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BR122017015069B1 - Aparelho para geração em alto volume de produção de tecido vegetal transformável - Google Patents

Aparelho para geração em alto volume de produção de tecido vegetal transformável Download PDF

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BR122017015069B1
BR122017015069B1 BR122017015069-3A BR122017015069A BR122017015069B1 BR 122017015069 B1 BR122017015069 B1 BR 122017015069B1 BR 122017015069 A BR122017015069 A BR 122017015069A BR 122017015069 B1 BR122017015069 B1 BR 122017015069B1
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BR
Brazil
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explants
plant
transformation
seed
petition
Prior art date
Application number
BR122017015069-3A
Other languages
English (en)
Inventor
D. Dersch Erik
J. Heinzen Richard
J. Martinell Brian
Rivlin Anatoly
Wan Yuechun
Ye Xudong
Original Assignee
Monsanto Technology Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

a presente invenção refere-se à excisão de material de explante que compreende tecido meristemático de sementes de algodão. são descritos métodos para preparação de estocagem, transformação, e seleção ou identificação de tecidos de plantas transformadas, como são produzidos tecidos de meristemas transformáveis e plantas por tais métodos, e aparatos para a preparação de tecidos.

Description

(54) Título: APARELHO PARA GERAÇÃO EM ALTO VOLUME DE PRODUÇÃO DE TECIDO VEGETAL TRANSFORMÁVEL (51) Int.CI.: C12N 5/14; C12N 5/04; C12N 15/82; A01H 5/00; A01H 4/00; B02B 3/04 (30) Prioridade Unionista: 09/03/2007 US 60/894,096, 30/04/2007 US 60/915,066 (73) Titular(es): MONSANTO TECHNOLOGY LLC (72) Inventor(es): ERIK D. DERSCH; RICHARD J. HEINZEN; BRIAN J. MARTINELL; ANATOLY RIVLIN; YUECHUN WAN; XUDONG YE
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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para APARELHO PARA GERAÇÃO EM ALTO VOLUME DE PRODUÇÃO DE TECIDO VEGETAL TRANSFORMÁVEL.
[001] Dividido do PI0808716-4, depositado em 10.03.2008. Antecedentes da Invenção [002] Este pedido de Patente reivindica a prioridade dos Pedidos de Patente provisórios US n°s 60/894.096, depositado em 9 de março de 2007, e US 60/915.066, depositado em 30 de abril de 2007, cujos teores inteiros são aqui incorporados como referência.
Campo Técnico da Invenção [003] A presente invenção refere-se a métodos para preparar e transformar tecido vegetal meristemático de algodão e subsequente regeneração de plantas transgênicas.
Descrição de Técnicas Anteriores [004] As plantas transformadas podem ser obtidas por distribuição de DNA heterólogo para tecido meristemático de um embrião de planta. O tecido meristemático contém células vegetais formativas que diferenciam para produzir múltiplas estruturas vegetais, incluindo talo, raízes, folhas, tecido de linhagem germinal, e sementes. Os meristemas de plantas podem ser tratados, e selecionados ou triados para determinar quais desses meristemas tratados incorporaram novas informações genéticas no tecido de linhagem germinal. As Patentes US n°s 6.384.301 e 7.002.058, e a Publicação do Pedido de Patente n2 2006/0059589 descrevem métodos para transformar genericamente sojas (Glycine max) usando transferência gênica mediada de forma bacteriana diretamente nas células meristemáticas de embriões de soja. A publicação US n° 2005/0005321 descreve a excisão de tecidos meristemáticos de sementes. Meristemas de algodão isolados e tecidos do ápice de brotos foram transformados (vide, por exemplo, documento WO n° 9215675; Patente US n° 5.164.310; McCabe e MartiPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 9/90
2/65 nell, 1993). Entretanto, devido a propriedades físicas e fisiológicas das sementes de algodão, as condições para excisão de material meristemático e transformação para obter plantas transgênicas diferem daquelas para soja.
[005] O atual processo manual de excisão de embriões de sementes de algodão embebidas é lento e tem um gravame ergonômico. Neste processo, sementes com a superfície esterilizada são manuseadas de forma asséptica em um tempo com as mãos enluvadas. O explante é então cuidadosamente excisado. No caso de meristemas de algodão, as sementes são orientadas cuidadosamente de uma maneira a ejetar o embrião com força aplicada. Mesmo com manuseio cuidadoso de sementes individuais, uma baixa recuperação de embriões utilizáveis é comum.
[006] A contaminação bacteriana de embriões depois da excisão também é uma preocupação significativa. O maior manuseio para preservar viabilidade mais alta e recuperação de explantes também aumenta a possibilidade de contaminação destrutiva (que se manifestará em etapas subsequentes do processamento). Tal contaminação pode resultar em perda significativa, pois um único explante contaminado contaminará outras amostras durante a transformação e cultura do tecido. Isto causa perda de rendimento e/ou frequência de transformação. Além disso, o processo de excisão manual é extremamente intensivo em mão-de-obra, moroso, e representa uma barreira para um aumento do volume de produção do processo de transformação, no qual muitas plantas devem ser tipicamente tratadas com resultados desejados de rendimento. Permanece existindo, assim, uma grande necessidade de se obter um processo que aumentaria a disponibilidade de embriões de algodão transformáveis sem aumentar inaceitavelmente os custos totais e/ou os prazos para preparação de explantes para transformação.
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Sumário da Invenção [007] Em um aspecto, a invenção fornece um método de alto volume de produção para produzir tecido de algodão transformado, compreendendo:
(a) romper mecanicamente sementes de algodão para obter uma pluralidade de explantes de meristemas de algodão embrionários; e (b) colocar os explantes em contato com uma sequência de DNA selecionada para obter pelo menos um primeiro explante transformado com o DNA selecionado. Em certas modalidades, os explantes são estocados em uma temperatura entre 0-15Ό d urante entre 1 hora e 7 dias antes de serem colocados em contato com uma sequência de DNA selecionada. Em outras modalidades, o método compreende ainda a etapa de regenerar uma planta de algodão transgênica transformada com o DNA selecionado a partir do pelo menos primeiro explante. Em certas modalidades, o método não compreende gerar uma cultura de calos a partir do explante.
[008] Em modalidades específicas, a planta de algodão transgênica se origina da transformação de um meristema, que resulta na transformação de tecido de linhagem germinal. Em certas modalidades, a planta resultante é não-quimérica. Em modalidades alternativas, a planta resultante é quimérica. Em certas modalidades, o método compreende ainda triar os explantes antes de colocar os explantes em contato com a sequência de DNA selecionada para identificar uma fração de explantes suscetíveis à transformação com o DNA selecionado e regeneração de uma planta transgênica a partir deles. Em outras modalidades, triar os explantes compreende colocar mecanicamente as sementes de algodão rompidas, que compreendem os explantes, em um ambiente aquoso, e selecionar os explantes para colocar em contato com o DNA selecionado, baseado em flutuação. Em ainda ouPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 11/90
4/65 tras modalidades, triar os explantes compreende peneirar mecanicamente as sementes de algodão rompidas para remover os explantes do revestimento de sementes ou tecido de cotiledôneo. Triar os explantes pode também enriquecer a fração de explantes suscetíveis à transformação.
[009] Em certas modalidades, a sequência de DNA selecionada codifica um marcador selecionável ou capaz de ser triado, ou ela pode codificar ou especificar de outra forma um traço agronômico, incluindo adaptabilidade ambiental, dentre outros fenótipos. O traço pode também especificar a produção de um produto final desejado. O método pode compreender ainda selecionar ou triar quanto a um explante transformado com o DNA selecionado, colocando o explante em contato com um agente seletivo, onde o marcador selecionável confere tolerância ao agente seletivo. O método pode ser definido como compreendendo regenerar tecido de planta transgênica a partir dos explantes. O método pode ser definido ainda como compreendendo regenerar tecido de planta transgênica quimérica a partir do explante e selecionar ou triar quanto a tecido transgênico a partir do tecido vegetal. Em outras modalidades, o método compreende ainda regenerar uma planta quimérica a partir do explante e selecionar ou triar quanto a tecidos transgênicos a partir da planta. Em modalidades específicas, o tecido de planta de algodão transgênica se origina a partir da transformação de meristema. Em certas modalidades, a planta de algodão transgênica se origina a partir de transformação periclinal.
[0010] O método pode se referir ainda a selecionar ou triar quanto a tecido transgênico, compreendendo colocar o tecido em contato com um agente seletivo ou um agente que produz um fenótipo capaz de ser triado, selecionado no grupo que consiste em glufosinato, dicamba, glifosato, espectinomicina, estreptomicina, canamicina, G418, paromomicina, higromicina B, imidazolinona, um substrato de GUS, e comPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 12/90
5/Q5 binações dos mesmos.
[0011] Em outras modalidades, o método compreende romper mecanicamente as sementes de algodão passando as sementes através de roletes que esmagam a semente. Em modalidades específicas, os roletes compreendem sulcos secundários. Em ainda outras modalidades, os roletes são feitos de aço inoxidável.
[0012] Em modalidades específicas, os explantes são colocados em contato com uma sequência de DNA selecionada, por exemplo, colocando os explantes em contato com uma Rhizobium ou Agrobacterium spp. recombinante capaz de transformar pelo menos uma primeira célula do explante com o DNA selecionado. Em modalidades específicas, o explante é colocado em contato por uma cultura de Agrobacterium desenvolvida até uma DO660 entre cerca de 0,0045 e cerca de 1,4. O pH no qual o tecido de algodão meristemático é colocado em contato por células de Agrobacterium pode ser, em certas modalidades, entre cerca de 5,0 e cerca de 6,0, até cerca de 10,0. Em algumas modalidades, as Rhizobium ou Agrobacterium spp. são colocadas em suspensão na presença de um agente seletivo ativo contra um explante não-transformado antes de colocar os explantes em contato com uma Rhizobium ou Agrobacterium spp. recombinante. Em outras modalidades, os explantes podem ser colocados em contato com uma sequência de DNA selecionada por bombardeio de microprojéteis. [0013] Em certas modalidades, depois de colocar os explantes em contato com uma sequência de DNA selecionada, os explantes são desenvolvidos na presença de um agente seletivo a 35Ό, ou são desenvolvidos sob condições de iluminação que permitem o desenvolvimento normal de plastídios. Em outras modalidades, os explantes podem ser desenvolvidos no escuro. Em modalidades específicas, o desenvolvimento a 35Ό é realizado por cerca de 1-7 d ias, tal como cerca de 3-5 dias; o agente seletivo é selecionado no grupo que consiste
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6/65 em espectinomicina, estreptomicina, canamicina, glifosato, glufosinato, higromicina, e dicamba; ou os explantes são desenvolvidos sob uma intensidade de luz > 5μ Einsteins, incluindo 5-200 μ Einsteins, 5-130 μ Einsteins, ou 70-130μ Einsteins com um fotoperíodo de cerca de 16 horas de luz/8 de escuridão.
[0014] Em algumas modalidades, os explantes são desenvolvidos na presença de um fungicida antes, durante, ou depois de colocar os explantes em contato com um DNA selecionado. Em certas modalidades, os explantes são desenvolvidos na presença de um fungicida e DMSO. Em modalidades específicas, os explantes são desenvolvidos na presença de nistatina, tiabendazol, e DMSO. Em outro aspecto, a invenção fornece um aparelho para a geração com alto volume de produção de tecido vegetal transformável, compreendendo roletes espaçados entre si que compreendem sulcos secundários para aplicar uma força às sementes de algodão que passam através dos roletes. Em certas modalidades, os roletes são espaçados uns dos outros em entre cerca de 2 mm e cerca de 4 mm de afastamento, ou cerca de 2,2 mm a cerca de 3,5 mm de afastamento, medido pelo afastamento dos picos de roletes opostos. Em modalidades específicas, os roletes são feitos de aço inoxidável. O aparelho pode compreender ainda um separador para separar os explantes de algodão meristemáticos do revestimento das sementes ou do tecido cotiledôneo. Em uma modalidade específica, o separador compreende um recipiente de líquido para a determinação da flutuação do tecido vegetal transformável. O aparelho pode compreender ainda uma bandeja de contenção de água e sementes. Em modalidades específicas, o aparelho pode compreender ainda um mecanismo automatizado para limpar o aparelho, que controla uma ou mais das seguintes etapas: (a) aplicar uma solução sanitizante; (b) remover a solução sanitizante; e (c) estocar o aparelho sob condições estéreis.
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Breve Descrição dos Desenhos [0015] Os desenhos que seguem fazem parte do presente relatório descritivo e são incluídos para demonstrar ainda mais certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser mais bem entendida fazendo referência ao desenho em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas aqui apresentadas.
[0016] FIGURA 1: máquina de excisão de sementes: (A) máquina de excisão de sementes, vista geral; (B) alimentador; (C) vista de topo do alimentador e roletes; (D) close-up de roletes de aço, ilustrando distância do afastamento “pico para vale”; (E) vista lateral de roletes. [0017] FIGURA 2: excisão e purificação de embriões de algodão pela máquina: (A) efeito do tamanho do afastamento entre roletes sobre a excisão de embriões; (B) efeito da purificação por peneiração e flutuação sobre a pureza da fração de explantes; (C) close-up de embrião de algodão excisado.
[0018] FIGURA 3: seção transversal do crivo (tecnologia em V) com (A) vista lateral esquemática; (B) vistas de topo; e (C) fundo. [0019] FIGURA 4: máquina de excisão com sistema de contenção de água e sementes.
[0020] FIGURA 5: espectinomicina como agente de seleção e marcador visual para identificação precoce da transformação. (A-B) Duas vistas de tecido de algodão transformado quimérico, ilustrando que os tecidos não-transformados parecem branqueados e frequentemente malformados sob seleção com espectinomicina, enquanto que os tecidos transformados são verdes e se desenvolvem adequadamente. Os brotos transformados sobreviventes também estão ilustrados.
[0021] FIGURA 6: resultados da hibridização Southern blot que confirmam a transformação, e identificação de tecido de algodão transgênico excisado com a máquina.
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8/65 [0022] FIGURA 7: Western blot, duas exposições, demonstrando a expressão de transgene DMO em tecido de algodão derivado de um explante excisado com a máquina.
[0023] FIGURA 8: aumento na frequência de transformação (TF) % visto a partir da adição de concentrações crescentes de espectinomicina ao meio de cocultura.
Descrição Detalhada da Invenção [0024] O texto que segue é uma descrição detalhada da invenção fornecida para auxiliar os versados nessas técnicas a praticar a presente invenção. Os versados nessas técnicas podem fazer modificações e variações nas modalidades aqui descritas sem fugir do espírito ou âmbito da presente invenção.
