、rRNA、snoRNA、siRNA、miRNA、长ncRNA等)、分泌的蛋白质(例如细胞因子、趋化因子、生长因子、激素)、膜蛋白、细胞表面蛋白(例如受体、标记)、酶(例如激酶)、溶酶体相关蛋白、细胞溶解蛋白和金属蛋白酶。
根据一个实施方式，感兴趣基因包括但不限于其产物影响NK细胞的增殖、存活率、功能性例如细胞因子产生(例如IFNγ)和/或细胞毒性活性的基因。
根据一个实施方式，感兴趣基因包含CISH、TGFβ受体或CD38。
根据一个具体实施方式，感兴趣基因使NK细胞对IL-15更加敏感。
根据一个具体实施方式，感兴趣基因包括CISH。
如本文所用，术语“CISH”是指这样的基因，其编码具有基因符号“CISH”的细胞因子诱导含SH2蛋白(CIS)，或者例如基因库登记号NP_037456.5和NP_659508.1(蛋白质)以及NM_013324.7和NM_145071.4(mRNA)，或其同源物。
根据一个具体实施方式，感兴趣基因包含TGFβ受体。
如本文所用，术语“TGFβ受体”是指这样的基因，其编码具有基因符号“TGFBR1”的转化生长因子β受体1，或者例如基因库登记号NP_001124388.1、NP_001293139.1或NP_004603.1(蛋白质)和NM_001130916.3、NM_001306210.2或NM_004612.4(mRNA)，或其同源物；这样的基因，其编码具有基因符号“TGFBR2”的转化生长因子β受体2，或例如基因库登记号NP_001020018.1或NP_003233.4(蛋白质)和NM_001024847.2或NM_003242.6(mRNA)，或其同源物；或这样的基因，其编码具有基因符号“TGFBR3”的转化生长因子β受体3，或例如基因库登记号NP_001 182612.1、NP_001182613.1或NP_003234.2(蛋白质)和NM_001 195683.2、NM_001 195684.1或NM_003243.5(mRNA)，或其同源物。
根据一个具体实施方式，感兴趣基因包含CD38。
如本文所用，术语“CD38”是指这样的基因，其编码具有基因符号“CD38”的CD38分子，或例如基因库登记号NP_00 1766.2(蛋白质)和NM_001775.4，或其同源物。
如本文所用，短语“下调表达”是指使用干扰转录(例如DNA编辑剂)和/或翻译(例如RNA沉默剂)的各种分子在基因组和/或转录水平下调感兴趣基因(例如CISH、CD38或TGFβ受体)的蛋白质产物的表达。
表达的下调可以是瞬时的或永久的。
对于相同的培养条件，与在相同物种但未与下调剂接触或与载体对照(也称为“对照”)接触的细胞中的表达相比，该表达通常被表达。
根据具体实施方式，下调表达分别是指通过RT-PCR或蛋白质印迹检测到的mRNA和/或蛋白质的缺失。
根据其它具体实施方式，下调表达分别指通过RT-PCR或蛋白质印迹检测的mRNA和/或蛋白质水平的降低。所述降低可以是降低至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％。
能够下调感兴趣基因(例如CISH、CD38或TGFβ受体)表达的剂的非限制性示例在下文详细描述。
以下是用于在基因组(DNA)水平上下调感兴趣基因的表达的方法和DNA编辑剂，以及可根据本发明的具体实施方式使用的用于实施其的剂的各种非限制性示例的描述。
使用工程内切核酸酶进行基因组编辑-该方法是指一种反向遗传学方法，使用人工工程核酸酶在基因组的所需位置切割并产生特定的双链断裂，然后通过细胞内源性过程，例如同源定向修复(homology directed repair，HDR)和非同源末端连接(non-homologous end-joining，NHEJ)，进行修复。NHEJ在双链断裂中直接连接DNA末端，而HDR利用同源序列作为模板在断裂点再生缺失的DNA序列。为了向基因组DNA引入特定的核苷酸修饰，在HDR过程中必须存在含有所需序列的DNA修复模板。
不能使用传统的限制性内切核酸酶进行基因组编辑，因为大多数限制性内切核酸酶将DNA上的几个碱基对识别为它们的靶标，并且在基因组的许多位置发现识别的碱基对组合的可能性非常高，从而导致不限于所需位置的多次切割。为了克服这一挑战并产生位点特异性单链或双链断裂，迄今为止已经发现并生物工程化了几种不同类型的核酸酶。这些包括兆核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription-activator like effector nuclease，TALEN)、T-GEE系统和CRISPR/Cas系统。
兆核酸酶±兆核酸酶通常分为4个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cysbox家族和HNH家族。这些家族的特征是影响催化活性和识别序列的结构基序。例如，LAGLIDADG家族的成员的特征是具有保守的LAGLIDADG基序(conserved LAGLIDADG motif)的一个或两个拷贝。这四个兆核酸酶的家族在保守的结构元件方面彼此存在很大差异，因此在DNA识别序列特异性和催化活性方面也存在很大差异。兆核酸酶通常在微生物物种中发现，并且具有非常长的识别序列(>14bp)的独特性质，从而使它们在所需位置切割时自然具有非常特异性。
这可用于在基因组编辑中进行位点特异性双链断裂。本领域技术人员可以使用这些天然存在的兆核酸酶，然而这种天然存在的兆核酸酶的数量是有限的。为了克服这一挑战，已经使用诱变和高通量筛查方法来创建识别独特序列的兆核酸酶变体。例如，各种兆核酸酶已经融合，产生了能够识别新序列的杂合酶。
或者，可改变兆核酸酶的DNA相互作用氨基酸以设计序列特异性兆核酸酶(参见例如美国专利号8,021,867)。可以使用在如下文献中描述的方法来设计兆核酸酶：例如Certo,MT等人，Nature Methods(2012)9:073-975；美国专利号8,304,222；8,021,867；8,119,381；8,124,369；8,129,134；8,133,697；8,143,015；8,143,016；8,148,098；或8,163,514，其各自的内容通过引用整体并入本文。或者，具有位点特异性切割特性的兆核酸酶可以使用市售技术获得，例如Precision Biosciences的Directed Nuclease EditorTM基因组编辑技术。
ZFN和TALEN±两类不同的工程核酸酶，锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，均已被证明在产生靶向双链断裂方面是有效的(Christian等人，2010；Kim等人，1996；Li等人，2011；Mahfouz等人，2011；Miller等人，2010)。
基本上，ZFN和TALEN限制性内切核酸酶技术利用了非特异性DNA切割酶，其与特异性DNA结合结构域(分别是一系列锌指结构域或TALE重复)连接。通常，选择DNA识别位点和切割位点彼此分开的限制酶。切割部分被分离，然后连接至DNA结合结构域，从而产生对所需序列具有非常高特异性的内切核酸酶。具有这种特性的示例性限制性内切酶是Fokl。另外，Fokl的优点是需要二聚化以具有核酸酶活性，这意味着随着每个核酸酶配偶体(nuclease partner)识别独特的DNA序列，特异性显著增加。为了增强这种效果，Fokl核酸酶已经被工程化，只能以异二聚体发挥作用，并具有更高的催化活性。异二聚体功能核酸酶避免了不需要的同二聚体活性的可能性，并因此增加了双链断裂的特异性。
因此，例如为了靶向特定位点，ZFN和TALEN被构建为核酸酶对，该对中的每个成员被设计为结合靶向位点处的相邻序列。在细胞中瞬时表达时，核酸酶与其靶位点结合，并且FokI结构域异二聚体化以产生双链断裂(DSB)。通过非同源末端连接途径修复这些双链断裂通常会导致小缺失或小序列插入(Indels)。由于NHEJ进行的每次修复都是独特的，因此使用单个核酸酶对可以在靶位点产生具有一系列不同缺失的等位基因系列。
缺失的长度通常从几个碱基对到几百个碱基对不等，但是通过同时使用两对核酸酶，在细胞培养中成功地产生了较大的缺失(Carlson等人，2012；Lee等人，2010)。此外，当与靶向区域具有同源性的DNA片段与核酸酶对一起引入时，可以通过同源定向修复来修复双链断裂，以产生特异性修饰(Li等人，2011；Miller等人，2010；Urnov等人，2005)。
尽管ZFN和TALEN的核酸酶部分具有相似的性质，但这些工程核酸酶之间的差异在于它们的DNA识别肽。ZFN依赖于Cys2-[His2]锌指，TALEN依赖于TALE。这两种DNA识别肽结构域都具有天然存在于其蛋白质组合中的特征。Cys2-His2锌指通常在间隔3bp的重复序列中发现，并在多种核酸相互作用蛋白的不同组合中发现。另一方面，TALE在氨基酸和识别的核苷酸对之间具有一比一识别比例的重复序列中被发现。由于锌指和TALE均以重复模式出现，因此可以尝试不同的组合来创建多种序列特异性。用于制备位点特异性锌指内切核酸酶的方法包括，例如，模块化组装(其中与三联体序列相关的锌指成排连接以覆盖所需的序列)、OPEN(在细菌系统中，对肽结构域和三联体核苷酸进行低严格性选择，随后对肽组合和最终靶标进行高严格性选择)，和锌指文库的细菌单杂交筛查等。ZFN也可以被设计，并从例如Sangamo BiosciencesTM(Richmond,CA)商购获得。
设计和获得TALEN的方法描述于如下文献中：例如Reyon等人，NatureBiotechnology2012年5月,30(5):460-5；Miller等人，Nat Biotechnol.(2011)29:143-148；Cermak等人，Nucleic Acids Research(2011)39(12):e82；和Zhang等人，NatureBiotechnology(2011)29(2):149-53。梅奥诊所(Mayo Clinic)最近开发了名为Mojo Hand的基于网络的程序，用于设计基因组编辑应用的TAL和TALEN结构(可以通过http://www(.)talendesign(.)org访问)。TALEN也可以被设计，并从例如Sangamo BiosciencesTM(Richmond,CA)商购获得。
T-GEE系统(TargetGene的基因组编辑引擎)-提供了含有多肽部分和特异性赋予核酸(specificity conferring nucleic acid，SCNA)的可编程核蛋白分子复合物，其在体内靶细胞中组装，并且能够与预定的靶核酸序列相互作用。可编程核蛋白分子复合物能够特异性修饰和/或编辑靶核酸序列内的靶位点和/或修饰靶核酸序列的功能。核蛋白组合物包含(a)编码嵌合多肽的多核苷酸分子，其包含(i)能够修饰靶位点的功能结构域，和(ii)能够与特异性赋予核酸相互作用的连接结构域，和(b)特异性赋予核酸(SCNA)，其包含(i)与靶位点侧翼的靶核酸的区域互补的核苷酸序列，和(ii)能够特异性连接至所述多肽的连接结构域的识别区域。该组合物能够通过赋予特异性的核酸(specificity-conferringnucleic acid)和靶核酸的碱基配对，以分子复合物与靶核酸的高特异性和结合能力，精确、可靠和具有成本效益地(cost-effectively)修饰预定的靶核酸序列。该组合物遗传毒性较小、组装模块化，使用单一平台而无需定制，可在专用核心设施之外独立使用，开发时间较短，成本较低。
CRISPR-Cas系统-许多细菌和古细菌(archea)含有基于内源性RNA的适应性免疫系统，其可以降解入侵的噬菌体和质粒的核酸。这些系统由产生RNA组分的规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)基因和编码蛋白质组分的CRISPR相关(Cas)基因组成。CRISPR RNA(crRNA)包含与特定病毒和质粒同源的短段(short stretch)，并作为指导(direct)Cas核酸酶以降解相应病原体的互补核酸的向导(guide)。对酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)II型CRISPR/Cas系统的研究已经表明，三种组分形成RNA/蛋白复合物，并且它们一起足以实现序列特异性核酸酶活性：Cas9核酸酶、含有与靶序列(gRNA)同源的20个碱基对的crRNA，和反式激活crRNA(tracrRNA)(Jinek等人，Science(2012)337:816-821)。
进一步证明了由crRNA和tracrRNA融合组成的合成嵌合单向导RNA(syntheticchimeric single guide RNA，sgRNA)可以在体外指导Cas9切割与crRNA互补的DNA靶标。还证明了Cas9与合成sgRNA的瞬时表达可用于在多种不同物种中产生靶向双链断裂(DSB)(Cho等人，2013；Cong等人，2013；DiCarlo等人，2013；Hwang等人，2013a,b；Jinek等人，2013；Mali等人，2013)。sgRNA(本文也称为单向导RNA(sgRNA))通常是80至100个核苷酸的序列，其编码靶同源序列(crRNA)和内源细菌RNA的组合，该内源细菌RNA在单个嵌合转录物中将crRNA连接到Cas9核酸酶(tracrRNA)。
用于基因组编辑的CRIPSR/Cas系统包含两种不同的组分：sgRNA和核酸内切酶(例如Cas9)，或三种不同的组分：gRNA、tracrRNA和核酸内切酶(例如Cas9)。
通过gRNA序列和互补基因组DNA之间的碱基配对将sgRNA/Cas9复合物或gRNA/tracrRNA/Cas9招募到靶序列。为了成功结合Cas9，基因组靶序列还必须包含靶序列之后的正确的原间隔序列邻近基序(Protospacer Adjacent Motif，PAM)序列。sgRNA/Cas9复合物的结合或gRNA/tracrRNA/Cas9的结合将Cas9定位于基因组靶序列，使得Cas9可以切割DNA的两条链，引起双链断裂(DSB)。正如ZFN和TALEN一样，CRISPR/Cas产生的双链断裂(DSB)可以经历同源重组或NHEJ，并且在DNA修复过程中容易受到特定序列修饰的影响。
Cas9核酸酶具有两个功能结构域：RuvC和HNH，各自切割不同的DNA链。当这两个结构域都有活性时，Cas9会引起基因组DNA双链断裂。
CRISPR/Cas的一个显著优点是该系统的高效率与轻松创建合成sgRNA或gRNA的能力相结合。这创建了可容易地被修饰以在不同基因组位点靶向修饰和/或在相同位点靶向不同修饰(例如在CISH、CD38或TGFβ受体基因座(gene locus)中)的系统。此外，已经建立了能够同时靶向多个基因的方案。大多数携带突变的细胞在靶向的基因中存在双等位基因突变。
然而，sgRNA或gRNA序列与基因组DNA靶序列之间的碱基配对相互作用的明显灵活性允许与待被Cas9切割的靶序列的不完美匹配。
含有单个无活性催化结构域(RuvC-或HNH-)的Cas9酶的修饰形式被称为“切口酶(nickases)”。由于只有一个活性核酸酶结构域，Cas9切口酶仅切割靶DNA的一条链，从而产生单链断裂或“切口”。单链断裂或切口主要通过单链断裂修复机制修复，该机制涉及蛋白质，例如但不仅限于PARP(传感器)和XRCC1/LIG III复合物(连接(ligation))。然而，在通常被称为“双切口”CRISPR系统中，由Cas9切口酶引入的两个近端相对的链切口被视为双链断裂。双切口基本上是非平行的DSB，可以像其它DSB一样通过HR或NHEJ修复，这取决于对基因靶的所需效果。因此，如果特异性和降低的脱靶效应是至关重要的，那么使用Cas9切口酶通过设计两个gRNA，其中靶序列非常接近且位于基因组DNA相对链上，从而创建双切口，这将减少脱靶效应，因为单独的gRNA将产生不可能改变基因组DNA的切口。
含有两个无活性催化结构域(死的Cas9，或dCas9)的Cas9酶的修饰形式没有核酸酶活性，但仍然能够基于sgRNA或gRNA特异性结合DNA。dCas9可以用作DNA转录调节子的平台，通过将无活性的酶与已知的调节结构域融合来激活或抑制基因表达。例如，单独的dCas9与基因组DNA中的靶序列的结合可以干扰基因转录。
或者，CRISPR系统可以与各种效应物结构域，如DNA切割结构域融合。DNA切割结构域可以从任何核酸内切酶或核酸外切酶获得。可衍生DNA切割结构域的核酸内切酶的非限制性示例包括但不限于限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶(参见，例如，新英格兰生物实验室目录(New England Biolabs Catalog)或Belfort等人,(1997)Nucleic Acids Res.)，例如Fokl核酸内切酶和I-CreI。
可用gRNA进行DNA编辑的其它Cas核酸内切酶包括但不限于Cas9、Cpf1(Zetsche等人，2015，Cell.163(3):759-71)、C2c1、C2c2、C2c3(Shmakov等人，Mol Cell.2015年11月5日；60(3):385-97)、Casx和Cpf1/Cas 12a。
有许多公开可用的工具可用于帮助选择和/或设计靶序列以及不同物种中不同基因的生物信息学确定的独特sgRNA或gRNA列表，例如但不限于Feng Zhang实验室的靶标查找器(Target Finder)、Alex Scier实验室靶标查找器(ChopChop)、Michael Boutros实验室的靶标查找器(E-CRISP)、RGEN工具：Cas-OFFinder、CasFinder：用于识别基因组中特定Cas9靶标的灵活算法和CRISPR最佳靶标查找器。
为了使用CRISPR系统，crRNA(gRNA)、tracrRNA和Cas核酸内切酶(例如Cas9)应该在靶细胞中表达或存在(例如，作为核糖核蛋白复合物(RNP))。或者，sgRNA和Cas核酸内切酶(例如Cas9)，或gRNA、tracrRNA和Cas核酸内切酶(例如Cas9)，都应该在靶细胞中表达或存在(例如，作为核糖核蛋白复合物)。插入载体可包含单个质粒上的所有盒，或者由单独的质粒表达的所有盒。CRISPR质粒是可商购的，如购自Addgene(Cambridge,Mass.)的px330质粒。
根据一个具体实施方式，DNA编辑剂包括DNA靶向模块(例如sgRNA)。
根据一个具体实施方式，DNA编辑剂包含核酸酶(例如核酸内切酶)和DNA靶向模块(例如sgRNA)。
根据一个具体实施方式，DNA编辑剂是CRISPR/核酸内切酶。
根据一个具体实施方式，DNA编辑剂是CRISPR/Cas，例如sgRNA和Cas9或者gRNA、tracrRNA和Cas9。
根据一个具体实施方式，DNA编辑剂是sgRNA和Cas9的RNP复合物。
可用于本发明的sgRNA的非限制性示例包含下表2中所示的核酸序列。
根据一个具体实施方式，使用例如Nucleofector或BTX-Gemini Twin Wave电穿孔器，通过RNP电穿孔将RNP复合物引入NK细胞中。
可用于在基因组(DNA)水平下调感兴趣基因表达的其它DNA编辑剂和系统包括但不限于转座子和TFO。这些将在下面简要讨论。
转座子-指包含可以在单个细胞的基因组内移动到不同的位置的核苷酸序列的可移动遗传元件(mobile genetic element)。在该过程中，转座子可引起突变和/或改变细胞基因组中DNA的数量。已经分离或设计了能够在细胞(例如脊椎动物)中转座的许多转座子系统，例如Sleeping Beauty[Izsvjk和Ivics，Molecular Therapy(2004)9,147-156]、piggyBac[Wilson等人，Molecular Therapy(2007)15,139-145]、Tol2[Kawakami等人，PNAS(2000)97(21):11403-11408]或Frog Prince[Miskey等人，Nucleic Acids Res.12月1日,(2003)31(23):6873-6881]。通常，DNA转座子以简单的切割和粘贴(cut-and-paste)的方式从一个DNA位点转移到另一个DNA位点。
