CN108699132A - Mhc细胞受体的靶向破坏 - Google Patents

Abstract

本文公开了使用包括锌指蛋白和切割结构域或切割半结构域的锌指核酸酶(ZFN)在能够保存细胞活力的条件下用于灭活MHC基因的组合物和方法。还提供了编码ZFN的多核苷酸，包括编码ZFN的多核苷酸的载体，包括编码ZFN的多核苷酸的细胞和/或包括ZFN的细胞。

Description

MHC细胞受体的靶向破坏

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年12月18日提交的美国临时申请号62/269,410；2016年3月8日提交的美国临时申请号62/305,097；和2016年4月29提交的美国临时申请号62/329,439的权益，其公开通过引用全文纳入本文。

技术领域

本公开属于人细胞(包括淋巴细胞和干细胞)基因组修饰的领域。

背景技术

基因治疗对于人类治疗学的新纪元拥有巨大的潜能。这些方法将实现对于标准医疗实践尚未解决的病症的治疗。基因治疗可以包括基因编辑技术的许多变形，诸如基因座的破坏和修正，以及插入可表达的转基因，所述可表达的转基因可以通过融合该转基因的特异性外源性启动子控制，或通过存在于插入基因座位点的内源性启动子控制。

对于这项技术任何真正实施，转基因的递送和插入是必须要解决的障碍的示例。例如，尽管许多基因递送方法对于治疗应用有潜在的可行性，但是它们所有都涉及安全性、持久性和表达水平之间大量的权衡。以附加体(例如，基础腺病毒(Ad)、腺相关病毒(AAV)和基于质粒的系统)提供转基因的方法通常是安全的，并且可以实现高初始表达水平，然而，这些方法缺少稳定的附加型复制，而这可能会在有丝分裂活性组织中限制表达的持续时间。与之相反，导致所需转基因(例如，整合慢病毒(LV))随机整合的递送方法提供了更加持久的表达，但是由于随机插入未靶向的性质，其可能会在受体细胞中引起不受调控的生长，可能经由随机整合的转基因盒附近致癌基因的活化导致恶性肿瘤。此外，尽管转基因整合避免了复制驱动的损失，但是其并不阻止融合转基因的外源性启动子的最终沉默。随着时间，这样的沉默导致针对大部分非特异性插入事件的转基因表达减少。另外，转基因的整合很少发生在每个靶细胞中，这可能使得感兴趣的转基因难以实现足够高的表达水平，进而实现所需的治疗效果。

近些年间，已经开发了针对转基因整合的新策略，其利用以位点特异性核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物结构域核酸酶(TALEN)、具有工程改造的crRNA/tracr RNA(“单一向导RNA”)的CRISP/Cas系统来引导特异性切割等)和Cfp1/CRISPR系统的切割来引导特异性切割等)以偏好(bias)插入所选基因组基因座。参见，例如，美国专利号9,255,250、9,045,763、9,005,973、8,956,828、8,945,868、8,703,489、8,586,526、6,534,261、6,599,692、6,503,717、6,689,558、7,067,317、7,262,054、7,888,121、7,972,854、7,914,796、7,951,925、8,110,379、8,409,861；美国专利公开号20030232410、20050208489、20050026157、20050064474、20060063231、20080159996、201000218264、20120017290、20110265198、20130137104、20130122591、20130177983和20130177960和20150056705。此外，靶向的核酸酶基于阿尔古(Argonaute)系统(例如，来自嗜热栖热菌(T.thermophilus)，称作‘TtAgo’，参见Swarts等(2014)Nature 507(7491):258-261)开发，其也可具有用于基因组编辑和基因治疗的潜力。与经典的整合途径相比，该核酸酶介导的转基因整合途径提供了改善的转基因表达、增加的安全性和表达持久性的前景，因为其允许准确的转基因定位，从而使基因沉默或附近致癌基因激活的风险最小化。

T细胞受体(TCR)是T细胞选择性激活的主要部分。其具有与抗体的一些相似之处，TCR的抗原识别部分通常由α和β两条链构成，两者聚集形成异二聚体。其与抗体的相似之处在于将编码TCRα和β复合物的单个基因组合在一起的方式。TCRα(TCRα)和TCRβ(TCRβ)链各自由C-末端恒定区和N-末端可变区两个区域组成。编码TCRα和β链的基因组基因座与抗体编码基因座类似，所述抗体编码基因座中TCRα包括V和J区段，而β链基因座除了V和J区段外包括D区段。对于TCRβ基因座，另外还存在选择过程期间选择的两个不同的恒定区。T细胞发育期间，各种区段重组，因而使得各T细胞在α和β链中包括独特的TCR可变部分，而这被称为互补决定区(CDR)，并且机体具有T细胞的大库，因其独特的CDR，其能够与通过抗原呈递细胞展示的独特的抗原相互作用。一旦TCRα或β基因重排发生，第二相应TCRα或TCRβ的表达被抑制，从而使得各T细胞仅在一种被称为“抗原受体等位排斥”的过程中表达一种独特的TCR结构(参见，Brady等,(2010)J Immunol 185:3801-3808)。

T细胞激活期间，TCR与抗原呈递细胞主要组织相容性复合物(MHC)上以肽展示的抗原相互作用。通过TCR的抗原-MHC复合物识别导致T细胞刺激，进而反过来导致记忆和效应淋巴细胞中的T辅助细胞(CD4+)和细胞毒素T淋巴细胞(CD8+)分化。其后可以克隆的方式扩增这些细胞，以在整个T细胞群中产生能够与一种特定抗原反应的激活的亚群。

MHC蛋白质具有两种类型——I型和II型。MHC I型蛋白是两个蛋白质、α链和β2微球蛋白链(一些时候也称为B2M)的异二聚体，所述α链是由I型MHC基因编码的跨膜蛋白，而β2微球蛋白链是由不位于MHC基因簇内的基因编码的小细胞外蛋白。α链折叠成3个球形结构域，并且与β2微球蛋白相关时，球形结构复合物与抗体复合物相似。外来肽被呈递到两个最N-末端结构域，其也是最可变的。MHC II型蛋白同样是异二聚体，但是该异二聚体包括由MHC复合物内的基因编码的两个跨膜蛋白。MHC I型:抗原复合物与细胞毒性T细胞相互作用，而MHC II呈递抗原至辅助T细胞。此外，MHC I型蛋白倾向于表达在几乎所有成核的细胞和血小板(以及小鼠中的红细胞)中，而MHC II型蛋白更多地被选择性表达。通常，MHC II型蛋白表达于B细胞，一些巨噬细胞和单核细胞，朗格汉斯细胞和树突细胞。

人的HLA I型基因簇包括B、C和A三种主要的基因座，以及几个次要基因座(包括E、G和F，全部存在于染色体6上的HLA区域)。HLA II型簇还包括DP、DQ和DR三种主要基因座，并且I型和II型基因簇都是多态性的，因此在该群体内存在I型和II型的多个不同的等位基因。同样，一些辅助蛋白在HLA功能性中也起作用。β-2微球蛋白被用作伴侣(通过B2M编码，位于染色体15上)，并且稳定表达在细胞表面的HLA A、B或C蛋白，并且还稳定I型结构上的抗原显示槽(display groove)。其通常在血清和尿液中少量存在。

HLA在移植排斥中起主要作用。移植排斥的急性期可能在约1-3周内出现，并且由于宿主系统对供体I型和II型HLA分子的致敏作用，通常涉及供体组织上的宿主T淋巴细胞的作用。在大多数的情况中，触发抗原是I型HLA。为了实现最佳的成功，针对HLA对供体进行分型，并且与患者受体尽可能的完全匹配。但是即使家庭成员之间的捐赠，纵然可以拥有高百分比的HLA同一性，仍然不是十分成功。因此，为了保护受体内的移植组织，患者常常必需进行长久的免疫移植治疗以避免排斥。然而这样的治疗可能导致并发症以及显著的发病，因为患者可能难以克服机会性感染。I或II型基因的调节可以在一些肿瘤存在的情况下被破坏，并且这样的破坏对于患者的预后可以具有影响。例如，在转移性结直肠癌中发现了B2M表达的减少(Shrout等(2008)Br J Canc 98:1999)。因为B2M在稳定MHC I型复合物中具有关键作用，在某些实体癌中B2M的减少已经被假设为从T细胞驱动的免疫监督免疫逃逸的机制。抑制的B2M表达已经被证明是抑制正常IFNγB2M表达调节和/或导致基因敲除的B2M编码序列中特异性突变的结果(Shrout等，同上).令人困惑的是，B2M的升高也与一些类型的癌症相关。尿液中B2M水平的升高作为多种癌症的预测物，包括前列腺，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和非霍奇金淋巴瘤。

过继细胞治疗(ACT)是一种发展中的癌症治疗形式，其基于将肿瘤特异性免疫细胞递送至患者，从而使递送的细胞攻击和清除患者的癌症。ACT可以涉及肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的应用，所述TIL是分离自患者自身的肿瘤肿块并经离体扩增以再灌注回该患者的T细胞。该方法在治疗转移性黑素瘤中具有前景，其中在一个研究中，观测到>50％的长期响应率(参见例如，Rosenberg等(2011)Clin Canc Res 17(13):4550)。TIL是细胞有前景的来源，因为它们是患者自身针对呈递在肿瘤上的肿瘤相关抗原(TTA)具有T细胞受体(TCR)特异性的细胞的混合集合(Wu等(2012)Cancer J 18(2):160)。其它方法涉及编辑分离自患者血液的T细胞，从而使其被工程改造为以一定方式对肿瘤具有响应性(Kalos等(2011)SciTransl Med 3(95):95ra73)。

嵌合抗原受体(CAR)是这样的分子，其被设计成使免疫细胞靶向表达在细胞表面的特异性分子靶标。在它们最基本的形式中，它们是被导入这样细胞的受体，所述细胞将表达在细胞外的特异性结构域与细胞内的信号转导途径偶联，从而使得特异性结构域与其靶标相互作用时细胞被激活。CAR通常由模拟T细胞受体(TCR)的功能结构域制备，其中抗原特异性结构域，诸如scFv或一些类型的受体与诸如ITAM和其它共刺激结构域的信号转导结构域融合。然后将这些构建体导入离体T细胞，以允许该T细胞在表达靶抗原细胞存在的情况下被激活，进而当该T细胞被再次导入患者时，导致通过激活T细胞以非MHC依赖性的方式攻击靶细胞(参见，Chicaybam等(2011)Int Rev Immunol 30:294-311,Kalos同上)。因此，使用藉由工程改造的TCR或CAR离体改变的T细胞的过继细胞治疗对于多种类型的疾病是非常有前景的临床途径。例如，癌症以及其被靶向的抗原包括滤泡性淋巴瘤(CD20或GD2)、成神经细胞瘤(CD171)、非霍奇金淋巴瘤(CD19和CD20)、淋巴瘤(CD19)、成胶质细胞瘤(IL13Rα2)、慢性淋巴白血病或CLL和急性淋巴白血病或ALL(都是CD19)。还开发了病毒特异性CAR以攻击包括诸如HIV的病毒的细胞。例如，使用对Gp100具有特异性的CAR启动了用于HIV治疗的临床试验(Chicaybam,同上)。

ACTR(抗体-偶联T细胞受体)是工程改造的T细胞成分，其能够结合异源性提供的抗体。抗体与ACTR成分的结合装配T细胞与通过抗体识别的抗原相互作用，并且当遇到抗原时，包括T细胞的ACTR被触发以与抗原相互作用(参见，美国专利公开号20150139943)。

然而，过继细胞治疗的一个缺点是细胞产物的来源必须是患者特异性的(自体同源的)，从而避免移植细胞潜在的排异。这导致研究人员研发编辑患者自身T细胞的方法以避免这样的排异。例如，患者的T细胞或造血干细胞可以藉由工程改造的CAR、ACTR和/或T细胞受体(TCR)的添加体外操控，并且然后进一步使用工程改造的核酸酶处理以敲除T细胞检查点抑制剂，诸如PD1和/或CTLA4(参见，PCT公开号WO2014/059173)。为了将该技术应用于更大的患者群体，研发细胞的通用群体(同种异体)将有利。此外，TCR的敲除将会产生一旦导入患者后无法产生移植物抗宿主病(GVHD)响应的细胞。

因此，仍然需要可以被用于修饰MHC基因表达(例如，敲除B2M)和/或敲除T细胞中TCR表达的组合物和方法。

发明内容

本文公开了用于部分或完全灭活或破坏B2M基因的方法和组合物，以及在内源性TCR和/或B2M破坏后或同时，用于在T淋巴细胞中导入和表达所需水平的外源性TCR、CAR或ACTR转基因的方法和组合物。此外，本文提供了用于删除(灭活)或抑制B2M基因以产生无HLA I型的T细胞、干细胞、组织或完整生物体的组合物和方法，例如，在其表面不表达一种或多种HLA受体的细胞。在某些实施方式中，无HLA细胞或组织是人细胞或组织，其有利于移植中的应用。在优选实施方式中，制备无HLC的T细胞用于过继T细胞治疗。

在一个方面，本文所述的是分离的细胞(例如，真核细胞，诸如包括淋巴细胞、干细胞(例如，iPSC、胚胎干细胞、MSC或HSC)或祖细胞的哺乳动物细胞)，其中β2微球蛋白(B2M)基因的表达通过修饰B2M基因的外显子1或外显子2调控。在某些实施方式中，修饰是对SEQID NO:6-48或137-205中一个或多个所示序列；SEQ ID NO:6-48或137-205任一侧(侧接的基因组序列)上1-5个、1-10个或1-20个碱基对内；或GGCCTTA、TCAAAT、TCAAATT、TTACTGA和/或AATTGAA内进行。修饰可以通过外源性融合分子，所述外源性融合分子包括功能结构域(例如，转录调节结构域、核酸酶结构域)以及DNA结合结构域，其包括但不限于：(i)包括外源性转录因子的细胞，所述外源性转录因子包括结合如SEQ ID NO:6-48和/或137-205中任一项所示靶位点的DNA结合结构域以及转录调节结构域，其中转录因子修饰B2M基因表达，和/或(ii)包括这样的插入和/或缺失的细胞，所示插入和/或缺失位于SEQ ID NO:6-48和/或137-205中一个或多个内；位于SEQ ID NO:6-48和/或137-205任一侧(侧接的基因组序列)上1-5个、1-10个或1-20个碱基对内；或GGCCTTA、TCAAAT、TCAAATT、TTACTGA和/或AATTGAA内。细胞可以进一步包括修饰，例如，灭活的T细胞受体基因，PD1和/或CTLA4基因和/或转基因，编码嵌合抗原受体(CAR)的转基因，编码抗体-偶联T细胞受体(ACTR)和/或编码抗体的转基因。还提供了包括本文所述任何细胞的药物组合物，以及将该细胞或药物组合物在离体治疗中用于治疗对象中病症(例如，癌症)的方法。

因此，在一个方面中，本文所述是这样的细胞，其中的B2M基因的表达被调控(例如，激活、抑制或灭活)。在优选的实施方式中，B2M的外显子1或外显子2被调控。调控可以通过结合B2M基因并且调节B2M表达的外源性分子(例如，工程改造的转录因子，其包括DNA结合结构域和转录激活或抑制结构域)和/或经由B2M基因的序列修饰(例如，使用这样的核酸酶，其通过插入和/或缺失切割B2M基因并修饰基因序列)。在某些实施方式中，一个或多个其它基因的表达也被调节(例如，TCR基因，诸如TCRA基因)。在一些实施方式中，描述了这样的细胞，其包括工程改造的核酸酶以引起B2M基因的敲除，从而使得I型HLA复合物不稳定。在优选的实施方式中，I型HLA的不稳定性导致细胞表面I型HLA复合物显著丢失。在其它实施方式中，描述了这样的细胞，其包括外源性分子，例如，工程改造的转录因子(TF)，从而调控B2M基因的表达。在一些实施方式中，所述细胞是T细胞。进一步描述的是这样的细胞，其中B2M基因的表达被调控，并且其中该细胞被进一步工程改造以包括至少一个外源性转基因或额外敲除至少一个内源性基因或其组合。可以将外源性转基因整合进TCR基因(例如，当TCR基因被敲除时)，可以整合进B2M基因和/或可以整合进非TCR，非B2M基因座，诸如安全港基因座。在一些情况中，外源性转基因编码ACTR、工程改造的TCR和/或CAR。转基因构建体可以通过HDR或NHEJ驱动的过程插入。在一些方面，具有调控的B2M表达的细胞在其细胞表面缺少显著的I型HLA，并且还至少包括外源性ACTR和/或外源性CAR。包括B2M调节剂的一些细胞还包括敲除一个或多个检查点抑制剂基因。在一些实施方式中，检查点抑制剂是PD1。在其它实施方式中，检查点抑制剂是CTLA4。在其他方面，B2M调控的细胞包括PD1敲除和CTLA4敲除。在一些实施方式中，细胞在TCR基因处被进一步修饰。在一些实施方式中，调节的TCR基因是编码TCRβ(TCRB)的基因。在一些实施方式中，这是经由靶向切割该基因的恒定区(TCRβ恒定区，或TRBC)实现。在某些实施方式中，调节的TCR基因是编码TCRα(TCRA)的基因。在另一些实施方式中，经由靶向切割TCR基因的恒定区实现插入，包括靶向切割TCRα基因的恒定区(本文称之为“TRAC”序列)。在一些实施方式中，B2M基因修饰的细胞在TCR基因，HLA-A、-B、-C基因或TAP基因或其任意组合处被进一步修饰。在其他实施方式中，还修饰针对HLA II型的调节剂CTIIA。