[0025] A invenção fornece métodos e composições para preparar, triar e usar explantes de algodão em procedimentos de alto volume de produção automatizados. Estes explantes podem ser então transformados por uma sequência de DNA heteróloga selecionada, e plantas de algodão transgênicas podem ser regeneradas a partir deles, sem a necessidade de gerar uma cultura de células de calos a partir do explante transformado, para obter plantas progênitas transgênicas. A sequência de DNA heteróloga selecionada pode, por exemplo, codificar um marcador capaz de ser triado ou selecionável, e/ou compreender um gene de interesse que especifica um traço apresentado por uma planta ou célula de algodão resultante da expressão do ácido nucléico heterólogo. O traço pode ser agronomicamente útil, por exemplo, resultando em maior rendimento, resistência a pragas ou patógenos, ou adaptabilidade ambiental, dentre outros fenótipos. Isto permite obter um processo de alto volume de produção mecanizado, rápido e eficiente, para gerar plantas de algodão transformadas. O processo mecanizado para excisão de algodão descrito fornece benefícios monetários, de segurança e flexibilidade. A mecanização reduz o número de
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9/65 homem-hora necessário para produzir 10.000 explantes de algodão a partir de cerca de 40 a apenas 2,4 horas, economizando significativamente os custos de mão-de-obra. Um custo mais baixo de explantes produz maiores oportunidades para o desenvolvimento de métodos de transformação aperfeiçoados ou o uso de técnicas que, embora proporcione benefícios tais como tempo reduzido para criação de plantas transgênicas ou capacidade para usar cultivares melhores para transformação, têm até hoje produzido uma eficiência de transformação deficiente demais para serem implementadas amplamente. Tal técnica permite obter números maiores de transgenes a serem testados e episódios de qualidade mais altos a serem escolhidos para análise adicional, pois apenas um pequeno número de episódios de transformação são esperados a apresentar os perfis de expressão mais desejados, apropriados para desenvolvimento comercial. Um processo de excisão aperfeiçoado permite também melhor sincronismo e programação de etapas de transformação, por causa da maior flexibilidade na distribuição de explantes.
[0026] O processo mecânico aqui descrito pode ser ainda facilmente incrementado para suportar transformação com maior volume de produção. A taxa de produção potencial, presumindo 28 h de excisado por semana, é aumentada de 7.000 explantes por pessoa (equivalente a tempo completo), por excisão manual, para 117.600 por pessoa pelos métodos aqui descritos. Um resumo dos benefícios obtidos em modalidades específicas da invenção está indicado nas tabelas 1416. Os processos mecanizados aqui descritos são também significativamente mais ergonomicamente menos prejudiciais por eliminarem o movimento repetitivo típico do processo de excisão manual. No caso do algodão no qual números substanciais de explantes podem ser necessários, os benefícios são particularmente significativos.
[0027] Para fornecer um entendimento claro e consistente do relaPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 17/90
10/65 tório descritivo e das reivindicações, inclusive o âmbito dado a esses termos, as definições que seguem são fornecidas.
[0028] “Embrião” é parte de uma semente, consistindo em tecidos precursores (tecidos meristemáticos) para as folhas, talo e raiz, bem como um ou mais cotilédones. Depois que o embrião começa a crescer (germinar), ele se torna uma planta de semeadura.
[0029] “Meristema” ou “tecido meristemático” consiste em células indiferenciadas, as células meristemáticas, que diferenciam para produzir múltiplas estruturas de plantas, incluindo talo, raízes, folhas, tecido de linhagem germinal e sementes. As células meristemáticas são os alvos para a transformação a fim de obter plantas transgênicas. [0030] “Explante” é um termo utilizado para se referir a materialalvo para transformação. Portanto, ele é utilizado de forma intercambiável com “tecido meristemático” ou “embrião” nas modalidades em questão.
[0031] “Plantas quiméricas” são plantas que são compostas de tecidos que não são genericamente idênticos, isto é, as plantas terão apenas uma parte ou fração de seus tecidos transformados, enquanto que os tecidos remanescentes não são geneticamente transformados. [0032] A “transformação de linhagem germinal” ocorre quando o gene de interesse é transformado em células que geram pólen ou óvulo produzindo assim sementes.
[0033] As sementes a partir das quais os explantes vão ser preparados podem ser colhidas a partir de cultivares de algodão de interesse. Devido ao fato de que os métodos descritos não requerem embriogênese ou organogênese, e à regeneração de plantas de algodão, os métodos são apropriados para uso com muitos cultivares, mesmo aqueles que reconhecidamente possuem potencial embriogênico deficiente. Assim sendo, em contraste com muitos métodos anteriores, cultivares não-agronomicamente valorizados com bom potencial emPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 18/90
11/65 briogênico, tal como Coker 312, não precisam ser usados para obter plantas transgênicas iniciais Ro. Ajustes podem ser feitos nos parâmetros tais como condições de inibição (por exemplo, temperatura e intensidade de luz durante a embebição de sementes), afastamentos de roletes e tamanhos de peneiras para permitir o uso com sementes de algodão de vários tamanhos. A semente para excisão pode ser transgênica ou não-transgênica. Assim sendo, a transformação repetida de uma variedade de algodão já transgênica está contemplada.
[0034] Antes da embebição, germinação, e/ou excisão do explante, as sementes podem ser submetidas a uma etapa de esterilização, bem como uma etapa de separação, para evitar contaminação microbiana, a fim de remover as sementes com um alto grau de contaminação bacteriana ou fúngica, e também a fim de remover as sementes que podem, por qualquer razão, ser improváveis de produzir tecido de explante viável para uso com a presente invenção. A separação pode ser conduzida, por exemplo, baseado em parâmetros tais como tamanho, cor, ou densidade da semente ou outras características, incluindo características de composição química. A flutuação de uma semente em uma solução aquosa pode ser utilizada para selecionar semente para excisão. Os exemplos de métodos de separação podem incluir o uso de uma balança automática depois de classificação por tamanho ou classificação por ar de semente pelo uso de ventiladores e/ou mesa de gravitação vibratória para separar sementes por peso. Outras técnicas de separação também podem ser empregadas, incluindo separação por teor de umidade. Um tratamento térmico pode ser realizado antes da embebição (por exemplo, 42-55Ό). O condicionamento osmótico de sementes pode ser utilizado para controlar o desenvolvimento embrionário antes ou depois da excisão. As sementes podem ser também pré-tratadas com certos agentes químicos e/ou condições ambientais antes ou durante a embebição, germinação, ou excisão
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12/65 para tornar os explantes mais transformáveis e regeneráveis depois da excisão.
[0035] A embebição pode ser feita em um processo limpo, tanque à prova de água (algumas vezes denominado tanque de embebição), tal como um recipiente de plástico ou aço que pode reter as sementes. Uma capacidade típica seria 1 a 12,5 kg de sementes secas, apesar de que recipientes com outros tamanhos podem ser utilisados. A temperatura e duração da embebição das sementes podem ficar na faixa, por exemplo, entre cerca de 15Ό e cerca de 40Ό, t al como cerca de 20Ό, 23Ό, 24Ό ou 280. A temperatura na extremid ade inferior da faixa pode ser útil para uma inibição com duração mais longa. A duração pode ficar na faixa entre várias horas e 14-48 horas, ou vários dias. Em certas modalidades, um período de embebição de cerca de 18 horas pode ser usado.
[0036] Em modalidades específicas, a excisão é realizada mecanicamente usando roletes que esmagam as sementes aplicadas às suas faces, que podem girar contrariamente, em modalidades específicas. O afastamento entre os roletes pode ser ajustado, baseado no tamanho das sementes aplicadas. Em certas modalidades nas quais a semente de algodão está sendo esmagada, os afastamentos entre roletes pode ficar, por exemplo, na faixa de 2-4,5 mm (medido dos picos entre roletes opostos). O material dos roletes pode ser, por exemplo, elastomérico ou metálico. Em certas modalidades, roletes de aço inoxidável demonstraram reter qualidades de funcionamento benéficas, mesmo depois de uso repetido e prolongado. Para uso com sementes de algodão, os roletes com sulcos secundários demonstraram agarrar e esmagar eficientemente a semente com mínimo dano para a fração de sementes de explantes meristemáticos. A excisão pode ser realizada em semente de algodão desidratada. Os tecidos meristemáticos obtidos a partir delas podem ser então reidratados e transformados.
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13/65 [0037] Depois da excisão, a invenção fornece também métodos e aparelhos para triar a fim de separar material de explante meristemático transformável a partir de explantes, cotilédones, revestimentos de sementes, e outros fragmentos danificados não-transformáveis. Os métodos podem ser realizados manualmente, ou podem ser parcial ou totalmente mecanizados. Em certas modalidades, o processo de triagem é substancialmente mecanizado. Por exemplo, uma ou mais etapas de peneiração podem ser realizadas, usando peneiras com o tamanho apropriado, baseado no tamanho das sementes que estão sendo esmagadas e dos explantes que estão sendo isolados. O rendimento bruto das sementes esmagadas que atravessaram os roletes pode ser colocado através de uma série de peneiras de separação, de tal modo que os fragmentos grandes e pequenos indesejados sejam separados do explante desejado por exclusão de tamanho. As peneiras de peneiração podem ser inclinadas para facilitar a movimentação do material vegetal. A movimentação do material ao longo ou através das peneiras (por exemplo, embriões e fragmentos) pode ser auxiliada, por exemplo, por um fluxo de água, incluindo spray de água, ou por uma combinação de inclinação das peneiras e spray de água. A vibração das superfícies das peneiras pode também auxiliar na movimentação do material vegetal. A peneiração contínua pode ser realizada usando um volteador rotativo feito de uma peneira com uma malha adequadamente dimensionada. A peneiração pode ser realizada eficazmente, por exemplo, com um material de semente de algodão, usando peneiras do padrão norte-americano tal como: n2 8 (abertura 2,36 mm), n2 10 (abertura de 2,0 mm), n2 16 (abertura 1,18 mm), e outras, conforme apropriado (por exemplo, peneiras com aberturas alongadas, tais como 1/16 x 3/4, 1/18 x 3/4, 1/19 x 1/2, ou 1/20 x 1/2). Peneiras com outros tamanhos de aberturas podem ser fabricadas conforme necessário, baseado no tamanho do material que está
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14/65 sendo aplicado. A extensão do tempo para o processo de peneiração e o vigor da peneiração também podem ser ajustadas para aumentar o volume de produção e/ou o rendimento do processo.
[0038] O aparelho pode incluir ainda um sistema de contenção de água e sementes para ajudar a manter a esterilidade, bem como um sistema limpo em curso, permitindo uma manutenção e limpeza convenientes da máquina.
[0039] Outros métodos de peneiração também podem ser utilizados, tal como medindo a flutuação diferencial em soluções do material de explante versus fragmentos. Uma fração de material que flutua em solução aquosa demonstrou ser enriquecida para explantes transformáveis intactos. Combinações destes métodos de peneiração também podem ser usadas. A fração de material com explantes transformáveis pode compreender tecidos meristemáticos e outros tecidos, tais como partes de cotilédones. O explante pode conter, entretanto, pelo menos alguma região meristemática de tal modo que tipicamente o explante possa produzir um botão ou broto dentro de 12 semanas depois do início de condições de crescimento apropriadas.
[0040] Em algumas modalidades, o material meristemático excisado pode ser estocado antes do começo do cocultivo ou outro procedimento de transformação. Os parâmetros que podem ser variados incluem temperatura, duração, e meio usado na estocagem, dentre outros. Por exemplo, os explantes podem ser estocados submersos no meio, por exemplo, meio INO ou meio INO desgaseificado a 0Ό ou mais, por exemplo, cerca de 4-15Ό. Os explantes podem ser estocados também sobre papel de filtro umedecido com INO, por exemplo, a 4Ό. Componentes do meio tais como antibióticos, PE G 8000, e antioxidantes também podem ser empregados. A duração da estocagem pode ficar na faixa, por exemplo, entre uma ou mais horas e de um dia para o outro, ou 1, 2, 3, 4 dias ou até 7 dias. A estocagem pode servir
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15/65 para ajustar o estágio de desenvolvimento de um embrião em relação ao tempo de transformação, bem como para auxiliar na programação de procedimentos de excisão e transformação, ou para permitir que o material excisado se recupere da tensão mecânica da excisão. Os explantes meristemáticos excisados úmidos podem ser secos para estocagem, e em seguida, reidratados para inoculação. Essa secagem pode ocorrer, por exemplo, antes ou durante a peneiração. A inoculação pode ser realizada, por exemplo, por 10-120 minutos, e durante este tempo os explantes são incubados em um vascolejador com uma suspensão de Agrobacterium. O meio de suspensão pode ser INO, ou outro meio. Depois desta etapa de inoculação, a suspensão é removida e a cocultura continua em INO, por exemplo. Agentes antiapoptópicos podem ser usados durante a cocultura, incluindo antipaína (1-100 uM);
3-aminobenzamida ((5 uM- 4 mM), Ac-DEVD-CHO (0,01- 0,1 uM) e Ac-YVAD-CMK (0,01- 0,1 uM), ou outro inibidor de caspase dentre outros. Reguladores do crescimento de plantas e outros agentes que promovem a transferência de T-DNA e regeneração de plantas também podem ser incluídos para intensificar a transformação e regeneração de plantas. Sulfito também pode ser adicionado ao meio de cocultura, para melhorar a saúde do tecido vegetal. Antibióticos e agentes antifúngicos, tais como estreptomicina, espectinomicina, nistatina, e tiabendazol, dentre outros, podem ser usados para suplementar o meio de the cocultura. A cocultura pode ser conduzida no escuro, ou sob condições de iluminação apropriadas para promover o desenvolvimento normal de plastídios, tais como em uma incubadora iluminada Percival com um fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de escuridão sob uma intensidade de luz > 5μΕ, tal como cerca de 5 μΕ até cerca de 200 μΕ. Tais condições de iluminação podem promover a transferência de Agrobacterium (Zambre et al., 2003).
[0041] Em certas modalidades, os tecidos excisados e triados poPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 23/90
16/65 dem ser transformados com um gene heterólogo de interesse. Vários métodos foram desenvolvidos para transferir genes para tecido vegetal, incluindo microinjeção de microprojéteis em alta velocidade, eletroporação, captação direta de DNA, e transformação mediada de forma bacteriana. As bactérias que reconhecidamente medeiam transformação de células vegetais incluem inúmeras espécies das rizobiáceas, incluindo, porém sem limitações, Agrobacterium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Rhizobium spp., and Bradyrhizobium spp. (por exemplo, Broothaerts et al., 2005; Publicação de Pedido de Patente US n° 2007/0271627). Os alvos para tal transformação foram frequentemente tecidos de calos não-diferenciados, embora o tecido não-diferenciado tenha sido usado para transformação transiente e estável de plantas, e pode ser neste caso.