三链体形成寡核苷酸(TFO)-TFO可以被设计成以序列特异性方式识别并结合双链螺旋DNA中的多嘌呤/多嘧啶(polypurine/polypirimidine)区域。这些识别规则概述于如下文献：Maher III,L.J.等人，Science,1989；245:725-730；Moser,H.E.等人，Science,1987；238:645-630；Beal,P.A.等人，Science,1992；251:1360-1363；Cooney,M.等人，Science,1988；241:456-459；和Hogan,M.E.等人，EP公开375408。寡核苷酸的修饰，如嵌入剂和主链取代的引入，以及结合条件(pH和阳离子浓度)的优化有助于克服TFO活性的固有障碍，如电荷排斥和不稳定性，并且显示合成的寡核苷酸可以靶向特定的序列(参见Seidman和Glazer，J Clin Invest(2003)112:487-94)。
通常，三链体形成寡核苷酸具有序列对应关系：
寡核苷酸3’--A G T
双链体5’—A G C T
双链体3’--T C G A
用TFO转染细胞(例如，通过阳离子脂质体)，并与靶DNA形成三螺旋结构，会诱导空间和功能变化，阻断转录起始和延伸，从而在内源DNA中引入所需序列变化，并导致基因表达的特异性下调。
此外，根据上述原理设计的TFO可以诱导能够实现DNA修复的定向诱变，从而提供内源基因表达的下调和上调(Seidman和Glazer,J Clin Invest(2003)112:487-94)。有效TFO的设计、合成和施用的详细描述可在如下文献中找到：Froehler等人的美国专利申请号2003017068和20030096980，Emanuele等人的20020128218和20020123476，以及Lawn的美国专利号5,721,138。
应当理解，DNA编辑剂可以是引起随机突变的诱变剂，并且可以选择表现出感兴趣基因的表达水平和/或活性下调的细胞。
诱变剂可以是但不限于遗传剂、化学剂或辐射剂。例如，诱变剂可以是电离辐射，例如但不限于紫外线、γ射线或α粒子。其它诱变剂可包括但不限于碱基类似物，其可引起复制错误；脱氨剂，如亚硝酸；嵌入剂(intercalating agent)，如溴化乙锭；烷基化剂，如溴尿嘧啶；转座子；天然和合成的生物碱；溴及其衍生物；叠氮化钠；补骨脂素(例如，与紫外辐射结合)。诱变剂可以是化学诱变剂，例如但不限于ICR191、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、5-azaC、N-甲基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲基磺酸乙酯(EMS)或N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)。
如上所述，可用于下调NK细胞中感兴趣基因表达的其它剂包括RNA沉默剂。示例性的RNA沉默剂包括dsRNA，如siRNA、miRNA和shRNA；反义RNA(即单链RNA)；DNAzyme、RNAzyme和MNAzyme。
无论采用何种方法下调感兴趣基因的表达，在细胞培养中的NK细胞群中的下调通常在体外进行(如下文进一步讨论的)。
根据一个实施方式，从细胞培养开始，下调进行1至7天、1至6天、1至5天、1至4天、1至3天、1至2天。
根据一个实施方式，从细胞培养开始，下调进行12至24小时、12至36小时、12至48小时、24至36小时、24至48小时、24至60小时、24至72小时、36至48小时、36至60小时、36至72小时、48至60小时、48至72小时、48至84小时、60至72小时、60至84小时、60至96小时、72至84小时、72至96小时或72至120小时。
根据一个具体的实施方式，从细胞培养开始，下调进行24至48小时。
根据一个具体的实施方式，从细胞培养开始，下调进行24至72小时。
根据一个实施方式，该方法包括扩增经遗传修饰以下调感兴趣基因的NK细胞群，从而获得离体扩增的NK细胞群。
当涉及NK细胞群时，术语“扩增的”是指通过离体或体外扩增(增殖)而增加的NK细胞数量，而不会对细胞的生存力(viability)或功能性产生负面影响。
根据一个实施方式，本发明一些实施方式的NK细胞的扩增倍数为2至12，例如3至11，例如4至10(即从培养的第0天至第14至16天)。
NK细胞的扩增通常在离体细胞培养中进行。
先前的研究已经证明，与用细胞因子但含有少于0.1mM烟酰胺和/或其它烟酰胺部分(moiety)培养的细胞相比，用生长因子和烟酰胺和/或其他烟酰胺部分培养短至7天或长达3周的NK细胞，产生增强的优先的增殖和/或功能性(参见PCT公开WO2011/080740)。在制备用于免疫治疗的临床上合适的NK细胞时，需要提供显著的离体NK细胞扩增，同时保留扩增的NK细胞在治疗上有利的功能性，而不需要长时间的培养。
根据一个实施方式，NK细胞的扩增进行7至30天、7至25天、7至21天、7至14天、10至24天、10至21天、10至18天、10至15天、10至12天、12至21天、12至18天、12至15天、14至21天、14至18天、14至16天、14至15天、16至21天、16至18天，或18至21天。
根据一个具体实施方式，NK细胞的扩增进行12至18天。
根据一个具体实施方式，NK细胞的扩增进行14至16天。
根据本发明的这一方面，可以通过向离体NK细胞提供细胞增殖条件并用烟酰胺部分离体培养NK细胞，来进行NK细胞的离体培养，从而离体扩增NK细胞群。
如本文所用，“培养”包括提供维持NK细胞所需的化学和物理条件(例如，温度、气体)，以及营养素和生长因子。在一个实施方式中，培养NK细胞包括为NK细胞提供用于NK细胞增殖的条件。可支持NK细胞增殖的化学条件的示例包括但不限于缓冲液、营养素、血清、维生素和抗生素，以及细胞因子和通常在生长(即培养)培养基中提供的其他生长因子。在一个具体实施方式中，细胞增殖的条件包括营养素、血清和细胞因子。根据一个具体实施方式，生长因子包括，例如IL-15、IL-2、IL-7、IL-12、IL-21、SCF和FLT3。
根据一个实施方式，允许细胞增殖的条件使NK细胞每1天、1.25天、1.5天、1.75天或2.0天加倍。
在一个实施方式中，NK培养基包括最低必需培养基(minimal essential medium，MEM)，如MEMα(BI、Bet HaEmek、Israel)和血清。在一些实施方式中，以培养基的2-20％、5-15％或5-10％提供血清。在具体实施方式中，血清是人血清，以培养基的10％提供。在一个具体实施方式中，培养基是包含10％人AB血清的MEMα(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。适用于本发明的其他培养基包括但不限于格拉斯科培养基(Glascow's medium，GibcoCarlsbad CA)、RPMI培养基(Sigma-Aldrich，StLouis MO)或DMEM(Sigma-Aldrich，StLouis MO)。值得注意的是，许多培养基都含有烟酰胺作为维生素补充物，例如，MEMα(8.19mM烟酰胺)、RPMI(8.19pM烟酰胺)、DMEM(32.78pM烟酰胺)和格拉斯科培养基(16.39pM烟酰胺)，然而，本发明的方法涉及外源(exogenously)添加的烟酰胺，其补充培养基配方中所含有的烟酰胺和/或烟酰胺部分，或者由培养基成分浓度的整体调整所产生的烟酰胺和/或烟酰胺部分。
根据一个实施方式，在允许细胞增殖的条件下培养NK细胞包括为细胞提供营养素、血清和细胞因子。在一些实施方式中，至少一种生长因子包括细胞因子和/或趋化因子(例如IL-15、IL-2、IL-7、IL-12、IL-21、SCF和FLT3)。细胞因子和其他生长因子通常以0.5ng/ml至100ng/ml，或1.0ng/ml至80ng/ml，更通常是5ng/ml至750ng/ml，还更通常5.0ng/ml至50ng/ml的浓度范围来提供(可以考虑高达10倍的此类浓度)，并且可以商购获得，例如，从Perpo Tech,Inc.,Rocky Hill,NJ,USA获得。在一个实施方式中，允许细胞增殖的条件包括提供细胞因子白细胞介素15(IL-15)。在具体实施方式中，NK细胞群用20ng/ml的IL-15培养。
此外，在这方面应该理解的是，新的细胞因子不断被发现，其中一些细胞因子可用于本发明的NK细胞增殖方法。
培养基通常还包含抗生素，例如但不限于庆大霉素、青霉素或链霉素。
对于其中将细胞引入(或再引入)至人类对象的应用，通常优选使用无血清制剂，如用于淋巴细胞培养的AIM无血清培养基或骨髓培养基。这样的培养基制剂和补充剂可从商业来源获得，例如Invitrogen(GIBCO)(Carlsbad,CA,USA)。可以对培养物补充氨基酸、抗生素和/或细胞因子，以促进最佳生存力、增殖、功能性和/或存活率。
根据一个实施方式，NK细胞群与营养素、血清、细胞因子(例如IL-15)和烟酰胺和/或烟酰胺部分一起培养。如本文所用，术语“烟酰胺部分”是指烟酰胺以及衍生自烟酰胺、其衍生物、类似物和代谢物的产物，如例如，NAD、NADH和NADPH，其能够有效并优先增强NK细胞增殖和/或激活。烟酰胺衍生物、类似物和代谢物可以通过添加到如下文所述维持的NK培养物中、添加到功能测定(如杀伤和移动性测定(motility assay))，或以本领域公知的设计用于高通量测定(high-throughput assay)的自动筛选方案进行筛选和评估，以评估它们在培养中对体外NK增殖的作用，并在下文进一步讨论。
如本文所用，短语“烟酰胺类似物”是指已知在上述或类似测定中与烟酰胺作用类似的任何分子。烟酰胺类似物的代表性示例可包括但不限于苯甲酰胺、烟碱硫酰胺(nicotinethioamide)(烟酰胺的硫醇类似物)、烟酸和α-氨基-3-吲哚丙酸(α-amino-3-indolepropionic acid)。
短语“烟酰胺衍生物”还指烟酰胺本身或烟酰胺类似物的任何结构衍生物。此类衍生物的示例包括但不限于取代的苯甲酰胺、取代的烟酰胺和烟碱硫酰胺以及N-取代的烟酰胺和硫烟酰胺(nicotinthioamide)、3-乙酰基吡啶和烟酸钠(sodium nicotinate)。在本发明的一个具体实施方式中，烟酰胺部分是烟酰胺。
适用于本发明一些实施方式的烟酰胺或烟酰胺部分的浓度范围通常为约0.5mM至约50mM，约1.0mM至约25mM，约1.0mM至约15mM，约1.0mM至约10mM，约2.5mM至约20mM，约2.5mM至约10mM，约5.0mM至约10mM。基于烟酰胺的这些浓度对增殖和NK细胞功能的作用，烟酰胺的示例性有效浓度可以为约0.5mM至约15mM、1.0mM至10.0mM，通常为2.5mM、5.0mM或7.0mM。
根据本发明的具体实施方式，烟酰胺的浓度范围为约0.5、约0.75、约1.0、约1.25、约1.5、约1.75、约2.0、约2.25、约2.5、约2.75、约3.0、约3.25、约3.5、约3.75、约4.0、约4.25、约4.5、约4.75、约5.0、约5.25、约5.5、约5.75、约6.0、约6.25、约6.5、约6.75、约7.0、约7.25、约7.5、约7.75、约8.0、约8.25、约8.5、约8.75、约9.0、约9.25、约9.5、约9.75、约10.0、约11.0、约12.0、约13.0、约14.0，约15.0、约16.0、约17.0、约18.0或约20.0mM。考虑所有有效的中间浓度。在具体实施方式中，允许增殖的条件包括1.0至10.0mM的烟酰胺。在具体实施方式中，允许增殖的条件包括5.0mM的烟酰胺。在其它具体实施方式中，允许增殖的条件包括7.0mM的烟酰胺。
可以根据NK增殖和/或活性的任何试验，例如细胞培养或功能，来确定所述烟酰胺和/或烟酰胺部分的合适浓度。烟酰胺的合适浓度是这样的浓度，在相同的试验和相似的培养条件(暴露于烟酰胺的持续时间、暴露于烟酰胺的时间)下，与含有少于0.1mM烟酰胺且来自相同NK细胞来源(例如脐带血、骨髓或外周血制剂)的“对照”培养物相比，在培养物中使用烟酰胺“增强”或导致培养物中NK细胞的增殖和/或功能的净增加。
在一些研究中，通过用营养素、血清、细胞因子和烟酰胺培养来离体扩增纯化的NK细胞，不需要在培养期间补充培养基或操作，而其它研究则主张在NK细胞培养过程中以不同的时间间隔补充(“再补料(refeeding)”)培养基。在本发明的一些实施方式中，在培养期间“再补料”NK细胞群。因此，在具体实施方式中，扩增NK细胞包括，在离体培养开始8至10天后，用新鲜的营养素、血清、IL-15和烟酰胺补充NK细胞群。在一些实施方式中，在离体培养开始后4至12天之间，离体培养开始后5至10天之间，或NK细胞培养开始后6至9天之间提供补充。
在一些实施方式中，在培养物中补充(或“再补料”)NK细胞不包括从NK细胞培养物中除去培养基。在一些实施方式中，补充(或“再补料”)包括除去细胞培养物的约30％至80％、约40％至70％或约45％至55％的NK细胞培养物的培养基，并用与除去的培养基具有相同组成和水平的营养素、血清、细胞因子(例如IL-15)和烟酰胺的相似(例如等量)体积的新鲜培养基替换。在其他实施方式中，再补料后的培养物体积达到NK细胞培养开始时(“接种”)原始培养物体积的大约两倍。
可以使用多种方法和装置培养NK细胞群。培养装置的选择通常基于培养的规模和目的。细胞培养物的放大优选涉及使用专用装置。用于大规模、临床级NK细胞生产的装置详细描述于如下文献：例如Spanholtz等人(PLoS ONE(2010)5:e9221)和Sutlu等人(Cytotherapy(2010),早期在线1-12)。在一些实施方式中，在培养瓶中，以每瓶100×106至4000×106个细胞的细胞密度进行NK细胞的培养。在具体实施方式中，在培养瓶中，以每瓶200×106至300×106个细胞的细胞密度进行NK细胞的培养(例如，离体培养的开始和/或“再补料”)。在一些实施方式中，培养瓶是包含气体可渗透膜的培养瓶，例如G-Rex培养装置(G-Rex 100M或封闭系统G-Rex MCS,WolfWilson,St Paul MN)。
根据培养装置的大小和体积，在培养瓶(如G-Rex培养装置)中接种NK细胞群可能受到不同密度的影响。本领域技术人员能够做出这样的决定。根据一个实施方式，以以下密度接种NK细胞群：0.01×106个细胞/ml至10×106个细胞/ml、0.01×106个细胞/ml至7.5×106个细胞/ml、0.01×106个细胞/ml至5×106个细胞/ml、0.1×106个细胞/ml至10×106个细胞/ml、0.1×106个细胞/ml至7.5×106个细胞/ml、0.1×106个细胞/ml至5×106个细胞/ml、0.1×106个细胞/ml至2.5×106个细胞/ml、0.1×106个细胞/ml至1×106个细胞/ml、0.25×106个细胞/ml至10×106个细胞/ml、0.25×106个细胞/ml至7.5×106个细胞/ml、0.25×106个细胞/ml至5×106个细胞/ml、0.25×106个细胞/ml至2.5×106个细胞/ml，或0.25×106个细胞/ml至1×106个细胞/ml。根据一个具体实施方式，以以下密度接种NK细胞群：0.25×106个细胞/ml至0.5×106个细胞/ml，例如0.35×106个细胞/ml至0.4×106个细胞/ml。
可以理解的是，培养瓶中的细胞密度在培养过程中随着细胞的增殖而增加。因此，在一些实施方式中，在培养扩增过程中，以以下密度培养NK细胞群：10×106至4000×106个细胞/瓶、25×106至4000×106个细胞/瓶、50×106至4000×106个细胞/瓶、100×106至4000×106个细胞/瓶、20×106至3000×106个细胞/瓶、100×106至3000×106个细胞/瓶、200×106至3000×106个个细胞/瓶、30×106至2000×106个细胞/瓶、100×106至2000×106个细胞/瓶、300×106至2000×106个细胞/瓶、40×106至1000×106个细胞/瓶、100×106至1000×106个细胞/瓶、400×106至1000×106个细胞/瓶、100×106至800×106个细胞/瓶、250×106至800×106个细胞/瓶、100×106至600×106个细胞/瓶，或150×106至500×106个细胞/瓶。在具体实施方式中，在培养瓶中培养的持续时间内，NK细胞群的NK细胞以每瓶100×106至3000×106个细胞的细胞密度进行培养。
NK细胞的培养可以在有或没有饲养细胞或饲养细胞层的情况下进行。根据一个实施方式，饲养细胞包括T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。根据一个具体实施方式，饲养细胞包括经辐射的细胞(即非增殖细胞)，例如经辐射的T细胞或经辐射的外周血单核细胞。辐射可以例如在20-50Gy(例如20Gy、30Gy、40Gy、50Gy)、130KV、5mA下进行。根据一个实施方式，当使用饲养细胞时，培养中NK细胞与饲养细胞的比例可以是1:1、1:2、1:3、2:1或3:1。根据一个具体实施方式，培养中NK细胞与饲养细胞的比例为1:1。
根据一个具体实施方式，当T细胞或PBMC(例如经辐射的T细胞或经辐射的PBMC)用作饲养细胞时，进一步用CD3激动剂补充培养物，以刺激饲养细胞层中的T细胞分泌有利于NK细胞扩增的生长因子。适用于本发明一些实施方式的方法的CD3激动剂包括但不限于抗-CD3单克隆-CD3激动剂抗体，如OKT-3、mAb 145-2C11、MGA031和ChAglyCD3。
根据一个实施方式，该方法包括在离体扩增的NK细胞群中上调至少一种膜结合蛋白的表达。
如本文所用，短语“上调表达”是指增加NK细胞上膜结合蛋白的表达。膜结合蛋白可以是NK细胞天然表达的蛋白质，或者是NK细胞非天然表达的蛋白质(即外源性蛋白)。
对于相同的培养条件，与相同物种但是未被修饰的细胞中的表达相比，该表达通常被表达，以增加膜结合蛋白的mRNA和/或蛋白质的水平，或者与载体对照(也称为“对照”)接触。
根据一个实施方式，上调膜结合蛋白的表达是指增加mRNA和/或蛋白水平，分别通过RT-PCR或蛋白质印迹检测。该增加可以是至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％，或至少99％或更多。
上调膜结合蛋白的表达可以在基因组水平(即，通过启动子、增强子、调节元件激活转录)、转录水平(即，正确剪接(correct splicing)、聚腺苷酸化(polyadenylation)、翻译激活)或蛋白质水平(即，翻译后修饰(post-translational modification)、与底物的相互作用等)进行。根据一个具体实施方式，通过将编码膜结合蛋白的外源核酸(例如mRNA)引入NK细胞，来影响NK细胞上膜结合蛋白表达的上调。因此，本发明一些实施方式的NK细胞被修饰以表达膜结合蛋白。
表达的上调可以是瞬时的或永久的。根据一个具体实施方式，膜结合蛋白的表达是瞬时的(即，细胞的基因组没有经遗传修饰以表达膜结合蛋白)(Pato等人，Clin.Exp.Immunol.2015年11月；182(2)220-9，其内容通过引用整体并入本文)。
如本文所用，术语“膜结合蛋白”是指存在于NK细胞膜上的重组分子。膜结合蛋白可以是与配体(例如抗原)结合并介导NK细胞的激活(例如，抗疾病细胞毒性活性或炎性细胞因子的产生)的受体。或者，膜结合蛋白可以是与NK细胞的存活率、增殖和/或分化相关的蛋白质。
如本文所用，术语“抗原”或“Ag”被定义为引起免疫应答的可溶性或不溶性(如膜相关)分子。本领域技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，以及碳水化合物、脂质和DNA，都可用作抗原。根据本发明的一些实施方式，抗原与恶性疾病相关，即肿瘤抗原(例如，肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原)、病毒蛋白抗原、细菌蛋白抗原或真菌蛋白抗原，如下文进一步详细描述的。