在某些实施方式中，本文所述细胞包括修饰(例如，缺失和/或插入，结合工程改造的TF以抑制B2M)B2M基因(例如，修饰外显子1或外显子2)。在某些实施方式中，修饰是对SEQID NO:6-48和/或137-205，其包括通过结合、切割、插入和/或缺失一个或多个核苷酸的修饰，所述核苷酸位于这些序列的任意序列内和/或在B2M基因中侧接这些序列的基因(基因组)序列的1-50个碱基对内(包括诸如1-5、1-10或1-20个碱基对之间的任意值)。在某些实施方式中，细胞包括一个或多个下述序列内的修饰(结合、切割、插入和/或缺失)：B2M基因内的GGCCTTA,TCAAATT,TCAAAT,TTACTGA和/或AATTGAA(例如，外显子1和/或外显子2，参见图1)。在某些实施方式中，修饰包括结合本文所述工程改造的TF，从而使得B2M基因表达被调控，例如，抑制或激活。在其他实施方式中，修饰是位于或邻近一个或多个核酸酶结合(靶标)和/或一个或多个切割位点的遗传修饰(核苷酸序列的改变)，包括但不限于，修饰一个或多个切割位点和/或结合位点的上游、下游的1-300个碱基对(或于其间任意数量的碱基对)内和/或包括切割位点和/或结合位点的1个或多个碱基对的序列；修饰包括和/或位于一个或多个结合和/或切割位点任一侧的1-100个碱基对内(或于其间任意数量的碱基对)；修饰包括和/或位于一个或多个结合和/或切割位点任一侧(例如，1-5、1-10、1-20或更多的碱基对)的1-50个碱基对内(或于其间任意数量的碱基对)；和/或修饰核酸酶结合位点和/或切割位点内的一个或多个碱基对。在某些实施方式中，修饰位于或邻近(例如，1-300、1-50、1-20、1-10或1-5或更多)碱基对或于其间任意数量的碱基对)围绕SEQ ID NO:6-48或137-205中任一项的B2M基因序列。在某些实施方式中，修饰包括在SEQ ID NO:6-48或137-205中所示的一个或多个序列内或B2M基因的GGCCTTA、TCAAATT、TCAAAT、TTACTGA和/或AATTGAA(例如，外显子1和/或外显子2)内修饰B2M基因，例如，对一个或多个这些序列修饰1个或多个碱基对。在某些实施方式中，核酸酶介导的遗传修饰位于配对的靶位点之间(当使用二聚体切割靶标时)。核酸酶介导的遗传修饰可以包括任意数量碱基对的插入和/或缺失，包括插入任意长度的非编码序列和/或任意长度的转基因和/或使1碱基对至超过1000kb(或于其间任意值，但不限于1-100个碱基对、1-50个碱基对、1-30个碱基对、1-20个碱基对、1-10个碱基对或1-5个碱基对)缺失。

本发明经修饰的的细胞可以是淋巴细胞(例如，T细胞)、干细胞/祖细胞(例如，诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(例如，人ES)、间充质干细胞(MSC)或造血干细胞(HSC))。干细胞可以是全能性的或多能性(例如，部分分化的，诸如是多能骨髓或淋巴干细胞的HSC)。在其他实施方式中，本发明提供了用于产生具有对HLA表达缺失基因型(nullgenotype)的细胞的方法。然后，可以对本文所述任何经修饰的干细胞(修饰B2M基因座)进行分化，以生成源自本文所述干细胞的分化的(体内或体外)细胞。本文所述任何经修饰的干细胞可以包括在其它感兴趣的基因中的进一步修饰(例如，TCRA、TCRB、PD1、CTLA4等)。

在另一方面，本文所述组合物(经修饰的细胞)和方法可以被用于例如治疗或预防或改善病症。该方法通常包括(a)使用核酸酶(例如，ZFN或TALEN)或核酸酶系统诸如CRISPR/Cas或Cfp1/CRISPR与工程改造的crRNA/tracr RNA，或使用工程改造的转录因子(例如，ZFN-TF、TALE-TF、Cfp1-TF或Cas9-TF)，在分离的细胞(例如，T细胞或淋巴细胞)中切割或下调内源性B2M基因，从而使得B2M基因被灭活或下调；和(b)向对象导入细胞，因此治疗或预防病症。

在一些实施方式中，编码TCRα(TCRA)和/或TCRβ(TCRB)的基因也被灭活或下调。在一些实施方式中，灭活是经由靶向切割该基因的恒定区(TCRβ恒定区，或TRBC)实现。在优选的实施方式中，编码TCRα(TCRA)的基因被灭活或下调。在进一步优选的实施方式中，病症是癌症或感染性疾病。在进一步优选的实施方式中，灭活是经由靶向切割该基因的恒定区(TCRα恒定区，缩写为TRAC)实现。

转录因子和/或一个或多个核酸酶可以mRNA、以蛋白质形式和/或以编码一个或多个核酸酶的DNA序列导入细胞。在某些实施方式中，向对象导入分离的细胞进一步包括其它遗传修饰例如整合外源性序列(至切割的B2M、TCR基因或其他基因，例如，安全港基因或基因座)和/或灭活(例如，核酸酶介导的)其它基因，例如，一个或多个HLA和/或TAP基因。外源性序列可以经由载体(例如，Ad、AAV、LV)导入，或通过使用诸如电穿孔的技术导入。在一些实施方式中，蛋白质通过细胞挤压(cell squeezing)导入细胞(参见Kollmannsperger等(2016)Nat Comm 7,10372doi:10.1038/ncomms10372)。在一些方面，组合物包括分离的细胞片段和/或(部分或完全)分化的细胞。

在一些方面，成熟细胞可以被用于细胞疗法，例如，用于过继细胞转移。在其他实施方式中，用于T细胞移植的细胞包含感兴趣的其它基因修饰。在一个方面，T细胞包含对癌症标志物具有特异性的插入的嵌合抗原受体(CAR)。在另一方面，插入的CAR对B细胞恶性肿瘤的CD19标志物特征具有特异性。这样的细胞能够用于治疗组合物，用于治疗患者而不需要匹配HLA，并且因此能够被用作针对任何有需要的患者的“现成的”治疗剂。

在另一方面，B2M调控的(修饰的)T细胞包含插入的抗体-偶联T细胞受体(ACTR)供体序列。在一些实施方式中，ACTR供体序列被插入B2M或TCR基因中，以在核酸酶诱导的切割后破坏该基因表达。在其实施方式中，供体序列被插入“安全港”基因座中，诸如AAVS1、HPRT、白蛋白和CCR5基因。在一些实施方式中，ACTR序列经由靶向的整合插入，其中ACTR供体序列包括侧接同源臂，所述侧接同源臂与侧接工程改造的核酸酶的切割位点的序列具有同源性。在一些实施方式中，ACTR供体序列进一步包括启动子和/或其它转录调节序列。在其他实施方式中，ACTR供体序列缺少启动子。在一些实施方式中，ACTR供体被插入TCRβ编码基因(TCRB)。在一些实施方式中，插入是经由靶向切割该基因的恒定区(TCRβ恒定区，或TRBC)实现。在优选的实施方式中，ACTR供体被导入TCRα编码基因(TCRA)。在进一步优选的实施方式中，插入是经由靶向切割该基因的恒定区(TCRα恒定区，缩写为TRAC)实现。在一些实施方式中，供体被插入TCRA内的外显子序列，然而在其它一些实施方式中，供体被插入TCRA内的内含子序列。在一些实施方式中，TCR调节的细胞还包括CAR。在还有一个实施方式中，B2M调节的细胞在HLA基因或检查点抑制剂基因处被额外调控。

还提供了包括本文所述经修饰的细胞(例如，具有灭活的B2M基因的T细胞或干细胞)的药物组合物，或包括一个或多个如本文所述的B2M基因结合分子(例如，工程改造的转录因子和/或核酸酶)的药物组合物。在某些实施方式中，药物组合物还可包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。经修饰的细胞，B2M基因结合分子(或编码这些分子的多核苷酸)和/或包括这些细胞或分子的药物组合物经由本领域已知的方法导入对象，例如，通过静脉输注，注入如肝动脉的特定血管，或通过直接组织注射(例如，肌肉)。在一些实施方式中，对象是患有可以通过该组合物治疗或缓解的疾病或病症的成年人。在其他实施方式中，对象是这样的儿科对象，向其给予该组合物以预防、治疗或缓解疾病和病症(例如，癌症，移植物抗宿主疾病等)。

在一些方面，组合物(包括ACTR的B2M调控的细胞)还包括外源性抗体同样参见，美国专利申请号15/357,772。在一些方面，抗体能够用于装配包含ACTR的T细胞，以预防或治疗病症。在一些实施方式中，抗体识别与肿瘤细胞或与癌症相关过程相关联的抗原，如EpCAM、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸-结合抗体、CD19、EGFR、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、VEGF、VEGFR、αVβ3和α5β1整合素、CD20、CD30、CD33、CD52、CTLA4和细胞粘合素(enascin)(Scott等(2012)Nat Rev Cancer 12:278)。在其他实施方式中，抗体识别与如HIV、HCV等感染性疾病相关联的抗原。

在另一方面，本文提供了B2M DNA-结合结构域(例如，ZFP、TALE和sgRNA)，其结合B2M基因中的靶位点。在某些实施方式中，DNA结合结构域包括：ZFP，其具有如表1中任一行中所示的顺序的识别螺旋区域；TAL-效应物结构域DNA-结合蛋白，其具有如表2B中任一行中所示的RVD；和/或如表2A中任一行中所示的sgRNA。DNA-结合蛋白蛋白可以与转录调节结构域关联以形成工程改造的转录因子，其调控B2M表达。或者，这些DNA-结合蛋白可以与一个或多个核酸酶结构域相关联，以形成工程改造的锌指核酸酶(ZFN)、TALEN和/或CRISPR/Cas系统，其结合并切割B2M基因。在某些实施方式中，ZFN、TALEN或CRISPR/Cas系统的单一向导RNA(sgRNA)结合人B2M基因中的靶位点。转录因子或核酸酶(例如，ZFP、TALE、sgRNA)的DNA-结合结构域可以结合B2M基因中的靶位点，所述B2M基因包括SEQ ID NO:6-48和/或137-205中任一项的9、10、11、12或更多个(例如，13、14、15、16、17、18、19、20或更多)核苷酸。锌指蛋白可以包括1、2、3、4、5、6或更多个锌指，各锌指具有识别螺旋，其与靶基因中的亚靶位点(target subsite)特异性地接触。在某些实施方式中，锌指蛋白包括4或5或6个指(将其称之为F1、F2、F3、F4、F5和F6，并且由N-末端至C-末端排列F1至F4或F5或F6)，例如表1所示。在其他实施方式中，单一向导RNA或TAL-效应物DNA-结合结构域可以结合SEQ ID NO:6-48或137-205中任一项所示的靶位点(或者，SEQ ID No:6-48中任一项内12或更多个碱基对)。示例性的sgRNA靶位点示于SEQ ID NO:16-48，并且示例性的TALEN结合位点示于表2B(SEQ ID No:137-205)。如美国专利号8,586,526和9,458,205所述，使用典型或非典型RVD，其它TALEN可以被设计成靶向本文所述位点。本文所述核酸酶(包括ZFP、TALE或sgRNA DNA-结合结构域)能够在包括SEQ ID NO:6-48和/或137-205中任一项的B2M基因内产生遗传修饰，包括在这些序列(SEQ ID NO:6-48和/或137-205)中任一个内的修饰(插入和/或缺失)和/或对侧接SEQ ID NO:6-48或137-205中所示的靶位点序列的B2M基因序列的修饰，例如，B2M基因外显子1或外显子2内的修饰，其位于一个或多个下述序列中：GGCCTTA、TCAAATT、TCAAAT、TTACTGA和/或AATTGAA。

还提供了融合分子，其包括结合B2M基因的外显子1或外显子2的DNA结合结构域以及转录调节结构域或核酸酶结构域，其中所述DNA结合结构域包括如表1中任一行所示的锌指蛋白(ZFP)以及表2B中任一行所示的TALE-效应物蛋白或表2A中任一行所示的单一向导RNA(sgRNA)。

本文所述其它蛋白质可以进一步包括切割结构域和/或切割半结构域(例如，野生型或工程改造的FokI切割半结构域)。因此，在本文所述的核酸酶(例如，ZFNs、TALEN、CRISPR/Cas系统)的任意一个中，核酸酶结构域可以包括野生型结构域或核酸酶半结构域(例如，FokI切割半结构域)。在其他实施方式中，核酸酶(例如，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas核酸酶)包括工程改造的核酸酶结构域或半结构域，例如，形成专性异二聚体的工程改造的FokI切割半结构域，参见例如，美国专利公开号20080131962。

在另一个方面，本公开提供了编码本文所述任何蛋白质、融合分子和/或其分成(例如，sgRNA或其他DNA-结合结构域)的多核苷酸。多核苷酸可以是病毒载体、非病毒载体(例如，质粒)的部分或者处于mRNA形式。本文所述任何多核苷酸可以还包括用于靶向插入B2M、TCRα和/或TCRβ基因的序列(供体，同源性臂或补丁(patch)序列)。而在另一个方面中，提供包含本文所述的任何多核苷酸的基因递送载体。在某些实施方式中，载体是腺病毒载体(例如，Ad5/F35载体)，或慢病毒载体(LV)，包括整合活性或整合缺陷型慢病毒载体，或腺相关的病毒载体(AAV)。因此，本文还提供了病毒载体，其包括编码核酸酶(例如，ZFN或TALEN)和/或核酸酶系统(CRISPR/Cas或Ttago)的序列和/或用于靶基因内的靶向整合的供体序列。在一些实施方式中，供体序列和编码核酸酶的序列位于不同的载体。在其他所述方法中，核酸酶以多肽提供。在优选的实施方式中，多核苷酸是mRNA。在一些方面中，该mRNA可经化学修饰(参见例如Kormann等，(2011)Nature Biotechnology 29(2):154-157)。在其它方面中，该mRNA可包含ARCA帽(参见美国专利7,074,596和8,153,773)。在一些方面，mRNA可以包括通过酶修饰导入的帽。酶导入的帽可以包括：帽0、帽1或帽2(参见例如，Smietanski等，(2014)Nature Communications 5:3004)。在其它方面，mRNA可以通过化学修饰封端。在其它实施方式中，该mRNA可包括未经修饰的和经修饰的核苷酸的组合(参见美国专利公开2012-0195936)。在还有一个实施方式中，该mRNA可包括WPRE元件(参见美国专利申请号15/141,333)。在一些实施方式中，mRNA是双链的(参见例如，Kariko等(2011)Nucl Acid Res39:e142)。

而在另一个方面中，本公开提供了分离的细胞，其包括本文所述的任何蛋白质、多核苷酸和/或载体。在某些实施方式中，细胞选自下组：干细胞/祖细胞或T细胞(例如，CD4⁺T细胞)。在另一个方面中，本公开提供了源自包括本文所述任何蛋白质、多核苷酸和/或载体的细胞或系的细胞或细胞系，即源自(例如，培养自)这样的细胞的细胞或细胞系，所述细胞中B2M已经通过一种或多种ZFN被灭活和/或其中供体多核苷酸(例如，ACTR，工程改造的TCR和/或CAR)已经被稳定地整合进细胞的基因组中。因此，本文所述细胞的后代自己可能并不包括本文所述蛋白质、多核苷酸和/或载体，但是在这些细胞中，至少B2M基因被灭活和/或供体多核苷酸被整合到基因组中和/或表达。