[0042] Ao desenhar um vetor para o processo de transformação, são selecionados um ou mais componentes genéticos que são introduzidos na célula ou tecido vegetal. Os componentes genéticos podem incluir qualquer ácido nucléico que é introduzido em uma célula ou tecido vegetal, usando o método de acordo com a invenção. Em uma modalidade, os componentes genéticos são incorporados em uma composição de DNA, tal como uma molécula de plasmídeo ou vetor recombinante de filamento duplo que compreende pelo menos um ou mais dos seguintes tipos de componentes genéticos: (a) um promotor que funciona em células vegetais para causar a produção de uma sequência de RNA, (b) uma sequência de DNA estrutural que causa a produção de uma sequência de RNA que codifica um produto de utilidade agronômica, e (c) uma sequência de DNA 3' não-traduzida que funciona em células vegetais para causar a adição de nucleotídeos poliadenilados para a extremidade 3' da sequência de RNA.
[0043] O vetor pode conter inúmeros componentes genéticos para facilitar a transformação da célula ou tecido vegetal e regulam a exPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 24/90
17/65 pressão da sequência de ácidos nucléicos estruturais. Na modalidade preferida, os componentes genéticos são orientados de modo a expressar um RNAm que é uma modalidade opcional e pode ser traduzido em uma proteína. A expressão de uma sequência codificadora estrutural de plantas (um gene, cDNA, DNA sintético, ou outro DNA) que existe na forma de filamento duplo envolve a transcrição de RNA mensageiro (RNAm) a partir de um filamento do DNA pela enzima RNA polimerase e processamento subsequente do transcrito primário do RNAm dentro dos núcleos. Este processamento envolve uma região 3' não-traduzida que adiciona nucleotídeos poliadenilados às extremidades 3' do RNAm. Os meios para preparar plasmídeos ou vetores que contêm os componentes genéticos desejados são bem conhecidos nessas técnicas.
[0044] A transcrição de DNA em RNAm é regulada por uma região do DNA usualmente referida como o “promotor”. A região promotora contém uma sequência de bases que sinaliza RNA polimerase para se associar com o DNA e para iniciar a transcrição em RNAm usando um dos filamentos do DNA como modelo para produzir um filamento complementar correspondente do RNA. Inúmeros promotores que são ativos em células vegetais foram descritos na literatura. Tais promotores incluiriam, porém sem limitações, os promotores de nopalina sintase (NOS) e octopina sintase (OCS) que são transportados em plasmídeos Ti de Agrobacterium tumefaciens, os promotores de caulimovírus tais como o vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) promotores 19S e 35S e o vírus do mosaico da escrofulária (FMV) promotor 35S, e o promotor intensificado de CaMV35S (e35S). Vários outros promotores de genes de plantas, que são regulados em resposta a sinais ambientais, hormonais, químicos e/ou desenvolvimentais, também podem ser usados para a expressão de genes heterólogos em células vegetais, incluindo, por exemplo, promotores regulados por (1) calor (Callis et al.,
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1988, (2) luz (por exemplo, promotor RbcS-3A da ervilha, Kuhlemeier et al., (1989); promotor RbcS do milho, Schaffner et al., (1991); (3) hormônios, tal como ácido abscísico (Marcotte etal., 1989, (4) ferimento (por exemplo, Wuni, Siebertz et al., 1989); ou outros sinais ou produtos químicos. A expressão específica de tecidos também é conhecida.
[0045] Como descrito abaixo, prefere-se que o promotor específico selecionado seja capaz de causar expressão suficiente para resultar na produção de uma quantidade eficaz do produto gênico de interesse. Os exemplos que descrevem tais promotores incluem, sem limitações, Patente US n° 6.437.217 (promotor RS81 do milho), Patente US n° 5.641.876 (promotor de actina do arroz), Patente US n° 6.426.446 (promotor RS324 do milho), Patente US n° 6.429.362 (promotor PR-1 do milho), Patente US n° 6.232.526 (promotor A3 do milho), Patente US n° 6.177.611 (promotores constitutivos do milho), Patentes US n°s 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor 35S), Patente US n° 6.433.252 (promotor de oleosina L3 do milho), Patente US n° 6.429.357 (promotor de actina 2 do arroz bem como um íntron de actina 2 do arroz), Patente US n° 5.837.848 (promotor específico de raiz), Patente US n° 6.294.714 (promotores induzíveis por luz), Patente US n° 6.140.078 (promotores induzíveis por sais), Patente US n° 6.252.138 (promotores induzíveis por patógenos), Patente US n° 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo), Patente US n° 6.635.806 (promotor de gama-coixina), e pedido de Patente n2 de série US 09/757.089 (promotor de cloroplasto aldolase do milho). Os promotores adicionais que podem encontrar uso são um promotor de nopalina sintase (NOS) (Ebert et al., 1987), o promotor de octopina sintase (OCS) (que é transportado em plasmídeos indutores de tumores de Agrobacterium tumefaciens), os promotores de caulimovírus tais como o promotor 19S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (LawPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 26/90
19/65 ton et al., 1987), promotor 35S de CaMV (Odell et al., 1985), o promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária (Walker et al., 1987; Patentes US n°s 6.051.753; 5.378.619), o promotor de sacarose sintase (Yang et al., 1990), o promotor do complexo do gene R (Chandler et al., 1989), e o promotor do gene da proteína ligante clorofila a/b, PCISV (Patente US n° 5.850.019), e promotores AGRtu.nos (Número de Acesso do GenBank V00087; Depicker et al, 1982; Bevan et al., 1983).
[0046] Os híbridos de promotores também podem ser construídos para intensificar a atividade transcricional (Patente US n° 5.106.739), ou para combinar atividade transcricional desejada, induzibilidade e especificidade de tecido ou especificidade desenvolvimental. Os promotores que funcionam em plantas incluem, porém sem limitações, promotores que são induzíveis, virais, sintéticos, constitutivos como descritos, e temporalmente regulados, espacialmente regulados, e regulados espacialmente e também temporalmente. Outros promotores que são intensificados por tecidos, específicos de tecidos, ou regulados de forma desenvolvimental também são conhecidos nessas técnicas e previstos como tendo utilidade na prática desta invenção.
[0047] Os promotores usados nas construções de DNA (isto é, genes de plantas quiméricas/recombinantes) da presente invenção podem ser modificados, caso desejado, para afetar suas características de controle. Os promotores podem ser derivados por meios de ligação com regiões de operador, mutagênese aleatória ou controlada, etc. Além disso, os promotores podem ser alterados para conter múltiplas “sequências intensificadoras” para auxiliar em elevar a expressão gênica.
[0048] O RNAm produzido por uma construção de DNA da presente invenção pode conter também uma sequência-líder 5' não-traduzida.
Esta sequência pode ser derivada a partir do promoter selecionado
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20/65 para expressar o gene e pode ser especificamente modificada de modo a aumentar ou diminuir a tradução do RNAm. As regiões 5' nãotraduzidas podem ser obtidas a partir de RNA's virais, a partir de genes eucarióticos apropriados, ou a partir de uma sequência gênica sintética. Tais sequências “intensificadoras” podem ser desejáveis para aumentar ou alterar a eficiência da tradução do RNAm resultante. A presente invenção não está limitada às construções nas quais a região não-traduzida é derivada a partir de uma sequência 5' não-traduzida que acompanha a sequência promotora. Ao invés disso, a sequêncialíder não-traduzida pode ser derivada a partir de promotores ou genes não relacionados (vide, por exemplo, Patente US n° 5.362.865). Os exemplos de sequências-líderes não-traduzidas incluem líderes de proteínas de choque térmico do milho e petúnia (Patente US n° 5.362.865), líderes de proteínas do revestimento viral vegetal, líderes da rubisco de plantas, GmHsp (Patente US n° 5.659.122), PhDnaK (Patente US n° 5.362.865), AtAntl, TEV (Carrington e Freed, 1990), e AGRtu.nos (N2 de Acesso GenBank V00087; Bevan et al., 1983). Outros componentes genéticos que servem para intensificar a expressão ou afetar a transcrição ou tradução de um gene também estão previstos como componentes genéticos.
[0049] A região 3' não-traduzida das construções quiméricas pode conter um terminador transcricional, ou um elemento que tem função equivalente, e um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos poliadenilados à extremidade 3' do RNA. As sequências de DNA são aqui referidas como regiões de terminação da transcrição. As regiões são necessárias para a poliadenilação eficiente do RNA mensageiro transcrito (RNAm). A RNA polimerase transcreve uma sequência de DNA codificadora através de um sítio onde a poliadenilação ocorre. Os exemplos de regiões 3' regiões apropriadas são (1) as regiões 3' transcritas, não-traduzidas que conPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 28/90
21/65 têm o sinal de poliadenilação de genes de plasmídeos indutores de tumores (Ti) de Agrobacterium, tais como o gene de nopalina sintase (NOS; Fraley et al., 1983), e (2) os genes de plantas tais como os genes de proteínas de armazenamento de soja e a subunidade pequena do gene de ribulose-1, 5-bisfosfato carboxilase (ssRUBISCO). Um exemplo de uma região 3' preferida é aquela do gene ssRUBISCO E9 da ervilha (pedido de Patente europeu n2 0385 962).
[0050] Em uma modalidade, o vetor contém um gene selecionável, ou capaz de ser triado ou marcado. Estes componentes genéticos são aqui referidos também como componentes genéticos funcionais, pois eles produzem um produto que serve para uma função na identificação de uma planta transformada, ou um produto de utilidade agronômica. O DNA que serve como um dispositivo de seleção ou triagem pode funcionar em um tecido vegetal regenerável para produzir um composto que conferiría depois a resistência do tecido vegetal a um composto de outra forma tóxico. Inúmeros genes marcadores capazes de serem triados ou selecionados são conhecidos nessas técnicas e podem ser usados na presente invenção. Os genes de interesse para uso como um gene capaz de ser selecionado, triado ou marcado incluiríam, porém sem limitações, gus, proteína verde fluorescente (gfp), luciferase (lux), genes que conferem tolerância a antibióticos tais como canamicina (Dekeyser et al., 1989) ou espectinomicina (por exemplo, aminoglicosídeo espectinomicina adeniltransferase (aac/A); Patente US n° 5.217.902), genes que codificam enzimas que dão tolerância a herbicidas, tais como glifosato (por exemplo, 5-enoilpiruvilshiquimato-3fosfato sintase (EPSPS): Della-Cioppa et al., 1987; Patente US n° 5.627.061; Patente US n° 5.633.435; Patente US n° 6.040.497; Patente US n° 5.094.945; documentos WO n°s 04074443, e WO 04009761; glifosato oxidorredutase (GOX; Patente US n° 5.463.175); glifosato descarboxilase (documento WO n° 05003362 e pedido de Patente US
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22/65 η° 2004/0177399; ou glifosato N-acetiltransferase (GAT): Castle et al., publicação de Patente US n° 2003/0083480), dalapon (por exemplo, deh\ que codifica ácido 2,2- dicloro-propiônico desalogenase que confere tolerância ao ácido 2,2-dicloro-propiônico (Dalapon; documento WO n° 9927116)), bromoxinil (haloarilnitrilase (Bxn) para conferir tolerância a bromoxinil (documento WO n° 8704181A1 ; Patente US n° 4.810.648; documento WO n° 8900193A)), herbicidas de sulfonila (por exemplo, aceto-hidroxiácido sintase ou acetolactato sintase que confere tolerância a a inibidores de acetolactato sintase, tais como sulfoniluréia, imidazolinona, triazolopirimidina, pirimidilóxi-benzoatos e ftalida; (Patentes US n°s 6.225.105; 5.767.366; 4.761.373; 5.633.437; 6.613.963; 5.013.659; 5.141.870; 5.378.824; 5.605.011); que codificam ALS, GST-II), bialafos ou fosfinotricina ou derivados (por exemplo, fosfinotricina acetiItransferase (bar) que confere tolerância a fosfinotricina ou glufosinato (Patentes US n°s 5.646.024, 5.561.236, 5.276.268; 5.637.489; 5.273.894; e Documento EP n2 275,957), atrazina (que codifica GST-III), dicamba (dicamba monooxigenase; publicações de pedidos de Patente US n°s 2003/0115626, 2003/0135879), ou setoxodim (acetil-coenzima A carboxilase modificada para conferir tolerância a ciclo-hexanodiona (setoxidim) e arilóxi-fenóxi-propionato (haloxifop) (Patente US n° 6.414.222), dentre outros. Outros procedimentos de seleção também podem ser implementados, incluindo mecanismos de seleção positiva (por exemplo, uso do gene manA de E. coli, que permite o crescimento na presença de manose), e seleção dual (por exemplo, usando simultaneamente 75-100 ppm de espectinomicina e
3-10 ppm de glufosinato, ou 75 ppm de espectinomicina e 0,2- 0,25 ppm de dicamba) e ainda cairiam dentro do âmbito da presente invenção. O uso de espectinomicina em uma concentração de cerca de 251.00 ppm, tal como cerca de 150 ppm, também está contemplado. [0051] A presente invenção pode ser usada com qualquer plasmíPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 30/90
23/65 deo ou vetor de transformação de plantas, que contém um marcador capaz de ser selecionado ou triado e elementos reguladores associados, como descrito, junto com um ou mais ácidos nucléicos expressados de uma maneira suficiente para conferir um traço específico desejável. Os exemplos de genes estruturais apropriados de interesse agronômico previstos pela presente invenção incluiriam, porém sem limitações, genes para tolerância a doenças, insetos ou pragas, tolerância a herbicidas, genes para melhoras de qualidades tais como rendimento, intensificação nutricional, tolerância ao meio ambiente ou tensão, ou quaisquer mudanças desejáveis na fisiologia, crescimento, desenvolvimento, morfologia de plantas, ou produto ou produtos vegetais, incluindo produção de amido (Patentes US n°s 6.538.181; 6.538.179; 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), produção de óleos modificados (Patentes US n°s 6.444.876; 6.426.447; 6.380.462), alta produção de óleos (Patentes US n°s 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008;
6.476.295) , teor modificado de ácidos graxos (Patentes US n°s 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; 6.459.018), alta produção de proteínas (Patente US n° 6.380.466), amadurecimento de frutos (Patente US n° 5.512.466), maior nutrição animal e humana (Patentes US n°s 6.723.837; 6.653.530; 6.541.259; 5.985.605; 6.171.640), biopolímeros (Patentes US n°s RE37,543; 6.228.623; 5.958.745 e publicação de Patente US n° 2003/0028917). Além disso, resistência a estresse ambiental (Patente US n° 6.072.103), peptídeos farmacêuticos e peptídeos secretáveis (Patentes US n°s 6.812.379; 6.774.283; 6.140.075; 6.080.560), traços de melhor processamento (Patente US n°
6.476.295) , melhor digestibilidade (Patente US n° 6.531.648) baixo teor de rafinose (Patente US n° 6.166.292), produção industrial de enzimas (Patente US n° 5.543.576), melhor sabor (Patente US n° 6.011.199), fixação de nitrogênio (Patente US n° 5.229.114), produção
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24/65 de sementes híbridas (Patente US n° 5.689.041), produção de fibras (Patentes US n°s 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; 5.869.720) e produção de biocombustíveis (Patente US n° 5.998.700). Qualquer um destes ou outros elementos genéticos, métodos, e transgenes podem ser usados com a invenção, como deve ser avaliado pelos versados nessas técnicas tendo em vista a presente invenção.