根据一个实施方式，膜结合蛋白包含IL-15、IL-15R、受体连接蛋白IL-15(RLI)或TLR。
如本文所用，术语“IL-15”是指具有基因符号“IL15”的白介素15基因的基因产物，或者例如基因库登记号NP_000576.1和NP_751915.1(蛋白质)和NM_000585.5和NM_172175.3(mRNA)，或其同源物。
根据一个具体实施方式，IL-15包含位于螺旋C末端的位置72处的天冬酰胺残基用天冬氨酸的氨基酸取代(即N72D取代)。
如本文所用，术语“IL-15受体”是指具有基因符号“IL15RA”的白细胞介素15受体亚单位α基因的基因产物，或者例如基因库登记号NP_001230468.1、NP_001243694.1、NP_002180.1和NP_751950.2(蛋白质)和NM_001243539.2、NM_001256765.1、NM_002189.4和NM_172200.3(mRNA)，或其同源物。
术语“受体连接蛋白IL-15(RLI)”是指包含通过柔性连接蛋白IL-15结合至IL-15的IL-15Rα的结合结构域(即，所谓的sushi结构域)的重组蛋白。在SEQ ID NO:25(称为301.A)和SEQ ID NO:28(称为301.B)中提供了可根据本发明的一些实施方式使用的示例性RLI。
如本文所用，术语“TLR”是指具有基因符号“TLR4”的Toll样受体4基因的基因产物，或者例如基因库登记号NP_003257.1、NP_612564.1和NP_612567.1(蛋白质)和NM_003266.4、NM_138554.5和NM_138557.3(mRNA)，或其同源物。术语“TLR”还指具有基因符号“TLR1”的toll样受体1基因、具有基因符号“TLR2”的toll样受体2基因、具有基因符号“TLR2”的toll样受体3基因、具有基因符号“TLR5”的toll样受体5基因、具有基因符号“TLR6”的toll样受体6基因、具有基因符号“TLR7”的toll样受体7基因、具有基因符号“TLR8”的toll样受体8基因、具有基因符号“TLR9”的toll样受体9基因、或具有基因符号“TLR10”的toll样受体10基因的基因产物。
根据一个实施方式，膜结合蛋白包含嵌合抗原受体(CAR)或转基因T细胞受体(tg-TCR)。
如本文所用，术语“转基因T细胞受体”或“tg-TCR”是指包含T细胞受体(TCR)特异性的重组分子，即识别由主要组织相容性复合体(MHC)蛋白呈现的抗原肽(即抗原)。通常，TCR识别抗原，即外源(例如病毒)或细胞(例如肿瘤)来源的肽，其已被细胞加工，装载到MHC复合体上并作为肽-MHC复合体运输到细胞膜上。
本发明的tg-TCR通常包含两条链(即多肽链)，例如T细胞受体(TCR)的α链、TCR的β链、TCR的γ链、TCR的δ链，或其组合(例如αβ链或γδ链)。tg-TCR的多肽可包含任何氨基酸序列，条件是tg-TCR具有上文所述的抗原特异性和T细胞效应子功能。应当理解，抗原特异性由TCR异二聚体(即，由αβ链或γδ链)决定。
应当理解，两条链中的每条链通常由两个胞外结构域组成，即可变区(V)和恒定区(C)。
根据一个实施方式，tg-TCR包含TCR的可变区。根据一个具体实施方式，tg-TCR包含TCR的α-和β-链的可变区。根据另一个具体实施方式，tg-TCR包含TCR的γ-链和δ-链的可变区。
根据本发明的一些实施方式，tg-TCR的可变区包含能够特异性结合抗原的互补决定区(CDR)。CDR可以选自CDR1、CDR2、CDR3和/或CDR4中的任何一种。根据一个具体实施方式，CDR存在于单链上，优选CDR存在于tg-TCR的两条链上。
根据一个实施方式，tg-TCR包含TCR的恒定区。根据一个具体实施方式，tg-TCR包含TCR的α-和β-链的恒定区。根据另一个具体实施方式，tg-TCR包含TCR的C-和γ-和δ-链的恒定区。
tg-TCR的选择取决于限定靶细胞的MHC-肽复合体的抗原的类型和数量。例如，可以选择tg-TCR来识别与特定疾病状态相关的靶细胞上的MHC-肽复合体。因此，例如，可以作为抗原被tg-TCR识别的标记可以包括与病毒、细菌和寄生虫感染以及癌细胞相关的那些标记。下面提供了示例。
为了成功生产tg-TCR，首先需要识别合适的靶序列。因此，可以从抗原反应性T细胞(例如肿瘤反应性T细胞)中分离TCR，或者，在不可能的情况下，可以使用替代技术。根据示例性实施方式，用人类抗原肽(例如肿瘤或病毒抗原)免疫转基因动物(例如兔或小鼠，优选人类-HLA转基因小鼠)以产生表达针对人类抗原的TCR的T细胞[例如，如Stanislawski等人，Nat Immunol.(2001)2(10):962-70所述]。根据另一个示例性实施方式，从经历疾病(例如肿瘤)缓解的患者中分离抗原特异性T细胞(例如肿瘤特异性T细胞)，并从中分离反应性TCR序列[例如，如Witte等人,Blood(2006)108(3):870所述]。
根据另一个示例性实施方式，采用体外技术改变现有TCR的序列，以增强弱反应性抗原特异性TCR与靶抗原的亲合力(这些方法在下文描述)。
根据一个实施方式，tg-TCR的信号传导模块可以包括单个子单元或多个信号传导单元。因此，本发明的tg-TCR可以使用与TCR协同作用以在抗原受体接合后起动信号转导的共受体，以及其具有相同功能能力的其任何衍生物或变体。
根据一个实施方式，TCR信号传导模块包含CD3复合体(例如，CD3链，例如CD3δ/ε、CD3γ/ε和/或ζ链，例如ζ/ζ或ζ/η)。
附加地或替代地，TCR信号传导模块可包含共刺激结构域以向T细胞提供额外的信号。下文将针对CAR分子进行详细讨论。
根据一个实施方式，tg-TCR可包含如下文针对CAR分子详细描述的跨膜结构域。
如本文所用，短语“嵌合抗原受体(CAR)”是指重组分子，其将所需抗原的特异性与T细胞受体激活胞内结构域(即T细胞受体信号传导模块)结合，以产生对特定抗原表现出细胞免疫活性的嵌合蛋白。通常，CAR独立于主要组织相容性复合体(MFIC)识别细胞表面表达的抗原(例如蛋白质或非蛋白质)(而不是内部抗原)。
因此，本发明的CAR通常包含胞外结构域、跨膜结构域和T细胞对抗原的有效应答所需的细胞内结构域(即，细胞质结构域也称为内结构域)，该胞外结构域包含抗原结合部分。
抗原结合部分
在一个实施方式中，本发明的CAR包含靶特异性结合元件，也称为抗原结合部分。部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体(即抗原)的类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域来识别作为与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记的配体(即抗原)。因此，可作为本发明CAR中抗原部分结构域的配体的细胞表面标记的示例包括与病毒、细菌和寄生虫感染以及癌细胞有关的那些细胞标记。
根据本发明的一些实施方式，抗原结合部分包含能够特异性结合抗原的互补决定区(CDR)。这样的CDR可以从抗体获得。
本发明中使用的术语“抗体”包括完整分子及其功能片段，例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、线性抗体、scFv抗体和由能够结合抗原的抗体片段形成的多特异性抗体。这些功能性抗体片段定义如下：(1)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可以通过用木瓜蛋白酶消化完整的抗体以产生完整的轻链和一条重链的一部分而产生；(2)Fab’，抗体分子的片段，其可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体，然后还原，以产生完整的轻链和重链的一部分而获得；每个抗体分子获得两个Fab'片段；(3)(Fab’)2，其可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体而无需随后还原而获得的抗体的片段；F(ab')2是由两个二硫键保持在一起的两个Fab'片段的二聚体；(4)Fv，定义为含有表达为两条链的轻链可变区和重链可变区的经遗传工程的片段；(5)单链抗体(“SCA”)，包含轻链可变区和重链可变区的经遗传工程的分子，通过合适的多肽连接体连接而成的经遗传融合的单链分子(genetically fused single chainmolecule)；(6)CDR肽是编码单个互补决定区(CDR)的肽；以及(7)单域抗体(也称为纳米抗体)，其是一种经过经遗传工程的单一单体可变抗体结构域，可选择性地结合特定抗原。纳米抗体的分子量仅为12-15kDa，比普通抗体(150-160kDa)小得多。
如本文所用，“抗体重链”是指存在于在其自然存在的构象中所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较大一条。
如本文所用，“抗体轻链”是指存在于在其自然存在的构象中所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较小的一条。κ-和λ-轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
本文所用的术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语还应被解释为是指通过合成编码抗体的DNA分子而产生的抗体，该DNA分子表达抗体蛋白质，或特定于该抗体的氨基酸序列，其中该DNA或氨基酸序列是使用本领域可用且熟知的合成DNA或氨基酸序列技术获得的。
生产多克隆和单克隆抗体及其片段的方法是本领域熟知的(参见，例如Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,纽约,1988，通过引用并入本文)。
根据本发明的抗体片段可以通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞培养或其它蛋白质表达系统)中表达编码该片段的DNA来制备。抗体片段可以通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整个抗体来获得。例如，可以通过用胃蛋白酶酶切抗体来产生抗体片段，以提供表示为F(ab')2的5S片段。可以用硫醇还原剂和可选的二硫键裂解产生的巯基的封闭基团进一步裂解该片段，以产生3.5SFab'单价片段。或者，使用胃蛋白酶的酶促裂解直接产生两个单价Fab'片段和一个Fc片段。这些方法描述于如下文献：例如Goldenberg的美国专利号4,036,945和4,331,647，以及其中包含的参考文献，这些专利的内容通过引用整体并入本文。还参见Porter,R.R.[Biochem.J.73:119-126(1959)]。也可使用其它裂解抗体的方法，如分离重链以形成单价轻-重链片段，进一步裂解片段，或其它酶促、化学或遗传技术，只要片段与完整抗体识别的抗原结合。
Fv片段包含VH和VL链的结合。这种结合可以是非共价的，如Inbar等人，[Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 69:2659-62(19720]所述。或者，可变链可以通过分子间二硫键连接或通过化学物质如戊二醛交联。优选地，Fv片段包含通过肽连接体连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)是通过构建包含编码由寡核苷酸连接的VH和VL结构域的DNA序列的结构基因而制备的。将结构基因插入到表达载体中，随后将其引入到宿主细胞如大肠杆菌中。重组宿主细胞合成具有桥接两个V结构域的连接肽的单个多肽链。用于生产sFv的方法描述于如下文献：例如[Whitlow和Filpula,Methods 2:97-105(1991)；Bird等人，Science 242:423-426(1988)；Pack等人，Bio/Technology 11:1271-77(1993)；和美国专利号4,946,778，其内容通过引用整体并入本文。
可以通过构建编码感兴趣抗体的CDR的基因来获得CDR肽(“最小识别单位”)。例如，通过使用聚合酶链反应从抗体产生细胞的RNA合成可变区来制备这种基因。参见，例如Larrick和Fry[Methods,2:106-10(1991)]。
一旦使用常规基因工程技术识别了抗体的CDR，就可以以许多方式之一合成和修饰编码本文所述抗体的任何形式或片段的可表达多核苷酸，以产生一系列相关产物。
根据本发明的一些实施方式，CDR衍生自与抗原特异性结合的ap T细胞受体(TCR)。
根据本发明的一些实施方式，CDR衍生自与抗原特异性结合的γδT细胞受体(TCR)。
根据本发明的一些实施方式，CDR衍生自与抗原特异性结合的工程化的亲和力增强的ap T细胞受体或γδT细胞受体(TCR)(如上文详细讨论的)。
根据本发明的一些实施方式，CDR衍生自具有改善的稳定性或任何其它生物物理性质的工程化的ap T细胞受体或γδT细胞受体(TCR)。
根据本发明的一些实施方式，CDR衍生自与抗原特异性结合的T细胞受体样(TCRL)抗体。TCRL及其产生方法的示例描述于WO03/068201、WO2008/120203、WO2012/007950、WO2009125395、WO2009/125394中，其各自的内容通过引用整体并入本文。
根据本发明的一些实施方式，抗原结合结构域包含单链Fv(scFv)分子。
细胞质结构域
本发明的CAR分子的细胞质结构域(也称为“胞内信号传导结构域”或“T细胞受体信号传导模块”)负责激活已放置CAR的细胞的至少一种正常效应子功能。
虽然通常可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下没有必要使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可以用来代替完整的链，只要它转导效应子功能信号即可。因此，术语胞内信号传导结构域意味着包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本发明CAR分子的胞内信号传导结构域的优选示例包括T细胞受体(TCR)和协同受体(co-receptor)的胞质序列，它们协同作用以在抗原受体结合后启动信号转导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。
因此，NK细胞激活可以由两种不同类型的细胞质信号传导序列介导：启动抗原依赖性初级激活的那些序列(初级细胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些序列(次级细胞质信号传导序列)。
以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可以包含被称为免疫受体酪氨酸的激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)的信号传导基序。在本发明中特别使用的含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的示例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特别优选的是，本发明CAR中的细胞质信号分子包含来源于CD3ζ的细胞质信号传导序列。
共刺激信号传导区通常是指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR分子的一部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原有效应答所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导共刺激分子配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM，结合Toll配体受体的激动剂或抗体和特异性结合B7-H3的配体。共刺激配体尤其还包括与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，例如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，以及与CD83特异性结合的配体。
根据一个实施方式，CAR的细胞质结构域可以被设计成包含CD3-ζ信号传导结构域本身或与可用于本发明的CAR的上下文中任何其它所需细胞质结构域组合。例如，CAR的细胞质结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区域。共刺激信号传导区域是指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原有效应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。这种分子的示例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、PD-1、DAP 10、2B4、Lsk、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，以及与CD83特异性结合的配体等。
根据本发明的一些实施方式，胞内结构域包含CD3ζ-链[CD247分子，也称为“CD3-ζ”和“CD3z”；基因库登记号NP_000725.1和NP_932170.1]，其是内源性TCR信号的主要传递者。
根据本发明的一些实施方式，胞内结构域包含CAR的细胞质尾部的各种共刺激蛋白受体，以向T细胞提供额外的信号(“第二代”CAR)。示例包括但不限于CD28[例如基因库登记号NP_001230006.1、NP_001230007.1、NP_006130.1]、4-1BB[肿瘤坏死因子受体超家族，成员9(TNFRSF9)，也称为“CD137”，例如基因库登记号NP_001552.2]、ICOS[诱导型T-细胞共刺激分子，例如基因库登记号NP_036224.1]、DAP10[造血细胞信号转导因子(hematopoietic cell signal transducer)，例如基因库登记号NP_001007470、NP_055081.1]、2B4[CD244分子，例如基因库登记号NP_001160135.1、NP_001160136.1、NP_057466.1]，以及Lsk[LCK原癌基因、Src家族酪氨酸激酶，例如基因库登记号NP_001036236.1、NP_005347.3]。临床前研究已经表明，第二代CAR设计提高了T细胞的抗肿瘤活性。
根据本发明的一些实施方式，胞内结构域包含至少一种、至少两种、至少三种或更多种选自由以下所组成的组的多肽：CD3ζ(CD247,CD3z)、CD27、CD28、4-1BB/CD137、2B4、ICOS、OX40/CD134、DAP10、肿瘤坏死因子受体(TNFR)和Lsk。
根据本发明的一些实施方式，胞内结构域包含多个信号传导结构域，如CD3z-CD28-4-1BB或CD3z-CD28-OX40，以进一步增强效力。术语“OX40”是指肿瘤坏死因子受体超家族，成员4(TNFRSF4)，例如基因库登记号NP_003318.1(“第三代”CAR)。
根据本发明的一些实施方式，胞内结构域包含CD28-CD3z、CD3z、CD28-CD137-CD3z。术语“CD137”是指肿瘤坏死因子受体超家族，成员9(TNFRSF9)，例如基因库登记号NP_001552.2。
根据一个具体实施方式，胞内结构域包含CD3z和CD28。
根据一个具体实施方式，胞内结构域包含CD3z和4-1BB。
根据一个具体实施方式，胞内结构域包含CD3z和2B4。
跨膜结构域
