BR122017022360B1 - Dna genômico de algodão, molécula de ácido nucleico isolada e uso de uma planta compreendendo o evento elite - Google Patents
Dna genômico de algodão, molécula de ácido nucleico isolada e uso de uma planta compreendendo o evento elite Download PDFInfo
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Abstract
a presente invenção se refere a sementes, material de planta e plantas de algodão transgênicas específicas, caracterizada pelo fato de que esses produtos contêm um evento de transformação específico em uma localização específica no genoma de algodão. ferramentas são também providas que permitem identificação rápida e inequívoca do evento nas amostras biológicas.
Description
[001] Dividido do PI0813814-1, depositado em 09.06.2008.
[002] A presente invenção se refere a sementes, material de planta e plantas de algodão transgênicas, caracterizados por conter um evento de transformação específico, particularmente pela presença de um gene que codifica uma proteína que confere resistência a inseto, em uma localização específica no genoma do algodão. As plantas de algodão da invenção combinam o fenótipo de resistência a inseto com um desempenho agronômico, estabilidade genética e adaptabilidade a diferentes experiências genéticas equivalentes a linha de algodão não-transformada na ausência de insetos. Esta invenção ulterior- mente provê métodos e kits para a identificação da presença de material de planta compreendendo especificamente evento de transforma-ção EE-GH6 nas amostras biológicas.
[003] A expressão fenotípico de um transgene em uma planta é determinada tanto pela estrutura do próprio gene quanto por sua localização no genoma da planta. Ao mesmo tempo a presença do transgene (em um DNA exógeno) em diferentes localizações no genoma influenciará o fenótipo total da planta de diferentes modos. A introdução agronomicamente ou industrialmente bem sucedida de uma característica comercialmente interessante em uma planta por manipulação genética pode ser um procedimento comprido dependente de outros fatores diferentes. A transformação e regeneração real de plantas ge-neticamente transformadas são apenas a primeira de uma série de etapas de seleção, que incluem caracterização genética extensa, re- produção e avaliação nas experiências de campo, finalmente levando à seleção de um evento elite.
[004] Fibra de algodão é o único produto têxtil importante mundialmente. Cerca de 80 milhões de acres de algodão são coletados anualmente no globo. Algodão é a quinta maior colheita nos U.S. em termos de produção de acreage, com mais de 15 milhões de acres plantados em 2000.
[005] A espécie de inseto mais prejudicial que se alimenta com algodão são Helicoverpa zea (minhoca do milho ou lagarta do algodão), Helicoverpa armigera (lagarta americana) Heliothis virescens (gorgulho de botão de tabaco) e Helicoverpa punctigera.
[006] A identificação inequívoca de um evento elite está se tornando de modo crescente importante em virtude de um evento elite discussões no Novel Food/Feed, segregação de produtos de GMO e de não-GMO e a identificação de material de propriedade. De modo ideal, tal método de identificação é tão rápido quanto simples, sem a necessidade de uma instalação de laboratório extensiva. Além do mais, o método proveria resultados que permitem determinação inequívoca do evento elite sem interpretação de expert, mas que favoreceu sob escrutínio de expert se necessário. Ferramentas específicas para o uso na identificação de evento elite EE-GH6 nas amostras biológicas são descritas aqui.
[007] EE-GH6 foi identificado como um evento elite a partir de uma população de plantas de algodão transgênicas no desenvolvimento de algodão resistente ao inseto (Gossypium hirsutum) compreendendo um gene que codifica uma proteína de cristal inseticida de Bacillus thuringiensis. As plantas de algodão transgênicas contêm um gene quimérico que codifica uma proteína de cristal inseticida de Bt (como descrito na WO 02/057664) sob controle de um promotor expressável por planta.
[008] Plantas de algodão compreendendo um gene de resistência a inseto foram descritas na técnica. No entanto, nenhuma técnica anterior descreve, ensina ou sugere a presente invenção.
[009] A presente invenção se refere a uma semente ou planta de algodão transgênico, suas células e tecidos, compreendendo, esta- velmente integrados em seu genoma, um pacote de expressão que compreende um gene de resistência a inseto compreendendo a sequência de codificação do gene de cry2Ae (como descrito no exemplo 1.1 aqui), que é resistente a inseto e, na ausência de pressão de inseto, tem um desempenho agronômico que é substancialmente equivalente à linha isogênica não-transgênica. Sob pressão de inseto, a planta terá um fenótipo agronômico superior em comparação com a planta não-transgênica.
[0010] De acordo com a presente invenção a semente ou planta de algodão, suas células e tecidos compreendem evento elite EE- GH6.
[0011] Mais especificamente, a presente invenção se refere a uma semente, planta de algodão transgênica, suas células e tecidos, cujo DNA genômico é caracterizado pelo fato de que, quando analisado em um protocolo de identificação de PCR como descrito aqui, usando-se dois iniciadores dirigidos para a região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GH6 e o DNA exógeno, respectivamente, fornece um fragmento que é específico para EE-GH6. Os iniciadores podem ser dirigidos contra a região de flanqueamento 5' dentro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO 11 e o DNA exógeno respectivamente tais como os iniciadores compreendendo ou que consistem na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 7 respectivamente, e fornecem um fragmento de DNA de entre 100 e 700 bp, de preferência de cerca de 197 bp. Os iniciadores podem também ser dirigidos contra a região de flanqueamento 3' dentro de SEQ ID NO: 2 e o DNA exógeno respectivamente tais como os iniciadores compreendendo ou que consistem na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 3 respectivamente, e fornecem um fragmento de DNA de entre 100 e 700 bp, de preferência de cerca de 189 bp.
[0012] A semente de referência compreendendo o evento elite da invenção foi depositada na ATCC sob o número de acesso PTA-8398. Uma concretização da invenção é a semente compreendendo o evento elite EE-GH6 deposistada na ATTC número de acesso PTA-8398, que se desenvolverá para dar uma planta de algodão resistente a insetos, particularmente Helicoverpa sp. ou Heliothis sp. A semente da ATCC número de depósito PTA-8398, é uma porção de semente que consiste em pelo menos cerca de 95% de homozigoto de sementes transgênicas para o transgene, compreendendo o evento elite da invenção, que se desenvolverá para dar plantas resistentes a inseto, pelo que as plantas são também plantas tolerantes a glufosinato. A semente pode ser semeada e as plantas em desenvolvimento podem ser tratadas com glufosinato como que descrito aqui para se obter 100% de plantas tolerantes a glufosinato, compreendendo o evento elite da invenção. A invenção ulteriormente se refere a células, tecidos, progê- nie, e descendentes de uma planta compreendendo o evento elite da invenção desenvolvido a partir da semente depositada no ATCC tendo número de acesso PTA-8398. A invenção ulteriormente se refere a plantas obteníveis por propagação de e/ou reprodução com uma planta de algodão compreendendo o evento elite da invenção desenvolvido a partir de a semente depositado no ATCC tendo número de acesso PTA-8398. A invenção também se refere a plantas de algodão compreendendo o evento elite EE-GH6.
[0013] A invenção ulteriormente se refere a um método para a identificação de uma planta transgênica, ou suas células e tecidos, compreendendo o evento elite EE-GH6, método esse que é baseado por identificação da presença de sequências de DNA de caracterização ou aminoácidos codificados por tais sequências de DNA na planta transgênica, células ou tecidos. De acordo com uma concretização preferida da invenção, tais sequências de DNA de caracterização são sequências de 15 bp, de preferência 20 bp, mais de preferência 30 bp ou mais que compreendem que compreendem o sítio de inserção do evento, isto é, tanto uma parte de DNA exógeno quanto uma parte do genoma de algodão (ou a região de flanqueamento 5' ou 3') contígua com o mesmo, permitindo identificação específica do evento elite.
[0014] A presente invenção ulteriormente se refere a métodos para a identificação do evento elite EE-GH6 nas amostras biológicas, métodos esses que são baseados nos iniciadores ou sondas que especificamente reconhecem a região de flanqueamento 5' e/ou 3' de EE- GH6.
[0015] Mais especificamente, a invenção se refere a um método compreendendo da ampliação de uma sequência de um ácido nucleico presente nas amostras biológicas, usando-se uma reação de cadeia de polimerase com pelo menos dois iniciadores, um dos quais reconhece a região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GH6, ou outro que reconhece uma sequência dentro do DNA exógeno, de preferência para se obter um fragmento de DNA de entre 100 e 500 bp. Os iniciadores podem reconhecer uma sequência dentro da região de flanquea- mento 5' de EE-GH6 (SEQ ID NO 1, da posição 1 até a posição 140 ou SEQ ID NO 11 da posição 1 até a posição 463) ou dentro da região de flanqueamento 3' de EE-GH6 (complemento de SEQ ID NO 2 da posição 113 até a posição 438) e uma sequência dentro do DNA exógeno (complemento de SEQ ID NO 1 da posição 141 até 192 ou SEQ ID NO 2 da posição 1 até a posição 112), respectivamente. O iniciador que reconhece a região de flanqueamento pode compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 7 e o iniciador que reconhece uma sequência dentro do DNA exógeno pode compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 5 descrita aqui. O iniciador que reconhece a região de flanqueamento 3' pode compreender a sequência de nu- cleotídeos de SEQ ID NO 3 ou SEQ ID NO 6 e o iniciador que reconhece uma sequência dentro do DNA exógeno podem compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 4 descrita aqui
[0016] A presente invenção mais especificamente se refere a um método para a identificação do evento elite EE-GH6 nas amostras biológicas, método esse que compreende ampliação de uma sequência de um ácido nucleico presente em uma amostra biológica, usando-se uma reação de cadeia de polimerase com dois iniciadores tendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4 respectivamente, para se obter um fragmento de DNA de cerca de 189 bp ou com dois iniciadores tendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 7 respectivamente, para se obter um fragmento de DNA de cerca de 197 bp.