[0052] Alternativamente, as sequências de DNA de interesse podem afetar estes fenótipos codificando uma molécula de RNA que causa a inibição assestada da expressão de um gene endógeno por intermédio de tecnologias silenciadoras de genes, tais como mecanismos mediados por antissense, cossupressão, tecnologias de RNAi incluindo RNAmi (por exemplo, publicação do pedido de Patente US n° 2006/0200878).
[0053] Os ácidos nucléicos exemplificativos que podem ser introduzidos pelos métodos englobados pela presente invenção incluem, por exemplo, sequências de DNA ou genes de outras espécies, ou mesmo genes ou sequências que se originam ou estão presentes na mesma espécie, mas são incorporadas em células recebedoras por métodos de engenharia genética ao invés de métodos de técnicas clássicas de reprodução ou criação. Entretanto, o termo “exógeno” pretende incluir também referência a genes que não estão normalmente presentes na célula que está sendo transformada ou talvez simplesmente não presentes na forma, estrutura, etc., como encontrados no segmento de DNA em transformação ou gene, ou genes que estão normalmente presentes ainda que se deseje, por exemplo, tenham sido superexpressado. Assim sendo, o termo gene ou DNA “exógeno” pretende referir-se a qualquer gene ou segmento de DNA que é introduzido em uma célula recebedora, independentemente de se um gene similar já possa estar presente nesta célula. O tipo de DNA incluído no DNA exógeno pode incluir o DNA que já está presente na célula vegePetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 32/90
25/65 tal, DNA de outra planta, DNA de um organismo diferente, ou um DNA gerado externamente, tal como uma sequência de DNA que contém uma mensagem antissense de um gene, ou uma sequência de DNA que codifica uma versão sintética ou modificada de um gene.
[0054] Em uma modalidade, a transformação de tecido vegetal é realizada por métodos mediados por Agrobacterium ou outra Rhizobia, e as sequências de DNA de interesse estão presentes em um ou mais T-DNA's (Patentes US n°s 6.265.638, 5.731.179; publicações de pedidos de Patentes US n°s 2005/0183170; 2003/110532), ou outra sequência (por exemplo, esqueleto de vetor) que é transformada em uma célula vegetal. Os T-DNA's que podem ser ligados por sequências RB e/ou LB, e podem ter uma sequência de extremidade ou duas sequências de extremidade adjacentes. As sequências que podem ser transferidas para dentro de uma célula vegetal podem estar presentes em um vetor de transformação em uma cepa bacteriana que está sendo utilizada para transformação. Em outra modalidade, as sequências podem estar presentes em vetores de transformação separados na cepa bacteriana. Em ainda outra modalidade, as sequências podem ser encontradas em células ou cepas bacterianas separadas usadas conjuntamente para transformação.
[0055] As construções de DNA usadas para transformação nos métodos da presente invenção contêm também genericamente os segmentos de DNA do esqueleto do plasmídeo, que fornecem a função de replicação e seleção com antibióticos em células bacterianas, por exemplo, uma origem de replicação de Escherichia coli, tal como or/322, uma origem de replicação de Agrobacterium, tal como ori\f ou or/Ri, e uma região codificadora para um marcador selecionável tal como Spec/Strp que codifica aminoglicosídeo adeniltransferase Tn7 (aadA) que confere resistência a espectinomicina ou estreptomicina, ou um gene marcador selecionável de gentamicina (Gm, Gent). Para a
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26/65 transformação de plantas, a cepa bacteriana hospedeira é frequentemente Agrobacterium tumefaciens ABI, C58, LBA4404, AGLO, AGL1, EHA101, e EHA105 portadora de um plasmídeo que tem uma função de transferência para a unidade de expressão. Outras cepas conhecidas pelos versados nessas técnicas de transformação de plantas podem funcionar na presente invenção.
[0056] A distribuição gênica mediada de forma bacteriana (por exemplo, mediada por Agrobacterium-, Patentes US n°s 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840) pode ser feita em células no meristema vivo de um embrião excisado de uma semente (por exemplo, Patente US n° 6.384.301). Durante a etapa de cocultura ou depois um composto antifúngico e/ou antibacteriano composto pode ser utilizado. Os exemplos não-limitativos desses compostos incluem Nistatina, PCNB (pentacloro-nitrobenzeno) e tiabendazol, dentre outros. A espectinomicina ou estreptomicina também pode ser empregada, por exemplo, antes, durante a cocultura, ou depois. Em certas modalidades, a espectinomicina pode ser adicionada durante a cocultura (por exemplo, 100 ou 150 ppm, ou até 300-500 ppm, ou até 1.000 ppm), e opcionalmente não está presente no meio de etapas de cultura posteriores.
[0057] A região meristemática pode ser cultivada na presença de um agente de seleção. O agente seletivo pode ser “pulsado”; isto é, a concentração do agente seletivo que está sendo usado pode ser variada em diferentes estágios na pré-cultura, cocultura, ou processo subsequente de cultura de tecidos. Em certas modalidades, o agente seletivo pulsado é um aminoglicosídeo tal como espectinomicina. O resultado desta etapa é a terminação ou pelo menos retardamento do crescimento da maioria das células dentro das quais a construção genética estranha não foi distribuída com a formação simultânea de brotos, que se originam a partir de uma única célula ou um pequeno agregado de
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27/65 células, incluindo uma célula meristemática transformada. Os brotos e plantas transformadas resultantes podem ser quiméricas (por exemplo, quimeras periclinais) ou elas podem ser derivadas de forma clonal. Entretanto, depois que uma plantinha fenótipo-positiva é identificada, em certas modalidades o uso continuado de agente(s) seletivo(s), denominada também “seleção secundária”, pode ser evitada. Assim sendo, as plantas resultantes podem, neste caso, ser quiméricas com tecido de raiz não-transformado que cresceu na ausência de seleção, mesmo embora o tecido do broto alongado, advindo de um meristema que entrou em contato com um ácido nucléico heterólogo, em si possa ou não possa ser quimérico. Esta evitação de seleção secundária pode economizar tempo, mão-de-obra, e pode também resultar em economias significativas US n° o de meio de cultura e recipientes. O meristema pode ser cultivado na presença de um agente de seleção, incluindo, porém sem limitações, herbicidas semelhantes a auxina, tais como dicamba, 2,4-D, ou MCPA, glufosinato, glifosato, herbicidas da classe de imidazolinona, inibidores de acetolactato sintase, inibidores de protoporfirinogênio oxidase, e inibidores de hidróxi-fenil-piruvatodioxigenase, neomicina, canamicina, paramomicina, G418, aminoglicosídeos, espectinomicina, estreptomicina, higromicina B, bleomicina, fleomicina, sulfonamidas, estreptotricina, cloranfenicol, metotrexato, 2desoxiglicose, betaína-aldeído, S-aminoetil-L-cisteína, 4-metiltriptofano, D-xilose, D-manose, benziladenina-N-3-glicuronidase. Os exemplos de vários marcadores selecionáveis e genes que proporcionam resistência contra eles estão descritos em Miki e McHugh, 2004. [0058] À luz deste relatório descritivo, inúmeros outros genes de marcadores capazes de serem selecionados ou triados, elementos reguladores, e outras sequências de interesse ficarão evidentes para os versados nessas técnicas. Portanto, a discussão precedente pretende ser exemplificativa e não exaustiva.
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28/65 [0059] O uso desses agentes seletivos pode facilitar a recuperação de células de linhagem germinal transformadas no caso de plantas quiméricas da geração RO, de tal como que uma semente R1 completamente transformada seja produzida; isto é, “poda química”, ou pelo menos inibição do crescimento de tecidos não-transformados de seleções de plantas quiméricas da geração RO para crescimento e desenvolvimento de tecidos transformados que incluem tecidos de linhagem germinal transformados capazes de produzir plantas completamente transformadas em uma geração subsequente. Isto pode permtir a cultura simplificada de tecidos e regeneração de plantas, por exemplo, eliminando a embriogênese, tornando o processo mais rápido, menos oneroso, e aplicável a uma série mais ampla de genótipos de algodão, incluindo cultivares melhores que são geralmente difíceis de transformar, bem como a outras plantas para as quais os procedimentos de embriogênese e regeneração não são bem desenvolvidos, se tanto. Em certas modalidades, o tecido de linhagem germinal pode ser selecionado dentro de uma planta quimérica ou parte de planta, para produzir tecido de linhagem germinal transformado, como assinalado abaixo.
[0060] Alternativamente, marcadores capazes de ser triados ou julgados podem ser empregados para identificar setores e/ou plantas transgênicas. Os marcadores exemplificativos são conhecidos e incluem β-glicuronidase (GUS) que codifica uma enzima para vários substratos cromogênicos (Jefferson et al., 1987a; Jefferson et al., 1987b); um gene de locus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos vegetais (Dellaporta et al., 1988); um gene de β-lactamase (Sutcliffe et al., 1978); um gene que codifica uma enzima para os vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene de luciferase (Ow et al., 1986); um gene xy1E
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29/65 (Zukowsky et al., 1983) que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos; um gene de oc-amilase (Ikatu et al., 1990); um gene de tirosinase (Katz et al., 1983) que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina para DOPA e dopaquinona, que, por sua vez, condensa para melanina; proteína verde fluorescente (Elliot et al., 1999) e uma oc-galactosidase.
[0061] Como é do conhecimento nessas técnicas, outros métodos para transformação de plantas podem ser utilizados, por exemplo como descrito por Miki et al., (1993), incluindo o uso de bombardeio de microprojéteis (por exemplo, Patente US n° 5.914.451; McCabe et al., 1991; Patentes US n°s 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880).
[0062] São conhecidos vários meios de cultura de tecidos, os quais, quando suplementados adequadamente, suportam o crescimento e desenvolvimento de tecidos, incluindo a formação de plantas maduras a partir de meristemas excisados. Estes meios de cultura de tecidos podem ser adquiridos como uma preparação comercial ou preparada especialmente, e modificada pelos versados nessas técnicas. Os exemplos desses meios incluem, porém sem limitações, aqueles descritos por Murashige e Skoog, (1962); Chu et al., (1975); Linsmaier e Skoog, (1965); Uchimiya e Murashige, (1962); Gamborg et al., (1968); Duncan et al., (1985); McCown e Lloyd, (1981); Nitsch e Nitsch (1969); e Schenk e Hildebrandt, (1972), ou derivações desses meios suplementados adequadamente. Os versados nessas técnicas estão cientes que os meios e suplementos de meios tais como nutrientes e reguladores do crescimento para uso em transformação e regeneração são usualmente otimizados para a cultura-alvo ou variedade-alvo de interesse. Os meios de cultura de tecidos podem ser suplementados com carboidratos tais como, porém sem limitações, glicose, sacarose, maltose, manose, frutose, lactose, galactose, dextrose, ou proporções de carboidratos. Os reagentes estão disponíveis no mercado e podem ser
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30/65 adquiridos de inúmeros fornecedores (vide, por exemplo, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; e PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS). Uma etapa de temperatura elevada (por exemplo, 1-7 ou 3-5 dias de cultura a 35Ό) pode ser realizada no i nício da cultura de tecidos, depois da cocultura. Explantes também podem ser desenvolvidos, por exemplo, durante a cocultura e seleção, sob condições de iluminação que permitem o desenvolvimento normal de plastídios. Assim sendo, os explantes podem ser desenvolvidos sob uma intensidade de luz de 5-200 μ Einsteins, tal como 5-130 μ Einsteins, com um fotoperíodo de 16 horas de luz/8 de escuridão.
[0063] As plantas transgênicas podem ser regeneradas a partir de uma célula vegetal transformada por métodos e composições aqui descritas. Quando plântulas transgênicas putativas são identificadas na cultura, elas podem ser transplantadas. Os meios de crescimento depois do transplante podem incluir solo, ou um meio isento de solo em vaso ou tampão (plug) de crescimento, tal como um plug OÁSIS, plug Fertiss™, ou vaso Elle. Um regulador do crescimento de plantas, tal como o pentaborato Mepiquat, pode ser usado para reduzir o tamanho das plantas e facilitar o manuseio de grandes números de plantas. Uma planta transgênica formada usando métodos de transformação com Agrobacterium contém tipicamente (porém nem sempre) uma única sequência de DNA recombinante dentro de um cromossoma e é referida como um episódio transgênico. Tais plantas transgênicas podem ser referidas como sendo heterozigotos para a sequência exógena inserida. Um homozigoto de planta transgênica com relação a um transgene pode ser obtido por reprodução sexuada (autocruzamento) de uma planta transgênica segregante independente que contém uma única sequência gênica exógena para si própria, por exemplo, uma planta R0, para produzir uma semente R1. Um quarto da semente R1 produzida será homozigótico com relação ao transgene. A semente R1
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31/65 germinante resulta em plantas que podem ser testadas quanto à zigosidade, usando tipicamente um ensaio SNP ou um ensaio de ampliação térmica que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio de zigosidade).
[0064] Para confirmar a presença do DNA exógeno ou “transgene(s)” nas plantas transgênicas, uma série de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios de “biologia molecular”, tais como Southern e Northern blotting e PCR™; ensaios “bioquímicos”, tais como detecção da presença de um produto protéico, por exemplo, por meios imunológicos (ELISAs e Western blots) ou por função enzimática (por exemplo, ensaio GUS); histoquímica de pólens; ensaios de parte de plantas, tais como ensaios de folha ou raiz; e também analisando o fenótipo da planta regenerada total.