CAR的跨膜结构域可以来自自然来源或合成来源。当来源是自然的时，结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。在本发明中特别有用的跨膜区域可以衍生自T细胞受体的α、β或ζ链(即至少包含其跨膜区域)、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或NKG2D。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成跨膜结构域的每一端会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
根据一个具体实施方式，跨膜结构域包含CD8。
根据一个具体实施方式，跨膜结构域包含CD28。根据一个具体实施方式，跨膜结构域包含NKG2D。
根据本发明的一些实施方式，本发明一些实施方式的CAR分子中包含的跨膜结构域是与CAR中的一个结构域自然相关的跨膜结构域。根据本发明的一些实施方式，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免这些结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合体的其它成员的相互作用最小化。
根据一些实施方式，在CAR分子的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR分子的细胞质结构域和跨膜结构域之间，可以掺入间隔结构域。如本文所用，术语“间隔结构域”通常是指多肽链中起连接跨膜结构域、胞外结构域或细胞质结构域作用的任何寡肽或多肽。间隔结构域可包含多达300个氨基酸，优选10至100氨基酸，最优选25至50氨基酸。
可选地，长度优选在2至10氨基酸的短的寡肽或多肽连接体，可以形成CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间的连接(也称为“铰链”)。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。
根据一个具体实施方式，CD8的铰链区用于构建CAR分子。
根据一个具体实施方式，CD28的铰链区用于构建CAR分子。
如上所述，CAR或tg-TCR对选自由肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原和/或寄生虫抗原所组成的组的抗原具有抗原特异性。
本文讨论的抗原仅作为示例子包括在内。该列表不是排他性的，并且其他示例对于本领域技术人员来说是显而易见的。
如本文所用，短语“肿瘤抗原”是指特定过度增殖性病症(如癌症)所共有的抗原。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，其引发免疫应答，特别是T细胞介导的免疫应答。本发明抗原结合部分的选择将取决于待治疗癌症的具体类型。
根据一个实施方式，肿瘤抗原与实体瘤相关。
根据一个实施方式，肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。
本发明所指的肿瘤抗原类型包括肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。“TSA”是指肿瘤细胞所特有的蛋白质或多肽抗原，其不会出现在体内的其它细胞上。“TAA”是指由肿瘤细胞表达的蛋白质或多肽抗原。例如，TAA可以是肿瘤细胞的一种或多种表面蛋白质或多肽、核蛋白或糖蛋白或其片段。
TSA或TAA抗原的非限制性示例包括以下抗原：分化抗原如MART-1/MelanA(MART-1)、gp 100(Pme117)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2，和肿瘤特异性多系抗原(tumor-specificmultilineage antigen)如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因如p53、Ras、HER2/neu；由染色体易位产生的独特的肿瘤抗原，如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，如EB病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其它基于蛋白质的大抗原包括：TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白(beta-Catenin)、CDK4、Mum-1、p 15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.291\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、MUCI、NB/70K、NKG2DL、NR、ROBO1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
肿瘤抗原的其它示例包括但不限于：A33、BAGE、Bcl-2、β-连环蛋白、BCMA、CAl25、CA19-9、CD5、CD7、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33/IL3Ra、CD34、CD37、CD38、CD45、CD123、CD135(FLT3)、CD138、癌胚抗原(CEA)、CLL1、c-Met、CS-1、细胞周期蛋白(cyclin)B1、DAGE、EBNA、EGFR、EGFRvIII、ephrinB2、雌激素受体、FAP、铁蛋白、叶酸盐结合蛋白、GAGE、G250、GD-2、GM2、gp75、gp100(Pmel 17)、糖脂F77、HER2/neu、HPV E6、HPV E7、Ki-67、LRP、间皮素、MY-ESO-1、MART-1、MAGE A3、p53、PRAME、PR1、PSMA、ROR1、SLAMF7、WT1(willms肿瘤)等。其它肿瘤抗原提供于van der Bruggen P,Stroobant V,Vigneron N,Van den Eynde B.肽数据库：T细胞限定的肿瘤抗原Cancer Immun(2013),www(.)cancerimmunity(.)org/peptide/，通过引用并入本文。
实体瘤的其他CAR/tg-TCR靶标描述于：Ma等人，Int.J.Biol.Sci.(2019)15(12):2548-2560，通过引用并入本文。
根据一个具体实施方式，靶抗原是HER2。
根据一个具体实施方式，靶抗原是CD38。
根据本发明一些实施方式，病毒抗原可以来自任何病毒，例如但不限于：人类免疫缺陷病毒(HIV)；流感病毒；巨细胞病毒(CMV)；1型T细胞白血病病毒(TAX)；丙型肝炎病毒(HCV)；(HBV)；EB病毒(EBV)；腺病毒(Adv)；感冒病毒；流感病毒；甲型、乙型和丙型肝炎病毒；单纯疱疹病毒；日本脑炎；麻疹；脊髓灰质炎；狂犬病；呼吸道合胞病毒；风疹；天花；水痘带状疱疹；轮状病毒；西尼罗河病毒；多瘤病毒(例如BK病毒)；严重急性呼吸综合征(SARS)，例如严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，和/或寨卡病毒。
根据本发明的一些实施方式，病毒抗原包括，但不限于，选自由以下所组成的组的多肽的病毒表位：人类T细胞嗜淋巴细胞病毒I型(HTLV-1)转录因子(TAX)、流感基质蛋白表位、EB病毒(EBV)衍生的表位、HIV-1RT、HIV Gag、HIV Pol、流感膜蛋白M1、流感病毒血凝素(influenza hemagglutinin)、流感病毒神经氨酸酶(influenza neuraminidase)、流感核蛋白(influenza nucleoprotein)、流感核蛋白、流感基质蛋白(influenza matrixprotein，M1)、流感离子通道(influenza ion channel，M2)、流感非结构蛋白NS-1、流感非结构蛋白NS-2、流感PA、流感PB1、流感PB2、流感BM2蛋白、流感NB蛋白、流感核衣壳蛋白(influenza nucleocapsid protein)、巨细胞病毒(CMV)磷酸化基质蛋白(pp65)、TAX、丙型肝炎病毒(HCV)、HBV前S蛋白85-66、HTLV-1tax 11-19、HBV表面抗原185-194、严重急性呼吸综合征(SARS-CoV)蛋白S1、SARS-CoV蛋白RBD、SARS-CoV核衣壳蛋白、SARS-CoV蛋白Plpro、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)蛋白S1、SARS-CoV-2蛋白S2、SARS-CoV-2蛋白S1+S2 ECD、SARS-CoV-2蛋白RBD、SARS-CoV-2蛋白N抗原、SARS-CoV-2S抗原或SARS-CoV-2核衣壳蛋白。
根据本发明的一些实施方式，细菌抗原可以来自任何细菌，例如但不限于炭疽；革兰氏阴性杆菌、衣原体、白喉、流感嗜血杆菌(haemophilus influenza)、幽门螺杆菌、疟疾、结核分枝杆菌、百日咳毒素、肺炎球菌、立克次氏体、葡萄球菌、链球菌和破伤风。
根据本发明的一些实施方式，细菌抗原包括但不限于炭疽抗原，包括但不限于炭疽保护性抗原；革兰氏阴性杆菌抗原，包括但不限于脂多糖；流感嗜血杆菌抗原，包括但不限于荚膜多糖(capsular polysaccharide)；白喉抗原，包括但不限于白喉毒素；结核分枝杆菌抗原，包括但不限于分枝菌酸、热激蛋白65(HSP65)、30kDa主要分泌蛋白和抗原85A；百日咳毒素抗原，包括但不限于血凝素、百日咳杆菌粘附素(pertactin)、FIM2、FIM3和腺苷酸环化酶；肺炎球菌抗原，包括但不限于肺炎球菌溶血素和肺炎球菌荚膜多糖；立克次氏体抗原，包括但不限于rompA；链球菌抗原，包括但不限于M蛋白；以及破伤风抗原，包括但不限于破伤风毒素。
根据本发明的一些实施方式，抗原是超级细菌抗原(例如多重性耐药菌)。超级细菌的示例包括但不限于：屎肠球菌(Enterococcus faecium)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、肠杆菌属(Enterobacter spp.))。
根据本发明的一些实施方式，真菌抗原可以来自任何真菌，例如但不限于：念珠菌属(candida)、球孢子菌(coccidiode)、隐球菌属(cryptococcus)、组织胞浆菌(histoplasma)、利什曼原虫属(leishmania)、疟原虫属(plasmodium)、原生动物门(protozoa)、寄生虫属(parasite)、血吸虫属(schistosomae)、癣菌属(tinea)、弓形体属(toxoplasma)和克氏锥虫(trypanosoma cruzi)。
根据本发明的一些实施方式，真菌抗原包括但不限于球孢子菌抗原，球孢子菌抗原包括但不限于小球抗原；隐球菌抗原包括但不限于荚膜多糖；组织胞浆菌抗原包括但不限于热激蛋白65(HSP65)；利什曼原虫抗原包括但不限于gp63和脂磷酸聚糖；恶性疟原虫抗原，包括但不限于裂殖子表面抗原(merozoite surface antigen)、子孢子表面抗原、环子孢子抗原、配子母细胞(gametocyte)/配子(gamete)表面抗原、原生动物和其它寄生虫抗原包括血液阶段抗原pf 155/RESA；血吸虫抗原包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶和副肌球蛋白；癣真菌抗原包括但不限于毛癣菌素(trichophytin)；弓形虫抗原包括但不限于SAG-1和p30；克氏锥虫抗原包括但不限于75-77kDa抗原和56kDa抗原。
可以使用各种方法将本发明一些实施方式的核酸引入NK细胞(例如，编码膜结合蛋白的核酸)。这种方法一般描述于如下文献：Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory,纽约(1989,1992)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1989)；Chang等人，Somatic Gene Therapy,CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995)；Vega等人，Gene Targeting,CRC Press,Ann Arbor Mich.(1995),Vectors:A Survey ofMolecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston Mass.(1988)；和Gilboa等人，[Biotechniques4(6):504-512,1986]，并且包括，例如，稳定或瞬时转染、脂质体转染、电穿孔和重组病毒载体感染。此外，参见用于正-负选择方法的美国专利号5,464,764和5,487,992。
根据一个示例，将本发明一些实施方式的核酸作为裸DNA或在合适的载体中引入NK细胞。使用裸DNA通过电穿孔稳定转染细胞的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号6,410,319。裸DNA通常是指编码膜结合蛋白的DNA，该膜结合蛋白以合适的表达方向包含在质粒表达载体中。
或者，病毒载体(例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)可用于将本发明一些实施方式的核酸引入NK细胞(例如编码膜结合蛋白的核酸)。根据本公开的方法使用的合适载体在NK细胞中是非复制的。已知大量基于病毒的载体，其中细胞中维持的病毒拷贝数足够低以维持细胞的生存力，例如基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。
根据一个示例，通过非病毒基因转移将本发明一些实施方式的核酸引入NK细胞。
根据一个示例，本发明的一些实施方式的核酸作为mRNA被引入NK细胞。
根据一个具体实施方式，上调膜结合蛋白的表达通过核酸(例如mRNA)电穿孔进入NK细胞来进行。可以使用任何电穿孔装置进行电穿孔，例如但不限于细胞核转染仪(Nucleofector)或BTX-Gemini双波电穿孔仪(Electroporator)。
根据一个实施方式，两种、三种或更多种膜结合蛋白可以在单个NK细胞上共表达。
根据一个实施方式，NK细胞可以被修饰以共表达：
(i)CAR或tg-TCR，和
(ii)影响体内NK细胞存活率的细胞因子或受体(例如IL-15、IL-15R、受体连接蛋白IL-15(RLI)、TLR等)
根据一个具体实施方式，当感兴趣基因是CISH时，至少一种膜结合蛋白包含IL-15。
根据一个具体实施方式，当感兴趣基因是CD38时，至少一种膜结合蛋白包含抗-CD38 CAR。
根据一个实施方式，上调膜结合蛋白的表达在细胞培养开始8至20天、8至18天、10至18天、12至18天、12至16天、12至14天进行。
根据一个具体实施方式，上调膜结合蛋白的表达在细胞培养开始12至16天进行。
根据一个具体实施方式，上调膜结合蛋白的表达在细胞培养开始12至14天进行。
在一些实施方式中，在NK细胞已经被修饰以表达至少一种膜结合蛋白之后，可以从培养物中收获细胞。
根据一个具体实施方式，在收集细胞之前1至4天、1至3天、1至2天或0.5至1天，修饰细胞以表达至少一种膜结合蛋白。
细胞的收获可以通过释放附着的细胞(例如“刮擦”培养容器表面)或通过细胞收获设备进行，该设备被设计成有效地将细胞从培养容器中清洗出来并自动收集细胞。在具体实施方式中，通过细胞收获设备(例如，G-Rex MCS、WolfWilson、St Paul MN的收获设备)从培养容器中收获扩增的NK细胞。在具体实施方式中，通过细胞收获设备(例如FreseniusRKabi(Hamburg，德国)的LOVO细胞处理设备)从培养容器中收获扩增的CD3-耗尽的NK细胞部分。
在一些实施方式中，从培养物中收获扩增的NK细胞从培养容器中除去大部分或几乎所有的细胞。在其它实施方式中，收获可以分两步或多步进行，从而允许未收获的细胞保留在培养物中直至稍后收获。在一些实施方式中，分两步收获扩增的NK细胞，包括收获扩增的NK细胞的第一部分，然后收获扩增的NK细胞的第二部分。可以在收获第一部分和收获第二部分之间间隔数小时、数天或更长时间来收获两个部分。收获的两部分可以包含大约相等部分的培养物(例如，等量的培养的NK细胞)，或者其中一个部分可包含比另一部分更大部分的培养的NK细胞)。根据一个实施方式，收获包括在培养开始后约12至18天，例如14至16天收获扩增的修饰的NK细胞。根据一个实施方式，收获包括在修饰细胞以表达至少一种膜结合蛋白(例如CAR)后约1至4天，例如1至2天收获扩增的修饰的NK细胞。
为了制备扩增的NK细胞群以供使用，将收获的细胞洗去培养基，评估关键参数，并将体积调整至适合在临床合理的时间内输注的浓度。
在收获之后，可以将扩增的修饰的NK细胞手动洗去培养基，或者优选用于临床应用，使用采用封闭系统的自动化设备。洗涤过的细胞可以用输注溶液重构(例如，一种示例性输注溶液包含8％w/v HSA和6.8％w/v Dextran-40)。在一些实施方式中，重构在封闭系统中进行。在一些实施方式中，对输注溶液进行筛选，以确定其是否适合用于本发明的方法和组合物。选择合适的输注溶液的示例性标准包括安全测试，表明没有细菌、酵母或霉菌生长、内毒素含量低于0.5Eu/ml，并且外观清澈无外来颗粒。
一旦获得扩增的修饰的NK细胞，就检查细胞的数量(即增殖)、细胞特征(cellsignature)(例如CD3-CD56+细胞)、膜结合蛋白(例如CAR、tg-TCR、IL-15、RL1等)的表达和NK细胞功能性。
本领域熟知的细胞增殖试验，包括但不限于克隆形成试验，其中细胞以低密度接种和生长，并对集落进行计数；机械试验[流式细胞术(例如，FACSTM)，碘化丙啶]，其机械测量细胞数量；代谢试验(如掺入四唑盐(tetrazolium)，例如XTT、MTT等)，其测量活细胞的数量；直接增殖试验(如溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine)、胸苷掺入(thymidineincorporation)等)，其测量生长群的DNA合成。
细胞特征和细胞膜上蛋白质表达的测定是本领域熟知的，包括但不限于FACS分析和免疫组织化学染色技术。
如本文所用，术语“NK细胞功能性”是指归因于(ascribed to)NK细胞的任何生物学功能。NK细胞功能的非限制性列表包括，例如，细胞毒性、细胞凋亡的诱导、细胞运动性(cell motility)、定向迁移、细胞因子和其他细胞信号应答、细胞因子/趋化因子产生和分泌、体外激活和抑制细胞表面分子的表达、移植宿主中的细胞归巢和植入(体内保留)，以及体内疾病或疾病过程的改变。在一些实施方式中，在烟酰胺和/或其它烟酰胺部分存在下通过扩增增强的NK细胞功能包括以下中的至少一种：CD62L表面标记的表达增加；迁移应答的提高和NK细胞的更大细胞毒活性，以及输注的NK细胞的归巢和体内保留的升高。
粘附和迁移分子如CD62L、CXCR-4、CD49e等的测定，对于归巢/植入和移植中的细胞保留很重要，这在本领域中是熟知的。细胞中CD62L表达可以通过例如流式细胞术、免疫检测、定量cDNA扩增、杂交等来测定。
细胞迁移的测定是本领域熟知的。可以通过迁移测定(transmigration assay)或间隙封闭测定(gap closure assay)来测定细胞的迁移。在一个实施方式中，不同NK细胞群的迁移潜力通过"Transwell"TM迁移测定来进行测定。