[0017] A presente invenção ulteriormente se refere às sequências de flanqueamento específicas de EE-GH6 descritas aqui, que podem ser usadas para desenvolver a identificação específica métodos para EE-GH6 nas amostras biológicas. Tais sequências de flanqueamento específicas podem também ser usadas como material de controle de referência nos ensaios de identificação. Mais particularmente, a invenção se refere às regiões de flanqueamento 5' e ou 3' de EE-GH6 que podem ser usadas para o desenvolvimento de sondas e iniciadores específicos como ulteriormente descritos aqui. Também adequado como material de referência são moléculas de ácido nucleico, de preferência de cerca de 180-200 bp, compreendendo a sequência que pode ser ampliada por iniciadores tendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 7 e SEQ ID NO 5 ou de SEQ ID NO 4 e SEQ ID NO 3.
[0018] A invenção ulteriormente se refere a métodos de identificação para a presença de EE-GH6 nas amostras biológicas com base no uso de tais sondas ou iniciadores específicos. Iniciadores podem consistir em uma sequência de nucleotídeos de 17 a cerca de 200 nucleo- tídeos consecutivos selecionados da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 140 ou SEQ ID NO 11 da posição 1 até a posição 463 ou o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID 2 de nucleotídeo 113 até o nucleotídeo 438) combinada com iniciadores que consistem de uma sequência de nu- cleotídeos de 17 a cerca de 200 nucleotídeos consecutivos selecionados do complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 141 até o nucleotídeo 192 ou a sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO 2 de nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 112. Iniciadores podem também compreender essas sequências de nucleotídeos localizadas em sua extremidade 3' extrema, e ulteriormente compreendem sequências não-relacionadas ou sequências derivadas das sequências de nucleotídeos mencionadas, mas compreendendo mal emparelhamentos.
[0019] A invenção ulteriormente se refere um kits para a identificação do evento elite EE-GH6 nas amostras biológicas, os ditos kits compreendendo pelo menos um iniciador ou sonda que especificamente reconhece a região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GH6 ou a re-estruturação específica dentro da sequência de DNA exógeno no EE-GH6.
[0020] O kit da invenção pode compreender, além de um iniciador que especificamente reconhece a região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GH6, um segundo iniciador que especificamente reconhece uma sequência dentro do DNA exógeno EE-GH6, para o uso em um protocolo de identificação de PCR. Os kits da invenção podem compreender pelo menos dois iniciadores específicos, um dos quais reconhece uma sequência dentro da região de flanqueamento 5' de EE-GH6, e o outro que reconhece uma sequência dentro do DNA exógeno. O iniciador que reconhece a região de flanqueamento de 5' pode compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 3 e o iniciador que reconhece o transgene pode compreender a sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO 4 ou qualquer outro iniciador ou combinação de iniciadores como descrito aqui.
[0021] A invenção ulteriormente se refere a um kit para a identificação do evento elite EE-GH6 nas amostras biológicas, o dito kit compreendendo os iniciadores de PCR tendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4 para o uso no protocolo de identificação de PCR EE-GH6 descrito aqui.
[0022] A invenção também se refere a um kit para a identificação do evento elite EE-GH6 nas amostras biológicas, kit esse que compreende uma sonda específica tendo uma sequência que corresponde (ou é complementar a) uma sequência tendo entre 80% e 100% de identidade de sequência com uma região específica EE-GH6. De preferência, a sequência da sonda corresponde a uma região específica compreendendo parte da região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GH6. Mais de preferência a sonda específica tem (ou é complementar a) uma sequência tendo entre 80% e 100% de identidade de sequência a uma sequência entre nucleotídeo 120 a 160 de SEQ ID NO 1 ou SEQ ID NO 2 de nucleotídeo 102 a 123.
[0023] De acordo com um outro aspecto da invenção, sequências de DNA são descritas compreendendo o sítio de inserção do evento e comprimento suficiente de polinucleotídeos tanto do DNA genômico do algodão e do DNA exógeno (transgene), de modo que seja útil como iniciador ou sonda para a detecção de EE-GH6. Tais sequências podem compreender pelo menos 9 nucleotídeos do DNA genômico do algodão e um número similar de nucleotídeos do DNA exógeno (trans- gene) EE-GH6 com as mesmas em cada lado do sítio de inserção res-pectivamente. Mais de preferência, tais sequências de DNA compreendem pelo menos 9 nucleotídeos do DNA genômico do algodão e um número similar de nucleotídeos do DNA exógeno contíguo com o sítio de inserção na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.
[0024] Os métodos e kits incluídos pela presente invenção podem ser usados para diferentes finalidades tais como, mas não-limitadas às seguintes: para identificar a presença ou a ausência de EE-GH6 em plantas, material de planta ou em produtos tais como, mas não- limitados a alimento ou produtos alimentícios (frescos ou processados) compreendendo ou derivados de material de planta; adicionalmente ou alternativamente, os métodos e kits da presente invenção podem ser usados para identificar material de planta transgênica para as finalidades de segregação entre material transgênico e não-transgênico; adicionalmente ou alternativamente, os métodos e kits da presente invenção podem ser usados para determinar a qualidade (isto é, percentagem de material puro) de material de planta compreendendo EE-GH6.
[0025] A invenção ulteriormente se refere às regiões de flanquea- mento 5' e/ou 3' de EE-GH6 bem como as sondas e iniciadores específicos desenvolvidos a partir das sequências de flanqueamento 5' e/ou 3' de EE-GH6.
[0026] A invenção também se refere a DNA genômico obtido a partir de plantas compreendendo o evento elite EE-GH6. Tal DNA ge- nômico pode ser usado como material de referência de controle nos ensaios de identificação aqui descritos.
[0027] Os seguintes exemplos, não se destinam a limitar a invenção a concretizações específicas descritas, podem ser entendidos em combinação com a figura anexa, incorporada aqui por referência, em que:
[0028] figura 1: representa esquematicamente a relação entre os iniciadores e sequências de nucleotídeos citados. Barra preta: DNA exógeno; barra preta listrada: re-estruturação no DNA exógeno específica para EE-GH6; barra clara: DNA de origem de planta; barra clara listrada: pré-inserção de deleção de alvo; setas: iniciadores de oligo- nucleotídeo, as figuras sob as barras representam posições de nucleo- tídeo; (c) se refere a complemento da sequência de nucleotídeos indicada; NA: não-aplicável.
[0029] figura 2: representa resultados obtidos pelo protocolo de identificação de PCR desenvolvido para EE-GH6. Sequência de carregamento do gel: Raia 1: Padrão de peso molecular (padrão de PM de 100 bp); raias 2 a 5: amostras de DNA oriundas de plantas de algodão compreendendo o evento transgênico EE-GH6; raias 6 e 7: amostras de DNA oriundas de plantas de algodão transgênicas não compreendendo o evento elite EE-GH6, mas compreendendo um gene de resistência a inseto similar; raia 8: nenhum controle de DNA de modelo; raia 9: padrão de peso molecular.
[0030] figura 3: representa resultados obtidos pelo protocolo de PCR de classificação de zigosidade desenvolvido para EE-GH6. Sequência de carregamento do gel: Raia 1: Padrão de peso molecular (padrão de PM de 100 bp); raias 2 e 3: amostras de DNA oriundas de plantas de algodão compreendendo o evento transgênico EE-GH6 na forma homozigota; raias 4 a 6: amostras de DNA oriundas de plantas de algodão compreendendo o evento transgênico EE-GH6 na forma heterozigota; raia 7: amostra de DNA de controle oriunda de planta de algodão selvagem; raia 8: nenhum controle de DNA de modelo; raia 9: padrão de peso molecular.
[0031] A incorporação de uma molécula de DNA recombinante no genoma da planta tipicamente resulta da transformação de uma célula ou tecido. O sítio particular da incorporação é usualmente devido a integração "aleatória".