在另一方面中，本文所述的是在细胞中灭活B2M基因的方法，其通过将本文所述一个或多个蛋白质、多核苷酸和/或载体导入如本文所述的细胞。在本文所述方法的任意一个中，核酸酶可以诱导靶向突变，细胞DNA序列的缺失，和/或促进位于预定染色体基因座的靶向重组。因此，在某些实施方式中，核酸酶将一个或多个核苷酸从靶基因删除或将其插入到靶基因。在一些实施方式中，通过核酸酶切割，然后进行非同源末端连接，B2M基因被灭活。在其他实施方式中，靶基因中的基因组序列被替换，例如，使用本文所述核酸酶(或编码所述核酸酶的载体)和在用核酸酶的靶向切割后插入该基因的“供体”序列。供体序列可以存在于核酸酶载体，存在于单独载体(例如，AAV、Ad或LV载体)，或者另选地，可以使用不同的核酸递送机制将其导入该细胞。

此外，本文所述方法的任意一种可以在体外、体内和/或离体实施。在某些实施方式中，离体实施该方法，例如以修饰T细胞，从而使其在同种异体设置中能够用作治疗剂，以治疗对象(例如，患有癌症的对象)。可以治疗和/或预防的癌症的非限制示例包括：肺癌、胰腺癌、肝癌、骨癌、乳腺癌、结肠直肠癌、白血病、卵巢癌、淋巴瘤、脑癌等。

附图简要说明

图1是被核酸酶靶向的B2M基因外显子1和外显子2(SEQ ID NO:1和2)的示意图。方框指示侧接ZFN结合(靶向)位点的5个不同的切割区域(A(GGCCTTA)、C(TCAAATT)、D(TCAAAT)、E(TTACTGA)和G(AATTGAA))。

图2A和图2B显示了核酸酶活性。图2A是描述以2或6μg剂量的ZFN处理的T细胞中各位点基因修饰百分比的柱状图，所述ZFN对如图1所示的B2M位点A、C、D、E和G具有特异性。图2B描述了针对K562细胞中B2M基因的TALEN活性。

图3描述了在用B2M特异性ZFN对处理后，通过FACS分析所分析的HLA阴性T细胞的百分比。

图4A-4E描述了来自经B2M和TCRA特异性ZFN处理的细胞的FACS结果。图4A描述了无ZFN处理的结果，图4B显示了只有TCRA特异性ZFN后的结果(CD3信号96％的敲除)，以及图4C显示了只有B2M特异性ZFN后的结果(HLA信号92％的敲除)。图4D是显示具有双重敲除的细胞(导致HLA标志和CD3标志的丢失)位置的示意图。图4E显示了用TCRA-和CD3-特异性ZFN处理细胞后的结果，在82％的这些细胞中证明了双重敲除。

图5显示了来自TRAC(TCRA)和B2M双敲除以及将供体靶向整合到TRAC(TCRA)或B2M基因座中的结果。

具体实施方式

本文公开了用于生成这样细胞的组合物和方法，所述细胞中的B2M基因的表达被调控，从而使得细胞在其细胞表面不再包括HAL I型。以这种方式修饰的细胞可以被用于治疗，例如，移植，因为缺少B2M表达防止或降低了基于HLA的免疫反应。此外，感兴趣的其它基因可以被插入其中B2M基因已经被操控和/或感兴趣的其他基因可能被敲除的细胞中。

概述

除非另有说明，本方法的实施以及本文所述组合物的制备与应用采用本领域技术范围内的分子生物学、生物化学、染色质结构与分析、计算化学、细胞培养、重组DNA与相关领域的常规技术。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如，Sambrook等，MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL(《分子克隆：实验室手册》)第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1989以及第3版，2001；Ausubel等，CURRENT方案IN MOLECULAR BIOLOGY(《新编分子生物学实验指南》)，纽约约翰韦利父子公司(JohnWiley&Sons,New York)1987及定期更新；METHODS IN ENZYMOLOGY(《酶学方法》)丛书，圣迭戈学术出版社(Academic Press,San Diego)；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION(《染色质结构与功能》)，第3版，学术出版社，圣迭戈，1998；METHODS INENZYMOLOGY(《酶学方法》)，第304卷，“Chromatin(染色质)”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe编)，学术出版社，圣迭戈，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(《分子生物学方法》)，第119卷，“Chromatin方案(染色质方法)”(P.B.Becker编)，托托瓦的休玛纳出版社(HumanaPress,Totowa)，1999。

定义

术语"核酸"，"多核苷酸"和"寡核苷酸"互换使用并指脱氧核糖核苷酸或核糖核甘酸聚合物，可以是直链或环状构型的，是单链或双链形式的。出于本公开目的，这些术语不意在限制聚合物的长度。所述术语可涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分(例如，硫逐磷酸酯主链)经修饰的核苷酸。一般而言，具体核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即，A的类似物将与T碱基配对。

互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物。该术语还应用于其中一种或多种氨基酸是对应的天然产生的氨基酸的化学类似物或经修饰的衍生物的氨基酸聚合物。

"结合"指大分子之间(例如蛋白与核酸之间)的序列特异性、非共价相互作用。只要相互作用作为整体为序列特异性，不要求结合相互作用的所有组分都是序列特异性(例如，与DNA主链中的磷酸残基接触)。这样的相互作用通常表征为解离常数(K_d)是10^-6M^-1或更低。“亲合力”指结合的强度：提高的结合亲合力与较低的K_d关联。“非特异性结合”指不依赖于靶序列的发生在大分子(例如，DNA)和感兴趣的任何分子(例如，工程改造的核酸酶)之间的非共价相互作用。

“DNA结合分子”是可以结合DNA的分子。这样的DNA结合分子可以是多肽，蛋白质的结构域，较大蛋白质内的结构域，或多核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸是DNA，而在其它实施方式中，多核苷酸是RNA。在一些实施方式中，DNA结合分子是核酸酶的蛋白质结构域(例如，FokI结构域)，而在其他实施方式中，DNA结合分子是RNA引导的核酸酶的向导RNA成分(例如，Cas9或Cfp1)。

"结合蛋白"是能与另一分子非共价结合的蛋白质。结合蛋白能够结合至，例如，DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)。在蛋白质结合蛋白的情况中，其可与自身结合(形成同型二聚体、同型三聚体等)和/或其可与一种或多种不同蛋白的一个或多个分子结合。结合蛋白可具有多于一种类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白结合活性。

"锌指DNA结合蛋白"(或结合结构域)是能以序列特异性方式通过一个或多个锌指结合DNA的蛋白质或较大蛋白质内的结构域，锌指是通过锌离子配位稳定其结构的结合结构域内氨基酸序列的区域。术语锌指DNA结合蛋白常缩写作锌指蛋白或ZFP。

“TALE DNA结合结构域”或“TALE”是包含一种或多种TALE重复结构域/单元的多肽。各自包括重复可变双残基(RVD)的重复结构域涉及TALE与其关联靶DNA序列的结合。单个“重复单元”(也称作“重复”)通常是33-35个氨基酸长度，并且与天然产生的TALE蛋白中的其它TALE重复序列显示至少一些序列同源。TALE蛋白可以被设计成使用重复单元内典型或非典型RVD结合靶位点。参见例如，美国专利号8,586,526和9,458,205，通过引用全文纳入本文。

锌指和TALE DNA结合结构域可以"经工程改造"以结合至预定的核苷酸序列，例如经由对天然产生的锌指蛋白的识别螺旋区域进行工程改造(改变一种或多种氨基酸)或通过工程改造DNA结合中涉及的氨基酸(重复可变双残基或RVD区域)。因此，经工程改造的锌指蛋白或TALE蛋白是非天然产生的蛋白质。设计和选择工程改造锌指蛋白和TALE的方法的非限制性示例。设计的蛋白是其设计/组成主要由合理基准所得的非天然存在的蛋白。设计的合理标准包括应用替代法则和计算机算法来处理现有ZFP或TALE设计(典型和非典型RVD)和结合数据的数据库存储信息中的信息。参见例如，美国专利号9,458,205；8,586,526；6,140,081；6,453,242；和6,534,261；也参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。

"选定的"锌指蛋白、TALE蛋白或CRISPR/Cas系统天然情况下未被发现，并且其产生主要来自使用经验方法如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂交体选择。参见例如，U.S.5,789,538；U.S.5,925,523；U.S.6,007,988；U.S.6,013,453；U.S.6,200,759；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197和WO02/099084。

“TtAgo”是原核阿尔古(Argonaute)蛋白质，认为其参与基因沉默。TtAgo源自嗜热细菌(Thermus thermophilus)。参见例如，Swarts等，同上，G.Sheng等，(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111，652)。“TtAgo系统”是所需的全部组分，包括例如，用于通过TtAgo酶切割的向导DNA。

"重组"指两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程。就本公开的目的而言，"同源重组(HR)"指发生这种交换的特定形式，例如在修复细胞内双链断裂期间通过同源导向修复机制发生。该过程要求核苷酸序列同源性，利用"供体"分子模板修复"靶"分子(即，经历双链断裂的分子)，该过程也称作"非交叉基因转化"或"短道基因转化"，因为其导致遗传信息从供体向靶转移。不希望受限于任何特定理论，这种转移可以涉及断裂的靶与供体间形成的异双链体DNA的错配校正，和/或采用供体再合成将成为部分靶的遗传信息的"合成依赖性链退火"，和/或相关过程。这些特定HR通常导致靶分子的序列改变使得供体多核苷酸的部分或全部序列被纳入靶多核苷酸。

在本公开的方法中，本文所述的一种或多种靶向核酸酶在靶序列(例如，细胞染色质)中的预定位点(例如，感兴趣的基因或基因座)产生双链断裂(DSB)，并且可以将与所述断裂区域中的核苷酸序列具有同源性的“供体”多核苷酸导入该细胞。已显示存在DSB有助于供体序列的整合。任选地，该构建体对于该断裂区域内的核苷酸序列具有同源性。供体序列可被物质整合(physically integrated)，或者，供体多核苷酸被用作模板用于通过同源重组进行的断裂修复，导致将供体中的全部或部分核苷酸序列导入细胞染色质。因此，细胞染色质中的第一序列可改变，并且在某些实施方式中，可转化成供体多核苷酸中存在的序列。因此，使用术语“替换”或“置换”可理解为表示一种核苷酸序列被另一种核苷酸序列替换(即，信息意义上序列的替换)，而不一定要求一种多核苷酸被另一种多核苷酸物理或化学替换。

本文所述的任何方法中，可使用其它锌指蛋白对，用于对细胞内其它靶位点的其它双链切割。

在用于靶向重组和/或替代和/或改变细胞染色质内感兴趣区域的序列的方法的某些实施方式中，通过采用外源性“供体”核苷酸序列的同源重组来改变染色体序列。如果存在与断裂的区域同源的序列，那么所述同源重组受细胞染色质中存在的双链断裂的刺激。

在本文所述的任何方法中，第一核苷酸序列(“供体序列”)可包含与感兴趣区域中的基因组序列同源但不相同的序列，由此刺激同源重组以在感兴趣区域插入非相同序列。因此，在某些实施方式中，供体序列中与感兴趣区域序列同源的部分呈现与待替换的基因组序列有约80-99％(或其间任意整数)的序列相同性。在其它实施方式中，供体和基因组序列间的同源性超过99％，例如，超过100个连续碱基对的基因组序列与供体之间相差仅1个核苷酸。在某些情况中，供体序列的非同源部分可包含不存在于感兴趣区域的序列，从而将新序列导入感兴趣区域。在这些情况中，非同源序列一般侧接50-1,000个碱基对(或其间的任何整数值)或大于1,000的任何数量个碱基对的序列，其与感兴趣区域中的序列同源或相同。在其它实施方式中，供体序列与第一序列非同源，并且通过非同源重组机制插入基因组。

本文所述的任意方法可用于通过能破坏感兴趣基因表达的供体序列的靶向整合来使细胞内的一种或多种靶序列部分或完全失活。还提供具有部分或完全失活基因的细胞系。

此外，本文所述的靶向整合方法也可用于整合一种或多种外源性序列。外源性核酸序列可包含，例如，一种或多种基因或cDNA分子，或任何类型的编码或非编码序列，以及一种或多种控制元件(例如，启动子)。此外，外源性核酸序列可产生一种或多种RNA分子(例如，小发夹RNA(shRNA)，抑制性RNA(RNAi)，微小RNA(miRNA)等)。

"切割"指DNA分子共价主链的断裂。切割可以由多种方法引发，包括但不限于，磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链切割和双链切割均可采用，并且双链切割可由不同的单链切割事件所致。DNA切割可导致产生钝端或交错末端。在某些实施方式中，将融合多肽用于靶向双链DNA切割。

"切割半结构域"是能与第二多肽(两者相同或不同)形成具有切割活性(优选双链切割活性)的复合物的多肽序列。术语“第一和第二切割半结构域”；“+和–切割半结构域“和”右和左切割半结构域“可互换使用，指切割二聚化的半结构域的对。

“工程改造的切割半结构域”是经修饰以与另一切割半结构域(例如，另一工程改造的切割半结构域)形成专性异二聚体的切割半结构域。还参见，美国专利号7,888,121；7,914,796；8,034,598；8,623,618和美国专利公开号2011/0201055，通过应用其全文纳入本文。

术语"序列"指任意长度的核苷酸序列，可以是DNA或RNA；可以是直链、环状或支链且可以是单链或双链。术语"供体序列"指插入基因组的核苷酸序列。供体序列可以是任意长度，例如长度为2-10,000个核苷酸(或其间或其上的任意整数值)，优选长度为100-1,000个核苷酸(或其间的任意整数)，更优选长度为200-500个核苷酸。

"染色质"是包含细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包含核酸和蛋白，核酸主要为DNA，蛋白包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白。真核细胞染色质主要以核小体形式存在，其中核小体核心包含约150碱基对的DNA与八聚体关联，所述八聚体包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两份；以及在核小体核心之间延伸的接头DNA(长度根据生物体而各有不同)。组蛋白H1分子通常与接头DNA关联。就本公开的目的而言，术语“染色质”意在涵盖所有类型的细胞核蛋白，包括原核与真核的。细胞染色质包括染色体和附加体染色质。

"染色体"是包含细胞的全部或部分基因组的染色质复合体。细胞基因组通常由其核型表征，其为包含该细胞基因组的全部染色体的集合。细胞基因组可包含一条或多条染色体。

"附加体"是复制的核酸、核蛋白复合体或其它包含并非细胞染色体核型部分的核酸的结构。附加体的示例包括质粒和某些病毒基因组。

"靶位点"或"靶序列"是限定结合分子将结合的核酸部分的核酸序列，前提是存在结合的充分条件。例如，序列5'GAATTC 3'是Eco RI限制性内切核酸酶的靶位点。

"外源性"分子是通常不存在于细胞内的分子，但可通过一种或多种遗传、生化或其它方法导入细胞。“正常存在于细胞中”关于具体发展心理状态(mental stage)和该细胞的环境条件确定。因此，例如，仅在肌肉的胚胎发育期间存在的分子对于成体肌肉细胞是外源性分子。类似地，相对于非热激的细胞，通过热激诱导的分子是外源性分子。例如，外源性分子可以包括功能失常的内源性分子的功能性形式或者正常功能的内源性分子的功能失常形式。

外源性分子可以是小分子或大分子等，小分子如由组合化学方法所产生，大分子如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何经修饰衍生物，或者是包含一种或多种上述分子的任何复合物。核酸包括DNA和RNA，其可以是单链或双链的；可以是直链、支链或环状的；并且可以具有任何长度。参见例如，美国专利号8,703,489和9,255,259。核酸包括能够形成双链体的那些，以及形成三链体的核酸。参见，例如美国专利号5,176,996和5,422,251。蛋白质可包括但不限于，DNA结合蛋白、转录因子、染色质重构因子、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脱甲基酶、乙酰基转移酶、脱乙酰酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、旋转酶和解旋酶。

外源性分子可以是与内源性分子同一类型的分子，例如外源性蛋白或核酸。例如，外源性核酸可以包括感染性病毒基因组、导入细胞内的质粒或附加体，或包含通常不存在于细胞内的染色体。本领域技术人员已知将外源性分子导入细胞内的方法，包括但不限于脂质介导的转移(即脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电转导、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。外源性分子也可以是与内源性分子相同类型但源自与该细胞来源不同物种的分子。例如，可将人核酸序列引入原始源自小鼠或仓鼠的细胞系。

相反，"内源性"分子是通常存在于特定环境条件下特定发育阶段的特定细胞中的分子。例如，内源核酸可以包括染色体、线粒体基因组、叶绿体或其它细胞器，或天然产生的附加型核酸。附加内源分子可包括蛋白质，例如，转录因子和酶。

"融合"分子是其中两个或多个亚单元分子相连(优选共价相连)的分子。亚基分子可以是相同化学类型的分子，也可以是不同化学类型的分子。第一类型的融合分子的示例可包括但不限于，融合蛋白(例如，ZFP或TALE DNA结合结构域与一种或多种激活结构域之间的融合)和融合核酸(例如，编码上文所述的融合蛋白的核酸)。第二类融合分子的示例包括但不限于：形成三链体的核酸与多肽之间的融合体，以及小沟结合子与核酸之间的融合体。该术语还包括这样的系统，其中的多核苷酸组分与多核苷酸组分相关联以形成功能性分子(例如，CRISPR/Cas系统，其中单一向导RNA与功能结构域相关联以调控基因表达)。