细胞毒性测定(“细胞杀伤”)是本领域熟知的。用于重定向杀伤试验的合适靶细胞的示例是癌症细胞系、原发性癌症细胞(primary cancer cell)、实体瘤细胞、白血病细胞或病毒感染的细胞。特别地，可以使用K562、BL-2、colo250和原代白血病细胞(primaryleukemic cell)，但可以使用许多其他细胞类型中的任何一种，并且是本领域熟知的(参见，例如，Sivori等人(1997)J.Exp.Med.186:1129-1136；Vitale等人(1998)J.Exp.Med.187:2065-2072；Pessino等人(1998)J.Exp.Med.188:953-960；Neri等人(2001)Clin.Diag.Lab.Immun.8:1131-1135)。例如，可通过细胞生存力测定(例如，染色剂排斥、铬释放、CFSE)、代谢测定(例如，四唑盐)和直接观察，来评估细胞杀伤。
由本发明的一些实施方式产生的经洗涤和浓缩的扩增的修饰的NK细胞部分的特征是包含约60％至约99％的CD56+/CD3-细胞、约70％至约99％的CD56+/CD3-细胞、约80％至约99％的CD56+/CD3-细胞，或约90％至99％的CD56+/CD3-细胞。在一个实施方式中，由本发明的一些实施方式产生的经洗涤和浓缩的扩增的NK细胞部分的特征是包含至少约60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的CD56+/CD3-细胞。
由本发明的一些实施方式产生的经洗涤和浓缩的扩增的修饰的NK细胞部分的特征是包含约60％至约99％的膜结合蛋白阳性细胞、约70％至约99％的膜结合蛋白阳性细胞、约80％至约99％的膜结合蛋白阳性细胞，或约90％至99％的膜结合蛋白阳性细胞(例如，CAR、tg-TCR、IL-15、RLI等)。在一个实施方式中，由本发明的一些实施方式产生的经洗涤和浓缩的扩增的NK细胞部分的特征是包含至少约60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的膜结合蛋白阳性细胞(例如，CAR、tg-TCR、IL-15、RLI等)。
本发明一些实施方式的修饰的NK细胞可用作新鲜细胞。或者，细胞可以冷冻保存以备将来使用，或“现成(off the shelf)”使用。
根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了可根据本发明一些实施方式的方法获得的分离的NK细胞群。
根据一个实施方式，分离的NK细胞群(即离体扩增后，例如在培养结束时)包含至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的NK细胞。
根据一个实施方式，至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的分离的NK细胞群(即离体扩增后，例如在培养结束时)经遗传修饰。
根据一个实施方式，至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的分离的NK细胞群(即离体扩增后，例如在培养结束时)包含至少一种膜结合蛋白的上调表达。
根据一个实施方式，至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的分离的NK细胞群(即离体扩增后，例如在培养结束时)均经遗传修饰，并包含至少一种膜结合蛋白的上调表达。
本发明一些实施方式的分离的NK细胞群可以施用于生物体本身，或者以与合适的载体或赋形剂混合的药物组合物的形式施用。
如本文所用，“药物组合物”是指本文所述的一种或多种活性成分与其它化学成分(例如生理学上合适的载体和赋形剂)的制剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的施用。
本文中，术语“活性成分”是指负责生物效应的分离的NK细胞群。
下文中，可互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对生物体造成显著刺激并且不会消除所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。这些短语中包括佐剂。
本文中，术语“赋形剂”是指加入到药物组合物中以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。赋形剂的示例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
可以在最新版本的“雷明登氏药学全书(Remington's PharmaceuticalSciences)”(麦克出版公司(Mack Publishing Co.)Easton,PA，最新版)中找到药物的配制和给药技术，其通过引用并入本文。
合适的给药途径可以例如包括口服、直肠、经粘膜特别是经鼻、肠或肠胃外递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内，例如进入右心室或左心室腔、进入普通冠状动脉、静脉内、腹膜内、鼻内、肿瘤内或眼内注射。
用于将药物递送至中枢神经系统(CNS)的常规方法包括：神经外科策略(例如，脑内注射或脑室内输注)；对剂进行分子操作(例如，生产包含转运肽的嵌合融合蛋白，所述转运肽对内皮细胞表面分子具有亲和力并且与本身不能穿过BBB的剂组合)；试图利用BBB的内源性转运途径之一；设计用于增加剂的脂质溶解度的药理学策略(例如，将水溶性剂与脂质或胆固醇载体缀合)；以及通过高渗破坏而暂时破坏BBB的完整性(由将甘露糖醇溶液输注到颈动脉或使用生物活性剂(如血管紧张素肽)引起)。然而，这些策略中的每一种都具有局限性，例如与侵入性外科手术相关的固有风险，由内源转运系统中固有的局限性所强加的尺寸限制，可与包含在CNS外部可能具有活性的载体基序的嵌合分子的全身施用相关的不希望的生物副作用，以及在BBB被破坏的脑区域内的脑损伤的可能风险，这使其成为一种次优的递送方法。或者，可以以局部方式而不是全身方式施用药物组合物，例如，通过将药物组合物直接注射到患者的组织区域中。
根据一个实施方式，给药途径包括，例如，注射、摄入(ingestion)、输液(transfusion)、植入或移植。本文所述的组合物可以皮下、皮内、肿瘤内、结节内(intratumorally)、髓内、肌内，通过静脉内(i.v.)注射，或腹膜内地施用于患者。在一个实施方式中，本发明的药物组合物通过皮内或皮下注射施用于患者。在另一个实施方式中，本发明的药物组合物优选通过静脉内注射施用。药物组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。
本发明的一些实施方式的药物组合物可以通过本领域熟知的方法制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封(encapsulating)、包埋(entrapping)或冻干方法。
因此，根据本发明的一些实施方式的用于用途的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述载体包含赋形剂和助剂，其有助于将活性成分加工成可药用的制剂。合适的制剂取决于所选的给药途径。
对于注射，药物组合物的活性成分可以在水溶液中配制，优选在生理上相容的缓冲液中配制，例如Hank’s溶液、林格溶液(Ringer’s solution)或生理盐缓冲液。对于经粘膜给药，在制剂中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。这种渗透剂在本领域中通常是已知的。
对于口服给药，可以通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体组合来容易地配制药物组合物。这种载体使得药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，以供患者口服摄入(oral ingestion)。用于口服使用的药物制剂可以使用固体赋形剂制备，可选地研磨所得混合物，如果需要，在加入合适的助剂后，加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂特别是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。
糖衣丸芯具有合适的包衣。为此，可以使用浓缩的糖溶液，其可以可选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中，以用于识别或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合式胶囊(push-fitcapsule)以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制成的密封软胶囊。推入配合式胶囊可含有与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)、润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)和可选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可以溶解或悬浮在合适的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。用于口服给药的所有制剂的剂量都应适合所选的给药途径。
对于含服给药(buccal administration)，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过鼻吸入给药，根据本发明的一些实施方式使用的活性成分方便地以气溶胶喷雾形式从加压包装或喷雾器中递送，使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供递送计量的量的阀来确定。用于分配器的例如明胶的胶囊和药筒可以配制成含有化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文所述的药物组合物可以配制用于肠胃外给药，例如通过推注或连续输注。
用于注射的制剂可以以单位剂型形式存在，例如在安瓿中或多剂量容器中，可选地添加有防腐剂。组合物可以是在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制试剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外给药的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液。另外，活性成分的悬浮液可以制备成适当的油基或水基注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(如芝麻油)，或合成脂肪酸酯(如油酸乙酯)、甘油三酯或脂质体。
水性注射悬浮液(Aqueous injection suspension)可含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。可选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度的剂，以允许制备高度浓缩的溶液。
或者，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前与合适的载体，例如无菌、无热原的水一起构成。
还可以使用例如常规栓剂基质(如可可脂)或其它甘油酯，将本发明一些实施方式的药物组合物配制成直肠组合物，如栓剂或保留灌肠剂。
适用于本发明的一些实施方式的上下文中的药物组合物包括组合物，其中活性成分的含量能有效达到预期目的。更具体地，治疗有效量是指有效预防、缓解或改善疾病(例如恶性或非恶性疾病)的症状或延长正在接受治疗的对象的生存的活性成分(分离的NK细胞群)的量。
治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
当指明“治疗量”时，医生可以考虑患者(对象)的年龄、体重、疾病状态(例如肿瘤大小、感染或转移的程度)的个体差异来确定本发明组合物的精确给药量。一般而言，包含本文所述细胞的药物组合物可以以如下剂量施用：25×106至500×106个细胞/kg体重，例如25×106至400×106个细胞/kg体重、50×106至300×106个细胞/kg体重，例如50×106至250×106个细胞/kg体重，包括这些范围内的所有整数值。根据一个实施方式，本文所述的细胞可以以如下剂量施用：约25×106个细胞/kg体重、约50×106个细胞/kg体重、约75×106个细胞/kg体重、约100×106个细胞/kg体重、约150×106个细胞/kg体重、约200×106个细胞/kg体重、约250×106个细胞/kg体重，或约300×106个细胞/kg体重。
本发明一些实施方式的NK细胞组合物还可以以这些剂量多次施用。NK细胞可以通过使用免疫治疗中通常已知的输注技术来施用(参见，例如，Rosenberg等人，New Eng.J.ofMed.319:1676,1988)。医学领域的技术人员通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗方案，可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
例如，可以通过使用熟知的方法(例如，ELISA、FACS等)，监测治疗对象的生物样品中的细胞标记、激素、葡萄糖、肽、碳水化合物、细胞因子等的水平，或通过使用熟知的方法(例如，超声、CT、MRI等)监测肿瘤大小，来评估活性成分(例如，本发明的一些实施方式的分离的NK细胞群)对病理的影响。
对于在本发明的方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量最初可以从体外和细胞培养测定估计。例如，可以在动物模型中配制剂量，以实现所需的浓度或滴度。这种信息可用于更准确地确定人体中的有用剂量。
本文所述的活性成分的毒性和治疗功效可通过体外、细胞培养或实验动物中的标准制药程序来确定。从这些体外和细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。
剂量可以根据使用的剂型和使用的给药途径而变化。鉴于患者状况，各个医师可以选择确切的制剂、给药途径和剂量。(例如参见Fingl等人所著，1975，“治疗药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)”，Ch.1p.1)。
剂量和间隔可以单独调整，以提供足以诱导或抑制生物效应的活性成分的水平(最小有效浓度，MEC)。MEC将因每种制剂而有差异，但可以从体外数据估算。实现MEC所需的剂量取决于个体特征和给药途径。检测分析可用于测定血浆浓度。
取决于要治疗的病症的严重性和反应性，给药可以是单次或多次给药，治疗过程持续数天至数周，或直到治愈，或达到疾病状态的减轻。根据一个实施方式，给药可以是每天一次、两次、三次或更多次给药。给药可以在随后的几天内进行，或者在相隔几天或几周内进行。医学领域的技术人员可以容易地确定这种测定。
当然，要施用的组合物的量将取决于被治疗的对象、痛苦的严重程度、给药方式、处方医师的判断等。
根据本发明的一些实施方式，可以将本发明的治疗剂与设计用于治疗所述病理的其他药物联合提供给对象[即，联合疗法，例如，在施用分离的NK细胞群之前、同时或之后]。
根据本发明的一个实施方式，本发明的一些实施方式的分离的NK细胞群可以与化疗、放射治疗、免疫抑制剂(例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酸和FK506)、抗体或本领域已知的其它剂联合使用。
在一些实施方式中，本发明的一些实施方式的分离的NK细胞群与任何数量的相关治疗方式一起施用于患者，所述治疗方式包括但不限于用如下剂治疗：如抗病毒剂(如更昔洛韦(Ganciclovir)、伐昔洛韦(Valaciclovir)、阿昔洛韦(Acyclovir)、缬更昔洛韦(Valganciclovir)、膦甲酸(Foscarnet)、西多福韦(Cidofovir)、马立巴韦(Maribavir)、来氟米特(Leflunomide))；化疗剂(如抗肿瘤剂，例如但不限于烷基化剂，包括例如环磷酰胺、白消安、二氯甲二乙胺或莫司汀(mustine，HN2)、乌拉莫司汀(Uramustine)或尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、马法兰(melphalan)、氯丁酸氮芥(Chlorambucil)、异环磷酰胺(Ifosfamide)、苯达莫司汀(Bendamustine)、亚硝基脲卡莫司汀(NitrosoureasCarmustine)、洛莫司汀(Lomustine)、链脲佐菌素(Streptozocin)、噻替哌(thiotepa)、顺铂(Cisplatin)、卡铂(Carboplatin)、奈达铂(Nedaplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、沙铂(Satraplatin)、四硝酸三铂(Triplatin tetranitrate)、甲基苄肼(Procarbazine)、六甲蜜胺、三氮烯(Triazene)(达卡巴嗪(dacarbazine)、米托唑胺(mitozolomide)、替莫唑胺(temozolomide))、达卡巴肼(dacarbazine)、替莫唑胺(Temozolomide)、白消安、白舒非(Busulfex)、氟达拉滨(fludarabine)、二甲基马利兰(dimethylmileran)或阿糖胞苷(Cytarabine))，或治疗性单克隆抗体(例如曲妥珠单抗(Trastuzumab，)、帕妥珠单抗(Pertuzumab，)、西妥昔单抗(Certuximab，)、帕尼单抗(Panitumumab，)、耐昔妥珠单(Necitumumab，)、地妥昔单抗(Dinutuximab，)、贝伐单抗(Bevacizumab，)、雷莫芦单抗(Ramucirumab，)、奥拉单抗(Olaratumab，)、伊匹木单抗(Ipilimumab，)、纳武单抗(Nivolumab，)、派姆单抗(Pembrolizumab，)、阿替佐珠单抗(Atezolizumab，)、Ado-曲妥珠单抗-药物偶联物(Ado-trastuzumab emtansine融合、第诺单抗(Denosumab，)、阿仑单抗(Alemtuzumab，)、阿维单抗(Avelumab，)、博纳吐单抗(Blinatumomab，)、维布妥昔单抗(Brentuximab vedotin，)、卡普罗单抗喷地肽(Capromab pendetide，)、达妥木单抗(Daratumumab，)、德瓦鲁单抗(Durvalumab，)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab，)、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan，)、奥比妥珠单抗(Obinutuzumab，)、奥法木单抗(Ofatumumab，)、帕妥珠单抗(Pertuzumab，)、利妥昔单抗(Rituximab，)、利妥昔单抗-透明质酸酶(Rituximab-hyaluronidase，Rituxan)、奥英妥珠单抗(Inotuzumab ozogamicin，)、贝伐单抗-awwb(Bevacizumab-awwb，)、曲妥珠单抗dkst(Trastuzumab dkst，)，或托西莫单抗(Tositumomab，))。
在一个具体实施方式中，本发明一些实施方式的分离的NK细胞群与达妥木单抗(DARA)联合施用于患者。
在一个具体实施方式中，本发明一些实施方式的分离的NK细胞群与利妥昔单抗联合施用于患者。
应当理解，本发明一些实施方式的分离的NK细胞群可以与化疗剂、放射治疗、抗体治疗、手术、光治疗等联合施用于患者。
组合疗法可增加本发明的药剂在所治疗的对象中的治疗效果。
