ES2637862T3

ES2637862T3 - Elementos reguladores de plantas y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2637862T3
Application number: ES14154965.9T
Authority: ES
Inventors: Stanislaw Flasinski
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2011-03-25
Filing date: 2012-03-21
Publication date: 2017-10-17
Anticipated expiration: 2032-03-21
Also published as: US10731170B2; UY39165A; MX2013010973A; WO2012134921A3; ZA201306899B; EP2733152A1; PH12017500577A1; JP2018138024A; US20150232866A1; AU2017204438B2; UY39167A; UY33974A; RU2017145549A; JP6316331B2; JP6689904B2; EP2688906B1; KR20140020968A; UY39164A; US20230145023A1; AU2017235954B2

Abstract

Una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN seleccionada de: (a) una secuencia con al menos el 95 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de cualquiera de SEQ ID NO: 27-28, en la que la secuencia tiene actividad de promotor; (b) una secuencia que comprende cualquiera de SEQ ID NO: 27-28; y (c) un fragmento que comprende al menos 500 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 27, en la que el fragmento tiene la actividad de promotor de SEQ ID NO: 27; en la que dicha secuencia está unida operativamente a una molécula de polinucleótido heteróloga que se puede transcribir.

Description

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DESCRIPCIÓN

Elementos reguladores de plantas y usos de los mismos

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la biología molecular vegetal y a la modificación por ingeniería genética vegetal, 5 y a moléculas de ADN útiles para modular la expresión genética en plantas.

Antecedentes

Los elementos reguladores son elementos genéticos que regulan la actividad genética mediante la modulación de la transcripción de una molécula de polinucleótido unida operativamente que se puede transcribir. Dichos elementos incluyen promotores, líderes, intrones y regiones no traducidas 3’, y son útiles en el campo de la biología molecular

10 vegetal y la modificación por ingeniería genética vegetal.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona nuevos elementos reguladores para su uso en plantas. La presente invención también proporciona construcciones de ADN que comprenden los elementos reguladores. La presente invención también proporciona células vegetales, plantas, y semillas transgénicas que comprenden los elementos reguladores. 15 Las secuencias se pueden proporcionar unidas operativamente a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir. En una realización, la molécula de polinucleótido que se puede transcribir puede ser heteróloga con respecto a una secuencia reguladora que se proporciona en el presente documento. Una secuencia de elemento regulador proporcionada por la invención puede, por tanto, en realizaciones particulares, definirse como unida operativamente a una molécula de polinucleótido heteróloga que se puede transcribir. La presente invención también

20 proporciona procedimientos de producción y de uso de los elementos reguladores, las construcciones de ADN que comprenden los elementos reguladores, y las células vegetales, plantas y semillas transgénicas que comprenden los elementos reguladores unidos operativamente a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir.

Así pues, en un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia con al menos el 95 por ciento de identidad de 25 secuencia con SEQ ID NO: 27-28; b) una secuencia que comprende cualquiera de SEQ ID NO: 27-28; y c) un fragmento que comprende al menos 500 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 27; en la que el fragmento tiene la actividad de promotor de SEQ ID NO: 27, en la que la secuencia está unida operativamente a una molécula de polinucleótido heteróloga que se puede transcribir. En realizaciones específicas, la molécula de ADN comprende al menos el 98 por ciento o al menos el 99 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de ADN de

30 cualquiera de SEQ ID NO: 27-28. En ciertas realizaciones de la molécula de ADN, la secuencia de ADN comprende un elemento regulador. En algunas realizaciones, el elemento regulador comprende un promotor. En realizaciones particulares, la molécula de polinucleótido heteróloga que se puede transcribir comprende un gen de interés agronómico, tal como un gen capaz de proporcionar resistencia a herbicidas a la planta, o un gen capaz de proporcionar resistencia a plagas a la planta.

35 La invención también proporciona una célula de planta transgénica que comprende una construcción de ADN heteróloga proporcionada por la invención, que incluye una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 27-28, o un fragmento o una variante de las mismas como se ha descrito anteriormente, en la que dicha secuencia está unida operativamente a una molécula de polinucleótido heteróloga que se puede transcribir. En ciertas realizaciones, la célula de planta transgénica es una célula de planta monocotiledónea. En otras realizaciones, la célula de planta

40 transgénica es una célula de planta dicotiledónea.

Además, la invención proporciona una planta transgénica, o parte de la misma, que comprende una molécula de ADN como la proporcionada en el presente documento, que incluye una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia con al menos el 95 por ciento de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 27-28; b) una secuencia que comprende cualquiera de SEQ ID NO: 27-28; y c) un fragmento que comprende al menos 500 45 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 27, en la que el fragmento tiene la actividad de promotor; en la que la secuencia está unida operativamente a una molécula de polinucleótido heteróloga que se puede transcribir. En realizaciones específicas, la planta transgénica puede ser una planta descendiente de cualquier generación que comprenda la molécula de ADN, con relación a una planta transgénica de partida que comprenda la molécula de ADN. También se proporciona una semilla transgénica que comprende una molécula de ADN de acuerdo con la

50 invención.

En otro aspecto más, la invención proporciona un procedimiento de expresión de una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que comprende la obtención de una planta transgénica de acuerdo con la invención, tal como una planta que comprenda una molécula de ADN como la descrita en el presente documento, y una planta de cultivo, en la que se exprese un polinucleótido que se puede transcribir en la molécula de ADN.

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Breve descripción de las figuras

Las FIG. 1a-1h representan el alineamiento de las variantes con tamaño de promotor correspondientes a los elementos promotores aislados de la especie herbácea Andropogon gerardii. En particular, las Fig. 1a-1h muestran el alineamiento de la secuencia promotora de 2.603 pb P-ANDge.Ubq1-1:1:11 (SEQ ID NO: 2), que se 5 encuentra en el grupo de elementos de expresión reguladores a nivel transcripcional EXP-AND-ge.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 1), con las secuencias promotoras derivadas por medio del análisis de eliminación de PANDge.Ubq1-1:1:11. La eliminación, por ejemplo, del extremo 5’ de P-ANDge.Ubq1-1:1:11 produjo el promotor P-ANDge.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 6), una secuencia de 2.114 pb que se encuentra en EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5). Otras secuencias promotoras de la Fig. 1 incluyen P-ANDge.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 9), una 10 secuencia de 1.644 pb comprendida en EXPANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8); P-ANDge.Ubq1-1:1:12 (SEQ ID NO: 11), una secuencia de 1.472 pb comprendida en EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10); P-ANDge.Ubq1

1:1:8 (SEQ ID NO: 13), una secuencia de 1.114 pb comprendida en EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12); PANDge.Ubq1-1:1:13 (SEQ ID NO: 15), una secuencia de 771 pb comprendida en EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14); y P-ANDge.Ubq1-1:1:14 (SEQ ID NO: 17), una secuencia de 482 pb comprendida en EXP

15 ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16). Las FIG. 2a-2g representan el alineamiento de las variantes de promotor aisladas de la herbácea Saccharum ravennae (Erianthus ravennae). En particular, las FIG. 2a-2g muestran un alineamiento de la secuencia promotora de 2.536 pb P-ERIra.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 19) (que se encuentra, por ejemplo, en el grupo de elementos de expresión reguladores a nivel transcripcional EXP-ERIra.Ubq1 (SEQ ID NO: 18)) con secuencias

20 promotoras derivadas del análisis de eliminación de P-ERIra.Ubq1-1:1:10: una secuencia promotora de 2.014 pb P-ERIra.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 23); una secuencia promotora de 1.525 pb P-ERIra.Ubq1-1:1:11 (SEQ ID NO: 26); una secuencia promotora de 1.044 pb P-ERIra.Ubq1-1:1:8 (SEQ ID NO: 28); una secuencia de 796 pb PERIra.Ubq1-1:1:12 (SEQ ID NO: 30); y una secuencia de 511 pb P-ERIra.Ubq1-1:1:13 (SEQ ID NO: 32). Las FIG. 3a-3c representan el alineamiento de variantes en tamaño del promotor correspondientes a elementos

25 promotores aislados de la especie herbácea Setaria viridis. En particular, las FIG. 3a-3c muestran un alineamiento de una secuencia promotora de 1.493 pb P-Sv.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 34) con los promotores derivados del análisis de eliminación del extremo 5’ de P-Sv.Ubq1-1:1:1: un promotor con un tamaño de 1.035 pb P-Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 38); y una secuencia promotora de 681 pb P-Sv.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 40). Las FIG. 4a-4e representan el alineamiento de las variantes del grupo de elementos de expresión reguladores a

30 nivel transcripcional de la herbácea Zea mays subesp. mexicana. En particular, las FIG. 4a-4e comparan un grupo de elementos de expresión reguladores a nivel transcripcional de 2.005 pb denominado EXPZm.UbqM1:1:2 (SEQ ID NO: 49) con la variante alélica EXP-Zm.UbqM1:1:5 (SEQ ID NO: 53), así como con variantes de tamaño EXP-Zm.UbqM1:1:1 (SEQ ID NO: 41), que tiene 1.922 pb de longitud, y EXP-Zm.UbqM1:1:4 (SEQ ID NO: 45), que tiene 1.971 pb de longitud.

35 Las FIG. 5a-5b representan el alineamiento de variantes en tamaño del promotor aisladas de la herbácea Sorghum bicolor. En particular, las FIG. 5a-5b muestran el alineamiento del elemento promotor de 791 pb, PSb.Ubq6-1:1:2 (SEQ ID NO: 60) comprendido en el grupo de elementos de expresión reguladores a nivel transcripcional EXP-Sb.Ubq6 (SEQ ID NO: 59), con el elemento promotor de 855 pb P-Sb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 64) comprendido en EXP-Sb.Ubq6:1:1 (SEQ ID NO: 63).

40 Las FIG. 6a-6c representan el alineamiento de variantes en tamaño del promotor correspondientes a los elementos promotores aislados de la herbácea Setaria italica. En particular, las FIG. 6a-6c muestran un alineamiento de la variante de promotor de 1.492 pb P-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 70) con la variante del promotor de 1.492 pb P-SETit.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 74), el elemento promotor de 1.034 pb P-SETit.Ubq1

1:1:2 (SEQ ID NO: 76) y el elemento promotor de 680 pb P-SETit.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 78).

45 Las FIG. 7a-7b representan el alineamiento de las variantes en tamaño del promotor y un elemento potenciador correspondiente a los elementos promotores aislados de la especie herbácea Coix lachryma-jobi. En particular, las FIG. 7a-7b muestran un alineamiento de la variante del promotor de 837 pb, P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80) que se encuentra en el grupo de elementos de expresión reguladores a nivel transcripcional EXP-Cl.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 79), con un fragmento potenciador derivado de P-Cl.Ubq1-1:1:1, denominado E-Cl.Ubq1:1:1 (SEQ

50 ID NO: 89), que tiene 798 pb de longitud, así como con tres variantes de eliminación del extremo 5’ de PCl.Ubq1-1:1:1: un elemento de 742 pb P-Cl.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 84); un elemento de 401 pb P-Cl.Ubq1

1:1:3 (SEQ ID NO: 86); y un elemento promotor mínimo de 54 pb P-Cl.Ubq1-1:1:5 (SEQ ID NO: 88). La FIG. 8 representa configuraciones de casetes transgénicos de la presente invención.

Breve descripción de las secuencias

55 SEQ ID NO: 1, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 22, 25, 27, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 45, 49, 53, 55, 59, 63, 65, 69, 73, 75, 77, 79, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 128, 130, 132, 133, 134, 136, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 180, 181 y 183 son secuencias de grupos de elementos de expresión reguladores a nivel transcripcional o secuencias EXP que comprenden una secuencia promotora unida operativamente en 5’ a una secuencia líder que está unida

60 operativamente en 5’ a una secuencia de intrón. SEQ ID NO: 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 y 135 son secuencias promotoras. SEQ ID NO: 3, 20, 35, 43, 47, 51, 57, 61, 67, 71 and 81 son secuencias líderes.

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SEQ ID NO: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 y 182 son secuencias de intrón. SEQ ID NO: 89 es la secuencia de un potenciador.

Descripción detallada de la invención

5 La invención desvelada en el presente documento proporciona moléculas de polinucleótido que tienen una actividad reguladora genética beneficiosa de especies vegetales. La invención proporciona el diseño, la construcción y el uso de estas moléculas de polinucleótido. Las secuencias de nucleótido de estas moléculas de polinucleótido se proporcionan entre las SEQ ID NO: 27 y 28. Estas moléculas de polinucleótido son, por ejemplo, capaces de afectar a la expresión de una molécula de polinucleótido que se puede transcribir unida operativamente en tejidos vegetales

10 y, por lo tanto, regular selectivamente la expresión genética, o la actividad de un producto genético codificado, en plantas transgénicas. La presente invención también proporciona procedimientos de modificación, producción y uso de las mismas. La invención también proporciona composiciones, células huésped transformadas, plantas transgénicas y semillas que contienen los promotores y/u otras secuencias de nucleótidos desveladas, y procedimientos de preparación y uso de las mismas.

15 Las siguientes definiciones y procedimientos se proporcionan para definir mejor la presente invención y para guiar a los expertos en la materia en la práctica de la presente invención. A menos de que se indique lo contrario, los términos se han de entender de acuerdo con su uso convencional por los expertos habituales en la materia pertinente.

Moléculas de ADN

20 Como se usa en el presente documento, el término “ADN” o la expresión “molécula de ADN” se refieren a una molécula de ADN bicatenaria de origen genómico o sintético, es decir, un polímero de bases de desoxirribonucleótido o una molécula de polinucleótido, leída desde el extremo 5’ (cadena arriba) hasta el extremo 3’ (cadena abajo). Como se usa en el presente documento, la expresión “secuencia de ADN” se refiere a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN. La nomenclatura usada en el presente documento se corresponde con la

25 del Título 37 del Código de Regulaciones Federales de Estados Unidos § 1.822, y expuesta en las tablas de la norma WIPO ST.25 (1998), Apéndice 2, Tablas 1 y 3.

Como se usa en el presente documento, la expresión “molécula de ADN aislada” se refiere a una molécula de ADN separada al menos parcialmente de otras moléculas que se asocian con ella normalmente en su estado nativo o natural. En una realización, el término “aislado” se refiere a una molécula de ADN que está separada al menos 30 parcialmente de algunos de los ácidos nucleicos que flanquean normalmente la molécula de ADN en su estado nativo o natural. Por lo tanto, las moléculas de ADN fusionadas a las secuencias reguladoras o codificantes con las que no se asocian normalmente, por ejemplo, como resultado de técnicas recombinantes, se consideran aisladas en el presente documento. Dichas moléculas se consideran aisladas cuando están integradas en el cromosoma de una célula huésped o están presentes en una solución de ácido nucleico con otras moléculas de ADN, en la que no

35 están en su estado nativo

Se puede usar cualquier número de procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia para aislar y modificar una molécula de ADN, o un fragmento de la misma, desvelados en la presente invención. Por ejemplo, se puede usar la tecnología PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para amplificar una determinada molécula de ADN de partida y/o producir variantes de la molécula original. Las moléculas de ADN, o los fragmentos de las

40 mismas, también se pueden obtener mediante otras técnicas tales como sintetizando directamente el fragmento por medios químicos como se realiza comúnmente usando un sintetizador de oligonucleótidos automático.

Como se usa en el presente documento, la expresión “identidad de secuencia” se refiere a la extensión hasta la que dos secuencias de polinucleótido alineados óptimamente o dos secuencias de polipéptido alineadas óptimamente son idénticas. Un alineamiento de secuencias óptimo se crea alineando manualmente dos secuencias, por ejemplo,

45 una secuencia de referencia y otra secuencia, para maximizar el número de apareamientos de nucleótidos en el alineamiento de secuencias con las inserciones, eliminaciones o huecos de nucleótidos internos apropiados. Como se usa en el presente documento, la expresión “secuencia de referencia” se refiere a una secuencia proporcionada como las secuencias de SEQ ID NO: 27 y 28.

Como se usa en el presente documento, la expresión “porcentaje de identidad de secuencia “o “porcentaje de

50 identidad” o “% de identidad” es 100 veces la fracción de identidad. La “fracción de identidad” para una secuencia alineada óptimamente con una secuencia de referencia es el número de apareamientos de nucleótidos en el alineamiento óptimo, dividido entre el número total de nucleótidos en la secuencia de referencia, por ejemplo, el número total de nucleótidos en la longitud total de la secuencia de referencia completa. Por lo tanto, una realización de la invención es una molécula de ADN que comprende una secuencia que, cuando se alinea óptimamente con una

55 secuencia de referencia que se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 27 y 28., tiene al menos el 95 por ciento de identidad, al menos el 96 por ciento de identidad, al menos el 97 por ciento de identidad, al menos el 98 por ciento de identidad o al menos el 99 por ciento de identidad con respecto a la secuencia de referencia. En realizaciones particulares, dichas secuencias se pueden definir por tener una actividad reguladora de genes.

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Elementos reguladores

Un elemento regulador es una molécula de ADN que tiene actividad reguladora de genes, es decir, aquel que tiene la capacidad de afectar a la transcripción y/o a la traducción de una molécula de polinucleótido que se puede transcribir unida operativamente. La expresión “actividad reguladora de genes”, por tanto, se refiere a la capacidad 5 de afectar al patrón de expresión de una molécula de polinucleótido que se puede transcribir unida operativamente afectando a la transcripción y/o a la traducción de la molécula de polinucleótido que se puede transcribir unida operativamente. Como se usa en el presente documento, un grupo de elementos de expresión reguladores a nivel transcripcional o secuencia “EXP” puede estar compuesto de elementos de expresión tales como potenciadores, promotores, líderes o intrones, unidos operativamente. Por lo tanto, un grupo de elementos de expresión 10 reguladores a nivel transcripcional puede estar compuesto, por ejemplo, de un promotor unido operativamente en 5’ a una secuencia líder, que, a su vez, está unida operativamente en 5’ a una secuencia de intrón. La secuencia de intrón puede estar compuesta de una secuencia que comienza en el punto de la primera unión de corte y empalme de intrón/exón de la secuencia nativa y además puede estar compuesta de un pequeño fragmento líder que comprenda la segunda unión del corte y empalme de intrón/exón para proporcionar un procesamiento de intrón/exón 15 apropiado para facilitar la transcripción y el procesamiento apropiado de la transcripción resultante. Los líderes e intrones pueden afectar positivamente a la transcripción de una molécula de polinucleótido que se puede transcribir unida operativamente, así como a la traducción del ARN transcrito resultante. La molécula de ARN previamente procesada comprende líderes e intrones, que pueden afectar el procesamiento posterior a la transcripción del ARN transcrito y/o la exportación de la molécula de ARN transcrita, del núcleo celular al citoplasma. Tras el

20 procesamiento posterior a la transcripción de la molécula de ARN transcrita, la secuencia líder puede retenerse como parte del ARN mensajero final y puede afectar positivamente a la traducción de la molécula de ARN mensajero.

Los elementos reguladores tales como promotores, líderes, intrones y regiones de terminación de la transcripción (o UTR de 3’) son moléculas de ADN que tienen actividad reguladora y forman una parte integral de la expresión total

25 de genes en células vivas. La expresión “elemento regulador” se refiere a una molécula de ADN que tiene actividad reguladora de genes, es decir, aquella que tiene la capacidad de afectar a la transcripción y/o la traducción de una molécula de polinucleótido que se puede transcribir unida operativamente. Los elementos reguladores aislados, tales como los promotores y líderes que funcionan en plantas son, por lo tanto, útiles para modificar los fenotipos vegetales a través de los procedimientos de modificación por ingeniería genética.

30 Los elementos reguladores se pueden caracterizar por los efectos de su patrón de expresión (cualitativa y/o cuantitativamente), por ejemplo, los efectos positivos o negativos y/o constitutivos u otros efectos tales como por su patrón de expresión temporal, espacial, de desarrollo, tisular, medioambiental, fisiológico, patológico, de ciclo celular

o sensible químicamente, y cualquier combinación de los mismos, así como por indicaciones cuantitativas y

cualitativas. Un promotor es útil como elemento regulador para modular la expresión de una molécula de 35 polinucleótido que se puede transcribir unida operativamente.

Como se usa en el presente documento, un “patrón de expresión de genes” es cualquier patrón de transcripción de una molécula de ADN unida operativamente en una molécula de ARN transcrita. La molécula de ARN transcrita se puede traducir para producir una molécula proteica o puede proporcionar una molécula de ARN antisentido u otra molécula de ARN reguladora, tal como un ARNbc, un ARNt, un ARNr y un miARN.

40 Como se usa en el presente documento, la expresión “expresión proteica” es cualquier patrón de traducción de una molécula de ARN transcrita en una molécula proteica. La expresión proteica se puede caracterizar por sus cualidades temporales, espaciales, de desarrollo o morfológicas, así como por las indicaciones cuantitativas o cualitativas.

Como se usa en el presente documento, el término “promotor” se refiere, en general, a una molécula de ADN que

45 está implicada en el reconocimiento y en la unión de la ARN polimerasa II y otras proteínas (factores de transcripción que actúan en trans) para iniciar la transcripción. Un promotor puede aislarse inicialmente a partir de la región sin traducir 5’ (UTR de 5’) de una copia genómica de un gen. Como alternativa, los promotores pueden ser moléculas de ADN producidas sintéticamente o modificadas. Los promotores también pueden ser quiméricos, es decir, un promotor que se produce por medio de la fusión de dos o más moléculas de ADN heterólogas. Los promotores útiles

50 en la práctica de la presente invención incluyen SEQ ID NO: 28, o fragmentos o variantes de la misma. En realizaciones específicas de la invención, dichas moléculas y cualquier variante o derivado de las mismas que se describe en el presente documento, se definen además como aquellos que comprenden una actividad de promotor, es decir, que son capaces de actuar como un promotor en una célula huésped, tal como una planta transgénica. En otras realizaciones específicas adicionales, un fragmento se puede definir como aquel que presenta la actividad de

55 promotor poseída por la molécula promotora de partida de la que se deriva, o un fragmento puede comprender un “promotor mínimo” que proporciona un nivel basal de transcripción y está compuesto de una caja TATA o secuencia equivalente de reconocimiento y unión del complejo de ARN polimerasa II para el inicio de la transcripción.

En una realización, se proporcionan fragmentos de una secuencia promotora desvelada en el presente documento. Los fragmentos de promotor pueden comprender actividad de promotor, según lo descrito anteriormente, y pueden 60 ser útiles solos o en combinación con otros promotores o fragmentos de promotores, tales como en la construcción

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de promotores quiméricos. En realizaciones específicas, se proporcionan fragmentos de un promotor que comprenden al menos 500, 750 o al menos 1.000 nucleótidos contiguos, o más, de una molécula de polinucleótido que tiene actividad de promotor desvelada en el presente documento.

Las composiciones derivadas de cualquiera de los promotores presentados como SEQ ID NO: 28, tal como con

5 eliminaciones internas o en 5’, por ejemplo, se pueden producir usando procedimientos que se conocen en la técnica para mejorar o modificar la expresión, que incluyen la eliminación de elementos que tienen efectos bien positivos o negativos sobre la expresión; elementos de duplicación que tienen efectos positivos o negativos sobre la expresión; y/o elementos de duplicación o eliminación que tienen efectos específicos tisulares o celulares sobre la expresión. Se pueden usar composiciones derivadas de cualquiera de los promotores que se presentan como SEQ ID NO: 28

10 compuestos de eliminaciones en 3’ de los que se eliminan el elemento caja TATA o una secuencia equivalente del mismo y la secuencia cadena abajo, por ejemplo, para producir elementos potenciadores. Se pueden realizar eliminaciones adicionales para eliminar cualquier elemento que tenga efectos positivos o negativos; específicos de tejidos, específicos de células; o específicos del tiempo (tales como, pero sin limitación, los ritmos circadianos) sobre la expresión. Se puede usar cualquiera de los promotores presentados como SEQ ID NO: 28 y potenciadores

15 derivados de los mismos para producir composiciones de elementos reguladores a nivel transcripcional quiméricos compuestos de cualquiera de los promotores presentados como SEQ ID NO: 28 y potenciadores derivados de los mismos unidos operativamente a otros potenciadores y promotores. La eficacia de las modificaciones, duplicaciones

o eliminaciones que se describen en el presente documento sobre los aspectos deseados de la expresión de un determinado transgén se pueden ensayar empíricamente en ensayos en plantas estables y transitorios, tal como se

20 describen en los ejemplos de trabajo del presente documento, para validar los resultados, que pueden variar dependiendo de los cambios producidos y del objetivo del cambio en la molécula de partida.

Como se usa en el presente documento, el término “líder” se refiere a una molécula de ADN aislada de la región no traducida 5’ (UTR de 5’) de una copia genómica de un gen y que se define, en general, como un segmento de nucleótidos entre el sitio de inicio de la transcripción (TSS) y el sitio de inicio de la secuencia codificante de proteína. 25 Como alternativa, los líderes pueden ser elementos de ADN producidos sintéticamente o modificados. Un líder se puede usar como un elemento regulador 5’ para modular la expresión de una molécula de polinucleótido que se puede transcribir unida operativamente. Las moléculas líderes se pueden usar con un promotor heterólogo o con su promotor nativo. Las moléculas de promotor de la presente invención pueden estar unidas operativamente a su líder nativo o pueden estar unidas operativamente a un líder heterólogo. Los líderes útiles en la práctica de la presente

30 invención incluyen SEQ ID NO: 20 o sus variantes. En realizaciones específicas, dichas secuencias pueden proporcionarse definidas como aquellas capaces de actuar como un líder en una células huésped que incluyen, por ejemplo, una célula de planta transgénica. En una realización, dichas secuencias se decodifican como aquellas que comprenden actividad líder.

Las secuencias líder (UTR de 5’) que se presentan como SEQ ID NO: 20 pueden estar compuestas de elementos

35 reguladores o pueden adoptar estructuras secundarias que pueden tener un efecto sobre la transcripción o traducción de un transgén. Las secuencias líder que se presentan como SEQ ID NO: 20 se pueden usar de acuerdo con la invención para fabricar elementos reguladores quiméricos que afecten a la transcripción o a la traducción de un transgén. Además, las secuencias líder que se presentan en SEQ ID NO: 20 se pueden usar para fabricar secuencias líder quiméricas que afecten a la transcripción o a la traducción de un transgén.

40 La introducción de un gen foráneo en una nueva planta huésped no siempre da lugar a una alta expresión del gen introducido. Además, si se trata de rasgos complejos, a veces, es necesario modular varios genes con diferentes patrones de expresión espacial o temporal. Los intrones pueden proporcionar principalmente dicha modulación. Sin embargo, el uso múltiple del mismo intrón en una planta ha demostrado que presenta desventajas. En estos casos, es necesario tener una colección de elementos de control básicos para la construcción de los elementos de ADN

45 recombinantes apropiados. Como la colección disponible de intrones que se conoce en la técnica con propiedades potenciadoras de la expresión es limitada, se requieren alternativas.

Las composiciones derivadas de cualquiera de los intrones presentados como SEQ ID NO: 24 pueden estar compuestas de eliminaciones o duplicaciones internas de elementos reguladores cis; y/o se pueden usar alteraciones de las secuencias en 5’ y 3’ que comprenden las uniones de corte y empalme de intrón/exón para 50 mejorar la expresión o especificidad de la expresión cuando se une operativamente a un promotor + líder o promotor quimérico + líder y secuencia codificante. También se pueden realizar modificaciones de las regiones 5’ y 3’ que comprenden la unión de corte y empalme de intrón/exón para reducir el potencial de introducción de falsos codones de inicio y parada que se producen en la transcripción resultante tras el procesamiento y el corte y empalme del ARN mensajero. Los intrones se pueden ensayar empíricamente como se describe en los ejemplos de trabajo para

55 determinar el efecto del intrón sobre la expresión de un transgén.

De acuerdo con la invención, se puede analizar un promotor o fragmento de promotor en cuanto a la presencia de elementos promotores conocidos, es decir, características de las secuencias de ADN, tales como una caja TATA y otros motivos conocidos del sitio de unión a un factor de transcripción. La identificación de dichos elementos promotores conocidos puede ser usada por un experto en la materia para diseñar variantes del promotor que tengan

60 un patrón de expresión similar al promotor original.