[0065] Depois que um transgene foi introduzido em uma planta, este gene pode ser introduzido em qualquer planta sexuadamente compatível com a primeira planta cruzando, sem a necessidade de sempre transformar diretamente a segunda planta. Portanto, como aqui utilizado, o termo “progênie” denota a descendência de qualquer geração de uma planta parental preparada de acordo com a presente invenção, onde a progênie compreende uma construção de DNA selecionada. Uma “planta transgênica” pode ser, assim, de qualquer geração. O “cruzamento” de uma planta para produzir uma linhagem de planta que tem um ou mais transgenes ou alelos adicionados em relação a uma linhagem de planta originária é definido como as técnicas que resultam em uma sequência específica que está sendo introduzida em uma linhagem de planta cruzando uma linhagem de partida com uma linhagem de planta doadora que compreende um transgene ou alelo. Para conseguir isto poder-se-ia, por exemplo, realizar as seguintes etapas: (a) plantar sementes da primeira (linhagem de partida) e segunda (linhagem de planta doadora que compreende um transgene
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32/65 ou alelo desejado) plantas parentais; (b) desenvolver as sementes da primeira e segunda plantas parentais para dar plantas portadoras de flores; (c) polinizar uma flor da primeira planta parental com pólen da segunda planta parental; e (d) colher sementes produzidas na planta parental portadora da flor fertilizada.
[0066] A presente invenção fornece também partes ou a planta produzida pelos métodos da presente invenção. As partes da planta, sem limitações, incluem fruto, semente, endosperma, óvulo, pólen, folha, talo, e raízes. Em uma modalidade preferida da presente invenção, a parte da planta é uma semente.
Exemplos [0067] Os versados nessas técnicas devem avaliar as muitas vantagens dos métodos e composições fornecidas pela presente invenção. Os exemplos que se seguem são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Os versados nessas técnicas devem avaliar que as técnicas descritas nos exemplos que seguem representam técnicas descobertas pelos inventores para funcionar bem na prática da invenção, e assim sendo, podem ser consideradas como constituindo modos preferidos para sua prática. Entretanto, os versados nessas técnicas devem, à luz do presente relatório descritivo, avaliar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas descritas e ainda assim obter um resultado semelhante ou similar sem fugir do espírito e âmbito da invenção. Todas referências aqui citadas são aqui incorporadas como referência até o grau em que elas suplementam, explicam, fornecem um fundamento, ou enunciam a metodologia, técnicas ou composições aqui empregadas.
Exemplo 1
Esterilização, Hidratação, e Excisão de Sementes de Algodão, e Recuperação de Explantes de Meristemas.
A. Esterilização de Hidratação de Sementes de Algodão
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33/65 [0068] As sementes de algodão foram processadas mecanicamente para excisar e isolar seus tecidos meristemáticos. Para obter material de explante meristemático transformável, as sementes de algodão (por exemplo, dos genótipos STN474 (Stoneville Pedigreed Seed Co., Stoneville, MS), Delta Pearl (Delta and Pine Land Co., Scott, MS), DP5415, DP393, 00S04 (Delta and Pine Land Co.), SureGrow501 or SureGrow747 (Sure Grow Cotton Seed Company, Maricopa, AZ) foram processadas como se segue para separar o embrião que compreende tecidos meristemáticos do revestimento da semente e cotilédone(s)). As sementes de algodão foram removidas da estocagem a 4Ό ou 20Ό e levadas até a temperatura ambiente. As semen tes foram pesadas, colocadas em uma unidade de embebição estéril, e esterilizadas na superfície em Clorox a 50% (hipoclorito de sódio) por 5 min. As sementes são então enxaguadas 3 vezes com água destilada esterilizada e foram hidratadas em um meio de hidratação líquido (CSM) a 28Ό no escuro por cerca de 18 h (faixa de 14 a 42 horas). Alternativamente, a temperatura de embebição pode ser mais baixa, por exemplo, cerca de 23Ό. O meio CSM continha 200 mg/L de carbenicil ina (PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS), 125 mg/L de cefotaxima (Midwest Scientific, St. Louis, MO), 30 mg/L de BRAVO 75 (Carlin, Milwaukee, Wl) e 30 mg/L de Captan 50 (Carlin). Outras soluções também foram usadas com sucesso para hidratar sementes de algodão, incluindo água desmineralizada estéril ou água contendo uma concentração fraca de branqueador (tipicamente 50 a 1.000 ppm de hipoclorito de sódio). Depois da hidratação, as sementes podem ser usadas imediatamente, ou estocadas em temperaturas de refrigeração por até uma semana antes de processamento adicional.
B. Esmagamento de Sementes de Algodão [0069] Um modelo atual de máquina de excisão está ilustrado na figua 1. As sementes hidratadas esterilizadas na superfície foram carPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 41/90
34/65 regadas sem orientação dentro da máquina de excisão em bateladas ou continuamente através de um alimentador localizado no topo da máquina (figura 1B, 1C). A excisão mecânica de embriões foi realizada usando a máquina de excisão em uma sala limpa dedicada. A máquina de excisão contém 1 par de roletes de aço para esmagar as sementes. Os roletes de aço (figura 1D, 1E) foram modificados a partir daqueles usados para excisão de meristemas de soja (por exemplo, pedido de Patente US n° 2005/0005321) alterando o material de elastômero para aço inoxidável, reduzindo o número de roletes em pares de 3 para 1, e adicionando sulcos ao longo do eixo geométrico dos roletes para agarrar melhor as sementes de algodão e esmagamento mais eficiente das sementes. Uma comparação dos roletes de aço modificados com os roletes de elastômero desenvolvidos anteriormente usados em excisão de eixo embrionário de soja está apresentada na tabela 1. “Explantes de Qualidade” significa explantes com tecido meristemático viável (isto é, úteis como alvos de transformação).
Tabela 1. Comparação entre roletes de aço modificados e roletes de elastômero.
Roletes de Aço Modificados Roletes de Elastômero
% de rendimento 41,6 11,5
% de regenerável 14,3 3,5
% de explante de Qualidade 45,8 16,6
% de GUS positivos 0,5 0,2
% com forte expressão de gus perto de periclinal 0,08 0,04
[0070] Os resultados d os testes nos parâmetros da máquina tais
como distância de afastamento dos roletes e velocidade dos roletes estão resumidos nas tabelas 2-4. Os seguintes ajustes exemplificativos demonstraram funcionar bem, dentre outros: distância de afastamento dos roletes de 2,5 mm; rolete direito girando no sentido horário em
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35/65 ajuste 40 (número arbitrário de ajuste da velocidade no dial); rolete esquerdo girando no sentido anti-horário no ajuste 80; vazão de água de 10 L/min.
Tabela 2. Efeito da distância do afastamento de roletes sobre o rendimento de explantes.
Experimento 1 Experimento 2
Afastamento dos Roletes (mm) % de rendimento % com meristema Afastamento de Roletes (mm) % de rendimento % com meristema
2 10,4 37,1 2,2 9,5 39,1
2,5 12,1 48,7 2,6 11,9 52,3
3 11,2 32 3 8,9 46
3,5 9,4 43,9 3,6 8,7 48,6
4,1 6,6 40,6
Tabela 3. Efeito da velocidade dos roletes sobre o rendimento de exmento de explantes.
Ajustes da velocidade dos roletes direito/esquerdo Recuperação de explante de qualidade (%) % de explante com meristema
40/60 7 27,3
40/80 9,3 32,5
40/100 6,3 31
60/80 6,2 20,3
60/100 9,45 31
80/100 7 23,2
Tabela 4. Efeito da vazão de água sobre a recuperação de explantes.
Vazão de Água (L/min) % de esma- gamento de sementes % de recuperação % de recuperação de explante de qualidade % de explante com meristema
5 21 23,9 5,7 24
10 24 40,8 10,4 25,4
15 19 20,5 5,9 28,8
20 14 18,2 4,4 24,2
25 14 15,0 3,5 23,1
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Exemplo 2
Separação de Explante Meristemático por Peneiração.
[0072] Depois que o material de semente atravessou o mecanismo de roletes), a mistura de sementes esmagadas (figura 2) foi coletada por uma peneira que permite que água escape, mas retém semente esmagada. O efeito do afastamento dos roletes sobre a condição de tecidos meristemáticos a partir de sementes esmagadas também está ilustrado na figura 2. O material retido foi então peneirado para remover detritos e enriquecer quanto a explantes potencialmente regeneráveis e transformáveis, compreendendo tecidos meristemáticos. Um método para separar explantes meristemáticos de revestimento de semente e material cotiledôneo da semente esmagada grossa foi por peneiração mecanizada ou manual, iliustrada na figura 2. Vários materiais foram testados na construção de peneiras, incluindo peneiras de aço-carbono e peneiras de aço inoxidável com laterais de alumínio, madeira ou aço. Uma seção transversal com formato em “V” da peneira demonstrou ser fácil de fabricar e eficaz em reter explantes, e ao mesmo tempo, permitindo que os detritos menores atravessem (figura
3). Os explantes meristemáticos das sementes esmagadas puderam ser também eficientemente separados por um método de peneiração em duas etapas, que pode ser realizado mecanicamente ou manualmente. Em primeiro lugar, as sementes esmagadas (uma mistura de revestimentos de sementes, cotilédones e embriões) foram passadas através de uma peneira n2 8, que reteve os detritos grandes (revestimento e cotilédone de sementes), e ao mesmo tempo, permitindo que os detritos pequenos e explantes atravessem.
[0073] A mistura resultante foi então peneirada novamente usando uma segunda peneira de aço inoxidável. Vários tamanhos de abertura na faixa entre, por exemplo, 1/16” x 3/8” e 1/24” x 1/2” foram testados. Um tamanho de abertura de 1/18” x 3/4” ou 1/19” x 3/4” deu a melhor
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37/65 pureza de explante com mínima perda adicional em recuperação de explante. Assim sendo, as peneiras com um tamanho de abertura de 1/18” x 3/4” ou 1/19” x 3/4” foram escolhidas para uso adicional na segunda etapa de peneiração. Este parâmetro pode ser ajustado baseado no tamanho das sementes e no tamanho esperado do explante. A segunda peneira reteve explantes e alguns detritos maiores, mas permitiu que os detritos pequenos atravessassem. A tabela 5 indica uma comparação de material resultante depois das duas etapas de peneiração, envolvendo procedimento mecanizado ou manual. No primeiro caso, uma etapa inicial de peneiração manual foi seguida de uma etapa de peneiração em máquina. No segundo caso, ambas etapas de peneiração foram realizadas por máquina. Tanto a peneiração como a manual podem separar explantes meristemáticos de outros detritos. A peneiração com máquina parece ser mais eficiente do que a peneiração manual em produzir explantes úteis para transformação.
Tabela 5. Recuperação de explantes usando peneiração manual e/ou mecanizada.
1a peneiração manual e 2a peneiração mecanizada 1â e 2- peneirações mecanizadas
Entrada de sementes secas (g) 850 300
Saída de mistura esmagada (g) 96,8 34.7
% de rendimento 27,8 36,2
% de explante de qualidade 46,4 62,1
[0074] Outros parâmetros que podem ser variados durante o processo de peneiração incluem a quantidade de semente (por exemplo, gramas de semente por batelada), vigor e extensão do processo de peneiração (por exemplo, em minutos), levando a melhor pureza e rendimento de material transformável, medido pelo número de “explantes de qualidade” por grama de material peneirado, ou pelo número de “explantes de qualidade” recuperados por minuto de peneiração. O
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38/65 termo “explantes de qualidade” significa explantes com meristemas úteis como alvos de transformação. Observou-se que a produtividade mais alta do processo (mas não necessariamente o número de explantes) é atingida quando uma batelada grande de sementes esmagadas é peneirada durante um tempo curto. Embora o número absoluto de “explantes de qualidade” possa ser diminuído um tanto neste caso, a economia de tempo mais do que compensa isto. Uma maior pureza dos explantes também pode ser conseguida. Isto presume, entretanto, que a quantidade de semente esmagada disponível não é limitativa, devido à contribuição relativamente pequena do tempo de excisão na extensão global do processo para obter tecido de explante de algodão transformável. Assim sendo, caso a quantidade de semente seja limitativa, os parâmetros de peneiração podem ser ajustados de acordo. Os explantes de qualidade preparados por intermédio do processo automatizado descrito estão prontos para serem transformados, ou podem ser estocados antes de usar em temperaturas de refrigeração, ou de até 28Ό antes do uso. A estocagem nestas temperatu ras pode manter a qualidade e capacidade de transformação por pelo menos 1 semana. A refrigeração é preferida para estocagem mais longa.
Exemplo 3
Enriquecimento Adicional de Explantes Embrionários Recuperados [0075] Os explantes recuperados a partir do exemplo acima ainda continham alguns detritos. Os explantes foram purificados adicionalmente por um método de flutuação. O método baseou-se na observação que os explantes mais recém-peneirados, mas não a maioria dos detritos, são capazes de flutuar para a superfície de água desmineralizada estéril fresca. Esta etapa removeu detritos adicionais, melhorando a pureza dos explantes (por exemplo, figura 2) e como indicado nas tabelas 6-7. A separação por flutuação (isto é, com descarte da fração em decantação) pode resultar em alguma perda de explantes transPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 46/90
39/65 formáveis, pois tanto as frações flutuantes como as em decantação continham explantes transformáveis, como concluído pela subsequente transformação transiente com Agrobacteríum e coloração de GUS de material do explante de cada fração de explantes. Entretanto, a pureza dos explantes da fração flutuante é melhorada consideravelmente em comparação com o material sem a etapa de flutuação.
Tabela 6. Enriquecimento de Explantes por Flutuação.
Componentes de rendimento Peneiração de 2 Etapas Peneiração de 2 Etapas + Flutuação
% de explante com meristema 25 44
% de explante danificado 25 35
% de detritos 50 21
Tabela 7. Enriquecimento da Pureza de Explantes por Intermédio do termédio do Uso de Etapa de Peneiração com Flutuação
Fração de Explantes % de Explantes na Fração Explantes Totais/ grama (pureza)
Flutuantes 57% 62,7
Submersos 43% 14,6
Exemplo 4
Aperfeiçoamentos Adicionais do Processo.
[0077] Para melhorar ainda mais a eficiência do processo, modificações adicionais da unidade de excisão (“excisionador”) são realizadas. Por exemplo, uma bandeja de contenção de água e sementes é adicionada para assegurar a contenção de sementes (figura 4). A bandeja pode ser, por exemplo, uma bandeja de aço inoxidável retangular localizada embaixo da saída da máquina, com paredes laterais em três dos quatro lados da bandeja. O quarto lado contém meios para afixar um saco de malha descartável que retém sementes e detritos, e ao mesmo tempo, permitindo que a água escape.