[0032] O DNA introduzido para dentro do genoma da planta como um resultado da transformação de uma célula de planta ou tecido com um DNA recombinante ou "transformação de DNA", e se originando tal transformação de DNA é aqui em seguida chamado de "DNA exógeno" compreendendo um ou mais "transgenes". "DNA da planta" no contexto da presente invenção referirá-se a DNA que se origina da planta que é transformado. DNA de planta usualmente será encontrado no mesmo locus genômico na planta selvagem correspondente. O DNA exógeno pode ser caracterizado pelo locus e pela configuração no sítio de incorporação da molécula de DNA recombinante no geno- ma da planta. O sítio no genoma da planta onde um DNA recombinan- te foi inserido é também chamado do "sítio de inserção" ou "sítio alvo". Inserção do DNA recombinante para dentro da região do genoma da planta chamado de "pré-inserção de DNA de planta" pode estar ass- sociada com uma deleção de DNA de planta, chamado de "deleção de sítio alvo". Uma "região de flanqueamento" ou "sequência de flanque- amento" como usado aqui se refere a uma sequência de pelo menos 20 bp, de preferência pelo menos 50 bp, e até 5000 bp de DNA diferente do DNA introduzido, de preferência DNA a partir do genoma de planta que está localizado imediatamente a montante de e contíguo com ou imediatamente a jusante de e contíguo com o DNA exógeno. Procedimentos de transformação levando à integração aleatória do DNA exógeno resultará em transformantes com diferentes regiões de flanqueamento, que são características e únicas para cada transfor- mante. Quando o DNA recombinante é introduzido para dentro de uma planta através de cruzamento tradicional, seu sítio de inserção no ge- noma da planta, ou suas regiões de flanqueamento em geral não serão mudadas. Uma "região de inserção" como usada aqui se refere à região que corresponde à região de pelo menos 40 bp, de preferência pelo menos 100 bp, e até 10000 bp, incluída pela sequência que compreende a montante e/ou a jusante de região de flanqueamento de um DNA exógeno no genoma da planta. Levando em consideração diferenças menores devido a mutações dentro de uma espécie, uma região de inserção reterá, no cruzamento com uma planta da mesma espécie, pelo menos 85%, de preferência 90%, mais de preferência 95%, e com mais preferência 100% de identidade de sequência com a sequência compreendendo a montante e a jusante da região de flanque- amentos do DNA exógeno na planta originalmente obtida a partir de transformação.
[0033] Um evento é definido como um locus genético (artificial) que, como um resultado de engenharia genética, porta um transgene compreendendo pelo menos uma cópia de um gene de interesse. Os estados alélicos típicos de um evento são a presença ou a ausência do DNA exógeno. Um evento é caracterizado fenotipicamente pela expressão do transgene. No nível genético, um evento é parte da produção genética de uma planta. No nível molecular, um evento pode ser caracterizado pelo mapa de restrição (por exemplo, como determinado por Southern blotting), pelas sequências de flanqueamento a montante e/ou a jusante do transgene, a localização de marcadores moleculares e/ou a configuração molecular do transgene. Usualmente transformação de uma planta com uma transformação de DNA compreendendo pelo menos um gene de interesse leva a uma população de transfor- mantes compreendendo uma multiplicidade de eventos separados, cada um dos quais é único.
[0034] Um evento elite, como usado aqui, é um evento que é selecionado de um grupo de eventos, obtidos por transformação com a mesma transformação de DNA ou por retrocruzamento com plantas obtidas por tal transformação, com base na expressão e estabilidade do(s) transgene(s) e sua compatibilidade com ótimas características agronômicas da planta compreendendo-as. Assim os critérios para seleção de evento elite são um ou mais, de preferência dois ou mais, vantajosamente a totalidade dos seguintes:
[0035] a) que a presença do DNA exógeno não compromete outras características desejadas da planta, tais como aquelas que se relacionam com o desempenho agronômico ou valor comercial;
[0036] b) que o evento é caracterizado por uma configuração molecular bem definida que é estavelmente herdada e para que ferramentas apropriadas para a identidade de controle pode ser desenvolvida;
[0037] c) que o(s) gene(s) de interesse mostra(m) uma expressão fenotípica estável espacial e temporal, correta e apropriada, tanto em condição heterozigoto (ou hemizogoto) quanto homozigoto do evento, em um nível comercialmente aceitável em uma faixa de condições ambientais em que as plantas que portam o evento devem provavelmente ser exposto no uso agronômico normal.
[0038] É preferido que o DNA exógeno está associado a uma posição no genoma da planta que permite progressão fácil em bases genéticas comerciais.
[0039] O estado de um evento como um evento elite é confirmado por introgressão do evento elite em diferentes bases genéticas relevantes e concordância de observação de com um, dois ou a totalidade dos critérios, por exemplo, a), b) e c) acima.
[0040] Um "evento elite" assim se refere a um locus genético compreendendo um DNA exógeno, que responde aos critérios acima descritos. Uma planta, material de planta ou progênie tais como sementes podem compreender um mais eventos de elite em seu genoma.
[0041] As ferramentas desenvolvidas para identificar um evento elite ou a planta, material de planta compreendendo um evento elite, ou produtos que compreendem material de planta compreendendo o evento elite são baseados nas características genômicas do evento elite, tais como, um mapa de restrição específica da região genômica compreendendo o DNA exógeno, marcadores moleculares ou a sequência da região de flanqueamento(s) do DNA exógeno.
[0042] Uma vez que uma ou ambas as regiões de flanqueamento do DNA exógeno foram sequenciadas, iniciadores e sondas podem ser desenvolvidas que especificamente reconhecem essa (essas) sequên- cia(s) no ácido nucleico (DNA ou RNA) de uma amostra a título de uma técnica de biologia molecular. Por exemplo, um método de PCR pode ser desenvolvido para identificar o evento elite nas amostras biológicas (tais como amostras de plantas, material de planta ou produtos compreendendo material de planta). Tal PCR é baseado por pelo menos dois "iniciadores" específicos um que reconhece uma sequência dentro da região de flanqueamento 5' ou 3' do evento elite e o outro que reconhece uma sequência dentro do DNA exógeno. Os iniciadores de preferência têm uma sequência de entre 15 e 35 nucleotídeos que sob condições de PCR otimizadas "especificamente reconhecem" uma sequência dentro da região de flanqueamento 5' ou 3' do evento elite e o DNA exógeno do evento elite respectivamente, de modo que um fragmento específico ("fragmento de integração" ou amplicon de discrimi-nação) é ampliado a partir de uma amostra de ácido nucleico compreendendo o evento elite. Isso significa que apenas fragmento de integração direcionado, e nenhuma outra sequência no genoma da planta ou DNA exógeno, é ampliado sob condições de PCR otimizadas.
[0043] Iniciadores de PCR adequados para a invenção podem ser os seguintes:
[0044] oligonucleotídeos que variam no comprimento de 17 nucle- otídeos a cerca de 100 nucleotídeos, compreendendo a sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, de preferência 20 nucleotídeos consecutivos selecionados da sequência de flanqueamento 5' (SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 140 ou SEQ ID NO 11 da posição 1 até a posição 463) em sua extremidade 3' (iniciadores que reconhecem sequências de flanqueamento 5'); ou oligonucleotídeos que variam no comprimento de 17 nucleotí- deos a cerca de 200 nucleotídeos, compreendendo a sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, de preferência 20 nucleotídeos consecutivos, selecionados a sequência de flanqueamento 3' (complemento de SEQ ID NO 2 de nucleotídeo 113 até o nucleotídeo 438) em sua extremidade 3' (iniciadores que reconhecem sequências de flanqueamento 3'); ou oligonucleotídeos que variam no comprimento de 17 nucleotídeos a cerca de 200 nucleotí- deos, compreendendo a sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, de preferência 20 nucleotídeos selecionados de sequências de DNA inseridas (complemento de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 141 até o nucleotídeo 192) em sua extremidade 3' (iniciadores que reconhece DNA exógeno) ou
[0045] oligonucleotídeos que variam no comprimento de 17 nucle- otídeos a cerca de 40 nucleotídeos, compreendendo a sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, de preferência 20 nucleotídeos selecionados das sequências de DNA inseridas (SEQ ID NO 2 de nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 112).
[0046] Os iniciadores podem naturalmente ser mais longos do que os 17 nucleotídeos consecutivos mencionados, e podem, por exemplo, ter um comprimento de 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 nucleotí- deos ou ainda mais longo. Os iniciadores podem totalmente consistir em sequência de nucleotídeos selecionados das sequências de nucle- otídeos mencionadas das sequências de flanqueamento e sequências de DNA exógeno. No entanto, as sequências de nucleotídeo dos iniciadores em sua extremidade 5' (isto é, do lado de fora dos 17 nucleotí- deos consecutivos localizados 3') é menos crítica. Assim, a sequência 5' dos iniciadores pode consistir na sequência de nucleotídeos selecionada das sequências de flanqueamento ou DNA exógeno, quando apropriado, mas podem conter vários (por exemplo, 1, 2, 5, 10 desem- parelhamentos). A sequência 5' dos iniciadores pode ainda totalmente consistir na sequência de nucleotídeos não relacionada com as sequências de flanqueamento ou DNA exógeno, por exemplo, a sequência de nucleotídeos que representa sítios de reconhecimento de enzima de restrição. Tais sequências não-relacionadas ou sequências de flanqueamento de DNA com desemparalhamentos de preferência não seriam maiores do que 100, mais de preferência não mais do que 50 ou 25 nucleotídeos.
[0047] Além do mais, iniciadores adequados podem compreender ou consistir na sequência de nucleotídeos em sua da variação da extremidade 3' a região de união entre as sequências derivadas de DNA de planta e as sequências de DNA exógeno (localizadas nos nucleotí- deos 140-141 na SEQ ID NO 1 e nucleotídeos 112-113 na SEQ ID NO 2) com a condição de que os 17 nucleotídeos consecutivos mencionados localizados 3' não são derivados exclusivamente das sequências de DNA exógeno ou sequências derivadas na SEQ ID NO 1 ou 2.
[0048] Estará também imediatamente claro pelo técnico versado que pares de iniciador de PCR adequadamente selecionados também não compreendem sequências complementares entre si.
[0049] Para a finalidade da invenção, o "complemento da sequência de nucleotídeos representada na SEQ ID No: X" é a sequência de nucleotídeos que pode ser derivada da sequência de nucleotídeos representada por substituição dos nucleotídeos através de seu nucleotí- deo complementar de acordo com as regras de Chargaff's (AT; GC) e leitura da sequência na direção 5' a 3', isto é, em direção oposta sequência de nucleotídeos representada.
