BRPI0611508A2 - algodão inseticida ce44-69d - Google Patents
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Abstract
ALGODãO INSETICIDA CE44-69D. A presente invenção refere-se a um algodoeiro transgénico resistente a insetos. Em particular, a invenção refere-se a um evento específico, designado CE44-69D. A invenção também refere-se aos polinucleotídeos que são característicos do evento CE44-69D, plantas que compreendem os ditos polinucleotídeos e métodos para detectar o evento CE44-69D.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ALGODÃO INSETICIDA CE44-69D".
A presente invenção refere-se a inter alia, polinucleotídeos e mé-todos de uso desses e em particular a algodoeiros que compreendem osditos polinucleotídeos. Especificamente, a invenção refere-se a um eventode algodão designado CE44-69D que compreende um gene CryIAb. A in-venção também se refere a métodos de identificar eventos de algodão espe-cíficos que contêm um gene capaz de conferir resistência a insetos nos ditosalgodoeiros.
Pragas de plantas são um grande fator na perda das importantescolheitas agrícolas do mundo. Aproximadamente 8 bilhões de dólares sãoperdidos a cada ano nos EUA devido a infestações de plantas por pragas denão-mamíferos incluindo insetos. Além de perdas nas colheitas de campo,os insetos nocivos também são um fardo para plantadores de vegetais e fru-tas, para produtores de flores ornamentais e para jardineiros.
Insetos nocivos são controlados principalmente por aplicaçõesintensivas de pesticidas químicos, que são eficazes através da inibiçãó docrescimento dos insetos, prevenção da alimentação ou reprodução dos inse-tos ou causam morte. Controle satisfatório de insetos nocivos pode então seratingido, mas esses químicos podem algumas vezes também afetar outrosinsetos, benéficos. Outro problema que resulta do amplo uso de pesticidasquímicos é o aparecimento de variedades de insetos resistentes. Isso temsido parcialmente reduzido por várias práticas de controle de resistência,mas há uma necessidade crescente por agentes de controle de pragas al-ternativos. Agentes de controle de pragas biológicos, tais como cepas deBacillus thuringiensis que expressam toxinas pesticidas como δ-endotoxinas,também têm sido aplicados às plantações com resultados satisfatórios, ofe-recendo uma alternativa ou complemento aos pesticidas químicos. Os genesque codificam algumas dessas δ-endotoxinas foram isoladas e sua expres-são em hospedeiros heterólogos foi mostrada como fornecendo outra ferra-menta para o controle de insetos nocivos importantes economicamente. Emparticular, a expressão da toxina inseticida CryIAc de Bacillus thuringiensisem plantas transgênicas, forneceu proteção eficaz contra insetos nocivos, eplantas transgênicas expressando essa toxina têm sido comercializadas,permitindo aos agricultores reduzir as aplicações de agentes químicos decontrole de insetos. CryIAc é um de uma grande família de toxinas insetici-das produzida por diferentes cepas de Bacillus thuringiensis. Cada toxina nafamília tem um espectro único de atividade inseticida.
A família do algodão, gênero Gossypium, um membro da Malva-ceae, consiste em 39 espécies, das quais Gossypium hirsutum é a espéciemais cultivada. Três outras espécies também são cultivadas: G. arboreum,G. barbadense, e G. herbaceum. Essas espécies cultivadas são crescidasprimariamente por causa dos pêlos da semente que são transformados emtêxteis. O algodão é adequado como fibra têxtil porque os pêlos secos sedeformam de tal maneira que filamentos finos e fortes podem ser fiados apartir deles. Outros produtos, tais como óleo de algodão, torta, e línteres dealgodão são sub produtos da produção de fibra.
Danos a plantações de algodão por insetos nocivos por todo omundo resultam em uma perda de rendimento significativa a cada ano. Ocontrole eficaz dessas pragas para minimizar a perda do rendimento é degrande importância econômica. Exemplos de insetos nocivos de algodãoincluem lagarta da beterraba (Spodoptera exígua), Gorgulho da cápsula (An-thonomus grandis grandis), Larva do repolho (Trichoplusia ni), Percevejoescuro de plantas (Neurocolpus nubilus), Afídeo do algodão (Aphis gossypii),Lagarta do capulho (Heliocoverpa zea), Lagartas cortadoras (Feltia subterrâ-nea, Peridroma saucia, Agrotis ipsilon), Broca européia do milho (Ostrinianubilalis), Lagarta do cartucho (Spodoptera frugiperda), Lagarta rosada (Pec-tinophera gossypiella), Tripés da erupção dos frutos (Frankliniella spp.), Lar-va da soja (Pseudoplusia ineludens)-, Percevejos (Nezara viridula, Acroster--num~hilarerEusehisius servus), Percevejo manchado de plantaTLygus Iineo-laris), Lagarta da maçã (Heliothis vireseens) e Moscas Brancas (Trialeurodesabutilonea, Bemisia tabaei).
Transformação e regeneração de algodoeiros agora é um pro-cedimento bem-estabelecido, baseado tipicamente na transferência mediadapor Agrobacterium tumefaciens de DNA estranho dentro de partes do algo-doeiro e regeneração das ditas partes de planta em cultura de tecido em al-godoeiros transgênicos completamente férteis.
Existe uma necessidade de gerar um novo algodoeiro que sejaresistente a insetos tal que a perda de rendimento através do dano a planta-ções de algodão por insetos nocivos seja reduzida. Um algodoeiro resistentea insetos reduziria a necessidade de se aplicar pesticidas químicos, que po-dem ser prejudiciais ao ambiente. Em particular, é desejável fornecer umaplanta resistente a insetos alternativa às plantas transgênicas que compre-endem o gene Cryl Ac de Bacillus thuringiensis.
A presente invenção fornece, inter alia, um evento de algodãoespecífico (referido daqui por diante como "CE44-69D") e métodos para i-dentificação desse. Esse evento específico foi selecionado com base em,inter alia, seu desempenho agronômico, eficácia e características molecula-res. Acredita-se que as características desse evento sejam muito superioresa de transformantes semelhantes com base, inter alia, no sítio de integraçãodo transgene durante o processo de transformação.
"Evento CE44-69D" no contexto desse pedido refere-se ao al-godoeiro transgênico inseticida original descrito aqui e qualquer material deplanta derivado dele, incluindo sementes. "Inseticida" como aqui usado refe-re-se a qualquer efeito inibidor sobre um inseto, incluindo mas não limitadoa, alimentação reduzida, crescimento retardado, fecundidade reduzida, para-lisia ou morte. "Fecundidade" compreende todos os aspectos relacionadoscom a reprodução tal como habilidade reprodutiva, freqüência reprodutiva, enúmero de prole. Também abrangido por essa invenção está qualquer mate-rial de planta derivado do evento CE44-69D, incluindo sementes.
O evento CE44-69D exibe um novo genótipo que compreendepelo menos um cassete de expressão. O cassete compreende um promotoradequado para expressão em plantas operativamente ligado a um gene quecodifica uma toxina inseticida CryIAb1 útil no controle de um grande espectrode insetos lepidópteros nocivos, e um sinal de poliadenilação adequado.Promotores adequados podem ser isolados de, inter alia, plantas. Váriospromotores de plantas foram isolados e caracterizados incluindo promotoresconstitutivos, cambiáveis e/ou tecido específicos. Promotores adequadospodem ser selecionados a partir do seguinte grupo não limitante: CaMV35S,FMV35S, Ubiquitina, Act2, NOS, OCS, promotor do vírus Cestrum yellowleaf curl, Patatin, E9, chave de alcA/alcR, chave de GST, chave de RMS,oleosina, Gelvin, pequena subunidade da ribulose bisfosfato carboxilase-oxigenase, actina 7, promotor de MR7 (milho), Gos 9 (arroz), promotores deG0S2, MasOcs (ou superpromotor), promotor de RoID (Agrobacterium rhi-zogenes), promotor de SuperMAS, e promotor de Suc2 (Arabidopsis). Emuma modalidade da presente invenção, o promotor é o promotor de Actina,ACT2, de Arabidopsis thaliana. Elementos adicionais tais como seqüênciasintensificadoras também podem ser incorporadas no cassete de expressão afim de estimular níveis de expressão gênica, por exemplo intensificadorestranscricionais ou traducionais, tais como ativador de tradução do vírus etchdo tabaco (TEV), intensificador de CaMV35S, e intensificador de FMV35S.Alternativamente pode ser desejável incluir uma seqüência de direcionamen-to, por exemplo, para direcionar o transporte da toxina CryIAb para umcomponente celular em particular. Por exemplo, se é desejado fornecer aproteína fora da célula então uma seqüência de direcionamento extracelularpode ser ligada ao polinucleotídeo que codifica a proteína CryIAb. Outrosexemplos de direcionamento incluem direcionar para uma organela ou com-partimento intracelular específico, por exemplo para o retículo endoplasmáti-co usando uma seqüência de retenção 1KDEL'. Vários sinais de poliadenila-ção foram isolados e caracterizados. Exemplos de sinais de poliadenilaçãoadequados funcionais em plantas incluem aquele do gene de nopalina sinta-se (nos) de Agrobacterium tumefaciens, do gene de inibidor de proteinase Ile do gene de alfa-tubulina (EP-A 652,286). Em uma modalidade da presenteinvenção, o sinal de poliadenilacao e aquele do gene nos de Agrobacteriumtumefaciens.
O polinucleotídeo que codifica a proteína CryIAb pode ser có-don-otimizado ou alterado de outra maneira para aumentar, por exemplo, atradução uma vez que ele está incorporado dentro do material da planta. Talotimização de códon também pode ser usada para alterar a estrutura secun-dária prevista do transcrito de RNA produzido em qualquer célula transfor-mada, ou para destruir elementos de instabilidade de RNA crípticos presen-tes no transcrito inalterado, assim aumentando a estabilidade e/ou disponibi-Iidade do transcrito na célula transformada (Abler & Green (1996) Plant Mo-lecular Biology (32) pp.63-78). A otimização de códon também pode ser em-pregada para alterar uma seqüência codificante heteróloga de DNA para queela lembre mais intimamente a seqüência codificante de um gene do hospe-deiro. Por exemplo, um gene bacteriano pode ser códon otimizado para au-mentar a proporção de bases citosina e guanina para adenina e timina paraque ele lembre mais intimamente um gene de planta (por exemplo, algodãoou milho), ainda que codificando a mesma proteína. Tal otimização de códonpode ser realizada de acordo com as tabelas de uso de códon usuais.
Em um precursor ao evento CE44-69D, um segundo casseteestá presente que compreende um gene que quando expresso pode ser u-sado como um marcador selecionável. Vários marcadores selecionáveis fo-ram caracterizados, incluindo alguns que conferem tolerância a antibióticos eoutros que conferem tolerância a herbicidas. Exemplos de genes marcado-res adequados incluem aqueles que conferem tolerância a higromicina, ca-namicina ou gentamicina. Mais marcadores selecionáveis incluem genes queconferem resistência a herbicidas tais como herbicidas a base de glifosatoou resistência a toxinas tais como eutipina. Outras formas de seleção tam-bém estão disponíveis tais como sistemas de seleção a base de hormôniostal como o sistema Multi Auto Transformation (MAT) de Hiroyrasu Ebinumaet ai (1997) PNAS Vol. 94 pp. 2117-2121; sistemas de seleção visual queusam a conhecida proteína verde-fluorescente, β glicoronidase; e qualqueroutro sistema de seleção tal como manose isomerase (Positech®), xiloseisomerase e 2-desoxiglicose (2-DOG). Em uma modalidade da presente in-venção, o gene marcador selecionável é um que confere tolerância a higro-micina. Esse segundo cassete de expressão é útil para selecionar um trans-formante durante e após a transformação em plantas. Opcionalmente, elepode ser separado do precursor do evento CE44-69D após a transformaçãopara deixar o evento CE44-69D em si. O evento CE44-69D per se não com-preende um cassete de marcador selecionável. Cassetes de expressão adi-cionais estão opcionalmente compreendidos no evento CE44-69D. Por e-xemplo, eles podem fornecer genes que codificam toxinas inseticidas dife-rentes tais como VIP3A. Alternativamente, eles podem fornecer outros bene-fícios desejáveis tal como resistência a um herbicida.