细胞内融合蛋白的表达可由融合蛋白递送入细胞造成或通过向细胞递送编码融合蛋白的多核苷酸而引起，其中所述多核苷酸被转录，转录本经翻译产生所述融合蛋白。细胞中蛋白质的表达也可涉及反式剪接、多肽切割和多肽连接。用于将多核苷酸和多肽递送至细胞的方法在本公开内容中的他处呈现。

就本公开的目的而言，"基因"包括编码基因产物(见前文)的DNA区域，以及调节基因产物生成的DNA区域，不论这类调节序列是否毗邻编码和/或转录序列。因此，基因包括但不必限于，启动子序列、终止子、翻译调节序列，例如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质连接位点和基因座控制区域。

"安全港"基因座是基因组内的基因座，其中，基因可以在对宿主细胞没有任何有害影响。最有益的是这样的安全港基因座，其中插入的基因序列的表达没有被来自相邻基因的任何通读表达所扰乱。由核酸酶靶向的安全港基因座的非限制性示例包括：CCR5、CCR5、HPRT、AAVS1、Rosa和白蛋白。参见例如，美国专利号8,771,985；8,110,379；7,951,925；美国专利公开号20100218264；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983；20130177960；20150056705和20150159172)。

"基因表达"指基因所含信息转化成基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核糖酶、结构RNA或任何其它类型的RNA)或通过mRNA翻译产生的蛋白质。基因产物还包括经修饰的RNA，通过如下加工修饰，例如加帽、聚腺苷酸化、甲基化，和编辑，以及通过如下加工修饰的蛋白质，例如，甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、豆蔻酰化和糖基化。

基因表达的"调控"或"修饰"指基因活性的改变。表达的调控可以包括但不限于：基因激活和基因抑制，包括通过经由结合外源性分子(例如，工程改造转录因子)的基因修饰。调节可以通过经由基因组编辑(例如，切割、改变、灭活、随机突变)基因序列的修饰来实现。基因灭活指的是，相较于没有经过本文所述修饰的细胞，基因表达的任何减少。因此，基因灭活可以是部分或完全的。

"感兴趣区域"是需要结合外源性分子的细胞染色质的任意区域，例如，基因或者基因内或与之毗邻的非编码序列。结合可以是出于靶向DNA切割和/或靶向重组的目的。感兴趣区域可以存在于例如染色体，附加体，细胞器基因组(例如，线粒体、叶绿体)，或感染性病毒基因组中。感兴趣区域可处于基因的编码区中，转录的非编码区域例如前导序列、尾随序列或内含子中，或非转录区域中编码区的上游或下游。感兴趣区域可如单一核苷酸对一样小，或长达2,000个核苷酸对，或任意整数值的核苷酸对。

"真核"细胞可包括但不限于，真菌细胞(例如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人细胞(例如，T细胞)。

涉及两个或多个组件(例如序列元件)的并置，所述组件设置成组件都可正常发挥作用并允许组件中至少一种能介导施加于至少一种其它组件上的作用时，术语"操作性相连"和"操作性连接"(或"可操作地连接")互换使用。例如，若转录调节序列控制编码序列响应一种或多种转录调节因子存在与否时的转录水平，则所述转录调节序列如启动子与所述编码序列操作性连接。转录调节序列一般与编码序列以顺式操作性地连接，但无需紧邻该序列。例如，增强子是操作性地连接编码序列的转录调节序列，尽管它们是不连续的。

对于融合多肽，术语"操作性连接"可指各组件在与其它组件的连接中所发挥的功能与其在未连接时的功能相同。例如，对于其中DNA结合结构域(例如，ZFP、TALE)与激活结构域融合的融合多肽，DNA结合结构域和激活结构域是操作性连接的，在该融合多肽中，DNA结合结构域部分能够结合其靶位点和/或其结合位点，而所述激活结构域能够上调基因表达。当融合多肽中DNA结合结构域与切割结构域融合时，若在融合多肽中DNA结合结构域部分能结合其靶位点和/或其结合位点，而切割结构域能切割靶位点附近的DNA，那么DNA结合结构域和切割结构域是可操作地连接的。相似的，对于其中DNA结合结构域与激活或抑制结构域融合的融合多肽，若再融合多肽中DNA结合结构域部分能够结合其靶位点和/或其结合位点，而激活结构域能上调基因表达或抑制结构域能下调基因表达，那么DNA结合结构域和激活或抑制结构域是可操作地连接的。

蛋白质、多肽或核酸的"功能性片段"是序列与全长蛋白质、多肽或核酸不相同但保留全长蛋白质、多肽或核酸的相同功能的蛋白质、多肽或核酸。功能片段可具有比相应的天然分子更多、更少或相同数量的残基，和/或可含有1个或多个氨基酸或核苷酸取代。用于确定核酸功能(例如，编码功能、与另一核酸杂交的能力)的方法是本领域熟知的。类似地，用于确定蛋白质功能的方法也是熟知的。例如，可测定多肽的DNA结合功能，例如通过滤膜结合、电泳迁移率改变或免疫沉淀试验。DNA切割可通过凝胶电泳分析。参见Ausubel等，同上。可测定蛋白与另一蛋白相互作用的能力，例如，通过共免疫沉淀、双杂交试验或互补分析，既可以是遗传的也可以是生化的。参见例如，Fields等，(1989)Nature 340:245-246；美国专利号5,585,245和PCT WO 98/44350。

"载体"能将基因序列转移至靶细胞。"载体构建体"、"表达载体"、"表达构建体"、"表达盒"和"基因转移载体"通常指能指导感兴趣基因表达并能将基因序列转移至靶细胞的核酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及整合载体。

"报告基因"或"报告序列"指的是产生这样蛋白质产物的任何序列，所述蛋白质产物容易被检测，其在常规试验中并非必需但是优选的。合适的报告基因可包括但不限于，编码介导抗生素抗性(例如，氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性)的蛋白质的序列、编码有色或荧光或发光蛋白质(例如，绿色荧光蛋白、强化绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶)的序列，和介导增强的细胞生长和/或基因扩大的蛋白质(例如，二氢叶酸还原酶)。表位标签包括，例如，一个或多个拷贝的FLAG、His、myc、Tap、HA或任何可检测的氨基酸序列。“表达标签”包括编码可操作性地连接至所需基因序列以监测感兴趣的基因的表达的报告物的序列。

术语“对象”和“患者”互换使用，并且表示哺乳动物例如人类患者和非人类灵长类，以及实验室动物例如兔、狗、猫、大鼠、小鼠和其他动物。因此，术语“对象”或“患者”表示可给予本发明表达盒的任何哺乳动物患者或对象。本发明的对象包括患有病症的那些或处于发展病症的风险中的那些。

本文所用的术语“治疗”和“处理”指减少症状的严重性和/或频率、消除症状和/或根本原因、预防症状的发生和/或它们的根本原因、以及改善或消除损伤。癌症和移植物抗宿主疾病是可以使用本文所述组合物和方法治疗的病症的非限制性示例。因此，“处理”和“治疗”包括：

(i)预防所述疾病或病症在哺乳动物中发生，具体是在所述哺乳动物倾向于患上该病症但尚未诊断患有该病症时；

(ii)抑制该疾病或病症，即阻止其发展；

(iii)减轻该疾病或病症，即，使该疾病或病症消退；或

(iv)减轻由该疾病或病症所致的症状，即，减轻痛苦但不解决潜在的疾病或病症。

本文中所用术语“疾病”和“病症”可互换使用，或可不同，其中具体的疾病或病症可不具有已知的致病物(从而病因尚不知晓)，因此其尚未被视作疾病而仅仅是作用不希望的病症或综合征，其中由临床医师或多或少地鉴定出了具体的一组症状。

"药物组合物"指本发明的化合物制剂以及本领域通常接受的用于将生物活性化合物递送到哺乳动物(例如，人)的介质。这样的介质包括药学上可接受的运载剂、稀释剂或赋形剂等等。

“有效量”或“治疗有效量”指：本发明化合物的一定量，当将其给予哺乳动物，优选人类时，足以提供对于该哺乳动物(优选人类)的有效治疗。构成“治疗有效量”的本发明化合物的量将根据化合物、病症及其严重性、给予方式，以及待治疗的哺乳动物的年龄而变化，但可由本领域技术人员根据其所掌握的知识和本发明内容来常规地确定。

DNA结合结构域

本文描述包括DNA结合结构域的组合物，所述DNA结合结构域特异性地结合包括HLA基因或HLA调控子(包括B2M基因)的任何基因中的靶位点。本文所公开的方法和化合物中可以使用任何DNA结合结构域，包括但不限于锌指DNA结合结构域，TALE DNA结合结构域，CRISPR/Cas核酸酶的DNA结合部分(sgRNA)，或来自大范围核酸酶(meganuclease)的DNA结合结构域。DNA结合结构域可以结合该基因内的任何靶序列，包括但不限于，SEQ ID NO:6-48中任一项所示的12或更多个核苷酸的靶序列。

在某些实施方式中，DNA结合结构域包含锌指蛋白。优选地，该锌指蛋白是非天然产生的，其中它经工程改造以结合至所选的靶位点。参见例如，Beerli等(2002)NatureBiotechnol.20:135-141；Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；美国专利号6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273；和美国专利公开号2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061，其均通过引用其全文纳入本文。在某些实施方式中，DNA结合结构域包括美国专利公开号2012/0060230中所公开的锌指蛋白(例如，表1)，通过引用将其全部内容纳入本文。

与天然产生的锌指蛋白相比，经工程改造的锌指结合结构域可具有新型结合特异性。工程改造方法可包括但不限于，合理的设计和不同选择类型。例如，合理设计包括利用包含三体(或四体)核苷酸序列和单独锌指氨基酸序列的数据库，其中各三体或四体核苷酸序列与一种或多种结合该特定三体或四体序列的锌指氨基酸序列相关联。参见，例如，美国专利6,453,242和6,534,261，通过引用其全文纳入本文。

示例性选择方法包括噬菌体展示和双杂交系统，公开于美国专利5,789,538、5,925,523、6,007,988、6,013,453、6,410,248、6,140,466、6,200,759和6,242,568；以及WO98/37186、WO 98/53057、WO 00/27878、WO 01/88197和GB 2,338,237。此外，例如在美国专利号6,794,136中，已描述对锌指结合结构域的结合特异性的增强。

此外，如这些以及其它参考文献中所公开的，锌指结构域和/或多指的锌指蛋白可利用任何合适的接头序列连接在一起，包括例如长度为5个或更多个氨基酸的接头。长度为6个或更多个氨基酸的示例性接头序列还参见例如，美国专利号6,479,626、6,903,185和7,153,949。本文所述的蛋白质可包括蛋白质的个体锌指之间的合适的接头的任何组合。此外，例如在美国专利号6,794,136中，已描述对锌指结合结构域的结合特异性的增强。

靶位点选择；用于设计和构建融合蛋白(及其编码多核苷酸)的ZFP和方法是本领域技术人员已知的，并且详细描述于美国专利号6,140,081；5,789,538；6,453,242；6,534,261；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,200,759；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970WO 01/88197；WO 02/099084；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。

此外，如这些以及其它参考文献中所公开的，锌指结构域和/或多指的锌指蛋白可利用任何合适的接头序列连接在一起，包括例如长度为5个或更多个氨基酸的接头。长度为6个或更多个氨基酸的示例性接头序列还参见例如，美国专利号6,479,626、6,903,185和7,153,949。本文所述的蛋白质可包括蛋白质的个体锌指之间的合适的接头的任何组合。

在某些实施方式中，DNA结合结构域是经工程改造的锌指蛋白，其(以序列特异性方式)结合B2M基因或B2M调控基因中的靶位点并调控B2M表达。在一些实施方式中，锌指蛋白结合B2M中的靶位点，而在其他实施方式中，锌指结合B2M中的靶位点。

ZFP通常包括至少三个指。某些ZFP包括四个、五个或六个指。包括三个指的ZFP通常识别包括9或10个核苷酸的靶位点；包括四个指的ZFP通常识别包括12-14个核苷酸的靶位点；而具有六个指的ZFP能识别包括18-21个核苷酸的靶位点。ZFP也可以是包括一种或多种调节结构域的融合蛋白，其结构域可以是转录活化或阻遏结构域。

在一些实施方式中，DNA结合结构域可衍生自核酸酶。例如，已知寻靶内切核酸酶和大范围核酸酶的识别序列如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。还可参见美国专利第5,420,032号；美国专利第6,833,252号；Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25:3379–3388；Dujon等(1989)Gene 82:115–118；Perler等(1994)Nucleic Acids Res.22,1125–1127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224–228；Gimble等(1996)J.Mol.Biol.263:163–180；Argast等(1998)J.Mol.Biol.280:345–353和NEB公司(New England Biolabs)产品目录。此外，寻靶内切核酸酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性可被工程改造以结合非天然靶位置。参见例如Chevalier等.(2002)Molec.Cell 10:895-905；Epinat等.(2003)Nucleic AcidsRes.31:2952-2962；Ashworth等.(2006)Nature 441:656-659；Paques等.(2007)CurrentGene Therapy 7:49-66；美国专利公开号20070117128。

在其它实施方式中，DNA结合结构域包括来自TAL效应物的工程改造的结构域，其类似于源自植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)的那些(参见Boch等，(2009)Science 326:1509-1512和Moscou与Bogdanove,(2009)Science 326:1501)和Ralstonia(参见Heuer等(2007)Applied and Environmental Microbiology 73(13):4379-4384)；美国专利申请号20110301073和20110145940。已知黄单胞菌属(Xanthomonas)的植物病原菌在重要农作物中导致很多疾病。黄单胞菌属的病原性取决于保守的III型分泌(T3S)系统，该系统向植物细胞内注入超过25种不同的效应物蛋白。这些注入的蛋白质中，有模拟植物转录激活物并操纵植物转录组的转录活化样效应物(TALE)(参见Kay等(2007)Science 318:648-651)。这些蛋白含有DNA结合结构域和转录激活结构域。最为充分表征的TALE之一是来自野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)的AvrBs3(参见Bonas等(1989)Mol Gen Genet 218:127-136和WO2010079430)。TALE含有串联重复的集中化结构域，各重复含有约34个氨基酸，它们是这些蛋白的DNA结合特异性的关键。此外，它们含有核定位序列和酸性转录激活结构域(综述参见Schornack S等(2006)J Plant Physiol163(3):256-272)。此外，在致植物病细菌烟草青枯菌(Ralstonia solanacearum)中，已发现烟草青枯菌生物变型(biovar)1菌株GMI1000和生物变型4菌株RS1000中称为brg11和hpx17的两个基因与黄单胞菌属(Xanthomonas)的AvrBs3家族同源(参见Heuer等(2007)Appl and Envir Micro 73(13):4379-4384)。这些基因在核苷酸序列上彼此为98.9％的同一性，但区别为hpx17重复结构域中的1,575bp缺失。然而，两种基因产物均与黄单胞菌属(Xanthomonas)的AvrBs3家族蛋白质具有低于40％序列同一性。

这些TAL效应物的特异性取决于串联重复中存在的序列。重复序列包含约102个碱基对，且重复彼此间通常91-100％同源(Bonas等，同上)。重复的多态性通常位于12和13位，并且似乎在位置12和13的高可变双残基(重复可变双残基或RVD区域)的种类与TAL效应物靶序列中连续核苷酸的种类之间存在一一对应(参见Moscou和Bogdanove,(2009)Science326:1501以及Boch等(2009)Science 326:1509-1512)。实验上，已确定用于这些TAL效应物DNA识别的天然编码，因此位于位置12与13的HD序列(重复可变双残基或RVD)导致对于胞嘧啶(C)的结合，NG结合T、NI结合A、C、G或T，NN结合A或G，而IG结合T。这些DNA结合重复已被装配在具有新的重复组合与数量的蛋白质中，产生能在植物细胞中与新序列相互作用并激活非内源性报告基因的表达的人工转录因子(Boch等，同上)。已将经工程改造的TAL蛋白连接至FokI切割半结构域，以产生TAL效应物结构域核酸酶融合体(TALEN)，包括具有非典型RVD的TALEN。参见例如，美国专利号8,586,526。

在一些实施方式中，TALEN包括内切核酸酶(例如，FokI)切割结构域或切割半结构域。在其它实施方式中，TALE-核酸酶是大范围TAL。这些大氛围TAL核酸酶是这样的融合蛋白，其包括TALE DNA结合结构域以及大范围核酸酶切割结构域。大范围核酸酶切割结构域作为单体具有活性，并且不需要二聚化获得活性。(参见Boissel等,(2013)Nucl Acid Res:1-13,doi:10.1093/nar/gkt1224)。