[0050] Exemplos de iniciadores adequados são as sequências de oligonucleotídeos da SEQ ID NO 7 (sequência de flanqueamento 5' que reconhece iniciadores), SEQ ID NO 5 (DNA exógeno que reconhece iniciadores para o uso com a sequência de flanqueamento 5' que reconhece iniciadores), SEQ ID NO 4 (DNA exógeno que reconhece iniciadores para o uso com a sequência de flanqueamento 3' que reconhece iniciadores), SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6 (sequência de flanqueamento 3' que reconhece iniciadores).
[0051] Outros exemplos de iniciadores de oligonucleotídeo adequados compreendem em sua extremidade 3' as seguintes sequências ou consistem de tais sequências:
[0052] a. sequência de flanqueamento 5' que reconhece iniciado- res:
[0053] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 111 até o nucleotídeo 130
[0054] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 104 até o nucleotídeo 123
[0055] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 106 até o nucleotídeo 125
[0056] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 112 até o nucleotídeo 130
[0057] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 103 até o nucleotídeo 123
[0058] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 109 até o nucleotídeo 125
[0059] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotí- deo 109 até o nucleotídeo 130
[0060] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotí- deo 113 até o nucleotídeo 130
[0061] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotí- deo 99 até o nucleotídeo 116
[0062] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotí- deo 102 até o nucleotídeo 123
[0063] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotí- deo 104 até o nucleotídeo 125
[0064] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotí- deo 108 até o nucleotídeo 130
[0065] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotí- deo 114 até o nucleotídeo 130
[0066] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotí- deo 100 até o nucleotídeo 116
[0067] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 101 até o nucleotídeo 123
[0068] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 103 até o nucleotídeo 125
[0069] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 110 até o nucleotídeo 129
[0070] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 109 até o nucleotídeo 129
[0071] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 111 até o nucleotídeo 129
[0072] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 108 até o nucleotídeo 129
[0073] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 112 até o nucleotídeo 129
[0074] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotí- deo 107 até o nucleotídeo 129
[0075] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotí- deo 113 até o nucleotídeo 129
[0076] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotí- deo 287 até o nucleotídeo 306
[0077] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotí- deo 288 até o nucleotídeo 306
[0078] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotí- deo 289 até o nucleotídeo 306
[0079] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotí- deo 290 até o nucleotídeo 306
[0080] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotí- deo 264 até o nucleotídeo 281
[0081] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotí- deo 265 até o nucleotídeo 281
[0082] b. Sequência de DNA exógeno que reconhece iniciadores para o uso com sequência de flanqueamento 5' que reconhece iniciadores:
[0083] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 140 até o nucleotídeo 159
[0084] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 140 até o nucleotídeo 158
[0085] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 139 até o nucleotídeo 158
[0086] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 140 até o nucleotídeo 160
[0087] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 167 até o nucleotídeo 184
[0088] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 136 até o nucleotídeo 157
[0089] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 139 até o nucleotídeo 157
[0090] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 140 até o nucleotídeo 157
[0091] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 139 até o nucleotídeo 159
[0092] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 140 até o nucleotídeo 161
[0093] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 140 até o nucleotídeo 156
[0094] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 139 até o nucleotídeo 156
[0095] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 136 até o nucleotídeo 158
[0096] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 139 até o nucleotídeo 160
[0097] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 139 até o nucleotídeo 155
[0098] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 139 até o nucleotídeo 161
[0099] c. sequência de flanqueamento 3' que reconhece iniciadores:
[00100] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 2 de nucleotídeo 366 até o nucleotídeo 385
[00101] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 2 de nucleotídeo 366 até o nucleotídeo 384
[00102] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 2 de nucleotídeo 366 até o nucleotídeo 386
[00103] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 2 de nucleotídeo 366 até o nucleotídeo 383
[00104] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 2 de nucleotídeo 366 até o nucleotídeo 387
[00105] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 2 de nucleotídeo 125 até o nucleotídeo 142
[00106] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 2 de nucleotídeo 366 até o nucleotídeo 382
[00107] o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 2 de nucleotídeo 94 até o nucleotídeo 115
[00108] d. Sequência de DNA exógeno que reconhece iniciadores para o uso com sequência de flanqueamento 3' que reconhece inicia- dores:
[00109] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 95 até o nucleotídeo 114
[00110] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 96 até o nucleotídeo 115
[00111] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 2 de nucleotí- deo 95 até o nucleotídeo 115
[00112] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 2 de nucleotí- deo 96 até o nucleotídeo 114
[00113] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 97 até o nucleotídeo 115
[00114] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 93 até o nucleotídeo 114
[00115] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 94 até o nucleotídeo 115
[00116] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 98 até o nucleotídeo 115
[00117] a sequência de nucleotídeos de SEQ deo 92 até o nucleotídeo 114
[00118] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 2 de nucleotí- deo 93 até o nucleotídeo 115
[00119] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 2 de nucleotí- deo 98 até o nucleotídeo 114
[00120] a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 2 de nucleotí- deo 99 até o nucleotídeo 115
[00121] Como usado aqui, "a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO Z da posição X até a posição Y" indica a sequência de nucleotí- deos incluindo ambos os pontos finais de nucleotídeo.
[00122] De preferência, o fragmento ampliado tem um comprimento entre 50 e 500 nucleotídeos, tal como um comprimento entre 100 e 350 nucleotídeos. Os iniciadores específicos podem ter uma sequência que está entre 80 e 100% idêntica a uma sequência dentro da região de flanqueamento 5' ou 3' do evento elite e o DNA exógeno do evento elite, respectivamente, com a condição de que os desempare- lhamentos ainda permitem identificação específica do evento elite com esses iniciadores sob condições de PCR otimizadas. A faixa de de- semparelhamentos possíveis no entanto, pode facilmente ser determinada experimentalmente e é facilmente determinada e é conhecida por uma pessoa versada na técnica.
[00123] Detecção de fragmentos de integração pode ocorrer de vários modos, por exemplo, via avaliação de tamanho depois da análise de gel. Os fragmentos de integração podem também ser diretamente sequenciados. Outros métodos específicos de sequência para a de-tecção de fragmentos de DNA ampliados são também conhecidos na técnica.
[00124] Uma vez que a sequência dos iniciadores e sua localização relativa no genoma são únicos para o evento elite, ampliação do frag-mento de integração ocorrerá apenas nas amostras biológicas com-preendendo (o ácido nucleico de) o evento elite. De preferência quando do desempenho de um PCR para identificar a presença de EE-GH6 nas amostras desconhecidas, um controle é incluído de um conjunto de iniciadores com os quais um fragmento dentro de um "gene governanta" da espécie de planta do evento pode ser ampliado. Genes governantas são genes que são expressos na maioria dos tipos de célula e que tratavam com atividades metabólicas básicas comuns a todas as células. De preferência, o fragmento ampliado do gene governanta é um fragmento que é maior do que o fragmento ampliado de integração. Dependendo das amostras a serem analisadas, outros controles podem ser incluídos.
[00125] Protocolos de PCR padrão são descritos na técnica, tal como no "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2a Edição, 1999) e outras referências. As ótimas condições para o PCR, incluindo a sequência dos iniciadores específicos, é especificada em um "protocolo de identificação de PCR" para cada evento elite. É no entanto entendido que numerosos parâmetros no protocolo de identificação de PCR podem ser ajustados para condições de laboratório específicas, e podem ser modificados levemente para se obter resultados similares. Por exemplo, uso de um método diferente para a preparação de DNA pode exigir ajuste de, por exemplo, a quantidade de iniciadores, condições de anelamento e polimerase usados. Similarmente, a seleção de outros iniciadores podem ditar outras ótimas condições para o protocolo de identificação de PCR. Esses ajustes no entanto não estarão evidentes por uma pessoa versada na técnica, e são além do mais detalhados nos manuais de aplicação de PCR atuais tal como aquele citado acima.
[00126] Alternativamente, iniciadores específicos podem ser usados para ampliar um fragmento de integração que pode ser usado como uma "sonda específica" para a identificação de EE-GH6 nas amostras biológicas. O contato de ácido nucleico de uma amostra biológica, com a sonda, sob condições que permitem hibridização da sonda com seu fragmento correspondente no ácido nucleico, resulta na formação de um ácido nucleico/híbrido de sonda. A formação desse híbrido pode ser detectada (por exemplo, marcação do ácido nucleico ou sonda), pelo que a formação desse híbrido indica a presença de EE-GH6. Tais métodos de identificação com base na hibridização com uma sonda específica (ou em um veículo de fase sólida ou em solução) foram descritos na técnica. A sonda específica é de preferência uma sequência que, sob condições otimizadas, hibridiza especificamente para dar uma região dentro da região de flanqueamento 5' ou 3' do evento elite e de preferência também compreendendo parte do DNA exógeno contíguo com a mesma (aqui em seguida chamado de "região específica"). De preferência, a sonda específica compreende uma sequência de entre 50 e 500 bp, de preferência de 100 a 350 bp que é pelo menos 80%, de preferência entre 80 e 85%, mais de preferência entre 85 e 90%, especialmente de preferência entre 90 e 95%, com mais preferência entre 95% e 100% idêntica (ou complementar) à sequência de nucleotídeos de uma região específica. De preferência, a sonda específica compreenderá uma sequência de cerca de 15 a cerca de 100 nucleotídeos idênticos contíguos (ou complementar) a uma região específica do evento elite.