Os cassetes de expressão podem ser introduzidos dentro daplanta no mesmo plasmídeo ou em plasmídeos diferentes. Se os cassetesde expressão estão presentes no mesmo plasmídeo e são introduzidos naplanta através de um método de transformação mediado por Agrobacteríum,eles podem estar presentes dentro das mesmas regiões de T-DNA ou regi-ões diferentes. Em uma modalidade da presente invenção, dois cassetes deexpressão estão presentes em diferentes regiões de T-DNA dentro de plas-mídeos diferentes.
De acordo com a presente invenção é fornecido um nucleotídeoque compreende uma primeira região que compreende a seqüência descritacomo SEQ ID NO: 1 e uma outra região que compreende a seqüência des-crita como SEQ ID NO: 2.
Em uma modalidade adicional o dito polinucleotídeo compreen-de uma região que pode ser amplificada por uma reação de amplificaçãoque usa os iniciadores descritos como SEQ ID NO: 5 e 6 ou SEQ ID NO: 10e 11. Ainda em uma outra modalidade o dito polinucleotídeo compreendeuma região ainda adicional que codifica um gene CryIAb de Bacillus thurín-giensis. Ainda em uma outra modalidade o dito polinucleotídeo compreendeuma região que fornece o promotor de actina de Arabidopsis operativamenteligado ao dito gene CryIAb.
Em um aspecto adicional da invenção é fornecido um polinucleo-tideo que compreende pelo menos 18 nucleotidos contiguos da sequenciadescrita como SEQ ID NO: 3. Ainda é fornecido um polinucleotídeo quecompreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da seqüência descritacomo SEQ ID NO: 3. Ainda é fornecido um polinucleotídeo que compreendepelo menos 25 nucleotídeos contíguos da seqüência descrita como SEQ IDNO: 3. Ainda é fornecido um polinucleotídeo que compreende a seqüênciadescrita como SEQ ID NO: 3.
Ainda é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo me-nos 35 nucleotídeos contíguos da seqüência descrita como nucleotídeos 106a 165 de SEQ ID NO: 1. Ainda é fornecido um polinucleotídeo que compre-ende pelo menos 40 nucleotídeos contíguos da seqüência descrita comonucleotídeos 106 a 165 de SEQ ID NO: 1. Ainda é fornecido um polinucleotí-deo que compreende pelo menos 50 nucleotídeos contíguos da seqüênciadescrita como nucleotídeos 106 a 165 de SEQ ID NO: 1. Ainda é fornecidoum polinucleotídeo que compreende a seqüência descrita como nucleotí-deos 106 a 165 de SEQ ID NO: 1.
Ainda é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo me-nos 50, 100 ou 150 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, o dito polinu-cleotídeo contendo a junção de nucleotídeo entre os nucleotídeos 135 e 136de SEQ ID NO: 1. Ainda é fornecido um polinucleotídeo que compreende aseqüência descrita como SEQ ID NO: 1.
Ainda é fornecida uma seqüência que é o complemento de umaseqüência descrita acima.
Em um aspecto adicional da invenção é fornecido um polinucleo-tídeo que compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüênciadescrita como SEQ ID NO: 4. Ainda é fornecido um polinucleotídeo quecompreende pelo menos 20 nucleotídeos da seqüência descrita como SEQID NO: 4. Ainda é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menosnucleotídeos contíguos da seqüência descrita como SEQ ID NO: 4. Aindaé fornecido um polinucleotídeo que compreende a seqüência descrita comoSEQ ID NO: 4.
Ainda é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo me-nos 35 nucleotídeos contíguos da seqüência descrita como nucleotídeos 242a 301 de SEQ ID NO: 2. Ainda é fornecido um polinucleotídeo que compre-ende pelo menos 40 nucleotídeos contíguos da seqüência descrita comonucleotídeos 242 a 301 de SEQ ID NO: 2. Ainda é fornecido um polinucleotí-deo que compreende pelo menos 50 nucleotídeos contíguos da seqüênciadescrita como nucleotídeos 242 a 301 de SEQ ID NO: 2. Ainda é fornecidoum nucleotídeo que compreende a seqüência escrita como nucleotídeos 242a 301 de SEQ ID NO: 2.
Ainda é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo me-nos 50, 100, 150, 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos contíguos de SEQ IDNO: 2, o dito polinucleotídeo contendo a junção de nucleotídeos entre osnucleotídeos 271 e 272 de SEQ ID NO: 2. Ainda é fornecido um polinucleotí-deo que compreende a seqüência descrita como SEQ ID NO: 2.
Ainda é fornecida uma seqüência que é o complemento de umaseqüência descrita acima.
Em uma modalidade adicional é fornecido um algodoeiro quecompreende um polinucleotídeo descrito acima. Ainda em outra modalidadeé fornecida uma semente de algodão que compreende o polinucleotídeoconforme descrito acima. Em uma outra modalidade, a dita planta é um al-godoeiro inseticida que é um precursor ao evento CE44-69D, o eventoCE44-69D per se, ou uma planta derivada dele que ainda compreende umpolinucleotídeo conforme descrito acima. Ainda em outra modalidade a ditaplanta compreende um segundo cassete de expressão. Em uma modalidadeo dito segundo cassete de expressão codifica uma toxina inseticida VIP3A.
Em outra modalidade, o dito segundo cassete de expressão codifica umaproteína que fornece resistência a um herbicida que compreende ácido deglifosato ou um sal agricolamente aceitável desse.
A pessoa versada está familiarizada com métodos de transfor-mação de plantas. Em particular duas técnicas principais foram caracteriza-das através de uma grande variedade de espécies de plantas: transforma-ção por Agrobacterium e transformação por transferência direta de DNA.
A transformação mediada por Agrobacterium é um método co-rrramenteusadoparatransformação de plantas aicotiledoneas. O-DNA es-tranho a ser introduzido dentro da planta é clonado em um vetor binário en-tre as seqüências consenso da borda direita e esquerda. Essa é a região deT-DNA. O vetor binário é transferido para uma célula de Agrobacterium, queé subseqüentemente usada para infectar tecidos de planta. A região de T-DNA do vetor que compreende o DNA estranho é inserida dentro do genomada planta. O cassete do gene marcador e o cassete do gene da característi-ca podem estar presentes na mesma região de T-DNA, regiões de T-DNAdiferentes no mesmo vetor, ou até mesmo regiões de T-DNA diferentes emvetores diferentes. Em uma modalidade da presente invenção, os cassetesestão presentes em regiões de T-DNA diferentes em vetores diferentes.
Alternativamente, a transferência direta de DNA pode ser usadapara introduzir o DNA diretamente dentro de uma célula de planta. Um mé-todo adequado de transferência direta pode ser o bombardeio de células deplanta com um vetor que compreende o DNA para inserção usando uma ar-ma de partículas (transformação biolística mediada por partículas); outro mé-todo estabelecido, "whiskes", envolve o revestimento do DNA sobre fibras decarboneto de silício sobre as quais as células são imobilizadas. Outros mé-todos para transformar células de planta incluem transformação de proto-plasto (opcionalmente na presença de polietileno glicóis); sonicação de teci-dos, células ou protoplastos de planta em um meio que compreende o poli-nucleotídeo ou vetor; microinserção do polinucleotídeo ou vetor dentro dematerial de planta (opcionalmente empregando a técnica de "whiskers" decarboneto de silício conhecida), eletroporação e semelhantes.
Após a transformação, plantas transgênicas são regeneradas apartir do tecido de planta transformado, e a progênie que possui o DNA es-tranho selecionada usando um marcador apropriado tal como resistência ahigromicina. A pessoa versada está familiarizada com a composição de meiode regeneração adequado. O marcador selecionável pode ser separado doseventos transgênicos por métodos convencionais de reprodução de plantas,assim resultando, por exemplo, no evento CE44-69D.
Uma planta da invenção, conforme descrita aqui, tem efeito inse-ticida sobre insetos de uma ou mais espécies do grupo que compreende He-Ilothis sp. e Helicoverpa sp. que podem infestá-la. "Infestar" como usado a-qui refere-se ao ataque, colonização, alimentação ou dano de qualquer ma-neira por um ou mais insetos. Dessa forma, por exemplo, a planta da pre-sente invenção fornecerá um mecanismo de autodefesa contra infestaçãopor insetos nocivos tais como Helicoverpa zea (lagarta do capulho). Comoresultado, um número reduzido de pulverizações de inseticida é necessáriodurante o cultivo da dita planta em comparação com um algodoeiro nãotransgênico da mesma variedade e a perda de rendimento por insetos noci-vos é mantida em um nível mínimo.
A presente invenção não está limitada ao evento CE44-69D emsi, mas ela é ainda estendida para incluir qualquer material de planta deriva-do dele, incluindo sementes, na medida em que elas contenham pelo menosum dos presentes polinucleotídeos inventivos. A presente invenção inclui,mas não está limitada a plantas que são derivadas de uma reprodução cru-zada com o evento CE44-69D ou um derivado dele por métodos de reprodu-ção convencionais ou outros métodos. A invenção também inclui material deplanta derivado do evento CE44-69D que pode compreender seqüências depolinucleotídeo adicionais, modificadas ou em menor número em compara-ção ao evento CE44-69D ou que exibem outras características fenotípicas.Por exemplo, pode ser desejável transformar material de planta derivado doevento CE44-69D para gerar um novo evento que possui uma característicaadicional, tal como um segundo gene de resistência a insetos. Esse proces-so é conhecido como empilhamento de genes. O segundo gene de resistên-cia a insetos pode codificar, por exemplo, Iecitinas inseticidas, inibidores deprotease inseticidas e proteínas inseticidas derivadas de espécies de Bacil-Ius thuringiensis, Xenorhabdus nematophilus, ou Photorabdus luminescens.
Em um aspecto, o segundo gene de resistência a insetos codifica um geneinseticida de Bacillus thuringiensis. Preferivelmente, o segundo gene de re-sistência a insetos codifica um gene VIP da bactéria Bacillus thuringiensis,cujo gene VIP produz uma toxina com um modo de ação ou sítio de ligaçãodiferente no intestino do inseto do que Cryl Ab para o controle de diferentesespéeies deHnsetorO gene-VtP^pode, por exemplo, ser VIP3A!
A presente invenção ainda fornece material de planta derivadodo evento CE44-69D que possui uma característica adicional tal como resis-tência a herbicidas, resistência a nematódeos, ou resistência a fungos. Emuma modalidade, a dita característica adicional pode ser fornecida, por e-xemplo, por uma enzima de degradação de herbicida, ou uma enzima resis-tente específica do sítio-alvo. Em uma modalidade adicional, a dita caracte-rística de resistência a herbicida fornece resistência a um herbicida quecompreende ácido de glifosato ou um sal agricolamente aceitável desse.
Ainda em uma outra modalidade, a dita característica de resistência a herbi-cida é fornecida por um gene que codifica EPSP sintase ou um mutantedesse.
A presente invenção ainda fornece um método de controlar inse-tos que compreende fornecer o evento CE44-69D ou material de planta deri-vado do evento CE44-69D a um local onde o dito inseto de alimenta. A in-venção ainda fornece adicionalmente um método de controlar insetos quecompreende fornecer o evento CE44-69D ou material de planta derivado doevento CE44-69D a um local onde o dito inseto se alimenta, e aplicar outrosagroquímicos ao dito material de planta tais como herbicidas, fungicidas, eoutros compostos inseticidas incluindo outras proteínas inseticidas. Exem-plos de possíveis compostos inseticidas incluem Iecitinas inseticidas, inibido-res de protease inseticidas, e proteínas inseticidas derivadas de espécies deBacillus thuringiensis, Xenorhabdus nematophilus, ou Photorabdus Iumines-cens. Exemplos de possíveis químicos incluem piretróides, carbamatos, imi-dacloprida, organoclorados e macromoléculas tais como spinosad, abamec-tina ou emamectina.
A presente invenção ainda fornece um método para detectar ma-terial de planta que é derivado do evento CE44-69D, o dito método compre-endendo: (a) preparar uma amostra contendo o DNA genômico do materialde planta a ser testado; (b) obter um par de iniciadores que são adequadospara uso em uma reação de amplificação para amplificar uma seqüênciaselecionada a partir de um grupo que consiste em: (i) uma seqüência quecompreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüência descritacomo SEQ ID NO: 3 e o complemento da mesma e (ii) uma seqüência quecompreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüência descritacomo SEQ ID NO: 4 e o complemento da mesma; (c) adicionar o dito par deiniciadores à dita amostra e os recursos para realizar uma reação de amplifi-cação; (d) realizar uma reação de amplificação; e (e) visualizar a seqüênciaassim amplificada.