在还有一个实施方式中，核酸酶包括紧凑型(compact)TALEN。存在单链融合蛋白，其将TALE DNA结合结构域与TevI核酸酶结构域连接。该融合蛋白可以作为通过TALE区域定位的切口酶，或可以产生双链断裂，这取决于该TALE DNA结合结构域相对于TevI核酸酶结构域所在的位置(参见Beurdeley等(2013)Nat Comm:1-8DOI:10.1038/ncomms2782)。此外，核酸酶结构域还可以展现DNA-结合功能性。任何TALEN都可以与其它TALEN(例如，一个或多个具有一个或多个大范围TALE的TALEN(cTALEN或FokI-TALEN))联用。

此外，如这些以及其它参考文献中所公开的，锌指结构域和/或多指的锌指蛋白或TALE可利用任何合适的接头序列连接在一起，包括例如长度为5个或更多个氨基酸的接头。长度为6个或更多个氨基酸的示例性接头序列还参见例如，美国专利号6,479,626、6,903,185和7,153,949。本文所述的蛋白质可包括蛋白质的个体锌指之间的合适的接头的任何组合。此外，例如在美国专利号6,794,136中，已描述对锌指结合结构域的结合特异性的增强。

在某些实施方式中，DNA结合结构域是CRISPR/Cas核酸酶系统的部分，包括与DNA结合的单一向导RNA(sgRNA)。参见，例如，美国专利号8,697,359和美国专利公开号20150056705和20150159172。编码该系统RNA组分的CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复)基因座以及编码蛋白质的cas(CRISPR-相关)基因座(Jansen等,2002.Mol.Microbiol.43:1565-1575；Makarova等,2002.Nucleic Acids Res.30:482-496；Makarova等,2006.Biol.Direct 1:7；Haft等,2005.PLoS Comput.Biol.1:e60)组成了CRISPR/Cas核酸酶系统的基因序列。微生物宿主中的CRISPR基因座包含这样的组合，所述组合是CRISPR-相关(Cas)基因以及能够对CRISPR介导的核酸切割的特异性进行编程的非编码RNA元件。

II型CRISPR是充分表征的系统之一，并且以4个连续步骤进行靶向的DNA双链断裂。第一，由CRISPR基因座转录两个非编码RNA，前-crRNA阵列和tracrRNA。第二，将tracrRNA杂交至前-crRNA的重复区域，并且介导前-crRNA加工成包含单独的间隔子序列的成熟crRNA。第三，成熟的crRNA:tracrRNA复合物经由沃森-克里克碱基配对引导功能结构域(例如，核酸酶，诸如Cas)至靶DNA，其位于crRNA上的间隔子和原型间隔子邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)旁边的靶DNA上的原型间隔子之间，所述PAM是靶标识别的额外要求。最后，Cas9介导靶DNA的切割以在原型间隔子内产生双链断裂。CRISPR/Cas系统的活性包括3步：(i)将外来DNA序列插入CRISPR阵列防止未来的攻击，通过被称之为“适应”的过程，(ii)表达相关蛋白质，以及表达并处理该阵列，然后(iii)对外来核酸进行RNA介导的干扰。因此，在细菌细胞中，多个所谓的“Cas”的蛋白质涉及CRISPR/Cas系统自然功能，并且在诸如插入外来DNA等的功能中起作用。

在某些实施方式中，Cas蛋白可以是天然产生的Cas蛋白的"功能性衍生物"。天然序列多肽的“功能性衍生物”是具有与天然序列多肽共同的定性生物性质的化合物。“功能性衍生物”包括但不限于，天然序列的片段或天然序列多肽的衍生物及其片段，前提是它们具有与相应的天然序列多肽共同的生物活性。本文所预期的生物活性是功能性衍生物将DNA底物水解成片段的能力。术语“衍生物”包括多肽的氨基酸序列变体，共价修饰物，和其融合体，诸如衍生的Cas蛋白。Cas多肽合适的衍生物或其片段包括但不限于Cas蛋白的突变体、融合体、共价修饰物或其片段。包括Cas蛋白或其片段的Cas蛋白以及Cas蛋白或其片段的衍生物可以获得自细胞或化学合成或通过这两种方法的组合。该细胞可以是天然产生Cas蛋白的细胞，或这样的细胞，该细胞天然产生Cas蛋白并经遗传工程改造以较高的表达水平产生内源性Cas蛋白或由异源导入的核酸产生Cas蛋白，该核酸编码与内源性Cas相同或不同的Cas。在一些情况中，细胞天然不产生Cas蛋白，但是经遗传工程改造以产生Cas蛋白。在一些实施方式中，Cas蛋白是小Cas9同源物，用于经AAV载体的递送(Ran等(2015)Nature510,p.186)。

在一些实施方式中，DNA结合结构域是TtAgo系统的部分(参见，Swarts等,如上；Sheng等,如上)。在真核细胞中，基因沉默通过阿尔古(Argonaute，Ago)家族的蛋白介导。在该范例中，Ago与小(19-31nt)RNA结合。该蛋白质-RNA沉默复合物经由沃森-克里克碱基配对识别靶RNA，其位于小RNA和靶标之间，并且内切核酸酶活性地切割靶RNA(Vogel(2014)Science 344:972-973)。相反，原核Ago蛋白与小单链DNA片段结合，并且可能作用于检测并移除外源(通常是病毒)DNA(Yuan等,(2005)Mol.Cell 19,405；Olovnikov,等(2013)Mol.Cell 51,594；Swarts等,同上)。示例性的原核Ago蛋白包括：来自超嗜热菌(Aquifexaeolicus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)和嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)的那些。

最为充分表征的原核Ago蛋白之一是来自嗜热栖热菌(T.thermophilus)的其中一种(TtAgo；Swarts等,同上)。TtAgo与具有5'磷酸基团的15nt或13-25nt单链DNA片段关联。通过TtAgo结合的该"向导DNA"可用于引导该蛋白质-DNA复合物结合DNA第三方(third-party)分子中的沃森-克里克互补的DNA序列。一旦这些向导DNA中的序列信息能够允许鉴定靶DNA，TtAgo-向导DNA复合物切割该靶DNA。这样的机制还通过TtAgo-向导DNA复合物的结果予以支持，尽管与其靶DNA结合(G.Sheng等,同上)。来自类球红细菌的Ago(RsAgo)具有相似的性质(Olivnikov等，同上)。

任意DNA序列的外源性向导DNA可以被加载到TtAgo蛋白上(Swarts等，同上)。因为TtAgo切割的特异性通过向导DNA指导，以外源性且识别物特异性的(investigator-specified)向导DNA形成的TtAgo-DNA复合物将因此指导TtAgo靶DNA切割，成为互补识别物特异性的靶DNA。以此方式，人们可以在DNA中生成靶向的双链断裂。TtAgo-向导DNA系统(或来自其它有机体的同源Ago-向导DNA系统)的应用将允许靶向切割细胞内的基因组DNA。这样的切割可以是单链的或双链的。对于切割哺乳动物基因组DNA，优选地是应用针对哺乳动物细胞中表达优化的TtAgo密码子形式。此外，可以优选体外形成的TtAgo-DNA复合物处理细胞，其中的TtAgo与细胞-穿膜肽融合。此外，可以优选应用这样形式的TtAgo蛋白，其已经通过诱变改变，以在37℃具有改善的活性。Ago-RNA-介导的DNA切割可以被用于影响包括使用本领域用于开发DNA断裂的技术标准的基因敲除、靶向基因添加、基因校正、靶基因缺失在内的所有结果。

因此，可以使用任何DNA结合结构域。

融合分子

还提供这样的融合分子，其包括本文所述与异源性调节(功能)结构域(或其功能性片段)相关的DNA结合结构域(例如，ZFP或TALE，CRISPR/Cas组分，诸如单一向导RNA)。常见的结构域包括例如：转录因子结构域(活化子、抑制子、共激活子、共抑制子)、沉默子、致癌基因(例如myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mos家族成员等)；DNA修复酶及其相关因子和修饰子；DNA重排酶及其相关因子和修饰子；染色质相关蛋白及其修饰子(例如激酶、乙酰化酶和脱乙酰基酶)；和DNA修饰酶(例如甲基转移酶、拓扑异构酶、解螺旋酶、连接酶、激酶、磷酸酶、聚合酶、内切核酸酶)及其相关因子和修饰子。这样的融合分子包括转录因子，其包括本文所述DNA结合结构域和转录调节结构域，以及核酸酶，其包括DNA结合结构域和一个或多个核酸酶结构域。

用于实现活化的合适结构域(转录激活结构域)包括HSV VP16活化结构域(参见例如，Hagmann等,J.Virol.71,5952-5962(1997))，核激素受体(参见例如，Torchia等,Curr.Opin.Cell.Biol.10:373-383(1998))；核因子κB的p65亚基(Bitko和Barik,J.Virol.72:5610-5618(1998)和Doyle与Hunt,Neuroreport 8:2937-2942(1997))；Liu等,Cancer Gene Ther.5:3-28(1998))，或人工嵌合功能结构域，例如VP64(Beerli等,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:14623-33)，和降解决定子(degron)(Molinari等,(1999)EMBO J.18,6439-6447)。额外的示例性活化结构域包括，Oct 1，Oct-2A，Sp1，AP-2和CTF1(Seipel等.，EMBO J.11，4961-4968(1992)以及p300，CBP，PCAF，SRC1PvALF，AtHD2A和ERF-2。参见例如Robyr等.(2000)Mol.Endocrinol.14:329-347；Collingwood等.(1999)J.Mol.Endocrinol.23:255-275；Leo等.(2000)Gene 245:1-11；Manteuffel-Cymborowska(1999)Acta Biochim.Pol.46:77-89；McKenna等.(1999)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.69:3-12；Malik等.(2000)Trends Biochem.Sci.25:277-283；和Lemon等.(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9:499-504。额外的示例性活化结构域可包括但不限于，OsGAI，HALF-1，C1，AP1，ARF-5,-6,-7和-8，CPRF1，CPRF4，MYC-RP/GP，和TRAB1。参见例如，Ogawa等.(2000)Gene 245:21-29；Okanami等.(1996)Genes Cells 1:87-99；Goff等.(1991)Genes Dev.5:298-309；Cho等.(1999)Plant Mol.Biol.40:419-429；Ulmason等.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:5844-5849；Sprenger-Haussels等.(2000)PlantJ.22:1-8；Gong等.(1999)Plant Mol.Biol.41:33-44；和Hobo等.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:15,348-15,353。

本领域技术人员应明了，在DNA结合结构域与功能结构域之间的融合蛋白(或编码相同内容的核酸)的形成中，活化结构域或与活化结构域相互作用的分子适于作为功能结构域。基本上，能够招募活化复合物和/或活化活性(例如，组蛋白乙酰化)至靶基因的任何分子均可用作融合蛋白的活化结构域。适用作融合分子中的功能结构域的绝缘子结构域、定位结构域和染色质重构蛋白例如含ISWI的结构域和/或甲基结合结构域蛋白描述于，例如，美国专利号7,053,264。

示例性的阻遏结构域可包括但不限于，KRAB A/B，KOX，TGF-β-诱导型早期基因(TIEG)，v-erbA，SID，MBD2，MBD3，DNMT家族成员(例如，DNMT1，DNMT3A，DNMT3B)，Rb和MeCP2。参见例如，Bird等.(1999)Cell 99:451-454；Tyler等.(1999)Cell 99:443-446；Knoepfler等.(1999)Cell 99:447-450；和Robertson等.(2000)Nature Genet.25:338-342。其他示例性的阻遏结构域包括但不限于ROM2和AtHD2A。参见例如，Chem等，(1996)Plant Cell 8:305-321；和Wu等，(2000)Plant J.22:19-27。

通过本领域技术人员熟知的克隆和生物化学偶联方法构建融合分子。融合分子包括DNA结合结构域(例如，ZFP、TALE、sgRNA)和功能结构域(例如，转录激活或抑制结构域)。融合分子还任选包含核定位信号(例如，来自SV40介质T-抗原)和表位标签(例如，FLAG和血细胞凝集素)。设计融合蛋白(以及编码其的核酸)，从而保留融合组分间的翻译阅读框。

一方面，功能结构域(或其功能性片段)多肽组分与另一方面非蛋白质DNA结合结构域(例如，抗生素、嵌入剂、小沟结合剂、核酸)之间的融合通过本领域技术人员已知的生物化学偶联法构建。参见例如，皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Compan)(伊利诺伊州罗克福德)目录。已描述用于生成小沟结合剂与多肽之间的融合的方法和组合物。Mapp等.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:3930-3935。此外，CRISPR/Cas系统的单一向导RNA与功能结构域相关，以形成活性转录调节剂和核酸酶。

在某些实施方式中，靶位点存在于细胞染色质的可及区域。可及区域可以按，例如，美国专利号7,217,509和7,923,542中所述确定。如果靶位点不存在于细胞染色质的可及区域，可以按美国专利号7,785,792和8,071,370所述产生一个或多个可及区域。在其它实施方式中，融合分子的DNA结合结构域能够结合至细胞染色质，无论其靶位点是否位于可及区域中。例如，所述DNA结合结构域能够结合至接头DNA和/或核小体DNA。该类型的"先驱"DNA结合结构域的示例可见于某些类固醇受体和肝细胞核因子3(HNF3)中(Cordingley等(1987)Cell 48:261-270；Pina等(1990)Cell 60:719-731；和Cirillo等(1998)EMBO J.17:244-254)。

融合分子可与药学上可接受的运载体配制，如本领域技术人员已知。参见例如，《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，17版，1985；和美国专利号6,453,242和6,534,261。

融合分子的功能性组分/结构域可选自任何多种不同的组分，所述组分一旦该融合分子通过其DNA结合结构域结合至靶序列即能影响基因转录。因此，功能性组分可包括但不限于，各种转录因子结构域，例如活化物、阻遏物、共活化物、共阻遏物，和沉默子。

例如，美国专利号6,534,261和6,933,113中公开了额外的示例性功能结构域。

还可选择通过外源性小分子或配体调节的功能结构域。例如，可采用技术，其中功能结构域仅在额外的RheoChem^TM配体的存在下假定其活性构象(参见例如US 20090136465)。因此，可将ZFP可操作地连接至可调节的功能结构域，其中所得ZFP-TF的活性由外部配体控制。

核酸酶

在某些实施方式中，融合分子包括与切割(核酸酶)结构域相关的DNA结合型结合结构域。如此，基因修饰可采用核酸酶，例如经工程改造的核酸酶来实现。经工程改造的核酸酶技术基于对天然产生的DNA结合蛋白的工程改造。例如，已描述了具有调整的DNA结合特异性的寻靶内切核酸酶的工程改造。Chames等.(2005)Nucleic Acids Res 33(20):e178；Arnould等.(2006)J.Mol.Biol.355:443-458。此外，已描述ZFP的工程改造。例如，参见美国专利号6,534,261；6,607,882；6,824,978；6,979,539；6,933,113；7,163,824；和7,013,219。

此外，ZFP和/或TALE可以与核酸酶结构域融合以产生ZFN和TALEN，其是这样的功能性实体，它们能够通过其经工程改造的(ZFP或TALE)DNA结合结构域识别其意图的核酸靶标，并造成该DNA在DNA结合位点附近经由核酸酶活性被切割。

因此，本文所述的方法和组合物应用面广，并且可涉及任何感兴趣的核酸酶。核酸酶的非限制性示例包括大范围核酸酶、TALEN和锌指核酸酶。核酸酶可包含异源性DNA结合与切割结构域(例如，锌指核酸酶；具有异源性切割结构域的大范围核酸酶DNA结合结构域)或者替代地，可改变天然产生的核酸酶的DNA结合结构域以结合选定的靶位点(例如，大范围核酸酶经工程改造以结合不同于关联结合位点)。

在本文所述的核酸酶的任何一个中，核酸酶可以包括工程改造的TALE DNA结合结构域以及核酸酶结构域(例如，内切核酸酶和/或大范围核酸酶结构域)，也称之为TALEN。已经公开了用于工程改造这些TALEN蛋白从而与用户选择的靶序列稳健且位点特异性地相互作用的方法和组合物(参见，美国专利号8,586,526)。在一些实施方式中，TALEN包括内切核酸酶(例如，FokI)切割结构域或切割半结构域。在其它实施方式中，TALE-核酸酶是大范围TAL。这些大氛围TAL核酸酶是这样的融合蛋白，其包括TALE DNA结合结构域以及大范围核酸酶切割结构域。大范围核酸酶切割结构域作为单体具有活性，并且不需要二聚化获得活性。(参见Boissel等,(2013)Nucl Acid Res:1-13,doi:10.1093/nar/gkt1224)。此外，核酸酶结构域还可以展现DNA-结合功能性。