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Como se usa en el presente documento, el término “potenciador” o “elemento potenciador” se refiere a un elemento regulador de la transcripción que actúa en cis, también conocido como elemento cis, que confiere un aspecto del patrón de expresión total, pero que es normalmente solo no basta para dirigir la transcripción de una secuencia de polinucleótido unida operativamente. A diferencia de los promotores, los elementos potenciadores normalmente no 5 incluyen un sitio de inicio de la transcripción (TSS) o caja TATA o una secuencia equivalente. Un promotor puede comprender de manera natural uno o más elementos potenciadores que afecten a la transcripción de una secuencia de polinucleótido unida operativamente. Un elemento potenciador aislado también se puede fusionar a un promotor para producir un elemento cis promotor quimérico, que confiere un aspecto de la modulación total de la expresión de genes. Un promotor o fragmento de promotor puede comprender uno o más elementos potenciadores que efectúan la transcripción de genes unidos operativamente. Se cree que muchos elementos potenciadores de promotor se unen a proteínas de unión al ADN y/o afectan a la topología del ADN, produciendo configuraciones locales que permiten o restringen selectivamente el acceso de la ARN polimerasa al molde de ADN o que facilitan selectivamente la apertura de la doble hélice en el sitio de inicio de la transcripción. Un elemento potenciador puede funcionar uniéndose a factores de transcripción que regulen la transcripción. Algunos elementos potenciadores se 15 unen a más de un factor de transcripción, y los factores de transcripción pueden interactuar con diferentes afinidades con más de un dominio potenciador. Los elementos potenciadores se pueden identificar mediante una serie de técnicas, incluyendo el análisis de eliminación, es decir, eliminando uno o más nucleótidos del extremo 5’ o nucleótidos internos de un promotor; el análisis de proteínas de unión al ADN usando la identificación genética de DNasa I, la metilación de interferencia, ensayos de cambio de movilidad de electroforesis, identificación genómica in vivo por PCR mediada por ligadura, y otros ensayos convencionales; o mediante el análisis de similitud de la secuencia de ADN usando elementos de motivos cis conocidos o elementos potenciadores como una secuencia diana o un motivo diana con procedimientos de comparación de secuencia de ADN convencionales, tales como BLAST. La estructura fina de un dominio potenciador se puede estudiar además por mutagénesis (o sustitución) de uno o más nucleótidos o por otros procedimientos convencionales. Los elementos potenciadores se pueden obtener

25 mediante síntesis química o aislamiento de los elementos reguladores que incluyen dichos elementos, y se pueden sintetizar con nucleótidos flanqueantes adicionales que contienen sitios de enzimas de restricción útiles para facilitar la modificación posterior. Por lo tanto, la invención engloba el diseño, la construcción y el uso de los elementos potenciadores de acuerdo con los procedimientos desvelados en el presente documento para modular la expresión de moléculas de polinucleótido que se pueden transcribir unidas operativamente.

En las plantas, la inclusión de algunos intrones en las construcciones génicas conduce a un aumento del ARNm y acumulación proteica con respecto a las construcciones que carecen de intrón.

Este efecto se ha denominado “aumento mediado por intrón” (IME) de la expresión génica (Mascarenhas y col., (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920). Se han identificado intrones que se sabe que estimulan la expresión en plantas en genes del maíz (por ejemplo, tubA1, Adh1, Sh1, Ubil (Jeon y col. (2000) Plant Physiol. 123:1005-1014; Callis y 35 col. (1987) Genes Dev. 1:1183-1200; Vasil y col. (1989) Plant Physiol. 91:1575-1579; Christiansen y col. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689) y en genes del arroz (por ejemplo, sal, tpi: McElroy y col., Plant Cell 2:163-171 (1990); Xu y col., Plant Physiol. 106:459-467 (1994)). De manera similar, se ha descubierto que los intrones de genes de plantas dicotiledóneas como los de la petunia (por ejemplo, rbcS), patata (por ejemplo, st-ls1) y de Arabidopsis thaliana (por ejemplo, ubq3 y pat1) elevan las tasas de expresión génica (Dean y col. (1989) Plant Cell 1:201-208; Leon y col. (1991) Plant Physiol. 95:968-972; Norris y col. (1993) Plant Mol Biol 21:895-906; Rose y Last (1997) Plant J. 11:455464). Se ha demostrado que las eliminaciones o mutaciones en los sitios de corte y empalme de un intrón reducen la expresión génica, indicando que el corte y empalme puede ser necesario para el IME (Mascarenhas y col. (1990) Plant Mol Biol. 15:913-920; Clancy y Hannah (2002) Plant Physiol. 130:918-929). Sin embargo, se ha observado que ese corte y empalme en sí no es necesario para un cierto IME en plantas dicotiledóneas mediante mutaciones

45 puntuales en los sitios de corte y empalme del gen pat1 de A. thaliana (Rose y Beliakoff (2000) Plant Physiol. 122:535-542).

El aumento de la expresión génica por los intrones no es un fenómeno general debido a que algunas inserciones de intrones en los casetes de expresión recombinantes no potencian la expresión (por ejemplo, los intrones de genes dicotiledóneos (gen rbcS de guisante, gen faseolina de alubia y el gen stls-1 de Solanum tuberosum) y los intrones de genes de maíz (el noveno intrón del gen adh1, el primer intrón del gen hsp81)) (Chee y col. (1986) Gene 41:4757; Kuhlemeier y col. (1988) Mol Gen Genet 212:405-411; Mascarenhas y col. (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920; Sinibaldi y Mettler (1992) en W. E. Cohn, K Moldave, eds, “Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology”, Vol 42. Academic Press, Nueva York, pág. 229-257; Vancanneyt y col. 1990 Mol. Gen. Genet. 220:245250). Por lo tanto, no se puede emplear cada intrón con el fin de modificar el nivel de expresión génica de genes no

55 endógenos o genes endógenos en plantas transgénicas. No se conocen en la técnica anterior las características o distintivos específicos de secuencia que deben estar presentes en una secuencia de intrón para aumentar la tasa de expresión de un determinado gen y, por lo tanto, a partir de la técnica anterior no es posible predecir si un intrón vegetal dado, cuando se usa de manera heteróloga, producirá un aumento de la expresión a nivel del ADN o a nivel transcripcional (IME).

Como se usa en el presente documento, el término “quimérico” se refiere a una sola molécula de ADN que se produce fusionando una primera molécula de ADN a una segunda molécula de ADN, de modo que ni la primera ni la segunda molécula de ADN se encontraría normalmente en esa configuración, es decir, fusionadas entre sí. La molécula quimérica de ADN, por tanto, es una nueva molécula de ADN que, en cambio, no se encuentra normalmente en la naturaleza. Como se usa en el presente documento, la expresión “promotor quimérico” se refiere a un promotor producido por medio de dicha manipulación de moléculas de ADN. Un promotor quimérico puede combinar dos o más fragmentos de ADN; un ejemplo sería la fusión de un promotor con un elemento potenciador. Por lo tanto, el diseño, la construcción y el uso de promotores quiméricos de acuerdo con los procedimientos

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5 desvelados en el presente documento para modular la expresión de moléculas de polinucleótido que se pueden transcribir unidas operativamente están englobados en la presente invención.

Como se usa en el presente documento, el término “variante” se refiere a una segunda molécula de ADN que está en una composición similar, pero no idéntica a, una primera molécula de ADN y, aun así, la segunda molécula de ADN sigue manteniendo la funcionalidad general, es decir, el mismo o similar patrón de expresión, de la primera 10 molécula de ADN. Una variante puede ser una versión más corta o truncada de la primera molécula de ADN y/o una versión modificada de la secuencia de la primera molécula de ADN, tal como una con diferentes sitios de enzimas de restricción y/o eliminaciones, sustituciones y/o inserciones internas. Una “variante” también puede englobar un elemento regulador que tenga una secuencia de nucleótido que comprenda una sustitución, eliminación y/o inserción de uno o más nucleótidos de una secuencia de referencia, en la que el elemento regulador derivado tiene actividad 15 de la transcripción o traducción superior, inferior o equivalente a la molécula reguladora precursora correspondiente. Las “variantes” del elemento regulador también comprenderán variantes que surgen por mutaciones que se producen de manera natural en la transformación de células bacterianas y vegetales. En la presente invención, se puede usar una secuencia de nucleótidos proporcionada como SEQ ID NO: 27 y 28 para crear variantes que tengan una composición similar, pero no idéntica a, la secuencia de polinucleótidos del elemento regulador original, 20 manteniendo a la vez la funcionalidad general, es decir, el mismo o similar patrón de expresión, del elemento regulador original. La producción de dichas variantes de la presente invención es muy conocida por los expertos en la materia a la luz de la divulgación, y se engloba en el alcance de la presente invención. Las “variantes” del elemento regulador quimérico comprenden los mismos elementos constitutivos que una secuencia de referencia, pero los elementos constitutivos que comprenden el elemento regulador quimérico se pueden unir operativamente 25 mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica tales como digestión y unión por enzimas de restricción, clonación independiente de la unión, ensamblaje modular de productos de PCR durante la amplificación o síntesis química directa del elemento regulador, así como otros procedimientos conocidos en la técnica. La “variante” de elemento regulador quimérico resultante puede estar compuesta de los mismos, o variantes de los mismos, elementos constituyentes de la secuencia de referencia, pero difieren en la secuencia o secuencias que comprenden 30 la secuencia o las secuencias de unión que permiten que las partes constituyentes estén unidas operativamente. En la presente invención, una secuencia de polinucleótido proporcionada como SEQ ID NO: 27 y 28 proporcionan una secuencia de referencia en la que los elementos constituyentes que comprenden la secuencia de referencia se pueden unir mediante procedimientos conocidos en la técnica y pueden comprender sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de uno o más nucleótidos o mutaciones que se producen de manera natural en la transformación de

35 células bacterianas y vegetales.

Construcciones

Como se usa en el presente documento, el término “construcción” significa cualquier molécula de polinucleótido recombinante tal como un plásmido, un cósmido, un virus, una molécula de polinucleótido de replicación autónoma, un fago o una molécula de polinucleótido de ADN o ARN monocatenaria o bicatenaria, procedente de cualquier 40 fuente, capaz de la integración genómica o la replicación autónoma, que comprende una molécula de polinucleótido en la que una o más moléculas de polinucleótido se ha unido de manera funcionalmente operativa, es decir, se ha unido operativamente. Como se usa en el presente documento, el término vector” significa cualquier construcción de polinucleótido recombinante que se puede usar con el fin de transformar, es decir, introducir un ADN heterólogo en una célula huésped. El término incluye un casete de expresión aislado de cualquiera de las moléculas mencionadas

45 anteriormente.

Como se usa en el presente documento, la expresión “unido/a operativamente” se refiere a una primera molécula unida a una segunda molécula, en la que las moléculas se disponen de manera que la primera molécula afecta a la función de la segunda molécula. Las dos moléculas pueden ser parte o no de una sola molécula contigua y pueden estar adyacentes o no. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una molécula de polinucleótido que se

50 puede transcribir si el promotor modula la transcripción de la molécula de polinucleótido que se puede transcribir de interés en una célula. Un líder, por ejemplo, está unido operativamente a la secuencia codificante cuando es capaz de funcionar como líder del polipéptido codificado por la secuencia codificante.

Las construcciones de la presente invención se pueden proporcionar, en una realización, como construcciones de ADN de doble borde de plásmido Ti que tienen las regiones del borde derecho (RB o AGRtu.RB) y del borde 55 izquierdo (LB o AGRtu.LB) del plásmido Ti aislado de Agrobacterium tumefaciens que comprende un ADN-T, que junto con las moléculas de transferencia proporcionadas por las células de A. tumefaciens, permiten la integración del ADN-T en el genoma de una célula vegetal (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 6.603.061). Las construcciones también pueden contener segmentos de ADN de estructura principal de plásmido que proporcionan la función de replicación y selección de antibióticos en células bacterianas, por ejemplo, un origen de replicación de 60 Escherichia coli tal como ori322, un origen de replicación con una amplia selección de huéspedes tales como oriV u oriRi, y una región codificante para un marcador genético tal como Espec/Estrp que codifica una aminoglucósido adeniltransferasa Tn7 (aadA) que confiere resistencia a la espectinomicina o estreptomicina, o un gen marcador

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seleccionable de la gentamicina (Gm, Gent). Para la transformación de plantas, la cepa bacteriana huésped suele ser A. tumefaciens ABI, C58 o LBA4404; sin embargo, en la presente invención, pueden funcionar otras cepas conocidas por los expertos en la materia de transformación de plantas.

Se conocen en la técnica procedimientos de ensamblaje e introducción de construcciones en una célula de manera que la molécula de polinucleótido que se puede transcribir se transcriba en una molécula de ARNm funcional que se traduzca y exprese como un producto proteico. Para la práctica de la presente invención, se conocen bien composiciones y procedimientos convencionales para que el experto en la materia prepare y use construcciones y células huésped, véase, por ejemplo, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3ª edición, Volúmenes 1, 2, y 3 (2000) J. Sambrook, D. W. Russell, y N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Los procedimientos de fabricación de vectores recombinantes adecuados particularmente para la transformación en plantas incluyen los descritos en la patente de EE. UU. N.º 4.971.908; 4.940.835; 4.769.061; y 4.757.011. Estos tipos de vectores también se han revisado en la bibliografía científica (véase, por ejemplo, Rodriguez y col., “Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses”, Butterworths, Boston, (1988) y Glick, y col., “Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology”, CRC Press, Boca Raton, FL. (1993)). Los vectores típicos útiles para la expresión de ácidos nucleicos en plantas superiores se conocen bien en la técnica, e incluyen vectores derivados del plásmido inductor tumoral (Ti) de Agrobacterium tumefaciens (Rogers, y col., Methods in Enzymology 153: 253-277 (1987)). Otros vectores recombinantes útiles para la transformación de plantas, que incluyen el vector de control de transferencia pCaMVCN, también se han descrito en la bibliografía científica (véase, por ejemplo, Fromm y col., Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 82: 5824-5828 (1985)).

Se pueden incluir diversos elementos reguladores en una construcción incluyendo cualquiera de los que se proporcionan en el presente documento. Se puede proporcionar cualquiera de dichos elementos reguladores en combinación con otros elementos reguladores. Dichas combinaciones se pueden diseñar o modificar para producir características reguladoras deseables. En una realización, las construcciones de la presente invención comprenden al menos un elemento regulador unido operativamente a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir unida operativamente a una UTR de 3’.

Las construcciones de la presente invención pueden incluir cualquier promotor o líder que se proporcione en el presente documento o se conozca en la técnica. Por ejemplo, un promotor de la presente invención se puede unir operativamente a un líder 5’ no traducido heterólogo tal como uno derivado del gen de la proteína de choque término (véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.º 5.659.122 y 5.362.865). Como alternativa, un líder de la presente invención puede unirse operativamente a un promotor heterólogo tal como el promotor de la transcripción del virus del mosaico de la coliflor 35S (véase, la patente de EE. UU. n.º 5.352.605).

Como se usa en el presente documento, el término “intrón” se refiere a una molécula de ADN que se puede aislar o identificar a partir de la copia genómica de un gen y se puede definir, en general, como una región cortada y empalmada durante el procesamiento del ARNm previo a la traducción. Como alternativa, un intrón puede ser un elemento de ADN producido o manipulado sintéticamente. Un intrón puede contener elementos potenciadores que efectúen la transcripción de genes unidos operativamente. Un intrón se puede usar como elemento regulador para modular la expresión de una molécula de polinucleótido que se puede transcribir unida operativamente. Una construcción de ADN puede comprender un intrón, y el intrón puede ser o no heterólogo con respecto a la secuencia de la molécula de polinucleótido que se puede transcribir. Los ejemplos de intrones en la técnica incluyen el intrón de actina del arroz (patente de EE. UU. n.º 5.641.876) y el intrón HSP70 del maíz (patente de EE. UU. n.º 5.859.347). Los intrones útiles en la práctica de la presente invención incluye la SEQ ID NO: 24. Además, cuando se modifican las secuencias límite de intrón/exón, puede ser preferible evitar el uso de la secuencia de nucleótidos AT o el nucleótido A justo antes del extremo 5’ del sitio de corte y empalme (GT) y el nucleótido G o la secuencia de nucleótidos TG, respectivamente, justo después del extremo 3’ del sitio de corte y empalme (AG) para eliminar el potencial de los codones de partida no deseados que se forman durante el procesamiento del ARN mensajero en la transcripción final. La secuencia alrededor de los sitios de unión de corte y empalme 5’ o 3’ del intrón puede, por tanto, modificarse de esta manera.

Como se usa en el presente documento, la expresión “molécula de terminación de la transcripción de 3’” o “UTR de 3’” se refiere a una molécula de ADN que se usa durante la transcripción para producir la región no traducida 3’ (UTR de 3’) de una molécula de ARNm. La región no traducida de 3’ de una molécula de ARNm se puede generar mediante la escisión específica y la poliadenilación en 3’, también conocida como cola poliA. Una UTR de 3’ se puede unir operativamente y ubicarse cadena abajo de una molécula de polinucleótido que se puede transcribir, y puede incluir polinucleótidos que proporcionen una señal de poliadenilación y otras señales reguladoras capaces de afectar a la transcripción, al procesamiento del ARNm o a la expresión génica. Se cree que las colas PoliA funcionan en la estabilidad del ARNm y en el inicio de la traducción. Los ejemplos de moléculas de terminación de la transcripción de 3’ en la técnica son la región 3’ de nopalina sintasa (véase, Fraley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 80: 4803-4807 (1983)); región 3’ de hsp17 del trigo; región 3’ de la subunidad pequeña de la rubisco del guisante; región 3’ E6 del algodón (patente de EE. UU. n.º 6.096.950; regiones 3’ desveladas en el documento WO0011200A2; y la UTR de 3’ de coixina (patente de EE. UU. n.º 6.635.806).

Las UTR de 3’ normalmente tienen un uso beneficioso para la expresión recombinante de genes específicos. En los sistemas animales, se ha definido bien la maquinaria de las UTR de 3’ ((por ejemplo, Zhao y col., Microbiol Mol Biol

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Rev 63:405-445 (1999); Proudfoot, Nature 322:562-565 (1986); Kim y col., Biotechnology Progress 19:1620-1622 (2003); Yonaha y Proudfoot, EMBO J. 19:3770-3777 (2000); Cramer y col., FEBS Latters 498:179-182 (2001); Kuerstem y Goodwin, Nature Reviews Genetics 4:626-637 (2003)). La terminación eficaz de la transcripción de ARN es necesaria para evitar una transcripción no deseada de secuencias (cadena abajo) no relacionadas con el rasgo, que puede interferir con el rendimiento de un rasgo. La disposición de múltiples casetes de expresión génica en proximidad local entre sí (por ejemplo, con un T-ADN) puede producir la supresión de la expresión génica de uno o más genes de dicha construcción en comparación con inserciones independientes (Padidam y Cao, BioTechniques 31:328-334 (2001). Esto puede interferir con la consecución de niveles adecuados de expresión, por ejemplo, en casos en los que se desea la expresión génica potente de todos los casetes.

En las plantas, no se conocen secuencias de señal de poliadenilación claramente definidas. Hasegawa y col., Plant J 33:1063-1072, (2003)) no fueron capaces de identificar secuencias de señal de poliadenilación conservadas en sistemas tanto in vitro como in vivo en Nicotiana sylvestris y para determinar la longitud actual de la trascripción primaria (no poliadenilada). Una UTR de 3’ débil tiene el potencial de generar una translectura, que puede afectar a la expresión de los genes situados en las proximidades de los casetes de expresión (Padidam y Cao, BioTechniques 31:328-334 (2001)). El control apropiado de la terminación de la transcripción puede evitar la translectura en secuencias (por ejemplo, otros casetes de expresión) situadas cadena abajo, y puede además permitir el reciclaje eficaz de la ARN polimerasa, para mejorar la expresión génica. La terminación eficaz de la transcripción (liberación de ARN polimerasa II a partir de ADN) es un prerrequisito para el reinicio de la transcripción y, por tanto, afecta al nivel de transcripción total. Tras la terminación de la transcripción, el ARNm maduro se libera del sitio de síntesis y del molde hacia el citoplasma. Los ARNm en eucariotas se acumulan como formas poliA in vivo, de manera que es difícil detectar sitios de terminación de la transcripción mediante procedimientos convencionales. Sin embargo, la predicción de UTR de 3’ funcionales y eficaces mediante procedimientos bioinformáticos es difícil, ya que no tienen secuencias conservadas que permitirían la predicción fácil de una UTR de 3’ eficaz.

Desde una perspectiva práctica, normalmente es beneficioso que una UTR de 3’ que se usa en un casete transgénico posea las siguientes características. La UTR de 3’ debería ser capaz de terminar eficiente y eficazmente la transcripción del transgén y evitar la translectura de la transcripción en cualquier secuencia de ADN vecina que pueda comprender otro casete transgénico como en el caso de múltiples casetes que residen en un ADN-T, o el ADN cromosómico vecino en el que se inserta el ADN-T. La UTR de 3’ no debería producir una reducción en la actividad de la transcripción transmitida por el promotor, líder e intrones que se usan para dirigir la expresión de un transgén. En la tecnología vegetal, la UTR de 3’ se suele usar para cebar reacciones de amplificación de ARN transcrito extraído inversamente de la planta transformada y que se usa para (1) evaluar la actividad de la transcripción o expresión de un casete transgénico una vez que se integra en el cromosoma de la planta; (2) evaluar el número de copias de inserciones en el ADN de la planta; y (3) evaluar la cigosidad de la semilla resultante tras el cruce. La UTR de 3’ también se usa en reacciones de amplificación del ADN extraído de la planta transformada para caracterizar la intactilidad del casete insertado.

Las UTR de 3’ útiles para proporcionar la expresión de un transgén en plantas se pueden identificar basándose en la expresión de marcadores de secuencia expresados (EST) en bibliotecas de ADNc fabricadas a partir del ARN mensajero aislado de semillas, flores y otros tejidos derivados de tallo azul grande (Andropogon gerardii), carricera (Saccharum ravennae (Eriantus ravennae)), almorejo (Setaria viridis), maíz cimarrón (Zea mays subesp. mexicana), mijo (Setaria italica) o Coix (Coix lacryma-jobi). Las bibliotecas de ADNc se fabrican a partir de tejidos aislados de especies vegetales seleccionadas usando procedimientos conocidos por los expertos en la materia a partir de tejidos florales, de semillas, hojas y raíces. Los ADNc resultantes se secuencian usando diversos procedimientos de secuenciación conocidos en la técnica. Los EST resultantes se ensamblan en grupos usando software bioinformáticos tales como clc_ref_assemble_complete versión 2.01.37139 (CLC bio USA, Cambridge, Massachusetts 02142). La abundancia de transcripción de cada grupo se determina contando el número de lecturas de ADNc de cada grupo. Las UTR de 3’ identificadas pueden estar compuestas de la secuencia derivada de una secuencia de ADNc, así como de una secuencia derivada de ADN genómico. La secuencia de ADNc se usa para diseñar cebadores, que se usan entonces con las bibliotecas GenomeWalker™ (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) siguiendo el protocolo del fabricante para clonar la región 3’ de la secuencia correspondiente del ADN genómico para proporcionar una secuencia de terminación más larga. El análisis de la abundancia relativa de las transcripciones por recuentos directos o recuentos normalizados de las lecturas de secuencia observadas para cada biblioteca de tejidos se puede usar para deducir las propiedades de los patrones de expresión. Por ejemplo, algunas UTR de 3’ se pueden encontrar en transcripciones que se ven con mayor abundancia en el tejido de la raíz en oposición con las hojas. Esto sugiere que la transcripción se expresa a un alto nivel en la raíz y que las propiedades de la expresión en la raíz pueden atribuirse a la regulación de la transcripción del promotor, el líder, los intrones o la UTR de 3’. El ensayo empírico de las UTR de 3’ identificadas por las propiedades de expresión en órganos, tejidos y tipos de células específicos pueden dar lugar a las UTR de 3’ que aumentan la expresión en esos órganos, tejidos y tipos de células específicos.

Las construcciones y los vectores también pueden incluir una secuencia codificante de un péptido de tránsito que expresa un péptido unido que es útil para la dirección de un producto proteico, en particular, a un cloroplasto, leucoplasto u otro orgánulo plástido; mitocondrias; peroxisoma; vacuola; o una ubicación extracelular. Para las descripciones del uso de péptidos de transito al cloroplasto, véase la patente de EE. UU. n.º 5.188.642 y la patente de EE. UU. n.º 5.728.925. Muchas proteínas ubicadas en el cloroplasto se expresan a partir de genes nucleares

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como precursores que son dirigidos al cloroplasto por un péptido de tránsito al cloroplasto (CTP). Los ejemplos de dichas proteínas de cloroplasto aisladas incluyen los que se asocian con la subunidad pequeña (SSU) de ribulosa1,5-bifosfato carboxilasa, ferredoxina, ferredoxina oxidorreductasa, el complejo de proteína I y proteína II de recogida de luz, tiorredoxina F, enolpiruvil shikimato fosfato sintasa (EPSPS) y los péptidos de tránsito descritos en la patente de EE. UU. n.º 7.193.133. Se ha demostrado in vivo e in vitro que las proteínas no del cloroplasto pueden ser dirigidas al cloroplasto mediante el uso de fusiones proteicas con un CTP heterólogo y que el CTP es suficiente para dirigir una proteína al cloroplasto. La incorporación de un péptido de tránsito al cloroplasto adecuado tal como el CTP EPSPS de Arabidopsis thaliana (CTP2) (véase, Klee y col., Mol. Gen. Genet. 210:437-442 (1987)) o el CTP EPSPS de Petunia hybrida (CTP4) (véase, della-Cioppa y col., Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 83:6873-6877 (1986)) ha demostrado dirigir secuencias de proteína EPSPS heterólogas a los cloroplastos a plantas transgénicas (véanse, las patentes de EE. UU. n.º 5.627.061; 5.633.435; y 5.312.910 y los documentos EP 0218571; EP 189707; EP 508909; y EP 924299).

Moléculas de polinucleótidos que se pueden transcribir

Como se usa en el presente documento, la expresión “molécula de polinucleótido que se puede transcribir” se refiere a cualquier molécula de ADN capaz de ser transcrita en una molécula de ARN, incluyendo, pero sin limitación, las que tienen secuencias codificantes de proteína y las que producen moléculas de ARN que tienen secuencias útiles para la supresión genética. Un “transgén” se refiere a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir heteróloga para una célula huésped al menos con respecto a su ubicación en el genoma y/o una molécula de polinucleótido que se puede transcribir incorporada artificialmente en el genoma de la célula huésped en la generación actual o una anterior de la célula.

Un promotor de la presente invención puede estar unido operativamente a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que es heteróloga con respecto a la molécula de promotor. Como se usa en el presente documento el término “heterólogo” se refiere a la combinación de dos o más moléculas de polinucleótido cuando dicha combinación no se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, las dos moléculas se pueden derivar de diferentes especies y/o las dos moléculas se pueden derivar de genes diferentes, por ejemplo, genes diferentes de la misma especie o los mismos genes de especies diferentes. Un promotor, por lo tanto, es heterólogo con respecto a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir unida operativamente si dicha combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza, es decir, que la molécula de polinucleótido que se puede transcribir no se encuentra de manera natural unida operativamente en combinación con esa molécula promotora.

La molécula de polinucleótido que se puede transcribir puede ser, en general, cualquier molécula de ADN para la que se desee la expresión de una transcripción de ARN. Dicha expresión de una transcripción de ARN puede dar lugar a la traducción de la molécula de ARNm resultante y, por lo tanto, a la expresión proteica. Como alternativa, por ejemplo, se puede diseñar una molécula de polinucleótido que se puede transcribir para producir, en última instancia, la reducción de la expresión de un gen o de una proteína específicos. En una realización, esto se puede realizar usando una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que se oriente en dirección antisentido. Un experto en la materia está familiarizado con el uso de dicha tecnología antisentido. En resumen, según se transcribe la molécula de polinucleótido que se puede transcribir antisentido, el producto de ARN se hibrida y secuestra una molécula de ARN complementaria dentro de la célula. Este dúplex de moléculas de ARN no puede ser traducido en una proteína por la maquinaria de traducción de la célula, y es degradado en la célula. Cualquier gen se puede regular negativamente de esta manera.

Por lo tanto, una realización de la invención es un elemento regulador de la presente invención, tal como los que se proporcionan como SEQ ID NO: 27 y 28, unido operativamente a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir de manera que module la transcripción de la molécula de polinucleótido que se puede transcribir a un nivel deseado o con un patrón deseado cuando la construcción se integra en el genoma de una célula vegetal. En una realización, la molécula de polinucleótido que se puede transcribir comprende una región codificante de una proteína de un gen, y el promotor afecta a la transcripción de una molécula de ARN que se traduce y expresa como un producto proteico. En otra realización, la molécula de polinucleótido que se puede transcribir comprende una región antisentido de un gen, y el promotor afecta a la transcripción de una molécula de ARN antisentido, un ARN bicatenario u otra molécula de ARN inhibidora similar con el fin de inhibir la expresión de una molécula de ARN específica de interés en una célula huésped diana.

Genes de interés agronómico

Las moléculas de polinucleótido que se pueden transcribir pueden ser genes de interés agronómico. Como se usa en el presente documento, la expresión “gen de interés agronómico” se refiere a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que cuando se expresa en un determinado tejido, célula, o tipo de célula vegetal confiere una característica deseable, tal como las que se asocian con la morfología, fisiología, crecimiento, desarrollo, rendimiento, producto, perfil nutricional, resistencia a enfermedades y plagas, y/o tolerancia ambiental o química de la planta. Los genes de interés agronómico incluyen los que codifican una proteína de rendimiento, una proteína de resistencia al estrés, una proteína de control del desarrollo, una proteína de diferenciación tisular, una proteína del meristemo, una proteína sensible al medio ambiente, una proteína de senescencia, una proteína sensible a hormonas, una proteína de abscisión, una proteína fuente, una proteína de sedimentación, una proteína de control de la floración, una proteína de semilla, una proteína de resistencia a herbicidas, una proteína de resistencia a enfermedades, una enzima biosintética de ácidos grasos, una enzima biosintética de tocoferol, una enzima biosintética de aminoácidos, una proteína plaguicida o cualquier otro agente tal como una molécula antisentido o ARNi que se dirige a un gen en particular para suprimirlo. El producto de un gen de interés agronómico puede actuar

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5 en la planta con el fin de producir un efecto en la fisiología o en el metabolismo de la planta o puede actuar como un agente plaguicida en la dienta de una plaga que se alimenta de la planta.