Há vários métodos de amplificação que podem ser usados deacordo com os métodos da invenção. O princípio envolvido é a reação emcadeia da polimerase (PCR), uma técnica conhecida daqueles versados natécnica. O produto da amplificação de uma reação de PCR pode ser visuali-zado por marcação com brometo de etídeo e excitação com luz UV, tipica-mente após separação por tamanho usando eletroforese em gel de agarose.
Em uma modalidade particular da invenção, variações do princípio de PCR,tal como TaqMan®, podem ser usados. Tais técnicas envolvem a marcaçãode pelo menos um dos iniciadores envolvidos no processo de amplificaçãocom um corante fluorescente. Quando não ligado, o iniciador adota uma con-formação tal que nenhuma fluorescência pode ser detectada. Entretanto,quando o iniciador está ligado a um pedaço de DNA, a conformação muda ea fluorescência pode ser detectada. Dessa maneira, o processo de amplifi-cação pode ser monitorado em tempo real, a intensidade de fluorescênciacorrespondendo diretamente ao nível de amplificação.
A análise por TaqMan® pode ser útil, por exemplo, para detectara presença do evento CE44-69D em um meio de algodão selvagem, ou paradetectar a presença acidental de CE44-69D em outro germoplasma. Modali-dades adicionais da presente invenção incluem, mas não estão limitas a,RACE PCR.
Uma modalidade adicional da presente invenção envolve o usode PCR multiplex para distinguir entre material de planta CE44-69D homozi-goto e material de planta CE44-69D heterozigoto. Isso é conhecido pelosversados na técnica como teste de zigosidade, e envolve o uso de iniciado-res de PCR que se ligam a partes específicas do genoma do algodão e/ou
-DHA inseridor A presença ou aüsência de cada um^dos tfoi produtos deamplificação de tamanhos particulares indica se a amostra em teste é hemi-zigota ou homozigota para CE44-69D. Iniciadores adequados para isso emtal teste de zigosidade são descritos como SEQ ID NOs 6, 8 e 9.
A presente invenção ainda fornece um método para detectaruma planta que contém o polinucleotídeo descrito como SEQ ID NO: 1 o ditométodo compreendendo: (a) preparar uma amostra contendo o DNA genô-mico da planta a ser testada; (b) obter um par de iniciadores que são ade-quados para uso em uma reação de amplificação para amplificar uma se-qüência que compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüên-cia descrita como SEQ ID NO: 3 e o complemento da mesma; (c) adicionar odito par de iniciadores a dita amostra e os recursos para realizar uma reaçãode amplificação; (d) realizar uma reação de amplificação; e (e) visualizar aseqüência assim amplificada.
A presente invenção ainda fornece um método conforme descri-to acima em que os ditos iniciadores são adequados para uso em uma rea-ção de amplificação para amplificar uma seqüência que compreende pelomenos 20 nucleotídeos contíguos da seqüência descrita como SEQ ID NO: 3e o complemento da mesma. Ainda em uma outra modalidade os ditos inici-adores são adequados para uso em uma reação de amplificação para ampli-ficar uma seqüência que compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguosda seqüência descrita como SEQ ID NO: 3 e o complemento da mesma. A-inda em uma outra modalidade os ditos iniciadores são adequados para usoem uma reação de amplificação para amplificar uma seqüência que compre-ende a seqüência descrita como SEQ ID NO: 3 e o complemento da mesma.
A presente invenção ainda fornece adicionalmente um métodoconforme descrito acima em que a seqüência a ser amplificada pela dita re-ação de amplificação compreende uma seqüência que contém a junção denucleotídeos do inserto do cassete do transgene - seqüência genômica (g-g)fornecida como os nucleotídeos 135/136 de SEQ ID NO: 1. O versado natécnica observará que essa junção pode ser usada para caracterizar e assimidentificar o evento, e então está bem dentro do âmbito do dito versado natécnica projetar e produzir seqüências de iniciadores de oligonucleotídeo quesão adequadas para uso em uma reação de amplificação para amplificar aseqüência que compreende a junção supramencionada. O versado na técni-ca também observará que as seqüências de iniciadores adequadas para usoem uma reação de amplificação podem ser projetadas com base na seqüên-cia genômica que está a 5', isto é, a montante do nucleotídeo número 1 deSEQ ID NO: 1 e o inserto ou seqüência genômica que está a 3', isto é, a ju-sante do nucleotídeo número 230 de SEQ ID NO: 1.
A presente invenção ainda fornece um método para detectaruma planta que contém o polinucleotídeo descrito como SEQ ID NO: 1 o ditométodo compreendendo: (a) preparar uma amostra que contém o DNA ge-nômico da planta a ser testada; (b) obter um par de iniciadores que são ade-quados para uso em uma reação de amplificação para amplificar uma se-qüência que compreende pelo menos 35 nucleotídeos contíguos da seqüên-cia descrita como nucleotídeos 106 a 165 de SEQ ID NO: 1 e o complemen-to da mesmas; (c) adicionar o dito par de iniciadores à dita amostra e os re-cursos para realizar uma reação de amplificação; (d) realizar uma reação deamplificação; e (e) visualizar a seqüência assim amplificada. Em uma moda-lidade adicional, os ditos iniciadores são adequados para uso em uma rea-ção de amplificação para amplificar uma seqüência que compreende pelomenos 40 nucleotídeos contíguos da seqüência descrita como nucleotídeos106 a 165 de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade adicional os ditos iniciado-res são adequados para uso em uma reação de amplificação para amplificaruma seqüência que compreende pelo menos 50 nucleotídeos contíguos daseqüência descrita como nucleotídeos 106 a 165 de SEQ ID NO: 1. Em umamodalidade adicional os ditos iniciadores são adequados para uso em umareação de amplificação para amplificar uma seqüência que compreende aseqüência descrita como nucleotídeos 106 a 165 de SEQ ID NO: 1.
Ainda em uma outra modalidade os ditos iniciadores são ade-quados para uso em uma reação de amplificação para amplificar uma se-qüência que compreende pelo menos 50, 100 ou 150 nucleotídeos contíguosde SEQ ID NO: 1 a dita seqüência contendo a junção de nucleotídeos entre-os nucteotídeos135 a^36 de SEQ ID-NOr iTOsiniüiãdüresTefefidõs aquiacima são adequados para uso em uma reação de amplificação para ampli-ficar as seqüências mencionadas acima e as seqüências complementares dessas.
A presente invenção ainda fornece adicionalmente uma seqüên-cia que é o produto de amplificação do método descrito acima.
A presente invenção ainda fornece adicionalmente uma seqüên-cia que é o complemento de uma seqüência descrita acima.
A presente invenção ainda fornece adicionalmente um métodoconforme mencionado acima, em que o produto assim amplificado compre-ende uma seqüência conforme descrita acima.
A presente invenção ainda fornece adicionalmente um métodoconforme descrito acima em que o dito par de iniciadores compreende uminiciador de sentido direto que compreende uma seqüência que quando lidana direção 5'->3' é idêntica a uma região da seqüência descrita como nucle-otídeos 1 a 135 de SEQ ID NO: 1 e um iniciador de sentido reverso quecompreende uma seqüência que quando lida na direção 5'->3' é idêntica auma região do complemento reverso da seqüência descrita como nucleotí-deos 136 a 230 de SEQ ID NO: 1. O versado na técnica reconhecerá quevários iniciadores adequados para uso nos métodos da invenção podem sercriados com base nas seqüências fornecidas aqui e nas seqüências com-plementares a elas. Além disso, conforme mencionado acima, tais seqüên-cias de iniciadores podem ser baseadas na seqüência 5' e 3' (a montante e ajusante) das seqüências descritas como SEQ ID NO: 1 e está dentro da ca-pacidade da pessoa versada na técnica identificar tal seqüência 5' e 3'.
Em uma modalidade particular da invenção o dito par de inicia-dores compreende as seqüências descritas como SEQ ID NO: 5 e 6. Emuma modalidade adicional da invenção o dito par de iniciadores compreendeas seqüências descritas como SEQ ID NO: 6 e 8. Em uma modalidade adi-cional da invenção o dito par de iniciadores compreende as seqüências des-critas como SEQ ID NO: 10 e 11.
A presente invenção ainda fornece um método para detectaruma planta que contém o polinucleotídeo descrito como SEQ ID NO: 2, odito método compreendendo: (a) preparar uma amostra que contém o DNAgenômico da planta a ser testada; (b) obter um par de iniciadores que sãoadequados para uso em uma reação de amplificação para amplificar umaseqüência que compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da se-qüência descrita como SEQ ID NO: 4 e o complemento da mesma; (c) adi-cionar o dito par de iniciadores à dita amostra e os recursos para realizaruma reação de amplificação; (d) realizar uma reação de amplificação; e (e)visualizar a seqüência assim amplificada.
A presente invenção ainda fornece um método conforme descri-to acima, em que os ditos iniciadores são adequados para uso em uma rea-ção de amplificação para amplificar uma seqüência que compreende pelomenos 20 nucleotídeos contíguos da seqüência descrita como SEQ ID NO: 4e o complemento da mesma. Ainda em uma outra modalidade os ditos inici-adores são adequados para uso em uma reação de amplificação para ampli-ficar uma seqüência que compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguosda seqüência descrita como SEQ ID NO: 4 e o complemento da mesma. A-inda em uma outra modalidade os ditos iniciadores são adequados para usoem uma reação de amplificação para amplificar uma seqüência que compre-ende a seqüência descrita como SEQ ID NO: 4 e o complemento da mesma.
A presente invenção ainda fornece adicionalmente um métodoconforme descrito acima em que a seqüência a ser amplificada pela dita re-ação de amplificação compreende uma seqüência que contém a junção denucleotídeos do inserto do cassete do transgene -seqüência genômica (t-c)fornecida como os nucleotídeos 271/272 de SEQ ID NO: 2. O versado natécnica observará que essa junção pode ser usada para caracterizar a assimidentificar o evento e então está dentro do âmbito do dito versado na técnicaprojetar e produzir seqüências de iniciadores de oligonucleotídeos que sãoadequadas para uso em uma reação de amplificação para amplificar a se-qüência que compreende a junção supramencionada. O versado na técnicatambém observará que as seqüências de iniciadores adequadas para issoem uma reação de amplificação podem ser projetadas com base no insertoou na seqüência gènômica montante do nucleofídêõnúmero 1 de SEQ ID NO: 2 e a seqüência genômica que está a 3' isto é, ajusante do nucleotídeo número 659 da seqüência genômica de SEQ ID NO: 2.
A presente invenção ainda fornece um método para detectaruma planta que contém o polinucleotídeo descrito como SEQ ID NO: 2, odito método compreendendo: (a) preparar uma amostra que contém o DNAgenômico da planta a ser testada; (b) obter um par de iniciadores que sãoadequados para uso em uma reação de amplificação para amplificar umaseqüência que compreende pelo menos 35 nucleotídeos contíguos da se-qüência descrita como nucleotídeos 242 a 301 de SEQ ID NO: 2 e o com-plemento da mesma; (c) adicionar o dito par de iniciadores à dita amostra eos recursos para realizar uma reação de amplificação; (d) realizar uma rea-ção de amplificação; e (e) visualizar a seqüência assim amplificada. Em ou-tra modalidade os ditos iniciadores são adequados para uso em uma reaçãode amplificação para amplificar uma seqüência que compreende pelo menos40 nucleotídeos contíguos da seqüência descrita como nucleotídeos 242 a301 de SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade os ditos iniciadores são ade-quados para uso em uma reação de amplificação para amplificar uma se-qüência que compreende pelo menos 50 nucleotídeos contíguos da seqüên-cia descrita como nucleotídeos 242 a 301 de SEQ ID NO: 2. Em outra moda-lidade os ditos iniciadores são adequados para uso em uma reação de am-plificação para amplificar uma seqüência que compreende a seqüência des-crita como nucleotídeos 242 a 301 de SEQ ID NO: 2.
Ainda em uma outra modalidade os ditos iniciadores são ade-quados para uso em uma reação de amplificação para amplificar uma se-qüência que compreende pelo menos 50, 100, 150, 200, 300, 400 ou 500nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 2 a dita seqüência contendo a junçãode nucleotídeos entre os nucleotídeos 271 e 272 de SEQ ID NO: 2. Os inici-adores referidos acima são adequados para uso em uma reação de amplifi-cação para amplificar as seqüências mencionadas acima e as seqüênciascomplementares dessas.