在还有一个实施方式中，核酸酶包括紧凑型TALEN(cTALEN)。存在单链融合蛋白，其将TALE DNA结合结构域与TevI核酸酶结构域连接。该融合蛋白可以作为通过TALE区域定位的切口酶，或可以产生双链断裂，这取决于该TALE DNA结合结构域相对于TevI核酸酶结构域所位于的位置(参见Beurdeley等(2013)Nat Comm:1-8DOI:10.1038/ncomms2782)。任何TALEN都可以与其它TALEN(例如，一个或多个具有一个或多个大范围TAL的TALEN(cTALEN或FokI-TALEN))或其它DNA切割酶联用。

在其它实施方式中，核酸酶包括展现出切割活性的大范围核酸酶(寻靶内切核酸酶)或其部分。天然产生的大范围核酸酶识别15-40碱基对的切割位点，并且通常分为四个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cyst箱家族和HNH家族。示例性寻靶核酸内切酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。其识别序列是已知的。还可参见，美国专利号5,420,032号；美国专利第6,833,252号；Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25:3379–3388；Dujon等(1989)Gene 82:115–118；Perler等(1994)Nucleic Acids Res.22,1125–1127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224–228；Gimble等(1996)J.Mol.Biol.263:163–180；Argast等(1998)J.Mol.Biol.280:345–353和NEB公司(New England Biolabs)产品目录。

来自天然产生的大范围核酸酶的DNA结合结构域，主要是来自LAGLIDADG家族的DNA结合结构域已被用于在植物、酵母、果蝇、哺乳动物细胞和小鼠中促进位点特异性基因组修饰，但该方法仅限于修饰保留大范围核酸酶识别序列的同源基因(Monet等(1999),Biochem.Biophysics.Res.Common.255:88-93)或是对其中已经被导入识别序列的预先经工程改造的基因组(Route等(1994),Mol.Cell.Biol.14:8096-106；Chilton等(2003),Plant Physiology.133:956-65；Puchta等(1996),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5055-60；Rong等(2002),Genes Dev.16:1568-81；Gouble等(2006),J.Gene Med.8(5):616-622)。因此，已尝试工程改造大范围核酸酶使其在医学或生物技术相关位点呈现新型结合特异性(Porteus等(2005),Nat.Biotechnol.23:967-73；Sussman等(2004),J.Mol.Biol.342:31-41；Epinat等(2003),Nucleic Acids Res.31:2952-62；Chevalier等(2002)Molec.Cell10:895-905；Epinat等(2003)Nucleic Acids Res.31:2952-2962；Ashworth等(2006)Nature 441:656-659；Paques等(2007)Current Gene Therapy 7:49-66；美国专利公开号20070117128、20060206949、20060153826、20060078552和20040002092)。此外，天然产生或工程改造的来自大范围核酸酶的DNA结合结构域可以可操作地连接来自异源性核酸酶(例如，FokI)的切割结构域和/或来自大范围核酸酶的切割结构域，所述大范围核酸酶可以与异源性DNA结合结构域(例如，ZFP或TALE)可操作地连接。

在其他实施方式中，核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)或TALE DNA结合结构域-核酸酶融合体(TALEN)。ZFN和TALEN包括DNA结合结构域(锌指蛋白或TALE DNA结合结构域)其经工程改造以结合所选基因中的靶位点和切割结构域或切割半结构域(例如，来自如本文所述的限制性和/或大范围核酸酶)。

如上详述，锌指结合结构域和TALE DNA结合结构域可经工程改造以结合所选序列。参见例如，Beerli等(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416。与天然产生的锌指蛋白相比，经工程改造的锌指结合结构域或TALE蛋白可具有新型结合特异性。工程改造方法可包括但不限于，合理的设计和不同选择类型。例如，合理设计包括利用包含三体(或四体)核苷酸序列和单独的锌指或TALE氨基酸序列的数据库，其中各三体或四体核苷酸序列与一种或多种结合该特定三体或四体序列的锌指或TALE重复单元的氨基酸序列相关联。参见，例如，美国专利6,453,242和6,534,261，通过引用其全文纳入本文。

靶位点的选择；以及用于设计和构建融合蛋白(以及编码与之相同的多核苷酸)的方法是本领域技术人员已知的并且详述于美国专利号7,888,121和8,409,861中，两者通过引用将其全部内容纳入本文。

此外，如这些以及其它参考文献中所公开的，锌指结构域、TALE和/或多指的锌指蛋白可利用任何合适的接头序列连接在一起，包括例如长度为5个或更多个氨基酸的接头。长度为6个或更多个氨基酸的示例性接头序列参见例如，美国专利号6,479,626、6,903,185和7,153,949。本文所述的蛋白质可包括蛋白质的个体锌指之间的合适的接头的任何组合。还可参见美国专利号8,772,453。

因此，诸如ZFN、TALEN和/或大范围核酸酶的核酸酶可以包括任何DNA结合结构域以及任何核酸酶(切割)结构域(切割结构域，切割半结构域)。如上所述，切割结构域可以与DNA结合结构域是异源的，例如，锌指或TAL效应物DNA结合结构域和来自某一核酸酶的切割结构域或大范围核酸酶DNA结合域和来自另一核酸酶的切割结构域。异源切割结构域可获自任何内切核酸酶或外切核酸酶。可衍生出切割结构域的示范性核酸内切核酸酶，包括但不限于限制性内切核酸酶和寻靶内切核酸酶。参见例如，马萨诸塞州贝弗利(Beverly,MA)的NEB公司的2002-2003产品目录；和Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-338。已知切割DNA的其它酶(例如，S1核酸酶、绿豆核酸酶、胰DNA酶I、微球菌核酸酶、酵母HO核酸内切酶；还参见Linn等编，Nucleases(《核酸酶》)，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)，1993)。可将一种或多种这些酶(或其功能性片段)用作切割结构域和切割半结构域的来源。

类似地，切割活性需要二聚化的切割半结构域可衍生自任何核酸酶或其部分，正如前文所述。一般而言，如果融合蛋白包含切割半结构域，则需要两种融合蛋白供于切割。或者，可使用包含两个切割半结构域的单个蛋白。这两个切割半结构域可衍生自同一核酸内切核酸酶(或其功能性片段)，或各切割半结构域可衍生自不同的核酸内切核酸酶(或其功能性片段)。此外，优选两种融合蛋白的靶位点相对彼此排列，从而这两种融合蛋白与其各自靶位点的结合将切割半结构域放置为能使切割半结构域形成功能性切割结构域(例如，通过二聚化)的彼此空间定位。因此，在某些实施方式中，这些靶位点的邻近边缘间隔有5-8个核苷酸或15-18个核苷酸。然而,可在两个靶位点之间介入任何整数个核苷酸或核苷酸对(例如，2-50个核苷酸对或更多)。一般而言，切割的位点位于靶位点之间，但是可能位于离该切割位点1或多个千碱基的位置，包括离该切割位点1-50碱基对之间(或其间的任何值，包括1-5、1-10和1-20碱基对)、1-100碱基对(或其间的任何值)、100-500碱基对(或其间的任何值)、500-1000碱基对(或其间的任何值)或甚至超过1kb。

限制性内切核酸酶(限制性酶)存在于许多物种中，其能够序列特异性结合DNA(在识别位点处)，并在结合位点处或其附近切割DNA。某些限制性酶(例如，IIS型)在从识别位点移除的位点处切割DNA并具有可分开的结合与切割结构域。例如，IIS型酶Fok I催化DNA的双链切割，其一是距其识别位点9个核苷酸处，而另一是距其识别位点13个核苷酸处。参见例如，美国专利5,356,802、5,436,150和5,487,994；以及Li等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.US A89:4275-4279；Li等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim等(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。因此，在一实施方式中，融合蛋白包括来自至少一种IIS型限制性酶的切割结构域(或切割半结构域)和一种或多种经或未经工程改造的锌指结合域。

Fok I是示例性IIS型限制性酶，其切割结构域可与结合域分离。该具体酶作为二聚体具有活性。Bitinaite等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10,570-10,575。因此，就本公开的目的而言，认为所述融合蛋白所用Fok I酶的部分是切割半结构域。因此，对于利用锌指-Fok I融合体的靶向双链切割和/或靶向细胞序列置换，可使用各自含有一个FokI切割半结构域的两种融合蛋白重建催化活性的切割结构域。或者，也可使用含有锌指结合域和两个Fok I切割半结构域的单一多肽分子。采用锌指-Fok I融合的靶向切割和靶向序列变化的参数在本申请他处提供。

切割结构域或切割半结构域可以是保留切割活性或保留多聚化(例如，二聚化)能力以形成功能性切割结构域的蛋白质任意部分。

通过引用全文纳入本文的国际公开WO 07/014275中描述了示例性IIS型限制性酶。其它限制性酶还包含可分开的结合和切割结构域，并且这些是本发明所设想的。参见例如Roberts等.(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420。

在某些实施方式中，切割结构域包含一个或多个经工程改造的切割半结构域(也称作二聚化结构域突变体)，其同二聚作用降至最小或被阻止，例如，如美国专利号7,914,796；8,034,598和8,623,618；和美国专利公开号20110201055所述，所有公开通过引用全文纳入本文。位于Fok I位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538的氨基酸残基都是影响Fok I切割半结构域二聚化的靶标。

能形成专性异二聚体的示例性工程改造Fok I切割半结构域包括这样的对：第一切割半结构域包括Fok I位置490和538处氨基酸残基的突变，和第二切割半结构域包括氨基酸残基486和499处的突变。

因此，在一实施方式中，490位的突变将Glu(E)替换为Lys(K)；538位的突变将Iso(I)替换为Lys(K)；486位的突变将Gln(Q)替换为Glu(E)；而499位的突变将Iso(I)替换为Lys(K)。具体地，制备本文所述经工程改造的切割半结构域是通过在一个切割半结构域中对位置490(E→K)和538(I→K)进行突变来产生名为“E490K:I538K”的经工程改造切割半结构域，并通过另一切割半结构域中对位置486(Q→E)和499(I→L)进行突变来产生名为“Q486E:I499L”的经工程改造切割半结构域。本文所述的经工程改造的切割半结构域是专性杂二聚体突变型，其中异常切割被最小化或废除。参见例如，美国专利号7,914,796和8,034,598，其公开内容通过引用其全文纳入本文用于所有目的。在某些实施方式中，经工程改造的切割半结构域包括位于位置486、499和496(根据野生型FokI编号)的突变，例如突变将位置486的野生型Gln(Q)残基替换为Glu(E)残基，将位置499的野生型Iso(I)残基替换为Leu(L)残基，以及将位置496的野生型Asn(N)残基替换为Asp(D)或Glu(E)残基(还分别称作“ELD”和“ELE”结构域)。在其它实施方式中，经工程改造的切割半结构域包括在位置490、538和537(相对于野生型FokI编号)的突变，例如突变将位置490的野生型Glu(E)残基替换为Lys(K)残基，将位置538位野生型的Iso(I)残基替换为Lys(K)残基，并且将位置537位的野生型His(H)残基替换为Lys(K)或Arg(R)残基(还分别称作“KKK”和“KKR”结构域)。在其它实施方式中，经工程改造的切割半结构域包括在位置490和537(相对于野生型FokI编号)的突变，例如突变将位置490的野生型Glu(E)残基替换为Lys(K)残基，并且将位置537的野生型His(H)残基替换为Lys(K)残基或Arg(R)残基(也分别被称作“KIK”和“KIR”结构域)。参见例如美国专利号7,914,796；8,034,598和8,623,618，其公开内容通过引用其全文纳入本文用于所有目的。在其他实施方式中，工程改造的七个结构域包括“Sharkey”和/或“Sharkey”突变(参见Guo等,(2010)J.Mol.Biol.400(1):96-107)。

或者，核酸酶可利用称为“分裂-酶(split-enzyme)”的技术(参见例如，美国专利公开号20090068164)在核酸靶位点处体内组装。这类分裂酶的组件可在另外的表达构建物上表达，或者可以连接于单独的组件相互分开的某一开放读框中，例如，组件由自切割2A肽或IRES序列分开。组件可以是单独的锌指结合域或大范围核酸酶核酸结合域的结构域。

核酸酶(例如，ZFN和/或TALEN)可在使用前针对活性进行筛选，例如，在如美国专利号8,563,314中所述的基于酵母的染色体系统中。

在某些实施方式中，核酸酶包括CRISPR/Cas系统。编码该系统RNA组分的CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复)基因座以及编码蛋白质(Jansen等,2002.Mol.Microbiol.43:1565-1575；Makarova等,2002.Nucleic Acids Res.30:482-496；Makarova等,2006.Biol.Direct 1:7；Haft等,2005.PLoS Comput.Biol.1:e60)的Cas(CRISPR相关的)基因座组成了CRISPR/Cas核酸酶系统的基因序列。微生物宿主中的CRISPR基因座包含这样的组合，所述组合是CRISPR-相关(Cas)基因以及能够对CRISPR介导的核酸切割的特异性进行编程的非编码RNA元件。

II型CRISPR是充分表征的系统之一，并且以4个连续步骤进行靶向的DNA双链断裂。第一，由CRISPR基因座转录两个非编码RNA、前-crRNA阵列和tracrRNA。第二，将tracrRNA杂交至前-crRNA的重复区域，并且介导前-crRNA向包含单独的间隔子序列的成熟crRNA的过程。第三，成熟的crRNA:tracrRNA复合物经由沃森-克里克碱基配对指导Cas至靶DNA，其位于crRNA上的间隔子和原型间隔子邻近基序(PAM)旁边的靶DNA上的原型间隔子之间，所述PAM是靶标识别的额外要求。最后，Cas9介导靶DNA的切割以在原型间隔子内产生双链断裂。CRISPR/Cas系统的活性包括3步：(i)将外来DNA序列插入CRISPR阵列防止未来的攻击，通过被称之为“适应”的过程，(ii)表达相关蛋白质，以及表达并处理该阵列，然后(iii)对外来核酸进行RNA介导的干扰。因此，在细菌细胞中，多个所谓的“Cas”的蛋白质涉及CRISPR/Cas系统自然功能，并且在诸如插入外来DNA等的功能中起作用。

在一些实施方式中，使用CRISPR-Cpf1系统。在弗朗西斯氏菌种(Francisellaspp)中鉴定的CRISPR-Cpf1系统是2型CRISPR-Cas系统，其在人细胞中介导稳健的DNA干扰。尽管功能性保守，Cpf1和Cas9在许多方面不同，包括在其向导RNA和底物特异性上(参见Fagerlund等,(2015)Genom Bio 16:251)。Cas9和Cpf1蛋白之间主要的区别在于Cpf1并不利用tracrRNA，并且因此仅需要crRNA。FnCpf1crRNA长度为42–44个核苷酸(19个核苷酸的重复以及23–25个核苷酸的间隔子)，并且包含单一的茎环，其耐受维持二级结构的序列变化。此外，Cpf1crRNA显著短于Cas9所需的约100个核苷酸的工程改造的sgRNA，并且对FnCpfl的PAM需求是置换链上的5′-TTN-3′和5′-CTA-3′。尽管Cas9和Cpf1都在靶DNA中产生双链断裂，Cas9使用其RuvC-和HNH-样结构域以在向导RNA的种子序列内产生钝端切口，然而Cpf1使用RuvC-样结构域以产生种子外的错位切口。因为Cpf1产生的错位切口远离关键的种子区域，NHEJ将不会破坏靶位点，因此保证Cpf1可以继续切割相同位点直到所需的HDR重组事件发生。因此，在本文所述的方法和组合物中，应当理解的术语“Cas”包括Cas9和Cpf1蛋白。因此，本文所用“CRISPR/Cas系统”指CRISPR/Cas和/或CRISPR/Cpf1系统，同时包括核酸酶和/或转录因子系统。

在某些实施方式中，Cas蛋白可以是天然产生的Cas蛋白的"功能性衍生物"。天然序列多肽的“功能性衍生物”是具有与天然序列多肽共同的定性生物性质的化合物。“功能性衍生物”包括但不限于，天然序列的片段或天然序列多肽的衍生物及其片段，前提是它们具有与相应的天然序列多肽共同的生物活性。本文所预期的生物活性是功能性衍生物将DNA底物水解成片段的能力。术语“衍生物”涵盖多肽的氨基酸序列变体，共价修饰，和其融合体。Cas多肽合适的衍生物或其片段包括但不限于Cas蛋白的突变体、融合体、共价修饰物或其片段。包括Cas蛋白或其片段的Cas蛋白以及Cas蛋白或其片段的衍生物可以获得自细胞或通过化学合成或通过这两种方法的组合。该细胞可以是天然产生Cas蛋白的细胞，或这样的细胞，该细胞天然产生Cas蛋白并经遗传工程改造以较高的表达水平产生内源性Cas蛋白或由异源导入的核酸产生Cas蛋白，该核酸编码与内源性Cas相同或不同的Cas。在一些情况中，细胞天然不产生Cas蛋白，但是经遗传工程改造以产生Cas蛋白。