如果需要，本发明一些实施方式的组合物可以存在于包装或分配器装置中，例如FDA批准的试剂盒，其可以包含含有活性成分的一个或多个单位剂型。包装可以例如包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有给药说明书。包装或分配器也可以由与容器相关的通知来适应，该通知的形式由管理药物的制造、使用或销售的政府机构规定，该通知反映了该机构对组合物或人或兽医给药的形式的批准。例如，这种通知可以是美国食品和药品管理局批准的处方药的标签或批准的产品插页。还可以制备在相容的药物载体中配制的包含本发明制剂的组合物，将其置于适当的容器中，并标记用于治疗指定的病症，如上文进一步详述的。
试剂盒例如可以包括金属或塑料箔，如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有给药说明书。包装或分配器也可以由与容器相关的通知来适应，该通知的形式由管理药物的制造、使用或销售的政府机构规定，该通知反映了该机构对组合物或人或兽医给药的形式的批准。例如，这种通知可以是美国食品和药品管理局批准的处方药的标签或批准的产品插页。还可以制备在相容的药物载体中配制的包含本发明制剂的组合物，将其置于适当的容器中，并标记用于治疗指定的病症，如上文进一步详述的。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种治疗有需要的对象的疾病的方法，该方法包括向所述对象施用治疗有效量的本发明的一些实施方式的分离的NK细胞群，从而治疗所述对象。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了治疗有效量的本发明的一些实施方式的分离的NK细胞群，用于治疗有需要的对象的疾病。
术语“治疗”是指抑制、预防或阻止病理(疾病、病症或病状)的发展和/或引起病理的减少、缓解或消退。本领域技术人员将理解，可以使用各种方法和测定来评估病理的发展，并且类似地，可以使用各种方法和测定来评估病理的减少、缓解或消退。
如本文所用，术语“对象”或“需要其的对象(有需要的对象)”是指哺乳动物，优选人类，男性或女性，处于任何年龄或性别，其患有可用NK细胞治疗的疾病。
因此，本发明的方法可用于治疗任何疾病，例如但不限于恶性疾病(例如癌症)和感染性疾病(例如病毒感染、细菌感染、真菌感染、原生动物感染或寄生虫感染)。
根据一个实施方式，对象患有恶性疾病。
癌症疾病
可以通过本发明的一些实施方式的方法治疗的恶性疾病(也称为癌症)可以是任何实体或非实体肿瘤和/或肿瘤转移。
癌症的示例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。这种癌症的更具体的示例包括：鳞状细胞癌(squamous cell cancer)；软组织肉瘤；卡波西肉瘤；黑素瘤；肺癌(包括小细胞肺癌；非小细胞肺癌；肺腺癌(adenocarcinoma of the lung)和肺的鳞状细胞癌(squamous carcinoma of the lung))；腹膜癌(cancer of the peritoneum)；肝细胞癌；胃癌(包括胃肠道癌(gastrointestinal cancer))；胰腺癌；胶质母细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌；膀胱癌；肝细胞癌(hepatoma)；乳腺癌；结肠癌；结直肠癌；直肠癌；子宫内膜癌或子宫癌，如子宫癌(uterine carcinoma)；类癌(carcinoid carcinoma)；唾液腺癌；肾癌；肝癌；前列腺癌；外阴癌；甲状腺癌；肝癌(hepatic carcinoma)；间皮瘤(mesothelioma)；骨髓瘤(mesothelioma)，例如多发性骨髓瘤；移植后淋巴增殖性疾病(post-transplantlymphoproliferative disorder，PTLD)；成神经细胞瘤；食管癌；滑膜细胞癌；神经胶质瘤和各种类型的头颈癌(例如脑肿瘤)。适于治疗本发明的癌症病症包括转移癌。
根据一个实施方式，恶性疾病是血液恶性肿瘤。示例性血液恶性肿瘤包括但不限于：白血病[例如急性淋巴、急性成淋巴细胞、急性成淋巴细胞前B细胞、急性成淋巴细胞性T细胞白血病、急性巨核细胞、单核细胞、急性髓细胞(acute myelogenous)、急性髓系、急性髓性伴嗜酸性粒细胞(acute myeloid with eosinophilia)、B细胞、嗜碱性、慢性髓系、慢性、B细胞、嗜酸性、Friend、粒细胞或髓细胞、毛细胞、淋巴细胞、巨核细胞、单核细胞、单核-巨噬细胞、成髓细胞、髓系、骨髓单核细胞、浆细胞、前B细胞、早幼粒细胞、亚急性、T细胞、淋巴肿瘤、骨髓恶性肿瘤的易感性、急性非淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)和B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)]，以及淋巴瘤[例如，霍奇金病；非霍奇金淋巴瘤；伯基特(Burkitt)；皮肤T细胞；组织细胞；成淋巴细胞；T细胞；胸腺；B细胞，包括低级/滤泡；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡NHL；中级弥散性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级成淋巴细胞NHL；高级小非裂细胞NHL；大包块病变(bulky disease)NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；以及华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s Macroglobulinemia)。
根据本发明的一些实施方式，病理是实体瘤。根据本发明的一些实施方式，病理是肿瘤转移。
根据本发明的一些实施方式，病理是血液恶性肿瘤。
根据一个具体实施方式，恶性疾病是白血病或淋巴瘤。
根据一个具体实施方式，恶性疾病是多发性骨髓瘤。
感染性疾病
感染性疾病的实例包括但不限于慢性感染性疾病、亚急性感染性疾病、急性感染性疾病、病毒性疾病、细菌性疾病、原生动物疾病、寄生虫病、真菌疾病、支原体疾病和朊病毒疾病。
可根据本发明的教导治疗的引起感染性疾病的病毒病原体的具体类型包括但不限于：反转录病毒、圆环病毒(circoviruses)、细小病毒、乳多空病毒(papovaviruses)、腺病毒、疱疹病毒、虹色病毒(iridoviruse)、痘病毒、嗜肝DNA病毒、小核糖核酸病毒、杯状病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、正粘病毒、副粘病毒、弹状病毒、布尼亚病毒(bunyaviruses)、冠状病毒、沙粒病毒和丝状病毒。
可以根据本发明的教导治疗的病毒感染的具体示例包括但不限于：由人免疫缺陷病毒(HIV)诱导的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)；流感；鼻病毒感染；病毒性脑膜炎；EB病毒(EBV)感染；甲型、乙型或丙型肝炎病毒感染；麻疹；乳头状瘤病毒感染/疣；巨细胞病毒(CMV)感染；COVID-19感染；单纯疱疹病毒感染；黄热病；埃博拉病毒感染；狂犬病；腺病毒(Adv)；冷病毒；流感病毒；日本脑炎；脊髓灰质炎；呼吸道合胞；风疹；天花；水痘带状疱疹；轮状病毒；西尼罗河病毒和寨卡病毒。
根据一个具体实施方式，所述病毒疾病是由选自以下所组成的组的病毒引起的：EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、BK病毒、腺病毒(Adv)、严重急性呼吸综合征(SARS)、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感、巨细胞病毒(CMV)、1型T细胞白血病病毒(TAX)、丙型肝炎病毒(HCV)或乙型肝炎病毒(HBV)。
可以根据本发明的教导治疗的细菌感染的具体示例包括但不限于由以下引起的那些细菌感染：炭疽、革兰氏阴性杆菌、衣原体、白喉、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、疟疾、结核分枝杆菌、百日咳毒素、肺炎球菌、立克次氏体、葡萄球菌、链球菌和破伤风。
可以根据本发明的教导治疗的超级细菌感染(例如多重性耐药菌)的具体示例包括但不限于由屎肠球菌、艰难梭菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌科(包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌属)引起的那些。
可以根据本发明的教导治疗的真菌感染的具体示例包括但不限于由念珠菌属、球孢子菌、隐球菌属、组织胞浆菌、利什曼原虫属、疟原虫属、原生动物门、寄生虫属、血吸虫属、癣菌属、弓形体属和克氏锥虫引起的那些。
NK细胞治疗的临床经验已经表明，同种异体NK细胞可以成功地移植到宿主中，移植物抗宿主病(GVHD)的发生率较低。当已知用于移植的候选者(例如，“对象”)的身份时，可以确定诸如HLA匹配(相容性)的参数，并将其用作选择标准。根据一个实施方式，NK细胞选自HLA单倍体或HLA不匹配的供体。NK细胞供体可以是相关的或非相关的供体。根据一个实施方式，NK细胞获自同基因供体。
如本文所用，术语“约(about)”是指±10％。
术语“包括(comprises、comprising、includes、including)”、“具有(has、having)”及其同源词意为“包括但不限于”。
术语“由……组成(consisting of)”是为“包括并限于”。
术语“基本上由……组成(consisting essentially of)”意为组合物、方法或结构可包括
另外的成分、步骤和/或部件，但前提是另外的成分、步骤和/或部件不会实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特性。
如本文所使用的，单数形式“一个(a、an)”和“所述(the)”包括复数，除非上下文另有明确的指示。例如，术语“化合物(a compound)”或“至少一种化合物(at least onecompound)”可以包括多种化合物，包括其混合物。
在整个申请中，本发明的各个实施方式可以以范围的形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应当被解释为对本发明的范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应当被认为已经具体公开了子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何，都适用。
每当本文指出数值范围时，意为包括在所指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。表述“第一指示数和第二指示数之间的范围”和“从第一指示数到第二指示数的范围”在本文中可互换使用，意为包括第一指示数字和第二指示数字以及它们之间的所有分数和整数。
如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知的或者容易从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
如本文所用，术语“治疗(treating)”包括放弃、基本上抑制、减缓或逆转病症的发展、基本上改善病症的临床或美学症状，或基本上防止病症的临床或美学症状的出现。
应当理解，为了清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合地提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本本发明的各个特征也可以单独提供，或者以任何合适的子组合提供，或者以本发明的任何其它描述的实施方式中的合适的方式提供。在各个实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是这些实施方式的必要特征，除非该实施方式在没有这些元件的情况下不起作用。
如上文所述以及如以下权利要求部分所要求的本发明的各个实施方式和方面在以下实施例中得到实验支持。
实施例
现在参考下面的实施例，这些实施例与上面的描述一起以非限制性的方式说明了本发明。
通常，本文使用的命名和本发明中使用的实验室方法包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如：“Molecular Cloning:Alaboratory Manual”Sambrook等人，(1989)；“Current Protocols in MolecularBiology”，第I-III卷，Ausubel,R.M.编(1994)；Ausubel等人，“Current Protocols inMolecular Biology”，约翰威立国际出版公司(John Wiley and Sons,Baltimore,Md.)，巴尔的摩，马里兰州(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning”，约翰威立国际出版公司，纽约(1988)；Watson等人，“Recombinant DNA”，科学美国人书籍(Scientific American Books)，纽约；Birren等人(编辑)，“Genome Analysis:ALaboratory Manual Series”，第1-4卷，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborPress)，纽约(1998)；如以下美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中所述的方法论；“Cell Biology:A Laboratory Handbook”，第I-III卷，Cellis,J.E.编辑(1994)；“Current Protocols in Immunology”卷I-III，Coligan J.E.编辑(1994)；Stites等人编辑，“Basic and Clinical Immunology”(第八版)，Appleton&Lange出版社，诺沃克，CT(1994)；Mishell和Shiigi编辑，“Selected Methods in CellularImmunology”，曼出版公司，纽约(1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中被广泛描述，参见，例如：美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”，Gait,M.J.编辑(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”，Hames,B.D.和Higgins S.J.编辑(1985)；“Transcription and Translation”，Hames,B.D.,and Higgins S.J.编辑(1984)；“AnimalCell Culture”，Freshney,R.I.编辑(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”，IRL出版社(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”，Perbal,B.(1984)和“Methodsin Enzymology”，2、2、317卷，美国学术出版社；“PCR Protocols:A Guide To Methods AndApplications”，美国学术出版社，圣地亚哥，CA(1990)；Marshak等人，“Strategies forProtein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual”，CSHL出版社(1996)；所有这些都通过引用的方式并入本文，如同在本文中完全阐述一样。在本文中还提供了其它的一般参考资料。其中的程序被认为是本领域熟知的，是为了方便读者而提供的。其中包含的所有信息通过引用并入本文。
一般材料和实验程序
以T细胞为饲养细胞的离体培养
在第0天，通过单采术从健康供体采集血细胞。通过用ACK缓冲液(Gibco,Dublin,Ireland)洗涤来裂解红细胞(RBC)。根据制造商的说明，使用CliniMACS和CD3试剂(Miltenyi Biotec，德国)耗尽CD3+细胞。
用含有20％ HSA的CliniMACS缓冲液来洗涤CD3-耗尽的细胞，并将其重悬于完全MEMα培养基中。
将细胞接种在含有0.05mg/ml庆大霉素(Braun)、2mM L-谷氨酰胺(HyClone)的MEMα培养基中，该培养基并进一步补充有10％人类AB血清(Gemini)、7mM烟酰胺(Vertillus)和20ng/ml IL-15(Miltenyi)。
将0.35×106个细胞/ml的CD3-耗尽的细胞接种于GREX100MCS细胞培养瓶(WilsonWolf)中，该培养瓶含有400mL MEMα培养基，还含有1:1比例的经辐射的CD3+细胞作为饲养细胞(即在40Gy,130KV,5mA下辐射)和10ng/ml OKT-3(Miltenyi)。细胞在5％CO2和37℃下的加湿培养箱中温育。
在第6至9天，向每个G-REX100MCS培养瓶中加入400mL MEM培养基，以使体积加倍。
在第12至14天，对细胞进行计数并制备用于mRNA电穿孔以瞬时表达感兴趣的膜结合蛋白，如嵌合抗原受体(CAR)、IL-15等，如下所述。电穿孔后，将细胞转移到具有如上所述的富含人类血清的MEMα培养基的24孔板中。回收细胞24-48小时，然后进行分析。
(可选地，在培养开始后24至72小时，进一步制备如下所述用于电穿孔的CD3-耗尽的细胞，以敲除基因表达。电穿孔后，将CD3-耗尽的细胞接种于GREX100MCS细胞培养瓶中，持续培养12至14天，如上所述)。
以PBMC为饲养细胞的离体培养
在第0天，通过单采术从健康供体采集血细胞。通过用ACK缓冲液(Gibco,Dublin,Ireland)洗涤来裂解红细胞(RBC)。根据制造商的说明，使用CD56微珠和LS柱(MiltenyiBiotec；CAT号分别为130-050-401和130-042-401)。或者，使用MicroBeads(Miltenyi)的混合物通过负选择来选择CD56+细胞。
用含有20％ HSA的CliniMACS缓冲液洗涤CD56+细胞，并将其重悬于补充有10％人类血清和50ng/mL IL-2的培养基中，并以2×106个细胞/mL的浓度接种于培养瓶中。
24至72小时后，采集细胞，计数，使用CEDEX计数机和流式细胞仪生存力染料测试生存力，并制备电穿孔以敲除基因表达，如下所述。
电穿孔后，将细胞接种于含有0.05mg/ml庆大霉素(Braun)、2mM L-谷氨酰胺(HyClone)的MEMI培养基中，该培养基并进一步补充有10％人类AB血清(Gemini)、7mM烟酰胺(Vertillus)和20ng/ml IL-15(Miltenyi)。
将4×106个细胞/ml的CD56+细胞接种于6孔Grex培养瓶(Wilson Wolf)中，该培养瓶含有16mL MEMα培养基，还含有1:1比例的经辐射的外周血单核细胞(PBMC)(新鲜或解冻的)作为饲养细胞(即在40Gy,130KV,5mA下辐射)和10ng/ml的OKT-3(Miltenyi)。细胞在5％CO2和37℃下的加湿培养箱中温育。
在第6至9天，向每个6孔Grex培养瓶中加入16mLMEMα培养基，以使体积加倍。
在第14至16天，对细胞进行计数和分析。
可选地，在第12至14天，进一步制备用于mRNA电穿孔以瞬时表达感兴趣的膜结合蛋白(例如CAR、IL-15等)，如下所述。电穿孔后，将细胞转移到具有如上所述的富含人类血清的MEMα培养基的24孔板中。回收细胞24-48小时，然后进行分析。