A presente invenção ainda fornece uma seqüência que é o pro-duto de amplificação do método descrito acima.
A invenção ainda fornece uma seqüência que é o complementode uma seqüência descrita acima.
A presente invenção ainda fornece um método conforme men-cionado acima em que o produto assim amplificado compreende uma se-qüência conforme descrita acima.
A presente invenção ainda fornece adicionalmente um métodoconforme descrito acima em que o dito par de iniciadores compreende uminiciador de sentido direto que compreende uma seqüência que quando lidana direção 5'->3' é idêntica a uma região da seqüência descrita como nucle-otídeos 1 a 271 de SEQ ID NO: 2 e um iniciador de sentido reverso quecompreende uma seqüência que quando lida na direção 5'~>3' é idêntica aocomplemento reverso da seqüência descrita como nucleotídeos 272 a 659de SEQ ID NO: 2. O versado na técnica reconhecerá que vários iniciadoresadequados para uso nos métodos da invenção podem ser criados com basenas seqüências fornecidas aqui e nas seqüências complementares a elas.
Além disso, conforme mencionado acima, tais seqüências de iniciadores po-dem ser baseadas na seqüência 5' e 3' (a montante e a jusante) das se-qüências descritas como SEQ ID NO: 2 e está dentro da capacidade da pes-soa versada identificar tal seqüência a 5' e a 3'.
A presente invenção ainda fornece adicionalmente um métodopara detectar um material de planta derivado do evento CE44-69D, o ditométodo compreendendo: (a) preparar uma amostra que contém o DNA ge-nômico da planta a ser testada; (b) obter uma sonda que é capaz de hibridi-zar a uma seqüência selecionada a partir do grupo que consiste em umaseqüência que compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da se-qüência descrita como SEQ ID NO: 3 e uma seqüência que compreendepelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüência descrita como SEQ IDNO: 4; (c) adicionar pelo menos uma das sondas da etapa (b) à dita amostrasob condições que permitem que a dita sonda hibridize com um ácido núcle-ico complementar dentro da dita amostra; (d) remover a sonda substancia!-mente nao-nibridizaaa por lavagem; e (ê)~detectar a sonda assim hibridizadapara identificar se a amostra é do evento CE44-69D.
A presente invenção ainda fornece um método para detectaruma planta que contém o polinucleotídeo descrito como SEQ ID NO: 1, odito método compreendendo (a) preparar uma amostra que contém o DNAgenômico da planta a ser testada; (b) obter uma sonda que é capaz de hibri-dizar a uma seqüência que compreende pelo menos 18 nucleotídeos contí-guos da seqüência descrita como SEQ ID NO: 3 (c) adicionar a sonda à ditaamostra sob condições que permitem que a dita sonda hibridize a um ácidonúcleico complementar dentro da dita amostra; (d) remover a sonda subs-tancialmente não-hibridizada por lavagem; e (e) detectar a sonda assim hi-bridizada para identificar se a amostra contém o dito polinucleotídeo. .
A presente invenção ainda fornece um método para detectaruma planta que contém o polinucleotídeo descrito como SEQ ID NO: 2, odito método compreendendo: (a) preparar uma amostra que contém o DNAgenômico da planta a ser testada; (b) obter uma sonda que é capaz de hibri-dizar a uma seqüência que compreende pelo menos 18 nucleotídeos contí-guos da seqüência descrita como SEQ ID NO: 4 (c) adicionar a sonda à ditaamostra sob condições que permitem que a dita sonda hibridize a um ácidonúcleico complementar dentro da dita amostra; (d) remover a sonda subs-tancialmente não-hibridizada por lavagem; e (e) detectar a sonda assim hi-bridizada para identificar se a amostra contém o dito polinucleotídeo.
Em uma modalidade particular dos métodos descritos acima adita sonda compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos. Ainda emuma outra modalidade do dito método, a dita sonda compreende pelo menos50, 100 ou 150 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, a dita sonda con-tendo a junção de nucleotídeos entre os nucleotídeos 135 e 136 de SEQ IDNO: 1 ou pelo menos 50, 100, 150, 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos contí-guos de SEQ ID NO: 2, a dita sonda contendo a junção de nucleotídeos en-tre os nucleotídeos 271 e 272 de SEQ ID NO: 2. Ainda em uma outra moda-lidade da invenção, a dita sonda pode compreender um fragmento de umpolinucleotídeo relevante descrito dentro dessa especificação. Em particular,a dita sonda pode compreender uma seqüência de polinucleotídeo que écapaz de hibridizar a uma seqüência que caracteriza o evento descrito nopresente pedido. Ainda em uma outra modalidade do dito método, a dita la-vagem ocorre sob condições de alta estringência. A dita sonda pode ser ge-rada e marcada usando técnicas bem-conhecidas do versado na técnica.A sonda pode ser, por exemplo, um produto de PCR ou frag-mento de digestão de restrição. Em outra modalidade, a sonda conformedescrita aqui pode ser sinalizada com um marcador fluorescente, radioativo,enzimático ou outro marcador adequado para permitir que a hibridizaçãoseja detectada.
Ainda em uma outra modalidade da presente invenção é forne-cido um método de hibridizar uma sonda ao ácido núcleico complementardentro da amostra sob condições estringentes e detectar se a sonda hibridi-zou. Condições de hibridização de alta estringência são bem-conhecidas dosversados na técnica e compreendem, por exemplo, hibridização em umatemperatura de cerca de 65°C em uma solução contendo 6 χ SSC, 0,01% deSDS e 0,25% de leite em pó desnatado, seguido por enxágüe a mesmatemperatura em uma solução contendo 0,2 χ SSC e 0,1% de SDS. A pessoaversada pode selecionar alternativamente as seguintes condições de hibridi-zação, designadamente., hibridização em uma temperatura entre 60°C e65°C em salina tamponada com citrato de força 0,3 contendo 0,1% de SDSseguido por enxágüe a mesma temperatura com salina tamponada com ci-trato de força 0,3 contendo 0,1% de SDS. O versado na técnica também po-de selecionar outras condições de hibridização que são igualmente entendi-das como sendo condições de "alta estringência". Técnicas adequadas paradetectar material de planta derivado do evento descrito aqui com base noprincípio de hibridização incluem, mas não são limitadas a Southern Blots,Northern Blots e hibridização in-situ. A pessoa versada está familiarizadacom essas técnicas. Tipicamente elas envolvem incubar uma sonda comuma amostra, lavar para remover a sonda não ligada, e detectar se a sondahibridizou. O dito método de detecção é dependente do tipo de sinalizadorligado à sonda - por exemplo, uma sonda marcada radioativamente pode serdetectada por expOsiçãO e revelação de filme de raio x. Alternativamente,uma sonda marcada enzimaticamente pode ser detectada por conversão deum substrato para causar uma mudança de cor.
Ainda em outro aspecto é fornecido um método para identificaruma planta que compreende o evento CE44-69D, o dito método compreen-dendo (a) preparar uma amostra que contém o DNA genômico da planta aser testada; (b) digerir o dito DNA através de uma enzima de restrição; (c)separar os fragmentos de DNA digeridos e transferir os fragmentos assimseparados para uma membrana; (d) testar os fragmentos assim ligados comuma sonda, projetada conforma descrito acima, cuja sonda deve ser marca-da para permitir sua visualização; (e) remover a sonda substancialmente nãohibridizada; e (f) detectar a sonda assim hibridizada em que o dito eventopode ser caracterizado pela dita sonda hibridizando aos fragmentos que têmum tamanho particular.
Em outro aspecto é fornecido um evento de algodão que é ca-paz de ser identificado por um método de acordo com a invenção. Em umamodalidade particular o dito método é um de acordo com o parágrafo anterior.
A presente descrição também inclui um método para detectaruma planta que contém uma proteína capaz de ser codificada por um polinu-cleotídeo descrito como SEQ ID NO: 7, o dito método compreendendo: (a)preparar um extrato de proteína da planta a ser testada; (b) fornecer um an-ticorpo que é capaz de se ligar a uma proteína CryIAb de Bacillus thuríngi-ensis; (c) adicionar o dito anticorpo ao dito extrato sob condições que permi-tem que o dito anticorpo se ligue à dita proteína dentro do dito extrato; e (d)detectar o anticorpo assim ligado para identificar se o extrato contém a ditaproteína.
A presente descrição também inclui um método para detectaruma planta que compreende um gene CryIAb de Bacillus thuringiensis, odito método compreendendo: (a) preparar um extrato de proteína da planta aser testada; (b) fornecer um anticorpo que é capaz de se ligar a uma proteí-na CryIAb de Bacillus thuringiensis·, (c) adicionar o dito anticorpo ao dito ex-trato ou o dito extrato ao dito anticorpo sob condições que permitem que odito anticorpo se ligue à dita proteína CryIAb dentro do dito extrato; e (d)detectar o anticorpo assim ligado para identificar se o extrato contém a ditaproteína CryIAb. Esse método é útil para distinguir entre plantas que ex-pressam Cry 1 Ab, tal como plantas que compreendem CE44-69D, e plantasque não expressam CryIAb.
Métodos adequados de detectar material de planta derivado doevento descrito aqui, cujos métodos se baseiam na dita ligação de anticorpoincluem, mas não são limitados a Western Blots1 Ensaios ImunoabsorventesLigados a Enzima (ELISA) e espectrometria de massa SELDI. A pessoa ver-sada está familiarizada com essas e outras técnicas imunológicas. Etapastípicas incluem incubar uma amostra com um anticorpo que se liga à ditaproteína, lavar para remover anticorpo não ligado, e detectar se o anticorpose ligou. Vários de tais métodos de detecção se baseiam em reações enzi-máticas - por exemplo o anticorpo pode ser sinalizado com uma enzima talcomo peroxidase de rábano silvestre, e por aplicação de um substrato ade-quado, uma mudança de cor é detectada. Anticorpos adequados podem sermonoclonais ou policlonais.
A presente descrição também inclui um método de detectar ma-terial de planta derivado de um evento descrito aqui, o dito método compre-endendo obter uma amostra para análise; fazer um extrato de proteína daamostra; fornecer uma fita de teste ou fita reagente projetada para detectar apresença de uma dita proteína dentro da amostra; incubar a fita de teste oufita reagente com a amostra; e detectar se a dita proteína está presente.
Esse método pode ser um método de detecção à base de anti-corpo para os eventos referidos aqui e usa fitas de teste ou fita de teste. E-tapas típicas incluem incubar uma fita de teste ou fita reagente com umaamostra e observar a presença ou ausência de bandas coloridas na fita deteste ou fita reagente. As bandas coloridas são indicativas da presença deuma proteína na amostra. Tais testes de fita de teste ou fita reagente sãogeralmente específicos para uma proteína, e podem ser usados para testerapido de amostras no campo.
Em uma modalidade, o método imunológico ou fita reagente uti-liza um anticorpo ou anticorpos, ou fragmento/fragmentos desses, específi-cos para o gene CryIAb de Bacillus thuringiensis conforme codificado porSEQ ID NO: 7. Os fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limitadosa, fragmentos Fab, Fab modificado, diFab, Fab', F(ab')2 ou FV, monômerode cadeia leve ou de cadeia pesada de imunoglobulina, FV de cadeia única(scFV) ou nanocorpo. O anticorpo ou fragmento desse pode ser monoclonalou policlonal. Em uma modalidade particular, o. anticorpo é um anticorpo se-cretado por linhagens celulares selecionadas a partir do grupo que consisteem DSM ACC2723 e DSM ACC2724 (ambas depositadas em 12 de maio de2005 no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,MascheroderWeg 1b, 38124 Braunschweig, Alemanha) ou um anticorpo queé capaz de inibir a ligação a CryIAb de um anticorpo secretado por linha-gens celulares selecionadas a partir do grupo que consiste em DSMACC2723 e DSM ACC2724. Observa-se que métodos para produzir tantoanticorpos monoclonais como policlonais e fragmentos desses são bem-conhecidos na técnica.