靶向TCR基因的示例性CRISPR/Cas核酸酶系统以及其它基因公开在例如美国专利公开号20150056705中。

核酸酶可以在靶位点中产生一个或多个双链和/或单链切割。在某些实施方式中，核酸酶包括催化灭活的切割结构域(例如，FokI和/或Cas蛋白)。参见例如，美国专利号9,200,266；8,703,489，以及Guillinger等(2014)Nature Biotech.32(6):577-582。催化灭活的切割结构域可以与催化激活的结构组合，作为切口酶以产生单链切割。因此，可以联用两种切口酶以在特定区域产生双链切割。本领域已知其它切口酶，例如，AMcCaffery等(2016)Nucleic Acids Res.44(2):e11.doi:10.1093/nar/gkv878.电子出版于2015年10月19日。

递送

蛋白质(例如，转录因子、核酸酶、TCR和CAR分子)、多核苷酸和/或包括本文所述的蛋白质和/或多核苷酸的组合物，可以通过任何合适的手段递送至靶细胞，包括例如，通过注射蛋白质和/或mRNA组分。

合适的细胞包括但不限于真核和原核细胞和/或细胞系。由此类细胞产生的所述细胞或细胞系的非限制性示例包括T细胞、COS、CHO(例如，CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)和perC6细胞，以及昆虫细胞例如草地贪夜蛾(Spodoptera fugiperda)(Sf)，或真菌细胞例如酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces)。在某些实施方式中，细胞系是CHO-K1、MDCK或HEK293细胞系。合适的细胞还包括干细胞例如，举例而言，胚胎干细胞、诱导型多能干细胞(iPS细胞)、造血干细胞、神经元干细胞和间充质干细胞。

递送包括本文所述DNA结合结构域的蛋白质的方法可见述于，例如，美国专利号6,453,242；6,503,717；6,534,261；6,599,692；6,607,882；6,689,558；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219和7,163,824，其公开内容通过引用其全文纳入本文。

DNA结合结构域以及包括本文所述这些DNA结合结构域的融合蛋白还可以使用包含编码一种或多种DNA结合蛋白的序列的载体递送。此外，还可以经由这些载体递送其它核酸(例如，供体)。可采用任何载体系统，包括但不限于，质粒载体、逆病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体和腺相关病毒载体等。还参见例如，美国专利号6,534,261、6,607,882、6,824,978、6,933,113、6,979,539、7,013,219；和7,163,824，其通过引用全文纳入本文。此外，应明了，如果合适，这些载体中的任一种可包括一种或多种DNA结合蛋白-编码序列和/或其它合适的核酸。因此，当一种或多种本文所述的DNA结合蛋白被导入细胞时，并且其它DNA如果合适，它们可以被相同载体或不同载体携载。当采用多重载体时，各载体可以包括编码一种或多种DNA结合蛋白的序列，以及所需的其它核酸。

可采用传统的基于病毒和非病毒的转基因方法来将编码经工程改造的DNA结合蛋白的核酸导入细胞(例如，哺乳动物细胞)和靶组织，并且共导入所需的其它核苷酸序列。这样的方法也可用于体外给予核酸(例如，编码DNA结合蛋白和/或供体)至细胞。在某些实施方式中，给予的核酸，用于体内或离体基因治疗应用。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、裸核酸和与递送载体(例如脂质体、脂质纳米颗粒或泊咯沙姆)复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其在递送至细胞后具有附加体或整合的基因组。对于基因治疗法的综述，参见Anderson,Science 256:808-813(1992)；Nabel和Felgner,TIBTECH 11:211-217(1993)；Mitani和Caskey,TIBTECH 11:162-166(1993)；Dillon,TIBTECH 11:167-175(1993)；Miller,Nature 357:455-460(1992)；Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988)；Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36(1995)；Kremer和Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995)；Haddada等,刊于《微生物与免疫学热门主题》(Current Topics in Microbiology and Immunology)Doerfler与B鰄m(编)(1995)；和Yu等,Gene Therapy 1:13-26(1994)。

非病毒递送核酸的方法包括电穿孔、脂质转染、显微注射、基因枪、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸偶联物、裸DNA、mRNA、人工病毒粒，和试剂增强型DNA摄取。利用例如Sonitron 2000系统(Rich-Mar)的声孔效应也可用于递送核酸。在一个优选实施方式中，一种或多种核酸以mRNA形式递送。也优选采用加帽的mRNA来增加翻译效率和/或mRNA稳定性。尤其优选ARCA(防倒转帽类似物)帽或其变化形式。参见美国专利号7,074,596和8,153,773，其通过引用纳入本文。

其它示例性的核酸递送系统包括Amaxa生物系统公司(德国科隆)、迈克赛特公司(Maxcyte,Inc.)(马里兰州罗克韦尔)、BTX分子递送系统公司(马萨诸塞州霍利斯顿)和哥白尼治疗公司(Copernicus Therapeutics Inc.)(参见例如US6008336)提供的那些。脂质转染描述于例如，美国专利号5,049,386、4,946,787和4,897,355，并且脂质转染试剂市售可得(例如，Transfectam^TM，Lipofectin^TM，和Lipofectamine^TMRNAiMAX)。适于多核苷酸的高效受体-识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括那些Felgner、WO 91/17424、WO 91/16024的那些。可以递送至细胞(离体给予)或靶组织(体内给予)。

脂质:核酸复合物(包括靶向脂质体，例如免疫脂质复合物)的制备是本领域技术人员熟知的(参见例如,Crystal,Science 270:404-410(1995)；Blaese等,Cancer GeneTher.2:291-297(1995)；Behr等,Bioconjugate Chem.5:382-389(1994)；Remy等,Bioconjugate Chem.5:647-654(1994)；Gao等,Gene Therapy 2:710-722(1995)；Ahmad等,Cancer Res.52:4817-4820(1992)；美国专利号4,186,183,4,217,344,4,235,871,4,261,975,4,485,054,4,501,728,4,774,085,4,837,028和4,946,787)。

递送的其它方法包括将待被递送的核酸包装到EnGeneIC递送载体(EDV)中。采用双特异性抗体将这些EDV被特异性递送至靶组织，其中，所述抗体的一个臂对靶组织具有特异性，而另一个臂对EDV具有特异性。抗体将EDV带至靶细胞表面，然后EDV通过内吞作用进入细胞。一旦进入细胞，即释放内容物(参见MacDiarmid等(2009)Nature Biotechnology27(7):643页)。

使用基于RNA或DNA病毒的系统递送编码经工程改造的DNA结合蛋白的核酸和/或所需要的供体(例如，CAR或ACTR)利用高度演化的过程来将病毒靶向身体中特定的细胞并且将该病毒负荷运输至核。病毒载体可直接给予患者(体内)或其可用于体外处理细胞，并将经修饰的细胞给予患者(离体)。用于递送核酸的常规的基于病毒的系统包括但不限于，用于基因传递的逆病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关、牛痘和单纯性疱疹病毒载体。宿主基因组中的整合可采用逆病毒、慢病毒和腺相关病毒基因传递方法进行，通常导致插入的转基因的长期表达。此外，已在许多不同的细胞类型和靶组织中观察到了高转导功效。

逆病毒的趋性可通过引入外来包膜蛋白、扩大靶细胞的潜在靶群体来改变。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞的逆病毒载体，并且通常产生高病毒效价。逆病毒转基因系统的选择取决于靶组织。逆病毒载体包含顺式作用的长末端重复，其具有包装长达6-10kb的外来序列的能力。最小的顺式作用的LTR足以用于载体的复制和包装，其随后用于将治疗基因整合进入靶细胞，以提供永久的转基因表达。广泛应用的逆病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、类人猿免疫缺陷型病毒(SIV)、人类免疫缺陷型病毒(HIV)，及其组合的那些(参见例如，Buchscher等.,J.Virol.66:2731-2739(1992)；Johann等.,J.Virol.66:1635-1640(1992)；Sommerfelt等.,Virol.176:58-59(1990)；Wilson等.,J.Virol.63:2374-2378(1989)；Miller等.,J.Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。

在其中优选瞬时表达的应用中，可采用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中获得极高的转导效率，并且不需要细胞分裂。采用这种载体，已获得了高效价和高水平的表达。该载体可在相对简单的系统中大量产生。腺相关病毒(“AAV”)载体也用于用靶核酸转导细胞，例如，用于核酸和肽的体外生成，以及用于体内和离体基因治疗法(参见例如,West等.,Virology160:38-47(1987)；美国专利号4,797,368；WO 93/24641；Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801(1994)；Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)。重组AAV载体的构建描述于多个公开文本中，包括美国专利号5,173,414；Tratschin等.，Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin等.，Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat和Muzyczka，PNAS USA 81:6466-6470(1984)；和Samulski等.，J.Virol.63:03822-3828(1989)。

目前有至少六种病毒载体法可用于临床试验中的基因传递，其采用通过将基因插入辅助细胞系来产生转导剂进行涉及缺陷型载体的互补的方法。

pLASN和MFG-S是已用于临床试验的逆病毒载体的示例(Dunbar等.，Blood 85:3048-305(1995)；Kohn等.，Nat.Med.1:1017-102(1995)；Malech等.，PNAS USA 94:2212133-12138(1997))。PA317/pLASN是用于基因治疗试验的第一治疗载体。(Blaese等.，Science 270:475-480(1995))。已在MFG-S包装的载体中观察到50％或更高的转导功效。(Ellem等.,Immunol Immunother.44(1):10-20(1997)；Dranoff等.,Hum.Gene Ther.1:111-2(1997)。

重组腺相关病毒载体(rAAV)是一种具有前景的替代性基因递送系统，其基于缺陷型和非病原性细小病毒腺相关2型病毒。全部载体源自仅保留侧接转基因表达盒的AAV145bp反向末端重复的质粒。高效的基因转移和稳定的转基因递送是该载体系统的关键特征，这归因于向转导的细胞的基因组的整合。(Wagner等.,Lancet 351:9117 1702-3(1998),Kearns等.,Gene Ther.9:748-55(1996))。其它AAV血清型，包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV 8.2、AAV9和AAVrh10和假型化的AAV，如AAV2/8、AAV2/5和AAV2/6，也可根据本发明使用。

复制缺陷型重组腺病毒载体(Ad)可以高效价生成，并且容易地感染多种不同的细胞类型。大多数腺病毒载体是经工程改造的，从而转基因替代了Ad E1a、E1b和/或E3基因；随后该复制缺陷型载体在提供缺失反式基因功能的人293细胞中传播。Ad载体可体内转导多种类型的组织，包括不分裂的、分化的细胞，例如发现于肝、肾和肌肉中的那些。传统的Ad载体具有较大携载能力。临床试验中Ad载体应用的一个示例涉及用于采用肌内注射进行抗肿瘤免疫的多核苷酸治疗(Sterman等.，Hum.7:1083-9(1998))。临床试验中用于转基因的腺病毒载体的应用的其它示例包括Rosenecker等.，Infection 24:1 5-10(1996)；Sterman等.，Hum.Gene Ther.9:7 1083-1089(1998)；Welsh等.,Hum.Gene Ther.2:205-18(1995)；Alvarez等.,Hum.Gene Ther.5:597-613(1997)；Topf等.,Gene Ther.5:507-513(1998)；Sterman等.,Hum.Gene Ther.7:1083-1089(1998)。

采用包装细胞来形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。所述细胞包括293细胞，其包装腺病毒和AAV，和ψ2细胞或PA317细胞，其包装逆病毒。用于基因治疗的病毒载体通常由将核酸载体包装成病毒颗粒的生产细胞系产生。所述载体通常包含包装和后续整合进入宿主(若可行)所需的最小病毒序列，其它病毒序列被编码待表达的蛋白质的表达盒所替代。失去的病毒功能通过包装细胞系以反式提供。例如，用于基因治疗的AAV载体通常仅加工来自AAV基因组的反向末端重复(ITR)序列，其为包装和整合进入宿主基因组所需。病毒DNA被包装进入细胞系，其包含编码其它AAV基因，即rep和cap，但缺乏ITR序列的辅助质粒。所述细胞系也用腺病毒(作为辅助物)感染。辅助病毒促进AAV载体的复制和AAV基因从辅助质粒的表达。因为缺乏ITR序列，辅助质粒不以显著的量包装。腺病毒的污染可通过，例如，热处理(相比AAV，腺病毒对热处理更为敏感)来减少。此外，可以使用杆状病毒系统生产AVV(参见例如，美国专利号6,723,551和7,271,002)。

由293或杆状病毒系统纯化AAV颗粒通常涉及使产生病毒的细胞生长，然后由该细胞上清液收集病毒颗粒，或裂解该细胞并由粗裂解物收集病毒。然后通过本领域技术人员已知的方法纯化AAV，包括离子交换色谱(例如，参见美国专利号7,419,817和6,989,264)，离子交换色谱和CsCl密度离心(例如，PCT公开WO2011094198A10)，免疫亲和力色谱(例如，WO2016128408)或使用AVB琼脂糖的纯化(例如，GE医疗生命科学公司(GE Healthcare LifeSciences))。

在许多基因治疗应用中，希望将基因治疗载体以高度特异性递送至特定组织类型。因此，病毒载体可经修饰以通过将配体表达成与病毒包衣蛋白融合的位于病毒外表面上的蛋白来具有针对给定细胞类型的特异性。选择对于已知存在于感兴趣的细胞类型上的受体具有亲和力的配体。例如，Han等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9747-9751(1995)，报道了莫洛尼鼠白血病病毒可经修饰以表达融合至gp70的人调蛋白，并且该重组病毒感染表达人表皮生长因子受体的某些人乳腺癌细胞。该原理可延伸至其它病毒-靶细胞对，其中靶细胞表达受体，并且病毒表达包含针对该细胞表面受体的配体的融合蛋白。例如，丝状噬菌体可经工程改造以显示对于几乎任何所选细胞受体具有特异性结合亲和力的抗体片段(例如，FAB或Fv)。尽管上文描述主要应用至病毒载体，相同的原理可应用至非病毒载体。所述载体可经工程改造以包含特定的摄取序列，其有利于被特定靶细胞摄取。

基因治疗载体可通过给予个体患者来体内递送，通常通过全身性给予(例如，静脉内、腹膜内、肌内、皮下，或颅内输注)或局部施用，如下所述。或者，载体可离体递送至细胞，例如来自个体患者的外植的细胞(例如，淋巴细胞、骨髓抽出物、组织活检物)或通用供体造血干细胞，然后将所述再植入患者，通常在选择已纳入载体的细胞之后进行。

用于诊断、研究、抑制或用于基因治疗(例如，通过重新输注转染的细胞进入宿主生物体)的离体细胞转染是本领域技术人员熟知的。在一个优选实施方式中，细胞从对象机体分离，用DNA结合蛋白核酸(基因或cDNA)转染，并重新输注回对象机体(例如，患者)。合适于离体转染的多种细胞类型是本领域技术人员熟知的(参见例如，Freshney等.，《动物细胞 培养，基础技术手册》(Culture of Animal Cells，A Manual of Basic Technique)(第三版.1994))本文所引的参考内容是关于讨论如何分离和培养来自患者的细胞)。

在一个实施方式中，细胞转染和基因治疗的离体方案中采用干细胞。采用干细胞的好处是，它们可以体外分化成其它细胞类型，或可被导入哺乳动物(例如细胞的供体)，在此其将接植入骨髓。采用细胞因子例如GM-CSF、IFN-γ和TNF-α将CD34+细胞体外分化成临床上重要的免疫细胞类型的方法是已知的(参见Inaba等.，J.Exp.Med.176:1693-1702(1992))。

采用已知方法分离干细胞用于转导和分化。例如，干细胞也可通过骨髓细胞用结合不需要细胞的抗体筛选而从骨髓细胞中分离，所述细胞例如CD4⁺和CD8+(T细胞)、CD45⁺(panB细胞)、GR-1(粒细胞)和Iad(分化抗原呈递细胞)(参见Inaba等.,J.Exp.Med.176:1693-1702(1992))。

在一些实施方式中，可采用已经修饰的干细胞。例如，可将被制成抗凋亡的神经元干细胞用作治疗组合物，其中所述干细胞还包含本发明的ZFP TF。对于凋亡的抗性可来自于，例如，通过采用BAX-或BAK特异性ZFN敲除干细胞中的BAX和/或BAK(参见，美国专利申请号12/456,043)，或干扰胱冬酶的那些，同样采用例如胱冬酶6特异性ZFN。可以用已知调节TCR的ZFP TF转染这些细胞。