[00127] Oligonucleotídeos adequados como iniciadores de PCR para a detecção do evento elite EE-GH6 pode também ser usado para desenvolver um protocolo à base de PCR para determinar o estado de zigosidade do evento elite. Para esse fim, dois iniciadores que reco-nhecem o locus selvagem são projetados de tal modo que eles sejam dirigidos em direção entre si e tenham o sítio de inserção localizado entre os iniciadores. Esses iniciadores podem ser iniciadores especificamente que reconhecem as sequências de flanqueamento 3' e 5' contidas dentro de SEQ ID NO 1 (SEQ ID NO 11) ou SEQ ID NO 2, respectivamente. Esses iniciadores podem também ser iniciadores especificamente que reconhecem as sequência de flanqueamento 3' ou 5' (tal como um iniciador tendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 7 ou SEQ ID 6). Esse conjunto de iniciadores, juntamente com um terceiro iniciador complementar a sequências de DNA transforman- tes (tal como um iniciador tendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 5) permitem ampliação de PCR diagnóstico simultânea do locus específico EE-GH6, bem como do locus selvagem. Se a planta for ho- mozigoto para o locus transgênico ou locus selvagem correspondente, o PCR de diagnóstico dará origem a um único produto de PCR típico, de preferência típico no comprimento, para ou o locus transgênico ou locus selvagem. Se a planta for hemizogoto para o locus transgênico, dois produtos de PCR específicos de locus aparecerão, refletindo tanto a ampliação do locus transgênico quanto selvagem.
[00128] Além do mais, métodos específicos de detecção para evento elite EE-GH6 que diferem de métodos de ampliação à base de PCR podem também ser desenvolvidos usando-se a informação de sequência específica de evento elite provida aqui. Tais métodos de detecção alternativos incluem métodos de detecção de ampliação de sinal linear com base em clivagem invasiva de estruturas de ácido nu- cleico particulares, também conhecidas como tecnologia Invader®, (como descrito por exemplo, na patente de U.S. no. 5.985.557 "Invasive Cleavage of Ácido nucleicos", 6.001.567 "Detection de Ácido nu- cleico Sequences by Invader Directed Cleavage, incorporadas aqui por referência). Para esse fim, a sequência alvo pode hibridizar com primeiro oligonucleotídeo de ácido nucleico marcado compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 141 até o nucleotídeo 148 ou seu complemento ou a dita sonda de ácido nuclei- co marcada compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 2 de nucleotídeo 95 até o nucleotídeo 112 ou seu complemento e é ulteriormente hibridizado com um segundo oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 de nucleotídeo 123 até o nucleotídeo 140 ou seu complemento ou a dita sonda de ácido nucleico marcada compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 2 de nucleotídeo 113 até o nucleotídeo 130 ou seu complemento, em que a primeira e segunda sobreposição de oligonucleotídeo por pelo menos um nucleotídeo. A estrutura duplex ou triplex que é produzida por essa hibridização permite clivagem de sonda seletiva com uma enzima (Cleavase®) levando a sequência alvo intacta. A sonda marcada clivada é subsequentemente detectada, potencialmente via uma etapa intermediária resultando em outra am-pliação de sinal.
[00129] Um "kit" como usado aqui se refere a um conjunto de reagentes para a finalidade de desempenho do método da invenção, mais particularmente, a identificação do evento elite EE-GH6 nas amostras biológicas ou a determinação do estado de zigosidade de material de planta contendo EE-GH6. Mais particularmente, uma concretização preferida do kit da invenção compreende pelo menos um ou dois inici-adores específicos, como descrito acima para a identificação do evento elite, ou três iniciadores específicos para a determinação do estado de zigosidade. Opcionalmente, o kit pode ulteriormente compreender qualquer outro reagente descrito aqui no protocolo de identificação de PCR. Alternativamente, de acordo com uma outra concretização dessa invenção, o kit pode compreender uma sonda específica, como descrito acima, que especificamente hibridiza com ácido nucleico das amostras biológicas para identificar a presença de EE-GH6 ali. Opcionalmente, o kit pode ulteriormente compreender qualquer outro reagente (tal como, mas não-limitado, a tampão de hibridização, rótulo) para a identificação de EE-GH6 nas amostras biológicas, usando-se a sonda específica.
[00130] O kit da invenção pode ser usado, e seus componentes podem ser especificamente ajustados, para as finalidades de controle de qualidade (por exemplo, pureza de lotes de semente), detecção da presença ou da ausência do evento elite no material de planta ou material compreendendo ou derivado de material de planta, tal como mas, não-limitado, a alimento ou produtos alimentícios.
[00131] Como usado aqui, "identidade de sequência" com relação às sequências de nucleotídeos (DNA ou RNA), se refere ao número de posições com nucleotídeos idênticos divididos pelo número de nucleo- tídeos na mais curta das duas sequências. O alinhamento das duas sequências de nucleotídeos é realizado pelo algoritmo Wilbur e Lipmann (Wilbur e Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:726) usando-se um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, um comprimento de letra de 4 nucleotídeos, e uma lacuna de 4. Interpretação e análise auxiliada por computador dos dados de sequência, incluindo alinhamento de sequência como descrita acima, pode, por exemplo, ser convenientemente realizado usando-se um pacote de software de análise de sequência do Genetics Computer Group (GCG, University of Wisconsin Biotechnology center). Sequências são indicadas como "essencialmente similares" quando tais sequências têm uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 75%, particularmente pelo menos cerca de 80%, mais particularmente pelo menos cerca de 85%, totalmente particularmente cerca de 90%, especialmente cerca de 95%, mais especialmente cerca de 100%. Está claro que quando sequências de RNA são ditas serem essencialmente similares e têm um certo grau de identidade de sequência com sequências de DNA, timi- dina (T) na sequência de DNA é considerada igual a uracila (U) na sequência de RNA.
[00132] O termo "iniciador" como usado aqui inclui qualquer ácido nucleico que é capaz de inicializar a síntese de ácido nucleico nascente um processo dependente de modelo, tal como PCR. Tipicamente, iniciadores são oligonucleotídeos de 10 a 30 nucleotídeos, mas se-quências mais longas podem ser empregadas. Iniciadores podem ser providos em forma de fio duplo, embora a forma de fio único seja pre-ferida. Sondas podem ser usadas como iniciadores, mas são projetados para se ligarem a DNA ou RNA alvo e não precisem ser usados em um processo ampliação.
[00133] O termo "que reconhece" como usado aqui quando referindo-se a iniciadores específicos, se refere ao fato de que os iniciadores específicos especificamente hibridizar para uma sequência de ácidos nucleicos no evento elite sob as condições indicadas no método (tais como as condições do protocolo de identificação de PCR), pelo que a especificidade é determinada pela presença de controles positivos e negativos.
[00134] O termo "hibridização" como usado aqui quando referindo- se a sondas específicas, referem-se ao fato de que a sonda se liga a uma região específica na sequência de ácidos nucleicos do evento elite sob condições rigorosas padrão como usado aqui se refere às condições para a hibridização descrita aqui ou às condições de hibridiza- ção convencionais como descrita por Sambrook e outros, 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda Edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY) que, por exemplo, pode compreender as seguintes etapas: 1) imobilização de fragmentos genômicos de DNA de planta em um filtro, 2) pré-hibridização do filtro por 1 a 2 horas a 42°C em 50% de formamida, 5 X SSPE, 2 X reagente de Denhardt's e 0,1% de SDS, ou por 1 a 2 horas a 68°C em 6 X SSC , 2 X reagente de Denhardt's e 0,1% de SDS, 3) adição da sonda de hibridização que foi marcada, 4) incubação por 16 a 24 horas, 5) lavagem do filtro por 20 min a temperatura ambiente em 1X SSC, 0,1% de SDS, 6) lavagem do filtro três vezes por 20 min cada a 68°C em 0,2 X SSC, 0,1% de SDS, e 7) exposição do filtro por 24 a 48 horas a película de raios X a - 70°C com uma intensificação de triagem.
[00135] Como usado aqui, uma amostra biológica é uma amostra de uma planta, material de planta ou produtos compreendendo material de planta. O termo "planta" destina-se a incluir tecidos de planta de algodão (Gossypium hirsitum), em qualquer estágio de maturidade, bem como quaisquer células, tecidos, ou órgãos tirados ou derivados de qualquer tal planta, incluindo sem limitação, quaisquer sementes, folhas, tronco, flores, raízes, células simples, gametas, culturas de células, culturas de tecidos ou protoplastos. "Material de planta", como usado aqui se refere a material que é obtido ou derivado de uma planta. Produtos compreendendo material de planta referem-se a alimento, produtos alimentícios ou outros produtos que são produzidos usando- se material de planta ou podem ser contaminados por material de planta. É entendido que, no contexto da presente invenção, tais amostras biológicas são testadas quanto à presença de ácidos nucleicos específicos para EE-GH6, implicando a presença de ácidos nucleicos nas amostras. Assim os métodos mencionados aqui para a identificação de evento elite EE-GH6 nas amostras biológicas, referem-se a uma identificação nas amostras biológicas de ácido nucleicos que compreendem o evento elite.