En una realización de la invención, un promotor de la presente invención se incorpora a una construcción tal como el promotor que se une operativamente a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que es un gen de interés agronómico. La expresión del gen de interés agronómico es deseable para conferir un rasgo 10 agronómicamente beneficioso. Un rasgo agronómico beneficioso puede ser, por ejemplo, tolerancia a herbicidas, control de insectos, rendimiento modificado, resistencia a una enfermedad fúngica, resistencia vírica, resistencia a nematodos, resistencia a una enfermedad bacteriana, desarrollo y crecimiento vegetal, producción de almidón, producción de aceites modificados, alta producción de aceites, contenido en ácidos grasos modificados, alta producción proteica, maduración de los frutos, aumento de nutrición animal y humana, biopolímeros, resistencia al 15 estrés medioambiental, péptidos farmacéuticos y péptidos secretables, rasgos de procesamiento mejorados, digestibilidad mejorada, producción enzimática, sabor, fijación de nitrógeno, producción de semillas híbridas, producción de fibra y producción de biocombustible. Los ejemplos de genes de interés agronómico conocidos en la técnica incluyen los de resistencia a herbicidas (patentes de EE.UU. n.º 6.803.501; 6.448.476; 6.248.876; 6.225.114; 6.107.549; 5.866.775; 5.804.425; 5.633.435; y 5.463.175), aumento del rendimiento (patentes de EE.UU. n.º 20 USRE38.446; 6.716.474; 6.663.906; 6.476.295; 6.441.277; 6.423.828; 6.399.330; 6.372.211; 6.235.971; 6.222.098; y 5.716.837), control de insectos (patentes de EE.UU. n.º 6.809.078; 6.713.063; 6.686.452; 6.657.046; 6.645.497; 6.642.030; 6.639.054; 6.620.988; 6.593.293; 6.555.655; 6.538.109; 6.537.756; 6.521.442; 6.501.009; 6.468.523; 6.326.351; 6.313.378; 6.284.949; 6.281.016; 6.248.536; 6.242.241; 6.221.649; 6.177.615; 6.156.573; 6.153.814; 6.110.464; 6.093.695; 6.063.756; 6.063.597; 6.023.013; 5.959.091; 5.942.664; 5.942.658. 5.880.275; 5.763.245; y 25 5.763.241), resistencia a enfermedades fúngicas (patentes de EE.UU. n.º 6.653.280; 6.573.361; 6.506.962; 6.316.407; 6.215.048; 5.516.671; 5.773.696; 6.121.436; 6.316.407; y 6.506.962), resistencia a virus (patentes de EE.UU. n.º 6.617.496; 6.608.241; 6.015.940; 6.013.864; 5.850.023; y 5.304.730), resistencia a nematodos (patente de EE.UU. n.º 6.228.992), resistencia a enfermedades bacterianas (patente de EE.UU. n.º 5.516.671), crecimiento y desarrollo de plantas (patentes de EE.UU. n.º 6.723.897 y 6.518.488), producción de almidón (patentes de EE.UU. 30 n.º 6.538.181; 6.538.179; 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), producción de aceites modificados (patentes de EE.UU. n.º 6.444.876; 6.426.447; y 6.380.462), alta producción de aceite (patentes de EE.UU. n.º 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008; y 6.476.295), contenido de ácidos grasos modificado (patentes de EE.UU. n.º 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; y 6.459.018), alta producción proteica (patente de EE.UU. n.º 6.380.466), maduración de las frutos (patente de EE.UU. n.º 5.512.466), aumento de 35 nutrición animal y humana (patentes de EE.UU. n.º 6.723.837; 6.653.530; 6.5412.59; 5.985.605; y 6.171.640), biopolímeros (patentes de EE.UU. n.º USRE37,543; 6,228,623; y 5,958,745 y 6,946,588), resistencia al estrés medioambiental (patente de EE.UU. n.º 6.072.103), péptidos farmacéuticos y péptidos secretables (patentes de EE.UU. n.º 6.812.379; 6.774.283; 6.140.075; y 6.080.560), rasgos de procesamiento mejorados (patente de EE.UU. n.º 6.476.295), mejor digestibilidad (patente de EE.UU. n.º 6.531.648) bajo nivel de rafinosa (patente de EE.UU. n.º

40 6.166.292), producción enzimática industrial (patente de EE.UU. n.º 5.543.576), mejor sabor (patente de EE.UU. n.º 6.011.199), fijación de nitrógeno (patente de EE.UU. n.º 5.229.114), producción de semillas híbridas (patente de EE.UU. n.º 5.689.041), producción de fibra (patentes de EE.UU. n.º 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; y 5.869.720) y producción de biocombustible (patente de EE.UU. n.º 5.998.700).

Como alternativa, un gen de interés agronómico puede afectar a las características o al fenotipo de la planta que se

45 han mencionado anteriormente codificando una molécula de ARN que produzca una modulación dirigida de la expresión del gen de un gen endógeno, por ejemplo, por medio de antisentido (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 5.107.065); ARN inhibidor (“ARNi”, incluyendo la modulación de la expresión génica por medio de mecanismos mediados por miARN, ARNip, ARNip que actúa en trans y sARN en fase, por ejemplo, como se describe en las solicitudes publicadas US 2006/0200878 y US 2008/0066206, y en la solicitud de patente de EE. UU.

50 11/974.469) o mecanismos mediados por cosupresión. El ARN también podría ser una molécula de ARN catalítico (por ejemplo, una ribozima o un ribointerruptor, véase, por ejemplo, el documento US 2006/0200878) diseñada por ingeniería genética para escindir una producto de ARNm endógeno deseado. Por lo tanto, cualquier molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifique una molécula de ARN transcrita que afecte a un fenotipo agronómicamente importante o cambio morfológico de interés puede ser útil para la práctica de la presente

55 invención. Se conocen procedimientos en la técnica para construir e introducir construcciones en una célula de manera que la molécula de polinucleótido que se puede transcribir se transcriba en una molécula que sea capaz de producir supresión génica. Por ejemplo, la supresión génica posterior a la transcripción usando una construcción con una molécula de polinucleótido que se puede transcribir orientada anti-sentido para regular la expresión génica en células vegetales se desvela en las patentes de EE. UU. n.º 5.107.065 y 5.759.829, y la supresión génica posterior a

60 la transcripción usando una construcción con una molécula de polinucleótido que se puede transcribir orientada en sentido para regular la expresión génica en plantas se desvela en las patentes de EE. UU. n.º 5.283.184 y

5.231.020. La expresión de un polinucleótido que se puede transcribir en una célula vegetal también se puede usar para suprimir las plagas de las plantas que se alimentan de la célula vegetal, por ejemplo, composiciones aisladas de plagas de coleópteros (publicación de patente de EE. UU. n.º US20070124836) y composiciones aisladas de

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plagas por nematodos (publicación de patente de EE. UU. n.º US20070250947). Las plagas de plantas incluyen plagas de artrópodos, plagas de nematodos y plagas fúngicas o microbianas. Las moléculas de polinucleótido que se pueden transcribir ilustrativas para la incorporación a construcciones de la presente invención incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN o genes de una especie distinta de la especie diana o genes que se originan con o están presentes en la misma especie, pero que se incorporan en células receptoras mediante procedimientos de modificación por ingeniería genética en lugar de mediante técnicas clásicas de reproducción o cruzamiento. El tipo de molécula de polinucleótido puede incluir, pero sin limitación, una molécula de polinucleótido que ya está presente en la célula vegetal, una molécula de polinucleótido de otra planta, una molécula de polinucleótido de un organismo diferente o una molécula de polinucleótido generada externamente, tal como una molécula de polinucleótido que contenga un mensaje antisentido de un gen o una molécula de polinucleótido que codifique una versión artificial, sintética o modificada de otra manera de un transgén.

Marcadores seleccionables

Como se usa en el presente documento, el término “marcador” se refiere a cualquier molécula de polinucleótido que se puede transcribir cuya expresión, o falta de la misma, se puede explorar o valorar de alguna manera. Los genes marcadores para su uso en la práctica de la presente invención incluyen moléculas de polinucleótido que se pueden transcribir que codifican la β-glucuronidasa (GUS descrita en la patente de EE. UU. n.º 5.599.670), proteína verde fluorescente y variantes de la misma (GFP, descrita en las patentes de EE. UU. n.º 5.491.084 y 6.146.826), proteínas que confieren resistencia a antibióticos o proteínas que confieren tolerancia a herbicidas. Los marcadores de resistencia a antibióticos útiles, que incluyen los que codifican proteínas que confieren resistencia a la kanamicina (nptII), higromicina B (aph IV), estreptomicina o espectinomicina (aad, espec/estrep) y gentamicina (aac3 y aacC4) se conocen en la técnica. Los herbicidas por los que se ha demostrado tolerancia en las plantas transgénicas y para los que se puede aplicar el procedimiento de la presente invención, incluyen: herbicidas de ácido amino-metilfosfónico, glifosato, glufosinato, sulfonilureas, imidazolinonas, bromoxinilo, dalapon, dicamba, ciclohexanodiona, inhibidores de la protoporfirinógeno oxidasa y isoxasflutol. Las moléculas de polinucleótido que se pueden transcribir que codifican proteínas implicadas en la tolerancia a herbicidas se conocen en la técnica, e incluyen una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifica la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS para la tolerancia al glifosato descrita en la patente de EE. UU. n.º 5.627.061; 5.633.435; 6.040.497; y 5.094.945); una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifica una glifosato oxidorreductasa y una glifosato-Nacetil transferasa (GOX descrita en la patente de EE. UU. n.º 5.463.175; GAT descrita en la publicación de patente de EE.UU. n.º 20030083480 y dicamba monooxigenasa publicación de la patente de EE. UU. n.º 20030135879); una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifica la bromoxinil nitrilasa (Bxn para la tolerancia al Bromoxinil descrita en la patente de EE. UU. n.º 4.810.648); una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifica la fitoeno desaturasa (crtI) descrita en Misawa, y col., Plant Journal 4:833-840 (1993) y Misawa, y col., Plant Journal 6:481-489 (1994) para la tolerancia a la norflurazona; una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifica la acetohidroxiácido sintasa (AHAS, también conocida como ALS) descrita en Sathasiivan, y col., Nucl. Acids Res. 18:2188-2193 (1990) para la tolerancia a los herbicidas de sulfonilurea; y el gen bar descrito en DeBlock, y col., EMBO Journal 6:2513-2519 (1987) para la tolerancia a glufosinato y bialafós. Las moléculas promotoras de la presente invención pueden expresar moléculas de polinucleótido que se pueden transcribir a las que se unen que codifican fosfinotricina acetiltransferasa, EPSPS resistente a glifosato, aminoglucósido fosfotransferasa, hidroxifenil piruvato deshidrogenasa, higromicina fosfotransferasa, neomicina fosfotransferasa, dalapón deshalogenasa, nitrilasa resistente a bromoxinil, antranilato sintasa, ariloxialkanoato dioxigenasa, acetil CoA carboxilasa, glifosato oxidorreductasa y glifosato-N-acetil transferasa.

También se incluyen en la expresión “marcadores seleccionables” genes que codifican marcadores seleccionables cuya secreción se puede detectar como un medio para identificar o seleccionar las células transformadas. Los ejemplos incluyen marcadores que codifican un antígeno secretable que se puede identificar mediante la interacción con anticuerpos o incluso enzimas secretables que se pueden detectar catalíticamente. Las proteínas marcadoras secretadas seleccionables se encuentran en un número de clases, que incluyen proteínas pequeñas, difusibles, que son detectables (por ejemplo, por ELISA), enzimas pequeñas activas que se detectan en solución extracelular (por ejemplo, alfa-amilasa, beta-lactamasa, fosfinotricina transferasa) o proteínas que se insertan o atrapan en la pared celular (tal como proteínas que incluyen una secuencia líder tal como las que se encuentran en la unidad de expresión de extensión o proteínas relacionadas con la patogénesis del tabaco también conocidas como PR-S del tabaco). Otros genes marcadores seleccionables posibles serán evidentes para los expertos en la materia y se engloban en la presente invención.

Transformación celular

La invención también se dirige a un procedimiento de producción de células y plantas transformadas que comprenden un promotor unido operativamente a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir.

El término “transformación” se refiere a la introducción de un ácido nucleico en un huésped receptor. Como se usa en el presente documento, el término “huésped” se refiere a bacterias, hongos o plantas, incluyendo cualquier célula, tejido, órgano o progenie de las bacterias, hongos o plantas. Los tejidos y células vegetales de particular interés incluyen los protoplastos, callos, raíces, tubérculos, semillas, tallos, hojas, plántulas, embriones y polen.

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Como se usa en el presente documento, el término “transformado” se refiere a una célula, un tejido, un órgano o un organismo en el que se ha introducido una molécula de polinucleótido foránea, tal como una construcción. La molécula de polinucleótido introducida se puede integrar en el ADN genómico de la célula, tejido, órgano u organismo receptor de manera que la molécula de polinucleótido introducida es heredada por la progenie posterior. Una célula o un organismo “transgénico” o “transformado” también incluye la progenie de la célula o del organismo y la progenie producida en un programa de reproducción que emplea dicho organismo transgénico como parental en un cruzamiento y que presenta un fenotipo alterado que es el resultado de la presencia de una molécula de polinucleótido foránea. El término “transgénico” se refiere a una bacteria, un hongo o una planta que contiene una o más moléculas de ácido polinucleico heterólogo.

Hay muchos procedimientos de introducción de moléculas de ácido polinucleico en células vegetales. El procedimiento comprende, en general, las etapas de seleccionar una célula huésped adecuada, transformar la célula huésped con un vector recombinante y obtener la célula huésped transformada. Los procedimientos adecuados incluyen la infección bacteriana (por ejemplo, Agrobacterium), vectores cromosómicos artificiales bacterianos binarios, administración directa de ADN (por ejemplo, a través de transformación mediada por PEG, captación de ADN mediada por desecación/inhibición, electroporación, agitación con fibras de carburo de silicio y aceleración de partículas revestidas con ADN, etc. (revisado en Potrykus, y col., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205 (1991)).

La tecnología de introducción de una molécula de ADN en células es bien conocida por los expertos en la materia. Los procedimientos y materiales de transformación de células vegetales introduciendo una construcción de ADN vegetal en un genoma vegetal en la práctica de la presente invención pueden incluir cualquiera de los procedimientos demostrados y bien conocidos. Se puede utilizar cualquier procedimiento de transformación para transformar una célula huésped con uno de los promotores y/o construcciones de la presente invención. Las células huésped pueden ser cualquier célula u organismo tal como una célula vegetal, célula de alga, alga, célula fúngica, hongos, célula bacteriana o célula de insecto. Los huéspedes y células transformadas preferidos incluyen células de: plantas, Aspergilllus, levaduras, insectos, bacterias y algas.

Las plantas transgénicas regeneradas se pueden autopolinizar para proporcionar plantas transgénicas homocigotas. Como alternativa, el polen obtenido de las plantas transgénicas regeneradas se puede cruzar con plantas no transgénicas, preferentemente líneas endogámicas de especies agronómicamente importantes. Las descripciones de los procedimientos de reproducción que se usan comúnmente para los diferentes rasgos y cosechas se pueden encontrar en uno de varios libros de referencia, véase, por ejemplo, Allard, “Principles of Plant Breeding”, John Wiley & Sons, NY, U. de CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds, “Principles of crop improvement”, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep y Hendriksen, “Plant breeding perspectives”, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, “Soybeans: Improvement, Production and Uses”, 2ª edición, Monografía, 16:249 (1987); Fehr, “Principles of variety development, Theory and Technique”, (Vol. 1) y “Crop Species Soybean” (Vol 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987). Por el contrario, se puede usar el polen de plantas no transgénicas para polinizar las plantas transgénicas regeneradas.

Las plantas transformadas se pueden analizar en cuanto a la presencia de los genes de interés y el nivel de expresión y/o el perfil conferido por los elementos reguladores de la presente invención. Los expertos en la materia son conscientes de numerosos procedimientos de análisis de plantas transformadas. Por ejemplo, los procedimientos de análisis de plantas incluyen transferencias de Southern o transferencias Northern, metodologías basadas en PCR, análisis bioquímicos, procedimientos de exploración de fenotipo, evaluaciones de campo y ensayos de inmunodiagnóstico. La expresión de una molécula de polinucleótido que se puede transcribir puede medirse usando reactivos y procedimientos TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) según lo descrito por el fabricante y los tiempos de ciclos de PCR usando la Matriz de Ensayo TaqMan®. Como alternativa, para la expresión transgénica, se pueden usar los reactivos y procedimientos Invader® (Third Wave Technologies, Madison, WI) según lo descrito por el fabricante.

Las semillas de las plantas de la presente invención se pueden recolectar de las plantas transgénicas fértiles y se pueden usar para cultivar generaciones descendientes de plantas transformadas de la presente invención incluyendo líneas de plantas híbridas que comprenden la construcción de la presente invención y que expresan un gen de interés agronómico.

La presente invención también proporciona partes de las plantas de la presente invención. Las partes de plantas incluyen hojas, tallos, raíces, tubérculos, semillas, endospermos, óvulos y polen. La invención también incluye y proporciona células vegetales transformadas que comprenden una molécula de ácido nucleico de la presente invención.

La planta transgénica puede pasar la molécula de polinucleótido transgénica a su progenie. La progenie incluye cualquier parte o semilla de la planta regenerable que comprende el transgén derivado de una planta ancestral. La planta transgénica es preferentemente homocigótica para la molécula de polinucleótido transformada y transmite esa secuencia a toda la descendencia como resultado de la reproducción sexual. La progenie se puede cultivar a partir de semillas producidas por la planta transgénica. Estas plantas adicionales se pueden entonces autopolinizar para generar una línea de reproducción verdadera de plantas. La progenie de estas plantas se evalúa, entre otras cosas, en cuanto a la expresión génica. La expresión génica se puede detectar mediante varios procedimientos comunes tales como la transferencia Western, la transferencia Northern, la inmunoprecipitación y ELISA.

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Productos comerciales

Se desvelan además productos comerciales que comprenden las moléculas de ADN de acuerdo con la invención.

5 Como se usa en el presente documento, un “producto comercial” se refiere a cualquier composición o producto que está compuesto de un material derivado de una planta, semilla, célula vegetal o parte vegetal que comprende una molécula de ADN de la invención. Los productos comerciales se pueden vender a los consumidores y pueden ser viables o no viables. Los productos comerciales no viables incluyen, pero sin limitación, semillas y granos no viables; semillas procesadas, partes de semilla y partes de plantas; tejidos de plantas deshidratados, tejidos de plantas

10 congelados y tejidos de plantas procesados; semillas y partes de plantas procesadas para la alimentación animal para el consumo de animales terrestres y/o acuáticos, aceites, carne, harinas, copos, salvado, fibra, leche, queso, papel, crema, vino y otros alimentos para el consumo humano, y productos de biomasa o combustibles. Los productos comerciales viables incluyen, pero sin limitación, semillas y células vegetales. Las plantas que comprenden una molécula de ADN de acuerdo con la invención se pueden, por tanto, usar para fabricar cualquier

15 producto comercial que se adquiere normalmente a partir de plantas o partes de las mismas.

Habiendo descrito ya la invención en general, la misma se entenderá más fácilmente mediante la referencia a los siguientes ejemplos. Los ejemplos no cubiertos por el ámbito de las reivindicaciones tienen fines ilustrativos

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación y clonación de elementos reguladores

20 Se identificaron y aislaron nuevos elementos reguladores a nivel transcripcional de la ubiquitina, o secuencias de un grupo de elementos de expresión reguladores a nivel transcripcional (EXP) a partir del ADN genómico de las especies monocotiledóneas tallo azul grande (Andropogon gerardii), carricera (Saccharum ravennae (Eriantus ravennae)), almorejo (Setaria viridis), maíz cimarrón (Zea mays subesp. mexicana), mijo (Setaria italica) o Coix (Coix lacryma-jobi).

25 Se identificaron las secuencias de la transcripción de ubiquitina 1 de cada una de las especies anteriores. Se usó la región no traducida de 5’ (UTR de 5’) de cada una de las transcripciones de ubiquitina 1 para diseñar cebadores para amplificar los elementos reguladores a nivel transcripcional correspondientes para el gen de ubiquitina identificado, que comprende un promotor, un líder (UTR de 5’) y un primer intrón unido operativamente. Los cebadores se usaron con bibliotecas GenomeWalker™ (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) construidas

30 siguiendo el protocolo del fabricante para clonar la región 5’ de la secuencia de ADN genómico correspondiente. Los elementos reguladores a nivel transcripcional de ubiquitina también se aislaron de las monocotiledónea Sorghum bicolor usando las secuencias públicas que son homólogas para los genes de ubiquitina 4, 6, y 7 de Zea mays.

Usando las secuencias identificadas, se realizó un análisis informático para identificar los elementos reguladores en el ADN amplificado. Usando los resultados de este análisis, se definieron los elementos reguladores en las 35 secuencias de ADN y se diseñaron los cebadores para amplificar los elementos reguladores. La molécula de ADN correspondiente de cada elemento regulador se amplificó usando las condiciones de reacción en cadena de la polimerasa convencionales con cebadores que contenían sitios de enzimas de restricción únicos y el ADN genómico aislado de A. gerardii, S. ravennae, S. viridis, Z. mays subesp. mexicana, S. italica, C. lacrymajobi y S. bicolor. Se ligaron los fragmentos de ADN resultantes en vectores de expresión basados en plantas y se secuenciaron. Se hizo 40 entones un análisis del elemento regulador TSS y las uniones de corte y empalme de intrón/exón usando protoplastos vegetales transformados. En resumen, se transformaron los protoplastos con los vectores de expresión vegetales que comprendían los fragmentos de ADN clonados unidos operativamente a una molécula de polinucleótido heteróloga que se puede transcribir y se usó el sistema RACE 5’ para la Amplificación Rápida de extremos de ADNc, Versión 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, California 92008) para confirmar el elemento regulador TSS y

45 las uniones de corte y empalme de intrón/exón analizando la secuencia de las transcripciones de ARNm producidas de esta manera.

Se proporcionan en el presente documento las secuencias de los grupos de elementos de expresión reguladores a nivel transcripcional identificados (“EXP”) como las SEQ ID NO: 1, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 22, 25, 27, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 45, 49, 53, 55, 59, 63, 65, 69, 73, 75, 77, 79, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 50 112, 114, 115, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 128, 130, 132, 133, 134, 136, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 180, 181 y 183, como se enumeran en la siguiente Tabla 1. En el presente documento, se proporcionan secuencias promotoras SEQ ID NO: 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 y 135. En el presente documento, se proporcionan secuencias líder como SEQ ID NO: 3, 20, 35, 43, 47, 51, 57, 61, 67, 71 y 81. En el presente documento, se 55 proporcionan secuencias de intrón como SEQ ID NO: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 y

182. Se proporciona una secuencia potenciadora como SEQ ID NO: 89.

Tabla 1. Grupos de elementos de expresión reguladores a nivel transcripcional (EXP), promotores, potenciadores, líderes e intrones aislados de diversas especies herbáceas

Anotación: SEQ ID NO: Tamaño (pb) Género/especie deorigen Descripción y/o elementos reguladoresde EXP unidos en dirección 5’→ 3’ (SEQ ID NO): Construcciones de plásmidos yamplicones que comprenden EXP

EXP-ANDge.Ubq1:1:9: 1 3.741 A. gerardii EXP: P-ANDge.Ubq11:1:11 (SEQ ID NO: 2); L-ANDge.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 3); IANDge.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 4).

P-ANDge.Ubq1-1:1:11: 2 2.603 A. gerardii promotor

L-ANDge.Ubq1-1:1:2: 3 99 A. gerardii líder

I-ANDge.Ubq1-1:1:3: 4 1.039 A. gerardii intrón

EXP-ANDge.Ubq1:1:7: 5 3.255 A. gerardii EXP: P-ANDge.Ubq11:1:9 (SEQ ID NO: 6); LANDge.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 3); IANDge.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 7). pMON 136264, PCR0145892 pMON140896, PCR41

P-ANDge.Ubq1-1:1:9: 6 2.114 A. gerardii promotor

I-ANDge.Ubq1-1:1:4: 7 1.042 A. gerardii intrón

EXP-ANDge.Ubq1:1:8: 8 2.785 A. gerardii EXP: P-ANDge.Ubq11:1:10 (SEQ ID NO: 9); L-ANDge.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 3); IANDge.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 7). pMON140917, PCR42

P-ANDge.Ubq1-1:1:10: 9 1.644 A. gerardii promotor

EXP-ANDge.Ubq1:1:10: 10 2.613 A. gerardii EXP: P-ANDge.Ubq11:1:12 (SEQ ID NO: 11); L-ANDge.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 3); IANDge.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 7). PCR0145815, PCR43

P-ANDge.Ubq1-1:1:12: 11 1.472 A. gerardii promotor

EXP-ANDge.Ubq1:1:6: 12 2.255 A. gerardii EXP: P-ANDge.Ubq11:1:8 (SEQ ID NO: 13); L-ANDge.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 3); IANDge.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 7). pMON 136259, PCR0145893, pMON140898, PCR44

P-ANDge.Ubq1-1:1:8: 13 1.114 A. gerardii promotor

EXP-ANDge.Ubq1:1:11: 14 1.912 A. gerardii EXP: P-ANDge.Ubq11:1:13 (SEQ ID NO: 15); L-ANDge.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 3); IANDge.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 7). PCR0145817, pMON140899, PCR45

P-ANDge.Ubq1-1:1:13: 15 771 A. gerardii promotor

EXP-ANDge.Ubq1:1:12: 16 1.623 A. gerardii EXP: P-ANDge.UbqL1:1:14 (SEQ ID NO: 17); L-ANDge.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 3); IANDge.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 7). PCR0145819, pMON140900, PCR46

P-ANDge.Ubq1-1:1:14: 17 482 A. gerardii promotor

EXP-ERIra.Ubq1: 18 3.483 E. ravennae EXP: P-ERIra.Ubq11:1:10 (SEQ ID NO: 19);L-ERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 20); IERIra.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 21).

imagen10

(continuación) (continuación) (continuación)

Anotación: SEQ ID NO: Tamaño (pb) Género/especie deorigen Descripción y/o elementos reguladores de EXP unidos en dirección 5’→ 3’ (SEQ ID NO): Construcciones de plásmidos y amplicones que comprenden EXP

P-ERIra.Ubq1-1:1:10: 19 2.536 E. ravennae promotor

L-ERIra.Ubq1-1:1:2: 20 94 E. ravennae líder

I-ERIra.Ubq1-1:1:1: 21 1.041 E. ravennae intrón

EXP-ERIra.Ubq1:1:9: 22 3.152 E. ravennae EXP: P-ERIra.Ubq11:1:9 (SEQ ID NO: 23); L-ERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 20); IERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 24). pMON136263, PCR0145896, pMON140904, PCR50

P-ERIra.Ubq1-1:1:9: 23 2.014 E. ravennae promotor

I-ERIra.Ubq1-1:1:2: 24 1.044 E. ravennae intrón

EXP-ERIra.Ubq1:1:10: 25 2.663 E. ravennae EXP: P-ERIra.Ubq11:1:11 (SEQ ID NO: 26); L-ERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 20); IERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 24). PCR0145820, pMON140905, PCR51

P-ERIra.Ubq1-1:1:11: 26 1.525 E. ravennae promotor

EXP-ERIra.Ubq1:1:8: 27 2.182 E. ravennae EXP: P-ERIra.Ubq11:1:8 (SEQ ID NO: 28); L-ERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 20); IERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 24). pMON136258, PCR0145897, pMON140906, PCR52, pMON142864, pMON142862

P-ERIra.Ubq1-1:1:8: 28 1.044 E. ravennae promotor

EXP-ERIra.Ubq1:1:11: 29 1.934 E. ravennae EXP: P-ERIra.Ubq11:1:12 (SEQ ID NO: 30); L-ERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 20); IERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 24). PCR0145821, pMON140907, PCR53

P-ERIra.Ubq1-1:1:12: 30 796 E. ravennae promotor

EXP-ERIra.Ubq1:1:12: 31 1.649 E. ravennae EXP: P-ERIra.Ubq11:1:13 (SEQ ID NO: 32); L-ERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 20); IERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 24). PCR0145822, pMON140908, PCR54

P-ERIra.Ubq1-1:1:13: 32 511 E. ravennae

EXP-Sv.Ubq1:1:2: 33 2.631 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 34); LSv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 36). pMON140878, PCR0145909, pMON129203, pMON131958

P-Sv.Ubq1-1:1:1: 34 1.493 S. viridis promotor

L-Sv.Ubq1-1:1:2: 35 127 S. viridis líder

I-Sv.Ubq1-1:1:1: 36 1.011 S. viridis intrón

EXP-Sv.Ubq1:1:3: 37 2.173 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:2 (SQ ID NO: 38); LSv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 36). PCR0145929, pMON129204

P-Sv.Ubq1-1:1:2: 38 1.035 S. viridis promotor

EXP-Sv.Ubq1:1:5: 39 1.819 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 40); LSv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 36 pMON129205, pMON131959

imagen11

Anotación: SEQ ID NO: Tamaño (pb) Género/especie deorigen Descripción y/o elementos reguladoresde EXP unidos en dirección 5’→ 3’ (SEQ ID NO): Construcciones de plásmidos y amplicones que comprenden EXP

P-Sv.Ubq1-1:1:3: 40 681 S. viridis promotor

EXP-Zm.UbqM1:1:1 (Alelo-1): 41 1.922 Z. mays subesp. mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:1 (SEQ ID NO: 42); LZm.UbqM1-1:1:1 (SEQ ID NO: 43); IZm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 44). pMON140881, PCR0145914, pMON129210, pMON131961

P-Zm.UbqM1-1:1:1 (Alelo-1): 42 850 Z. mays subesp. mexicana promotor

L-Zm.UbqM1-1:1:1 (Alelo-1): 43 78 Z. mays subesp. mexicana líder

I-Zm.UbqM1-1:1:5 (Alelo1): 44 994 Z. mays subesp. mexicana intrón

EXP-Zm.UbqM1:1:4 (Alelo-2): 45 1.971 Z. mays subesp. mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 46); LZm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 47); 1Zm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 48). pMON140882, PCR0145915, pMON129212,

pMON131963

P-Zm.UbqM1-1:1:4 (Alelo-2): 46 887 Z. mays subesp. mexicana promotor

L-Zm.UbqM1-1:1:5 (Alelo-2): 47 77 Z. mays subesp. mexicana líder

I-Zm.UbqM1-1:1:4 (Alelo2): 48 1.007 Z. mays subesp. mexicana intrón

EXP-Zm.UbqM1:1:2 (Alelo-3): 49 2.005 Z. mays subesp. mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 50); LZm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 51); IZm.UbqM1-1:1:11 (SEQ ID NO: 52). PCR0145916, pMON129211, pMON131962, pMON132047

P-Zm.UbqM1-1:1:5 (Alelo-3): 50 877 Z. mays subesp. mexicana promotor

L-Zm.UbqM1-1:1:4 (Alelo-3): 51 78 Z. mays subesp. mexicana líder

I-Zm.UbqM1-1:1:11 (Alelo-3): 52 1.050 Z. mays subesp. mexicana intrón

EXP-Zm.UbqM1:1:5 (Alelo-3): 53 2.005 Z. mays subesp. mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 50); LZm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 51); IZm.UbqM1-1:1:12 (SEQ ID NO: 54).