也可将包含治疗性DNA结合蛋白(或编码这些蛋白质的核酸)的载体(例如，逆病毒、腺病毒、脂质体等)直接给予机体用于体内细胞转导。或者，可给予裸DNA。给予通过常用于导入分子并最终与血液或组织细胞接触的任何常规途径进行，包括但不限于，注射、输注、局部施用和电穿孔。合适的给予所述核酸的方法可得且为本领域技术人员熟知，并且，尽管可利用超过一种途径给予特定组合物，某特定途径通常能提供比另一途径更直接和更有效的反应。

用于将DNA导入造血干细胞的方法公开于，例如，美国专利号5,928,638。可用于将转基因导入造血干细胞(例如，CD34⁺细胞)的载体包括腺病毒第35型。

合适于将转基因导入免疫细胞(例如，T细胞)的载体包括非整合型慢病毒载体。参见例如Ory等.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11382-11388；Dull等.(1998)J.Virol.72:8463-8471；Zuffery等.(1998)J.Virol.72:9873-9880；Follenzi等.(2000)Nature Genetics 25:217-222。

药学上可接受的运载体部分取决于需给予的特定组合物以及用来给予组合物的特定方法。因此，有多种合适的药物组合物制剂可用，如下所述(参见例如，Remington’sPharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)；第17版，1989)。

如上所述，公开的方法和组合物可用于任何类型的细胞，包括但不限于，原核细胞、真菌细胞、古细菌细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞、脊椎动物细胞、哺乳动物细胞和人细胞，包括任何类型的T细胞和干细胞。用于蛋白质表达的合适的细胞系是本领域技术人员已知的，并且可包括但不限于COS、CHO(例如，CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)、perC6、昆虫细胞例如草地贪夜蛾(Spodoptera fugiperda)(Sf)，和真菌细胞例如酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces)。也可采用这些细胞系的子代、变体和衍生物。

应用

公开的组合物和方法可用于其中希望调控B2M表达和/或功能性的任何应用，包括但不限于，需要B2M调控的治疗和研究应用。例如，公开的组合物可以体内和/或离体(细胞疗法)使用以破坏T细胞中内源性B2M的表达，所述T细胞经修饰用于过继细胞治疗以表达一种或多种外源性CAR，外源性TCR，外源性ACTR或其它癌症特异性受体分子，从而治疗和/或预防癌症。此外，在这样的设置中，调节细胞内B2M表达可以清除或大幅度降低与健康、非靶向组织不需要的交叉反应的风险(即，移植物抗宿主响应)。

方法和组合物还包括干细胞组合物，其中，该干细胞内的B2M基因经调控(修饰)，并且细胞还包括ACTR和/或CAR和/或分离的或工程改造的TCR。例如，B2M敲除或敲减调控的同种异体造血干细胞可以在骨髓融除之后被导入HLA不匹配的患者。这些改变的HSC将允许患者的再定殖(re-colonization)，但是将不会引起潜在的GvHD。导入的细胞可能还具有其它改变以在后续治疗(例如，化疗耐药性)其间帮助治疗潜在的疾病。无HLA细胞还具有作为创伤患者急诊情况下的“现成(off the shelf)”疗法的应用。

本发明的方法和组合物也可用于设计和实现体外和体内模型，例如，B2M和/或HLA和相关病症的动物模型，其允许研究这些病症。

本文中提及的所有专利、专利申请和出版物均以参考的方式用全文纳入本文。

尽管出于理解和清楚的目的，本发明通过说明和示例的方式提供了一些细节，但本领域技术人员可理解在不偏离本发明的精神或范围的情况下可实施各种改变和改进。因此，上述说明和实施例不应理解为是限制性的。

实施例

实施例1：设计B2M特异性核酸酶

构建B2M特异性ZFN，以实现位于B2M基因处双链断裂的位点特异性导入。主要由Urnov等(2005)Nature 435(7042):646-651，Lombardo等(2007)Nat Biotechnol.十一月；25(11):1298-306，和美国专利公布号2008-0131962、2015-016495、2014-0120622、2014-0301990和美国专利8,956,828中所述设计ZFN。ZFN对靶向B2M基因恒定区的不同位点(参见图1)。针对示例性ZFN对的识别螺旋以及靶序列见下表1和表2所示。B2M锌指设计的靶位点如第一栏所示。被ZFP识别螺旋靶向的靶位点中的核苷酸以大写字母表示；未被靶向的核苷酸以小写字母指示。用于连接FokI核酸酶结构域和ZFP DNA结合结构域的接头也同样示出(参见，美国专利公开号20150132269)。例如，结构域接头L0的氨基酸序列是DNA结合结构域-QLVKS-FokI核酸酶结构域(SEQ ID NO:3)。类似地，结构域接头N7a的氨基酸序列是FokI核酸酶结构域-SGTPHEVGVYTL-DNA结合结构域(SEQ ID NO:4)，并且N6a是FokI核酸酶结构域-SGAQGSTLDF-DNA结合结构域(SEQ ID NO:5)。

表1：B2M锌指设计

测试所有的ZFN，并且发现它们结合其靶位点，并发现作为核酸酶的活性。

同样构建了针对酿脓链球菌(S.pyogenes)CRISPR/Cas9系统的向导RNA，用于靶向B2M基因。下表2A中指示了B2M基因中的靶序列以及向导RNA序列。在CRISPR/Cas9系统中测试所有的向导RNA，并且发现其具有活性。位于一些向导序列的5'末端的小写字母“g”指示在PAM序列中作用的添加的G核苷酸。

表2A：人B2M恒定区的向导RNA

TALEN被用作靶向B2M基因座并且在下表2B中示出。所有的TALEN在K562细胞中测试，并且被认为是具有活性的(参见表2C和图2B)。

表2B：对B2M具有特异性的TALEN

来自表2B的TALEN以每次反应25、100或400ng的不同浓度的各TALEN进行测试。所有测试的TALEN被认为结合其靶位点，并且被认为具有核酸酶的活性；示例性的数据如表2C和图2B所示。

表2C.K562细胞中TALEN对的活性

因此，本文所述核酸酶(例如，包括ZFP、TALE或sgRNA DNA结合结构域的核酸酶)结合其靶位点并且切割B2M基因，因此在包括SEQ ID NO:6-48或137-205中任一项的B2M基因中进行遗传修饰，包括在这些序列(SEQ ID NO:6-48，137-205)的任一项内的修饰(插入和/或缺失)；这些基因序列的1-50(例如，1-10)个碱基对内的修饰；配对的靶位点(对于二聚体)的靶位点之间的修饰；和/或下述一个或多个序列内的修饰：GGCCTTA、TCAAATT、TCAAAT、TTACTGA和/或AATTGAA(参见，图1)。

此外，当与一个或多个转录调节结构域相关时，所有DNA结合结构域(ZFP、TALE和sgRNA)与其靶位点结合，并且还形成活性工程改造的转录因子。

实施例2：T细胞中B2M特异性ZFN活性

在人T细胞中测试B2M特异性ZFN对的核酸酶活性。将编码ZFN的mRNA转染到纯化的T细胞中。简言之，从白细胞除去法(leukopheresis)产品中获得T细胞，并且使用美天旎(Miltenyi)公司的CliniMACS系统(CD4和CD8双选)纯化。根据生产商方案，然后使用Dynabeads(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))激活这些细胞。激活后3天，按照标准方案使用BTX 96孔电转化仪(BTX)，用两个剂量的mRNA(两种ZFN总计2或6μg)转染细胞。然后再扩增细胞7天，激活后总计10天。在第7天将细胞移除，并且使用深度测序(Miseq，亿明达公司(Illumina))分析定靶B2M修饰，并且在第10天使用HLA-A、-B和-C染色进行FACs分析。

B2M特异性ZFN对所有都在T细胞中具有活性，并且针对6μg和2μg mRNA剂量分别导致89％和83％的平均值(参见，图2)。使用的对和位置(图1中示出)在如下表3中列出。

表3：B2M特异性ZFN对和靶位点

相似地，用ZFN处理的T细胞失去HLA A、B和C表达，其中FACS分析分别在6μg和2μgmRNA剂量下显示出81％和67％HLA阴性T细胞的平均值(参见，图3)。

实施例3：向导RNA针对B2M的体外活性

在这些实验中，Cas9在pVAX质粒上提供，并且sgRNA在U6启动子的控制下在质粒上提供。质粒以各100ng或各400ng混合，并且每轮与2e5个细胞混合。使用Amaxa系统转染细胞。简言之，使用Amaxa转染试剂盒，并且使用标准Amxaa穿梭(shuttle)方案转染。转染后，让细胞在室温下复苏10分钟，然后在预热的RPMI中重悬。然后让细胞在37℃标准条件中生长。转染后7天分离基因组DNA，并且进行MiSeq分析。

如下所示数据(表4)表示以两个剂量的向导RNA检测的插入缺失(插入和缺失)百分比，并且表示不同的向导RNA在靶向的位点诱导的切割。数字表示两个实验的平均值。所有向导具有活性。

表4：CRISPR/Cas系统对B2M的活性

实施例4：原代T细胞中双重敲除B2M和TCR

本文所述B2M对也与针对TCRA的ZFN联合测试(参见下表5，以及美国临时专利申请62/269,365和62/306,500)。如实施例2中所述，获得并处理细胞。根据生产商的说明使用Maxcyte设备，将编码ZFN对的mRNA(SBS#57017/SBS#57327针对B2M，而SBS#55254/SBS#55248针对TCRA)电穿孔至细胞。简言之，在第0天激活T细胞，并且在第3天用ZFN-编码mRNA处理，其中细胞密度是3e7细胞/mL。电穿孔后进行电穿孔后的过夜30℃冷激(cold shock)。在第4天，对细胞进行计数并且分析活力，将其稀释至0.5e6细胞/mL并转移至37℃。在第7天，对细胞进行计数并且再次分析，然后将其再次稀释至0.5e6细胞/mL。在第10和14天，收获细胞的部分用于FACS和MiSeq深度测序分析。

表5：TCRA ZFN

细胞被分成4组：无ZFN对照、只有TCRA ZFN、只有B2M ZFN、以及TCRA ZFN+B2MZFN。通过FACS分析，单独针对TCRA(180μg/μL ZFN mRNA)或单独针对B2M(180μg/μL的ZFNmRNA)的ZFN集合实现高比例的切割(针对TCRA ZFN，96％CD3标志，以及针对B2M ZFN，92％HLA标志敲除(图4))。当以两种类型的ZFN对(均为180μg/μL)处理细胞时，82％的细胞失去CD3和HLA标志。

相似组的细胞也以不同量的所示TCRA特异性ZFN(60-250ug/uL)加60ug/mL的B2MZFN处理，并且在第10和14天，进行MiSeq深度测序(亿明达公司)以及FACs分析，其中结果如下表6所示。该结果表明以这些ZFN观测到通过NHEJ介导的插入和缺失所检测的高比例的双重敲除。

表6：对TCRA/B2M双重敲除的FACS和miSeq分析

因此，该数据证明了双重敲除B2M和TCRA使位于或邻近靶标和/或靶序列的1-50(例如，1-10)个碱基对(包括配对的靶位点之间)内和/或本文所述的核酸酶切割位点的2个基因被灭活，本文所述的核酸酶的切割位点包括B2M序列TCAAAT(图1中的位点D)和TCRA序列CCTTC，针对SBS#55254/SBS#55248TCRA特异性对的两个靶序列之间)。

实施例5：以靶向的整合双重敲除B2M和TCRA

如上所述的核酸酶(参见，实施例4)被用于灭活B2M和TCRA(参见，实施例5)，并且经由靶向的整合将供体(转基因)导入TCRA或B2M基因座。在该实验中，TCRA特异性ZFN对是SBS#55266/SBS#53853，其包括位于TCRA特异性ZFN靶位点(表5)之间的序列TTGAAA，并且B2M对是SBS#57332/SBS#57327(表1)，其包括B2M特异性ZFN靶位点之间的序列TCAAAT。

简言之，解冻T细胞(AC-TC-006)并以CD3/28dynabeads(1:3细胞：珠比)在X-vivo15T细胞培养基中激活(第0天)。2天培养后(第2天)，将AAV供体(包括GFP转基因以及TCRA或B2M基因的同源臂)添加到细胞培养物，除了没有供体的对照组也被维持。接下来的一天(第3天)，经由mRNA递送将TCRA和B2M ZFN添加到下述5组中：

(a)组1(仅有TCRA和B2M ZFN，无供体)：TCRA 120ug/mL：B2M仅为60ug/mL；

(b)组2(TCRA和B2M ZFN以及具有TCRA同源臂的供体)：TCRA 120ug/mL；B2M 60ug/mL和AAV(TCRA-hPGK-eGFP-克隆E2)1E5vg/细胞；

(c)组3(TCRA和B2M ZFN以及具有TCRA同源臂的供体)：TCRA 120ug/mL；B2M 60ug/mL：和AAV(TCRA-hPGK-eGFP-克隆E2)3E4vg/细胞；

(d)组4(TCRA和B2M ZFN以及具有B2M同源臂的供体)：TCRA 120ug/mL；B2M 60ug/mL和AAV(pAAV B2M位点D hPGK GFP)1E5vg/细胞；

(e)组5(TCRA和B2M ZFN以及具有B2M同源臂的供体)：TCRA 120ug/mL；B2M 60ug/mL和AAV(pAAV B2M位点D-hPGK GFP)3E4vg/细胞。

所有的实验都以3e7细胞/ml的细胞密度使用如美国申请号15/347,182所述方案(极端冷激(extreme cold shock))进行，并且在电穿孔后在30℃过夜培养至冷激。

接下来的一天(第4天)，将细胞稀释至0.5e6细胞/ml，并且在37℃转移至培养物。3天后(第7天)，再一次将细胞稀释至0.5e6细胞/ml。再培养3和7天后(分别为第10天和14天)，收获细胞用于FACS和MiSeq分析(稀释至0.5e6细胞/ml)。

如图5所示，GFP表达指示靶向整合成功并且获得了这样的遗传修饰的细胞，所述遗传修饰的细胞包括核酸酶位点内(或核酸酶靶位点的1-50个碱基对内，包括TTGAAA和TCAAAT内和/或配对的靶位点之间)的B2M和TCRA修饰(插入和/或缺失)。

还进行了这样的实验，其中CAR转基因被整合到B2M和/或TCRA基因座以创造表达CAR的双重B2M/TCRA敲除。

本文中提及的所有专利、专利申请和出版物均以参考的方式用全文纳入本文。

尽管出于理解清楚的目的，本发明通过说明和示例的方式提供了一些细节，但本领域技术人员可理解在不偏离本发明的精神或范围的情况下可实施各种改变和改进。因此，上述说明和实施例不应理解为是限制性的。

Claims (13)

1.一种分离的细胞，其中β2微球蛋白(B2M)基因的表达通过修饰B2M基因的外显子1或外显子2调控。

2.如权利要求1所述的细胞，其中，所述修饰通过包含DNA结合结构域和功能结构域的外源性融合分子进行，所述DNA结合结构域与SEQ ID NO:6-48或137-205中任一项所示的靶位点结合。

3.如权利要求1所述的细胞，其中，所述细胞包括插入和/或缺失，所述插入和/或缺失在SEQ ID NO:6-48或137-205中的一个或多个内；SEQ ID NO:6-48或137-205任一侧(侧接的基因组序列)上的1-10个碱基对内；或GGCCTTA、TCAAAT、TCAAATT、TTACTGA和/或AATTGAA内。

4.如权利要求1-3中任一项所述的细胞，其还包括灭活的T细胞受体基因、PD1和/或CTLA4基因。

5.如权利要求1-4中任一项所述的细胞，其还包括编码嵌合抗原受体(CAR)的转基因，编码抗体-偶联T细胞受体(ACTR)的转基因和/或编码工程改造的TCR的转基因。

6.如权利要求1-5中任一项所述的细胞，其中，所述细胞是淋巴细胞、干细胞或祖细胞。

7.如权利要求6所述的细胞，其中，所述细胞是T细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞、间充质干细胞(MSC)或造血干细胞(HSC)。

8.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-7中任一项所述的细胞。

9.一种融合分子，其包括结合B2M基因的外显子1或外显子2的DNA结合结构域以及转录调节结构域或核酸酶结构域，其中所述DNA结合结构域包括如表1中任一行所示的锌指蛋白(ZFP)，表2B中任一行所示的TALE-效应物蛋白或表2A中任一行所示的单一向导RNA(sgRNA)。

10.一种多核苷酸，其编码权利要求9所述的融合分子。

11.如权利要求10所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸是病毒载体、质粒或mRNA。

12.一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向癌症对象给予如权利要求1-7中任一项所述的细胞或如权利要求8所述的药物组合物。

13.权利要求1-7中任一项所述的细胞、权利要求8所述的药物组合物或权利要求9所述的融合分子或权利要求10所述的多核苷酸在治疗癌症对象中的应用。