[00136] Como usado aqui "compreendendo" deve ser interpretado como a especificação da presença das características afirmadas, números inteiros, etapas, reagentes ou componentes como mencionados, mas não exclui a presença ou adição de uma ou mais características, números inteiros, etapas ou componentes, ou seus grupos. Assim, por exemplo, um ácido nucleico ou proteína compreendendo uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos, podem compreender mais nucleotídeos ou aminoácidos do que realmente citados, isto é, ser implantada em um ácido nucleico ou proteína maior. Um gene quimérico compreendendo uma sequência de DNA que é funcionalmente ou estruturalmente definida, pode compreender sequências de DNA adicionais, etc.
[00137] A presente invenção também se refere ao desenvolvimento de um evento elite EE-GH6 no algodão para as plantas compreendendo esse evento, a progênie obtida a partir dessas plantas e as células de planta, ou material de planta derivado desse evento. Plantas com-preendendo o evento elite EE-GH6 foram obtidas como descrito no exemplo 1.
[00138] Plantas de algodão ou material de planta compreendendo EE-GH6 podem ser identificadas de acordo com o protocolo de identificação de PCR descrito para EE-GH6 no exemplo 2. Resumidamente, DNA genômico de algodão presente na amostra biológica é ampliado por PCR usando-se um iniciador que especificamente reconhece uma sequência dentro da sequência de flanqueamento 3' ou 5' de EE-GH6 tal como o iniciador com a sequência de SEQ ID NO: 3, e um iniciador que reconhece uma sequência no DNA exógeno, tal como o iniciador com a sequência de SEQ ID NO: 4. iniciadores de DNA que ampliam parte de uma sequência de algodão endógena são usados como controle positivo para a ampliação por PCR. Se na ampliação por PCR, o material fornece um fragmento do tamanho esperado, o material contém material de planta oriunda da planta de algodão que contém evento elite EE-GH6.
[00139] Plantas que contêm EE-GH6 são caracterizadas por sua resistência a inseto, bem como por sua tolerância a glufosinato. Plantas que contêm EE-GH6 são também caracterizadas por ter características agronômicas que são comparáveis com variedades comercialmente disponíveis de algodão nos US, na ausência de pressão de inseto. Foi observado que a presença de um DNA exógeno na região de inserção do genoma da planta de algodão descrito aqui, confere particularmente características moleculares e fenotípicas interessantes às plantas compreendendo esse evento.
[00140] Os seguintes exemplos descrevem a identificação de evento elite EE-GH6 e o desenvolvimento de ferramentas para a identificação específica do evento elite EE-GH6 nas amostras biológicas.
[00141] A não ser que de outra maneira afirmado nos exemplos, todas as técnicas recombinantes são realizadas de acordo com proto-colos padrão como descritos em "Sambrook J e Russell DW (eds.) (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York" e in "Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA e Struhl K (eds.) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York".
[00142] Referências e materiais padrão são descritos in "Croy RDD (ed.) (1993) Molecular Plant Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford e Blackwell Scientific Publications, Oxford" e in "Brown TA, (1998) Molecular Biology LabFax, 2a Edição, Academic Press, San Diego". Materiais e métodos padrão para a reação de cadeia de polimerases (PCR) podem ser encontrados em "McPherson MJ e M0ller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford" e em "PCR Applications Manual, 3a Edição (2006), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim ou www.roche-applied- science.com"
[00143] Na descrição e exemplos, referência é feita para as seguintes sequências:
[00144] SEQ ID NO 1: sequência de nucleotídeos compreen dendo uma região de flanqueamento 5' de EE-GH6
[00145] SEQ ID NO 2: sequência de nucleotídeos compreen dendo uma região de flanqueamento 3' de EE-GH6
[00146] SEQ ID NO 3: iniciador GHI058
[00147] SEQ ID NO 4: iniciador GHI059
[00148] SEQ ID NO 5: iniciador DPA286
[00149] SEQ ID NO 6: iniciador NEL115
[00150] SEQ ID NO 7: iniciador NEL117
[00151] SEQ ID NO 8: iniciador 1 para a ampliação de frag mento de controle
[00152] SEQ ID NO 9: iniciador 2 para a ampliação de frag- mento de controle
[00153] SEQ ID NO 10: sequência de nucleotídeos da sequência alvo genômica de planta antes da inserção de EE-GH6
[00154] SEQ ID NO 11: sequência de nucleotídeos compreendendo uma região de flanqueamento 5' de EE-GH6 (comprimento)
[00155] Algodão resistente a inseto foi desenvolvido por transformação de algodão com um vector compreendendo a sequência de codificação de um gene de cry2Ae modificado operavelmente ligado a um peptídeo de trânsito da subunidade pequena da Rubisco sob o controle de um promotor 35Sdo vírus do mosaico da couve-flor.
[00156] Evento elite EE-GH6 foi selecionado com base em um pro-cedimento de seleção extenso com base na boa expressão e estabilidade do gene de resistência a inseto e sua compatibilidade com ótimas características agronômicas tais como altura da planta, altura para o nódulo, retenção de casulo, resistência, vigor, comprimento de fibra, resistência da fibra e fibra de algodão fornecidas foram avaliados.
[00157] O evento selecionado foi introduzido para dentro de diferentes bases genéticas comerciais, e resultados de experiências de campo em diferentes localizações foram comparadas. Plantas foram desafiadas com pestes de inseto usando-se diferentes tratamentos. Plantas exibiam bom controle de inseto.
[00158] Além do mais, o evento tinha morfologia de casulo, flor e folha normal, excelente fertilidade e não mostrava nenhuma suscetibilidade a inseto anormal ou doença em múltiplas bases genéticas. Durante a introdução em múltiplas bases genéticas nenhum problema anômalo ou anormalidades foram observados.
[00159] A sequência das regiões que flanqueiam o DNA exógeno no evento elite EE-GH6 foi determinada usando-se o método de PCR interlaçado assimétrico térmico (TAIL-) descrito por Liu e outros (1995, Planta J. 8(3):457-463) onde possível. Esse método utiliza três inicia-dores aninhados em reações sucessivas juntamente com um iniciador degenerado arbitrário mais curto de modo que as eficácias de ampliação relativas de produtos específicos e não específicos podem ser termicamente controlados. Os iniciadores específicos foram selecionado para o anelamento para a borda do DNA exógeno e com base em suas condições de anelamento. Uma pequena quantidade (5 μl) de produtos de PCR não purificados, secundário e terciários foram analisados em um gel de agarose de 1%. O produto de PCR terciário foi purificado e foi sequenciado.
[00160] O fragmento identificado como compreendendo a região de flanqueamento 5' foi sequenciado (SEQ ID NO 1). A sequência entre nucleotídeo 1 e 140 corresponde a DNA de planta, enquanto a sequência entre nucleotídeo 141 e 192 corresponde a DNA exógeno. Um fragmento mais longo compreendendo a região de flanqueamento 5' foi também sequenciado (SEQ ID NO 11). A sequência entre nucleotí- deo 1 e nucleotídeo 463 corresponde a DNA de planta, enquanto a sequência entre nucleotídeo 464 e 555 corresponde a DNA exógeno.
[00161] O fragmento identificado compreendendo a região de flan- queamento 3' obtido pelo método de TAIL-PCR foi sequenciado (SEQ ID NO 2). A sequência entre nucleotídeo 1 e 112 corresponde a DNA exógeno, enquanto a sequência entre nucleotídeo 113 e 438 corresponde a DNA de planta.
[00162] Pré-inserção de DNA de planta foi ampliada por ampliação de PCR usando-se oligonucleotídeos NEL115 (SEQ ID NO 6) e NEL117 (SEQ ID NO 7). A sequência de nucleotídeos do fragmento ampliado foi identificada (SEQ ID NO 10). A região entre posições de nucleotídeos 141 e 148 foi identificada como sendo redisposta (dele- ção de sítio alvo) quando comparada com as sequências de nucleotí- deos derivadas de planta nas regiões de flanqueamento 5' e 3' do evento elite EE-GH6.
[00163] Iniciadores específicos foram desenvolvidos que reconhecem sequências dentro do evento elite.
[00164] Um iniciador foi desenvolvido que reconhece uma sequência dentro da região de flanqueamento 3' de EE-GH6. Um segundo iniciador foi então selecionado dentro da sequência do DNA exógeno de modo que os iniciadores variem uma sequência de cerca de 189 nucleotídeos. As seguintes iniciadores demonstraram dar resultados particularmente claros e reproduzíveis em uma reação de PCR no DNA EE-GH6: GHI058: 5'- gAA.ATT.gCg.TgA.CTC.AAA.TTC.C -3' (SEQ ID NO: 3) (alvo: DNA de planta) GHI059: 5'- ggT.TTC.gCT.CAT.gTg.TTg.AgC-3' (SEQ ID NO: 4) (alvo: enxerto de DNA)
[00165] Iniciadores que direcionam uma sequência endógena são de preferência incluídos no coquetel de PCR. Esses iniciadores servem como um controle interno nas amostras desconhecidas e no controle positivo de DNA. Um resultado positivo com o par de iniciador endógeno (presença de um fragmento ampliado por PCR de 445 bp) demonstra que há amplo DNA de qualidade adequada na preparação genômica de DNA para um produto de PCR a ser gerado. Os iniciado- res endógenos foram selecionados para reconhecer um gene governanta no algodão: GHI001: 5'-AAC.CTA.ggC.TgC.TgA.Agg.AgC-3' GHI002: 5'-CAA.CTC.CTC.CAg.TCA.TCT.CCg-3'
[00166] Os fragmentos ampliados esperados na são: Para o par inicidador GHI001-GHI002: 445 bp (controle endógeno) Para o par inicidador GHI058-GHI059: 189 bp (Evento elite EE- GH6)
[00167] DNA de modelo foi preparado a partir de um furador de folha de acordo com Edwards e outros (Ácido nucleico Research, 19, p1349, 1991). Quando usando DNA preparado com outros métodos, uma experiência de teste utilizando diferentes quantidades de modelo seria feito. Usualmente 50 ng de DNA de modelo genômico fornecem os melhores resultados.