I-Zm.UbqM1-1:1:12 (Alelo-3): 54 1.050 Z. mays subesp. mexicana intrón

imagen12

EXP-Sb.Ubq4:1:1: 55 1.632 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq4-1:1:1 (SEQ ID NO: 56); LSb.Ubq4-1:1:1 (SEQ ID NO: 57);I-Sb.Ubq4-1:1:1 (SEQ ID NO: 58). pMON140886, PCR0145921, pMON129219, pMON132932

P-Sb.Ubq4-1:1:1: 56 401 S. bicolor promotor

L-Sb.Ubq4-1:1:1: 57 154 S. bicolor líder

I-Sb.Ubq4-1:1:1: 58 1.077 S. bicolor intrón

EXP-Sb.Ubq6: 59 2.000 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq6-1:1:2 (SEQ ID NO: 60); LSb.Ubq6-1:1:1

(SEQ ID NO: 61); ISb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 62).

P-Sb.Ubq6-1:1:2: 60 791 S. bicolor promotor

L-Sb.Ubq6-1:1:1: 61 136 S. bicolor líder

I-Sb.Ubq6-1:1:1: 62 1.073 S. bicolor intrón

EXP-Sb.Ubq6:1:1: 63 2064 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 64); LSb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 61);I-Sb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 62). pMON140887, PCR0145920, pMON129218

P-Sb.Ubq6-1:1:1: 64 855 S. bicolor promotor

EXP-Sb.Ubq7:1:1: 65 2.000 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq7-1:1:1 (SEQ ID NO: 66); LSb.Ubq7-1:1:1 (SEQ ID NO: 67);I-Sb.Ubq7-1:1:1 (SEQ ID NO: 68) pMON 132974

P-Sb.Ubq7-1:1:1: 66 565 S. bicolor promotor

L-Sb.Ubq7-1:1:1: 67 77 S. bicolor líder

I-Sb.Ubq7-1:1:1: 68 1.358 S. bicolor intrón

EXP-SETit.Ubq1:1:1: 69 2.622 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:1 (SEQ ID NO: 70); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 72) pMON140877, PCR0145900, pMON129200

P-SETit.Ubq1-1:1:1: 70 1.492 S. italica promotor

L-SETit.Ubq1-1:1:1: 71 127 S. italica líder

I-SETit.Ubq1-1:1:1: 72 1.003 S. italica intrón

EXP-SETit.Ubq1:1:4: 73 2.622 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:4 (SEQ ID NO: 74); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.UbqL-1:1:1 (SEQ ID NO: 72). pMON132037

P-SETit.Ubq1-1:1:4: 74 1.492 S. italica promotor

EXP-SETit.Ubq1:1:2 EXP-SETit.Ubq1.1.2: 75 2.164 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 76); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 72).

P-SETit.Ubq1-1:1:2: 76 1.034 S. italica promotor

(continuación)

EXP-SETit.Ubq1:1:3: 77 1.810 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:3 (SEQ ID NO: 78); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 72). PCR0145905, pMON129202, pMON131957

P-SETit.Ubq1-1:1:3: 78 680 S. italica promotor

EXP-Cl.Ubq1:1:1: 79 1.940 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID N0:82). pMON140889, PCR0145922, pMON140913, PCR19, pMON129221, pMON146795, pMON146796, pMON146797, pMON146798, pMON146799, pMON132047, pMON146800, pMON146801, pMON146802

P-Cl.Ubq1-1:1:1: 80 837 C. lacrymajobi promotor

L-Cl.Ubq1-1:1:1: 81 86 C. lacrymajobi líder

I-Cl.Ubq1-1:1:1: 82 1017 C. lacrymajobi intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:3: 83 1845 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 84); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 82). PCR0145945, pMON140914, PCR20

P-Cl.Ubq1-1:1:4: 84 742 C. lacrymajobi promotor

EXP-Cl.Ubq1:1:4: 85 1.504 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 86); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 82). PCR0145946, pMON140915, PCR21

P-Cl.Ubq1-1:1:3: 86 401 C. lacrymajobi promotor

EXP-Cl.Ubq1:1:5: 87 1.157 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:5 (SEQ ID NO: 88); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 82). PCR0145947, pMON140916, PCR22

P-Cl.Ubq1-1:1:5: 88 54 C. lacrymajobi promotor

E-Cl.Ubq1-1:1:1: 89 798 C. lacrymajobi potenciador

EXP-Cl.Ubq1:1:12: 90 3.393 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 91); LCl.Ubq1-1:1:1 pMON142729

(SEQ ID NO: 81); ICl.Ubq1-1:1:7 (SEQ ID NO: 92)

P-Cl.Ubq1-1:1:9: 91 2.287 C. lacrymajobi promotor

(continuación)

I-Cl.Ubq1-1:1:7: 92 1.020 C. lacrymajobi Intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:16: 93 3.393 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 91); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubql-1:1:6 (SEQ ID NO: 94) pMON146750, pMON142748

I-Cl.Ubq1-1:1:6: 94 1.020 C. lacrymajobi Intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:11: 95 2.166 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 96); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq1-1:1:7 (SEQ ID NO: 92) pMON142730

P-Cl.Ubq1-1:1:10: 96 1.060 C. lacrymajobi Promotor

EXP-Cl.Ubq1:1:17: 97 2.166 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 96); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 94) pMON146751, pMON 142749

EXP-Cl.Ubq1:1:10: 98 1.943 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 94) pMON140889, PCR0145922, pMON140913, PCR19, pMON129221

EXP-Cl.Ubq1:1:18: 99 1.943 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq1-1:1:7 (SEQ ID NO: 92) pMON146795

EXP-Cl.Ubq1:1:19: 100 1.943 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq1-1:1:8 (SEQ ID NO: 101) pMON146796

I-Cl.Ubq1-1:1:8: 101 1.020 C. lacrymajobi Intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:20: 102 1.943 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 103) pMON146797

I-Cl.Ubq1-1:1:9: 103 1.020 C. lacrymajobi Intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:21: 104 1.943 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq11:1:10 (SEQ ID NO: 105) pMON146798

I-Cl.Ubq1-1:1:10: 105 1.020 C. lacrymajobi Intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:22: 106 1.943 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq11:1:11 (SEQ ID NO: 107) pMON146799

imagen13

(continuación) (continuación) (continuación) (continuación)

I-Cl.Ubq1-1:1:11: 107 1.020 C. lacrymajobi Intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:23: 108 1.943 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq11:1:12 (SEQ ID NO: 109) pMON132047, pMON146800

I-Cl.Ubq1-1:1:12: 109 1.020 C. lacrymajobi Intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:24: 110 1.943 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq11:1:13 (SEQ ID NO: 111) pMON146801

I-Cl.Ubq1-1:1:13: 111 1.020 C. lacrymajobi Intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:25: 112 1.943 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq11:1:14 (SEQ ID NO: 113) pMON146802

I-Cl.Ubq1-1:1:14: 113 1.020 C. lacrymajobi Intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:13: 114 1.848 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 84); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 94) PCR0145945, pMON140914, PCR20

EXP-Cl.Ubq1:1:14: 115 1.507 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 86); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 94) PCR0145946, pMON140915, PCR21

EXP-Cl.Ubq1:1:15: 116 1.160 C. lacrymajobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:5 (SEQ ID NO: 88); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 94) PCR0145947, pMON140916, PCR22

EXP-SETit.Ubq1:1:5: 117 2.625 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:1 (SEQ ID NO: 70); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 118) pMON140877, PCR0145900, pMON129200

I-SETit.Ubq1-1:1:2: 118 1.006 S. italica Intrón

EXP-SETit.Ubq1:1:10: 119 2.625 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:4 (SEQ ID NO: 64); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.UbqL-1:1:3 (SEQ ID NO: 120) pMON132037

I-SETit.Ubq1-1:1:3: 120 1.006 S. italica Intrón

EXP-SETit.Ubq1:1:12: 121 2.625 S. italica EXP: P-SETit.UbqL1:1:4 (SEQ ID NO: 64); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 122)

imagen14

I-SETit.Ubq1-1:1:4: 122 1.006 S. italica Intrón

EXP-SETit.Ubq1:1:7: 123 2.167 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 71); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 118) PCR0145928, pMON129201

EXP-SETit.Ubq1:1:6: 124 1.813 S. italica EXP: P-SETit.UbqL1:1:3 (SEQ ID NO: 73); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 118) PCR0145905, pMON129202

EXP-SETit.Ubq1:1:11: 125 1.813 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:3 (SEQ ID NO: 73); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 120) pMON131957

EXP-SETit.Ubq1:1:13: 126 1.813 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:3 (SEQ ID NO: 73); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:5 (SEQ ID NO: 127)

I-SETit.Ubq1-1:1:5: 127 1.006 S. italica Intrón

EXP-Sv.Ubq1:1:7: 128 2.634 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 34); LSv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 129) pMON140878, PCR0145909, pMON129203

I-Sv.Ubq1-1:1:2: 129 1.014 S. viridis Intrón

EXP-Sv.Ubq1:1:11: 130 2.634 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 34); LSv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 131) pMON131958

I-Sv.Ubq1-1:1:3: 131 1.014 S. viridis Intrón

EXP-Sv.Ubq1:1:8: 132 2.176 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 38); LSv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 129) PCR0145929, pMON129204

EXP-Sv.Ubq1:1:9: 133 1.822 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 40); LSv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 129) pMON129205

EXP-Sv.Ubq1:1:10: 134 1.822 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 135); LSv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 129) PCR0145911

P-Sv.Ubq1-1:1:4: 135 681 S. viridis Promotor

imagen15

EXP-Sv.Ubq1:1:12: 136 1.822 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 40); LSv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 131) pMON131959

EXP-Zm.UbqM1:1:6 (Alelo-1): 137 1.925 Z. mays subesp. Mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:1 (SEQ ID NO: 42); LZm.UbqM1-1:1:1 (SEQ ID NO: 43); IZm.UbqM1-1:1:13 (SEQ ID NO: 138) pMON140881, PCR0145914, pMON129210

I-Zm.UbqM1-1:1:13 (Alelo-1): 138 997 Z. mays subesp. Mexicana Intrón

EXP-Zm.UbqM1:1:10 (Alelo-1): 139 1.925 Z. mays subesp. Mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:1 (SEQ ID NO: 42); LZm.UbqM1-1:1:1 (SEQ ID NO: 43); IZm.UbqM1-1:1:17 (SEQ ID NO: 140) pMON131961

I-Zm.UbqM1-1:1:17 (Alelo-1): 140 997 Z. mays subesp. Mexicana Intrón

EXP-Zm.UbqM1:1:7 (Alelo-2): 141 1.974 Z. mays subesp. Mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 46); LZm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 47); IZm.UbqM1-1:1:14 (SEQ ID NO: 142) pMON140882, PCR0145915, pMON129212

I-Zm.UbqM1-1:1:14 (Alelo-2): 142 1.010 Z. mays subesp. Mexicana Intrón

EXP-Zm.UbqM1:1:12 (Alelo-2): 143 1.974 Z. mays subesp. Mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 46); LZm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 47); IZm.UbqM1-1:1:19 (SEQ ID NO: 144) pMON131963

I-Zm.UbqM1-1:1:19 (Alelo-2): 144 1.010 Z. mays subesp. Mexicana Intrón

EXP-Zm.UbqM1:1:8 (Alelo-3): 145 2.008 Z. mays subesp. Mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 50); LZm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 51); IZm.UbqM1-1:1:15 (SEQ ID NO: 146) PCR0145916, pMON129211

I-Zm.UbqM1-1:1:15 (Alelo-3): 146 1.053 Z. mays subesp. Mexicana Intrón

EXP-Zm.UbqM1:1:9 (Alelo-3): 147 2.008 Z. mays subesp. Mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 50); LZm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 51); IZm.UbqM1-1:1:16 (SEQ ID NO: 148)

imagen16

I-Zm.UbqM1-1:1:16 (Alelo-3): 148 1.053 Z. mays subesp. Mexicana Intrón

EXP-Zm.UbqM1:1:11 (Alelo-3): 149 2.008 Z. mays subesp. Mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 50); LZm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 51); IZm.UbqM1-1:1:18 (SEQ ID NO: 150) pMON131962, pMON132047

I-Zm.UbqM1-1:1:18 (Alelo-3): 150 1.053 Z. mays subesp. Mexicana Intrón

EXP-Sb.Ubq4:1:2: 151 1.635 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq4-1:1:1 (SEQ ID NO: 56); LSb.Ubq4-1:1:1 (SEQ ID NO: 57); I-Sb.Ubq4-1:1:2 (SEQ ID NO: 152) pMON140886, PCR0145921,

pMON129219, pMON132932

I-Sb.Ubq4-1:1:2: 152 1.080 S. bicolor Intrón

EXP-Sb.Ubq6:1:2: 153 2.067 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 64); LSb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 57); I-Sb.Ubq6-1:1:2 (SEQ ID NO: 154) pMON140887, PCR0145920, pMON129218, pMON 132931

I-Sb.Ubq6-1:1:2: 154 1.076 S. bicolor Intrón

EXP-Sb.Ubq6:1:3: 155 2.067 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 64); LSb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 57); I-Sb.Ubq6-1:1:3 (SEQ ID NO: 1569) pMON 132931

I-Sb.Ubq6-1:1:3: 156 1.076 S. bicolor Intrón

EXP-Sb.Ubq7:1:2: 157 2.003 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq7-1:1:1 (SEQ ID NO: 66); LSb.Ubq7-1:1:1 (SEQ ID NO: 67); I-Sb.Ubq7-1:1:A (SEQ ID NO: 158) pMON 132974

I-Sb.Ubq7-1:1:2: 158 1.361 S. bicolor Intrón

EXP-SETit.Ubq1:1:E: 180 2.625 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:4 (SEQ ID NO: 64); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:5 (SEQ ID NO: 127)

EXP-Zm.UbqM1:1:13 (Alelo-3): 181 2.008 Z. mays subesp. Mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 50); LZm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 51); IZm.UbqM1-1:1:20 (SEQ ID NO: 182)

I-Zm.UbqM1-1:1:20 (Alelo-3): 182 1.053 Z .mays subesp. Mexicana Intrón

EXP-SETit.Ubq1:1:9: 183 2.625 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:4 (SEQ ID NO: 64); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 118)

imagen17

Como se muestra en la Tabla 1, por ejemplo, la secuencia EXP reguladora a nivel transcripcional que se designa EXP-AND-ge.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 1), con componentes aislados de A. gerardii, comprende un elemento promotor, PAND-ge.Ubq1-1:1:11 (SEQ ID NO: 2), unido operativamente en 5’ a un elemento líder, L-ANDge.Ubq1

1:1:2 (SEQ ID NO: 3), unido operativamente en 5’ a un elemento de intrón, I-ANDge.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 4). 5 Otros EXP se unen de manera similar, como se define en la Tabla 1.

Como se muestra en la Tabla 1, el listado de secuencias y las FIG. 1-7, se modificaron por ingeniería genética variantes de secuencias promotoras de las especies A. gerardii, E. ravennae, Z. mays subesp. mexicana, S. bicolor,

C. lacryma-jobi, S. italica y S. viridis que comprenden fragmentos de promotor más cortos de, por ejemplo, PANDge.Ubq1-1:1:11 (SEQ ID NO: 2), P-ERIra.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 19) u otros promotores respectivos de otras

10 especies y, por ejemplo, dan lugar a P-ANDge.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 6), P-ERIra.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 23), PCl.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 96), P-SETit.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 76) y P-Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 38), así como otros fragmentos de promotor. P-SETit.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 74) comprende un cambio de un solo nucleótido con respecto a P-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 70). Asimismo, PSv.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 40) comprende un cambio de un solo nucleótido con respecto a P-Sv.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 135).

15 En algunos casos, se crearon variantes de intrones específicos modificando los últimos 3 nucleótidos de cada intrón respectivo siguiendo la secuencia 5’-AG-3’ de la unión de corte y empalme del intrón 3’. Estas variantes de intrón se muestran en la siguiente Tabla 2.

Tabla 2. Secuencia de extremo 3’ de las variantes de intrón

Anotación: SEQ ID NO: Nucleótidos del extremo 3’ del intrón inmediatamente después del sitio de corte y empalme 3’ AG

I-Cl.Ubq1-1:1:7: 92 GTG

I-Cl.Ubq1-1:1:6: 94 GTC

I-Cl.Ubq1-1:1:8: 101 GCG

I-Cl.Ubq1-1:1:9: 103 GAC

I-Cl.Ubq1-1:1:10: 105 ACC

I-Cl.Ubq1-1:1:11: 107 GGG

I-Cl.Ubq1-1:1:12: 109 GGT

I-Cl.Ubq1-1:1:13: 111 CGT

I-Cl.Ubq1-1:1:14: 113 TGT

I-SETit.Ubq1-1:1:2: 118 GTG

I-SETit.Ubq1-1:1:3: 120 GGT

I-SETit.Ubq1-1:1:4: 122 ACC

I-SETit.Ubq1-1:1:5: 127 GGC

I-Sv.Ubq1-1:1:2: 129 GTG

I-Sv.Ubq1-1:1:3: 131 GGT

I-Zm.UbqM1-1:1:13 (Alelo-1): 138 GTC

I-Zm.UbqM1-1:1:17 (Alelo-1): 140 GGT

I-Zm.UbqM1-1:1:14 (Alelo-2): 142 GTC

I-Zm.UbqM1-1:1:19 (Alelo-2): 144 GGT

I-Zm.UbqM1-1:1:15 (Alelo-3): 146 GTC

I-Zm.UbqM1-1:1:18 (Alelo-3): 148 GGT

I-Sb.Ubq6-1:1:2: 154 GTG

I-Sb.Ubq6-1:1:3: 156 GGT

I-Zm.UbqM1-1:1:20 (Alelo-3): 182 CGG

También se enumeran en la Tabla 1 tres variantes alélicas aisladas usando los mismos grupos de cebador 20 diseñados para la amplificación de ADN genómico de Z. mays subesp. mexicana. Las variantes alélicas de las secuencias EXP están compuestas de secuencias que comparten cierta identidad con diversas regiones de otras secuencias, pero también pueden ser evidentes eliminaciones y desapareamientos de nucleótidos en el promotor, líder y/o intrón de cada una de las secuencias EXP. La secuencia EXP designada EXP-Zm.UbqM1:1:1 (SEQ ID NO: 41) representa un primer alelo (Alelo-1) del grupo de elementos de expresión reguladores a nivel transcripcional del gen Ubq1 de Z. mays subesp. mexicana. Las secuencias EXP designadas EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137) y 5 EXP-Zm.UbqM1:1:10 (SEQ ID NO: 139) representan un primer alelo (Alelo-1), produciéndose la única diferencia entre las dos EXP en los últimos nucleótidos 3’ de cada respectivo intrón siguiendo la secuencia 5’-AG-3’ de la unión de corte y empalme del intrón 3’. La secuencia EXP designada EXP-Zm.UbqM1:1:4 (SEQ ID NO: 45) representa un segundo alelo (Alelo-2) del grupo de elementos de expresión reguladores a nivel transcripcional del gen Ubq1 de Z. mays subesp. mexicana. Las secuencias EXP designadas EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141) y EXP10 Zm.UbqM1:1:12 (SEQ ID NO: 143) representan un segundo alelo (Alelo-2), produciéndose la única diferencia entre las dos EXP en los últimos nucleótidos 3’ de cada respectivo intrón siguiendo la secuencia 5’-AG-3’ de la unión de corte y empalme del intrón 3’. Las secuencias EXP EXPZm.UbqM1:1:2 (SEQ ID NO: 49) y EXP-Zm.UbqM1:1:5 (SEQ ID NO: 53) representan un tercer alelo (Alelo-3) del grupo de elementos de expresión reguladores a nivel transcripcional del gen Ubq1 de Z. mays subesp. Mexicana y comprenden una diferencia de un solo nucleótido en la 15 posición 1.034 de sus respectivos intrones (G para I-Zm.UbqM1-1:1:11, SEQ ID NO: 52 y T para IZm.UbqM1-1:1:12, SEQ ID NO: 54). Las secuencias EXP designadas EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145), EXPZm.UbqM1:1:9 (SEQ ID NO: 147), EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149) y EXP-Zm.UbqM1:1:13 (SEQ ID NO: 181) también representan un tercer alelo (Alelo-3). El intrón de EXP-Zm.UbqM1:1:9, I-Zm.UbqM1-1:1:16 (SEQ ID NO: 148) comprende un resto de timina en la posición 1034, mientras que los intrones de EXP-Zm.UbqM1:1:8, EXP

imagen18

20 Zm.UbqM1:1:11 y EXPZm.UbqM1:1:13 (I-Zm.UbqM1-1:1:15, SEQ ID NO: 146; I-Zm.UbqM1-1:1:18, SEQ ID NO: 11 y; I-Zm.UbqM1-1:1:20, SEQ ID NO: 182) comprenden cada uno un resto de guanina en la posición 1034. Además, los 3 últimos nucleótidos del extremo 3’ de EXPZm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145) y EXP-Zm.UbqM1:1:9 (SEQ ID NO: 147) difieren de los de EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149) y EXP-Zm.UbqM1:1:13 (SEQ ID NO: 181).

Ejemplo 2: Análisis de elementos reguladores que dirigen GUS en protoplastos de maíz

25 Se transformaron protoplastos foliares del maíz con vectores de expresión vegetal que contenían una secuencia EXP, que dirigían la expresión de un transgén de la β-glucuronidasa (GUS), y se compararon con la expresión de GUS en los protoplastos foliares en los que la expresión de GUS es dirigida por promotores constitutivos conocidos.

Se comparó la expresión del transgén dirigida por EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22) o EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) con la expresión 30 de promotores constitutivos conocidos. Se clonaron las secuencias EXP anteriores en vectores de expresión vegetal como se muestra en la Tabla 3 que se presenta más adelante para dar lugar a vectores en los que una secuencia EXP estaba unida operativamente en 5’ a un indicador de β-glucuronidasa (GUS) que contenía un intrón procesable (denominado GUS-2, SEQ ID NO: 160) derivado del gen ST-LS1 específico de tejido fotoinducible de patata (Registro GenBank: X04753) o una secuencia codificante de GUS contigua (GUS-1, SEQ ID NO: 159), que estaba

35 unida operativamente en 5’ a una UTR de 3’ derivada de un gen Nopalina sintasa de A. tumefaciens (TAGRtu.nos1:1:13, SEQ ID NO: 161) o el gen Hsp17 del trigo (T-Ta.Hsp17-1:1:1, SEQ ID NO: 162).

Tabla 3. Construcción de plásmido de expresión de GUS en plantas y secuencia EXP correspondiente, secuencia codificante de GUS y UTR de 3’ usados para la transformación de protoplastos foliares de maíz. “SEQ. ID NO:” se refiere a la secuencia EXP dada

Plásmido: Secuencia EXP SEQ ID NO: GUS UTR de 3’

pMON19469: EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 170 GUS-1 T-AGRtu.nos-1:1:13

pMON65328: EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 163 GUS-2 T-Ta.Hsp17-1:1:1

pMON25455: EXP-Os.Act1:1:9 179 GUS-1 T-AGRtu.nos-1:1:13

pMON122605: EXP-Os.TubA-3:1:1 165 GUS-1 T-AGRtu.nos-1:1:13

pMON136264: EXP-ANDge.Ubq1:1:7 5 GUS-1 T-AGRtu.nos-1:1:13

pMON136259: EXP-ANDge.Ubq1:1:6 12 GUS-1 T-AGRtu.nos-1:1:13

pMON136263: EXP-ERIra.Ubq1:1:9 22 GUS-1 T-AGRtu.nos-1:1:13

pMON136258: EXP-ERIra.Ubq1:1:8 27 GUS-1 T-AGRtu.nos-1:1:13

40 Los plásmidos de control (pMON19469, pMON65328, pMON25455 y pMON122605) que se usaron para la comparación se construyeron como se ha descrito anteriormente, y contenían una secuencia EXP conocida: EXPCaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170), EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1(SEQ ID NO: 163), EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) o EXP-Os.TubA-3:1:1 (SEQ ID NO: 165), respectivamente, unida operativamente en 5’ a una secuencia codificante de GUS y una UTR de 3’. Se proporcionaron tres controles

45 adicionales para evaluar la expresión de GUS y de luciferasa de fondo: un control no ADN, un vector vacío que no se diseñó para la expresión del transgén, y un vector de expresión usado para expresar una proteína fluorescente

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verde (GFP).

También se construyeron dos plásmidos, para su uso en la cotransformación y la normalización de los datos, usando procedimientos conocidos en la técnica. Cada plásmido contenía una secuencia codificante de luciferasa específica que estaba dirigida por una secuencia EXP constitutiva. El vector vegetal pMON19437 comprende un casete 5 transgénico con un promotor constitutivo unido operativamente en 5’ a un intrón, (EXP-CaMV.35Senh+Zm.DnaK:1:1, SEQ ID NO: 170), unido operativamente en 5’ a una secuencia codificante de luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis) (LUCIFERASE:1:3, SEQ ID NO: 166), unida operativamente en 5’ a una UTR de 3’ del gen de nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 161). El vector vegetal pMON63934 comprende un casete transgénico con una secuencia EXP constitutiva (EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1,

10 SEQ ID NO: 168), unido operativamente en 5’ a una secuencia codificante de luciferasa de pensamiento de mar (Renilla reniformis) (CR-Ren.hRenilla Lucife-0:0:1, SEQ ID NO: 167), unida operativamente en 5’ a una UTR de 3’ del gen de nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 161).