[0078] Um sistema de “limpeza no lugar” também pode ser adicionado ao sistema de produção de explantes, para simplificar a limpeza do equipamento, e reduzir a possibilidade de acidentes no local de traPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 47/90
40/65 balho e contaminação de amostras. Os procedimentos de limpeza envolvem remoção de detritos, usando o fluxo de água esterilizada e fórceps, caso necessário, e em seguida, bombeamento de uma solução sanitizante (por exemplo, ácido peracético, tal como MINNCARE (Minntech, Minneapolis, MN)) ou gás através da máquina por 10 minutos a cerca de 10 L/min. A solução sanitizante é extrudada da máquina por aplicação de ar pressurizado estéril. A máquina limpa é mantida, entre usos, sob pressão positiva de ar esterilizado. Um sistema de limpeza no lugar automatizado foi projetado. O mecanismo controla o processo de limpeza da seguinte maneira: primeiramente, um agente sanitizante (por exemplo, 1% de MINNCARE ou similar) é bombeado através do equipamento por um período de tempo estabelecido (por exemplo, 10 min ou como recomendado pelo fabricante do agente sanitizante). O fluxo do agente é então descontinuado, e ar pressurizado estéril é purgado através do equipamento para remover o líquido remanescente. Finalmente, ar estéril sob pressão positiva é aplicado como um meio de estocagem estéril do equipamento entre usos. No caso do peneirador, as peças removíveis são enviadas para uma autoclave, enquanto que as peças estacionárias podem ser borrifadas com solução a 1% de MINNCARE ou outra solução de esterilização. Exemplo 5
Desenvolvimento de um Método de Transformação para Algodão
Usando Embriões Excisados.
[0079] Este exemplo descreve a transformação mediada com Agrobacterium de algodão usando embriões excisados mecanicamente.
A. Construções de Expressão de Plantas para Transformação.
[0080] Os vetores de transformação com Agrobacterium tumefaciens foram construídos usando técnicas padronizadas de biologia molecular conhecidas pelos versados nessas técnicas. As seguintes
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41/65 construções de transformação foram usadas:
[0081] (1) pMON96959: que contém o gene uidA sob o controle de um promotor de CaMV.35S intensificado (Patentes US n°s 5.322.938; 5.352.605; 5.359.142; e 5.530.1960, uma sequência-líder 35S, e uma região 3’ não-traduzida do gene de nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (N2 de Acesso do Genbank E01312); e o marcador selecionável Dicamba Monooxigenase (DMO) de Pseudomonas maltophilia (Patente US n° 7.022.896) assestado para cloroplasto por um peptídeo de trânsito de cloroplastos e os primeiros 24 aminoácidos da proteína madura da subunidade pequena de ribulose 1,5-bis-fosfato carboxilase (rbcS) da ervilha. O cassete do gene de DMO contém um promotor intensificado para o transcrito de comprimento inteiro do vírus das esfrias cloróticas do amendoim (PCISV.FIt), uma sequência-líder da região 5’ não-traduzida do genoma do vírus Etch RNA do tabaco (TEV Carrington e Freed, 1990), e uma região 3’ não-traduzida do rbcS2 da ervilha (Coruzzi etal., 1984).
[0082] (2) pMON96999: que contém o mesmo cassete de uidA descrito para pMON96959, mas um marcador selecionável diferente, um gene aadA (por exemplo, Patente US n° 5.217.902) para conferir resistência a espectinomicina. O produto gênico de aadA adenililtransferase foi assestado para o cloroplasto por um peptídeo de trânsito de cloroplastos de Arabidopsis EPSPS (ShkG-CTP2 Klee et al., 1987.), e ficou sob o controle do promotor para o fator de alongamento de Arabidopsis EF-1alfa (Tsf1; Pedido de Patente US n° 2005/0022261) com um intensificador de FMV-35S, um Tsf1 líder (éxon 1), um íntron Tsf1, e uma região 3’ não-traduzida de rbcS2 da ervilha.
[0083] (3) pMON102514: que inclui os genes de DMO e bar para uso em esquemas de seleção única ou dupla com dicamba e/ou glufosinato. O cassete do gene de DMO compreende um promotor intensificado do transcrito de comprimento inteiro do vírus da estria clorótica
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42/65 do amendoim (PCLSV.FIt; Patente US n° 5.850.019), a sequência-líder TEV, a região 3’ não-traduzida do gene da proteína de fibra E6 do algodão Sea-island, e o peptídeo de trânsito de cloroplastos de Arabidopsis ShkG-CTP2 para assestar DMO para cloroplasto. O cassete do gene bar contém um promotor de CaMV.35S intensificado, um líder de petúnia Hsp70 (Patente US n° 5.362.865), um gene bar, e um terminador nos de Agrobacteriumr.
[0084] (4) pMON 107303: que contém o gene uidA sob o controle de um promotor de CaMV.35S intensificado, uma sequência-líder 35S, e uma região 3’ não-traduzida do gene de nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens', e o cassete do gene bar contém os mesmos elementos reguladores, mas sem a sequência do peptídeo de trânsito de cloroplastos que o cassete de aadA em pMON96999.
[0085] Os exemplos de construções de transformação descritos acima continham todos um único T-DNA para integração do transgene dentro do genoma da planta. Os vetores de transformação com 2 TDNAs também foram usados com esta invenção. Um exemplo de tais vetores está descrito abaixo:
[0086] (5) pMON 107375: portando 2 T-DNAs, ambos contendo 2 genes marcadores, em uma orientação cabeça para cauda. O primeiro T-DNA inclui um cassete de aadA e um de uidA. O produto gênico de aadA adenililtransferase é assestado para o cloroplasto por um peptídeo de trânsito de cloroplasto de Arabidopsis EPSPS (ShkG-CTP2, Klee et al., 1987), e o gene fica sob o controle do promotor para o fator de alongamento de Arabidopsis EF-1alfa (Tsf1; Pedido de Patente US n° 2005/0022261) com um intensificador de FMV-35S, uma Tsf1 líder (éxon 1), um íntron Tsf1, e uma região 3’ não-traduzida de rbcS2 da ervilha. O gene uidA fica sob o controle e um promotor de CaMV.35S intensificado, e uma região 3’ não-traduzida do gene de nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens. O segundo T-DNA consiste em
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43/65 um cassete de expressão de DMO e bar. O cassete do gene de DM0 compreende um promtor intensificado para o transcrito de comprimento inteiro do vírus da estria clorótica do amendoim (PCLSV.FIt, Patente US n° 5.850.019), a sequência-líder de TEV, a região 3’ não-traduzida a partir do gene da proteína de fibra E6 do Sea-island cotton, e um peptídeo de trânsito de cloroplasto de Arabidopsis ShkG-CTP2 para assestar DMO para o cloroplasto. O gene de DMO foi otimizado em códons para expressão intensificada do dicotilédone. O cassete do gene dar contém um promotor de CaMV.35S intensificado, um líder de petúnia Hsp70 (Patente US n° 5.362.865), um gene bar, e um terminador nos de Agrobacterium. pMON 107353 (oriV), que é similar a pMON 107375 (oriRi), exceto pela origem de replicação, também foi usado extensivamente nos estudos aqui descritos.
[0087] O uso desta construção e episódios derivados de interesse demonstram a utilidade da poda química usando glufosinato como um meio para identificar plantas transgênicas e/ou setores positivamente transformados em plantas quiméricas, e eliminando quimicamente setores negativos.
B. Preparação de Células de Agrobacterium.
[0088] A cepa de Agrobacterium C58 que contém um vetor binário com um ou dois cassetes de expressão de plantas, como descrito acima, foi inoculada, a partir de um insumo em glicerina, dentro de um meio LB líquido (10 g/L de cloreto de sódio, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de bacto-triptona), contendo 75 mg/mL de espectinomicina e 50 mg/mL de canamicina. A cultura líquida foi deixada desenvolver a 28Ό a 200 rpm em um vascolejador rotativo de um di a para o outro. Depois que a densidade óptica (DO660) da cultura noturna atingiu a faixa-alvo de 0,4-1,2, a cultura bacteriana foi centrifugada a 3.500 rpm por aproximadamente 20-25 min até peletizar as células.
[0089] Depois da remoção do sobrenadante, o pélete foi recolocaPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 51/90
44/65 do em suspensão em 10 mL de um meio de inoculação (INO, tabela 8), e diluído ainda mais e ajustado para cerca de 0,28-0,32 em DO660. Uma série de estudos de expressão transiente de GUS indicou que uma DO660 de 0,6- 0,8 do inóculo produziu uma proporção comparativamente mais alta de transformação meristemática e expressão de transgene.
Tabela 8. Composição do Meio de Inoculação (INO).
Ingrediente Quantidade/L
Sulfato de magnésio (Fisher M63) 0,1 g
Sulfato de amônio (Fisher A702) 53,6 mg
Fosfato de sódio monoidratado (Fisher S369-500) 60 mg
Cloreto de cálcio (Sigma C-3881) 60 mg
Ácido bórico (Fisher A73-3) 0,3 mg
Sulfato de manganês (Sigma I-2550) 1 mg
Sulfato de zinco heptaidratado (Sigma Z-1001) 0,2 mg
lodeto de potássio (Sigma P-8166) 0,075 mg
Molibdato de sódio di-idratado (Sigma S-6646) 0,025 mg
Sulfato cúprico (Fisher C493-500) 2,5 pg
Cloreto de cobalto hexaidratado (Sigma C-2911) 2,5 pg
Sequestrene (Ciba 964603) 2,8 mg
Nitrato de potássio (Sigma P-8291) 1 g
Glicose (Phytotech G386) 30 g
MES (Sigma M8250) 3,9 g
Levar volume até 1L com água destilada desmineralizada
pH com KOH até 5,4
Autoclave
Adicionar insumo de vitamina estéril contendo o seguinte:
Mioinositol (Sigma 1-3011) 10 mg
Ácido nicotínico (Sigma N-0765) 0,1 mg
Cloridrato de piridoxina (Sigma P-8666) 0,1 mg
Cloridrato de tiamina (Sigma T-3902) 1 mg
Ό090] O pH do meio de preparação de Agrobacterium (meio de crescimento, recolocação em suspensão e cocultura) demonstrou afePetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 52/90
45/65 tar a eficiência da transformação de meristemas de algodão excisados. Um pH de cerca de 5,3 deu a proporção subsequente mais alta de episódios de transformação estável de “alta qualidade”, embora meios com outro pH entre 5,0 e 10,0 possam ser usados. Episódios de “alta qualidade” referem-se a episódios transgênicos que contêm uma grande área de expressão estável de GUS, por exemplo, em uma folha, incluindo a veia central ou a expressão estável de GUS em todas ou múltiplas folhas, como demonstrado por ensaio histoquímico de GUS. Tais padrões de expressão demonstraram estar mais possivelmente correlacionados com a camada celular L1, L2, ou L3 de tecido meristemático (por exemplo, transformação periclinal), que podem resultar em transformação de linhagem germinal, ou sugerem origem de uma única célula dos brotos.
C. Feridagem, Inoculação e Cocultivo de Explante.
[0091] Os explantes dos exemplos 1 ou 2 foram enxaguados em água esterilizada. Cerca de 1-60 g, por exemplo 30 g, de explantes foram colocados dentro da parte do topo (de cabeça para baixo) de um recipiente Plantcon® (MP Biomedicals, Solon, OH), e em seguida, adição de aproximadamente 50 mL da suspensão preparada de Agrobacterium, o suficiente para cobrir os explantes. Depois que o Plantcon® foi fechado, ele foi inserido dentro de um suporte adequadamente dimensionado,que foi colocado dentro de um aparelho de ultrassom (por exemplo, L&R Ultrasonics QS140; L&R Manufacturing Co., Kearny, NJ; ou um aparelho de ultrassom Honda W113, Honda, Denshi Japan). O aparelho de ultrassom foi enchido com cerca de 2 L de 0,1% de Triton® (por exemplo, Sigma 526-36-23; Sigma Chemical Co, St. Louis, MO). Depois de até 5 min de aplicação de ultrassom, o Plantcon® foi afixado firmemente em um vascolejador a 65-70 rpm ou mais por 10 min para incubação. Depois da inoculação, o inóculo de Agrobacterium foi removido do Plantcon®. Cerca de 2 g do tecido do explante inoculaPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 53/90
46/65 do foram transferidos para um novo Plantcon® contendo papel de filtro estéril e 5 mL de INO, e os explantes foram espalhados sobre a superfície do meio para evitar aglomeração. O meio INO foi também suplementado com reguladores do crescimento de plantas, tais como giberelinas (GA3), auxinas (por exemplo, NAA, IBA, IAA, 2,4-D, dicamba, etc.), citocininas (por exemplo, BAP, tidiazuron, dikegulac, cinetina, etc.), e/ou agentes antifúngicos ou antibacterianos tais como nistatina, ou tiabendazol (TBZ). O Plantcon® que contém explantes inoculados foi colocado dentro de uma incubadora Percival para cocultivo a aproximadamente 22-28Ό e um fotoperíodo de 16 horas de luz (intensidade da luz >5 μΕ, por exemplo, entre cerca de 5 μΕ e 200 μΕ) por 2-5 dias. Em certos estudos, a espectinomicina (50- 100 ppm) foi incluída no meio de cocultivo. Como ilustrado na figura 8, isto levou a TF intensificada.
D. Seleção e Identificação de Episódios Transqênicos pelo Uso de Espectinomicina ou Outro Agente Seletivo no Meio de Cultura de Tecidos.
[0092] Este exemplo descreve a seleção com o antibiótico espectinomicina. Entretanto, métodos análogos podem ser realizados usando outros agentes de seleção tais como canamicina, estreptomicina, G418, paromomicina, glufosinato, glifosato, higromicina B, imidazolinona, e dicamba, ou uma combinação de quaisquer deles ou agentes de seleção similares. Um marcador capaz de ser triado, tal como GUS, CrtB, ou uma fosfofrutocinase dependente de ATP de levedura (ATP PFK), também pode ser empregado.
[0093] Depois do cocultivo, os explantes foram removidos e implantados ou acamados sobre a superfície de um meio WPM semissólido (tabela 9) em recipientes Plantcon® suplementados com 200 mg/L de cefotaxima, 200 mg/L de carbenicilina e 25-200 mg/L de espectinomicina com ou sem reguladores do crescimento de plantas (tais coPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 54/90
47/Q5 mo BAP, tidiazuron, GA3 ou dikegulac), conforme necessário, para estimular a formação de múltiplos brotos. Tipicamente, ~25 explantes foram colocados dentro de cada recipiente. Os resultados indicam que o plaqueamento sobre a superfície de explantes foi pelo menos tão eficaz quanto a implantação (tabela 10). O plaqueamento dos explantes inoculados sobre a superfície de um meio líquido WPM (tabela 9, mas sem o agente geleificante AGARGEL) também foi testado para melhorar a eficiência e para reduzir a carga ergonômica da implantação de explantes dentro do meio. O plaqueamento sobre a superfície de explantes sobre substratos de cultura líquidos (papel de filtro, feltro de poliéster e outros panos, e outras membranas permeáveis e semipermeáveis também foram testados com sucesso. Os explantes foram deixados desenvolver sobre o meio de seleção a 28Ό (variações diárias e sazonais de 22-33Ό) com um fotoperíodo de tipicamente 16h de luz, embora 24 horas de luz também seja eficaz para produzir plantas de algodão transgênicas, e uma intensidade da luz de 5-200 μ Einsteins, tipicamente 70-130, por cerca de 4-8 semanas. Uma temperatura inicial de 35Ό durante os primeiros 3-5 d ias durante a seleção também foi testada, antes que os explantes fossem movidos para 28Ό. O período de cultura a 35Ό demonstrou ser be néfico (vide, por exemplo, exemplo 9).