mRNA电穿孔用于瞬时蛋白表达
在培养的第12至14天，对细胞进行计数，用PBS×1洗涤，然后再次用冷Opti-MEMTM(GibcoTM)洗涤。
对于mRNA电穿孔，使用2×106至4×106个细胞和10μg至30μg mRNA，最终体积为100μl。电穿孔在2mm冷比色皿中以最大体积400μl(按上述量按比例放大)进行，使用BTX-GeminiTwin WaveElectroporator按照校准程序(在电压300，持续时间1msc,1个方波脉冲下)进行。
表1：mRNA表达的序列列表
电穿孔后，将细胞转移到具有如上所述的富含人类血清的MEME培养基的12孔板中。回收细胞24小时，然后进行分析。
基因敲除
筛选gRNA
将每个向导RNA的DNA序列克隆到CRIS PR表达质粒中，并在Hek293细胞系中进行基因组编辑实验。选择活性最高的gRNA(见下表2，III)进行进一步的实验。为了评价编辑效率，用合适的引物通过PCR扩增所操作过的基因座(loci)(参见下表3)，并通过桑格测序进行测序。通过TIDE分析了INDEL编辑百分比E。
表2：CD38和CISH的gRNA序列
表3：引物序列
RNP复合物制备
化学修饰的sg RNA寡聚物由Integrated DNA Technologies公司(IDT；美国爱荷华州科勒尔维尔(Coralville,IA,USA))合成。对于每个电穿孔反应，416pmol的Alt-R Cas9蛋白质(IDT；美国爱荷华州科勒尔维尔)与Alt-R sg RNA以1:2.5摩尔比(每个反应1040μmol)在PBS溶液(总体积20μl)中复合。在电穿孔之前，在室温下使复合物形成10至20分钟。
通过RNP电穿孔在NK细胞中进行基因组编辑
培养24至72小时后，对CD56+NK细胞进行计数，用PBS×1洗涤，然后重悬于Opti-MEMTM(GibcoTM)中。每个反应在80μL Opti-MEMTM中使用2×106至4×106个细胞，并以4μM的最终浓度与RNP复合物混合。然后向细胞补充4μl(100μM)Alt-R增强剂(IDT；美国爱荷华州科勒尔维尔)。将补充的细胞溶液转移到BTX-Gemini双波电穿孔仪中，并使用校准程序(电压300，持续时间2msc)进行电穿孔。
电穿孔后，将细胞转移至GREX培养装置中，并培养(如上所述)12至14天。培养结束时，收获细胞并进行分析。此外，在同一时间点，用QuickExtract(Lucigen,Middleton,WI,USA)提取基因组DNA。为了评估编辑效率，使用合适的引物通过PCR扩增所操作的基因座(表2)，并通过桑格测序进行测序。通过TIDE分析了INDEL编辑百分比。
FACS分析
对于FACS分析，细胞用以下荧光抗体染色：
表4：用于FACS的抗体的列表
抗体 目录号
CD56 VioBright B515(FITC) Miltenyi 130-114-552
CD340(eRBb-2)(APC) Miltenyi 130-124-467
CD38(APC) Miltenyi 130-113-429
Viability-Helix NP Blue Biolegend 425305
夹层流式细胞术技术
该方法用于测定NK细胞上的CAR表达。该方法中使用的术语“夹层”遵循以下顺序：在底部-表达CAR的NK细胞；在中间-由CAR结合的蛋白质；以及在顶部-与蛋白质表位结合的AB。
例如，为了检测NK细胞表面上的抗-Her2 CAR表达，将NK细胞与1μg的Her2可溶性蛋白一起培养30分钟，洗涤，然后加入抗-Her2 APC抗体，并与细胞一起培养15分钟。
效力测定(促炎细胞因子和CD107a脱粒标记的细胞内染色)
效力测定分析了细胞内和表面表达的各种激活标记的表达。所选择的标记既是直接细胞细胞毒性的指标，又是能够促进NK细胞的抗肿瘤活性的促炎细胞因子分泌的指标。
NK细胞杀伤其靶标的机制之一是通过从裂解颗粒(lytic granule)中释放细胞毒性分子。该过程涉及颗粒膜与NK细胞的细胞质膜的融合，导致溶酶体相关蛋白质的表面暴露，这些蛋白质通常存在于裂解颗粒如CD107a周围的脂双层上。因此，CD107a的膜表达构成了免疫细胞激活和细胞毒性脱颗粒的标记。NK细胞拥有的另一种杀伤机制是通过死亡受体诱导的靶细胞凋亡。激活的NK细胞分泌多种细胞因子，如IFN-γ和TNFα、GM-CSF等。IFN-γ是NK细胞分泌的最有效的效应细胞因子之一，在抗肿瘤活性中发挥着至关重要的作用。IFN-γ已被证明可以调节半胱天冬酶、FasL和TRAIL表达，并激活抗肿瘤免疫。因此，基于CD107a、TNFα和IFN-γ的表达评估NK细胞的效力。
将1×106个NK细胞与0.5×106个靶细胞(K562，RAJI)+/-RTX(0.5μg/ml)共培养，并在FACS管中将2μl CD107a抗体加入到总体积为1ml的NK培养基(MEMα+10％ AB血清)中。对照的制备如下：阳性对照：NK细胞+5μl PMA(50ng/ml)+1μl离子霉素(1μg/ml)，阴性对照：NK细胞(无靶标)和尺寸对照：NK、K562、RAJI、NK+K562、NK+RAJI。将细胞以300rpm离心30秒，并在37℃下温育30分钟。温育后，向每个试管中加入BFA和莫能菌素/GolgiStop(BFA的最终浓度为5μg/ml，4μg/ml GS)。将细胞以300rpm离心30秒，并在37℃下温育3.5小时，之后加入Zombie生存力染料，并洗涤。
首先对细胞进行细胞表面标记染色，方法如下：加入1.5μl外膜抗体(CD56、CD16)，在2至8℃下避光温育10分钟，并洗涤。此时使用并加入内部染色试剂盒(Miltenyi,CAT#130-090-4777)进行细胞内染色。将细胞固定并透化，离心后加入细胞内mAb(IFN-γ和TNF-E)，将细胞在室温下避光温育15分钟。然后洗涤细胞，并进行分析。
表5：用于效力测定和脱粒的抗体列表
细胞毒性测定/杀伤测定(IncuCyte)
通过活细胞成像系统IncuCyte S3进行细胞毒性杀伤试验，允许采集有关NK活性的实时数据。用CFSE染料(Life Technologies公司)标记肿瘤靶细胞，并在培养基中存在PI(碘化丙啶，Sigma)的情况下与NK细胞共培养20小时。存活细胞保持未染色，而死亡细胞通过CFSE荧光染色和PI的重叠进行检测。
示例性实施方式
实施方式1.一种离体生产经遗传修饰的自然杀伤(NK)细胞的方法，所述方法包括：
(a)下调NK细胞群中感兴趣基因的表达，以获得经遗传修饰以下调感兴趣基因的NK细胞群；
(b)扩增所述经遗传修饰以下调感兴趣基因的NK细胞群，从而获得离体扩增的NK细胞群；和
(c)上调所述离体扩增的NK细胞群中至少一种膜结合蛋白的表达，从而产生经遗传修饰的NK细胞。
实施方式2.一种离体生产表达至少一种膜结合蛋白的自然杀伤(NK)细胞的方法，所述方法包括：
(a)通过包括以下步骤的方法扩增NK细胞群：
(i)在允许细胞增殖的条件下培养所述NK细胞群，其中所述条件包括提供有效量的营养素、血清、IL-15和烟酰胺；和
(ii)在步骤(i)后5至10天，用有效量的新鲜营养素、血清、IL-15和烟酰胺补充所述NK细胞群，以产生扩增的NK细胞；
从而获得离体扩增的NK细胞群；和
(b)上调所述离体扩增的NK细胞群中至少一种膜结合蛋白的表达，从而产生表达所述至少一种膜结合蛋白的NK细胞。
实施方式3.根据实施方式1或2的方法，其中所述NK细胞群来自脐带血、外周血、骨髓、CD34+细胞或iPSC。
实施方式4.根据实施方式1至3中任一项的方法，其中所述NK细胞群不含CD3+细胞。
实施方式5.根据实施方式1至4中任一项的方法，其中所述NK细胞群包括CD3-CD56+细胞。
实施方式6.根据实施方式1或3至5中任一项的方法，其中所述下调通过基因编辑系统进行。
实施方式7.根据实施方式1或3至6中任一项的方法，其中所述NK细胞在培养中。
实施方式8.根据实施方式7的方法，其中所述下调从所述培养开始后24至72小时进行。
实施方式9.根据实施方式1或3至8中任一项的方法，其中所述感兴趣基因包括其产物影响所述NK细胞增殖和/或存活的基因。
实施方式10.根据实施方式1或3至9中任一项的方法，其中所述感兴趣基因选自由CISH、TGFβ受体和CD38所组成的组。
实施方式11.根据实施方式1或3至10中任一项的方法，其中在允许细胞增殖的条件下进行所述NK细胞群的所述扩增，其中所述条件包括有效量的营养素、血清、生长因子和烟酰胺。
实施方式12.根据实施方式11的方法，其中所述生长因子包括至少一种选自由IL-15、IL-2、IL-7、IL-12、IL-21、SCF和FLT3所组成的组的生长因子。
实施方式13.根据实施方式2至12中任一项所述的方法，其中所述烟酰胺的所述有效量包括1.0mM至10mM的量。
实施方式14.根据实施方式1至13中任一项的方法，其中所述扩增所述NK细胞群在饲养细胞或饲养层的存在下进行。
实施方式15.根据实施例14的方法，其中所述饲养细胞包括经辐射的细胞。
实施方式16.根据实施方式14或15的方法，其中所述饲养细胞包括T细胞或PBMC。
实施方式17.根据实施例16的方法，还包括CD3激动剂。
实施方式18.根据实施方式1至17任一项的方法，其中所述扩增所述NK细胞群进行14至16天。
实施方式19.根据实施方式7至18中任一项的方法，其中所述上调所述至少一种膜结合蛋白的表达在培养开始的第12至14天进行。
实施方式20.根据实施方式1至19中任一项的方法，其中所述上调所述至少一种膜结合蛋白的表达通过mRNA电穿孔进行。
实施方式21.根据实施方式1至20中任一项的方法，其中所述至少一种膜结合蛋白是瞬时表达的。
实施方式22.根据实施方式1至21中任一项的方法，其中所述至少一种膜结合蛋白包含在体内影响所述NK细胞的抗疾病功能或存活的蛋白。
实施方式23.根据实施方式1至22中任一项的方法，其中所述至少一种膜结合蛋白选自由IL-15、IL-15R、受体连接蛋白IL-15(RLI)和TLR所组成的组。
实施方式24.根据实施方式1至22中任一项的方法，其中所述至少一种膜结合蛋白包含嵌合抗原受体(CAR)或转基因T细胞受体(tg-TCR)。
实施方式25.根据实施方式24的方法，其中所述CAR包含至少一个共刺激结构域。
实施方式26.根据实施方式25的方法，其中所述至少一个共刺激结构域选自由CD28、2B4、CD137/4-1BB、CD134/OX40、Lsk、ICOS和DAP10所组成的组。
实施方式27.根据实施方式24至26中任一项的方法，其中所述CAR包含至少一个激活结构域。
实施方式28.根据实施方式27的方法，其中所述激活结构域包含CD3ζ或～FcR-γ。
实施方式29.根据实施方式24至28中任一项的方法，其中所述CAR包括跨膜结构域和铰链结构域中的至少一个。
实施方式30.根据实施方式29的方法，其中所述跨膜结构域选自CD8、CD28和NKG2D。
实施方式31.根据实施方式29或30的方法，其中所述铰链结构域选自CD8和CD28。
实施方式32.根据实施方式24至31中任一项的方法，其中所述CAR包含抗原结合结构域，其是抗体或抗原结合片段。
实施方式33.根据实施方式32的方法，其中所述抗原结合片段是Fab或scFv。
实施方式34.根据实施方式24至33中任一项的方法，其中所述CAR或所述tg-TCR对选自由肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原和寄生虫抗原所组成的组的抗原具有抗原特异性。
实施方式35.根据实施方式34的方法，其中所述肿瘤抗原与实体瘤相关。
实施方式36.根据实施方式34的方法，其中所述肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。
实施方式37.根据实施方式34至36中任一项的方法，其中所述CAR或所述tg-TCR对抗原具有抗原特异性，所述抗原选自由以下所组成的组：HER2/Neu、CD38、CD19、CD319/CS1、ROR1、CD20、CD5、CD7、CD22、CD70、CD30、BCMA、CD25、NKG2D配体、MICA/MICB、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、黑素瘤相关抗原、突变p53、突变ras、ERBB2、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Ralpha、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、WT-1、EGFRvIII、TRAIL/DR4和/或VEGFR2。
实施方式38.根据实施方式1至37中任一项的方法，其中所述至少一种膜结合蛋白包含以下的共表达：
(i)CAR或TG-TCR，和
(ii)影响体内NK细胞存活的细胞因子或受体。
实施方式39.根据实施方式1或3至37中任一项的方法，其中当感兴趣基因是CISH时，所述至少一种膜结合蛋白包含IL-15。
实施方式40.根据实施方式1或3至37中任一项的方法，其中当感兴趣基因是CD38时，所述至少一种膜结合蛋白包含抗-CD38 CAR。
实施方式41.一种分离的NK细胞群，其可根据实施方式1至40中任一项的方法获得。
实施方式42.一种药物组合物，其包含实施方式41的分离的NK细胞群和药学活性载体。
实施方式43.一种治疗有需要的对象的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的实施方式41的分离的NK细胞群，从而治疗所述对象。
实施方式44.治疗有效量的实施方式41的分离的NK细胞群，用于治疗有需要的对象的疾病的用途。
实施方式45.根据实施方式43的方法，或根据实施方式44的用于用途的分离的NK细胞群，其中所述疾病选自由恶性疾病、病毒性疾病、细菌性疾病、真菌疾病、原生动物疾病和寄生虫疾病所组成的组。
实施方式46.根据实施方式45的方法或用于用途的分离的NK细胞群，其中所述恶性疾病是实体瘤或肿瘤转移。
实施方式47.根据实施方式46的方法或用于用途的分离的NK细胞群，其中所述恶性疾病选自由以下所组成的组：乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、黑素瘤、肉瘤、成神经细胞瘤、结肠癌、结直肠癌、食管癌、滑膜细胞癌、子宫癌、神经胶质瘤与宫颈癌。
实施方式48.根据实施方式45的方法或用于用途的分离的NK细胞群，其中所述恶性疾病是血液恶性肿瘤。
实施方式49.根据实施方式48的方法或用于用途的分离的NK细胞群，其中所述血液恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
实施方式50.根据实施方式43或45至49中任一项的方法，或根据实施方式44至49的用于用途的分离的NK细胞群，其中所述对象是人类对象。
实施例1：NAM离体扩增的NK细胞中的CISH基因敲除(KO)
尽管NK细胞具有杀伤多种病毒感染、应激和转化细胞的固有能力，但是在许多晚期实体人类癌症中经常观察到少量的功能失调的NK细胞。因此，本发明人已经生产了下一代策略来增强NK细胞治疗，例如通过靶向调节肿瘤微环境中NK细胞功能性的检查点。
IL-15是一种多效细胞因子，是NK细胞发育、稳态和激活的重要调节因子。IL-15信号传导是肿瘤微环境中NK细胞增殖、存活和抗肿瘤功能所需要的(如下面实施例2中进一步讨论的)。
如图1A-B所示，细胞因子可诱导的含SH2的蛋白质(CIS，由CISH编码)是细胞因子信号传导(SOCS)的抑制因子的成员，并通过负反馈环作为IL-15信号传导的关键抑制因子。SOCS基因是在细胞因子受体参与和JAK/STAT信号传导级联激活后被诱导的。它们主要作为E3泛素连接酶复合物的衔接子，并通过结合受体复合物和/或相关的JAK蛋白酪氨酸激酶来抑制细胞因子信号传导，从而靶向它们进行蛋白酶体降解。
因此，本发明人旨在生产其中CISH基因被敲除的NK细胞，从而通过降低NK激活阈值产生对IL-15的敏感性增加的细胞。
对于CISH敲除，检查了靶向第3外显子的4种gRNA和靶向第4外显子的另外4种gRNA(数据未示出)。如上所述，每个向导的DNA序列被克隆到CRISPR表达质粒中，并在Hek293细胞系中进行基因组编辑实验。选择活性最高的gRNA(参见上表1)进行进一步的实验。
从图2A-C所示可以明显看出，在测试的三种gRNA中，向导4(也称为CISH-G4或CISH2)和向导10(也称为CISH-G10或CISH3)产生了高编辑率(INDEL频率分别为85％和82％)，而“旧向导”(CISH1，其序列取自公共出版物，参见Palmer等人，bioRxiv September25,2020)产生了30％的INDEL频率。gRNA-4(CISH2)的INDEL指数最高。
如图3A-B所示，CISH敲除增强了促炎细胞因子应答。具体而言，与向导10(CISH3)和“旧向导”(CISH1)相比，发现向导4(CISH2)活性最高，并且效力增强。
此外，CISH敲除增加了对肿瘤细胞系的细胞毒性，如图4A-C所示。具体而言，发现向导4(CISH2)对共培养的靶细胞具有最有效的杀伤活性。
实施例2：膜结合的IL-15在NAM离体扩增的NK细胞上的表达
IL-15主要由激活的髓样细胞产生，作为与IL-15R～相关的膜结合异二聚体，以这种方式反式呈递给表达IL-2/IL-15Rβ和共有的γ链受体的NK细胞和T细胞(参见图5A-B)。重要的是，IL-15对于NK细胞的个体发生至关重要，事实上，IL-15是唯一一种已被证明能直接支持体内NK细胞发育的细胞因子。因此，IL-15诱导NK细胞的增殖、细胞毒性作用和其它细胞因子如IFN-γ的释放，突出了其在增强免疫应答中的作用。
临床前观察有力支持了NK细胞和T淋巴细胞介导的IL-15的潜在抗肿瘤活性。IL-15的全身递送已被尝试作为一种癌症疗法，但是其使用的热情因毒性而有所减弱。因此，将IL-15更精确地递送至靶细胞或特异性地使靶细胞对IL-15更敏感的新方法是有吸引力的研究途径。
受体连接蛋白IL-15(RLI)
体外和体内临床前研究表明，当反式-呈递吸附到IL-15R～受体亚基上时，其生物活性更高。重组IL-15由于其分子尺寸较小，可快速从血液中消除。因此，几种方法侧重于设计包含IL-15和IL-15RE的更稳定的蛋白质构建体，这些构建体显示出更长的半衰期和更好的生物分布参数。
重组蛋白受体连接蛋白IL-15(RL1)包括通过柔性连接体与IL-15结合的IL-15R～的结合结构域(所谓的Ssushi结构域)(参见图5C-D)。这种融合蛋白对IL-15R-β/γ复合物显示出更长的半衰期和超强的激动活性，并且在体内模型中发挥抗肿瘤特性。
IL-15N72D取代
发现位于螺旋C末端的位置第72位的天冬酰胺残基的氨基酸取代提供了部分激动剂和超激动剂活性，各种非保守取代提供了增强的活性。特别地，基于对带有人类IL-15R和共有的γ链的细胞的增殖分析，N72D取代使IL-15突变蛋白的生物活性比天然分子增加了4-5倍(Zhu等人，J Immunol(2009)183(6)3598-3607)。IL-15N72D突变蛋白通过改善与人类IL-15Rβ链的结合能力而表现出超激动剂活性。与野生型IL-15相比，IL-15N72D增强的生物活性与Jak1和Stat5更强烈的磷酸化以及更好的抗凋亡活性相关。当与单链T细胞受体结构域连接以产生肿瘤特异性融合蛋白时，IL-15N72D超激动剂活性也得以保留(Zhu等人，JImmunol(2009)183(6)3598-3607)。因此，人类IL-15超激动剂突变蛋白和融合蛋白可能为构建具有临床实用性的更有效的免疫治疗剂创造机会。
膜结合RILN72D
RL1以高亲和力与IL-15β/γ受体结合，并且IL-15细胞因子的第72位用天冬氨酸对天冬酰胺进行氨基酸取代增强了受体配体接触的活性(Guo等人，Cytokine GrowthFactor Rev.(2017)3 8:10-21)。