Se transformaron protoplastos foliares de maíz usando el procedimiento de transformación basado en PEG, que es bien conocido en la técnica. Las células de protoplasto se transformaron con el ADN de plásmido pMON19437, el 15 ADN de plásmido pMON63934 y una cantidad equimolar de uno de los plásmidos presentados en la Tabla 3 y se incubaron durante una noche totalmente a oscuras. Las mediciones de GUS y luciferasa se realizaron colocando alícuotas de un preparado de células lisadas transformadas como se ha descrito anteriormente en dos bandejas de pocillos pequeños diferentes. Una bandeja se usó para las mediciones de GUS y una segunda bandeja se usó para realizar un ensayo de luciferasa dual usando el sistema de ensayo indicador de luciferasa dual (Promega Corp., 20 Madison, WI; véase, por ejemplo, Promega Notes Magazine, n.º 57, 1996, p.02). Se realizaron una o dos transformaciones para cada secuencia EXP y se determinaron los valores de la expresión media para cada secuencia EXP a partir de varias muestras de cada experimento de transformación. Las mediciones de la muestra se realizaron usando cuatro repeticiones para cada transformación por la construcción de secuencia EXP, o como alternativa, tres repeticiones de cada construcción de secuencia EXP por cada uno de los dos experimentos de

25 transformación. En la Tabla 4, se proporciona media de los niveles de expresión de GUS y luciferasa. En esta tabla, los valores de luciferasa de luciérnaga (por ejemplo, a partir de la expresión de pMON19437) se proporcionan en la columna marcada como “FLuc” y los valores de luciferasa de Renilla se proporcionan en la columna marcada como “RLuc”.

Tabla 4. Actividad media de GUS y luciferasa en células de protoplasto foliares del maíz transformadas

Plásmido: Secuencia EXP SEQ ID NO: GUS RLuc FLuc

pMON19469: EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 170 789147 298899 36568

pMON65328: EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 163 508327 158227 17193

pMON25455: EXP-Os.Act1:1:9 179 460579 183955 53813

pMON122605: EXP-Os.TubA-3:1:1 165 25082 25821 21004

pMON136264: EXP-ANDge.Ubq1:1:7 5 926083 101213 23704

pMON136259: EXP-ANDge.Ubq1:1:6 12 845274 193153 51479

pMON136263: EXP-ERIra.Ubq1:1:9 22 901985 132765 41313

pMON136258: EXP-ERIra.Ubq1:1:8 27 1011447 210635 66803

30 Para comparar la actividad relativa de cada secuencia EXP, se expresaron los valores de GUS como una proporción de la actividad de GUS con respecto a la actividad de la luciferasa y se normalizó con respecto a los niveles de expresión observados para la secuencia EXP-Os.TubA-3:1:1 (SEQ ID NO: 165). La siguiente Tabla 5 muestra las proporciones de GUS/RLuc de la expresión normalizada con respecto a la expresión de EXP-Os.TubA-3:1:1 en protoplastos de maíz.

35 Como se puede observar en la Tabla 5, la expresión de GUS, dirigida por EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22) o EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) fue de 4,51 a 9,42 veces superior a la expresión de GUS dirigida EXP-Os.TubA-3:1:1 (SEQ ID NO: 165). La expresión de GUS dirigida por EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXPERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22) o EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) también fue superior a la de EXP

40 CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170), EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163) o EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179).

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Tabla 5. Veces de expresión de GUS/RLuc en comparación con la expresión de EXP-Os.TubA-3:1:1 en células de protoplasto foliar de maíz

Plásmido: Secuencia EXP SEQ ID NO: GUS/RLuc GUS/RLuc normalizado con respecto aEXPOs.TubA3:1:1

pMON19469: EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK: 1:1 170 2,640000 2,72

pMON65328: EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 163 3,210000 3,31

pMON25455: EXP-Os.Act1:1:9 179 2,500000 2,57

pMON122605: EXP-Os.TubA-3:1:1 165 0,971000 1,00

pMON136264: EXP-ANDge.Ubq1:1:7 5 9,150000 9,42

pMON136259: EXP-ANDge.Ubq1:1:6 12 4,380000 4,51

pMON136263: EXP-ERIra.Ubq1:1:9 22 6,790000 6,99

pMON136258: EXP-ERIra.Ubq1:1:8 27 4,800000 4,94

La siguiente Tabla 6 muestra la proporciones de expresión de GUS/FLuc normalizada con respecto a la expresión de EXP-Os.TubA-3:1:1 en protoplastos de maíz

Tabla 6. Veces de expresión de GUS/FLuc en comparación con la expresión de EXP-Os.TubA-3:1:1 en células de protoplasto foliar de maíz

pMON19469: EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK: 1:1 170 21,600000 18,15

pMON65328: EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 163 29,600000 24,87

pMON25455: EXP-Os.Act1:1:9 179 8,560000 7,19

pMON122605: EXP-Os.TubA-3:1:1 165 1,190000 1,00

pMON136264: EXP-ANDge.Ubq1:1:7 5 39,100000 32,86

pMON136259: EXP-ANDge.Ubq1:1:6 12 16,400000 13,78

pMON136263: EXP-ERIra.Ubq1:1:9 22 21,800000 18,32

pMON136258: EXP-ERIra.Ubq1:1:8 27 15,100000 12,69

Como se puede observar en la Tabla 6, la expresión de GUS, dirigida por EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22) o EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) demostró la misma tendencia general cuando se expresó como una proporción de valores de GUS/FLuc y se 10 normaliza con respecto EXPOs.TubA-3:1:1 (SEQ ID NO: 165). La expresión fue de 12,69 a 32,86 veces superior a la expresión de GUS dirigida por EXPOs.TubA-3:1:1 (SEQ ID NO: 165). La expresión de GUS dirigida por EXPANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-AND-ge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22) o EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) también fue superior en ciertas comparaciones a la de EXP-CaMV.35Senh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170), EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163) o EXP

15 Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179).

Ejemplo 3: Análisis de elementos reguladores que dirigen GUS en protoplastos de maíz usando ampliconesde casete de transgén GUS

Se transformaron protoplastos foliares del maíz con amplicones de ADN derivados de vectores de expresión en plantas que contenían una secuencia EXP, que dirigían la expresión de un transgén de la β-glucuronidasa (GUS), y 20 se compararon con los protoplastos foliares en los que la expresión de GUS es dirigida por promotores constitutivos

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conocidos en una serie de experimentos que se presentan más adelante.

En un primer conjunto de experimentos, se transformaron las células de protoplasto de maíz, derivadas del tejido foliar, como se ha descrito anteriormente con amplicones producidos por la amplificación de casetes transgénicos de GUS que comprendían vectores de expresión en plantas para comparar la expresión de un transgén (GUS) dirigida 5 por uno de EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXPERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 123), EXPSETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124), EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID 10 NO: 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 132), EXP-Sv.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 134), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151), EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) y EXP-C1.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) con la de promotores constitutivos conocidos. Se clonó cada secuencia EXP que comprende el molde de amplificación a partir del que se produce el amplicón del casete transgénico usando procedimientos conocidos en la técnica en un vector de expresión en plantas mostrado en la 15 siguiente Tabla 7 bajo el título de “Molde del amplicón”. Los vectores de expresión en plantas resultantes comprenden un casete transgénico compuesto de una secuencia EXP, unida operativamente en 5’ a una secuencia de codificación de β-glucuronidasa (GUS) que contenía un intrón procesable (“GUS-2” como se ha expuesto en el Ejemplo 2 anterior), o a una secuencia de codificación de GUS contigua (“GUS-1”, como se ha expuesto anteriormente), unida operativamente en 5’ a una UTR de 3’ T-AGRtu.nos-1:1:13 o T-Ta.Hsp17-1:1:1, como también 20 se ha indicado anteriormente. Los amplicones se produjeron usando procedimientos conocidos por los expertos en la materia, usando los moldes de construcción de plásmidos que se presentan en la siguiente Tabla 7. En resumen, se diseñó un oligonucleótido cebador 5’ para hibridarse con la secuencia promotora, y se usó un oligonucleótido cebador 3’, que se hibrida con el extremo 3’ de la UTR de 3’ para la amplificación de cada casete transgénico. Se introdujeron sucesivas eliminaciones 5’ en las secuencias promotoras que comprenden los casetes transgénicos, 25 dando lugar a diferentes secuencias EXP, usando diferentes oligonucleótidos cebadores que se diseñaron para

hibridarse en diferentes posiciones de la secuencia promotora que comprendía el molde de amplicón.

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Las construcciones de plásmidos enumeradas como moldes de amplicón en la Tabla 7 sirvieron como moldes para la amplificación de los casetes de expresión transgénica que comprenden las secuencias EXP enumeradas en la Tabla 7. Los plásmidos de control usados para generar amplicones transgénicos de GUS para la comparación se construyeron como se ha descrito anteriormente con secuencias EXP constitutivas conocidas descritas en el

5 Ejemplo 2. También se usaron controles negativos para la determinación del fondo de GUS y luciferasa, un control de no ADN y una muestra de control en la que se usaron los dos plásmidos de luciferasa en la transformación junto con un ADN de plásmido que no expresa una secuencia codificante. Los plásmidos pMON19437 y pMON63934, que se exponen en el Ejemplo 2, también se emplearon para la cotransformación y la normalización de los datos.

Se transformaron protoplastos foliares de maíz usando un procedimiento de transformación basado en PEG como

10 se ha descrito en el Ejemplo 2, anteriormente. La siguiente Tabla 8 muestra los valores medios de expresión de GUS y luciferasa determinados para cada casete transgénico.

Tabla 8. Actividad media de GUS y luciferasa en células transformadas de protoplasto foliar de maíz

Secuencia EXP: SEQ ID NO: GUS RLuc FLuc

EXP-Os.Act1:1:9: 179 1540,3 105416,8 2671,8

P-CAMV.35S-ENH-1:1:102/L-CAMV.35S-1:1:2: 169 10426,3 344088,6 8604,1

EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1: 163 12530,8 137722,6 3067,1

EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1: 170 61036,1 208125,3 5787,6

EXP-ANDge.Ubq 1:1:7: 5 59447,4 84667,6 2578,4

EXP-ANDge.Ubq1:1:10: 10 40123,3 76753,8 2419,8

EXP-ANDge.Ubq 1:1:6: 12 42621,0 121751,3 3974,8

EXP-ANDge.Ubq 1:1:11: 14 44358,5 87105,8 2687,1

EXP-ANDge.Ubq 1:1:12: 16 48219,0 107762,1 3279,6

EXP-ERIra.Ubq1:1:9: 22 31253,0 171684,1 6476,1

EXP-ERIra.Ubq1:1:10: 25 7905,8 21235,6 462,4

EXP-ERIra.Ubq1:1:8: 27 39935,8 173766,6 5320,3

EXP-ERIra.Ubq1:1:11: 29 34141,3 111626,8 3377,6

EXP-ERIra.Ubq1:1:12: 31 11540,3 42362,1 1045,3

EXP-SETit.Ubq1:1:5: 117 20496,5 88695,8 2358,8

EXP-SETit.Ubq1:1:7: 123 75728,5 185223,8 4723,1

EXP-SETit.Ubq1:1:6: 124 44148,3 161216,3 4962,1

EXP-Sv.Ubq1:1:7: 128 15043,8 74670,6 1888,3

EXP-Sv.Ubq1:1:8: 132 31997,8 113787,1 3219,8

EXP-Sv.Ubq1:1:10: 134 38952,8 220208,6 7011,3

EXP-Zm.UbqM1:1:6: 137 30528,3 90113,1 2453,6

EXP-Zm.UbqM1:1:7: 141 34986,3 105724,7 2553,8

EXP-Sb.Ubq4:1:2: 151 9982,3 72593,8 2171,6

EXP-Sb.Ubq6:1:2: 153 33689,0 114709,6 3879,6

EXP-Cl.Ubq1:1:10: 98 50622,3 107084,3 2621,3

Para comparar la actividad relativa de cada secuencia EXP, se expresaron los valores de GUS como una proporción de la actividad de GUS con respecto a la actividad de la luciferasa y se normalizó con respecto a los niveles de

15 expresión observados para EXP-Os.Act1:1:1 y EXPCaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1. La siguiente Tabla 9 muestra las proporciones de GUS/RLuc de la expresión normalizada con respecto a la expresión dirigida por EXPOs.Act1:1:1 y EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 en protoplastos de maíz.

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Secuencia EXP: SEQ ID NO: GUS/RLuc con respecto a EXPOs.Act1:1:9 GUS/FLuc conrespecto a EXPOs.Act1:1:9

EXP-Os.Act1:1:9: 179 1,00 1,00

P-CAMV.35S-ENH-1:1:102/L-CAMV.35S-1:1:2: 169 2,07 2,10

EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:11: 163 6,23 7,09

EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1: 170 20,07 18,29

EXP-ANDge.Ubq1:1:7: 5 48,05 39,99

EXP-ANDge.Ubq1:1:10: 10 35,78 28,76

EXP-ANDge.Ubq1:1:6: 12 23,96 18,60

EXP-ANDge.Ubq1:1:11: 14 34,85 28,64

EXP-ANDge.Ubq1:1:12: 16 30,62 25,50

EXP-ERIra.Ubq1:1:9: 22 12,46 8,37

EXP-ERIra.Ubq1:1:10: 25 25,48 29,66

EXP-ERIra.Ubq1:1:8: 27 15,73 13,02

EXP-ERIra.Ubq1:1:11: 29 20,93 17,53

EXP-ERIra.Ubq1:1:12: 31 18,64 19,15

EXP-SETit.Ubq1:1:5: 117 15,82 15,07

EXP-SETit.Ubq1:1:7: 123 27,98 27,81

EXP-SETit.Ubq1:1:6: 124 18,74 15,43

EXP-Sv.Ubq1:1:7: 128 13,79 13,82

EXP-Sv.Ubq1:1:8: 132 19,25 17,24

EXP-Sv.Ubq1:1:10: 134 12,11 9,64

EXP-Zm.UbqM1:1:6: 137 23,19 21,58

EXP-Zm.UbqM1:1:7: 141 22,65 23,76

EXP-Sb.Ubq4:1:2: 151 9,41 7,97

EXP-Sb.Ubq6:1:2: 153 20,10 15,06

EXP-Cl. Ubq1:1:10: 98 32,35 33,50

Como se puede observar en las Tablas 9 y 10, casi todas las secuencias EXP fueron capaces de dirigir la expresión del transgén GUS en células de maíz. La expresión media de GUS fue mayor para EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID 5 NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXPERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124), EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO:

10 132), EXP-Sv.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 134), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151), EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) y EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) en comparación con la expresión de GUS dirigida por EXP-Os.Act1:1:1 o EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1.

En un segundo conjunto de experimentos, se comparó un amplicón de casete de GUS que comprendía la secuencia

15 EXP, EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145), con los amplicones de control PCR0145942 (EXP-Os.Act1:1:9, SEQ ID NO: 179) y PCR0145944 (EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1, SEQ ID NO: 170) con respecto a la expresión de GUS. La expresión de GUS dirigida por la secuencia EXP EXP-Zm.UbqM1:1:8 fue superior a la de los controles. La siguiente tabla 11 muestra los valores medios de GUS y Luciferasa determinados para cada amplicón. La siguiente Tabla 12 muestra las proporciones de GUS/RLuc y GUS/FLuc de la expresión normalizada con respecto a la

20 expresión dirigida por EXP-Os.Act1:1:9 y EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 en protoplastos de maíz.

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Amplicón: Secuencia EXP SEQ ID NO: GUS RLuc FLuc

PCR0145942: EXP-Os.Act1:1:9 179 1512,25 190461 11333,8

PCR0145944: EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 170 41176,5 330837 13885,8

PCR0145916: EXP-Zm.UbqM1:1:8 145 79581,5 330756 15262,5

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En un tercer grupo de experimentos, se produjeron los casetes de transgén GUS de amplicón como se ha descrito anteriormente y se ensayaron para determinar la expresión por las secuencias EXP EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) y EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116). Los amplicones estaban compuestos de una secuencia EXP unida 5 operativamente a la secuencia de codificación de GUS-1 que estaba unida operativamente a la UTR de 3’ de TAGRtu.nos-1:1:13. Se comparó la expresión con los controles EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) y EXPCaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170). La siguiente Tabla 13 muestra los valores medios de GUS y luciferasa determinados por cada amplicón. La siguiente Tabla 14 muestra las proporciones de GUS/RLuc de la expresión normalizada con respecto a la expresión dirigida por EXP-Os.Act1:1:9 y EXP-CaMV.35S

10 enh+Zm.DnaK:1:1 en protoplastos de maíz.

Tabla 13. Actividad media de GUS y luciferasa en células transformadas de protoplasto foliar de maíz

ID del amplicón: Secuencia EXP SEQ ID NO: GUS RLuc

PCR0145942: EXP-Os.Act1:1:9 179 9445,25 929755

PCR0145944: EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 170 78591,25 445127

PCR0146628: EXP-ANDge.Ubq1:1:8 8 192056,75 972642

PCR0145922: EXP-Cl.Ubq1:1:10 98 175295,25 395563

PCR0145945: EXP-Cl.Ubq1:1:13 114 173674,5 402966

PCR0145946: EXP-Cl.Ubq1:1:14 115 185987,5 390052

PCR0145947: EXP-Cl.Ubq1:1:15 116 9435 320749

Tabla 14. Proporciones de GUS/RLuc y GUS/FLuc de expresión normalizada con respecto a EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) y EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) en protoplastos foliares de maíz

Secuencia EXP: SEQ ID NO: GUS/RLuc conrespecto a EXPOs.Act1:1:9 GUS/RLuc con respecto a EXPCaMV.35Senh+Zm.DnaK:1:1

EXP-Os.Act1:1:9: 179 1,00 0,06

EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1: 170 17,38 1,00

EXP-ANDge.Ubq1:1:8: 8 19,44 1,12

EXP-Cl.Ubq1:1:10: 98 43,62 2,51

EXP-Cl.Ubq1:1:13: 114 42,43 2,44

EXP-Cl.Ubq1:1:14: 115 46,94 2,70

EXP-Cl.Ubq1:1:15: 116 2,90 0,17

Como se puede observar en la Tabla 14 anterior, las secuencias EXP EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8),

15 EXPCl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) y EXPCl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) son capaces de dirigir la expresión transgénica. La expresión dirigida por EXPANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114) y EXPCl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) fue superior a la de ambos controles. La expresión dirigida por EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) fue inferior a la de EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170), pero superior a la del

20 control, EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179).

En un cuarto grupo de experimentos, se produjeron los casetes de transgén GUS de amplicón como se ha descrito anteriormente y se ensayaron para determinar la expresión por las secuencias EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) y EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97). Se comparó la expresión con los controles EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) y EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170). La siguiente

25 Tabla 15 muestra los valores medios de GUS y luciferasa determinados por cada amplicón. La siguiente Tabla 16 muestra las proporciones de GUS/FLuc de la expresión normalizada con respecto a la expresión dirigida por EXPOs.Act1:1:9 y EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 en protoplastos de maíz.

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ID del amplicón: Secuencia EXP SEQ ID NO: GUS RLuc FLuc

PCR0145942: EXP-Os,Act1:1:9 179 5333,5 171941,75 77817,88

PCR0145944: EXP-CaMV,35S-enh+Zm,DnaK:1:1 170 88517 177260,25 54207,38

PCR0145922: EXP-Cl,Ubq1:1:10 98 130125,75 194216 32055

pMON146750: EXP-Cl,Ubq1:1:16 93 134101,75 182317,5 32434,5

pMON146751: EXP-Cl,Ubq1:1:17 97 107122,5 151783,25 51354,38

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Como se puede observar en la Tabla 16, las secuencias EXP, EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXPCl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) y EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97) fueron capaces de dirigir la expresión transgénica. La expresión dirigida por cada una de las secuencias EXP fue superior a la de ambos controles.

En un quinto conjunto de experimentos, se produjeron los casetes de transgén GUS de amplicón como se ha descrito anteriormente y se ensayó la expresión dirigida por las secuencias EXP EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149) y EXP-C1.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108). Se comparó la expresión con los controles EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) y EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163).

Tabla 17. Actividad media de GUS y Luciferasa en células transformadas de protoplastos foliares de maíz

Molde: Amplicón Secuencia EXP SEQ ID NO: GUS RLuc

pMON65328: PCR0145943 EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 163 70352,00 79028,75

pMON25455: PCR0145942 EXP-Os.Act1:1:9 179 33155,25 92337,00

pMON131962
pMON131962: EXP-Zm.UbqM1:1:11 149 18814,75 33663,00

pMON132047
pMON132047: EXP-Cl.Ubq1:1:23 108 15387,50 40995,50

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Como se puede observar en la Tabla 18 anterior, las secuencias EXP EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149) y EXP-Cl.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108) fueron capaces de dirigir la expresión de GUS en los protoplastos foliares de maíz. La expresión fue similar a la del control EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) e inferior a la de EXPCaMV.35Senh+Ta.LhcbI+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163).

5 Se puede estudiar de manera similar la eficacia de los elementos reguladores que dirigen la expresión de GUS a partir de amplicones en protoplastos foliares de caña de azúcar. Por ejemplo, se pueden transformar protoplastos de caña de azúcar con amplicones de ADN derivados de vectores de expresión en plantas que contienen una secuencia EXP, que dirigen la expresión del transgén de β-glucuronidasa (GUS), y compararlos con protoplastos foliares en los que la expresión de GUS es dirigida por promotores constitutivos conocidos. Asimismo, se pueden

10 estudiar de manera similar elementos reguladores que dirigen la expresión de CP4 a partir de amplicones en protoplastos de maíz o de trigo.

Ejemplo 4: Análisis de elementos reguladores que dirigen GUS en protoplastos de trigo usando amplicones de casete de transgén GUS

Se transformaron protoplastos foliares de trigo con amplicones de ADN derivados de vectores de expresión en

15 plantas que contenían una secuencia EXP que dirigían la expresión de un transgén de la β-glucuronidasa (GUS), y se compararon con el protoplasto foliar en el que la expresión de GUS es dirigida por promotores constitutivos conocidos.

Se transformaron células de los protoplasto del trigo derivadas del tejido foliar usando procedimientos conocidos en la técnica con amplicones producidos a partir de la amplificación de casetes transgénicos de GUS que comprendían 20 vectores de expresión en plantas para comparar la expresión de un transgén (GUS) dirigida por las secuencias enumeradas en las Tablas 10-11 con la de promotores constitutivos conocidos con la metodología que se ha descrito en un ejemplo anterior (Ejemplo 3), usando los mismos amplicones del casete de GUS que se usaron para el ensayo en el maíz del Ejemplo 3 anterior. Los amplicones de casetes de GUS y los plásmidos de luciferasa de control usados para la transformación de protoplastos de trigo también fueron los mismos que los presentados en el 25 ejemplo anterior y proporcionados en la Tabla 7 anterior del Ejemplo 3. Asimismo, se usaron controles negativos para la determinación del fondo de GUS y luciferasa, como se ha descrito anteriormente. Se transformaron protoplastos foliares de trigo usando el procedimiento de transformación basado en PEG, como se ha descrito en el Ejemplo 3 anterior. La Tabla 19 enumera la actividad media de GUS y LUC que se observó en células transformadas de protoplastos foliares de trigo, y la Tabla 20 muestra las proporciones de expresión GUS/RLuc normalizadas en

30 protoplastos de trigo.

Tabla 19. Actividad media de GUS y luciferasa en células transformadas de protoplasto foliar de trigo

Secuencia EXP: SEQ ID NO: GUS RLuc FLuc

EXP-Os.Act1:1:9: 179 2976,33 53334,8 0,0558047

P-CAMV.35S-ENH-1:1:102/L-CAMV.35S-1:1:2: 169 1431,33 55996,1 0,0255612

EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1: 163 29299,3 50717,4 0,5776973

EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1: 170 34294,3 63307,9 0,5417066

EXP-ANDge.Ubq 1:1:7: 5 68444,3 60329,1 1,1345158

EXP-ANDge.Ubq1:1:10: 10 60606,3 60659,4 0,9991245

EXP-ANDge.Ubq 1:1:6: 12 33386,3 56712,1 0,5886984

EXP-ANDge.Ubq 1:1:11: 14 43237,3 48263,4 0,8958609

EXP-ANDge.Ubq 1:1:12: 16 51712,7 64702,8 0,7992341

EXP-ERIra.Ubq1:1:9: 22 20998,3 60273,4 0,3483845

EXP-ERIra.Ubq1:1:10: 25 17268,3 25465,4 0,6781084

EXP-ERIra.Ubq1:1:8: 27 34635,7 59467,1 0,5824341

EXP-ERIra.Ubq1:1:11: 29 28979 56153,8 0,516065

EXP-ERIra.Ubq1:1:12: 31 41409,7 55152,4 0,7508221

EXP-SETit.Ubq1:1:5: 117 39427,7 57463,1 0,6861388

EXP-SETit.Ubq1:1:7: 123 108091 49330,4 2,191169

EXP-SETit.Ubq1:1:6: 124 58703 46110,1 1,2731047

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(continuación)

Secuencia EXP: SEQ ID NO: GUS RLuc FLuc

EXP-Sv.Ubq1:1:7: 128 29330 43367,1 0,676319

EXP-Sv.Ubq1:1:8: 132 53359 40076,4 1,3314306

EXP-Sv.Ubq1:1:10: 134 49122,7 53180,8 0,9236922

EXP-Zm.UbqM1:1:6: 137 37268 54088,1 0,6890239

EXP-Zm.UbqM1:1:7: 141 51408 47297,4 1,0869087

EXP-Sb.Ubq4:1:2: 151 35660,3 62591,1 0,5697347

EXP-Sb.Ubq6:1:2: 153 27543 57826,4 0,4763046

EXP-Cl.Ubq1:1:10: 98 54493,3 41964,1 1,2985699

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Como se puede observar en la Tabla 20 anterior, casi todas las secuencias EXP fueron capaces de dirigir la expresión del transgén GUS en células de trigo. La expresión del transgén GUS dirigida por EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXPANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 5 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124), EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 132), EXP-Sv.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 134), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXPZm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151), EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) y EXP10 Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) fue muy superior a la expresión de GUS dirigida por EXP-Os.Act1:1:9. La expresión de GUS de los amplicones en las células de protoplastos foliares de trigo con respecto a EXP-CaMV.35Senh+ Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 fue ligeramente diferente de la expresión observada en las células de protoplasto de maíz. Cada una de EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXPANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 15 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124), EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 132), EXP-Sv.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 134), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141) y EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) demostraron niveles superiores de expresión de GUS en comparación con EXP-CaMV.35S

20 enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1. Las secuencias EXP EXPERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151) y EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) demostraron niveles inferiores de expresión de GUS en comparación con EXP-CaMV.35Senh+ Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1.

En un segundo conjunto de experimentos, se produjeron los casetes de transgén GUS de amplicón como se ha descrito anteriormente y se ensayaron para determinar la expresión dirigida por las secuencias EXP EXP25 ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXPCl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) y EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116). Los amplicones estaban compuestos de una secuencia EXP unida operativamente a la secuencia codificante de GUS-1 que estaba unida operativamente a la UTR de 3’ T-AGRtu.nos-1:1:13.Se comparó la expresión con los controles EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) y EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170). La siguiente Tabla 21 muestra los valores medios de GUS y

30 luciferasa determinados para cada amplicón. La siguiente Tabla 22 muestra las proporciones de expresión de GUS/RLuc normalizada con respecto a la expresión dirigida por EXP-Os.Act1:1:9 y EXP-CaMV.35Senh+Zm.DnaK:1:1 en cloroplastos de maíz.

Tabla 21. Actividad media de GUS y luciferasa en células transformadas de protoplasto foliar de trigo

ID del amplicón: Secuencia EXP SEQ ID NO: GUS RLuc

PCR0145942: EXP-Os.Act1:1:9 179 1234 176970,5

PCR0145944: EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 170 12883,5 119439

PCR0146628: EXP-ANDge.Ubq1:1:8 8 38353,3 171535,3

PCR0145922: EXP-Cl.Ubq1:1:10 98 34938 154245,8

PCR0145945: EXP-Cl.Ubq1:1:13 114 32121 122220,8

PCR0145946: EXP-Cl.Ubq1:1:14 115 56814 143318,3

PCR0145947: EXP-Cl.Ubq1:1:15 116 1890,5 167178,5

Tabla 22. Proporciones de GUS/RLuc y GUS/FLuc de expresión normalizada con respecto a EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) y EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) en protoplastos foliares de trigo

Secuencia EXP: SEQ ID NO: GUS/RLuc con respecto a EXPOs.Act1:1:9 GUS/RLuc conrespecto a EXPCaMV.35Senh+Zm.DnaK:1:1

EXP-Os.Act1:1:9: 179 1,00 0,06

EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1: 170 15,47 1,00

EXP-ANDge.Ubq1:1:8: 8 32,07 2,07

EXP-Cl.Ubq1:1:10: 98 32,48 2,10

EXP-Cl.Ubq1:1:13: 114 37,69 2,44

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(continuación)

EXP-Cl.Ubq1:1:14: 115 56,85 3,68

EXP-Cl.Ubq1:1:15: 116 1,62 0,10

Como se puede observar en la Tabla 22 anterior, las secuencias EXP EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXPCl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-C1.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) y EXPCl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) son capaces de dirigir la expresión transgénica. La expresión dirigida por EXP

5 ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114) y EXPCl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) fue superior a la de ambos controles. La expresión dirigida por EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) fue inferior a la de EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170), pero superior a la del control, EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179).

En un tercer conjunto de experimentos, se fabricaron casetes de transgén GUS de amplicón como los descritos

10 anteriormente para ensayar la expresión dirigida por las secuencias EXP EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXPCl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) y EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97). Se comparó la expresión con la de los controles EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) y EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170). La siguiente Tabla 23 muestra los valores medios de GUS y luciferasa determinados para cada amplicón. La siguiente Tabla 24 muestra las proporciones de GUS/RLuc y GUS/FLuc de expresión normalizada con respecto a la expresión dirigida

15 por EXP-Os.Act1:1:9 y EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 en protoplastos de maíz.