[00168] Para evitar falsos positivos ou negativos, foi determinado que os seguintes controles positivos e negativos seriam incluídos em uma experiência com PCR:
[00169] - Controle de mistura principal (controle negativo de DNA). Isso é uma PCR em que nenhum DNA é adicionado à reação. Quando o resultado esperado, nenhum produto de PCR, é observado isso indica que o coquetel de PCR não foi contaminado com DNA alvo.
[00170] - um controle positivo de amostra de DNA (DNA genômico conhecido como contendo às sequências transgênicas). Ampliação bem sucedida desse controle positivo demonstra que a PCR foi realizada sob condições que permitem a ampliação das sequências alvo.
[00171] - um controle de DNA selvagem. Isso é uma PCR em que o DNA de modelo provido é DNA genômico preparado a partir de uma planta não-transgênica. Quando o resultado esperado, nenhuma am-pliação de um produto de PCR de transgene mas a ampliação do produto de PCR endógeno, é observado isso indica que não há ampliação de base de transgene detectável em uma amostra de DNA genômico.
[00172] Ótimos resultados foram obtidos sob as seguintes condições:
[00173] - a mistura de PCR para 25 μl de reações contém:
[00174] 2,5 μl de DNA de modelo
[00175] 2,5 μ l 10x tampão de ampliação (fornecido pelo fabricante com a polimerase de Taq)
[00176] 0,5 μl de dNTP's a 10 mM
[00177] 0,4 μl de GHI001 (10 pmols/μ l)
[00178] 0,4 μl de GHI002 (10 pmols/μ l)
[00179] 0,7 μl de GHI058 (10 pmols/μ l)
[00180] 0,7 μl de GHI059 (10 pmols/μ l)
[00181] 0,1 μ l de polimerase de DNA de Taq (5 unidades/μ l)
[00182] água até 25 μ l
[00183] - o perfil de termociclagem a ser seguido para ótimos resul tados é os seguintes:
[00184] 4 min a 95°C
[00185] Seguido por: 1 min a 95°C
[00186] 1 min a 57°C
[00187] 2 min a 72°C
[00188] Para 5 ciclos
[00189] Seguido por: 30 seg a 92°C
[00190] 30 sec. a 57°C
[00191] 1 min a 72°C
[00192] Para 25 ciclos
[00193] Seguido por: 10 minutos a 72°C
[00194] Para otimamente visualizar os resultados do PCR foi determinado que entre 10 e 20 μ l das amostras de PCR seriam aplicadas sobre um gel de agarose de 1,5% (tampão de Tris-borato) com um padrão de peso molecular apropriado (por exemplo, padrão de PM de 100 bp PHARMACIA).
[00195] Foi determinado que dados oriundos de amostras de DNA de planta transgênica dentro de uma única experiência de PCR e um único coquetel de PCR não seriam aceitáveis a não ser 1) o controle positivo de DNA mostra os produtos de PCR esperados (fragmentos endógenos e transgênicos), 2) o controle negativo de DNA é negativo para a ampliação de PCR (nenhum fragmento) e 3) o controle de DNA selvagem mostra o resultado esperado (ampliação de fragmento endógeno).
[00196] Quando a seguir o protocolo de identificação de PCR para EE-GH6 como descrito acima, raias que mostram quantidades visíveis dos produtos de PCR transgênicos e endógenos dos tamanhos esperados, indicam que a planta correspondente a partir da qual o DNA de modelo genômico foi preparado, herdou o evento elite EE-GH6. Raias que não mostram quantidades visíveis de qualquer um dos produtos de PCR transgênicos e que mostram quantidades visíveis do produto de PCR endógeno, indicam que a planta correspondente a partir da qual o DNA de modelo genômico foi preparado, não compreende o evento elite. Raias que não mostram quantidades visíveis dos produtos de PCR transgênicos e endógenos, indicam que a qualidade e/ou quantidade do DNA genômico não permitiram que um produto de PCR seja gerado. Essas plantas não podem ser classificadas. A preparação de DNA genômico seria repetida e uma nova experiência de PCR, com os controles apropriados, tinham de ser realizados.
[00197] Antes da tentativa de triar desconhecidos, uma experiência de teste, com todos os controles apropriados, tinha de ser realizada. O protocolo desenvolvido poderia exigir otimização para os componentes que podem diferir entre laboratórios (preparação de DNA de modelo, polimerase de DNA de Taq, qualidade dos iniciadores, dNTP's, termo- ciclador, etc.).
[00198] Ampliação da sequência endógena desempenha um papel chave no protocolo. Uma tem de alcançar PCR e condições de termo- ciclagem que ampliam quantidades equimolares tanto da sequência endógeno quanto transgênica em um modelo de DNA genômico trans- gênico conhecidos. Sempre que o fragmento endógeno direcionado não é ampliado ou sempre que as sequências direcionadas não são ampliadas com as mesmas intensidades de marcação de brometo de etídio, como julgado por eletroforese de agarose, otimização das condições de PCR pode ser exigida.
[00199] Material de folha oriunda de numerosas plantas de algodão, algumas das quais compreendendo EE-GH6 foram testadas de acordo com o protocolo descrito acima. Amostras oriundas de evento elite EE- GH6 e oriundas selvagem de algodão foram tiradas como controles positivos e negativos, respectivamente.
[00200] Figura 2 ilustra o resultado obtido com o protocolo de evento elite identificação de PCR 1 para EE-GH6 em numerosas amostras de planta de algodão. As amostras nas raias de 2 a 5 demonstraram conter o evento elite quando a tira de 189 bp é detectada, enquanto as amostras nas raias 6 e 7 não compreendem EE-GH6. Raias 6 e 7 compreendem outros eventos de elite de algodão (incluindo plantas compreendendo diferentes genes quiméricos de tolerância a inseto); raia 8 representa a amostra de controle negativo (água), e raias 1 e 9 representam o padrão de peso molecular (padrão de PM de 100 bp).
[00201] Um fragmento de integração específico EE-GH6 é obtido por ampliação de PCR usando-se iniciadores específicos GHI058 (SEQ ID NO 3) e GHI059 (SEQ ID NO 4) ou por síntese química e é marcado. Esse fragmento de integração é usado como uma sonda específica para a detecção de EE-GH6 nas amostras biológicas. Ácido nucleico é extraído a partir das amostras de acordo com procedimentos padrão. Esse ácido nucleico é então posto em contato com a sonda específica sob condições de hibridização que são otimizadas para permitir a formação de um híbrido. A formação do híbrido é então detectada para indicar a presença de ácido nucleico EE-GH6 na amostra. Opcionalmente, o ácido nucleico nas amostras é ampliado usando-se os iniciadores específicos antes do contato com a sonda específica. Alternativamente, o ácido nucleico é marcado antes do contato com a sonda específica ao invés do fragmento de integração. Opcionalmente, a sonda específica está ligada a um veículo sólido (tais como, mas não-limitados a filtro, tira ou contas), antes do contato com as amostras.
[00202] Dois iniciadores que reconhecem as sequências de nucleo- tídeos do locus selvagem antes da inserção do evento elite, foram cri-ados de tal modo que eles são direcionados um ao outro e têm o sítio de inserção entre si. Esse conjunto de iniciadores, juntamente com um terceiro iniciador complementar a sequências de DNA exógenas e di-recionadas em direção ao DNA de flanqueamento, permitem amplia- ção de PCR simultânea do locus EE-GH6 bem como do locus selvagem.
[00203] Os seguintes iniciadores demonstraram dar resultados par-ticularmente claros e reproduzíveis em uma reação de PCR de classi-ficação de zigosidade no DNA EE-GH6: NEL115 5'- ACT.gAT.ggC.TCA.ACg.gTT.AC-3' (SEQ ID NO: 6) (alvo: DNA de planta a montante de sequência de flanqueamento 5') DPA286 5'- gAT.CgC.CAT.ggA.gCC.ATT-3' (SEQ ID NO: 5) (alvo: inserção de DNA) NEL117 5' - AAA.TCA.CAg.gCA.gAg.ggA.Ag-3' (SEQ ID NO: 7) (alvo: DNA de planta da sequência de flanqueamento 3')
[00204] Os fragmentos ampliados esperados na reação de PCR são: Para o par inicidador GHI065 - GHI066: 451 bp (locus selvagem) Para o par inicidador GHI057 - GHI065: 197 bp (locus EE-GH6)
[00205] DNA de modelo foi preparado a partir de um furador de folha de acordo com Edwards e outros (Ácido nucleico Research, 19, p1349, 1991). Quando usando DNA preparado com outros métodos, uma experiência de teste utilizando quantidades diferentes de modelo seria feita. Usualmente 50 ng de DNA de modelo genômico fornece os melhores resultados.
[00206] Para evitar falsos positivos ou negativos, é aconselhável que os seguintes controles positivos e negativos sejam incluídos em uma experiência de PCR:
[00207] - Controle de mistura principal (controle negativo de DNA). Isso é uma PCR em que no DNA é adicionado à reação. Quando o resultado esperado nos produtos PCR é observado isso indica que o coquetel de PCR não foi contaminado com DNA alvo.