[0094] Os explantes em regeneração com crescimento de brotos verdes sadios (por exemplo, figura 5) foram subsequentemente transferidos para dentro de meio de seleção fresco para crescimento continuado (segunda etapa de seleção). Em contraste, os explantes sem um gene que confere resistência à espectinomicina produziram brotos branqueados ou primórdios quando desenvolvidos com espectinomicina, que poderíam ser facilmente identificados. Depois de 1-4 semanas, as plântulas com brotos verdes parecendo sadios foram transferidas e implantadas em Meio de Enraizamento de Algodão (CRM) (tabela 11)
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48/65 para enraizamento. O meio de enraizamento pode compreender espectinomicina ou estreptomicina, ou a seleção pode ser descontinuada durante a etapa de enraizamento. As plantas enraizadas foram então levadas para uma estufa para crescimento continuado e para análise adicional.
[0095] A partir da infecção com Agrobacterium depois da excisão e enriquecimento dos explantes, os explantes passaram por um processo de seleção. Os episódios transgênicos selecionados cresceram então para dar uma planta madura. A semente R1 transgênica pode ser colhida por cerca de 24 semanas depois do início de um experiment de transformação (por exemplo, cocultivo com Agrobacterium), representando economia significativa de tempo e mão-de-obra em comparação com uma estratégia típica de transformação e regeneração de plantas de algodão que emprega embriogênese. A tabela 12 é ilustrativa de agentes de seleção e taxas eficazes testadas.
Tabela 9. Composição de WPM Modificado Suplementado com Antibióticos.
Ingrediente Quantidade / L ou concentração final
LM WPM com vitaminas (Phytotech L449) 2,41 g
Dextrose (Fisher D16-3) 20 g
Gluconato de cálcio (Sigma G-4625) 1,29 g
Clearys 3336 WP (Carlin 10-032) 0,03 g
AGARGEL (Sigma A-3301) 4g
Encher com água até 1 L
PH 5,6
Autoclave
Carbenicilina (Phytotech C346) (40mg/mL) 200 ppm
Cefotaxima (Midwest NDC0039-0019-10) (50 mg/mL) 200 ppm
Espectinomicina (50 mg/mL) 150 ppm
Tabela 10. Comparação de implantação de explante e plaqueamento superficial.
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49/65
Implantação Plaqueamento Superficial
N2 total de explantes 2.942 2.530
% de regeneráveis 25,8 35,3
% de fenótipo-positivos 3,0 4,7
% de regeneráveis com GUS 0,5 1,2
% de fenótipo-positivos com GUS 4,6 8,4
% de regeneráveis com forte expressão de gus quase periclinal 0,1 0,1
% de fenótipo-positivos com forte expressão de gus quase periclinal 1,2 0,8
[0096] Fenótipo-positivos: demonstrando fenótipo visível indicativo de resistência ao agente seletivo usado (por exemplo, verdes parecendo sadios crescimento adequadamente formado na seleção com espectinomicina como distintos de branqueados malformados e tecido fenótipo-negativo não-transgênico necrótico);
[0097] Transformação quase periclinal: uma área grande de 50% ou mais de borda cortada) de expressão de GUS em uma folha incluindo a veia central, ou expressão estável de GUS em múltiplas folhas, como testado por coloração histoquímica quanto a GUS.
Tabela 11. Composição de CRM.
Ingrediente Quantidade / L ou concentração final
Sais basais MS (Phytotech M524) 2,15 g
Mioinositol (Sigma 1-3011) 0,1 g
Dextrose (Fisher D16-3) 30 g
Insumo de SBRM vitamina: Glicina (Sigma G-6143): 1 g/L Ácido nicotínico (Sigma N-0765): 0,25g/L Cloridrato de piridoxina (Sigma P-8666): 0,25g/L Cloridrato de tiamina (Sigma T-3902): 0,5g/L 2 mL
Cisteína (10 mg/mL) 10 mL
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Ingrediente Quantidade / L ou concentração final
Levar volume com água destilada desmineralizada
pH com KOH 5,8
Bacto ágar (BD 214030) sg
Autoclave
IAA (Sigma I-2886) (0,02 mg/mL) 0,1 ppm
Timentina (Duchefa T0190) (100 mg/mL) 100 ppmL
Cefotaxima (Midwest NDC0039-0019-10) (50 mg/mL) 200 ppm
Tabela 12. Agentes de seleção e suas taxas eficazes.
Agente de Seleção Faixa testada (PPm) Plantas transformadas de forma estável produzidas em concentrações (ppm)
Dicamba 0-10 0,3
Glufosinato 0-25 0, 4, 5, 7, 10, 13, 25
Glufosinato + dicamba 0-7/0-0.3 4/0,2, 4/0,25
Espectinomicina 0-1000 50, 75, 100, 150+
Paromomicina 0-400 200, 300
[0098] A espectinomicina serviu como um marcador visual útil para identificação precoce da transformação. Os tecidos não-transformados usualmente apareceram branqueados e frequentemente malformados sob seleção com espectinomicina, enquanto que os tecidos transformados estavam verdes e adequadamente em desenvolvimento (figura
5). A natureza transformada do tecido verde foi confirmada por expressão de GUS depois de cerca de 4-8 semanas sobre o meio de seleção. Portanto, usando espectinomicina como um agente de seleção antecede os ensaios com GUS intensivos em mão-de-obra e morosos frequentemente usados em sistemas de transformação de meristemas e proporciona a vantagem de reduzir significativamente a mão-de-obra envolvida para produzir plantas transgênicas.
[0099] E. Seleção e Identificação de Episódios Transgênicos pelo
Uso de Poda Química ou Aspersão de Herbicida.
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51/65 [00100] A poda química por aspersão de herbicida, isto é, exterminação de tecido não-transformado, também foi testada em plantas que foram transformadas com transgenes para tolerância a dicamba e glufosinate. As plantas foram colocadas em uma câmara especial de aspersão, e borrifadas manualmente com formulações comerciais de herbicidas, tais como LIBERTY a 100-3.000 ppm, e CLARITY a 1003.000 ppm. As plantas foram borrifadas até escorrer, deixadas secar por cerca de 2 horas e depois levadas de volta para a estufa. Os tecidos não-transgênicos foram usualmente exterminados ou seu crescimento foi suprimido pelo spray, enquanto que os tecidos que expressam transgenes continuaram a crescer, permitindo fácil identificação de tecidos transgênicos. Os sprays de CLARITY e LIBERTY frequentemente resultaram no desenvolvimento de ramos laterais, que se tornaram o crescimento principal, levando a uma semente R1 que compreende um transgene.
[00101] Similarmente, os sprays de herbicidas I foram usados para selecionar plantas transgênicas na ausência de um agente de seleção, ou depois de seleção por cultura de tecido ineficiente. Os episódios regenerados de estado transgênico desconhecido depois da inoculação com um plasmídeo que contém um gene de tolerância a herbicida foram borrifados com uma dose otimizada de agente seletivo (por exemplo, 1.000 ppm de glufosinato, para obter o fenótipo de resistência.
F. Seleção e Identificação de Episódios Transgênicos pelo Uso de um
Ensaio Analítico.
[00102] As plantas transformadas com um plasmídeo que continham um gene marcador visual tal como uidA podem ser identificadas por ensaios histoquímicos de folhas, pólen, ou outros tecidos, como descrito no documento WO n° 9215675; Patente US n° 5.164.310; McCabe e Martinell, 1993. PCR em tempo real também pode ser utiliPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 59/90
52/65 zada.
Exemplo 6
Caracterização de Episódios Transgênicos Obtidos a Partir de Explantes de Algodão Excisados Mecanicamente.
[00103] Esta seção descreve a caracterização de episódios transgênicos. O Episódio N2 GH_A24519 é usado como um exemplo. Sementes (de algodão cv. STN474) foram esterilizadas superficialmente, enxaguadas, e embebidas em meio CSM por cerca de 16 horas a 28Ό. As sementes em embebição foram então excisadas com máquina, usando roletes de aço, ajustados em um espaçamento de afastamento de 2 a 3 mm (medido pelos picos dos roletes opostos, determinado como sendo apropriado para este lote de semente STN474), e peneiradas por um processo de peneiração em duas etapas (peneiração manual com uma peneira n2 10, e em seguida, peneiração automatizada), e preparadas e inoculadas com Agrobacterium contendo pMON96959, como descrito, por exemplo, nos exemplos 1-5. Depois da cocultura, os explantes foram implantados dentro de meio WPM sólido suplementado com 100 mg/L de cefotaxima e 0,3 mg/L de dicamba em 25 embriões por Plantcon®. Os explantes foram deixados desenvolver sobre este meio seletivo por cerca de um mês a 28Ό com um fotoperíodo de 16 horas de luz. Os ensaios com GUS foram realizados um mês depois e várias plantas promissoras que incluem GH_A24159 foram transferidas para CRM para desenvolvimento de raiz. Os ensaios com GUS para testar quanto à transformação foram relizados novamente 3 semanas depois, e todas folhas amostradas apresentaram alto nível de expressão de GUS. Um ensaio histoquímico de GUS na seção transversal apresentou expressão de GUS em tecidos vasculares de pecíolo. A primeira flor da planta Ro também apresentou expressão de GUS no pólen, pétala, sépala, e anteras. [00104] Análises moleculares também foram realizadas para conPetição 870170048956, de 13/07/2017, pág. 60/90
53/65 firmar a transformação. Os resultados da PCR de amostras de folhas indicou a presença de sequência de DMO. A análise de hibridização Southern blot da planta Ro confirmou a presença de pelo menos 2 cópias do transgene de DMO em folhas amostradas (por exemplo, fileiras
2-4 da figura 6). A análise Western blot demonstrou adicionalmente a expressão da proteína DMO (figura 7). As mudas da planta Ro demonstraram ser resistentes ao spray de CLARITY a 200 ppm. Para acelerar a análise de R1, embriões imaturos com 16 dias de idade da primeira flor foram excisados e estudados. Oito coloriram quanto à atividade de GUS, sendo que seis demonstraram expressão de GUS em todos os tecidos, sugerindo uma segregação mendeliana 3:1. As flores remanescentes foram deixadas maturar normalmente e recuperar a semente R1. Dentre 15 plantas-mudas R1, 9 eram GUS-positivas. A aplicação de dicamba (CLARITY 200 ppm ou CLARITY 3.000 ppm) confirmou adicionalmente que o fenótipo GUS+ e tolerância a dicamba eram cossegregantes em mudas R1 de GH_A24519.
[00105] A excisão mecanizada do eixo embrionário da semente de algodão com roletes de aço modificados combinada com a recuperação mecanizada de explantes a partir da semente esmagada, e a seleção eficaz de material transformado, incluindo “poda química”, depois da transformação mediada por Agrobacterium em explantes feridos, permitiu assim a produção de plantas de algodão transgênicas dentro de um período de tempo curto, 3 meses, com semente R1 transgênica disponível em 24 semanas depois da transformação. O tempo necessário para obter plantas transgênicas e progênie é significativamente menor do que o tempo necessário para produzir plantas de algodão transgênicas por intermédio de embriogênese, as plantas resultantes são férteis, e as plantas podem ser obtidas em inúmeros germoplasmas-alvo de algodão de interesse, mesmo em linhagens com potencial embriogênico deficiente. Estes métodos proporcionam a vantagem de
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54/65 aumentar a eficiência e a robustez do processo, e ao mesmo tempo, reduzindo custos e carga ergonômica.
Exemplo 7
Eficiência da Excisão Manual versus Mecanizada.
[00106] O processo manual de excisão do eixo embrionário da semente é lento, intensivo em mão-de-obra e carrega carga ergonômica significativa. O uso de excisão com máquina em combinação com peneiração mecanizada não apenas supera o problema supramencionado, mas também é passível de aumento de escala para aumentar o volume de produção. A tabela 13 e tabela 14 apresentam comparações de métodos manuais versus progressivamente aperfeiçoados de excisão/peneiração mecanizada no volume de produção e produtividade da excisão. A produtividade para excisão manual baseia-se na suposição de 7 horas/dia, 4 dias/semana de excisão ininterrupta, enquanto que a produtividade para excisão com máquina baseia-se na suposição de 1 corrida (45-75 minutos)/dia, 4 dias/semana. A tabela 15 indica que a excisão/peneiração mecanizada pode produzir 4.0005.000 explantes de qualidade, isto é, explantes com meristema visível, por hora, uma melhora de cerca de 20 vezes sobre a excisão manual e proporciona a vantagem de volume de produção mais alto e menor carga ergonômica.
Tabela 13. Comparação de volume de produção da excisão.
Método de Excisão N2 de Explantes produzidos/homem-hora
Excisão manual 250
Roletes de elastômero e peneiração manual 1.400
Roletes de aço e peneiração manual 4.200
Roletes de aço e peneiração mecanizada 4.00
Tabela 14. Comparação de homem-hora necessários para 10.000 explantes/ semana produzidos.
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55/Q5
Método de Excisão Homem-hora/semana
Excisão manual 40
Roletes de elastômero e peneiração manual 7
Roletes de aço e peneiração manual 2,4
Roletes de aço e peneiração mecanizada 2,4
Tabela 15. Comparação de produtividade
Roletes de aço e peneiração mecanizada Roletes de aço e peneiração mecanizada Roletes de aço e peneiração mecanizada
g de semente necessários para produzir 1.000 explantes de qualidade 300 333
% de recuperação de explantes de qualidade 32 30
Tempo necessário para produzir 1.000 explantes de qualidade 4 horas 14 min
Produtividade: explantes de qualidade/hora 250 4.200
Exemplo 8
Efeito da Estocagem de Explantes sobre a Transformação [00107] A estocagem de explantes de algodão excisados com máquina também foi explorada. A capacidade de estocar explantes prontos para transformação permitiria mais flexibilidade para programar e conduzir experimentos de transformação. Depois da excisão, os explantes de algodão podem ser estocados antes de continuar, por exemplo, com o processo de transformação. Em um experimento, os explantes foram estocados durante a noite inteira a 4Ό depois da excisão, antes da inoculação com Agrobacterium. Os explantes demonstraram permanecer competentes para transformação depois deste esquema de estocagem. A tabela 16 resume os resultados de outro experimento. Depois que os explantes foram recuperados, como descrito, por exemplo, nos exemplos 1 e 2 acima, eles foram colocados em um Plantcon® estéril (por exemplo, ICN Biomedical N2 do Catálogo 26-720-02) ou sobre papel de filtro umedecido meio INO e colocados em uma placa de Petri de 150 mm estéril em um refrigerador a 4Ό no
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56/65 escuro pelo tempo de estocagem designado de 0 versus 7 dias. Os explantes foram levados até a temperatura ambiente antes da inoculação. A % de Regeneráveis representa a porcentagem do número total de explantes que foram capazes de se desenvolver em uma plantinha. A % de Regeneráveis com GUS-positivo refere-se ao número de explantes GUS-positivo dividido pelo número total de explantes regeneráveis x 100. A % de acertos Regeneráveis com forte expressão de GUS quase periclinal é o número de explantes com forte expressão de GUS quase periclinal dividido pelo número total de explantes regeneráveis x 100.