Tabla 23. Actividad media de GUS y luciferasa en células transformadas de protoplasto foliar de trigo

ID del amplicón: Secuencia EXP SEQ ID NO: GUS RLuc FLuc

PCR0145942: EXP-Os,Act1:1:9 179 478 46584,5 2709,75

PCR0145944: EXP-CaMV,35S-enh+Zm,DnaK:1:1 170 8178,5 43490,8 2927,25

PCR0145922: EXP-Cl,Ubq1:1:10 98 22068,3 47662,3 1289

pMON146750: EXP-Cl,Ubq1:1:16 93 34205 45064,5 1379,63

pMON146751: EXP-Cl,Ubq1:1:17 97 31758 45739,3 2820,75

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imagen42

Como se puede observar en la Tabla 24 anterior, las secuencias EXP EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXPCl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) y EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97) fueron capaces de dirigir la expresión transgénica. La expresión dirigida por cada una de las secuencias EXP fue superior a la de ambos controles.

En el cuarto conjunto de experimentos, se fabricaron casetes de transgén GUS de amplicón como los descritos

5 anteriormente para ensayar la expresión dirigida por las secuencias EXP, EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149) y EXP-Cl.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108). Se comparó la expresión con la de los controles EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) y EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcbl+ Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163). La siguiente Tabla 25 muestra los valores medios de GUS y luciferasa determinados para cada amplicón. La siguiente Tabla 26 muestra las proporciones de GUS/RLuc de expresión normalizada con respecto a la expresión dirigida por EXP-Os.Act1:1:9 y

10 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcbl+Os.Act1:1:1 en protoplastos de maíz.

Tabla 25. Actividad media de GUS y Luciferasa en células transformadas de protoplastos foliares de trigo

Molde: ID del amplicón Secuencia EXP SEQ ID NO: GUS RLuc

pMON65328: PCR0145943 EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 163 67459,13 11682,00

pMON25455: PCR0145942 EXP-Os.Act1:1:9 179 56618,33 16654,83

pMON131962
pMON131962: EXP-Zm.UbqM1:1:11 149 53862,13 10313,75

pMON132047
pMON132047: EXP-Cl.Ubq1:1:23 108 38869,38 12279,00

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imagen44

Como se puede observar en la Tabla 26 anterior, las secuencias EXP EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149) y EXPCl.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108) fueron capaces de dirigir la expresión de GUS en protoplastos foliares de trigo. La expresión fue similar a la del control EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) e inferior a la de EXP-CaMV.35Senh+ Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163).

5 Ejemplo 5: Análisis de elementos reguladores que dirigen GUS en protoplastos de caña de azúcar usando amplicones de casete de transgén GUS

Se transformaron protoplastos foliares de caña de azúcar con amplicones de ADN derivados de vectores de expresión en plantas que contenían una secuencia EXP, que dirigían la expresión de un transgén de βglucuronidasa (GUS), y se compararon con el protoplasto foliar en el que la expresión de GUS es dirigida por

10 promotores constitutivos conocidos.

Se transformaron células de protoplasto de caña de azúcar, derivadas del tejido foliar usando un procedimiento de transformación basado en PEG, como se ha descrito en el Ejemplo 3 anterior con amplicones producidos por la amplificación de casetes de transgén GUS que comprendían vectores de expresión en plantas para comparar la expresión de un transgén (GUS) dirigida por uno de EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 15 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXPANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXPERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) y EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116), y se presentan en la siguiente Tabla 27, con la de promotores

20 constitutivos conocidos.

Tabla 27. Amplicones de expresión de GUS en plantas y el correspondiente molde de amplicón de construcción de plásmido y secuencia EXP

ID del amplicón: Molde del amplicón Secuencia EXP SEQ ID NO:

PCR0145942: pMON25455 EXP-Os.Act1:1:9 179

PCR0145944: pMON81552 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 170

PCR0145892: pMON136264 EXP-ANDge.Ubq 1:1:7 5

PCR0145815: pMON136264 EXP-ANDge.Ubq1:1:10 10

PCR0145893: pMON136259 EXP-ANDge.Ubq1:1:6 12

PCR0145817: pMON136264 EXP-ANDge.Ubq1:1:11 14

PCR0145819: pMON136264 EXP-ANDge.Ubq1:1:12 16

PCR0145896: pMON136263 EXP-ERIra.Ubq1:1:9 22

PCR0145820: pMON136263 EXP-ERIra.Ubq1:1:10 25

PCR0145897: pMON136258 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 27

PCR0145821: pMON136263 EXP-ERIra.Ubq1:1:11 29

PCR0145822: pMON136263 EXP-ERIra.Ubq1:1:12 31

PCR0145922: pMON140889 EXP-Cl.Ubq1:1:10 98

PCR0145945: pMON140889 EXP-Cl.Ubq1:1:13 114

PCR0145946: pMON140889 EXP-Cl.Ubq1:1:14 115

PCR0145947: pMON140889 EXP-Cl.Ubq1:1:15 116

Los amplicones del casete GUS y plásmidos de luciferasa de control usados para la transformación de protoplastos de caña de azúcar fueron los mismos que los que se presentan en los Ejemplos 2 a 4 y se proporcionan en la Tabla

25 7 anterior en el Ejemplo 3. Asimismo, se usaron controles negativos para la determinación del fondo de GUS y luciferasa, como se ha descrito anteriormente. La Tabla 28 enumera la actividad media de GUS y Luc observada en las células transformadas de protoplastos foliares de caña de azúcar, y la Tabla 29 muestra las proporciones de expresión de GUS/RLuc en protoplastos foliares de caña de azúcar.

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Secuencia EXP: SEQ ID NO: GUS RLuc FLuc

EXP-Os.Act1:1:9: 179 6667,5 3024,5 1129,25

EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1: 170 14872,8 5171 2019,5

EXP-ANDge.Ubq 1:1:7: 5 15225 4618,25 1775,75

EXP-ANDge.Ubq1:1:10: 10 17275,3 4333 1678

EXP-ANDge.Ubq 1:1:6: 12 17236 5633,25 2240

EXP-ANDge.Ubq 1:1:11: 14 22487,8 6898,25 2878

EXP-ANDge.Ubq 1:1:12: 16 22145,3 6240,25 2676,5

EXP-ERIra.Ubq1:1:9: 22 16796,5 7759,75 3179

EXP-ERIra.Ubq1:1:10: 25 16267,5 5632,75 2436,75

EXP-ERIra.Ubq1:1:8: 27 25351 9019,5 4313,5

EXP-ERIra.Ubq1:1:11: 29 16652,3 3672,25 1534

EXP-ERIra.Ubq1:1:12: 31 12654,5 3256,75 1261,5

EXP-Cl.Ubq1:1:10: 98 22383,8 7097,5 3109,25

EXP-Cl.Ubq1:1:13: 114 14532,3 2786,5 1198,25

EXP-Cl.Ubq1:1:14: 115 19244,5 3455,25 1475

EXP-Cl.Ubq1:1:15: 116 6676,5 3870,25 1497,75

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Como se puede observar en la Tabla 29 anterior, todas las secuencias EXP EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP5 ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXPCl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) y EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) fueron capaces de dirigir la expresión transgénica en los protoplastos de caña de azúcar. Las secuencias EXP EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8

10 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114) y EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) expresaron GUS a mayor nivel que EXP-CaMV.35Senh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) en este experimento.

Ejemplo 6: Análisis de elementos reguladores que dirigen CP4 en protoplastos de maíz

El presente ejemplo ilustra la capacidad de EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO:

15 132), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151) y EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) en la dirección de la expresión del gen de tolerancia al glifosato CP4 en protoplastos de maíz. Se clonaron estas secuencias EXP en construcciones de plásmido de transformación binaria en plantas usando

20 procedimientos conocidos en la técnica. Los vectores de expresión en plantas resultantes contenían una región de borde derecho de A. tumefaciens, una secuencia EXP de ubiquitina unida operativamente en 5’ a la secuencia codificante de EPSPS tolerante al glifosato dirigida a un plástido (CP4, US RE39247), unida operativamente en 5’ a la UTR de 3’ de T-AGRtu.nos-1:1:13 y una región de borde izquierdo de A. tumefaciens (B-AGRtu.borde izquierdo). Las construcciones de plásmido resultantes se usaron para transformar células de protoplastos foliares del maíz

25 usando procedimientos conocidos en la técnica.

Se utilizaron las construcciones de plásmido enumeradas en la Tabla 30, con las secuencias EXP definidas en la Tabla 1. Se construyeron tres plásmidos de control (pMON30098, pMON42410 y pMON30167), con elementos reguladores constitutivos conocidos que dirigían bien CP4 o GFP, y se usaron para comparar los niveles de expresión de CP4 relativos dirigidos por estas secuencias EXP con la expresión de CP4 dirigida por elementos de

30 expresión constitutivos conocidos. También se usaron otros dos plásmidos (pMON19437 y pMON63934) según lo descrito anteriormente para evaluar la eficiencia y viabilidad de las transformaciones. Cada plásmido contiene una secuencia de codificación de la luciferasa específica dirigida por una secuencia EXP constitutiva.

Se transformaron protoplastos foliares de maíz usando un procedimiento de transformación basado en PEG, según lo descrito en el Ejemplo 2 anterior. Se realizaron mediciones tanto de CP4 como de la luciferasa de manera similar

35 al Ejemplo 2 anterior. En la siguiente Tabla 30, se muestran los niveles medios de expresión de proteína CP4 expresados como partes por millón (ppm).

Tabla 30. Expresión media de proteína CP4 en protoplastos foliares de maíz

Plásmido: Secuencia EXP SEQ ID NO: Media de CP4 ppm DT de CP4 ppm

No ADN
No ADN: 0 0

pMON30098: GFP 0 0

pMON42410: EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 163 34,1 15,6

pMON30167: EXP-Os.Act1:1:1 164 40,4 11,6

pMON129203: EXP-Sv.Ubq1:1:7 128 45,2 6,2

pMON129204: EXP-Sv.Ubq1:1:8 132 101,9 13,8

pMON129205: EXP-Sv.Ubq1:1:9 133 71,1 8,7

pMON129210: EXP-Zm.UbqM1:1:6 137 137,1 14,8

pMON129211: EXP-Zm.UbqM1:1:8 145 136,5 12,3

pMON129212: EXP-Zm.UbqM1:1:7 141 170,2 18,1

pMON129200: EXP-SETit.Ubq1:1:5 117 44,3 9,5

pMON129201: EXP-SETit.Ubq1:1:7 123 105,1 8,4

imagen48

(continuación)

Plásmido: Secuencia EXP SEQ ID NO: Media de CP4 ppm DT de CP4 ppm

pMON129202: EXP-SETit.Ubq1:1:6 124 124,9 33,7

pMON129219: EXP-Sb.Ubq4:1:2 151 14,3 1

pMON129218: EXP-Sb.Ubq6:1:2 153 75,7 8,9

Como se puede observar en la Tabla 30, EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 132), EXPSv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145), EXPZm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO:

5 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124) y EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) dirigieron la expresión del transgén CP4 a niveles cercanos o superiores a los niveles de expresión de CP4 dirigidos por EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 y EXPOs.Act1:1. La secuencia EXP EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151) demostró la capacidad de dirigir la expresión de CP4, pero el nivel de expresión fue inferior al de los controles constitutivos.

También se pueden obtener datos similares a los anteriores en plantas transformadas establemente con

10 construcciones de plásmido descritas anteriormente, por ejemplo, plantas de generaciones de progenie R0, R1 o F1 o posteriores. Asimismo, se estudió la expresión a partir de otras construcciones de plásmido. Por ejemplo, pMON141619, que comprende la secuencia EXP EXP-ANDge.Ubq1:1:8, mientras que pMON142862 está compuesto de la secuencia EXP EXP-ERIra.Ubq1:1:8. Estas construcciones y otras se pueden analizar de esta manera.

15 Ejemplo 7: Análisis de los elementos reguladores que dirigen CP4 en protoplastos de maíz usando amplicones de casete de transgén CP4

El presente ejemplo ilustra la capacidad de EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), 20 EXPERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-C1.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115), EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116), EXP-Cl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) y EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97) en la dirección de la expresión del gen de tolerancia al glifosato CP4 en protoplastos de maíz. Se clonaron estas secuencias EXP en construcciones de plásmido de transformación binaria

25 en plantas. Los vectores de expresión en plantas resultantes se usaron como moldes de amplificación para producir un amplicón de casete transgénico compuesto de una secuencia EXP de ubiquitina unida operativamente en 5’ a la secuencia codificante de EPSPS tolerante al glifosato dirigida a un plástido (CP4, US RE39247), unida operativamente en 5’ a la UTR de 3’ de T-AGRtu.nos-1:1:13 y una región de borde izquierdo de A. tumefaciens. Los amplicones resultantes se usaron para transformar células de protoplastos foliares del maíz.

30 Se transformaron protoplastos foliares de maíz usando un procedimiento de transformación basado en PEG, según lo descrito en el Ejemplo 2 anterior. Las mediciones de ambos CP4 se realizaron usando un ensayo basado en ELISA. En las siguientes Tablas 31 y 32, se muestran los niveles medios de expresión de proteína CP4 expresados como partes por millón (ppm).

En una primera serie de experimentos, se ensayó la expresión de CP4 dirigida por amplicones compuestos de las

35 secuencias EXP EXPANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXPANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-C1.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14

40 (SEQ ID NO: 115) y EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) en protoplastos foliares de maíz transformados y se compararon con los niveles de expresión de CP4 dirigida por los controles constitutivos EXP-CaMV.35Senh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) y EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164). En la siguiente Tabla 31, se muestran los niveles medios de expresión de proteína CP4 expresados como partes por millón (ppm).

Tabla 31. Expresión media de proteína CP4 en protoplastos foliares de maíz

Molde de amplicón: ID de amplicón Secuencia EXP SEQ ID NO: Media de proteína CP4total ng/mg DT de proteínaCP4 total ng/mg

No ADN: 0,0 0,0

pMON30098: GFP (control negativo) 0,0 0,0

imagen49

(continuación)

pMON19469: PCR24 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 170 605,5 27,6

pMON30167: PCR25 EXP-Os.Act1:1:1 164 50,6 14,2

pMON140896: PCR41 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 5 459,0 60,9

pMON140917: PCR42 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 8 258,2 38,4

pMON140897: PCR43 EXP-ANDge.Ubq1:1:10 10 324,8 21,6

pMON140898: PCR44 EXP-ANDge.Ubq1:1:6 12 394,9 66,4

pMON140899: PCR45 EXP-ANDge.Ubq1:1:11 14 508,7 89,6

pMON140900: PCR46 EXP-ANDge.Ubq1:1:12 16 329,3 14,5

pMON140904: PCR50 EXP-ERIra.Ubq1:1:9 22 148,6 24,4

pMON140905: PCR51 EXP-ERIra.Ubq1:1:10 25 215,8 22,6

pMON140906: PCR52 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 27 376,6 44,1

pMON140907: PCR53 EXP-ERIra.Ubq1:1:11 29 459,9 104,7

pMON140908: PCR54 EXP-ERIra.Ubq1:1:12 31 221,6 15,9

pMON140913: PCR19 EXP-Cl.Ubq1:1:10 98 287,8 50,9

pMON140914: PCR20 EXP-Cl.Ubq1:1:13 114 585,8 47,9

pMON140915: PCR21 EXP-Cl.Ubq1:1:14 115 557,5 76,6

pMON140916: PCR22 EXP-Cl.Ubq1:1:15 116 33,2 9,5

Como se puede observar en la Tabla 31 anterior, las secuencias EXP EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXPANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXPANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ 5 ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) y EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) fueron capaces de dirigir la expresión de CP4. Todas las secuencias EXP a excepción de una, EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116), dirigieron niveles de expresión de CP4 a un nivel mucho mayor que el control constitutivo, EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID

10 NO: 164). Los niveles de expresión fueron inferiores a los de EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170).

En una segunda serie de experimentos, se ensayó la expresión de CP4 dirigida por amplicones compuestos de las secuencias EXP EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) y EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97) en protoplastos foliares de maíz transformados y se comparó con los niveles de expresión de CP4 dirigida por el control constitutivo, EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164). En la siguiente Tabla 32, se muestran los

15 niveles medios de expresión de proteína CP4 expresados como partes por millón (ppm).

Tabla 32. Expresión media de proteína CP4 en protoplastos foliares de maíz

Molde de amplicón: ID de amplicón Secuencia EXP SEQ ID NO: Media de CP4 foliar de maíz mg/proteínatotal DT de CP4 foliar de maíz mg/proteínatotal

pMON30167: PCR25 EXP-Os.Act1:1:1 164 12,2 1,69

pMON140913: PCR19 EXP-Cl.Ubq1:1:10 98 307,5 24,21

pMON142748
pMON142748: EXP-Cl.Ubq1:1:16 93 245,95 30,14

pMON142749
pMON142749: EXP-Cl.Ubq1:1:17 97 302,85 25,32

Como se puede observar en la Tabla 32 anterior, las secuencias EXP EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXPCl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) y EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97) fueron capaces de dirigir la expresión de CP4.

58

imagen50

Los niveles de expresión dirigidos por las tres secuencias EXP fueron superiores a los del control constitutivo, EXPOs.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164).

Ejemplo 8: Análisis de los elementos reguladores que dirigen CP4 en protoplastos de trigo

5 132), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 123), EXP-SETitUbq1:1:6 (SEQ ID NO: 124), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151) y EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) para dirigir la expresión de CP4 en protoplastos foliares de trigo. Se clonaron estas secuencias EXP en construcciones de plásmido de transformación binaria en plantas usando procedimientos conocidos en la

10 técnica, y según lo descrito en los Ejemplos 2 y 5 anteriores.

Los tres plásmidos de control (pMON30098, pMON42410, como el descrito previamente, y pMON43647 que comprende una región de borde derecho de Agrobacterium tumefaciens con EXP-Os.Act1+CaMV.35S.2xA1B3+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 138) unida operativamente en 5’ a una secuencia codificante de la tolerancia al glifosato dirigida a un plástido (CP4, US RE39247), unida operativamente en 5’ a T-AGRtu.nos-1:1:13, y una región

15 de borde izquierdo (B-AGRtu.borde izquierdo) con elementos reguladores constitutivos conocidos que dirigían bien CP4 o GFP se construyeron como se explica resumidamente en el Ejemplo 5.

Se transformaron protoplastos foliares de trigo usando procedimientos de transformación basados en PEG como se describe en los ejemplos previos, a excepción de que se usaron 1,5 x 105 células de protoplasto por ensayo. Los ensayos de expresión transgénica de luciferasa y CP4 se realizaron como se describe en el Ejemplo 6 anterior. Los

20 niveles de expresión medios de CP4 determinados por ELISA de CP4 se presentan en la siguiente Tabla 34.

Tabla 34. Expresión media de proteína CP4 en células de protoplastos foliares de trigo

Plásmido: Secuencia EXP SEQ ID NO: Media de CP4 ppm DT de CP4 ppm

No ADN
No ADN: 0 0

pMON30098: GFP 0 0

pMON43647: EXP-Os.Act1+CaMV.35S.2xA1-B3+Os.Act1:1:1 172 656,2 124,5

pMON42410: EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 163 438,3 78,9

pMON30167: EXP-Os.Act1:1:1 164 583 107,4

pMON129203: EXP-Sv.Ubq1:1:7 128 156,9 25,1

pMON129204: EXP-Sv.Ubq1:1:8 132 39,5 7

pMON129205: EXP-Sv.Ubq1:1:9 133 154,5 56,5

pMON129210: EXP-Zm.UbqM1:1:6 137 1500 0

pMON129211: EXP-Zm.UbqM1:1:8 145 199,7 64,9

pMON129212: EXP-Zm.UbqM1:1:7 141 234,6 66,9

pMON129200: EXP-SETit.Ubq1:1:5 117 725,7 149,7

pMON129201: EXP-SETit.Ubq1:1:7 123 64,9 14,5

pMON129202: EXP-SETit.Ubq1:1:6 124 122,9 48,7

pMON129219: EXP-Sb.Ubq4:1:2 151 113,1 32,8

La cantidad total de expresión de CP4 en protoplastos de trigo dirigidos por secuencias EXP y la secuencia EXP constitutiva EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 demostró diferentes niveles de expresión de CP4 en protoplastos de trigo en comparación con los protoplastos de maíz.

25 Varias secuencias EXP dirigieron la expresión de CP4 a niveles más bajos en protoplastos de trigo que las secuencias EXP constitutivas conocidas EXP EXP-Os.Act1+CaMV.35S.2xA1-B3+Os.Act1:1:1 y EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1. Dos secuencias EXP EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137) y EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), proporcionan niveles de expresión más altos de CP4 en protoplastos de trigo que las secuencias EXP constitutivas conocidas en este ensayo. EXP-Zm.UbqM1:1:2 dirigió la expresión de CP4 a niveles más altos,

30 siendo los niveles de expresión de 2,2 a 3,4 veces superiores a los de EXP-Os.Act1+CaMV.35S.2xA1B3+Os.Act1:1:1 y EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1, respectivamente. Todas las secuencias EXP ensayadas demostraron la capacidad de dirigir la expresión de CP4 en células de trigo.

imagen51

Ejemplo 9: Análisis de elementos reguladores que dirigen CP4 en protoplastos de trigo usando amplicones de casete de transgén GUS

El presente ejemplo ilustra la capacidad de EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 5 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXPERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115), EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116), EXP-Cl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) y EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97) en la dirección de la expresión del gen de tolerancia al glifosato CP4 en 10 protoplastos de trigo. Se clonaron estas secuencias EXP en construcciones de plásmido de transformación binaria en plantas. Los vectores de expresión en plantas resultantes se usaron como moldes de amplificación para producir un casete transgénico de amplicón compuesto de una secuencia EXP de ubiquitina unida operativamente en 5’ a la secuencia codificante de EPSPS tolerante al glifosato dirigida a un plástido (CP4, US RE39247), unida operativamente en 5’ a la UTR de 3’ de T-AGRtu.nos-1:1:13 y una región de borde izquierdo de A. tumefaciens. Los

15 amplicones resultantes se usaron para transformar células de protoplastos foliares del maíz.

Se transformaron protoplastos foliares de trigo usando un procedimiento de transformación basado en PEG, según lo descrito en el Ejemplo 2 anterior. Las mediciones de ambas CP4 se realizaron usando un ensayo basado en ELISA. En las siguientes Tablas 35 y 36, se muestran los niveles medios de expresión de proteína CP4 expresados como partes por millón (ppm).

20 En la primera serie de experimentos, se ensayó la expresión de CP4 dirigida por amplicones compuestos de las secuencias EXP EXPANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXPANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12

25 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) y EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) en protoplastos foliares de trigo transformados, y se comparó con los niveles de expresión de CP4 dirigida por los controles constitutivos EXP-CaMV.35Senh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) y EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164). En la siguiente Tabla 35, se muestran los niveles medios de expresión de proteína CP4 expresados como partes por millón (ppm).

30 Tabla 35. Expresión media de proteína CP4 en protoplastos foliares de trigo

No ADN: 0,0 0,0

pMON30098: GFP (control negativo) 0,0 0,0

pMON19469: PCR24 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 170 76,11 18,65

pMON30167: PCR25 EXP-Os.Act1:1:1 164 3,83 0,73

pMON140896: PCR41 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 5 103,46 16,31

pMON140917: PCR42 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 8 61,48 1,99

pMON140897: PCR43 EXP-ANDge.Ubq1:1:10 10 62,65 4,58

pMON140898: PCR44 EXP-ANDge.Ubq1:1:6 12 48,74 3,09

pMON140899: PCR45 EXP-ANDge.Ubq1:1:11 14 54,91 3,50

pMON140900: PCR46 EXP-ANDge.Ubq1:1:12 16 42,81 5,97

pMON140904: PCR50 EXP-ERIra.Ubq1:1:9 22 31,26 1,69

pMON140905: PCR51 EXP-ERIra.Ubq1:1:10 25 49,82 5,96

pMON140906: PCR52 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 27 37,43 4,52

pMON140907: PCR53 EXP-ERIra.Ubq1:1:11 29 27,17 0,96

pMON140908: PCR54 EXP-ERIra.Ubq1:1:12 31 17,41 4,13

pMON140913: PCR19 EXP-Cl.Ubq1:1:10 98 66,66 13,45

imagen52

(continuación)

pMON140914: PCR20 EXP-Cl.Ubq1:1:13 114 79,42 10,74

pMON140915: PCR21 EXP-Cl.Ubq1:1:14 115 75,53 9,32

pMON140916: PCR22 EXP-Cl.Ubq1:1:15 116 0,00 0,00

Como se puede observar en la Tabla 31 anterior, las secuencias EXP EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXPANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXPANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ 5 ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) y EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) fueron capaces de dirigir la expresión de CP4. Todas las secuencias EXP a excepción de una, EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116), dirigieron niveles de expresión de CP4 a un nivel mucho mayor que el control constitutivo EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID

10 NO: 164). Los niveles de expresión fueron aproximadamente iguales o inferiores a los de EXP-CaMV.35Senh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) para la mayoría de las secuencias EXP.

En una segunda serie de experimentos, se ensayó la expresión de CP4 dirigida por amplicones compuestos de secuencias EXP EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) y EXP-Cl.Ubq1:1:17 15 (SEQ ID NO: 97) en protoplastos foliares transformados de trigo, y se comparó con los niveles de expresión dirigidos

15 por el control constitutivo EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164). En la siguiente Tabla 32, se muestran los niveles medios de expresión de proteína CP4 expresados como partes por millón (ppm).

Tabla 36. Expresión media de proteína CP4 en protoplastos foliares de trigo

pMON30167: PCR25 EXP-Os.Act1:1:1 164 15,84 2,12

pMON140913: PCR19 EXP-Cl.Ubq1:1:10 98 736,32 79,56

pMON142748
pMON142748: EXP-Cl.Ubq1:1:16 93 593,72 80,22

pMON142749
pMON142749: EXP-Cl.Ubq1:1:17 97 763,95 86,94

Como se puede observar en la Tabla 36 anterior, las secuencias EXP EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXPCl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) y EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97) fueron capaces de dirigir la expresión de CP4.

20 Los niveles de expresión dirigidos por las tres secuencias EXP fueron superiores a las del control constitutivo EXPOs.Act1:1:1 (SEQ NO: 164).

Ejemplo 10: Análisis de elementos reguladores que dirigen CP4 en protoplastos de caña de azúcar

El presente ejemplo ilustra la capacidad de EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 132), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID 25 NO: 145), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151), EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) y EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) en la dirección de la expresión de CP4 en protoplastos foliares de caña de azúcar. Las secuencias EXP se clonaron en construcciones de plásmido de transformación binaria en plantas. Los vectores resultantes contenían una región de borde derecho de Agrobacterium tumefaciens, 30 una secuencia EXP de ubiquitina unida operativamente en 5’ a la secuencia codificante de EPSPS tolerante al glifosato dirigida a un plástido (CP4, US RE39247), unida operativamente en 5’ a la UTR de 3’ de T-AGRtu.nos

1:1:13 (SEQ ID NO: 127) o T-CaMV.35S-1:1:1 (SEQ ID NO: 140) y una región de borde izquierdo de A. tumefaciens (B-AGRtu.borde izquierdo). Las construcciones de plásmido resultantes se usaron para transformar células de protoplastos foliares de caña de azúcar usando un procedimiento de transformación basado en PEG.

35 Las construcciones de plásmido pMON129203, pMON12904, pMON12905, pMON129210, pMON129211, pMON129212, pMON129200, pMON129201, pMON129202, pMON129219 y pMON129218 son como se describen en la Tabla 12 anterior.

imagen53

Se construyeron tres plásmidos de control (pMON30167 descrito anteriormente; pMON130803 que también comprende EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164); y pMON132804 que comprende EXP-P-CaMV.35S-enh-1:1:13/LCaMV.35S-1:1:2/I-Os.Act1-1:1:19 (SEQ ID NO: 139), con elementos reguladores constitutivos conocidos que dirigían CP4, y se usaron para comparar los niveles relativos de expresión de CP4 dirigida por las secuencias EXP de ubiquitina enumeradas en la siguiente Tabla 37.