[00208] - um controle positivo de DNA (amostra de DNA genômico conhecido como contendo as sequências transgênicas). Ampliação bem sucedida para esse controle positivo demonstra que a PCR foi realizada sob condições que permitem para ampliação de sequências alvo.
[00209] - A controle de DNA selvagem. Isso é uma PCR em que o DNA de modelo provido é DNA genômico preparado a partir de uma planta não-transgênica. Quando o resultado esperado, nenhuma am-pliação de um produto de PCR de transgene mas ampliação do produto de PCR endógeno é observada, isso indica que não há ampliação de base de transgene detectável na amostra de DNA genômico.
[00210] Ótimos resultados foram obtidos sob as seguintes condições:
[00211] - a mistura de PCR para 25 μl de reações contém:
[00212] x μl de DNA de modelo (150 ng)
[00213] 2,5 μ l de 10x tampão de ampliação (fornecido pelo fabrican te com a polimerase de Taq)
[00214] 0,5 μl de 10 mM dNTP's
[00215] 0,5 μl de NEL115(10 pmols/μ l)
[00216] 0,5 μl de NEL117(10 pmols/μ l)
[00217] 0,2 μl de DPA286 (10 pmols/μ l)
[00218] 0,1 μ l de polimerase de DNA de Taq (5 unidades/μ l)
[00219] água até 25 μ l
[00220] - o perfil de termociclagem a ser seguido para ótimos resul tados é os seguintes:
[00221] 4 min a 95°C
[00222] Seguido por: 1 min a 95°C
[00223] 1 min a 57°C
[00224] 2 min a 72°C
[00225] Para 5 ciclos
[00226] Seguido por: 30 seg a 92°C
[00227] 30 seg a 57°C
[00228] 1 min a 72°C
[00229] Para 25 ciclos
[00230] Seguido por: 10 minutos a 72°C
[00231] Para otimamente visualizar os resultados do PCR foi determinado que entre 10 e 20 μ l das amostras de PCR seriam aplicadas em um gel de agarose de 1,5% (tampão de Tris-borato) com um padrão de peso molecular apropriado (por exemplo, padrão de PM de 100 bp PHARMACIA).
[00232] Dados oriundos das amostras de DNA de planta transgêni- ca dentro de uma única corrida de PCR e um única mistura principal de PCR não será aceitável a não ser que:
[00233] o controle positivo mostra dos produtos de PCR esperados (alvo ampliação de alvo transgênico)
[00234] o controle de DNA selvagem mostra o resultado esperado (ampliação de alvo selvagem).
[00235] o controle negativo é negativo para a ampliação de PCR (nenhum fragmento).
[00236] Raias que mostram quantidades visíveis do produto de PCR transgênico do tamanho esperado e que não mostram quantidades visíveis do produto de PCR selvagem, indicam que a planta cor-respondente a partir da qual o modelo de DNA genômico foi preparado, é homozigoto para o pacote de gene transgênico.
[00237] Raias que mostram quantidades visíveis dos produtos de PCR selvagem e transgênico do tamanho esperado, indicam que a planta correspondente a partir da qual o DNA de modelo genômico foi preparado, é hemizogoto para o pacote de gene transgênico. Raias que não mostram quantidades visíveis do produto de PCR transgênico e que mostram quantidades visíveis do produto de PCR selvagem, indicam que a planta correspondente a partir da qual o DNA de modelo genômico foi preparado, não herdou a sequência transgênica analisada quanto a e é assim homozigota para o locus selvagem.
[00238] Raias que não mostram quantidades visíveis de produtos de PCR selvagem e transgênico, indicam que a qualidade e/ou quantidade do DNA genômico não permitiu que um produto de PCR seja gerado. Essas plantas não podem ser classificadas. A preparação de DNA genômico seria repetida e uma nova experiência de PCR, com os controles apropriados, tem de ser realizados.
[00239] Figura 3 ilustra o resultado obtido com a PCR de classificação zigosidade para EE-GH6 em numerosas amostras de planta de algodão. As amostras nas raias 2-3 demonstraram conter o fragmento de PCR (197 bp) característico para o evento elite EE-GH6, enquanto as amostras nas raias de 4 a 7 continham o fragmento característico para a presença do locus selvagem. Raias de 4-6 continha ambos os fragmentos. Raias 2 e 3 portanto contêm EE-GH6 na forma de homo- zigoto, raias de 4 a 6 contêm EE-GH6 na forma de hemizogoto e raia 7 contém o locus selvagem na forma de homozigoto (azigoto para EE- GH6). Raia 8 representa a amostra de controle negativo (água), e raias de 1 e 9 representam o padrão de peso molecular (padrão de PM de 100 bp).
[00240] Evento elite EE-GH6 é introduzido por retrocruzamento repetido em cultivares de algodão comercial tais como mas não- limitados a FM5013, FM5015, FM5017, FM989, FM832, FM966 e FM958, FM989, FM958, FM832, FM991, FM819, FM800, FM960, FM966, FM981, FM5035, FM5044, FM5045, FM5013, FM5015, FM5017 ou FM5024.
[00241] É observado que a introdução do evento elite nesses cultivares não significativamente influenciam qualquer uma das características fenotípicas ou agronômicas desejáveis desses cultivares (nenhum obstáculo de ligação) enquanto expressão do transgene, como determinado pela tolerância a glufosinato, satisfaz níveis comercialmente aceitáveis do evento EE-GH6 como um evento elite.
[00242] Evento elite EE-GH6 pode ser vantajosamente combinado com outros eventos de elite disponíveis no mercado, particularmente outro evento elite gene de resistência a inseto para a finalidade de ge-renciamento de resistência a inseto, tal como mas não-limitado ao evento 3006-210-23; (petição de afídio de USDA 03-036-02p) evento 281-24-236 (petição de afídio de USDA 03-036-01p); evento MON158985 (petição de afídio de USDA 00-342-01p); evento MON531 (petição de afídio de USDA 94-308-01p), evento COT102 (=Syngenta vip3A) petição de afídio de USDA 03-155-01p, evento EE- GH5 descritos no pedido de patente EP 07075299.3. Evento elite EE- GH6 pode também ser combinado com eventos de elite tolerantes a herbicida tais como evento MON1445 (petição de afídio de USDA 95045-01p) ou evento MON88913 (petição de afídio de USDA 04-08601p).
[00243] Como usado nas reivindicações abaixo, a não ser que de outra maneira claramente indicada, o termo "planta" destina-se a incluir tecidos de planta, em qualquer estágio de maturidade, bem como quaisquer células, tecidos, ou órgãos tirados de ou derivados de qualquer tal planta, incluindo sem limitação, quaisquer sementes, folhas, tronco, flores, raízes, células simples, gametas, culturas de células, culturas de tecidos ou protoplastos.
[00244] Semente de referência compreendendo o evento elite EE- GH6 foi depositado como EE-GH6 na ATCC (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209) em 9 de abril de 2007, sob número de acesso de ATCC PTA-8398. Um nome alternativo para EE-GH6 é GBH119.
[00245] Como usado nas reivindicações abaixo, a não ser que de outra maneira claramente indicada, o termo "planta" destina-se a incluir planta tecidos, em qualquer estágio de maturidade, bem como quaisquer células, tecidos, ou órgãos tirados de ou derivados de qualquer tal planta, incluindo sem limitação, quaisquer sementes, folhas, tronco, flores, raízes, células simples, gametas, culturas de células, culturas de tecidos ou protoplastos.
[00246] A descrição acima da invenção destina-se a ser ilustrativa e não-limitante.
[00247] Várias mudanças ou modificações nas concretizações descritas podem ocorrer por aqueles versados na técnica. Essas podem ser feitas sem se afastar do espírito ou escopo da invenção.
Claims (5)
1. DNA recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende o evento elite, em que o dito evento elite compreende: a) um DNA exógeno compreendendo a sequência que codifica um gene cry2Ae modificado operacionalmente ligado a um peptídeo de trânsito da subunidade pequena da Rubisco sob o controle do promotor 35S do vírus do mosaico da couve flor; b) SEQ ID NO: 11, nucleotídeos 1-463 sendo a região de flanqueamento 5' do dito evento elite e estando imediatamente a montante de e contíguo com o referido DNA exógeno, e nucleotídeos 464-555 de SEQ ID NO: 11 sendo DNA exógeno; e c) SEQ ID NO: 2, nucleotídeos 113-438 sendo a região de flanqueamento do dito evento elite e estando imediatamente a jusante à e contíguo com o dito DNA exógeno, e nucleotídeos 1-112 de SEQ ID NO: 2 sendo DNA exógeno; em que o dito evento elite é compreendido na semente de referência que foi depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-8398.
2. DNA recombinante, caracterizado pelo fato de ser produzido a partir da planta de algodão, célula de planta ou semente, compreendendo o evento elite, como definido na reivindicação 1.
3. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 130 ao nucleotídeo 151 ou a SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 92 ao 123, ou o complemento total das ditas sequências, em que a dita molécula de ácido nucléico pode ser obtida a partir de sementes de algodão que foram depositadas na ATCC sob número de depósito PTA-8398.
4. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 1 e SEQ ID NO 2, ou o complemento total das ditas sequências.
5. Uso de uma planta compreendendo o evento elite, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para o controle de inseto em uma área de crescimento de algodão.
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