Fitas de teste ou fita de teste adequados e materiais para seuuso são descritos no pedido PCT WO 02/27322 e são, por exemplo, "lateral-flow immunostrips" que compreendem uma membrana de detecção de ace-tato de celulose, celulose, nitrocelulose ou náilon, sustentada sobre um a -poio plástico. Tal "immunostrip" pode ser produzido usando membranas efiltros através dos quais uma amostra líquida é puxada para cima por açãocapilar. A proteína na amostra reage com os anticorpos contidos no "immu-nostrip" enquanto ela se move pela extensão da fita e é capturada em umalinha que se torna visível. Meios adequados de detecção são, por exemplo,ouro coloidal e esferas de látex coloridas.
Em uma modalidade particular, uma linha de anticorpo anti-CryIAb específico, conforme descrito acima, é pulverizado sobre uma fita deteste, que é adequadamente feita de nitrocelulose sustentada sobre um a -poio plástico. Uma linha de anticorpo anticamundongo de controle de rea-gente é pulverizada em paralelo acima da primeira linha de anticorpo. Amembrana é flanqueada na parte superior por uma almofada de absorção ena parte inferior por uma almofada contendo anticorpo anti-Cry1Ab marcadocom ouro coloidal seco. Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-CryIAb marcado com ouro coloidal é diferente do primeiro anticorpo pulveri-zado na linha de teste. Em uma modalidade particular, o anticorpo anti-Cry1Ab marcado com ouro coloidal é o anticorpo secretado pela linhagemcelular DSM ACC2723 e o anticorpo pulverizado na linha de teste é o anti-corpo secretado pela linhagem celular DSM ACC2724. Uma almofada apli-cação de amostra flanqueia a almofada de ouro coloidal. Em uso, a almofa-da de aplicação de amostra é colocada em uma amostra de tecido extraídoou essa amostra é aplicada à almofada de outra maneira, por exemplo, porpipeta. Qualquer proteína CryIAb contida na amostra flui para cima na fita efica ligada pelo anticorpo anti-Cry1Ab marcado com ouro coloidal. Enquantocontinua a subir na fita, a proteína também fica ligada pelo anticorpo anti-CryIAb na linha de teste. O conjugado de ouro em excesso é capturado nalinha de controle de reagente. Em um teste positivo, isto é, se CryIAb estápresente na amostra, uma linha vermelha dupla aparece: a linha inferior indi-ca a presença de CryIAb enquanto que a linha superior é a linha de controleque sinaliza que o aparelho está funcionando de forma apropriada.
Ainda em outro aspecto da invenção é fornecido um kit de partesque compreende um par de iniciadores, conforme descrito acima, e instru-ções para executar o método conforme descrito acima e recursos para exe-cutar uma reação de amplificação e opcionalmente recursos para preparar aamostra a ser testada. Ainda em uma outra modalidade é fornecido um kit departes que compreende um anticorpo conforme descrito acima e instruçõespara executar o método conforme descrito acima e recursos para executar ométodo conforme descrito acima e opcionalmente recursos para preparar aamostra a ser testada. Ainda em uma outra modalidade da presente inven-ção, o dito-kit de partes pode compreender tecnologia de detecção de ampli-ficação de DNA tal como PCR ou TaqMan®. Ainda em uma outra modalida-de da presente invenção, o dito kit de partes pode compreender tecnologiade detecção de hibridização de sonda, tal como Southern Blots1 NorthernBlots ou hibridização in-situ. Em outra modalidade da presente invenção odito kit de partes pode compreender tecnologia de detecção de ligação deanticorpo, tal como Western Blots, ELISA's, espectrometria de massa SEL-Dl1 fitas de teste ou fita de teste. Em outra modalidade da presente invenção,o dito kit de partes pode compreender qualquer combinação das tecnologiasde detecção acima mencionadas. Em outra modalidade da presente inven-ção, o dito kit de partes pode compreender, na forma de instruções, um oumais dos métodos descritos acima.
Ainda em outro aspecto é fornecido uma planta ou semente deacordo com a invenção que é usado em um método de reprodução. Por e-xemplo, as plantas podem ser usadas para transferir a característica quefornece resistência a insetos em uma planta do mesmo gênero, mas que temum germoplasma diferente. Tal reprodução em um germoplasma diferentepode ser desejada se a planta tiver que ser cultivada em condições onde umgermoplasma alternativo for favorável. Métodos para reprodução que podemser usados para transferir a característica para um germoplasma diferentesão bem-conhecidas na técnica.
Ainda em outro aspecto é fornecido o uso de uma planta ou se-mente de acordo com a invenção para gerar material de explante para usoem um método de transformação do dito explante com uma característicagenética adicional. Uma vez fornecido com os eventos que podem ser identi-ficados pelos métodos da presente invenção, está dentro da capacidade doversado na técnica gerar tal material de explante e usar em procedimentosde transformação adicionais. Além disso, uma vez fornecido com os eventosque podem ser identificados pelos métodos da presente invenção está den-tro da capacidade do versado na técnica usar os ditos eventos em métodosde reprodução conforme descrito aqui.
De acordo com a presente invenção, é fornecido o uso de um oumais dos polinucleotídeos da invenção conforme descrito acima para detec-tar o evento CE44-69D. Em uma modalidade, os ditos polinucleotídeos po-dem ser usados em um método para detectar o evento CE44-69D conformedescrito acima.
EXEMPLOS
A invenção será mais clara a partir dos seguintes exemplos nãoIimitantes em conjunto com as listagens de seqüência associadas conformedescrito abaixo:<table>table see original document page 27</column></row><table>
Exemplo 1: Clonagem e Transformação
1.1 Clonagemdevetor
Técnicas de clonagem de gene usuais de digestão de restrição eligação de fragmentos de vetores "in-house" foram usadas para construir osvetores de transformação, pNOV1914 e pNOV4641. O vetor pNOV1914 in-cluiu um cassete de marcador selecionável compreendendo um promotor deUbiquitina (UBQ3), o íntron de UBQ3, uma seqüência gênica que codificauma proteína que confere resistência a higromicina, e uma seqüência nos depoliadenilação. O vetor pNOV4641 incluiu o cassete de expressão do genealvo, cujo cassete compreendeu um promotor de Actina (ACT2), o íntron deACT2, uma seqüência que codifica o gene CryIAb que foi códon otimizadopara expressão em milho, e uma seqüência de poliadenilação nos.
Os vetores foram transformados na cepa GV3101 de Agrobacte-rium tumefaciens usando técnicas de transformação de Agrobacterium usu-ais, e as células transformadas foram selecionadas através de resistência aantibiótico.
1.2 Transformação de planta
O evento CE44-69D foi produzido por transformação de Gossy-pium hirsutum L. cv Coker 312 mediada por Agrobacterium.
As sementes de Coker 312 foram semeadas na estufa. Pecíolosnovos foram cortados de plantas de 3 a 5 semanas de idade, e esterilizadospor imersão em etanol 70%. Os pecíolos foram então imersos em uma solu-ção de 5% de Clorox + 2 ml/l de Tween20 por 20 minutos. Os pecíolos foramlavados 3 vezes em ddHbO. As extremidades dos pecíolos foram cortadas, eos pecíolos foram transferidos para meio de pré-cultura de pecíolo (4,3 g/l desais MS, vitaminas B5 (100 mg/l de mio-lnositol, 1 mg/l de ácido nicotínico, 1mg/l de piridoxina HCI1 10 mg/l de tiamina HCI), 30 g/l de glicose, 2,4 g/l defitogel, pH 7.0) e deixados pré-cultivar com claridade a 30°C por 3 dias.
Culturas de 2 ml de Agrobacterium contendo os construtospNOV1914 e pNOV4641 foram cultivadas durante a noite em antibióticosapropriados e então diluídas com meio MMS1 líquido (4,3 g/l de sais MS,vitaminas B5 (100 mg/l de mio-lnositol, 1 mg/l de ácido nicotínico, 1 mg/l depiridoxina HCI, 10 mg/l de tiamina HCI), 0,05 mg/l de 2,4-D, 0,1 mg/l de qui-netina, 30 g/l de glicose, pH 6,5) para uma OD6eo de entre 0,1 e 0,2.
As extremidades foram cortadas dos pecíolos e colocadas em10 a 20 ml de solução bacteriana em uma placa de petri estéril. Uma vez nasolução, os pecíolos foram cortados longitudinalmente e então cortados emseções de 2 cm. Após os explantes dos pecíolos terem sido molhados emsolução bacteriana por 5 a 10 minutos, eles foram transferidos para placasde co-cultura (fórmula semelhan.te àquela do líquido MMS1 com a adição de2,4 g/l de Fitagel) cobertos com papéis de filtro estéreis, e deixados co-cultivar a 24°C por 48 a 72 horas sob baixa intensidade de luz. Os explantesco-cultivados foram transferidos para meio MMS1 (fórmula semelhante à-quela do meio líquido MMS1, adicionalmente com 2,4 g/l de Fitogel) conten-do 500 mg/l de cefotaxima e 10 mg/l de higromicina, e incubados a 30°C sobum ciclo de luz de 16 horas de luminosidade e 8 horas de escuridão. Os ex-plantes foram transferidos para meio novo após 2 semanas, e a cada 4 a 6semanas após isso até que o calo fosse formado.
Uma vez que os calos atingiam o tamanho de uma ervilha, eleseram removidos dos explantes e transferidos para meio MMS1 novo conten-do 500 mg/l de cefotaxima e 10 mg/l de higromicina, e mantidos em culturade tecido por subcultivo a cada 4 semanas conforme apropriado.
Tecido de calo de 1,5 g foi completamente fragmentado e colo-cado em um frasco de Erlenmeyer de 50 ml contendo 10 ml de meio MMS2líquido (4,3 g/l de sais MS, vitaminas B5 (100 mg/l de mio-lnositol, 1 mg/l deácido nicotínico, 1 mg/l de piridoxina HCI, 10 mg/l de tiamina HCI), 1,9 g/l deKNO3, 30 g/l de glicose, pH 6,5). O calo suspenso foi agitado a 100 rpm comclaridade a 30°C foi duas semanas. As células da cultura de suspensão fo-das sobre meio MMS2 sólido (fórmula semelhante àquela do meio MMS2líquido, adicionalmente com 2,4 g/L de fitogel). Uma vez plaqueadas, o meioMMS2 líquido em excesso foi removido, e as placas incubadas a 30°C comclaridade. As placas foram checadas quanto ao desenvolvimento de embri-ões somáticos a cada semana. Os embriões somáticos se formaram dentrode 1 a 2 meses. Essa etapa de suspensão líquida poderia ser repetida váriasvezes até que o calo embriogênico ou embriões somáticos fossem formados.
Os embriões somáticos foram transferidos para meio EG (germi-nação de embrióide) (2,65 g/l de sais MS modificação No. 4 (Duchefa), 1,9g/l de KNO3, vitaminas B5 (como antes), 30 g/l de glicose, 1 g/l de glutaminae 0,5 g/l de asparagina, pH 6,5), e sub cultivado para meio EG novo a cada 3a 4 semanas.
Uma vez que os embriões somáticos ficaram verdes e erammaiores do que 2 cm, eles foram plaqueados com a raiz para baixo em meioEG. Em todos os estágios de regeneração, as plântulas em crescimento fo-ram impedidas de atingir as tampas ou bordas dos seus recipientes paraevitar queda de folhas. Os embriões germinados com 1 a 2 folhas verdadei-ras foram transferidos para meio EG em recipientes Greiner de 175 ml. Plân-tulas resistentes com folhas verdadeiras foram transferidas para substratosde turfa estéreis expandidos com dH20 em Greiners de 175 ml e transferidospara turfa em vasos de 7,62 cm (3 inch). As plantas foram aclimatizadas emum propagador de plantas em alta umidade em um gabinete de crescimentosob condições de 14 horas de luz do dia a 30°C e 10 horas de escuridão a20'C. Uma vez que as ratzes foram vistas crescendo através dos furos dedrenagem do vaso elas foram transferidas para vasos maiores contendo50% de John Innes No. 3 e 50% de turfa suplementada com Osmocote, ecolocadas na estufa.
1.3 Identificação e seleção de transgênicosPlantas supostamente transgênicas foram rastreadas por PCRpara a presença do gene CryIAb. Os eventos positivos foram identificados erastreados usando bioensaios de insetos para atividade inseticida. A carac-terização molecular de linhagens inseticidas foi realizada por análise de Sou-thern Blot. Sementes T1 de vários eventos foram observadas em um testede campo para resistência a insetos e qualidade agronômica. O eventoCE44-69D foi escolhido com base na caracterização molecular, níveis deexpressão de proteína identificados por ELISA, atividade inseticida contraHeliothis virescens e Spodoptera Iittoralis e eficiência de campo. O cassetedo marcador selecionável de higromicina foi segregado usando reproduçãode planta convencional para resultar no evento CE44-69D.