Se transformaron protoplastos foliares de caña de azúcar usando un procedimiento de transformación basado en PEG. En la siguiente Tabla 37, se presentan los niveles medios de expresión de CP4 determinados mediante ELISA de CP4.

imagen54

imagen55

Como se puede observar en la Tabla 37 anterior, las secuencias EXP demostraron la capacidad de dirigir la expresión la expresión de CP4 en protoplastos de caña de azúcar. Los niveles de expresión fueron similares o superiores a los de la expresión de CP4 dirigida por EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164). Una secuencia EXP, EXPZm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145), demostró niveles superiores de expresión en comparación con EXP-P

5 CaMV.35S-enh-1:1:13/L-CaMV.35S-1:1:2/I-Os.Act1-1:1:19 (SEQ ID NO: 139) en protoplastos de caña de azúcar.

Ejemplo 11: Análisis de elementos reguladores que dirigen CP4 en protoplastos de caña de azúcar usando amplicones de casete de transgén CP4

El presente ejemplo ilustra la capacidad de EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:1 10 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXPERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) y EXP-C1.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) en la dirección de la expresión del gen de tolerancia al glifosato CP4 en protoplastos de caña de azúcar. Se clonaron estas secuencias EXP en 15 construcciones de plásmido de transformación binaria en plantas. Los vectores de expresión en plantas resultantes se usaron como moldes de amplificación para producir un amplicón de casete transgénico compuesto de una secuencia EXP de ubiquitina unida operativamente en 5’ a la secuencia codificante de EPSPS tolerante al glifosato dirigida a un plástido (CP4, US RE39247), unida operativamente en 5’ a la UTR de 3’ de T-AGRtu.nos-1:1:13 y una región de borde izquierdo de A. tumefaciens. Se usaron los amplicones resultantes para transformar células de

20 protoplasto foliar de caña de azúcar.

Se transformaron protoplastos foliares de caña de azúcar usando un procedimiento de transformación basado en PEG, según lo descrito en el Ejemplo 2 anterior. Las mediciones de ambas CP4 se realizaron usando un ensayo basado en ELISA.

Se ensayó la expresión de CP4 dirigida por amplicones compuestos de las secuencias EXP EXP-ANDge.Ubq1:1:7

25 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXPANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-C1.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) y EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ

30 ID NO: 116) en protoplastos foliares de trigo transformados y se compararon con los niveles de expresión de CP4 dirigidos por los controles constitutivos, EXPCaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) y EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164). En la siguiente Tabla 38, se muestran los niveles medios de expresión de proteína CP4 expresados como partes por millón (ppm).

Tabla 38. Expresión media de proteína CP4 en protoplastos foliares de caña de azúcar

Molde de amplicón: ID de amplicón Secuencia EXP SEQ ID NO: Media de proteína CP4total ng/mg DT de proteína CP4 total ng/mg

pMON19469: PCR24 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 170 99,6 7,2

pMON30167: PCR25 EXP-Os.Act1:1:1 164 0,0 0,0

pMON140896: PCR41 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 5 21,9 3,3

pMON140917: PCR42 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 8 15,4 1,9

pMON140897: PCR43 EXP-ANDge.Ubq1:1:10 10 20,7 2,2

pMON140898: PCR44 EXP-ANDge.Ubq1:1:6 12 21,8 2,8

pMON140899: PCR45 EXP-ANDge.Ubq1:1:11 14 36,9 7,2

pMON140900: PCR46 EXP-ANDge.Ubq1:1:12 16 51,7 5,6

pMON140904: PCR50 EXP-ERIra.Ubq1:1:9 22 10,3 1,1

pMON140905: PCR51 EXP-ERIra.Ubq1:1:10 25 25,3 4,7

pMON140906: PCR52 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 27 29,9 4,6

pMON140907: PCR53 EXP-ERIra.Ubq1:1:11 29 44,0 7,1

pMON140908: PCR54 EXP-ERIra.Ubq1:1:12 31 37,0 5,4

imagen56

(continuación)

pMON140913: PCR19 EXP-Cl.Ubq1:1:10 98 19,2 1,3

pMON140914: PCR20 EXP-Cl.Ubq1:1:13 114 20,5 2,1

pMON140915: PCR21 EXP-Cl.Ubq1:1:14 115 23,2 1,6

pMON140916: PCR22 EXP-Cl.Ubq1:1:15 116 0,0 0,0

Como se puede observar en la Tabla 38 anterior, las secuencias EXP EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXPANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXPANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ

5 ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERlra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114) y EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) fueron capaces de dirigir la expresión de CP4. EXPCl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) no pareció expresar la expresión de CP4 en dicho ensayo.

Ejemplo 12: Análisis de elementos reguladores que dirigen GUS en maíz transgénico

10 Se transformaron las plantas de maíz con vectores de expresión en plantas que contenían secuencias EXP que dirigen la expresión del transgén β-glucuronidasa (GUS), y se analizaron las plantas resultantes para determinar la expresión de la proteína GUS. Se clonaron las secuencias EXP de ubiquitina en construcciones de plásmido de transformación binaria de plantas usando procedimientos conocidos en la técnica.

Los vectores de expresión en plantas resultantes contenían una región de borde derecho de A. tumefaciens, un

15 primer casete transgénico para ensayar la secuencia EXP unida operativamente a una secuencia codificante de βglucuronidasa (GUS) que posee el intrón procesable GUS-2, descrito anteriormente, unido operativamente en 5’ a la UTR de 3’ del gen de proteína de transferencia lipídica del arroz (T-Os.LTP-1:1:1, SEQ ID NO: 141); un segundo casete de selección transgénico usado para la selección de células vegetales transformadas que confiere resistencia al herbicida glifosato (dirigido por el promotor Actina 1 del arroz) y una región de borde izquierdo de A. tumefaciens.

20 Se usaron los plásmidos resultantes para transformar plantas de maíz. La Tabla 39 enumera las designaciones de los plásmidos, las secuencias EXP y las SEQ ID NO, que también se han descrito en la Tabla 1.

Tabla 39. Plásmidos de transformación binaria en plantas y las secuencias EXP asociadas

Construcción de plásmido: Secuencia EXP SEQ ID NO: Datos

pMON142865: EXP-ANDge.Ubq1:1:8 8 R0 y R1

pMON142864: EXP-ERIra.Ubq1:1:8 27 R0 y R1

pMON142729: EXP-Cl.Ubq1:1:12 90 R0

pMON142730: EXP-Cl.Ubq1:1:11 95 R0

pMON132047: EXP-Cl.Ubq1:1:23 108 R0

pMON132037: EXP-SETit.Ubq1:1:10 119 R0 y F1

pMON131957: EXP-SETit.Ubq1:1:11 125 F1

pMON131958: EXP-Sv.Ubq1:1:11 130 R0 y F1

pMON131959: EXP-Sv.Ubq1:1:12 136 R0

pMON131961: EXP-Zm.UbqM1:1:10 139 R0

pMON131963: EXP-Zm.UbqM1:1:12 143 R0

pMON131962: EXP-Zm.UbqM1:1:11 149 R0

pMON132932: EXP-Sb.Ubq4:1:2 151 R0

pMON132931: EXP-Sb.Ubq6:1:3 155 R0

pMON132974: EXP-Sb.Ubq7:1:2 157 R0 y F1

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Se transformaron plantas usando transformaciones mediadas por Agrobacterium, por ejemplo, como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. 20090138985.

Se usó el análisis histoquímico de GUS para el análisis de la expresión cualitativa de las plantas transformadas. Se incubaron secciones tisulares completas con solución de tinción de GUS X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b5 glucurónido) (1 miligramo/mililitro) durante un tiempo apropiado, se aclararon y se examinaron visualmente para determinar la coloración azul. Se determinó cualitativamente la actividad de GUS mediante el examen visual directo

o la inspección bajo el microscopio usando órganos y tejidos vegetales seleccionados. Se examinaron las plantas R0 para determinar la expresión en raíces y hojas, así como en la antera, la seda y las semillas en desarrollo y los embriones de 21 días después de la polinización (21 DDP).

10 Para los análisis cuantitativos, se extrajo la proteína total de los tejidos seleccionados de las plantas de maíz transformadas. Se usó un microgramo de proteína total con el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-β-Dglucurónido (MUG) en un volumen de reacción total de 50 microlitros. El producto de reacción 4-metilumbeliferona (4-MU), es máximamente fluorescente a un pH alto, cuando se ioniza el grupo hidroxilo. La adición de una solución básica de carbonato sódico detiene simultáneamente el ensayo y ajusta el pH para la cuantificación del producto

15 fluorescente. Se midió la fluorescencia con una excitación a 365 nm, emisión a 445 nm usando un Fluoromax-3 (Horiba; Kioto, Japón) con un Lector Micromax, con la amplitud de hendidura ajustado a una excitación de 2 nm y una emisión de 3 nm.

La expresión media de GUS R0 observada para cada transformación se presenta en las siguientes Tablas 40 y 41. El ensayo de GUS R0 realizado en los transformantes transformados con pMON131957 (EXP-SETit.Ubq1:1:11, SEQ

20 ID NO: 125) no pasó los controles de calidad. Estos transformantes se ensayaron en la generación F1 y se presentan además posteriormente en el presente ejemplo.

Tabla 40. Expresión media de GUS R0 en tejido radicular y foliar

Secuencia EXP: SEQ ID NO: Raíz en V3 Raíz en V4 Raíz en V7 Raíz en VT Hoja en V3 Hoja en V4 Hoja en V7 Hoja en VT

EXP-ANDge.Ubq1:1:8: 8 nd 255 199 70 nd 638 168 130

EXP-ERIra.Ubq1:1:8: 27 nd 477 246 62 nd 888 305 242

EXP-C1.Ubq1:1:12: 90 nd 27 147 52 nd 75 189 199

EXP-C1.Ubq1:1:11: 95 nd 28 77 50 nd 101 177 223

EXP-C1.Ubq1:1:23: 108 0 nd 75 34 201 nd 194 200

EXP-SETit.Ubq1:1:10: 119 0 nd 29 57 58 nd 37 46

EXP-Sv.Ubq1:1:11: 130 nd nd nd 9 20 nd 55 29

EXP-Sv.Ubq1:1:12: 136 63 nd 0 28 184 nd 27 16

EXP-Zm.UbqM1:1:10: 139 0 nd 237 18 221 nd 272 272

EXP-Zm.UbqM1:1:12: 143 0 nd 21 43 234 nd 231 196

EXP-Zm.UbqM1:1:11: 149 124 nd 103 112 311 nd 369 297

EXP-Sb.Ubq4:1:2: 151 125 nd 0 95 233 nd 150 88

EXP-Sb.Ubq6:1:3: 155 154 nd 13 128 53 nd 39 55

EXP-Sb.Ubq7:1:2: 157 37 nd 22 18 165 nd 89 177

Tabla 41. Expresión media de GUS R0 en órganos reproductores del maíz (antera, seda) y semillas endesarrollo (embrión y endospermo)

Secuencia EXP: SEQ ID NO: Antera en VT Seda en VT/R1 Embrión 31 DDP Endospermo 21DDP

EXP-ANDge.Ubq1:1:8: 8 247 256 24 54

EXP-ERIra.Ubq1:1:8: 27 246 237 36 61

EXP-C1.Ubq1:1:12: 90 420 121 26 220

EXP-C1.Ubq1:1:11: 95 326 227 41 221

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40 (continuación)

EXP-C1.Ubq1:1:23: 108 598 416 212 234

EXP-SETit.Ubq1:1:10: 119 132 85 50 63

EXP-Sv.Ubq1:1:11: 130 217 3 45 92

EXP-Sv.Ubq1:1:12: 136 120 21 49 112

EXP-Zm.UbqM1:1:10: 139 261 506 403 376

EXP-Zm.UbqM1:1:12: 143 775 362 253 247

EXP-Zm.UbqM1:1:11: 149 551 452 234 302

EXP-Sb.Ubq4:1:2: 151 213 0 25 79

EXP-Sb.Ubq6:1:3: 155 295 87 51 61

EXP-Sb.Ubq7:1:2: 157 423 229 274 90

En las plantas de maíz R0, los niveles de expresión de GUS en las hojas y raíces se diferenciaban entre las secuencias EXP de ubiquitina. Aunque todas las secuencias EXP demostraron la capacidad para dirigir la expresión del transgén GUS en plantas transformadas establemente, cada secuencia EXP demostró un patrón único de expresión con respecto al resto. Por ejemplo, se observaron altos niveles de expresión de GUS en estadios tempranos del desarrollo de las raíces (V4 y V7) para EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8) y EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), y descendieron para el estadio VT. La expresión en la raíz dirigida por EXP-Zm.UbqM1:1:10 (SEQ ID NO: 139) demostró la falta de expresión en V3, pero fue alta en V7 y luego cayó en el estadio VT. La expresión en la raíz dirigida por EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149) se mantuvo a un nivel similar a lo largo del desarrollo desde los estados V3, V7 a VT. Se observó un aumento de expresión en la raíz desde el estadio de desarrollo temprano (V3/V4) a V7, y luego cayó desde el estadio V7 a V8 en plantas transformadas con EXP-Cl.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 90), EXP-Cl.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 95) y EXP-Cl.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108). Los niveles de expresión de GUS también mostraron diferencias drásticas en el tejido foliar. Se transmitieron niveles de expresión foliar más elevados en el desarrollo temprano (V3/V4) con EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8) y EXPERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) que se redujeron en el estadio V7 hasta VT. La expresión de GUS se mantuvo desde el estadio V3 hasta VT usando EXP-Zm.UbqM1:1:10 (SEQ ID NO: 139), EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149), EXP-Zm.UbqM1:1:12 (SEQ ID NO: 143) y EXP-Cl.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108); y en menor grado usando EXP-SETit.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 119) y EXP-Sb.Ubq6:1:3 (SEQ ID NO: 155). La expresión en la hoja aumentó desde el estadio V3 a V7 a VT usando EXP-Cl.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 90), EXP-Cl.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 95) y EXP-Cl.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108), mientras que la expresión se redujo desde el estadio V3 a VT usando EXPSv.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 136) y EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151).

Asimismo, con respecto a los tejidos reproductores (antera y seda) y las semillas en desarrollo (embrión y endospermo de 21 DDP), se observaron patrones diferentes de expresión únicos para cada secuencia EXP. Por ejemplo, se observaron altos niveles de expresión en la antera y en la seda, así como en las semillas en desarrollo usando EXPZm.UbqM1:1:10 (SEQ ID NO: 139), EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149), EXP-Zm.UbqM1:1:12 (SEQ ID NO: 143) y EXP-Cl.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108). La expresión fue alta en la antera y en la seda, pero baja en las semillas en desarrollo usando EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8) y EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27). La expresión dirigida por EXP-Sb.Ubq7:1:2 (SEQ ID NO: 157) fue alta en los tejidos reproductores y alta en el embrión en desarrollo, pero era inferior en el endospermo en desarrollo. La secuencia EXP EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151) solo demostró expresión en la antera, pero no en la seda, y expresó mucho menos en las semillas en desarrollo. La EXP-Sv.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 130) demostró un patrón similar a EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151) con respecto a los tejidos reproductores y las semillas en desarrollo, pero mientras que EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151) mostró expresión en tejidos radicales y foliares, EXP-Sv.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 130) expresó mucho menos en estos mismos tejidos.

Se cruzó la generación de transformantes R0, seleccionados para inserciones de una sola copia, con una línea no transgénica LH244 (produciendo F1) o se autopolinizaron (produciendo R1) con el fin de producir una población de semillas F1 o R1. En cada caso, se seleccionaron plantas heterocigóticas F1 o R1 para el estudio. Se midieron los niveles de expresión de GUS en tejidos seleccionados en el transcurso del desarrollo como se ha descrito anteriormente. Los tejidos F1 o R1 usados para este estudio incluían: embriones de semillas embebidas, endospermos de semillas embebidas, raíces y coleoptilos de 4 días después de la germinación (DDG); hojas y raíces del estadio V3; raíces y hojas maduras del estadio V8; raíces, hojas maduras, anteras del estadio VT (en la formación de panícula, antes de la reproducción), polen, hojas y hojas senescentes, mazorca R1, seda, raíz e internodo, semillas 12 días después de la polinización (DDP) y; embrión y endospermo 21 y 38 DDP. También se analizaron muestras de tejido seleccionadas en las plantas F1 expuestas a condiciones de estrés por sequía y frío

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para determinar los transformantes que comprendían pMON132037 (EXP-SETit.Ubq1:1:10, SEQ ID NO: 119), pMON131957 (EXPSETit.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 125), pMON131958 (EXP-Sv.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 130) y pMON132974 (EXP-Sb.Ubq7:1:2, SEQ ID NO: 157). El tejido radical y foliar de V3 se muestreó tras la exposición a la sequía y al frío.

Se indujo estrés por sequía en plantas F1 en estadio V3 transformadas con pMON132037 (EXP-SETit.Ubq1:1:10, SEQ ID NO: 119), pMON131957 (EXP-SETit.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 125), pMON131958 (EXP-Sv.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 130) y pMON132974 (EXP-Sb.Ubq7:1:2, SEQ ID NO: 157) evitando el riego durante 4 días permitiendo que el contenido en agua se redujera en al menos un 50 % del contenido original de agua de la planta con riego completo. El protocolo de sequía comprendía esencialmente las siguientes etapas. Las plantas en estadio V3 se privaron de agua. A medida que las plantas de maíz experimenta la sequía, la forma de la hoja cambia de un aspecto habitual sano y sin plegamientos a una hoja que presenta plegamientos en la vena media del haz vascular y adopta una forma en V si se observa desde el ápice foliar hacia el tallo. Este cambio en la morfología normalmente comenzaba a presentarse aproximadamente 2 días después de cesar el riego, y se observó en los experimentos anteriores que estaba asociado con la pérdida de agua de aproximadamente el 50 % medida por el peso de los tiestos antes del cese del riego y el peso de los tiestos al observarse la morfología rizada de las hojas en plantas no regadas. Las plantas se consideraban en condiciones de sequía cuando las hojas mostraban marchitamiento según lo evidenciado por el rizado hacia dentro (forma de V) de la hoja. Este nivel de estrés se considera una forma de estrés subletal. Una vez que la planta demostraba inducción a la sequía como se ha definido anteriormente, se destruía la planta para adquirir muestras tanto de raíz como de hoja.

Además de la sequía, las plantas F1 en estado V3 transformadas con pMON132037 (EXP-SETit.Ubq1:1:10, SEQ ID NO: 119), pMON131957 (EXP-SETit.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 125), pMON131958 (EXP-Sv.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 130) y pMON132974 (EXP-Sb.Ubq7:1:2, SEQ ID NO: 157) también se expusieron a condiciones de frío para determinar si los elementos reguladores demostraban una expresión de GUS inducida por el frío. Se ensayaron las plantas completas para determinar la inducción de la expresión de GUS bajo estrés por frío en el estadio V3. Se expusieron las plantas de maíz en estadio V3 a una temperatura de 12 ºC en una cámara de crecimiento durante 24 horas. Las plantas en la cámara de crecimiento se cultivaron con un flujo de luz blanca de 800 micromoles por metro cuadrado por segundo con un ciclo de luz de 10 horas de luz blanca y 14 horas de oscuridad. Tras la exposición al frío, se muestrearon los tejidos radicales y foliares para determinar la expresión de GUS cuantitativa.

La expresión de GUS se midió como se ha descrito anteriormente. La media de expresión de GUS en F1 determinada para cada muestra de tejido se presenta en las siguientes Tablas 42 y 43.

Tabla 42. Expresión media de GUS F1 en plantas transformadas con pMON142864 y pMON142865

Órgano: pMON142864 pMON142865

Hoja en V3: 86 74

Raíz en V3: 41 52

Hoja en V8: 109 123

Raíz en V8: 241 252

Flor, anteras en VT: 168 208

Hoja en VT: 158 104

Mazorca en R1: 171 224

Seda en R1: 314 274

Raíz en R1: 721 308

Internodo en R1: 428 364

Semilla en R2-12 DDP: 109 72

Semilla en R3-21 DDP-Embrión: 45 32

Semilla en R3-21 DDP-Endospermo: 175 196

Semilla en R5-38 DDP-Embrión: 163 58

Semilla en R5-38 DDP-Endospermo: 90 69

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Órgano: pMON132037 pMON131957 pMON131958 pMON132974

Embrión de semillas embebidas: 536 285 288 1190

Endospermo de semillas embebidas: 95 71 73 316

Coleoptilo 4 DDG: 218 60 143 136

Raíz 4 DDG: 74 33 101 48

Hoja en V3: 104 120 66 52

Raíz en V3: 74 71 81 194

Hoja en V3 -Frío: 73 15 72 N/D

Raíz en V3 -Frío: 113 44 89 49

Hoja en V3 –Sequía: 97 344 103 157

Raíz en V3 -Sequía: 205 153 129 236

Hoja en V8: 185 142 77 282

Raíz en V8: 33 16 61 28

Flor-Anteras en VT: 968 625 619 888

Hoja en VT: 138 89 132 268

Hoja en VT-en senescencia: 121 100 156 345

Polen en VT: 610 1119 332 4249

Mazorca en R1: 291 70 168 127

Seda en R1: 164 124 167 101

Raíz en R1: 36 39 39 21

Internodo en R1: 255 89 232 141

Semilla en R2 – 12 DDP: 138 170 165 169

Semilla en R3 – Embrión 21 DDP: 94 97 489 389

Semilla en R3 – Endospermo 21 DDP: 57 118 52 217

Semilla en R5 – Embrión 38 DDP: 600 147 377 527

Semilla en R5 – Endospermo 38 DDP: 58 36 57 106

En las plantas de maíz F1, los niveles de expresión de GUS en los diversos tejidos muestreados diferencian entre las

secuencias EXP de ubiquitina. Aunque todas las secuencias EXP demostraron la capacidad de dirigir la expresión

5 del transgén GUS en plantas de maíz F1 transformadas establemente, cada secuencia EXP demostró un patrón de

expresión único con respecto al resto. Por ejemplo, la expresión en la raíz de R1 es aproximadamente el doble para

EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) que para EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8). La expresión de GUS en el

embrión de semillas en desarrollo a los 38 DDP es casi tres veces superior para EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO:

27) que para EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8). Por el contrario, la expresión foliar y radical en los estadios V3 10 y V8 es aproximadamente igual para EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) que para EXP-AND-ge.Ubq1:1:8 (SEQ

ID NO: 8).

La expresión de GUS F1 en semillas embebidas (tejidos de embrión y endospermo) fue mucho más alta en plantas

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transformadas con EXP-Sb.Ubq7:1:2 (SEQ ID NO: 157) que en las transformadas con EXP-SETit.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 119), EXP-SETit.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 125) y EXP-Sv.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 130). La sequía produjo un aumento en la expresión en raíces en V3 en plantas transformadas con EXP-SETit.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 119), EXP-SETit.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 125), EXP-Sv.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 130) y EXP-Sb.Ubq7:1:2 (SEQ ID NO: 5 157), pero solo aumentaba la expresión foliar en plantas transformadas con EXP-SETit.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 125), EXP-Sv.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 130) y EXP-Sb.Ubq7:1:2 (SEQ ID NO: 157). La expresión aumentada en V3 por la sequía fue la mayor usando EXP-SETit.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 125). La expresión en el polen fue mucho mayor en plantas transformadas con EXP-Sb.Ubq7:1:2 (SEQ ID NO: 157) que en las que se transformaron con EXPSETit.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 119), EXP-SETit.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 125) y EXP-Sv.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO:

10 130). La expresión en el internodo en R1 fue la mayor con EXP-SETit.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 119) y EXPSv.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 130) y la menor con EXP-SETit.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 125).

Cada secuencia EXP demostró la capacidad de dirigir la expresión transgénica en plantas de maíz transformadas establemente. Sin embargo, cada secuencia EXP resultó tener un patrón de expresión para cada tejido que era único, ofreciendo la oportunidad de seleccionar la secuencia EXP que proporcionaría la mejor expresión de un

15 transgén específico dependiendo de la estrategia de expresión tisular necesaria para obtener los resultados deseados. El presente ejemplo demuestra que las secuencias EXP aisladas de genes homólogos no se comportan necesariamente de manera equivalente en la planta transformada, y esa expresión solo puede determinarse por medio de investigación empírica de las propiedades de cada secuencia EXP y no se puede predecirse basándose en la homología genética de la que se deriva el promotor.

20 Ejemplo 13: Análisis de elementos reguladores que dirigen CP4 en maíz transgénico

Se transformaron las plantas de maíz con vectores de expresión en plantas que contenían secuencias EXP que dirigen la expresión del transgén CP4, y se analizaron las plantas resultantes para determinar la expresión de la proteína CP4.

Se clonaron las secuencias EXP EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27),

25 EXPC1. Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133) y EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141) en construcciones de plásmido de transformación binaria en plantas. Los vectores resultantes contenían una región de borde derecho de Agrobacterium tumefaciens, una secuencia EXP de ubiquitina unida operativamente en 5’ a la secuencia codificante de EPSPS tolerante al glifosato dirigida a un plástido (CP4, US RE39247), unida operativamente en 5’ a la UTR de 3’ de T-AGRtu.nos-1:1:13 (SEQ ID NO: 127) y una región de borde izquierdo de A.

30 tumefaciens. La siguiente Tabla 44 muestra las construcciones de plásmido que se usan para transformar el maíz y las secuencias EXP correspondientes.

Tabla 44. Construcciones de plásmidos CP4 y secuencias EXP correspondientes usadas para transformar el maíz

Construcción de plásmido: Secuencia EXP SEQ ID NO: Datos

pMON141619: EXP-ANDge.Ubq1:1:8 8 R0 y F1

pMON142862: EXP-ERIra.Ubq1:1:8 27 R0 y P1

pMON129221: EXP-Cl.Ubq1:1:10 98 R0 y P1

pMON129205: EXP-Sv.Ubq1:1:9 133 R0 y P1

pMON129212: EXP-Zm.UbqM1:1:7 141 R0

Los plásmidos resultantes se usaron para transformar plantas de maíz. Se seleccionaron plantas transformadas para

35 una o dos copias del ADN-T insertado y se cultivaron en el invernadero. Se muestrearon tejidos seleccionados de plantas transformadas R0 en estadios de desarrollo específicos y se midieron los niveles de proteína CP4 en los tejidos usando un ensayo ELISA de CP4. La expresión media de CP4 que se observó en cada transformación se presenta en las siguientes Tablas 45 y 46, y gráficamente en la Figura 7.

Tabla 45. Expresión media de CP4 en hojas y raíces en plantas R0 transformadas de maíz

Secuencia EXP: SEQ ID NO: Hoja enV4 Hoja enV7 Hojaen VT Raíz en V4 Raíz en V7 Raíz en VT

EXP-ANDge.Ubq1:1:8: 8 20,90 18,53 25,49 11,50 26,54 17,20

EXP-ERIra.Ubq1:1:8: 27 19,92 16,60 25,58 9,92 26,31 13,33

EXP-C1.Ubq1:1:10: 98 10,70 12,49 17,42 7,56 13,95 6,68

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(continuación)

Secuencia EXP: SEQ ID NO: Hoja enV4 Hoja en V7 Hojaen VT Raíz en V4 Raíz en V7 Raíz en VT

EXP-Sv.Ubq1:1:9: 133 3,72 4,34 4,48 2,90 6,99 2,78

EXP-Zm.UbqM1:1:7: 141 13,42 21,89 38,78 9,56 16,69 11,15

Tabla 46. Expresión media de CP4 en tejido reproductivo y semilla en desarrollo en plantas R0 transformadas de maíz

Secuencia EXP: SEQ ID NO: Panícula en VT Seda en R1 Embrión en R3 Endospermoen R3

EXP-ANDge.Ubq1:1:8: 8 24,14 5,55 7,29 4,91

EXP-ERIra.Ubq1:1:8: 27 19,20 10,27 12,60 4,70

EXP-C1.Ubq1:1:10: 98 18,70 16,21 8,26 8,82

EXP-Sv.Ubq1:1:9: 133 7,10 4,72 3,13 1,74

EXP-Zm.UbqM1:1:7: 141 67,25 11,21 7,85 10,69

Como se puede observar en la Tablas 45 y 46, cada una de las secuencias EXP EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO:

5 8), EXPERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-C1.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133) y EXPZm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141) fue capaz de dirigir la expresión de CP4 en todos los tejidos muestreados de plantas transformadas R0. La expresión superior de CP4 en la raíz y hoja de transformantes que comprenden EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8) y EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) que dirigen CP4 en comparación con EXP-C1.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) que dirige CP4 puede ser relativa al nivel de tolerancia vegetativo a la

10 aplicación de glifosato que se observa para estas poblaciones de transformantes (véase el siguiente Ejemplo 14).

Cada secuencia EXP presentó un patrón de expresión único con respecto al nivel de expresión para cada tejido muestreado. Por ejemplo, aunque la expresión de CP4 en hojas, raíces y panículas fue similar para las secuencias EXP EXPANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8) y EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), la expresión en la seda usando EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8) fue la mitad de la expresión dirigida por ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 21).

15 Esto puede ser ventajoso para la expresión de transgenes en los que se desee la expresión constitutiva, pero se prefiera menos expresión en el tejido de seda. Las secuencias EXP demuestran patrones únicos de la expresión constitutiva de CP4 en plantas transformadas de maíz R0.

Se cruzaron las plantas transformadas de maíz R0 con una variedad LH244 no transgénica para producir semillas F1. La generación F1 resultante se analizó para determinar la segregación del casete transgénico, y se seleccionaron las

20 plantas heterocigóticas para el casete CP4 para el análisis de la expresión de CP4. Las semillas se cultivaron en el invernadero y se produjeron dos grupos de plantas; en un grupo, se pulverizó glifosato, mientras que el otro se dejó sin pulverizar. Se analizó la expresión de CP4 en tejidos seleccionados usando un ensayo basado en ELISA convencional. La expresión media de CP4 se muestra en las siguientes Tablas 47 y 48.