[00108] Na totalidade, os resultados (tabela 16) indicam que a estocagem de explantes a 4Ό por 3 dias antes da inocul ação melhorou a recuperação percentual de explantes regeneráveis, e portanto, é um método simples e eficaz para controlar fluxo de trabalho da transformação. Muito embora a estocagem no frio parecesse reduzir a porcentagem de plântulas que expressavam GUS em relação ao número de explantes regeneráveis, aqueles que permaneceram crescendo mais possivelmente tinham expressão estável de GUS. Consequentemente, a mão-de-obra envolvida em produzir episódios de transformação também foi reduzida.
Tabela 16. Efeito da estocagem de explantes sobre a transformação.
Parâmetros Dias em estocagem a 4Ό
0 7
% de Explantes Regeneráveis 40,07 32,45
% de Regeneráveis com GUS-positivo 6,95 9,09
% de Regeneráveis com forte expressão de GUS quase periclinal 2,67 2,27
Exemplo 9
Efeito de Manipular Outros Parâmetros Durante a Inibição, Cocultura,
Seleção e Etapas de Crescimento.
[00109] Manipulando um ou mais parâmetros entre parâmetros tais
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57/65 como reduzir a temperatura de embebição de 28Ό para 24Ό ou 15Ό, a seleção inicial de explantes a 35Ό por 3 d ias depois da cocultura, cocultura sob condições de iluminação que permitem o desenvolvimento normal de plastídios (por exemplo, uma intensidade > 5 μΕ, por exemplo, cerca de 5 μΕ até cerca de 130-200 μΕ, sob um fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de escuridão), uso de concentração mais alta de espectinomicina durante a inoculação/cocultura ou seleção, uso de espectinomicina no meio de cocultura, e selecionar plantas borrifando posteriormente (por exemplo, “poda química” durante o enraizamento ou crescimento posterior), foi possível aumentar a % de episódios de positivos de linhagem germinal por explante em 2 a 10 vezes. O uso de espectinomicina no meio de pré-cultura também pode se comprovar benéfico para elevar TF (%) ou para melhorar a qualidade dos episódios.
[00110] Em estudos adicionais, a embebição de sementes, e a excisão de explantes foram realizadas como assinalado acima (por exemplo, exemplo 5) ou como na Publicação de Patente US n° 2005/0005321. Para inoculação e cocultura, uma cepa de Agrobacterium ABI (derivado C58) portadora de um vetor binário que carrega 1 ou 2 T-DNAs e compreendendo um gene marcador selecionável aadA e um marcador capaz de ser triado uidA, foi usada. Os explantes foram passados em ultrassom a granel, ou ultrassom em recipientes PLANTCON individuais. A indução e seleção de brotos foi realizada plaqueando superficialmente os explantes sobre meio de seleção sólido (tabela 9) por cerca de 4 semanas. Uma indução adicional de brotos e enraizamento foi realizada desenvolvendo os explantes com brotos verdes em tampões Oásis® (Smithers-Oasis USA; Kent, OH) para alongamento de brotos e indução de enraizamento a partir de radicais originais em meio líquido simples, sem seleção, contendo 0,5 g/L de sais WPM com vitaminas ((Phytotech L449) e 0,25 mg/L de IBA por
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58/65 cerca de 2-3 semanas em estufa. Os resultados estão indicados na tabela 17. Uma temperatura inicial da cultura de 35Ό demonstrou ser benéfica para a produção de brotos de algodão GUS-positivos.
Tabela 17. Resultados de experimentos que comparam dois métodos de inoculação/cocultura, e dois esquemas de cultura diferentes.
Exp-T rt Método de Inoc/ co-cult.1 Temperatura de cultura N2 de explantes com me- ristema N2 de brotos GUS+ (n2 total de brotos testados) % de explantes produtores de brotos GUS+s
1021-1 A 35G, 3d até 28G 127 6(7) 4,7
1021-2 B 28C 183 0(2) 0
1021-3 B 35G, 3d até 28G 141 0(2) 0
1021-4 A 28C 324 2(2) 0,6
1021-5 A 35G, 3d até 28G 225 7(9) 3,1
1023-1 A 35G, 3d até 28G 81 5(7) 6,2
1023-2 B 28C 95 0(0) 0
1023-3 B 35G, 3d até 28G 81 11 (13) 13,6
1023-4 A 28C 101 0(0) 0
1023-5 A 35G, 3d até 28G 88 1 (3) 1,1
[00111] 1 Método A: Todos explantes em cada tratamento foram colocados em um PLANTCON e o inóculo de Agrobacterium foi adicionado pra cobrir os explantes. Os explantes no inóculo passaram por ultrassom (ultrassom a granel) por 2 min e em seguida 10 min em vascolejador (80rpm). Depois, o inóculo foi removido e os explantes foram distribuídos para PLANTCON, cada um contendo um pedaço de pepel de filtro e 5 mL de meio de inoculação.
[00112] Método B: Os explantes foram distribuídos para a parte da tampa de cada PLANTCON (aproximadamente 100 explantes por
PLANTCON). Cinco mililitros de inóculo de Agrobacterium foram adicionados. Os explantes então passaram por ultrassom por 20 s, e foram
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59/65 imediatamente transferidos junto com o inóculo para a parte do fundo do PLANTCON, que mantém um pedaço de papel de filtro.
Exemplo 10
Transformação Repetida de Germoplasma de Algodão com Round-up
Ready®.
[00113] Utilizando os métodos descritos nesta Patente, germoplasma transgênico superior com Round-Up Ready® pode ser transformado adicionalmente utilizando um vetor de 2 T-DNA's (ou alternativamente dois vetores com 1 T-DNA) que codifica o gene aadA para seleção com espectinomicina e empregando um novo gene (frequentemente referido como “o gene de interesse”; “GOI”) no segundo T-DNA para permitir a segregação longe do aadA como descrito acima. O método com algodão que se segue e o banco de dados (dataset) são úteis para descrever esta “transformação repetida”.
[00114] A variedade de semente de algodão RRFlex® (07W610F) e a variedade não-transgênica de controle de germoplasma (00S04) foram comparadas. A semente foi embebida por ~18 h a 24Ό, excisada com máquina e peneirada com máquina (em duas etapas), em seguida, enriquecimento por flutuação de explantes. Os explantes foram inoculados com suspensão de Agrobacterium em INO a uma DO 0,3, ultrassom por 2 min, e incubados por 10 min. A suspensão de Agrobacterium foi então removida e os explantes foram distribuídos dentro de recipientes de cocultura a aproximadamente 2 g por recipiente. Os explantes foram assentados sobre papéis de filtro umedecidos com 5 mL de meio de cocultura (INO com adições de 50 ppm de nistatina, 10 ppm de TBZ (tiabendazol), e 100 ppm de espectinomicina) e cocultivados em uma incubadora Percival iluminada a aproximadamente 23 a 25Ό (16 h de luz/8 h de escuridão, intensidade da luz > 5 μΕ, tal como 5 μΕ a 200 μΕ) por 3 dias. Os explantes foram então transferidos para cima de meio de seleção (tabela 9), incubados por 3
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60/65 dias a 35Ό em uma sala iluminada (16 h de luz/8 h de escuridão), e depois levados para uma sala iluminada a 28Ό (16 h de luz/8 h de escuridão). As plântulas verdes fenótipo-positivas foram colhidas 6 semanas depois da inoculação, colocadas em tampões OÁSIS umedecidos com 0,5 g/L de sais WPM e levadas para condições de estufa. Depois que as plantas se aclimataram e começaram a crescer, elas foram testadas quanto a CP4, GUS, expressão vascular de GUS (um preditor de transformação da linhagem germinal). As plantas transgênicas transformadas repetidamente eram esperadas para serem CP4+ GUS+, enquanto que as plantas de controle transformadas eram esperadas para serem CP4- GUS+. Uma análise do rendimento de plantas transformadas está listada na tabela 18 abaixo. O procedimento descrito pode ser, assim, usado para transformação repetida de plantas de algodão transgênicas com uma eficiência similar à transformação de uma variedade de algodão não-transgênica convencional.
Tabela 18. Frequência de Transformação Observada a Partir de Transformação Repetida de Germoplasma de Algodão Transgênico.
Germoplasma de Algodão Testado Explantes de Qualidade Inoculados Plântulas (Verdes) Fenótipo de Espectinomicina positivas % de Plântulas Verdes Número de plantas amostradas quanto a GUS Plantas que expressam GUS em todas folhas (linha- gem germinal) % de TF, linhagem germinal que expressa GUS
00S04 928 18 1,90% 11 2 0,22%
07W610F 3.665 87 2,40% 64 9 0,25%
00115] Todas as composições e métodos aqui descritos e reivindicados podem ser feitos e executados sem experimentação excessiva à luz do presente relatório descritivo. Embora as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos das modalidades ilustrativas precedentes, deve ficar evidente para os versados nessas técnicas que variações, mudanças, modificações e alterações podem ser aplicadas à composição, métodos, e nas etapas ou na sequência
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61/65 de etapas dos métodos aqui descritos, sem fugir do verdadeiro conceito, espírito e âmbito da invenção. Mais especificamente, deve ficar evidente que certos agentes que estão quimicamente e também fisiologicamente relacionados podem substituir os agentes aqui descritos, e ao mesmo tempo, resultados iguais ou similares poderíam ser atingidos. Todos esses substitutos e modificações evidentes para os versados nessas técnicas são julgados como estando dentro do espírito, âmbito e conceito da invenção como definida pelas reivindicações apensadas. Referências [00116] As referências que se seguem, até o grau em que elas fornecem detalhes de procedimentos ou outros detalhes suplementares àqueles aqui enunciados, são aqui especificamente incorporadas como referência.
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US n° 5,869,720;Patente US n° 5,914,451; Patente US n° 5,958,745; Patente US n° 5,981,834;Patente US n° 5,981,840; Patente US n° 5,985,605; Patente US n° 5,998,700; Patente US n° 6,011,199; Patente US n° 6,040,497; Patente US n° 6,051,753; Patente US n° 6,072,103; Patente US n° 6,080,560; Patente US n° 6,140,075; Patente US n° 6,140,078; Patente US n° 6,166,292; Patente US n° 6,171,640; Patente US n° 6,175,060; Patente US n° 6,177,611; Patente US n° 6,225,105; Patente US n° 6,228,623; Patente US n° 6,232,526; Patente US n° 6,252,138; Patente US n° 6,265,638; Patente US n° 6,271,443; Patente US n° 6,294,714; Patente US n° 6,380,462; Patente US n° 6,380,466; Patente US n° 6,384,301 patente US n° 6,414,222; Patente US n° 6,426,446; Patente US n° 6,426,447; Patente US n° 6,429,357; Patente US n° 6,429,362; Patente US n° 6,433,252; Patente US n° 6,437,217; Patente US n° 6,444,876; Patente US n° 6,459,018; Patente US n° 6,476,295; Patente US n° 6,483,008; Patente US n° 6,489,461; Patente US n° 6,495,739; Patente US n° 6,531,648; Patente US n° 6,537,750; Patente US n° 6,538,178; Patente US n° 6,538,179; Patente US n° 6,538,181; Patente US n° 6,541,259; Patente US n° 6,576,818; Patente US n° 6,589,767; Patente US n° 6,596,538; Patente US n° 6,613,963; Patente US n° 6,635,806; Patente US n° 6,653,530; Patente US n° 6,660,849; Patente US n° 6,706,950; Patente US n° 6,723,837; Patente US n° 6,770,465; Patente US n° 6,774,283; Patente US n° 6,812,379; Patente US n° 6,822,141; Patente US n° 6,828,475; Patente US n° 7,002,058; Patente US n° 7,022,896
Patente US n° RE37,543
Publicação de Pedido de Patente US n° 20050005321; Publicação de Pedido de Patente US n° 20060059589; Publicação de Pedido de Patente US n° 20030028917; Publicação de Pedido de Patente US n° 20030083480; Publicação de Pedido de Patente US n°
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20030083480; Publicação de Pedido de Patente US n° 20030115626; Publicação de Pedido de Patente US n° 20030135879; Publicação de Pedido de Patente US n° 2003110532; Publicação de Pedido de Patente US n° 20040177399; Publicação de Pedido de Patente US n° 2005/0005321; Publicação de Pedido de Patente US n° 2005/0183170; Publicação de Pedido de Patente US n° 20050022261; Publicação de Pedido de Patente US n° 2006/0200878; Publicação de Pedido de Patente US n° 2007/0271627;
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1/1

Claims (4)

REIVINDICAÇÕES
1/8
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1. Aparelho para geração em alto volume de produção de tecido vegetal transformável, caracterizado pelo fato de que compreende roletes espaçados entre si que compreendem sulcos secundários para aplicar uma força às sementes que passam através dos roletes.
2/8
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2. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os roletes são espaçados entre si de 2,2 mm a 3,5 mm, medido pelo afastamento dos picos de roletes opostos.
3/8 ω
co ώ
<
co
Ο
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3. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os roletes são feitos de aço inoxidável.
4. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um separador para separar explantes meristemáticos de algodão do revestimento de sementes ou tecido de cotilédone.
5. Aparelho, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o separador compreende um recipiente de líquido para determinar a flutuação do tecido vegetal transformável.
6. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma bandeja de contenção de água e sementes.
7. Aparelho, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um mecanismo automatizado para limpar o aparelho, que controla uma ou mais das seguintes etapas de limpeza: (a) aplicar uma solução de sanitização; (b) remoção da solução de sanitização; e (c) estocar o aparelho sob condições estéreis.
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4/8
Sistema de contenção de água e semente
Cortador (excisionator)
Saco de polinização descartável Bandeja de contenção Alavanca para capturar material de semente de água e semente de ajuste
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