1.4 Verificação da seqüência de CE44-69D
DNA genômico foi isolado do evento CE44-69D. Ele foi usado noseqüenciamento das junções do sítio de inserção de DNA com o DNA ge-nômico de algodão no evento CE44-69D (SEQ ID NOs: 1 e 2), usando técni-cas de seqüenciamento de DNA usuais.
Exemplo 2: Detecção específica do evento CE44-69D através de PCR
2.1 Extração de DNA
DNA foi extraído de tecido de folha usando o Wizard® Magnetic96 DNA Plant System (Promega, n9 FF3760), de acordo com as instruçõesdo fabricante, com uma etapa adicional no início do protocolo: após tritura-ção do material da folha, 0,9 ml de Tampão de Extração de Algodão (Tris0,2M pH 8.0, EDTA 50mM, NaCI 0,25M, 0,1% v/v de 2-mercaptoetanol, 2,5%p/v de polivinil-pirrolidona) foi adicionado a cada cavidade, o tecido de plantaressupenso e a placa centrifugada a 4.000 rpm (2755g) por 10 minutos. A-pós aspirar e descartar o sobrenadante, 300 μΙ de Tampão de Lise A (Pro-mega) foram adicionados e o protocolo do fabricante foi seguido a partirdesse ponto. Esse procedimento resultou em aproximadamente 85 μΙ deDNA genômico purificado em uma concentração de aproximadamente 10ng/μl.
2.2 Reações de PCR evento-especificas
Reações de PCR de 25 μΙ foram ajustadas usando uma misturade reação padrão que compreende:
1x Jumpstart RED TaqPCR (Sigma, n9P-1107)
0,5 μΜ de iniciador 1 (SEQ ID NO: 5)
0,5 μΜ de iniciador 2 (SEQ ID NO: 6)
10 ng de DNA genômico DNA
ddH20
As reações de PCR foram aquecidas em um termociclador a94°C por 3 minutos, seguido por 35 ciclos como segue: 94°C por 15 segun-dos, 60°C por 15 segundos, 72°C por 45 segundos. A reação foi completadapor aquecimento a 72°C por 5 minutos.
As reações de PCR foram corridas em um gel de agarose, e asbandas de DNA foram visualizadas sob luz UV após coloração com brometode etídeo. Uma banda de 314 bp de tamanho foi obtida.
Alternativamente, reações de PCR de 25 μΙ foram ajustadas u-sando uma mistura de reação padrão que compreende:
1x Jumpstart RED TaqPCR (Sigma, neP-1107)
0,5 μΜ de iniciador 1 (SEQ ID NO: 8)
0,5 μΜ de iniciador 2 (SEQ ID NO: 6)
10 ng de DNA genômico
ddH20
As reações de PCR foram aquecidas em um termociclador a94°C por 3 minutos, seguido por 35 ciclos como segue: 94°C por 30 segun-dos, 65°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos. A reação foi completadapor aquecimento a 72°C por 5 minutos.
As reações de PCR foram corridas em um gel de agarose, e asbandas de DNA foram visualizadas sob luz UV após coloração com brometode etídeo. Uma banda de 341 bp de tamanho foi obtida.
Exemplo 3: Detecção de CE44-69D através de teste de Zigosidade porPCR Multiplex
3.1 Extração do DNA genômico
O DNA genômico de CE44-69D foi extraído conforme descritono Exemplo 2.1.3.2 PCR Multiplex I
Iniciadores de PCR para uso em um teste de zigosidade porPCR multiplex foram projetados. Uma reação de PCR de 20 μΙ foi ajustadapara cada amostra a ser testada como segue:
1 χ JumpStart ReadyMix REDTaq PCR (Sigma P-1107)0,5 μΜ de iniciador 1 (SEQ ID NO: 6)
0,5 μΜ de iniciador 2 (SEQ ID NO: 8)0,5 μΜ de iniciador 3 (SEQ ID NO: 9)10 ng de DNA genômico DNAddH20
As reações de PCR foram aquecidas em um termociclador a940C por 3 minutos, seguido por 30 ciclos como segue: 94°C por 30 segun-dos, 540C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos. A reação foi completadapor aquecimento a 72°C por 5 minutos.
As reações de PCR foram corridas em um gel de agarose, e asbandas de DNA visualizadas sob luz UV após coloração com brometo deetídeo. A presença de 2 bandas (249 bp e 341 bp) indicou que a amostra erade uma planta heterozigota CE44-69D; 1 banda de 341 bp de tamanho indi-cou que a amostra era de uma planta homozigota CE44-69D; e 1 banda de249 bp de tamanho indicou que a amostra era de um algodoeiro selvagemhomozigoto.
3.3 PCR Multiplex Il
Iniciadores de PCR para uso em um teste de zigosidade porPCR multiplex foram projetados. Uma reação de PCR de 20 μΙ foi ajustadapara cada amostra a ser testada como segue:
1x JumpStart ReadyMix REDTaq PCR (Sigma P-1107)0,5 μΜ de iniciador 1 (SEQ ID NO: 10)0,5 μΜ de iniciador 2 (SEQ ID NO: 12)0,25 μΜ de iniciador 3 (SEQ ID NO: 11)10 ng de DNA genômicoddH20As reações de PCR foram aquecidas em um termociclador a94°C por 3 minutos, seguido por 35 ciclos como segue: 94°C por 30 segun-dos, 60°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos. A reação foi completadapor aquecimento a 72°C por 5 minutos.
As reações de PCR foram corridas em um gel de agarose, e asbandas de DNA visualizadas sob luz UV após coloração com brometo deetídeo. A presença de 2 bandas (358 bp e 456 bp) indicou que a amostra erade uma planta heterozigota CE44-69D; 1 banda de 456 bp de tamanho indi-cou que a amostra era de uma planta homozigota CE44-69D; e 1 banda de358 bp de tamanho indicou que a amostra era de um algodoeiro selvagemhomozigoto.
Exemplo 4: Detecção de CE44-69D através de Southern Blot
4.1 Extração de DNA para uso em Southern Blotting
Aproximadamente 2 a 3 g de matéria fresca de tecido de folhajovem congelado foram triturados em um gral resfriado e moídos para um pófino e adicionados a 15 ml de tampão de extração de núcleos gelado (glicose0,35 M, Tris-HCI 0,1 M pH 8, Na2EDTA 50 mM, 2% de Polivinil-pirrolidona-10, 0,1% de ácido ascórbico, 0,2% de β-mercaptoetanol) em um tubo rotula-do. A amostra foi incubada sobre gelo por 15-20 minutos. O tubo foi cuida-dosamente misturado e centrifugado a 2700 g por 20 minutos a 4°C. O so-brenadante foi descartado e 8 ml de tampão de Iise de núcleos (sorbitol 0,14M, Tris-HCI 0,22 M pH 8, Na2EDTA 0,22 mM, 0,8% p/v de CTAB, 1%, deSarcosil 1% de Polivinil-pirrolidona-10, 0,1% de ácido ascórbico, 0,2% de β-mercaptoetanol, 5pg/ml de proteinase K) foram adicionados. Após misturar,os tubos foram incubados a 65°C por 30 minutos. 10 ml de clorofórmio foramadicionados e o tubo foi misturado cuidadosamente por inversão até queuma emulsão se formou seguido por centrifugação a 4600 rpm por 10 minu-tos em temperatura ambiente.
A camada aquosa foi removida em um novo tubo contendo 10 μΙde RNase A (10 mg sigma R4642) e o tubo incubado por 30 minutos a 37°C.As etapas de clorofórmio e centrifugação foram repetidas uma vez. A cama-da aquosa foi removida para um novo tubo que continha 10 ml de propan-2-ol. Após aproximadamente 15 minutos de incubação em temperatura ambi-ente, um precipitado gelatinoso foi observado no meio do tubo. O tubo foicuidadosamente misturado para precipitar o DNA. O DNA foi enrolado usan-do uma alça estéril em um tubo falcon contendo etanol a 70%. O DNA foiseco ao ar para remover o etanol e ressuspenso em 200-400 μΙ de TE.
4.2 Método alternativo para extração de DNA
2-3 folhas de algodão novas (aproximadamente 1 g de matériafresca) são trituradas para uma pasta em um gral e moídos em temperaturaambiente, com 2 ml de tampão de trituração (NaOAc 100 mM pH 4.8, EDTA50 mM pH 8.0, NaCI 500 mM, 2% de PVP (10.000 Pm), 1,4% de SDS) e umpouco de areia. O tecido triturado é transferido para um tubo falcon de 15 mle o remanescente no gral enxaguado com 1 ml de tampão de trituração den-tro do tubo. A amostra é incubada a 65°C por 15 minutos, com agitação oca-sional. 4 ml de acetato de amônio 10M são adicionados e a amostra é bemmisturada e incubada a 65CC por 10 minutos para precipitar as proteínas. Asamostras são centrifugadas a temperatura ambiente a 4600 rpm por 10 mi-nutos. A fase aquosa é transferida para um tubo novo de 15 ml.
0,6 volumes de isopropanol gelado são adicionados e a amostraé incubada a temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos. Apósmisturar por inversão lenta do tubo várias vezes, o DNA é enrolado e dissol-vido em 500 μΙ de TE. 10 μΙ de RNAse 10 mg/ml são adicionados e incuba-dos por 15 minutos a temperatura ambiente. Após a extração com 500 μΙ defenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1), a amostra é cuidadosamentemisturada a centrifugada a 13000 rpm por 5 min.
O sobrenadante é transferido para um novo tubo usando umapipeta Pasteur fina e reextraído com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) co-mo acima. O sobrenadante é transferido para tubos novos, 1/10 de volumede NaOAc 3M (pH 4,8) adicionados e misturados e então um volume de iso-propanol gelado é adicionado. A amostra pode ser incubada a temperaturaambiente por até 30 minutos para precipitar o DNA. O DNA é enrolado eressuspenso em etanol 70%. O DNA é seco ao ar para remover o etanol eressuspenso em 200 μΙ de água.4.3 Digestão com enzima de restrição
O DNA foi quantificado usando um espectrofotômetro e corridosobre um gel. Digestos de enzima adequados foram preparados usando 5pg de DNA por digesto em um volume total de 40 μΙ. Digestos incluindoNcol, Mscl, Hindlll/Kpnl e Nhel/Ascl foram usados para detectar o númerode cópias e integridade do inserto. Os digestos foram incubados por 6 horasna temperatura apropriada para cada enzima.
4.4 Eletroforese em gel
Corante de aplicação de azul de bromofenol foi adicionado a ca-da amostra de 4.3 acima e cada amostra aplicada em um gel de agaroseTBE 0,8%. O gel foi corrido em 50 volts durante a noite.
Após a corrida, o gel foi lavado em HCI 0,25M por 10 minutospara despurinar o DNA, incubado em solução desnaturante (NaOH 0,5M,NaCI 1,5M) com agitação cuidadosa por 30 minutos, enxaguado com águadestilada e então incubado em solução neutrâlizanté (Tris 0,5M, NaCI 1,5M)por 30 minutos.
Um Southern Blot foi preparado como se segue: uma placa devidro foi colocada sobre uma bandeja contendo SSC 20X e uma tira de papel3M foi colocada sobre a placa de vidro tal que ambas as extremidades mer-gulhassem na solução de SSC 20X (para agir como um fio). Um pedaço depapel 3M do mesmo tamanho do gel foi colocado sobre o fio e o gel coloca-do sobre ele. Tiras de nescofilme foram colocadas em volta das lâminas degel para formar uma barreira. Uma membrana Hybond foi colocada sobre ogel, seguida de dois pedaços adicionais de papel 3M. Durante a montagemdo blot foi tomado cuidado para assegurar que bolhas de ar não ficassempresas entre a membrana, gel e papel 3M. Uma pilha de 5cm-10cm de toa-lhas de papel absorventes foi colocada sobre o papel 3M e mantida no lugarcom um peso.
O DNA foi deixado transferir para a membrana Hybond durante anoite. Após a transferência o empilhamento do Southern Blot foi desmontadoe o DNA estava ligado a membrana através de ligação cruzada UV.