将所有这些特征结合在一起，本发明人设计了称为301.A和301.B的新RLI构建体，其带有N72D突变并通过HLA胞外链、跨膜部分和胞质锚与细胞膜连接(参见图6A-C)。
遗传构建体301.A的构建(图6A-B和6E)
RL1-如Wong组(Zhu等人，J Immunol(2009)183(6)3598-3607)所述，在第72位用天冬氨酸对天冬酰胺进行氨基酸取代，并在SEQ ID NO:11中列出。
IL-15和IL-15Ra之间的连接体被25aa-(Gly4 Ser)5(SEQ ID NOs:17-18)的常规连接体替换。
IL-15Ra和HLA链之间的连接体被常规的短(13aa)GS连接体(SEQ ID NO:19-20)替换。
细胞外、跨膜和胞质片段被人类HLA-A基因(SEQ ID NO:21-22)替换。
301.A的完整构建体分别以SEQ ID No:23-24、完整序列和密码子优化序列提供。
遗传构建体301.B的构建(图6C-D和6F)
RL1-如Wong组(Zhu等人，J Immunol(2009)183(6)3598-3607)所述，在第72位用天冬氨酸对天冬酰胺进行氨基酸取代，并在SEQ ID NO:11中列出。
IL-15和IL-15Ra之间的连接体被25aa-(Gly4 Ser)5(SEQ ID NOs:17-18)的常规连接体替换。
IL-15和HLA链之间的连接体被常规的短(13aa)GS连接体(SEQ ID NO:19-20)替换。
细胞外、跨膜和胞质片段被人类HLA-A基因(SEQ ID NO:21-22)替换。
301.B的完整构建体分别以SEQ ID No:26-27、完整序列和密码子优化序列提供。
结果
如图7所示，发现表达膜结合的IL-15的NK细胞表达增加的CD107a相关的脱颗粒标记，表明在操作后细胞的高激活。
如图8A-C所示，与靶肿瘤细胞系共培养后，膜结合IL-15的表达也增强了促炎细胞因子应答。
此外，如图9A-C所示，膜结合的IL-15的表达增加了针对肿瘤细胞系K562、BL2和RPMI-8226的细胞毒性。
总之，RLI构建体301.B说明了评估的两个构建体之间更好的结果。
实施例3-包含CD38基因敲除(KO)并表达抗-p38 CAR的NAM离体扩增的NK细胞
使用嵌合抗原受体(CAR)增强同种异体自然杀伤(NK)细胞疗法，以增强多发性骨髓瘤(MM)靶向有很强的生物学原理。CD38是MM中已确定的免疫治疗靶点，但其在NK细胞上的表达及其在离体NK细胞扩增过程中的进一步诱导代表了开发抗-CD38CAR-NK细胞疗法的障碍(参见图10)。为了克服在使用原代扩增的NK细胞时由于NK细胞CD38表达而导致的预期自相残杀，本发明人应用CRISPR-Cas9基因组编辑来破坏NK细胞上的CD38蛋白表达。
对于p38敲除，检查了靶向第二外显子的四种gRNA(数据未示出)。如上所述，将每种向导的DNA序列克隆到CRISPR表达质粒中，并在Hek293细胞系中进行基因组编辑实验。选择活性最高的gRNA序列(参见上表1)进行进一步的实验。
从图11A-E可以明显看出，使用CRISPR-Cas9的CD38 KO是有效的，并且不影响NK细胞生存力。此外，在达妥木单抗存在的情况下，CD38 KO NK细胞对自相残杀具有抗性(图11F)。然而，自相残杀的拯救没有体现在更好的癌细胞杀伤中(图11F)。
为了改善癌症治疗，并避免同时使用抗-CD38抗体(如达妥木单抗(DARA))的需要，本发明人进一步在p38-KO NK细胞上构建和表达抗-CD38 CAR(参见图13)。
抗-CD38 CAR的构建(图12A-B)
抗-CD38 CAR是基于Zelig等人(PCT/IL2018/051325SEQ ID No:29-30)先前讨论的单链可变片段(scFv)。具体地，CAR构建体如下：～CD38scFv-CD28铰链+TM+Cy-FCγ(SEQID NO:31-32)。
从图14可以明显看出，CD38 KO和抗-CD38 CAR表达的组合增加了对多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性。
实施例4：表达抗-Her2 CAR的NAM离体扩增的细胞
在治疗ERBB2过表达肿瘤的实体肿瘤癌症患者的尝试中，基于广泛使用的人源化单克隆抗体曲妥珠单抗(mAb)曲妥珠单抗(Herceptin)的单链可变片段(scFv)开发了NK嵌合抗原受体(CAR)细胞，如Rosenberg等人(Mol Ther.(2010)18(4):843±851)先前所讨论的。
使用连接Her2 scFv的信号传导部分的不同片段。使用mRNA电穿孔将它们表达在NK细胞膜上。
抗-HER2 CAR构建
如图15、16A-D和17所示，以模块化的方式为抗-HER2 CAR设计了不同的构建体，其中铰链、跨膜、细胞质结构域被修饰，但是抗-Her2 scFv保持不变，如下所述：
铰链
铰链区的长度对于免疫突触的形成很重要。根据抗原离细胞表面的距离，需要调整铰链长度，以允许效应物和靶细胞之间的最佳距离。CD28或CD8的氨基酸序列用于构建抗-HER2 CAR(如SEQ ID No:38-41中所示)。
跨膜
跨膜(TM)结构域由跨越细胞膜并锚定CAR构建体的疏水性α螺旋组成。已经显示TM结构域的选择影响通过细胞激活程度介导的CAR构建体的功能性。CD28或CD8的氨基酸序列是迄今为止最常用的，并与NKG2D的氨基酸序列一起用于构建抗-HER2 CAR(如SEQ ID No:42-47所示)。
内结构域
CAR构建体的进化主要集中于优化细胞内信号传导结构域，前三代CAR构建体指的是构成内结构域的激活和共刺激分子的数量。共刺激结构域的选择允许对所需的NK细胞应答进行微调，因此，与基于4-1BB的CAR相比，基于CD28的CAR表现出增加的细胞溶解能力和更短的持续时间。
抗-HER2 CAR的构建包括具有CD3ζ或FC-受体激活结构域的共刺激结构域CD28、4-1BB和2B4(如SEQ ID No:48-55中所示)。命名为A-D的抗-HER2 CAR的完整构建体分别在SEQID No:60、62、64和66中提供。
命名为C、B和D的三个CAR构建体都表达抗-HER CAR，这可通过识别HER2蛋白得到证实(图18B-G)。使用夹层流式细胞术技术，通过将NK与Erbb2蛋白预温育，然后进行抗-Her2染色来识别NK细胞上的CAR构建体表达。
实施例5：NAM离体扩增的NK细胞中的TGFβ受体基因敲除(KO)
TGFβ是一种通过TGFβ受体抑制免疫应答的细胞因子。许多肿瘤过度表达TGFβ作为免疫防御机制。
TGFβ受体2敲除使NK细胞对TGFβ介导的免疫抑制不敏感。因此，本发明人正在产生其中TGFβ受体2基因被敲除的NK细胞(如图19所示)。
尽管已经结合本发明的特定实施方式描述了本发明，但是显然，对于本领域的技术人员来说，许多替换、修改和变化是显而易见的。因此，本发明旨在包含落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这些替换、修改和变化。
实施例6：受体连接蛋白IL-15CISH敲除NK细胞中的细胞表面表型
CISH敲除(KO)和受体连接蛋白IL-15(mbIL-15)表达的联合策略使得抗肿瘤细胞毒性提高。图20示出了CISH KO上NKp30表面表达与mbIL-15共表达的流式分析(向导4＝CISH3和向导3＝CISH4)。图25示出了CISH KO上CD122和NKG2A表面表达与mbIL-15(GDA-301)共表达的流式分析。此外，CISH KO与mbIL-15(GDA-301)NK细胞共表达表明，电穿孔后24小时，NKG2A减少，并且这种情况在4天的时间内得以维持。图26示出了CISH KO上TIGIT和LAG3表面表达与mbIL-15(GDA-301)共表达的流式分析。
实施例7：受体连接蛋白IL-15NK显示出对肿瘤细胞的细胞毒性
测试了针对肿瘤细胞系的受体连接蛋白IL-15NK(mbIL-15)与同种异体外周血单核细胞的比较。如图29所示，与对照相比，在mbIL-15电穿孔的NK与K562细胞(比例1:1)共培养后发现了显著的杀伤活性。
实施例8：组合的CISH KO和受体连接蛋白IL-15NK显示出细胞毒性效力
如图28所示，CISH的CRISPR介导的KO得以证实。此外，同时使用向导4/CISH3和向导10/CISH4获得双向导KO(DK)(图28凝胶)。使用CISH KO和mbIL-15生成NK的工作流程如图28所示。EGFP mRNA的表达作为在第14天进行的电穿孔过程的阳性对照。如图21和图22所示，CISH KO和mbIL-15NK分别与K562、Raji和RPMI细胞共培养6小时(3:1E:T)后，CISH KO和mbIL-15NK显示出细胞毒性效力。此外，如图23所示，在表达具有CISH KO的mbIL-15的NK细胞中，MIP1α和MIP1β的表达也有所增加。
实施例9：组合的CISH KO和受体连接蛋白IL-15NK显示出更强的杀伤
如图24所示，当与CISH
KO+mbIL-15NK(E:T的比例为1:1或5:1)共培养时，观察到K562、Raji和RPMI细胞系的杀伤更强。K562和Raji细胞与修饰的NK共培养4-5小时，而RPMI细胞与修饰的NK共培养6小时。
实施例10：具有CD38 KO的NK细胞和具有组合的CD38 KO/CD38 CAR(GDA-601)表达的NK细胞显示出低的CD38表达
图27示出了CD38表达的流式分析，因为它与CD38敲除的NK(KO)和CD38 KO与CD38CAR表达的组合的NK相关。
实施例11：具有组合的CD38 KO/CD38 CAR(GDA-601)表达的NK细胞显示出增强的效力和杀伤
将具有组合的CD38 KO和CD38 CAR表达的NK细胞与RPMI 8226细胞(具有和不具有达妥木单抗)以1:3的E:T比例共培养6小时。如图30所示，观察到CD107α、TNFα、IFNγ和CM-CSF升高。图31显示出当以平板形式与预先包被BSA的人类重组CD38中温育6小时时，具有组合的CD38 KO和CD38 CAR表达的NK细胞的效力提高。
为了证实GDA-601细胞杀伤，在存在或不存在达妥木单抗的情况下，将GDA-601细胞与CFSE标记的RPMI 8226细胞以5:1至0:1的E:T比例培养6小时(图32)。对靶细胞进行CFSE门控，并测定死亡细胞的百分比。或者，对CFSE阴性细胞进行门控，并测定死亡NK细胞(自相残杀)的百分比。
申请人的意图在于，本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用全部并入本说明书中，结合程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请都通过引用具体和单独地结合到本说明书中。此外，本申请中任何参考的引用或标识不应解释为承认此类参考可作为本发明的现有技术。就所使用的章节标题而言，它们不应被理解为必要的限制。此外，本发明的任何一个或多个优先权文件的全部内容过引用的方式整体并入本文。

Claims (46)

1.一种包含多个自然杀伤(NK)细胞的有核细胞群，其中所述群包含至少1.0×106个有核细胞，其中所述群中至少约70％的所述NK细胞是存活的并表达受体连接蛋白IL-15，其中：
所述群中至少约70％的细胞是CD56+；
所述群中不超过约0.5％的细胞是CD3+；
所述群中不超过约10％的细胞是CD19+；
所述群中不超过约10％的细胞是CD14+；
所述群中不超过约40％的细胞是LAG3+；
所述群中至少约50％的细胞是CD122+；
所述群中不超过约60％的细胞是NKG2A+；
所述群中不超过约20％的细胞是TIGIT+；并且
所述群中至少约50％的细胞是NKp30+。
2.根据权利要求1所述的有核细胞群，其中所述受体连接蛋白IL-15是SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:28。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的有核细胞群，其中表达受体连接蛋白IL-15的至少约75％的所述NK细胞也不表达CISH。
4.一种包含多个自然杀伤(NK)细胞的有核细胞群，其中所述群包含至少1.0×106个有核细胞，其中所述群中至少约70％的所述NK细胞是存活的并表达抗-CD38嵌合抗原受体(CAR)，其中：
所述群中至少约70％的细胞是CD56+；
所述群中不超过约0.5％的细胞是CD3+；
所述群中不超过约10％的细胞是CD19+；
所述群中不超过约10％的细胞是CD14+；并且
所述群中不超过约15％的细胞是CD38+。
5.根据权利要求4所述的有核细胞群，其中所述群中不超过约5％的细胞是CD38+。
6.根据权利要求4至5中任一项所述的有核细胞群，其中所述群中不超过约1％的细胞是CD38+。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的有核细胞群，其中所述CAR包含抗-CD38 scFv。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的有核细胞群，其中所述CAR包含选自CD28和CD8的铰链结构域。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的有核细胞群，其中所述CAR包含选自CD28、CD8和NKG2D的跨膜结构域。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的有核细胞群，其中所述CAR包含选自CD28、4-1BB、2B4、CD3ζR、OX40、Lsk、ICOS、DAP10和IgE受体Ig的Fc片段的共刺激结构域。
11.根据权利要求4至10中任一项所述的有核细胞群，其中所述CAR包含选自CD3ζ、FcR-γ和Fc-ε-R的激活结构域。
12.根据权利要求4至11中任一项所述的有核细胞群，其中所述CAR包含信号肽。
13.根据权利要求4至12中任一项所述的有核细胞群，其中所述CAR选自SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32。
14.根据权利要求1至4中任一项所述的有核细胞群，其中表达受体连接蛋白IL-15或抗CD38 CAR的所述细胞还包含突变趋化因子受体。
15.根据权利要求1至4中任一项所述的有核细胞群，其中所述突变趋化因子受体是SEQID NO:69。
16.一种离体生产权利要求1至15中任一项的经遗传修饰的自然杀伤(NK)细胞的方法，所述方法包括：
(a)下调NK细胞群中感兴趣基因的表达，以获得经遗传修饰以下调感兴趣基因的NK细胞群；
(b)扩增所述经遗传修饰以下调感兴趣基因的NK细胞群，从而获得离体扩增的NK细胞群；和
(c)上调所述离体扩增的NK细胞群中至少一种膜结合蛋白的表达，从而产生所述经遗传修饰的NK细胞。
17.一种离体生产权利要求1至15中任一项的表达至少一种膜结合蛋白的自然杀伤(NK)细胞的方法，所述方法包括：
(a)通过包括以下步骤的方法扩增NK细胞群：
(i)在允许细胞增殖的条件下培养所述NK细胞群，其中所述条件包括提供有效量的营养素、血清、IL-15和烟酰胺；和
(ii)在步骤(i)后5至10天，用有效量的新鲜营养素、血清、IL-15和烟酰胺补充所述NK细胞群，以产生扩增的NK细胞；
从而获得离体扩增的NK细胞群；和
(b)上调所述离体扩增的NK细胞群中至少一种膜结合蛋白的表达，从而产生所述表达至少一种膜结合蛋白的NK细胞。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述NK细胞群来自脐带血、外周血、骨髓、CD34+细胞或iPSC。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述NK细胞群不含CD3+细胞。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述NK细胞群包括CD3-CD56+细胞。
21.根据权利要求16或18至20中任一项所述的方法，其中所述下调通过基因编辑系统进行。
22.根据权利要求16或18至21中任一项所述的方法，其中所述NK细胞在培养中。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述下调从所述培养开始后24至72小时进行。
24.根据权利要求16或18至23中任一项所述的方法，其中所述感兴趣基因包括其产物影响所述NK细胞增殖和/或存活率的基因。
25.根据权利要求16或18至24中任一项所述的方法，其中所述感兴趣基因选自由CISH、TGFβ受体和CD38所组成的组。
26.根据权利要求16或18至25中任一项所述的方法，其中在允许细胞增殖的条件下进行所述扩增所述NK细胞群，其中所述条件包括有效量的营养素、血清、生长因子和烟酰胺。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述生长因子包括至少一种选自由IL-15、IL-2、IL-7、IL-12、IL-21、SCF和FLT3所组成的组的生长因子。
28.根据权利要求17至27所述的方法，其中所述烟酰胺的所述有效量包括1.0mM至10mM的量。
29.根据权利要求16至28中任一项所述的方法，其中所述扩增所述NK细胞群在饲养细胞或饲养层的存在下进行。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述饲养细胞包括经辐射的细胞。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述饲养细胞包括T细胞或PBMC。
32.根据权利要求31所述的方法，还包括CD3激动剂。
33.根据权利要求16至32中任一项所述的方法，其中所述扩增所述NK细胞群进行14至16天。
34.根据权利要求22至33中任一项所述的方法，其中所述上调所述至少一种膜结合蛋白的表达在培养开始的第12至14天进行。
35.根据权利要求22至34中任一项所述的方法，其中所述上调所述至少一种膜结合蛋白的表达通过mRNA电穿孔进行。
36.根据权利要求22至35中任一项所述的方法，其中所述至少一种膜结合蛋白是瞬时表达的。
37.一种分离的根据权利要求1至15中任一项所述的NK细胞群，其根据权利要求16至36中任一项所述的方法可获得。
38.一种药物组合物，包含根据权利要求37所述的分离的NK细胞群和药学活性载体。
39.一种治疗有需要的对象的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的权利要求38所述的分离的NK细胞群，从而治疗所述对象。
40.一种治疗有效量的权利要求38所述的分离的NK细胞群，用于治疗有需要的对象的疾病的用途。
41.根据权利要求39所述的方法，或根据权利要求40所述的用于用途的分离的NK细胞群，其中所述疾病选自由恶性疾病、病毒性疾病、细菌性疾病、真菌疾病、原生动物疾病和寄生虫疾病所组成的组。
42.根据权利要求40所述的方法或用于用途的分离的NK细胞群，其中所述恶性疾病是实体瘤或肿瘤转移。
43.根据权利要求42所述的方法或用于用途的分离的NK细胞群，其中所述恶性疾病选自由以下所组成的组：乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、黑素瘤、肉瘤、成神经细胞瘤、结肠癌、结直肠癌、食管癌、滑膜细胞癌、子宫癌、神经胶质瘤与宫颈癌。
44.根据权利要求42所述的方法或用于用途的分离的NK细胞群，其中所述恶性疾病是血液恶性肿瘤。
45.根据权利要求44所述的方法或用于用途的分离的NK细胞群，其中所述血液恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
46.根据权利要求39或41至45中任一项所述的方法或根据权利要求36至43中任一项所述的用于用途的分离的NK细胞群，其中所述对象是人类对象。
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