Tabla 47. Expresión media de CP4 en plantas de maíz transformadas F1

Órgano: pMON141619 pMON142862 pMON129221

Hoja en V4: 11,50 13,51 7,68

Raíz en V4: 12,48 12,60 10,29

Hoja en V7: 16,59 20,21 12,01

Raíz en V7: 11,00 13,62 8,15

Hoja en VT: 39,88 44,85 29,42

Raíz en VT: 17,43 21,83 13,43

Flor, anteras en VT: 52,74 55,72 53,62

Seda en R1: 16,01 23,81 14,42

Semilla en R3 – Embrión 21 DDP: 33,29 57,96 51,64

Semilla en R3 – Endospermo 21 DDP: 2,99 3,20 6,44

25 Como se puede observar en la Tabla 47 anterior, la expresión de CP4 en hojas y raíces fue mayor en los transformantes F1 transformados con pMON141619 (EXP-ANDge.Ubq1:1:8, SEQ ID NO: 5) y pMON142862 (EXPERIra.Ubq1:1:8, SEQ ID NO: 27) que los transformados con pMON129221 (EXP-Cl.Ubq1:1:10, SEQ ID NO: 98). La expresión en el tejido de antera fue similar para las tres secuencias EXP, mientras que la expresión en la seda fue más alta usando EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27). La expresión en embriones en desarrollo (21 DAP) era mayor en los transformantes que comprendían EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) y EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) que dirigían la CP4. La expresión en el endospermo en desarrollo fue mayor en los transformantes que comprendían EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) que dirigían la CP4.

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Tabla 48. Expresión media de CP4 en plantas transformadas de maíz F1

Órgano: pMON129205

Hoja en V4: 1,73

Raíz en V4: 2,44

Hoja en V7: 2,84

Raíz en V7: 1,51

Hoja en VT: 3,29

Raíz en VT: 2,63

Flor, anteras en VT: 7,52

Seda en R1: 1,99

Semilla en R3 – Embrión 21 DDP: 3,40

Semilla en R3 – Endospermo 21 DDP: 1,79

Como se puede observar en la Tablas 47-48 anteriores, la expresión de CP4 fue inferior en todos los tejidos de transformantes F1 transformados con pMON129205 (EXP-Sv.Ubq1:1:9, SEQ ID NO: 133) a la de los transformados

10 con pMON141619 (EXP-ANDge.Ubq1:1:8, SEQ ID NO: 8), pMON142862 (EXP-ERIra.Ubq1:1:8, SEQ ID NO: 27) y pMON129221 (EXPC1. Ubq1:1:10, SEQ ID NO: 98).

Los patrones únicos de expresión conferidos por cada una de las secuencias EXP ensayadas proporcionan una oportunidad para producir una planta transgénica en la que la expresión puede perfeccionarse para hacer pequeños ajustes en la expresión transgénica para un rendimiento o una eficacia óptimos. Además, el ensayo empírico de

15 estas secuencias EXP que dirigen diferentes expresiones transgénicas puede producir resultados en los que una secuencia EXP sea más adecuada para la expresión de un transgén o clase de transgenes específicos mientras que se descubre que otra secuencia EXP es la mejor para otro transgén o clase de transgenes diferentes.

Ejemplo 14: Análisis de la tolerancia vegetativa a glifosato en plantas transgénicas de maíz R0

Se transformaron plantas de maíz con vectores de expresión en plantas que contenían las secuencias EXP que

20 dirigen la expresión del transgén CP4, y se evaluaron las plantas resultantes para determinar la tolerancia vegetativa y reproductiva a la aplicación de glifosato.

Las plantas F1 transformadas de maíz descritas en el Ejemplo 13 anterior transformadas con pMON141619, pMON142862, pMON129221, pMON129205 y pMON129212, y que comprendían las secuencias EXPANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-C1.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), 25 EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133) y EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), respetivamente que dirigían CP4, se evaluaron para determinar la tolerancia tanto vegetativa como reproductiva al pulverizar glifosato. Se dividieron diez plantas F1 2 (e.a., equivalente de ácido). Tras siete a diez días, se evaluaron las hojas de cada planta para determinar los daños. Se evaluó la tolerancia vegetativa (Tol veg en la Tabla 49) comparando las plantas pulverizadas y no pulverizadas para cada caso, y se usó una escala de clasificación de daños para proporcionar una clasificación final para la tolerancia vegetativa (T = tolerante, NT = no tolerante). Además, se ensayó un grupo de semillas para determinar todas las plantas de cada caso. Se compararon

35 las medidas del grupo de semillas entre las plantas de control y las plantas pulverizadas, y se asignó una tolerancia reproductiva (Tol Repro en la Tabla 49) para cada caso basándose en el porcentaje del grupo de semillas de las plantas pulverizadas con respecto a los controles (T = tolerante, NT = no tolerante). La siguiente Tabla 49 muestra las clasificaciones de tolerancia vegetativa y reproductiva para cada caso pulverizado en estadio V4 y V8. La letra “T” denota tolerante y “NT” denota no tolerante

40

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Construcción de plásmido: Secuencia EXP SEQ ID NO: Caso Tol veg en V4 Tol veg en V8 Tol repro

pMON141619: EXP-ANDge.Ubq1:1:8 8 Caso 1 T T NT

Caso 2: T T T

Caso 3: T T NT

Caso 4: T T NT

Caso 5: T T T

Caso 6: T T NT

Caso 7: T T T

Caso 8: T T T

Caso 9: T T NT

pMON142862: EXP-ERIra.Ubq1:1:8 27 Caso 1 T T T

Caso 2: T T NT

Caso 3: T T T

Caso 4: T T T

Caso 5: T T NT

Caso 6: T T T

Caso 7: T T NT

Caso 8: T T T

Caso 9: T T T

pMON129221: EXP-C1.Ubq1:1:10 98 Caso 1 T T NT

Caso 2: T T NT

Caso 3: NT NT T

Caso 4: NT NT T

Caso 5: T T NT

Caso 6: NT NT T

Caso 7: T T T

pMON129205: EXP-Sv.Ubq1:1:9 133 Caso 1 NT NT

Caso 2: NT NT NT

Caso 3: T T NT

Caso 4: NT NT

Caso 5: NT NT NT

Caso 6: NT NT NT

Caso 7: NT NT NT

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(continuación)

pMON129212: EXP-Zm.UbqM1:1:7 141 Caso 1 T T

Caso 2: T T

Caso 3: T T

Caso 4: T T

Caso 5: T T

Caso 6: T T

Caso 7: T T

Caso 8: T T

Caso 9: T T

Caso 10: T T

En la Tabla 49 anterior, todos los casos transformados ensayados que comprendían casetes de transgén GP4 que comprenden las secuencias EXP EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO:8), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) y EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141) demostraron una tolerancia vegetativa completa basándose en la 5 clasificación de los daños que no superaban una puntuación de diez. Cuatro de los nueve casos que comprendían EXPANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8) y seis de los nueve casos que comprendían EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) fueron tolerantes tanto vegetativa como reproductivamente a la aplicación de glifosato. Por el contrario, los casos que comprendían EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) fueron bien vegetativamente tolerantes o reproductivamente tolerantes, pero no ambos. Solo un caso que comprendía EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133)

10 demostró tolerancia vegetativa, y ninguno de los casos ensayados resultó ser tolerante reproductivamente. Todos los casos que contenían EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141) demostraron tolerancia vegetativa, pero todavía hay una evaluación de la tolerancia reproductiva en progreso.

Ejemplo 15: Análisis de la expresión usando diferentes secuencias de unión de corte y empalme de intrón/exón del extremo 3’

15 Se transformaron células de protoplastos foliares de maíz y trigo con construcciones de expresión en plantas que comprendían secuencias EXP que dirigen la expresión de GUS que comprenden el mismo promotor y líder, pero tienen diferentes nucleótidos en el extremo 3’ a continuación de la secuencia de unión de corte y empalme de intrón/exón, 5’-AG-3’ para ver si la expresión estaba afectada por el ligero cambio de la secuencia. La expresión también se comparó con la de dos plásmidos de control constitutivos.

20 Se construyeron construcciones de expresión en plantas que comprendían un casete de expresión de GUS. Los vectores resultantes estaban compuestos del promotor de ubiquitina de Coix lacryma-jobi P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80) unido operativamente en 5’ a la secuencia líder, L-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81), unida operativamente en 5’ a un elemento intrón que se muestra en la siguiente Tabla 50 que comprenden cada uno diferentes nucleótidos en el extremo 3’ justo después de la secuencia de unión de corte y empalme de intrón/exón 5’-AG-3’, unida

25 operativamente en 5’ a una secuencia codificante de GUS que está unida operativamente en 5’ a la UTR de 3’ de TAGRtu.nos-1:1:13 (SEQ ID NO: 127). La siguiente Tabla 50 muestra las construcciones de expresión en plantas y la correspondiente secuencia del extremo 3’.

Tabla 50. Construcciones de expresión en plantas, intrones y secuencia del extremo 3’ detrás de la secuencia de unión de corte y empalme de intrón/exón 5’-AG-3’

Construcción de plásmido: Secuencia EXP SEQ ID NO: Variante de intrón Nucleótidos del extremo 3’ de intrón inmed. despuésdel sitio de corte yempalme de 3’ AG

pMON140889: EXP-C1.Ubq1:1:10 98 I-C1.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 94) GTC

pMON146795: EXP-C1.Ubq1:1:18 99 I-C1.Ubq1-1:1:7 (SEQ ID NO: 92) GTG

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(continuación)

pMON146796: EXP-C1.Ubq1:1:19 100 I-C1.Ubq1-1:1:8 (SEQ ID NO: 101) GCG

pMON146797: EXP-C1.Ubq1:1:20 102 I-C1.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 103) GAC

pMON146798: EXP-C1.Ubq1:1:21 104 I-C1.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 105) ACC

pMON146799: EXP-C1.Ubq1:1:22 106 I-C1.Ubq1-1:1:11 (SEQ ID NO: 107) GGG

pMON146800: EXP-C1.Ubq1:1:23 108 I-C1.Ubq1-1:1:12 (SEQ ID NO: 109) GGT

pMON146801: EXP-C1.Ubq1:1:24 110 I-C1.Ubq1-1:1:13 (SEQ ID NO: 111) CGT

pMON146802: EXP-C2.Ubq1:1:25 112 I-C1.Ubq1-1:1:14 (SEQ ID NO: 113) TGT

pMON25455: EXP-Os.Act1:1:9 179 Control constitutivo

pMON65328: EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1: 1 163 Control constitutivo

Los protoplastos de maíz y trigo se transformaron como se ha descrito anteriormente y se ensayaron para determinar la expresión de GUS y luciferasa. La siguiente Tabla 51 muestra los valores medios de GUS y RLuc para la expresión de protoplastos tanto de maíz como de trigo.

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Se usaron los valores de GUS/RLuc para cada secuencia EXP de ubiquitina de Coix lacryma-jobi de la Tabla 46 anterior para normalizar la expresión relativa de los dos controles constitutivos EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) y EXPCaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163) y se presentan en la siguiente Tabla 52.

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Como se muestra en la Tabla 52 anterior, cada una de las secuencias EXP de ubiquitina de Coix lacryma-jobi proporcionó una expresión que resultó ser superior a la del control constitutivo tanto en el maíz como en el trigo. La expresión en protoplastos de maíz fue relativamente similar para todas las secuencias EXP de ubiquitina de Coix. La expresión en el trigo resultó ser un poco más variable. El uso de diferentes nucleótidos en el extremo 3’ detrás de la secuencia de unión de corte y empalme de intrón/exón 5’-AG-3’ no pareció afectar drásticamente a la expresión de GUS a excepción de la GUS dirigida por EXP-Cl.Ubq1:1:20 (SEQ ID NO: 102). La EXP-Cl.Ubq1:1:20 comprende la secuencia de nucleótidos del extremo 3’ 5’-GAC-3’ detrás de la secuencia de unión de corte y empalme de intrón/exón 5’-AG-3’, e hizo que la expresión cayera ligeramente con respecto a las otras secuencias EXP de ubiquitina de CoixCl.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 103) debería ser adecuada para su uso en casetes de expresión transgénica sin pérdida significativa de actividad ni de procesamiento.

Ejemplo 16: Potenciadores derivados de los elementos reguladores

Los potenciadores se derivan de los elementos promotores proporcionados en el presente documento, tales como los presentados como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 y 135. El elemento potenciador puede estar compuesto de uno o más elementos reguladores cis que, cuando se unen operativamente en 5’ o 3’ a un elemento promotor, o se unen operativamente en 5’ o 3’ a elementos potenciadores adicionales que están unidos operativamente a un promotor, pueden amplificar o modular la expresión de un transgén, o proporcionar la expresión de un transgén en un tipo de célula o de órgano vegetal específico o en un determinado punto de tiempo del desarrollo o ritmo circadiano. Los potenciadores se producen retirando la caja TATA o elementos funcionalmente similares y cualquier secuencia cadena abajo de los promotores que permite que se inicie la transcripción a partir de los promotores proporcionados en el presente documento como se ha descrito anteriormente, incluyendo fragmentos de los mismos, de los que se retiran la caja TATA o elementos funcionalmente similares y secuencias cadena abajo de la caja TATA. El elemento potenciador E-Cl.Ubql-1:1:1 (SEQ ID NO: 89) que se deriva del elemento promotor PCl.Ubq1-1:1:1 se proporciona en el presente documento para demostrar potenciadores derivados de un elemento promotor.

Los elementos potenciadores se pueden derivar de elementos promotores proporcionados en el presente documento y clonados usando procedimientos conocidos en la técnica para unirse operativamente en 5’ o 3’ a un elemento promotor, o unirse operativamente en 5’ o 3’ a elementos potenciadores adicionales que están unidos operativamente a un promotor. Como alternativa, los elementos potenciadores se clonan usando procedimientos conocidos en la técnica, para unirse operativamente a una o más copias del elemento potenciador que están unidas operativamente en 5’ o 3’ a un elemento promotor, o unidas operativamente en 5’ o 3’ a elementos potenciadores adicionales que están unidos operativamente a un promotor. Los elementos potenciadores también se pueden clonar para estar unidos operativamente en 5’ o 3’ a un elemento promotor derivado de un organismo de un género diferente, o unido operativamente en 5’ o 3’ a elementos potenciadores adicionales derivados de organismos de otros géneros o un organismo del mismo género que está unido operativamente a un promotor derivado de un organismo del mismo o diferente género, dando lugar a un elemento regulador quimérico. Se construye vector de transformación en plantas para la expresión de GUS usando procedimientos conocidos en la técnica similares a las construcciones descritas en los ejemplos previos, en los que los vectores de expresión en plantas resultantes contienen una región de borde derecho de A. tumefaciens, un primer casete transgénico para ensayar un elemento regulador o elemento regulador quimérico compuesto de un elemento regulador o regulador quimérico, unido operativamente a un intrón derivado de la proteína de choque térmico HSP70 de Z. mays (I-Zm.DnaK-1:1:1 SEQ ID NO: 144) o cualquiera de los intrones presentados en el presente documento o cualquier otro intrón, unido operativamente a una secuencia codificante para β-glucuronidasa (GUS) que posee un intrón procesable (GUS-2, SEQ ID NO: 160) o ningún intrón (GUS-1, SEQ ID NO: 159), unido operativamente a la UTR de 3’ de nopalina sintasa de A. tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 161) o la UTR de 3’ del gen de la proteína de transferencia lipídica del arroz (T-Os.LTP-1:1:1, SEQ ID NO: 175); un segundo casete de selección transgénica usado para la selección de células vegetales transformadas que confiere resistencia al herbicida glifosato (dirigido por el promotor actina-1 del arroz), o como alternativa, al antibiótico kanamicina (dirigido por el promotor Actina-1 del arroz) y una región de borde izquierdo de A. tumefaciens. Los plásmidos resultados se usan para transformar plantas de maíz u otro género de plantas mediante los procedimientos descritos anteriormente o mediante otros procedimientos de bombardeo de partículas o mediados por Agrobacterium conocidos en la técnica. Como alternativa, las células de protoplasto derivadas del maíz u otro género de plantas se transforman usando procedimientos conocidos en la técnica para realizar ensayos transitorios.

La expresión de GUS dirigida por el elemento regulador que comprende uno o más potenciadores se evalúa en ensayos con plantas estables o transitorios para determinar los efectos del elemento potenciador sobre la expresión de un transgén. Se realizan modificaciones en uno o más elementos potenciadores o la duplicación de uno o más elementos potenciadores basándose en la experimentación empírica y la regulación de la expresión génica resultante que se observa usando cada composición de elementos reguladores. Mediante la alteración de las posiciones relativas de uno o más potenciadores en el elemento regulador o elemento regulador quimérico, se puede afectar a la actividad de la transcripción o a la especificidad del elemento regulador o regulador quimérico, y se determina empíricamente para identificar los mejores potenciadores para el perfil de expresión transgénica deseado en la planta de maíz o la planta de otro género.

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Ejemplo 17: Análisis de potenciación del intrón de la actividad GUS usando protoplastos derivados de plantas

Se selecciona un intrón basándose en la experimentación y la comparación con un vector de expresión de control sin intrón para seleccionar empíricamente un intrón y la configuración en la disposición de elementos en el vector ADN-T para la expresión óptima de un transgén. Por ejemplo, en la expresión de un gen de resistencia a un herbicida, tal como CP4 que confiere tolerancia al glifosato, es deseable tener una expresión transgénica en tejidos reproductores, así como en tejidos vegetativos, para evitar la pérdida de rendimiento cuando se aplica un herbicida. Un intrón en este caso se seleccionaría basándose en su capacidad, cuando se une operativamente a un promotor constitutivo, para potenciar la expresión del transgén que confiere la resistencia al herbicida, en particular, en células y tejidos reproductores de la planta transgénica y proporcionando así una tolerancia tanto vegetativa como reproductiva a la planta transgénica, cuando se pulveriza el herbicida. En la mayoría de los genes de ubiquitina, la UTR de 5’ se compone de un líder que tiene una secuencia de intrón embebida en él. Los elementos de expresión derivados de dichos genes, por tanto, se ensayan usando la UTR de 5’ completa que comprende el promotor, líder e intrón. Para conseguir diferentes perfiles de expresión o para modular el nivel de expresión de un transgén, el intrón de dicho elemento de expresión se puede retirar o sustituir con un intrón heterólogo.

Los intrones presentados en el presente documento como SEQ ID NO: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 y 182 se identificaron usando ADN genómico contiguo en comparación con los grupos de marcadores de secuencia expresada o ADNc contiguos para identificar las secuencias de intrón y exón en el ADN genómico. Además, también se usaron la UTR de 5’ o secuencias líder para definir la unión de corte y empalme de intrón/exón de uno o más intrones en condiciones en las que en la secuencia genética codifica una secuencia líder que está interrumpida por uno o más intrones. Se clonan intrones usando procedimientos conocidos en la técnica en una vector de transformación de plantas para que se una operativamente en 3’ con un elemento regulador de la transcripción y fragmento líder, y se una operativamente en 5’ con un segundo fragmento líder o con secuencias codificantes, por ejemplo, como se representa en los dos casetes transgénicos presentados en la FIG. 1.

Por lo tanto, por ejemplo, un primer casete transgénico posible (Configuración 1 de Casete transgénico en la FIG. 8) se compone de un elemento promotor o promotor quimérico [A], unido operativamente en 5’ a un elemento líder [B], unido operativamente en 5’ a un elemento intrón de ensayo [C], unido operativamente en 5’ a una región codificante [D], que está unida operativamente a un elemento de UTR de 3’ [E]. Como alternativa, un segundo casete transgénico posible (Configuración 2 de casete transgénico en la FIG. 8) se compone de un elemento promotor o promotor quimérico [F], unido operativamente en 5’ a un primer elemento líder o un primer fragmento de elemento líder [G], unido operativamente en 5’ a un elemento de intrón de ensayo [H], unido operativamente en 5’ a un segundo elemento líder o segundo fragmento del primer elemento líder [I], unido operativamente a una región codificante [J], que está unida operativamente a un elemento de UTR de 3’ [K]. Además un posible tercer casete transgénico (Configuración 3 de casete transgénico de la FIG. 8) se compone de un elemento promotor o promotor quimérico [L], unido operativamente en 5’ a un elemento líder [M], unido operativamente en 5’ a un primer fragmento del elemento de secuencia codificante [N], unido operativamente en 5’ a un elemento de intrón [O], unido operativamente en 5’ a un segundo fragmento del elemento de secuencia codificante [P], que está unido operativamente a un elemento de UTR de 3’ [Q]. La configuración 3 del casete transgénico está diseñado para permitir el corte y empalme del intrón de manera que permita producir una fase de lectura abierta completa sin cambio de fase entre el primer y segundo fragmento de la secuencia codificante.

Los 6 primeros nucleótidos del extremo 5’ y los 6 últimos nucleótidos del extremo 3’ de los intrones presentados como SEQ ID NO: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 y 182 representan nucleótidos antes y después de la unión de corte y empalme de intrón/exón, respectivamente. Estas 6 secuencias cortas de nucleótidos, por ejemplo, se pueden modificar para que tengan una secuencia adicional adjunta (es decir, nativa o artificial) para facilitar la clonación del intrón en un vector de transformación en plantas, siempre que se conserven el primer y segundo nucleótido del extremo 5’ (GT) y el cuarto y quinto nucleótido del extremo 3’ (AG) de SEQ ID NOS: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 y 182, conservándose así la unión de corte y empalme de intrón/exón del intrón. Como se ha expuesto anteriormente, puede ser preferible evitar el uso de la secuencia de nucleótidos AT o el nucleótido A justo antes del extremo 5’ del sitio de corte y empalme (GT) y el nucleótido G o la secuencia de nucleótidos TG, respectivamente justo después del extremo 3’ del sitio de corte y empalme (AG) para eliminar el potencial de que se formen codones de inicio no deseados durante el procesamiento de ARN mensajero en la transcripción final. La secuencia alrededor de los sitios de unión de corte y empalme de los extremos 5’ o 3’ del intrón se pueden modificar de esta manera.

Los intrones se ensayan para determinar un efecto de potenciación a través de la capacidad de aumentar la expresión en un ensayo transitorio o ensayo en plantas estables. Para el ensayo transitorio de la potenciación del intrón, se construye un vector vegetal básico usando procedimientos conocidos en la técnica. Se clona el intrón en un vector vegetal básico que comprende un casete de expresión compuesto de un promotor constitutivo tal como el promotor del virus del mosaico de coliflor, P-CaMV.35S-enh-1:1:9 (SEQ ID NO: 176), unido operativamente en 5’ a un elemento líder, LCaMV.35S-1:1:15 (SEQ ID NO: 177), unido operativamente en 5’ a un elemento de intrón de ensayo (por ejemplo, uno de SEQ ID NOS: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 y 182), unido operativamente a una secuencia codificante para β-glucuronidasa (GUS) que posee un intrón procesable (GUS-2, SEQ ID NO: 160) o ningún intrón (GUS-1, SEQ ID NO: 159), unido operativamente a la UTR de 3’ de nopalina sintasa de A. tumefaciens (TAGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 161). Las células de protoplasto derivadas de maíz o tejidos de otro género de plantas se transforman con el vector vegetal básico y vectores de control de luciferasa como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2 anterior y se ensayan para determinar su actividad. Para comparar la capacidad relativa del intrón para potenciar la expresión, se expresaron los valores de GUS como una proporción de la actividad de GUS con respecto a la luciferasa y se compararon con los niveles transmitidos por una construcción que comprende el promotor constitutivo unido operativamente a un intrón convencional conocido tal como el del intrón derivado de la proteína de choque térmico HSP70 de Zea mays, I-Zm.DnaK-1:1:1 (SEQ ID NO: 178), así como una construcción que comprende el promotor constitutivo, pero sin un intrón unido operativamente al promotor.

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Para el ensayo de plantas estables de los intrones presentados como SEQ ID NO: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 y 182, se construye un vector de transformación en plantas de expresión de GUS similar a las construcciones descritas en los ejemplos previos, en las que los vectores de expresión en plantas resultantes contienen una región de borde derecho de A. tumefaciens, un primer casete transgénico para ensayar el intrón compuesto de un promotor constitutivo tal como el promotor del virus del mosaico de coliflor, PCaMV.35Senh-1:1:9 (SEQ ID NO: 176), unido operativamente en 5’ a un elemento líder, L-CaMV.35S-1:1:15 (SEQ ID NO: 177), unido operativamente en 5’ a un elemento de intrón de ensayo proporcionado en el presente documento, unido operativamente a una secuencia codificante de β-glucuronidasa (GUS) que posee un intrón procesable (GUS-2, SEQ ID NO: 160) o ningún intrón (GUS-1, SEQ ID NO: 158), unido operativamente a la UTR de 3’ de nopalina sintasa de A. tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 161); un segundo casete transgénico de selección usado para la selección de las células vegetales transformadas que confiere resistencia al glifosato (dirigida por el promotor Actina-1 del arroz), o como alternativa, al antibiótico kanamicina (dirigida por el promotor Actina-1 del arroz) y una región de borde izquierdo de .. Los plásmidos resultantes se usan para transformas plantas de maíz o plantas de otro género mediante los procedimientos descritos anteriormente o mediante procedimientos mediados por Agrobacterium conocidos en la técnica. Se selecciona una copia única o un número bajo de copias de transformantes para su comparación con la copia única o un número bajo de copias de plantas transformadas, que se han transformado con un vector de transformación de plantas idéntico al vector de ensayo pero sin el intrón de ensayo para determinar si el intrón de ensayo proporciona un efecto de potenciación mediado por intrón. Cualquiera de los intrones presentados como SEQ ID NO: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 y 182 se puede modificar de varias maneras, tales como mediante la eliminación de fragmentos de la secuencia de intrón, que puede reducir la expresión o la duplicación de fragmentos con el intrón que puede potenciar la expresión. Además, las secuencias del intrón que pueden afectar a la especificidad de la expresión para determinados tipos de células o tejidos y órganos se pueden duplicar, o alterar o eliminar para afectar a la expresión y a los patrones de expresión del transgén. Además, los intrones proporcionados en el presente documento se pueden modificar para eliminar cualquiera de los codones de inicio (ATG) que pueden producir transcripciones no intencionadas que se expresen a partir de intrones cortados y empalmados inadecuadamente como proteínas diferentes, más largas o truncadas. Una vez que el intrón se ha ensayado empíricamente, o se ha alterado basándose en la experimentación, el intrón se usa para potenciar la expresión de un transgén en plantas transformadas establemente que pueden ser de cualquier género de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, siempre que el intrón proporcione la potenciación del transgén. El intrón también se puede usar para potenciar la expresión en otros organismos tales como células de algas, hongos o animales, siempre que el intrón proporcione la potenciación o atenuación o especificidad de la expresión del transgén al que está unido operativamente.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN seleccionada de:

(a)

una secuencia con al menos el 95 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de cualquiera de SEQ ID NO: 27-28, en la que la secuencia tiene actividad de promotor;

(b)

una secuencia que comprende cualquiera de SEQ ID NO: 27-28; y

(c)

un fragmento que comprende al menos 500 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 27,

en la que el fragmento tiene la actividad de promotor de SEQ ID NO: 27; en la que dicha secuencia está unida operativamente a una molécula de polinucleótido heteróloga que se puede transcribir.
2.

La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que la molécula de polinucleótido heteróloga que se puede transcribir comprende un gen de interés agronómico.
3.

La molécula de ADN de la reivindicación 2, en la que el gen de interés agronómico

(i)

confiere tolerancia a herbicidas en plantas; o

(ii)

confiere resistencia a plagas en plantas.
4.

Una célula vegetal transgénica que comprende una molécula de ADN heteróloga que comprende una secuencia seleccionada de:

(a)

una secuencia con al menos el 95 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de cualquiera de SEQ ID NO: 27-28, en la que la secuencia tiene actividad de promotor;

(b)

una secuencia que comprende cualquiera de SEQ ID NO: 27-28; y

(c)

un fragmento que comprende al menos 500 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 27,

en la que el fragmento tiene la actividad de promotor de SEQ ID NO: 27; en la que dicha secuencia está unida operativamente a una molécula de polinucleótido heteróloga que se puede transcribir.
5.

La célula vegetal transgénica de la reivindicación 4, en la que dicha célula vegetal transgénica es una célula de planta monocotiledónea.
6.

La célula vegetal transgénica de la reivindicación 4, en la que dicha célula vegetal transgénica es una célula de planta dicotiledónea.
7.

Una planta transgénica, o una parte de la misma, que comprende la molécula de ADN de la reivindicación 1.
8.

Una planta descendiente de la planta transgénica de la reivindicación 7, o una parte de la misma, en la que la planta descendiente o la parte de la misma comprende la molécula de ADN de la reivindicación 1.
9.

Una semilla transgénica, en la que la semilla comprende la molécula de ADN de la reivindicación 1.
10.

Un procedimiento de expresión de una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que comprende la obtención de una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 7 y cultivar la planta, en la que se exprese un polinucleótido que se puede transcribir.

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