4.5 HibridizaçãoUma sonda de DNA adequada foi preparada digestão de restri-ção com Hindlll/Kpnl de plasmídeo binário pNOV4641 e purificação do frag-mento resultante. 25 ng de sonda de DNA em 45 μΙ de TE foram fervidos por5 minutos, colocados sobre gelo por 5 minutos e transferidos para um tuboRediprime Il (Amersham Pharmacia Biotech1 ngRPN1633). Após a adição de5 μl de dCTP marcado com 32P ao tubo Rediprime, a sonda foi incubada a37°C por 1 hora. A sonda foi purificada por centrifugação através de umacoluna microspin G-50 (Amersham Pharmacia Biotech, ne27-5330-01) deacordo com as instruções do fabricante para remover dNTPs não incorpora-dos. A atividade da sonda foi medida grosseiramente por comparação daquantidade de componente radioativo remanescente na coluna com a quan-tidade no tubo da amostra, com uma proporção de pelo menos 50:50 sendoaceitável. A membrana Hybond foi pré-hibridizada umedecendo-se com 40ml de tampão Rapid-Hyb preaquecido (Amersham Pharmacia), a 65°C por30 minutos. A sonda marcada foi fervida por 5 minutos e colocada sobre ge-lo por 5 minutos. Uma quantidade apropriada da sonda (contagem de 1 mi-lhão por 1 ml de tampão de pré-hibridização) foi adicionada ao tampão depré-hibridização e a hibridização ocorreu a 65°C durante a noite. No dia se-guinte, o tampão de hibridização foi descartado e após uma lavagem com 50ml de solução 2xSSC/1%SDS, a membrana foi lavada em 150 ml de soluçãode 2xSSC/1% SDS a 65°C por 30-45 minutos. Esse processo foi repetidoduas vezes com solução de 0,1xSSC/1%SDS. A membrana foi exposta auma tela de fósforo ou filme de raio X para detectar onde a sonda havia ligado.
Exemplo 5: Detecção de CE44-69D através de ELISA
5.1 Extração de proteína
Tecido de algodão para análise foi colhido e congelado a -70°C.O tecido congelado foi triturado para um pó fino e pesado em um tubo depolipropileno rotulado. Tampão de extração (Tris 100 mM, Borato de sódio100 mM, MgCI 5mM, 0,05% de Tween 20, 0,2% de Ascorbato de Sódio, Á-gua, pH 7,8, AEBSF 1 mM, Leupeptina 0,001 mM) foi adicionado à amostraem uma proporção de 2:1 (volume de tampão de extração : peso fresco daamostra) para tecido congelado ou 30:1 (volume de tampão de extração :peso seco da amostra) para tecido liofilizado. A amostra foi vortexada e ho-mogeneizada usando um Brinkman PT 10/35 Polytron equipado com umgerador redutor de espuma PTA 10TS, até que mistura se tornou liqüefeita.
Os extratos foram centrifugados a 10.000 χ g por 15 minutos. O sobrenadan-te do extrato de proteína foi armazenado a 2-8°C.
5.2 Protocolo de ELISA
O protocolo de ELISA usou técnicas usuais como segue. Umaplaca de 96 cavidades foi molhada em etanol por 2 horas, e seca ao ar. Aplaca foi revestida com 50 μΙ de anticorpo anti-Cry1Ab de cabra por cavidadee incubada durante a noite a 2-8°C. Após lavar 3 vezes com solução de la-vagem de ELISA 1X (Tris 100 mM, 0,5% de Tween-20, NaCI 75 mM, pH8,5), a placa foi seca brevemente por leves batidas na placa invertida sobreuma toalha de papel. 150 μΙ de solução de bloqueio (NaPO4 10 mM, NaCI140 mM, 1% de BSA, 0,02% de Azida Sódica, titulada para pH 7,4 comNaH2PO4 e Na2HPO4) foram adicionados a cada cavidade seguido por incu-bação a temperatura ambiente por 45 minutos. A placa foi lavada 3 vezesconforme descrito acima.
Padrões de CryIAb e amostras de extrato de proteína foram a-plicados às cavidades apropriadas da placa em triplicata, volume total de 50μl por cavidade. A placa foi incubada a 2-8°C por 1 hora e 30 minutos, se-guido por temperatura ambiente por mais 30 minutos. A placa foi lavada trêsvezes com solução de lavagem de ELISA, e então incubada a 35-39°C por 1hora com 50 μΙ de anticorpo anti-Cry1Ab de coelho por cavidade. A placa foilavada três vezes com solução de lavagem de ELISA, e incubada em tempe-ratura ambiente por 30 minutos com 50 μΙ de anticorpo anticoelho de burroconjugado com fosfatase alcalina por cavidade. Após mais três lavagenscom solução delavagem de solucao de sabstrato de fosfa-tase alcalina foram adicionados e a placa incubada por 30 minutos em tem-peratura ambiente. A reação foi paralisada pela adição de 50 μΙ de NaOH3M por cavidade. A absorbância da solução em cada cavidade foi medida a405nm usando um leitor de placa mulicavidades Ceres 900C e os resultadosanalisados usando o programa de ajuste de curva KC3 (Bio-Tek InstrumentsInc.)· A concentração de CryIAb nas amostras foi calculada em relação aospadrões de proteína Cryl Ab.
Exemplo 6: Detecção de CE44-69D através de fita reagente
6.1 Extração de proteína
Um pedaço de tecido de folha de aproximadamente 0,2 cm2 foicolocado em um tubo contendo tampão de extração. Um agitador de plásticofoi usado para extrair proteína do tecido, por corte e maceração do tecido.
6.2 Teste de fita reagente
Uma fita de teste foi colocada dentro do tubo e incubada por 5 a10 minutos para desenvolver o resultado. A fita de teste compreendeu umaprimeira banda na qual anticorpo anti-Cry1Ab estava ligado, e uma segundabanda na qual um anticorpo de controle estava ligado. Após a incubação,uma linha vermelha dupla na janela de resultado da fita de teste indicou queCryIAb estava presente. A linha inferior indicou a presença de proteína.CryIAb enquanto que a linha superior era um controle indicando que o en-saio estava funcionando corretamente.
Exemplo 7: Eficácia inseticida de CE44-69D
7.1 Teste de campo I - delineamento
Testes de campo foram estabelecidos em 6 localidades nos EUApara testar a resistência a insetos de CE44-69D. Em cada localidade, testesem duplicata foram plantados em um delineamento de blocos ao acaso, ca-da um compreendendo 4 replicatas. Cada teste consistiu em um lote com-preendendo fileiras de 12,19 m (4 χ 40 pés), plantadas com 3 plantas porcada 30,48 cm (pé).
Em cada localidade, um teste foi infestado artificialmente comlarvas de Heliothis virescens (lagarta da maçã), e os outros com larvas deHelicoverpa zea (lagarta do capulho) quando as plantas brotavam ativamen-te. Os testes foram subseqüentemente avaliados quanto à porcentagem dedano às maçãs e aos botões florais. As infestações artificiais foram executa-das por pulverização de ovos em uma solução de goma xantana sobre asplantas para que as larvas recém-nascidas saíssem do ovo diretamente so-bre as plantas. As infestações foram projetadas para dar aproximadamente 3ovos por planta.
7.2 Teste de campo I - resultados
Os dados apresentados na tabela abaixo são a média de todasas avaliações tomadas durante os testes: múltiplas classificações de danoaos botões florais e dano às maçãs foram calculadas juntas para dar umaclassificação média de dano ao corpo de frutificação, e os dados de todas as6 localidades foram calculados juntos.
<table>table see original document page 39</column></row><table>
Os dados mostram claramente que CE44-69D tem excelenteresistência tanto a Heliothis virescens como a Helicoverpa zea quando com-parados o controle não transgênico designado Coker312.
7.3 Teste de campo Il - delineamento
Plantas CE44-69D foram infestadas artificialmente com ovos delagarta da maçã (Heliothis virescens), que foram obtidos do Southern InsectManagement Laboratory em Stoneville, MS 24 a 36 horas antes da infesta-ção artificial. Os ovos foram misturados em uma solução de goma xantana epulverizados sobre a área terminal dos algodoeiros utilizando um pulveriza-dor de CO2 tipo mochila convencional. Os ovos foram pulverizados atravésde bicos 8006 de jato plano a aproximadamente 69 kpa (10 psi). O teste foirealizado em 2 localidades, Syngenta1S Southern Regional Technical Centreem Leland, MS e Vero Beach fíesearch Centre em^s/eio Beach, E Erruambas as localidades, blocos sólidos, não replicados de aproximadamente2240 plantas de CE44-69D, assim como blocos menores de aproximada-mente 224 plantas de Coker 312 não transgênicas foram utilizados para ainfestação. Se as populações de inimigos naturais fossem consideradas co-mo sendo suficientemente altas para interferir com a infestação, a área deestudo era pulverizada em excesso com acefato (Orthene®) a 0,23 kg (0,5Ib) () ai/A 24 a 48 horas antes da infestação programada. O bloco de algo-dão Coker 312 não transgênico foi usado para estimar a eficácia da técnicade infestação e para determinar a adequabilidade de campo da cepa de la-garta da maçã utilizada nesses estudos. Em cada localidade, quatro infesta-ções artificiais foram feitas ao algodão CE44-69D e Coker 312 com um quar-to das plantas disponíveis sendo infestadas de cada vez. As infestações fo-ram realizadas entre o meio do brotamento e o início da eflorescência. A ta-xa de incubação dos ovos foi estimada pela coleta de várias folhas contendoovos de plantas Coker 312 e colocação delas em placas de Petri. Os ovosnas folhas coletadas foram contados e dois a três dias depois, a eclosãobem-sucedida das larvas foi avaliada. As avaliações foram realizadas 7 diasapós a infestação. Metade das plantas infestadas foi avaliada na localidadede Leland, MS, enquanto que três quartos das plantas infestadas foram ava-liados na localidade de Vero Beach, FL. Em cada caso, a avaliação envolveuuma pesquisa criteriosa em toda a planta por larvas sobreviventes. Graus dedano aos botões florais também foram tomados a partir do teste de Leland.
Onde larvas sobreviventes foram encontradas em plantas CE44-69D, as es-truturas de frutificação contendo a larva foram marcadas. Quatro a 7 diasdepois, essas estruturas de frutificação, mais todas as estruturas adjacentesforam criteriosamente avaliadas novamente para avaliar se as larvas aindaestavam vivas. Avaliações similares posteriores não foram realizadas noslotes de Coker 312 porque nesse estágio muitas das larvas que tinham esta-do sobre essas plantas começaram a procurar por sítios de pupa do solo.
7.4 Teste de campo Il - resultados
A tabela abaixo é um sunário dos dados coletados.<table>table see original document page 41</column></row><table>
* Estimado com base no número de ovos aplicados e a taxa de incubaçãoobservada.
ND = não determinado
As larvas sobreviventes nas plantas CE44-69D 7 dias após ainfestação em ambas as localidades eram muito pequenas, variando do pri-meiro ao terceiro instar. As estruturas de frutificação que continham larvasvivas 7 dias após a infestação foram marcadas e avaliadas novamente 4 a 7dias depois. Na segunda avaliação, nenhuma larva viva pôde ser recuperadanas estruturas de frutificação marcadas ou nas vizinhas. Além disso, todasas estruturas de frutificação marcadas permaneceram sobre as plantas eestavam sè desenvolvendo normalmente. Isso sugere fortemente que aspoucas larvas que ainda estavam vivas nas plantas CE44-69D 7 dias após ainfestação não sobreviveram à segunda avaliação.
Os níveis de dano ao botão floral observados nas plantas CE44-69D foram extremamente baixos em comparação com o controle Coker 312não transgênico, confirmando que as larvas de lagarta da maçã eram vigo-rosas e capazes de estabelecer uma infestação robusta.
Os dados desse teste de infestação artificial mostram que CE44-69D tem excelente resistência à lagarta da maçã quando comparado com ocontrole não transgênico designado Coker 312.LISTAGEM DE SEQUENCIA
<110> SYNGENTA PARTICIPATIONS AG
<120> CE44-69D ALGODÃO INSETICIDA CE44-69D
<130> 70691
<160> 12
<170> PatentIn versão 3.1
<210> 1
<211> 230
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Pedaço de nucleotideo CE44-69D
<400> 1
actttccaaa gtcttgtgct gtattattca aactaaagat ccctcttgca aacccaaaat 60ggtagaaaac caaaaggcaa aatcaatatg gtggggccgt ttctttttaa atcttgatcc 120tcaactatgc taatgggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata 180acacattgcg gatacggcca tgctggccgc ccgggcaccg gtaaatttcc 230
<210> 2<211> 659<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Pedaço de nucleotideo CE44-69D<400> 2
aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact 60agatcgggaa ttgggtaccg agctcgaatt cggcgcgccc aattgattta aatggccgct 120
cgtcatcggc gggggtcata acgtgactcc cttaattctc cgctcatgat cagattgtcg 240
tttcccgcct tcagtttaaa ctatcagtgt tccctttggt ccttctttct tgtagaaatc 300
aaaggcctat atataggagg ttaagaagtg tttatcattt tatgggttag accagagtat 360
actcacattt aatttctttt tcaaacatgg ttaaaaattt aattttacta ttttaatttt 420
taacataatt taatatttat atttttataa tgttattaat tagtcaaaat aattaatgtt 480gttagctttt cgtttaaaat attacatggt tatatataat ttgaatgacc caagagttttagagattaaa atgtgccttc tccttttttt ggattagcgt tgcatttttt tactgcacaagttagtagtt aaatttcaat tttggtactt atactagttg aaacttgaga atttatctg
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Pedaço de nucleotídeo CE44-69D
<400> 3
tcaactatgc taatgggata tattgtggtg
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Pedaço de nucleotídeo CE44-69D
<400> 4
taaactatca gtgttccctt tggtccttct
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Pedaço de nucleotídeo CE44-69D
<400> 5
ttcaaactaa agatccctct tgca
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Pedaço de nucleotídeo CE44-69D<400> 6
tgtcgtgcca tattcgtcaa a<210> 7
21
<211> 3546<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Pedaço de nucleotídeo CE44-69D<400> 7
atggacaaca accccaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60
gtggaggtgc tgggcggcga gcgcatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120
agcctgaccc agttcctgct gagcgagttc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180
gtggacatca tctggggcat cttcggcccc agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240
gagcagttga taaaccaacg catagaggaa ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 3 00
gagggcctga gcaacctgta ccaaatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 3 60
cccaccaacc ccgccctgcg cgaggagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420
ctgaccaccg ccatccccct gttcgccgtg cagaactacc aggtgcccct gctgagcgtg 480
tacgtgcagg ccgccaacct gcacctgagc gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540
cgctggggct tcgacgccgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600
ggcaactaca ccgaccacgc cgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660
cccgacagcc gcgactggat caggtacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720
ctggacatcg tgagcctgtt ccccaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780
agccagctga .cccgcgagat ttacaccaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840
cgcggcagcg cccagggcat cgagggcagc atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900
aacagcatca ccatctacac cgacgcccac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960
atcatggcca gccccgtcgg cttcagcggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020
atgggcaacg ctgcacctca gcagcgcatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080
accctgagca gcaccctgta ccgtcgacct ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140
agcgtgctgg acggcáccga gttcgcctac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200
taccgcaaga gcggcaccgt ggacagcctg gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 12 60
ccacctcgac agggcttcag ccaccgtctg agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320
agcaacagca gcgtgagcat catccgtgca cctatgttca gctggattca ccgcagtgcc 1380gagttcaaca acatcatccc cagcagccag atcacccaga tccccctgac caagagcacc 1440
aacctgggca gcggcaccag cgtggtgaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg 1500
cgccgcacca gccccggcca gatcagcacc ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc 1560
cagcgctacc gcgtccgcat ccgctacgcc agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc 1620
atcgacggcc gccccatcaa ccagggcaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac 1680
ctgcagagcg gcagcttccg caccgtgggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc 1740
agcagcgtgt tcaccctgag cgcccacgtg ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac 1800
cgcatcgagt tcgtgcccgc cgaggtgacc ttcgaggccg agtacgacct ggagagggct 1860
cagaaggccg tgaacgagct gttcaccagc agcaaccaga tcggcctgaa gaccgacgtg 1920
accgactacc acatcgacca ggtgagcaac ctggtggagt gcttaagcga cgagttctgc 1980
ctggacgaga agaaggagct gagcgagaag gtgaagcacg ccaagcgcct gagcgacgag 2040
cgcaacctgc tgcaggaccc caacttccgc ggcatcaacc gccagctgga ccgcggctgg 2100
cgaggcagca ccgatatcac catccagggc ggcgacgacg tgttcaagga gaactacgtg 2160
accctgctgg gcaccttcga cgagtgctac cccacctacc tgtaccagaa gatcgacgag 2220
agcaagctga aggcctacaç ccgctaccag ctgcgcggct acatcgagga cagccaggac 2280
ctggaaatct acctgatccg ctacaacgcg aagcacgaga ccgtgaacgt gcccggcacc 2340
ggcagcctgt ggcccctgag cgcccccagc cccatcggca agtgcgggga gccgaatcga 2400
tgcgctccgc acctggagtg gaacccggac ctagactgca gctgcaggga cggggagaag 2460
tgcgcccacc acagccacca cttcagcctg gacatcgacg tgggctgcac cgacctgaac 2520
gaggacctgg gcgtgtgggt gatcttcaag atcaagaccc aggacggcca cgcccgcctg 2580
ggcaatctag agttcctgga ggagaagccc ctggtgggcg aggccctggc ccgcgtgaag 2640
cgtgctgaga agaagtggcg cgacaagcgc gagaagctgg agtgggagac caacatcgtg 2700
tacaaggagg ccaaggagag cgtggacgcc ctgttcgtga acagccagta cgaccgcctg 2760
caggccgaca ccaacatcgc catgatccac gccgccgaca agcgcgtgca cagcattcgc 2820
gaggcctacc tgcccgagct gagcgtgatc cccggtgtga acgccgccat cttcgaggaa 2880
ctcgagggcc gcatcttcac cgccttcagc ctgtacgacg cccgcaacgt gatcaagaac 2940
ggcgacttca acaacggcct gagctgctgg aacgtgaagg gccacgtgga cgtggaggag 3000
cagaacaacc accgcagcgt gctggtggtg cccgagtggg aggccgaggt gagccaggag 3060
gtgcgcgtgt gccccggccg cggctacatc ctgcgcgtga ccgcctacaa ggagggctac 3120
ggcgagggct gcgtgaccat ccacgagatc gagaacaaca ccgacgaact caagttcagc 3180
aactgcgtgg aggaggaggt ttaccccaac aacaccgtga cctgcaacga ctacaccgcg 3240
acccaggagg agtacgaagg cacctacacc tctcgcaaca ggggttacga cggcgcctac 3300
gagtccaaca gctccgtgcc agctgactac gccagcgcct acgaggagaa agcctacacc 3360
gacggtagac gcgacaaccc atgtgagagc aacagaggct acggcgacta cacccccctg 3420cccgctggat acgtgaccaa ggagctggag tacttccccg agaccgacaa ggtgtggatc 3480gagattggcg agaccgaggg caccttcatc gtggacagcg tggagctgct gctgatggag 3540gagtag 3546
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Pedaço de nucleotídeo CE44-69D
<400> 8
ccgtttcttt ttaaatcttg atcct 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Pedaço de nucleotídeo CE44-69D
<400> 9
cactcaaatt ggtgtcatct atctc 25
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Pedaço de nucleotídeo CE44-69D
<400> 10
aaggcacatt ttaatctcta aaactcttgg__30
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Pedaço de nucleotídeo CE44-69D<400> 11
cgtgactccc ttaattctcc gctcat
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Pedaço de nucleotídeo CE44-69D
<400> 12
cccattagat attagttacg ttgagaatt
Claims (14)
1. Polinucleotídeo que compreende uma primeira região quecompreende a seqüência descrita como SEQ ID NO: 1 e uma região adicio-nal que compreende a seqüência descrita como SEQ ID NO: 2.
2. Polinucleotídeo que compreende:a) pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüênciadescrita como SEQ ID NO: 3;b) pelo menos 35 nucleotídeos contíguos da seqüênciadescrita como nucleotídeos 106 a 165 de SEQ ID NO: 1; ouc) pelo menos 50 nucleotídeos contíguos da seqüênciadescrita como SEQ ID NO: 1, o dito polinucleotídeo abrangendo os nucleotí-deos 135 e 136 de SEQ ID NO: 1.
3. Polinucleotídeo que compreende:a) pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüênciadescrita como SEQ ID NO: 4;b) pelo menos 35 nucleotídeos contíguos da seqüênciadescrita como nucleotídeos 242 a 301 de SEQ ID NO: 2; ouc) pelo menos 50 nucleotídeos contíguos da seqüênciadescrita como SEQ ID NO: 2, o dito polinucleotídeo abrangendo os nucleotí-deos 271 e 272 de SEQ ID NO: 2.
4. Algodoeiro que compreende um polinucleotídeo como defini-do em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Semente de um algodoeiro de acordo com a reivindicação 4,que compreende o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das rei-vindicações de 1 a 3.
6. Método para detectar uma planta que contém o polinucleotí-deo descrito como SEQ ID NO: 1 o dito método compreendendo:a) preparar uma amostra que contém o DNA genômico daplanta a ser testada;b) obter um par de iniciadores que são adequados parauso em uma reação de amplificação para amplificar uma seqüência quecompreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüência descritac) como SEQ ID NO: 3 e o complemento da mesma;d) adicionar o dito par de iniciadores à dita amostra e osrecursos para realização de uma reação de amplificação;e) realizar uma reação de amplificação; ef) visualizar a seqüência assim amplificada.
7. Método para detectar uma planta que contém o polinucleotí-deo descrito como SEQ ID NO: 2 o dito método compreendendo:a) preparar uma amostra que contém o DNA genômico daplanta a ser testada;b) obter um par de iniciadores que são adequados parauso em uma reação de amplificação para amplificar uma seqüência quecompreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüência descritacomo SEQ ID NO: 4 e o complemento da mesma;c) adicionar o dito par de iniciadores à dita amostra e osrecursos para realizar uma reação de amplificação;d) realizar uma reação de amplificação; ee) visualizar a seqüência assim amplificada.
8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que a ditaseqüência compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos.
9. Método para detectar uma planta que contém o polinucleotí-deos descrito como SEQ ID NO: 1 e/ou o polinucleotídeo descrito como SEQID NO: 2 o dito método compreendendo:a) preparar uma amostra que contém o DNA genômico daplanta a ser testada;b) obter uma sonda que é capaz de hibridizar a uma se-qüência selecionada a partir do grupo que consiste em uma seqüência quecompreende pelo menos 18 nucieoiídeos contíguos da seqüência descritacomo SEQ ID NO: 3 e uma seqüência que compreende pelo menos 18 nu-cleotídeos contíguos da seqüência descrita como SEQ ID NO: 4;c) adicionar pelo menos uma das sondas da etapa (b) à di-ta amostra sob condições que permitem que a dita sonda hibridize com umácido nucléico complementar dentro da dita amostra;d) remover a sonda substancialmente não hibridizada; ee) detectar a sonda assim hibridizada para identificar se aamostra contém o dito polinucleotídeo.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a ditaseqüência compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos.
11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou reivindicaçãoem que a dita sonda substancialmente não hibridizada é removida porenxágüe sob condições de alta estringência.
12. Kit de partes que compreende um par de iniciadores comodefinido na reivindicação 6 ou 7, instruções para realizar o método como de-finido ma reivindicação 6 ou 7, recursos para realizar uma reação de amplifi-cação e opcionalmente recursos para preparar a amostra a ser testada.
13. Anticorpo anti-Cry1Ab secretado pela linhagem celularDSM ACC2723 ou DSM ACC2724.
14. Fita reagente que compreende:a) uma linha de teste de anticorpo anti-Cryl Ab específico;b) uma linha de controle de reagente de anticorpo anti-camundongo;c) uma almofada contendo anticorpo anti-Cry1Ab marcadocom ouro coloidal seco; ed)- uma almofada de aplicação da amostra.em que o anticorpo anti-Cry1Ab e o anticorpo anti-Cry1Ab mar-cado com ouro coloidal seco são independentemente selecionados a partirdo grupo que consiste em um anticorpo secretado pela linhagem celularDSM ACC2723 e um anticorpo secretado pela linhagem celular DSMACC2724.
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